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UNIVERSIDADE DO ALGARVE

Faculdade de Ciências e Tecnologia

Testes com novos fármacos no tratamento do parasita de peixes Amyloodinium ocellatum

Mónica Cristina Lopes Amaral

Dissertação

Mestrado em Aquacultura e Pescas

(Especialidade em Aquacultura)

Trabalho efetuado sob a orientação de:

Professor Doutor Adelino V. M. Canário

Doutor Pedro M. Guerreiro

2013

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UNIVERSIDADE DO ALGARVE

Faculdade de Ciências e Tecnologia


Dissertação

Mestrado em Aquacultura e Pescas

(Especialidade em Aquacultura)

Autora:

Licenciada Mónica Cristina Lopes Amaral

Trabalho efetuado sob a orientação de:

Professor Doutor Adelino V. M. Canário, Universidade do Algarve

Doutor Pedro M. Guerreiro, Centro de Ciências do Mar do Algarve

2013

iii


Declaração de autoria de trabalho

Declaro ser a autora deste trabalho, que é

original e inédito. Autores e trabalhos

consultados estão devidamente citados no

texto e constam da listagem de referências

incluída.

A autora:

(Mónica C. L. Amaral)

Copyright® by Mónica Amaral

A Universidade do Algarve tem o direito, perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e

publicitar este trabalho através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma

digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, de o divulgar

através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos

educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e

editor.

iv

À minha família,

"I think using animals for food is an ethical thing to do,

but we've got to do it right. We've got to give those animals

a decent life and we've got to give them a painless death.

We owe the animal respect."

Temple Grandin

v

Agradecimentos

Ao Professor Doutor Adelino Canário, pelos conselhos valiosos na escrita desta tese e pela

disponibilidade demonstrada durante o decorrer deste estudo.

Ao Doutor Pedro Guerreiro pela disponibilidade ao longo de todas as etapas deste estudo,

pelo seu bom humor, por todos os conselhos e principalmente pela sua paciência.

À Piscicultura do Vale da Lama, Lda. pela realização de várias tarefas nas suas instalações e

pelo interesse demonstrado neste estudo.

Ao Grupo de Síntese e Reactividade Orgânica do Centro de Ciências do Mar pelo

fornecimento dos fármacos utilizados neste estudo.

À Paula Canada pela ajuda inicial, pela transmissão dos seus conhecimentos e pelo interesse

por este estudo.

À Elsa pela ajuda, disponibilidade e palavras sempre simpáticas durante o tempo passado no

laboratório.

À minha família por me terem sempre apoiado em todas as decisões ao longo da vida.

Principalmente aos meus pais, responsáveis pelo que sou hoje e que tornaram possível a

realização do sonho de estudar aquacultura.

Às amizades de infância, da Universidade de Évora, da Universidade do Algarve, de Erasmus

e às conquistadas durante a vida. Por vezes simples palavras foram essenciais para atingir os

meus objectivos.

E em especial ao Bruno (Shark), por tudo.

A todos,

Muito Obrigada!

vi


Resumo

O Amyloodinium ocellatum é um parasita dinoflagelado que aparece em aquaculturas

por todo o mundo, infectando as brânquias e o tegumento dos peixes. Esta parasita é

particularmente relevante na aquacultura mediterrânica onde os surtos causam perdas

consideráveis. Apesar de já terem sido experimentados vários tratamentos, nenhum deles se

revelou efectivo na erradicação do parasita e ainda alguns dos químicos utilizados podem ter

importantes efeitos nocivos sobre o ambiente. Deste modo, o objectivo deste estudo foi testar

novos fármacos para impedir o desenvolvimento e/ou eliminar o parasita em peixes já

infectados. Os fármacos utilizados neste estudo foram endoperóxidos, uma recente classe de

antimaláricos. Na primeira parte deste estudo realizaram-se ensaios in vitro onde se testaram

os efeitos de diferentes concentrações (0,1mM; 1 mM; 2mM e 2,5mM) dos fármacos NAD17,

NAD19, LCD93 e LCD67A sobre a divisão dos tomontes. Às 24 e 48 horas de exposição a

0,1mM NAD19 e 1mM LCD93, os tomontes observados não tinham entrado em divisão. Na

segunda parte realizou-se um ensaio in vivo no qual os fármacos foram administrados a

juvenis de dourada (Sparus aurata) a uma concentração de 10µmol/kg através de tratamento

oral. No ensaio in vivo avaliou-se o possível efeito profiláctico dos fármacos na infecção

através da análise da abundância e prevalência do parasita, da eficácia dos fármacos e dos

efeitos do parasita e do tratamento na fisiologia e no eixo do stress dos animais infectados

através de análises enzimáticas e de parâmetros bioquímicos do sangue. As medições

realizadas ao plasma sanguíneo e às brânquias de douradas com diferentes níveis de infecção

de A. ocellatum revelaram que não existe diferença significativa entre os controlos e os

endoperóxidos para a dose testada. Será necessário realizar mais ensaios para obter

conclusões sobre o efeito dos endoperóxidos no controlo do parasita de peixes A. ocellatum.

Palavras-chave: Amyloodinium ocellatum, endoperóxidos, fármacos, parasita de peixes.

vii

Trials with new drugs in the treatment of the fish parasite Amyloodinium ocellatum

Abstract

Amyloodinium ocellatum is a dinoflagellate parasite that occurs in aquacultures all

over the world, infecting the gills and integument of fish. This parasite is particularly relevant

in the Mediterranean Aquaculture, where the outbreaks cause considerable losses. Although

there are several treatments, none of them managed to completely eradicate the parasite and,

some of the compounds used may cause important adverse effects in the environment. Thus,

the aim of this study was to test new drugs that could hold back the parasite development or

eliminate it in fish that were already contaminated. The drugs tested were endoperoxides, a

recent type of antimalarials. Trials in vitro were conducted to assess the drugs effect, in

different concentrations (0,1mM; 1mM; 2mM and 2,5mM) of NAD17, NAD19, LCD93 and

LCD67A, in the division of the tomontes. In the tomontes exposed to concentrations of

0,1mM NAD19 and 1mM LCD93 didn’t occur division at 24 and 48 hours. In the second

part of the experiment, trials in vivo were made in which the drugs where administrated to the

seabream juveniles, with a concentration of 10µmol/kg, via oral treatment. In this trial it was

evaluated the possible prophylactic effect caused by the drugs in the infection through

analysis of the abundance, efficiency and prevalence of the parasite. The efficiency of the

drugs and the effects of the parasite, and their impact on the physiology and stress axis of fish

were also evaluated using an array of biochemical analysis on plasma. The analysis made in

the plasma and gills of seabream with different levels of infection with A. ocellatum revealed

no significant difference between the controls and the endoperoxides, for the tested dosages.

It will be necessary to perform more trials to obtain better conclusions about the

endoperoxides effect in the control of the fish parasite A. ocellatum.

Keywords: Amyloodinium ocellatum, endoperoxides, drugs, fish parasite.

viii

Índice

1. Introdução ........................................................................................................................................ 1

1.1. Patogenicidade em aquacultura ............................................................................................... 1

1.2. Amiloodiniose – informação geral .......................................................................................... 2

1.3. Taxonomia ............................................................................................................................... 2

1.4. Ciclo biológico e morfologia ................................................................................................... 3

1.5. Factores ecológicos que afectam o crescimento ...................................................................... 4

1.6. Principais hospedeiros e distribuição geográfica .................................................................... 5

1.7. Transmissão ............................................................................................................................. 7

1.8. Diagnóstico da infecção .......................................................................................................... 7

1.9. Sinais clínicos/patologia .......................................................................................................... 8

1.9. Resistência imunológica dos peixes a Amyloodinium ocellatum ............................................ 9

1.9.1. Imunidade inata ............................................................................................................... 9

1.9.2. Imunidade adquirida ...................................................................................................... 10

1.10. Profilaxia e Tratamento (químico, físico e biológico) ....................................................... 11

1.11. Aplicações de antimaláricos em aquacultura..................................................................... 13

2. Objectivos ...................................................................................................................................... 14

3.1. Espécies – alvo ...................................................................................................................... 15

3.3. Diagnóstico da infestação ...................................................................................................... 16

3.4. Recolha de parasita ................................................................................................................ 16

3.5. Fármacos ............................................................................................................................... 18

3.6. Ensaios in vitro ...................................................................................................................... 20

3.6.1. Observação do ciclo de vida do parasita ....................................................................... 20

3.6.2. Exposição aos endoperóxidos........................................................................................ 22

3.7. Ensaio in vivo ........................................................................................................................ 23

3.7.1. Tratamento..................................................................................................................... 23

3.7.2. Circuito experimental .................................................................................................... 24

3.7.4. Infecção dos animais-alvo ............................................................................................. 26

3.7.5. Amostragem biológica .................................................................................................. 26

3.7.6. Análises bioquímicas ..................................................................................................... 27

3.7.6.1. Análises ao plasma .................................................................................................... 27

3.7.6.2. Medição da actividade Na+, K

+ - ATPase nas brânquias ........................................... 28

3.8. Análise estatística .................................................................................................................. 29

ix

4. Resultados ..................................................................................................................................... 30

4.1. Isolamentos ............................................................................................................................ 30

4.2. Ensaios in vitro ...................................................................................................................... 31

4.2.1. Observação do ciclo de vida do parasita ....................................................................... 31

4.2.2. Exposição aos endoperóxidos........................................................................................ 33

4.2.2.1. Abundância relativa do parasita ................................................................................ 33

4.2.3. Índice de desenvolvimento do parasita .......................................................................... 37

4.3. Ensaios in vivo ...................................................................................................................... 39

4.3.1. Animais ......................................................................................................................... 39

4.3.2. Infecção ......................................................................................................................... 39

4.3.3. Metabolitos .................................................................................................................... 42

4.3.4. Osmorregulação ............................................................................................................. 49

4.3.5. Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo ....................................... 55

5. Discussão ....................................................................................................................................... 58

6. Conclusão ...................................................................................................................................... 65

7. Considerações finais ...................................................................................................................... 65

Referências bibliográficas ..................................................................................................................... 66

x

Índice de figuras

Figura 1.1 – Ciclo de vida de A. ocellatum………………………………………………….....3

Figura 1.2 – Endoperóxidos antimaláricos (1- artimisinina, 2- trioxalano OZ439, 3-

tetraoxano) (O’neill et al., 2010) …………………………………………………………….14

Figura 3.1 – Cronograma das etapas do ensaio in vivo………………………………………23

Figura 3.2 – Circuito experimental…………………………………………………………...25

Figura 4.2 – Abundância relativa do estado do parasita ao longo do tempo quando não esteve

a 4ºC (a) e quando esteve 1 dia a 4ºC (b) (n = variável)…………………………………...…32

Figura 4.3 - Índice de desenvolvimento do parasita ao longo do tempo quando não esteve a

4ºC e quando esteve 1 dia a 4ºC………………………………………………………………33

Figura 4.4 – Abundância relativa do estado do parasita comparando o controlo, solvente e

endoperóxido a 0,1mM de NAD17 (a), NAD19 (b) e LCD93 (c) às 24h e às 48h

(n=variável)…………………………………………………………………………………...34


endoperóxido a 1mM de NAD17 (a), NAD19 (b), LCD93 (c) e LCD67A (d) às 24h e às 48h

(n=variável)……………………………………………………………………………...……35


endoperóxido a 2 e 2,5mM de NAD17 (a), NAD19 (b) e LCD67A (c) às 24h e às 48h

(n=variável)………………………………………………………………………….………..36

Figura 4.7 - Índice de desenvolvimento do parasita quando exposto a NAD17 (a), NAD19 (b),

LCD93 (c) e LCD67A (d) a diferentes concentrações às 24 e 48 horas……………………..37

Figura 4.8 – Índice de desenvolvimento do parasita quando exposto a NAD19 a diferentes

concentrações às 24 e 48 horas……………………………………………………………….38

Figura 4.9 – Quociente do Índice de desenvolvimento do parasita do NAD19 e do respectivo

índice do controlo às 24h e 48h………………………………………………………………38

Figura 4.10 – Abundância média (número total de parasitas observados em 20 filamentos

branquiais/número de peixes examinados) de douradas infectadas ( ) e não infectadas ( )

com A. ocellatum em diferentes tratamentos na 1ª (a) e 2ª amostragem (b)………………....40

Figura 4.11 – Prevalência ((número peixes parasitados/ número de peixes examinados) x 100)

nas brânquias em douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum submetidas

a diferentes tratamentos orais na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n 1ª amostragem = 12; n 2ª

amostragem = 17-18)…………………………………………………………………………41

Figura 4.12 – Eficácia (%) (100 – (100 x (média da abundância de parasitas no grupo de

tratamento/media da abundância de parasitas no grupo de controlo)) dos tratamentos em

douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum na 1ª e 2ª amostragem. n=12

xi

(1ªamostragem) e n=17-18 (2ªamostragem) (n 1ªamostragem = 12; n 2ª amostragem = 17-

18)…………………………………………………………………………………………….42

Figura 4.13 – Níveis de cortisol (ng ml-1

) em plasma sanguíneo de diferentes grupos de

douradas expostas ao parasita. Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 5).…………….43


) em plasma sanguíneo de douradas infectadas ( ) e

não infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos na 1ª (a) e 2ª

amostragem (b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8)…………………………….44

Figura 4.15 – Relação entre o número de parasitas em 20 filamentos branquiais e o nível de

cortisol (ng ml-1

) no plasma sanguíneo das douradas infectadas e não infectadas na 1ª (a) e 2ª

amostragem (b) (n=47-48)……..…………………………......................................................45

Figura 4.16 – Níveis de glucose (mmol l-1



amostragem (b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8)……………………………46


glucose (mmol l-1

) em plasma sanguíneo de douradas infectadas e não infectadas com A.

ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48)………......................................................47

Figura 4.18 – Níveis de proteína (mmol l-1

) em plasma sanguíneo de douradas infectadas ( )

e não infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos orais na 1ª (a) e 2ª



proteína (mg ml-1


ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48)..................................................................49

Figura 4.20 – Níveis de osmolaridade (mOsm kg-1

) em plasma sanguíneo de douradas

infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos orais

na 1ª (a) e 2ª amostragem (b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8)……………...50


osmolaridade (mOsm kg-1

) em plasma sanguíneo de douradas infectadas e não infectadas com

A. ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48)………………………………………..51

Figura 4.22 – Níveis de cloro (mmol l-1





cloro (mmol l-1

) em plasma sanguíneo das douradas infectadas e não infectadas com A.

ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48)………......................................................53

Figura 4.24 – Actividade de Na+,K

+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) nas brânquias de

douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum de douradas do grupo controlo

xii

e do grupo exposto ao tratamento oral com o endoperóxido NAD19 na 2ª amostragem. Os

valores são as médias ± erro-padrão (n = 3)………………………………………………….54

Figura 4.25 – Relação entre o número de parasitas em 20 filamentos branquiais e a actividade

Na+,K+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) nas brânquias de douradas infectadas e não

infectadas com A. ocellatum na 2ª amostragem (n=12)…..…………………………………..55

xiii

Índice de tabelas

Tabela 1.1 – Infecções provocadas por amiloodiniose registadas em peixes para consumo

humano (esta tabela contém apenas registos de infecções onde o contágio foi identificado em

fontes locais ou foi introduzido nas águas locais com o peixe. Não inclui registos de peixes

em aquários) (Noga e Levy, 2006) ………………………………………………………….....6

Tabela 3.1 – Isolamentos de tomontes (não inclui isolamentos fracassados) ………………..17

Tabela 3.2 – Endoperóxidos fornecidos pelo Grupo de Síntese e Reactividade Orgânica…...19

Tabela 3.3 – Classificação do estado do ciclo de vida do parasita…………………………...21

Tabela 3.4 – Doses (mM) de endoperóxidos e volumes de DMSO (µl) testados…………….22

Tabela 3.5 – Tratamento por tanque………………………………………………………….26

Tabela 4.1 – Isolamento do parasita, quantidade isolada e utilização………………………..31

Tabela 4.2 – Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo de douradas

infectadas na 1ª amostragem. Teste de correlação de Pearson (n=47). Existe relação quando

p<0,05………………………………………………………………………………………...55

Tabela 4.3 - Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo de douradas não


p<0,05………………………………………………………………………………………...56

Tabela 4.4 - Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo de douradas


p<0,05………………………………………………………………………………………...56



p<0,05………………………………………………………………………………………...57

1

1. Introdução

1.1.Patogenicidade em aquacultura

O conhecimento das doenças dos peixes e das suas zoonoses reveste-se de um

interesse que vai para além do campo específico da patologia, da biologia e mesmo da saúde

pública, revelando-se, cada vez mais, um instrumento ao serviço da ecologia e da dinâmica

das populações marinhas. No entanto esta temática é sobretudo importante no caso particular

da aquacultura onde, face às condições de produção, os problemas ligados à patologia,

sanidade e profilaxia das doenças de organismos cultivados são ainda mais críticos e

frequentemente, determinantes do sucesso desta actividade (Menezes, 2000).

Paralelamente ao crescente interesse e aos avanços na produção aquícola, detecta-se o

aparecimento, com maior frequência, de patologias, constituindo estas um factor limitante ao

desenvolvimento da cultura de algumas espécies, pois diminuem a produção e causam perdas

económicas difíceis de avaliar e prever.

O aparecimento de uma doença nos peixes é o resultado da interacção entre

patogénicos, hospedeiros e o meio ambiente (Zambrano et al., 2001; Basurco e Toranzo,

2004). A elevada concentração de material biológico num volume restrito comparada com as

condições naturais significa que as possibilidades para que ocorram doenças por contágio ou

deficiente qualidade da água são maiores nos sistemas de produção de peixes que na natureza

(Lekang, 2007). Este é um problema relevante para a aquacultura mundial que tem encontrado

e em muitos casos, controlado com sucesso vários surtos de doenças de origens diversas,

incluindo desequilíbrios fisiológicos ou aqueles provocados por factores abióticos, vírus,

bactérias ou parasitas.

No nosso país são conhecidos prejuízos relacionados com doenças na piscicultura,

nomeadamente bacterioses (vibriose e pasteurelose) e parasitoses (diplectanose, caligulose,

ictioftiriose, amiloodiniose) (Menezes, 2000). Dentre os principais grupos de parasitas que

afectam peixes marinhos e dulçaquícolas encontram-se os protozoários: ciliados, flagelados e

esporozoos, que em oposição às formas de vida livre vivem em forma contínua ou

descontinua na pele, brânquias, tecidos e órgãos internos (Zambrano et al., 2001).

2

1.2. Amiloodiniose – informação geral

A amiloodiniose ou ‘marine velvet’, causada pelo dinoflagelado Amyloodinium ocellatum

(Brown, 1931), com uma distribuição mundial e infectando mais de 100 espécies diferentes

de água salgada e salobra (Kuperman e Matey, 1999), sendo ainda um dos poucos parasitas

que consegue infectar tanto elasmobrânquios como teleósteos (Lawler, 1980 cit. Noga, 2012).

A. ocellatum (Brown, 1931) é um parasita obrigatório que infecta principalmente as brânquias

e o tegumento do peixe (Paperna, 1980; Cheung et al., 1981; Kuperman e Matey, 1999;

Ramos e Oliveira, 2001). Esta parasitose está também identificada em Portugal, tendo um

impacto significativo na piscicultura semi-intensiva devido às características edafoclimáticas

existentes no nosso país (Menezes, 2000).

1.3.Taxonomia

Para que seja possível um controlo efectivo dos dinoflagelados é necessário perceber a sua

epidemiologia, incluindo os hospedeiros e o intervalo geográfico, assim como outros factores

que afectam a sua transmissão. Os dinoflagelados são classificados em taxa zoológica e

botânica pois têm características de plantas e animais, porém os estudos mais recentes de

taxonomia destes parasitas utilizam a nomenclatura botânica (Noga e Levy, 2006).

Na classificação mais recente Amyloodinium ocellatum pertence ao Reino Protista, Filo

Mastigofora, Classe Dinoflagelida, Ordem Blastodinida, Família Oodinidae (Arthur e

Lumanlan-Mayo, 1997). Porém este parasita na classificação botânica pertence ao Filo

Dinoflagelida, Classe Blastodinifuceae, Ordem Blastodinia, Família Oodiniae (Cachon e

Cachon, 1987; Fensome et al., 1993), enquanto na classificação zoológica este organismo

encontra-se no Filo Sarcomastigofora, Subfilo Mastigofora, Classe Fitomastigofora, Ordem

Dinoflagelida (Levine et al., 1980).

Este organismo possui uma mancha vermelha muito característica, o que dá origem ao

nome da espécie, ocellatum junto à base, enquanto o núcleo grande e os numerosos grânulos

de amido espalhados por todo o citoplasma explicam o nome genérico Amyloodinium (Conroy

e Conroy, 2008). Até à data, apenas foi identificada uma espécie no género. Recentes estudos

genéticos de 5 isolamentos de A. ocellatum, obtidos de peixes no Mar Vermelho (Israel),

Mediterrâneo Oriental (Israel), Mar Adriático (Itália), Golfo do México (Florida), e de origem

desconhecida, revelaram uma variação não significativa, indicando que todos os isolados são

3

da mesma espécie (Levy et al., 2007). Porém os mesmos autores não eliminam a

possibilidade de existirem diferentes estirpes pois observaram que 3 isolados variavam em

comportamentos e morfologia. Alguns estudos de morfologia, como de Landsberg et al.

(1994), sugerem a existência de múltiplas espécies. Serão necessários mais isolamentos de

Amyloodinium de outras regiões geográficas e ecológicas que confirmem a existência de uma

única espécie (Francis-Floyd e Floyd, 2011).

1.4.Ciclo biológico e morfologia

O ciclo de vida do A. ocellatum tem três fases (figura 1.1): o trofonte ou fase parasitária,

com uma longevidade de 72 a 96 horas; o encapsulado (tomonte) ou fase reprodutiva, onde

ocorrem até seis divisões sucessivas e o dinosporo ou fase dispersiva, que são células com a

morfologia típica de um dinoflagelado (Zambrano et al., 2001).

Figura 1.1 – Ciclo de vida de A. ocellatum

Os trofontes de A. ocellatum anexados ao corpo dos peixes, barbatanas, olhos e cavidade

bucal são acastanhados ou amarelos, de forma esférica, ovóide ou piriforme (Cruz-Lacierda et

al., 2004; Kuperman e Matey, 1999) cuja dimensão pode variar entre 49x26 µm e 120x79 µm

(Kuperman e Matey, 1999). No citoplasma é possível observar um núcleo esférico e grande,

numa posição central com numerosos cromatófaros, grânulos de amido e vacúolos digestivos.

Externamente possui uma cápsula pseudoquitinosa, na zona polar um estomatópodo, estrutura

especializada na absorção de nutrientes e um pedúnculo curto com numerosos rizóides que

permite penetrar e fixar-se ao hospedeiro. Possui um flagelo curto na base da abertura da

cápsula e um estigma como órgão sensitivo (Zambrano et al., 2001).

Tomonte

Dinosporo Trofonte

4

No final do processo de absorção dos nutrientes os rizóides e o estomatopódo são

absorvidos através da abertura da cápsula que se fecha dando origem a um cisto ou tomonte

(Zambrano et al., 2001; Noga e Levy 2006).

Antes da primeira divisão do tomonte, a célula muda de forma, passando de ovóide para

alongada e o citoplasma torna-se mais escuro, denso e sofre estrangulamento. Dentro do

tomonte dividem-se os tomitos por fissão binária sincronizada normalmente a cada 9-10

horas. A cada estado do processo de divisão, o tomonte contem 2n

tomitos de igual tamanho,

por exemplo no primeiro processo de divisão o tomonte contém 2 tomitos (21). O potencial

reprodutivo do tomonte (número de divisões antes da esporulação) é determinado pelo

tamanho inicial do tomonte quando é desalojado das brânquias, contudo as condições de

incubação são importantes para obter a máxima capacidade reprodutiva. No final da divisão

cada tomito diferencia-se e transforma-se em dois dinosporos, os quais escapam da cápsula do

tomito, a este processo dá-se o nome de “esporulação”. Ocasionalmente, os dinosporos

escapam do tomito enquanto ainda estão ligados uns aos outros e a separação final ocorre fora

da célula mãe (Paperna, 1984b).

O dinosporo constitui o estado activo do parasita, na qual adopta a morfologia típica de

um dinoflagelado com dois flagelos. Este estado obtém-se após a 6ª divisão com o

rompimento da parede do tomito originando 64 dinosporos (Paperna, 1984b), porém alguns

autores referem até 256 dinosporos (Menezes, 2000).

1.5. Factores ecológicos que afectam o crescimento

Paperna (1984b) estudou o efeito da temperatura e da salinidade no ciclo de vida do A.

ocellatum e observou que existe um efeito sinergético da temperatura e da salinidade na

tolerância da divisão dos tomontes. O intervalo de temperaturas ideal para a divisão dos

tomontes e esporulação é de 18-30ºC, porém ao intervalo médio de 23-27ºC é quando a

reprodução dos tomitos é mais eficiente, ocorrendo esporulação em 2-3 dias. A 29-30ºC há

uma redução no número de divisões e a divisão final e esporulação terminam ao 4º dia,

enquanto a 18-20ºC a divisão dos tomontes é mais lenta (uma divisão por 19-34h) e existe

uma redução no sucesso da divisão (de 100% para 80-83%). O processo de divisão foi

totalmente inibido a 8ºC, mas recomeçou a 20ºC, porém se a incubação durar 7-9 dias apenas

16% dos tomontes retornam a divisão e poucos esporulam. Paperna (1984b) conclui que a

5

tolerância à salinidade é dependente das condições de temperatura ambiental. A uma

temperatura de 24-25ºC, o rendimento total da esporulação e a infecção efectiva dos peixes

ocorre no intervalo de 10-60 ppt.

Pereira e os seus colaboradores (2011) estudaram os factores para a ocorrência do parasita

em dourada em tanques de terra. No seu estudo o oxigénio dissolvido, a temperatura da água,

o pH, a biomassa de fitoplâncton tiveram uma relação significativamente negativa com a

ocorrência de A. ocellatum, enquanto a salinidade teve uma relação significativamente

positiva com presença de trofontes de A. ocellatum nas brânquias. Este estudo é o primeiro

que observa uma relação significativamente negativa entre a temperatura e a ocorrência de A.

ocellatum.

1.6.Principais hospedeiros e distribuição geográfica

Foram observadas ocorrências epizoóticas tanto em peixes selvagens, tendo sido

identificado a primeira vez na natureza em tilápias (Oreochromis mossambicus) do lago

Salton Sea (Califórnia, Estados Unidos) (Kuperman e Matey, 1999), como cultivados, assim

como peixes em aquários particulares e públicos (Francis-Floyd e Floyd, 2011). O parasita foi

ainda encontrado a parasitar uma dourada (Sparus aurata) e o monogéneo Neobenedenia

melleni que se encontrava a parasitar o peixe (Colorni, 1994).

A infecção foi tão severa em Espanha que em 2010 associações de aquacultura pediram

ajuda ao Estado para compensar as perdas devido à mortalidade causada pelo parasita (Soares

et al., 2012a). Em Portugal, o parasita foi já identificado no robalo (Dicentrarchus labrax),

dourada (Sparus saurata), sargo (Diplodus sargus) (Menezes, 2000), pregado (Psetta

maxima) (Ramos e Oliveira, 2001), rodovalho (Scophthalmus maximus) (Saraiva et al., 2011)

e corvina (Argyrosomus regius) (Soares et al., 2012b).

Na tabela 1.1 é possível observar a ocorrência de infecções provocadas pelo parasita por

todo o mundo.

6

Tabela 1.1 – Infecções provocadas por amiloodiniose registadas em peixes para consumo

humano (esta tabela contém apenas registos de infecções onde o contágio foi identificado em

fontes locais ou foi introduzido nas águas locais com o peixe. Não inclui registos de peixes

em aquários) (Noga e Levy, 2006).

Localização geográfica Hospedeiro

Golfo do México

Mississipi, Texas,

Luisiana, Florida

Robalo-muge (Morone saxatilis)

Corvinão-de-pintas (Sciaenops ocellata)

Tainha-olhalvo (Mugil cephalus)

Seraia-da-Flórida (Trachinotus carolinus)

Oceano Atlântico

Carolina do Norte

Híbrido (Morone chrysops × Morone

saxatilis)

Carta-de-verão (Paralichthys dentatus)

Carolina do Sul

Híbrido (Morone chrysops × Morone

saxatilis)

“Southern flounder” (Paralichthys

lethostigma)

Florida “Southern flounder” (Paralichthys

lethostigma)

Florida Keys Luciano (Lutjanus sp.)

Oceano Pacifico

México Bullseye puffer (Sphoeroides annulatus)

Hawaii Barbudo de seis dedos (Polydactylus sexfilis)

Iloilo Tainha (Chelon sp.)

Taiwan “Ayu” (Plecoglossus altivelis)

Austrália Roncadeira-austral (Argyrosomus japonicus)

Mar das Caraíbas

Martinica Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Isla de Margarita Sereia (Trachinotus goodei, T. carolinus)

Mar Mediterrâneo

Espanha Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Itália Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Sargo-bicudo (Puntazzo puntazzo)

Sète, França Dourada (Sparus saurata)

Israel

Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Dourada (Sparus saurata)

Sicilia Charuteiro-catarino (Seriola dumerili)

7

Mar Adriático Itália Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Mar Egeu Turquia Dourada (Sparus saurata)

Mar Vermelho Eilat

Dourada (Sparus saurata)

Robalo-legítimo (Dicentrarchus labrax)

Tainha-olhalvo (Mugil cephalus)

Tilápia (Oreochromis aureus)

Golfo Pérsico Kweit “Sobaity sea bream” (Acanthopagrus cuvieri)

1.7.Transmissão

Os animais que se movem entre os sistemas de cultura podem ser veículos portadores do

parasita transportando-o para áreas não infectadas. A infecção pode também ser transmitida

através de dinosporos em gotas de água provenientes de aerossóis (Roberts-Thomson et al.,

2006). Dada a elevada resistência do tomonte, este parasita pode ainda ser transmitido por

fómites (redes, sapatos, ferramentas comuns de limpeza, etc.) que tenham contactado com

água ou sedimentos contaminado (Abreu et al., 2005).

Os peixes mortos podem também ser um reservatório para o Amyloodinium, nos quais os

trofontes caiem para o sedimento e dividem-se sob a forma de tomontes ou podem até dividir-

se no peixe morto. Por esta razão, é aconselhável remover os peixes mortos o mais rápido

possível do sistema (Francis-Floyd e Floyd, 2011).

1.8.Diagnóstico da infecção

O quadro clínico dos animais com amiloodiniose é comum, em termos gerais, a todas as

infecções cutâneas e branquiais, pelo que é necessário identificar o agente causador pela

observação a fresco, entre lâmina e lamela, de raspagem da pele e pelo corte de filamentos

branquiais de animais moribundos ou imediatamente após a morte (Menezes, 2000).

As grandes infecções na pele são fáceis de ver em peixes de coloração escura. A olho nu,

os parasitas vêem-se melhor usando iluminação indirecta, como por exemplo uma lanterna

sob o peixe num local escuro. A coloração da pele ou tecido branquial com solução de Lugol

8

diluído também ajuda a visualizar os parasitas, uma vez que o iodo reage com o amido

presente no trofonte (Noga, 2012). É ainda possível a observação de tomontes através de

peixes infectados colocados num recipiente contendo água destilada durante alguns minutos,

os tomontes repousam no fundo do recipiente ao fim de 15 minutos (Bower et al., 1987).

Uma técnica especifica de reacção de polimerase em cadeia (PCR) é a única capaz de

detectar uma única célula de qualquer uma das 3 fases do ciclo de vida do parasita (trofonte,

tomonte, dinosporo) (Levy et al., 2007), porém esta técnica está longe de ser usada em

aquaculturas pois acarreta custos consideráveis e requer equipamento específico (Plumb,

2001).

1.9. Sinais clínicos/patologia

Este parasita que tem grande tolerância osmótica, afecta inúmeras espécies de peixes

marinhos de águas quentes, localizando-se na pele e brânquias. Sintomatologicamente o

quadro é comum a outras parasitoses cutâneas e branquiais. Esta caracteriza-se por alteração

do comportamento dos peixes (Menezes, 2000; Ramos e Oliveira, 2001), com movimentos

bruscos, saltando fora de água de boca aberta (dispneia), roçando-se nas paredes dos tanques

(prurido) e diminuição do apetite (Menezes, 2000; Ramos e Oliveira, 2001; Conroy e Conroy,

2008). Com o aumento da infecção o apetite é abolido (anorexia), acentua-se a dificuldade

respiratória e começam a surgir erosões nas brânquias e na pele, com descamação mais ou

menos extensa, observaram-se também alterações da pigmentação da pele tais como o

aparecimento de manchas de despigmentação/hiperpigmentação, congestão e erosão das

barbatanas, hipersecrecção mucosa cutânea e dilatação do ventre (Menezes, 2000; Ramos e

Oliveira, 2001). A morte é normalmente atribuída à anoxia e pode ocorrer dentro de 12 horas,

especialmente em infestações severas (Lawler, 1980 cit. Noga, 2012). Em contraste,

mortalidades agudas são por vezes associadas a infestações pequenas (por exemplo um ou

dois trofontes por filamento branquial), sugerindo que a hipoxia não é sempre a causa da

morte. A insuficiência osmorreguladora e infecções microbianas secundárias devido a severas

lesões do epitélio podem também ser importantes causas de debilitação e morte (Noga, 2012).

Em relação à prevalência do parasita no peixe, Paperna (1980) observou que as infecções

provocadas pelo A. ocellatum a juvenis e reprodutores de dourada e robalo encontram-se

predominantemente nas brânquias e tegumento da mucosa, mas em larvas encontram-se mais

na pele do que nas brânquias.

9

O único caso documentado da presença de trofontes nos tecidos e órgãos internos

aconteceu no roncador-listado-americano (Anisotremus virginicus). O mecanismo pelo qual o

parasita atingiu estas áreas invulgares não está determinado, no entanto assume-se que tenha

sido no estado de dinosporo (único estado capaz de se mover) através da faringe (Cheung et

al., 1981).

1.9.Resistência imunológica dos peixes a Amyloodinium ocellatum

Apesar da importância de A.ocellatum, sabe-se relativamente pouco sobre os mecanismos

de protecção pelos quais o peixe hospedeiro pode resistir à infecção (Smith et al., 1993).

1.9.1. Imunidade inata

Lawler (1977) (cit. Noga, 2012) observou que algumas espécies de peixes são

naturalmente mais resistentes à infecção que outras, estas são geralmente as que produzem

muco espesso ou conseguem tolerar baixos níveis de oxigénio, presumivelmente devido à

capacidade destas espécies para resistir ao ataque do parasita ao tecido epitelial. Algumas

destas espécies incluem “gulf killifih” (Fundulus grandis), enguia americana (Anguilla

rostrata), molinésia latipina (Poecilia latipinna).

A superfície do corpo é a primeira linha de defesa e é uma importante barreira contra a

fixação e penetração pelos parasitas. Algumas secreções da pele contêm lisozimas que podem

danificar a superfície da membrana dos parasitas, enquanto outros (por exemplo, muco)

bloqueiam a adesão de parasitas às células epiteliais e eliminam-nas mais tarde (Woo, 2007).

Landsberg e os seus colaboradores (1992) observaram que a infecção de A. ocellatum numa

cultura celular foi significativamente reduzida após exposição a muco e soro de tilápias (O.

aureus) que nunca tinham sido infectadas. No entanto, o muco teve, consideravelmente, uma

menor actividade inibitória, pelo menos para esta espécie. Para além do soro, a pele, as

brânquias e o baço da truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e do híbrido “striped bass” têm

proteínas letais para o A. ocellatum (Noga et al., 2001). A informação da espectrometria de

massa e da sequência de aminoácidos sugere que estas proteínas estão muito relacionadas

com a histona H2B e a histona H1, por este motivo são designadas de proteínas do tipo das

histonas (HLPs). Estas HLPs são pequenas (13-21kDa) e a maioria da sua actividade

antibiótica encontra-se na epiderme, contudo alguma dessa actividade está presente no muco.

10

Existe a evidência experimental que a actividade destas proteínas é dirigida contra o estado

trofonte (alimentação) do parasita, enquanto o dinosporo não é afectado. Esta toxicidade

preferencial para trofontes não é comum quando comparada com outras drogas típicas usadas

para tratar a amiloodiniose (por exemplo, cobre e formalina), as quais normalmente têm como

alvo os dinosporos (Noga et al., 2001). O mecanismo responsável pela toxicidade das HLPs

contra o Amyloodinium não é conhecido (Noga et al., 2001). No entanto o principal sítio de

acção da maioria dos endobioticos pensa-se que seja no plasma da membrana, onde estes

causam a formação de um poro ou a lise da membrana (Hancock e Lehrer, 1998). Por outro

lado, foi demonstrado que o magainin2, um antibiótico produzido na pele do sapo africano

(Xenopus laevis), é igualmente tóxico tanto para trofontes quanto para dinosporos (Noga et

al., 2001).

Recentemente foi descoberto o efeito antiparasitário da piscidina tipo 2 contra

ectoparasitas protozoários. Porém a eficácia da piscidinia 2 sintetizada em laboratório foi

baixa contra o A. ocellatum, propagado continuamente in vitro, quando comparada com

ectoparasitas dulçaquícolas (Colorni et al., 2008).

1.9.2. Imunidade adquirida

Até ao momento, não existem vacinas comerciais disponíveis para o tratamento de

parasitas protozoários de peixes, incluindo dinoflagelados (Woo, 2007). Contudo, recentes

estudos têm identificado importantes mecanismos de defesa contra o A. ocellatum. Paperna

(1980) não observou surtos de hiperinfecção de grupos de peixes sobreviventes de epizootias

anteriores.

Estudos examinando a resposta humoral do parasita demonstraram que o soro de O.

aureus imunizadas com antigénios vivos ou sonicados de dinosporos produziram uma

resposta anticorpo específica que foi detectada pelo método ELISA. A resposta humoral não

foi detectada após 8 semanas da primeira imunização com dinosporos sonicados, mas após

uma dose intensificadora à 9ª semana, a resposta aumentou e teve um pico à 12ª semana. Ao

longo das seguintes 6 semanas os anticorpos diminuíram, mas a resposta continuou a ser

positiva até à 18ª semana, quando terminou a experiência (Smith et al., 1992). Igualmente, o

soro de tilápias azuis (Oreochromis aureus) imunizadas intraperitonalmente com dinosporos

de A. ocellatum diminuiu a motilidade e a capacidade de infectar de dinosporos vivos e o

crescimento de trofontes em culturas celulares (Smith et al.,1993).

11

Outros estudos experimentais em Amphiprion frenatus demonstraram que o peixe

desenvolve uma forte acção de imunidade contra infecções do parasita após repetidas

exposições não-letais e que os anticorpos específicos estão associados a essa resposta (Cobb

et al., 1998). Também Cecchini e os seus colaboradores (2001) observaram que alguns

robalos desenvolvem uma resposta imunológica adaptativa contra o parasita. Os resultados

mostram uma imunidade adquirida contra o A. ocellatum, podendo os peixes desenvolver uma

resistência parcial contra novas infecções do dinoflagelado.

1.10. Profilaxia e Tratamento (químico, físico e biológico)

O controlo de surtos de amiloodiniose é uma das principais preocupações em

mariculturas. Quando é diagnosticado, é necessária uma intervenção rápida, nomeadamente

na implementação de um tratamento eficaz contra o Amyloodinium ocellatum e seguro para o

peixe, de forma a evitar uma rápida perda de “stock” (Ramos e Oliveira, 2001).

Apesar da forma livre (dinosporo) ser susceptível à quimioterapia (Lawler, 1980, cit.

Noga, 2012), o estado parasitário (trofonte) e o estado encapsulado (tomonte) são resistentes.

O método mais comum de tratamento em controlo e eliminação do parasita é o cobre sob a

forma de sulfato de cobre – um químico largamente utilizado em agricultura (Soares et al.,

2012a). Após o desalojamento dos trofontes dos tecidos do hospedeiro, o processo de

encapsulação e divisão ocorre normalmente até à esporulação porque a parede da célula limita

a entrada de iões cobre. Na esporulação, os dinosporos são expostos ao efeito citotóxico do

cobre, deste modo interrompe-se o ciclo de vida do parasita (Paperna, 1984b). Segundo

Canosa (2006) os tratamentos com cobre devem durar 10-14 dias para controlar a doença, a

uma concentração de 0,12-0,2 mg.l-1

. No entanto, Vaz (2010) ao expor juvenis de sargo

(Diplodus sargus) a 0,2 mg.l-1

, 0,5 mg.L-1

e 1 mg.L-1

durante 23 dias e 0,25 mg.L-1

e 0,5

mg.L-1

durante 60 dias, observou evidências do efeito tóxico durante a exposição ao sulfato de

cobre, com um aumento da concentração de cobre no fígado acompanhada por alterações

morfológicas nos peixes.

Todos os agentes (formalina (25-200 ppm), Nitrofurazone (10-50 ppm) e Furanace (0.1-

10 ppm)) utilizados por Paperna (1984a) no controlo do parasita induziram um efeito gradual

inibitório na taxa de divisão dos tomontes.

12

Os juvenis de tainha-olhalvo (Mugil cephalus) tratados durante 30 minutos com 25ppm de

peróxido de hidrogénio não foram afectados negativamente por esta concentração e o mesmo

tratamento permitiu parar um surto de amiloodiniose (Montgomery-Brock et al., 2000). Num

estudo similar com Polydactylus sexfilis, apenas um tratamento com peróxido de hidrogénio a

75 ou 150 ppm durante 30 minutos foi eficaz a eliminar trofontes das brânquias sem causar

perdas de peixes (Montgomery-Brock et al., 2001). Também Cruz-Lacierda e os seus

colaboradores (2004) realizaram tratamentos de 1h de água doce e 200 ppm de H2O2 em

Chanos chanos e Lutjanus argentimaculatus, os quais foram eficazes na eliminação do

parasita e não tiveram qualquer efeito adverso sobre o peixe.

Muitos outros tratamentos químicos foram testados contra o A. ocellatum, como por

exemplo 3,N-metilglucamina (Oestmann e Lewis, 1996), formalina (Paperna, 1980; Paperna,

1984a) ou até mesmo tratamentetos homeopáticos (Santos, 2011), porém a maioria tem

demonstrado limitações ou nenhum sucesso contra a amiloodiniose.

O A. ocellatum tolera um intervalo de temperatura e salinidade muito grande, o que torna

o controlo desta doença pela manipulação dos parâmetros químicos e físicos muito difícil

(Soares et al., 2012a). No entanto, é possível a inibição do crescimento do parasita reduzindo

a temperatura e a salinidade (Paperna, 1984a). A colocação de peixes em água doce causa o

desalojamento da maioria dos trofontes (Bower et al., 1987), porém as medidas com base na

redução da salinidade não podem ser facilmente e rapidamente aplicadas em tanques de terra

e em espécies que não toleram variações de salinidade elevadas, como a maioria das espécies

de aquacultura no sul da Europa (Soares et al., 2012a). Recentemente, um estudo de Pereira et

al. (2011) referiu que a manutenção da qualidade da água com uma definição da densidade do

stock poderá evitar infecções na dourada.

Para além do controlo químico e físico, foi ainda testado em laboratório o controlo

biológico com Artemia spp. (Oestmann et al., 1995) e ostras (Crassostrea gigas) (Severino,

2008) sob os dinosporos. Uma ênfase nos tratamentos biológicos poderá contribuir para o

aumento da qualidade dos produtos de pisciculturas (Soares et al., 2012a).

Em termos de prevenção da introdução do parasita no sistema devem ser tomadas medidas

de profilaxia em tanques de aquacultura: os peixes devem ser tratados em diferentes tanques

para evitar a formação de tomontes nos tanques de cultivo; tanques onde os peixes mostrem

sintomas da doença, deve ser removido o biofilme através de escovação e uso de ácido

clorídrico; a abundância de tomontes e o seu estado de desenvolvimento deve ser

monitorizado no biofilme do fundo dos tanques; a presença de trofontes ou tomontes em

peixes vivos dados como alimento deve ser controlada, os tanques devem ser separados e o

13

equipamento isolado para evitar cruzamento da contaminação (Abreu et al., 2005). Pode ainda

reduzir-se o risco de introduzir dinosporos no sistema de uma aquacultura através de

desinfecção (por exemplo, radiação ultravioleta, ozono ou cloro) na entrada da água (Lawler,

1977 cit. Noga, 2012). No entanto, estas práticas são difíceis de aplicar em tanques de terra.

1.11. Aplicações de antimaláricos em aquacultura

Carol Bower verificou que o antimalárico difosfato de cloroquina é seguro e efectivo a

tratar a amiloodiniose de peixes palhaços (Amphiprion ocellaris) infectados. A cloroquina foi

o primeiro fármaco de síntese utilizado para o tratamento da Malária (Brunton et al., 2006).

Após 10 dias expostos a um único tratamento aquoso de 5-10mg/L de difosfato de cloroquina

não houve efeito na divisão dos tomontes, mas os dinosporos morreram imediatamente a

seguir ao seu encistamento. Esta concentração não é tóxica para o peixe, mas é altamente

tóxica para micro e macroalgas e vários invertebrados (C.E Bower, Connecticut, comunicação

pessoal cit. Noga, 2012) e não pode ser usada em tanques de recife, pelo menos como fórmula

aquosa.

A farmacocinética da cloroquina administrada por via oral em corvinão-de-pintas

(Sciaenops ocellata) produzido em cativeiro, poderia parecer uma forma efectiva como

medicamento oral (Lewis et al., 1988). Contudo, a cloroquina é muito cara e não é susceptível

de ser aprovada para uso em peixes para alimentação (Noga e Levy, 2006; Noga, 2012).

Xenobióticos (Cicloheximido, desferrioxamino, 2,2-bipiridil, pirimetamina, sulfadiazina,

ciprofloxacina, cloroquina, artimisinina, atovaquone) conhecidos pelas suas propriedades

antimaláricas e antiprotozoárias foram testados contra o Perkinsus olseni, um parasita que

afecta as culturas de amêijoa e no qual o Fe (II) é essencial na sua proliferação. Destes, apenas

o desferrioxamino foi efectivo na redução das infecções in vivo (Elandalloussiet et al., 2005).

Recentemente surgiu uma nova classe de antimaláricos, os endoperóxidos (figura 1.2).

Segundo Delves et al. (2012), os endoperóxidos podem ser aplicados em testes de fármacos

contra outros patogénicos com ciclos de vida complexos.

14

Figura 1.2 – Endoperóxidos antimaláricos (1- artimisinina, 2- trioxalano OZ439, 3-

tetraoxano) (O’Neill et al., 2010).

2. Objectivos

O principal objectivo deste estudo foi a caracterização dos efeitos de fármacos

endoperóxidos sintéticos no desenvolvimento e patogenicidade do parasita A. ocellatum, com

o intuito de inibir a produção de estados infestantes. Devido ao seu ciclo de vida, com uma

fase enquistante, a erradicação deste parasita ainda não é possível. A descoberta de métodos

que permitam o tratamento dos animais, quer por destruir os estados iniciais do parasita quer

por criar resistência no hospedeiro, ou pela eliminação dos quistos dos tanques, tem grande

valor para a indústria.

Numa primeira fase foram testados fármacos in vitro sob a fase de tomonte (quisto), de

modo a perceber qual(ais) o(s) endoperóxido(s) que tem efeito na divisão do parasita.

Enquanto numa segunda fase foram realizados ensaios in vivo com o objectivo de avaliar a

eficácia dos diferentes endoperóxidos quando administrados sob a forma de vacina oral sobre

o controlo do Amyloodinium em douradas, através da avaliação da eficácia, prevalência e

incidência parasitária.

15

Material e Métodos

A infecção e obtenção de Amyloodinium ocellatum realizaram-se tanto no Laboratório

Experimental para Organismos Aquático (LEOA) da Faculdade de Ciências e Tecnologia da

Universidade do Algarve, como no laboratório da Piscicultura do Vale da Lama, Lda.

Os ensaios in vitro e bioquímicos foram realizados no laboratório de Fisiologia

Adaptativa e Bioquímica do Grupo de Investigação em Endocrinologia Comparativa e

Molecular do Centro de Ciências do Mar (CCMAR), enquanto o ensaio in vivo decorreu no

laboratório da Piscicultura do Vale da Lama, Lda.

3.1. Espécies – alvo

Foram utilizados neste estudo peixes da espécie robalo (Dicentrarchus labrax) e

dourada (Sparus aurata). Estas espécies são produzidas na piscicultura e os seus ciclos de

vida, bem como os requisitos alimentares são bem conhecidos, deste modo a sua manutenção

em cativeiro e o seu manuseamento são de fácil execução. Todos estes factores são vantajosos

na escolha de um organismo modelo, e neste caso, a fácil disponibilidade, a sua importância

comercial bem como o vasto conhecimento que existe sobre as espécies, e o facto de serem o

principal alvo do parasita na indústria de aquacultura em Portugal foram determinantes para a

escolha destes espécimes como modelos experimental neste estudo.

3.2. Infecção dos peixes

Para o início e propagação da infecção dos peixes, com o intuito de obter parasitas

para os ensaios, foram realizados dois métodos, um utilizando sedimento com parasitas e

outro através de lavagem com água doce de peixes infectados.

O sedimento infectado foi utilizado para obter parasitas para os ensaios in vitro. Este

método consistiu em colocar peixes em aquários montados com sedimento proveniente de

tanques terra onde ocorreram surtos de Amyloodinium ocellatum, água salgada, arejamento

constante e termóstato. A temperatura foi aumentada gradualmente até aproximadamente

24ºC.

16

O outro método consistiu em lavar com água doce as brânquias e o tegumento de

peixes infectados e adicionar a água da lavagem a aquários onde se encontravam peixes.

3.3. Diagnóstico da infestação

O diagnóstico da infecção adaptado de Francis-Floyd e Floyd (2011) consistiu em

retirar o peixe do aquário com um camaroeiro e coloca-lo sob uma superfície plana não

abrasiva. Os olhos foram tapados para manter o peixe quieto enquanto se realizou a biópsia.

O material recolhido para biópsia foi uma pequena quantidade de filamentos

branquiais de modo a não ser um método letal para o peixe. Os animais não foram

anestesiados pois de acordo com Francis-Floyd e Floyd (2011) os anestésicos podem causar o

desalojamento do parasita do peixe, o que poderia resultar em falsos negativos aquando da

observação do material sob a luz do microscópio.

Para a realização de uma biópsia às brânquias, o opérculo foi levantado

cuidadosamente e com uma tesoura pequena foram cortadas as pontas dos filamentos

branquiais e logo de seguida colocadas numa lâmina, adicionada água salgada e colocada uma

lamela.

A observação ao microscópio foi realizada logo após a conclusão da preparação a uma

ampliação de 100x num microscópio Olympus CH2 ou num BMS - E1, consoante o

diagnóstico tenha sido realizado no Laboratório Experimental para Organismos Aquático

(LEOA) ou no laboratório da Piscicultura do Vale da Lama, Lda.

3.4. Recolha de parasita

O método inicialmente utilizado para isolar os parasitas dos peixes infectados (tabela

3.1) foi adaptado de Bower et al. (1987). Para remover os trofontes, os peixes infectados

foram capturados com camaroeiro e colocados num gobelé de 750 ml, cheio até metade com

água destilada. Após cerca de 5 minutos os peixes foram colocados de volta no aquário. A

suspensão de tomontes passou uma vez por filtros de 200 e 150 µm para filtrar pequenos

grãos de areia e outras impurezas que ficaram na suspensão quando os peixes foram

colocados no gobelé e deixada a repousar durante 20 min para os tomontes precipitarem.

Realizaram-se mais 2 lavagens com água destilada e 2 com água salgada filtrada (33 ppt).

17

Entre cada lavagem os tomontes foram deixados a repousar no fundo do gobelé durante 15-

20min e a água removida por sinfonagem através de uma pipeta de Pasteur ligada a uma

bomba de vácuo. Após a última lavagem fez-se a contagem de tomontes utilizando uma

câmara de Bürker. O método de isolamento do parasita (tabela 3.1) foi adaptado de Roberts-

Thomson et al. (2006) e passou a consistir em remover os trofontes das brânquias através de

jactos de água destilada para caixas de Petri. Sob a luz reflectida de uma lupa binocular Zeiss

Stemi DV4 agitou-se a placa de Petri de modo a concentrar no centro os tomontes. Os

tomontes foram recolhidos com uma micropipeta, de modo a minimizar a área de exposição,

para um frasco contendo água salgada (50ppt) sobre gelo. O gelo serviu para evitar que os

tomontes iniciassem o processo de divisão e a água salgada serviu para manter a salinidade a

cerca de 35ppt – importante da viabilidade dos tomontes (Paperna, 1984b) - pois ao

pipetarem-se os tomontes da caixa de Petri pipeta-se sempre uma pequena quantidade de água

doce. Após serem lavadas as brânquias dos peixes infectados, o frasco foi agitado e

pipetaram-se 1 ou 2µl de volume 3 vezes para uma lâmina para contar através do microscópio

a uma ampliação de 50x o número de tomontes e deste modo determinar a concentração de

tomontes isolados.

Tabela 3.1 – Isolamentos de tomontes (não inclui isolamentos fracassados).

Isolamento Local Nº

peixes Espécie

Técnica de

isolamento

Material de

contagem

13-01-

2012 LEOA 7 Robalo Bower et al. (1987) Câmara de Burker

25-01-

2012 LEOA 3 Robalos Bower et al. (1987) Câmara de Burker

28-01-

2012 LEOA 3 Robalos Bower et al. (1987) Câmara de Burker

04-02-

2012

Aqualvor,

Lda 9 Robalos Bower et al. (1987) Câmara de Burker

24-04-

2012 LEOA 3 Douradas Bower et al. (1987) Câmara de Burker

28-04-


04-05-


10-05-


17-05-


18

23-05-

2012

Aqualvor,

Lda 10 Robalos Lavagem brânquias Lâmina

04-06-

2012

Aqualvor,


18-06-

2012

Aqualvor,


13-07-

2012

Aqualvor,


21-07-

2012

Aqualvor,


29-07-

2012

Aqualvor,


15-09-

2012

Aqualvor,


3.5.Fármacos

Os fármacos utilizados no ensaio foram endoperóxidos sintetizados pelo Grupo de

Síntese e Reactividade Orgânica do Centro de Ciências do Mar. Este tipo de fármacos foi

seleccionado uma vez que alguns autores defendem que podem ser utilizados no combate a

outros patogénicos com um ciclo de vida complexo (Cristiano, 2012; Delves et al., 2012),

como é o caso do Amyloodinium ocellatum.

Os endoperóxidos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) - um composto

muito usado como solvente aprótico e polar em laboratório e na indústria (Vignes, 2000) – e

conservados a 4ºC. A concentração final, nominal, em milimolar (mM) das soluções-mãe foi

de 100 mM (LCD67A, LC50, NAD16, NAD17 e NAD19), 75 mM (LCD95) e 50mM

(LCD93 e NAD11). No entanto, devido às suas propriedades fisico-químicas, a dissolução

destes fármacos, mesmo em DMSO, é difícil. Assim, e também por uma limitação logística

do número de ensaios possíveis e animais necessários, daqueles 8 endoperóxidos fornecidos

(tabela 3.2), optou-se por testar apenas os 4 (LCD67A, LCD93, NAD17, NAD19) cuja

dissolução ocorreu sem qualquer dificuldade.

19

Tabela 3.2 – Endoperóxidos fornecidos pelo Grupo de Síntese e Reactividade Orgânica.

Nome Formula Estrutura molecular

Massa

molecular

(g/mol)

LC50 C16H22O4

278,34

LCD67A C19H28O5

336,42

LCD93 C17H26O4

294,39

LCD95 C17H27NO3

293,4

NAD11 C16H24O3

264,36

NAD16 C20H30O5

350,45

NAD17 C18H26O5

322,40

NAD19 C22H33NO4

377,52

20

3.6.Ensaios in vitro

Cada ensaio in vitro iniciou-se a partir de um inóculo de concentração conhecida

(tomonte/µL) de parasita, do qual pipetou-se 200 µl de amostra para uma placa de 96 poços.

A placa de poços foi colocada à temperatura ambiental do laboratório, controlada para 24ºC,

no interior numa câmara com entrada de ar atmosférico e contendo água destilada no fundo de

forma a reduzir a evaporação nos poços.

Os tomontes incubados foram examinados diariamente usando um microscópio

Olympus CH2 e o número de tomitos por tomonte (t/T) registado. Os ensaios continuaram à

temperatura ambiente e a uma salinidade de 33 ppt até se observar o estado de dinosporo em

pelo menos um dos poços.

3.6.1. Observação do ciclo de vida do parasita

Na primeira parte dos ensaios in vitro observou-se o ciclo de vida do parasita de um

inóculo que após o isolamento foi incubado numa placa de poços à temperatura ambiente e de

outro inóculo que esteve 1 dia a 4ºC, com o objectivo de observar se existem diferenças no

ciclo de vida do parasita quando os inóculos com parasita após isolamento são armazenados a

baixas temperaturas. Foram adicionados 0,5ml de água salgada não esterilizada a cada um dos

inóculos de 1ml de parasita e seguidamente distribuídos em triplicado numa placa de poços. O

início da monitorização do ciclo de vida do parasita foi às 36 h após a inoculação e depois

passadas 4h e 12h até às 76h, pipetando 3 amostras de cada poço em cada contagem.

Na monitorização do ciclo de vida do parasita realizou-se uma classificação ao seu

ciclo de vida (tabela 3.3), optando-se por acrescentar estados intermédios entre as divisões do

tomonte pois durante os ensaios in vitro observou-se que a divisão dos tomitos dentro do

tomonte não era sincronizada. Para além disso, -aplicou-se um índice de desenvolvimento do

parasita, através da utilização de uma pontuação para cada estado do ciclo de vida do parasita

(tabela 3.3). O valor final do índice corresponde à soma dos produtos da frequência de células

contadas nas três pipetagens para cada estado de desenvolvimento do parasita pela pontuação

dada a cada estado. Esta abordagem é semelhante a outras previamente utilizadas noutros

estudos sobre a saúde de peixes (Landsberg et al., 1998), e permite a comparação dos efeitos

dos vários fármacos e diferentes concentrações sobre o desenvolvimento.

21

Tabela 3.3 – Classificação do estado do ciclo de vida do parasita.

Estado do ciclo de vida da

célula Características

Pontuação

Célula com a morfologia de

um dinoflagelado com dois

flagelos

12

Tomito com a capsula lisada 11

Tomonte na 6ª divisão com

32 tomitos

10

Tomonte entre a 5ª e a 6ª

divisão

9

Tomonte na 5ª divisão com

16 tomitos

8


divisão

7

Tomonte na 4ª divisão com 8

tomitos

6


divisão

5

Tomonte na 3ª divisão com 4

tomitos

4


divisão

3

Tomonte na 1ª divisão 2

Tomonte que não sofreu

divisão

1

22

3.6.2. Exposição aos endoperóxidos

Os 4 endoperóxidos seleccionados foram testados em diferentes concentrações (Tabela

3.4) sob a divisão dos tomontes. Cada fármaco foi testado em triplicado e comparado com um

conjunto triplicado de controlo não tratado e outro tratado com solvente. O volume de

solvente (dimetilsulfóxido) testado em poços com 200µl de solução contendo parasitas foi

igual ao volume máximo de endoperóxido utilizado nesse ensaio (tabela 3.4) de modo a

verificar se o solvente tem influência na divisão do parasita.

Tabela 3.4 – Doses (mM) de endoperóxidos e volumes de DMSO (µl) testados.

Endoperóxido Concentração (mM) Volume de DMSO (µl)

NAD17

0,1 2

1 2

2 1

NAD19

0,01 20

0,05 20

0,1 20

0,25 20

1 2

2 1

LCD93 0,1 4

1 40

LCD67A 1 2

2,5 5

23

3.7. Ensaio in vivo

O ensaio in vivo decorreu ao longo de 42 dias (figura 3.1), durante o qual decorreu

aclimatização, tratamento oral, infecção dos peixes e amostragens.

Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Aclimatização

Tratamento oral

Infecção

Amostragem

Dia 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Aclimatização

Tratamento oral

Infecção

Amostragem

Figura 3.1 – Cronograma das etapas do ensaio in vivo.

3.7.1. Tratamento

A administração dos endoperóxidos aos peixes realizou-se através de tratamento oral,

pois este requer menos trabalho que os tratamentos através de banhos, além disso o peixe

pode ser tratado como parte do seu normal regime de alimentação (Grant, 2002) e a

quantidade de fármaco a utilizar é menor. Para além das vantagens anteriores, os tratamentos

orais têm ainda como vantagens serem de fácil administração e não existir necessidade de

mão-de-obra. Este processo não garante que todos os peixes recebam a mesma dose de

tratamento, contudo durante o período do ensaio os peixes foram monitorizados regulamente

para assegurar que a ração era consumida (Tojo e Santamarina, 1998).

Foram testados 4 endoperóxidos (NAD17, NAD19, LCD93, LCD97A) a uma

concentração de 10µmol/kg de ração, utilizou-se ainda dois grupos de controlo como nos

ensaios in vitro (ração sem tratamento e ração tratada com solvente dos fármacos) a um

volume igual ao usado na ração tratada com endoperóxidos. Cada fármaco (já previamente

24

dissolvido em DMSO) foi novamente dissolvido em 30ml de etanol 100% e vaporizado sobre

um tabuleiro contendo ração usando um pulverizador. A preparação da ração realizou-se

semanalmente.

A percentagem de alimento fornecido foi de 2% do peso médio vivo dos peixes para

cada aquário.

O período de exposição ao tratamento foi de 42 dias, com o objectivo de verificar

palatibilidade, mortalidade e eficácia do tratamento.

3.7.2. Circuito experimental

O ensaio in vivo foi realizado em sistema de circuito fechado, composto por 24

aquários de plástico com capacidade de 120L, dispostos em paralelo (figura 3.2). O sistema

existente na piscicultura funciona em duplicado, ou seja, existem dois tanques aos quais se

aplica o mesmo tratamento. Cada aquário comunicava com um aquário mais pequeno

disposto ao lado que continha um escumador, um sistema de bombagem de água e um sistema

de filtragem mecânica (manta acrílica) e biológica (biobolas).

Antes de entrar no sistema, a água foi bombeada da Ria de Alvor para reservatórios,

junto ao laboratório, onde a água é filtrada mecanicamente e desinfectada com ozono e UV.

Devido ao sistema funcionar em circuito fechado, verificou-se uma acumulação de

detritos orgânicos provenientes dos restos de alimento e do próprio metabolismo do peixe,

deste modo a água foi renovada a 100% até ao 15º dia, a partir do qual a renovação da água

passou a ser de 40% pois a qualidade da água é importante para o Amyloodinium infectar os

peixes (Pereira et al., 2011).

O arejamento e o fotoperíodo foram mantidos constantes ao longo de todo o ensaio em

todos os tanques. A iluminação foi garantida por lâmpadas flora fluorescente tubular,

dispostas no tecto da sala, de modo a abranger todo o circuito experimental.

A temperatura da sala foi controlada por um aparelho de ar condicionado junto à

entrada da sala de ensaio. Ao 25ºdia de ensaio foram distribuídos dinoflagelados pelos 12

primeiros tanques e a temperatura foi aumentada de 21ºC para 26ºC, para potenciar a infecção

do parasita.

25

Figura 3.2 – Circuito experimental.

3.7.3. Animais-alvo

Para o ensaio in vivo foram utilizados 360 juvenis de douradas provenientes de uma

maternidade de França, com um peso inicial de 18,58 ± 3,27 g (média ± D.P). Os animais

foram lavados em água doce e alguns amostrados para garantir que os mesmos não se

encontravam infectados com A. ocellatum.

Após a pesagem foram distribuídos 15 peixes por aquário pelos 24 aquários do ensaio.

Tiveram um período de aclimatização para se adaptarem às condições experimentais (tipo de

alimentação, regime alimentar, qualidade da água, fotoperíodo, densidade e manutenção dos

tanques) de 13 dias.

No início do ensaio, os peixes foram alimentados duas vezes por dia com uma ração

comercial “AquaGold 5” 2 mm (Aquasoja, SORGAL, S.A., Ovar, Portugal) a uma taxa de 3%

do peso vivo médio do peixe. Ao fim de 12 dias os peixes passaram a ser alimentados com

ração tratada (tabela 3.5) a uma taxa de 2% do peso vivo médio dos peixes em cada tanque.

Os peixes mortos, foram removidos do tanque, dissecados e inspeccionados para

confirmar se se encontravam infectados com A. ocellatum (Masson et al., 2011).

26

Tabela 3.5 – Tratamento por tanque.

Composto Tanques

Controlo 1;2;13;14

DMSO 3;4;15;16

NAD19 5;6;17;18

NAD17 7;8;19;20

LCD93 9;10;21;22

LCD67A 11;12;23;24

3.7.4. Infecção dos animais-alvo

Os dinosporos utilizados no ensaio in vivo foram os obtidos do isolamento de dia 15-

09-2012 (tabela 3.1). Após o isolamento, descrito anteriormente, os tomontes foram

colocados num frasco com um volume de água salgada artificial de 24 ml. Os tomontes foram

incubados a 26 ºC e 35 ppt durante 72h, tempo aproximado que o parasita atinge o estado de

dinosporo (Oestmann e Lewis, 1995). Todos os dias foi pipetado 1 µl do volume de água

contendo o parasita para uma lâmina e observado ao microscópio com o objectivo de

acompanhar o desenvolvimento do parasita e obter a concentração aproximada de dinosporos.

Após as 72 h, foram distribuídos por 12 tanques, 2 ml da suspensão de dinosporos (±667

dinosporos). De modo a detectar a presença do parasita, após 5 dias de se ter realizado a

infecção, foi cuidadosamente examinado um peixe por tanque através de raspagem do

tegumento e observada sob luz do microscópio.

3.7.5. Amostragem biológica

Realizaram-se duas amostragens, a primeira foi realizada ao 7º e 8º dias de infecção

com dinosporos amostrando-se 6 peixes, enquanto a segunda realizada ao 18º dia amostraram-

se os restantes peixes.

Em ambas as amostragens, o volume da água do tanque foi reduzido para 50 % do

volume total e os peixes capturados com um camaroeiro. Os animais não foram anestesiados

pois poderia haver falsos negativos (Floyd e Floyd, 2011).

27

Após a pesagem, foram recolhidos 300 µl de sangue de 4 peixes por punção caudal

com seringas de 1 ml heparinizadas e seguidamente sacrificados por corte da coluna. O

sangue recolhido foi colocado em tubos eppendorf, devidamente identificados. O plasma

sanguíneo foi separado por centrifugação (11500g) e colocado em tubos eppendorf

identificados e imediatamente congelados.

A todos os peixes amostrados foram cortados filamentos do segundo arco branquial

aos quais se adicionou água salgada a 33ppt. A lâmina montada com filamentos branquiais foi

observada sob a luz do microscópio BMS - E1, anotou-se o número de trofontes em 20

filamentos a uma ampliação 100x.

Na segunda amostragem foi retirado um arco branquial com uma tesoura de pontas

finas de 3 peixes de tanques que não receberam tratamento e de peixes que receberam o

fármaco NAD19. Cada arco branquial foi colocado num tubo eppendorf identificado com

tampão SEI (150 mM sacarose, 10 mM EDTA, 50 mM imidazole, pH 7.3) e congelado para

posterior medição da actividade Na+/K

+ - ATPase.

Foram ainda amostrados 5 peixes de 3 tanques de terra com animais que recuperaram

de infecção de A. ocellatum, peixes que nunca foram infectados e peixes infectados. O plasma

recolhido destes peixes foi congelado em azoto líquido a -80ºC.

O transporte das amostras da piscicultura até ao laboratório de Fisiologia Adaptativa e

Bioquímica do Grupo de Investigação em Endocrinologia Comparativa e Molecular do

CCMAR foi efectuado em caixas isotérmicas de transporte de peixe com gelo em escamas.

3.7.6. Análises bioquímicas

O plasma é uma fracção de fluido de sangue que contém sais e proteínas dissolvidas

que fornecem dados sobre o bem-estar animal. As análises bioquímicas realizadas ao plasma

foram: medição da osmolaridade, quantificação do cloro, glucose, proteína e cortisol, e aos

arcos branquiais medição da actividade Na+, K

+ - ATPase.

As amostras recolhidas foram descongeladas no dia das análises.

3.7.6.1.Análises ao plasma

Os níveis de cortisol no plasma foram determinados pelo radioimunoensaio (RIA)

descrito por Rotllant e os seus colaboradores (2005). As amostras de plasma foram diluídas

28

em tampão SEI e desnaturadas a 70ºC durante 30 minutos. Preparou-se a curva-padrão através

de uma concentração conhecida de cortisol. Pipetou-se 100 µl de amostra em duplicado,

adicionou-se 100 µl de solução anticorpo/marcador ([3H]-cortisol+anticorpo+tampão gelatina)

e incubou-se a 4ºC durante a noite. Após incubação adicionou-se 250 µl de carvão activado

com excepção do tubo total (indica a actividade total em cada tubo), sempre sobre gelo sem

ultrapassar 12 minutos entre a primeira e a última amostra. Centrifugou-se a 2000 rpm

durante 12 minutos a 4ºC e o sobrenadante transferiu-se para tubos de cintilação aos quais se

adicionou 4 ml de líquido de cintilar.

A medição da osmolaridade do sangue providência informação funcional e essencial

para entender o estado de osmorregulação do peixe (Bodinier et al., 2010), tendo sido medida

num osmómetro de pressão de vapor (WESCOR 5520).

A concentração de proteína no plasma foi determinada pela diluição do plasma 1:40 e

medição da concentração de proteína usando uma variante em “kit” comercial (BIORAD) do

método Bradford (1976) adaptado a placa de 96 poços. A curva padrão foi realizada com uma

concentração conhecida de albumina de soro bovino (BSA) (2mg/ml) e a absorbância lida a

595 nm.

A quantificação da glucose e do cloro foi medida com kits comerciais de Spinreact

(Sant Esteve de Bas, Espanha) adaptados a placas de 96 poços. Para ambos preparou-se a

curva-padrão através de uma concentração conhecida de glucose (20 mM) e cloreto de sódio

(200 mM). Pipetou-se 2,5 µl de cada concentração da curva-padrão em triplicado, do padrão

do kit e das amostras em duplicado. Aos poços adicionou-se 250 µl de reagente e deixou-se a

incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Através do espectofotómetro leu-se a

absorbância a 505 nm para a glucose e a 480 nm para o cloro. O declive da curva-padrão

permitiu calcular a concentração de cada composto em mmol/L.

3.7.6.2. Medição da actividade Na+, K

+ - ATPase nas brânquias

A actividade de Na+ / K

+ ATPase das brânquias foi determinada segundo o método

McCormick (1993) adaptado para peixes não-salmonideos. Após descongelar, cortou-se uns

três filamentos branquiais e homogeneizou-se em 125 µl de tampão SEI. A mistura foi

centrifugada a 5000g durante 2 minutos a 4ºC. Pipetou-se 10 µl dos homogeneizados em

quadriplicado para uma placa de 96 poços. Cada amostra tinha 2 poços contendo uma mistura

29

com oubaina (0,5 mM) e outros 2 contendo uma mistura sem oubaína, um inibidor específico

da actividade de Na+ / K

+ ATPase. Mediu-se cinemticamente durante 10 minutos a 25ºC e a

um comprimento de onda de 340 nm num espectofotometro.

A actividade ATPase foi detectada por acoplamento enzimático de desfosforilação de

ATP para a oxidação de NADH e expressa em µmol ADP mg proteína-1

hora-1

(Laiz-Carrión

et al., 2005).

3.8.Análise estatística

Para cada tratamento foi calculada a abundância média, a taxa de prevalência de

parasitas nas brânquias adaptado de Bush et al (1997) e a eficácia adaptada de Stone et al.,

(2000), como se segue:

Abundância média = (número total de parasitas observados em 20 filamentos

branquiais/número de peixes examinados);

Taxa de prevalência (%) = (número peixes parasitados/ número de peixes examinados)

x 100;

% Eficácia= 100 – (100 x (média da abundância de parasitas no grupo de

tratamento/media da abundância de parasitas no grupo de controlo)).

As diferenças estatisticamente significativas entre infectados e não infectados para o

mesmo tratamento e amostragem foram estadas através do teste t-Student. Utilizou-se ainda o

teste t-Student para verificar diferenças estatisticamente significantes entre infectados/não

infectados do mesmo tratamento entre amostragens. Para averiguar se existiam diferenças

significativas entre tratamentos para infectados/não infectados na mesma amostragem

aplicou-se uma análise de variância (ANOVA) em ranks seguindo-se o teste Kruskal-Wallis

para a osmolaridade, glucose e proteína e para o cloro foi através de uma ANOVA de um

factor. Através do teste de Pearson testou-se a relação entre o número de trofontes observados

em 20 filamentos branquiais para cada uma das medições realizadas ao plasma. Todos os

procedimentos estatísticos foram efectuados nos programas informáticos Microsoft Excel® e

SigmaPlot v.15 para Windows, para um nível de significância de 5%.

30

4. Resultados

A apresentação dos resultados foi elaborada em três partes. A primeira parte apresenta

os resultados dos isolamentos, enquanto a segunda e terceira parte apresenta os resultados dos

ensaios in vitro e in vivo, respectivamente.

4.1. Isolamentos

Para o diagnóstico da infecção foi necessário realizar biópsias às brânquias pois os

peixes utilizados para realizar isolamentos raramente revelaram sinais clínicos associados à

amiloodiniose.

Em contacto com água destilada o parasita retraiu os rizóides e formou uma célula

encapsulada (tomonte). Nos primeiros minutos após serem transferidos para água salgada

filtrada, ocorreu contracção do citoplasma da membrana celular. A maioria dos isolamentos

realizados foram utilizados para iniciar ensaios in vitro (tabela 4.1). Quando o inóculo não era

totalmente utilizado no ensaio in vitro, utilizou-se para contaminar peixes. Vários isolamentos

foram fracassados devido à morte dos animais ou ao reduzido número, por vezes zero, de

tomontes isolados.

31

Tabela 4.1 – Isolamento do parasita, quantidade isolada e utilização.

Isolamento Nº tomontes/µl Utilização

13-01-2012 0 -

25-01-2012 13 Ensaio in vitro


04-02-2012 0 -



04-05-2012 3 Infecção de outros peixes









12-09-2012 3 Ensaio in vivo

4.2.Ensaios in vitro

4.2.1. Observação do ciclo de vida do parasita

A divisão do parasita iniciou-se primeiro no inóculo que não esteve a 4ºC (figura 4.2 a

e b). Nesse inóculo (figura 4.2 a), observaram-se as primeiras divisões às 36h após o início do

isolamento e atingiu o último estado de divisão (32t/T) às 72h. Enquanto no inóculo que

esteve 1 dia a 4ºC as primeiras divisões observaram-se às 68h (figura 4.2 b) e o estado de

divisão mais avançado que se observou foi 8 t/T.

32

Neste ensaio, os tomitos dividiram-se por fissão binária em completa sincronização

dentro do tomonte. No entanto, a divisão dos tomontes não foi sincronizada em ambos os

inóculos.

Figura 4.2 – Abundância relativa do estado do parasita ao longo do tempo quando não esteve

a 4ºC (a) e quando esteve 1 dia a 4ºC (b) (n = variável). Consultar tabela 3.3.

O valor do índice de desenvolvimento do parasita (figura 4.3) aumenta ao longo do

tempo e com valores mais elevados em parasitas que não estiveram a 4ºC, enquanto em

parasitas que estiveram 1 dia a 4ºC mantém-se estável nas primeiras 44 horas e com valores

mais baixos.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 36 40 44 68 72 76

Ab

un

dân

cia

mé

dia

Tempo (h) (a)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 36 40 44 68 72 76

Ab

un

dân

cia

mé

dia

Tempo (h) (b)

33

Figura 4.3 - Índice de desenvolvimento do parasita ao longo do tempo quando não esteve a

4ºC e quando esteve 1 dia a 4ºC.

4.2.2. Exposição aos endoperóxidos

4.2.2.1.Abundância relativa do parasita

Na generalidade, as células dos grupos de controlo de cada ensaio de exposição de

células de A. ocellatum a endoperóxidos, encontravam-se em estados mais avançados de

divisão que as células expostas a DMSO e/ou a um endoperóxido (figura 4.4, 4.5 e 4.6). Além

disso a maioria das células observadas tanto nos controlos como nos tratamentos, às 24 e 48

horas estavam no estado 1t/T (não ocorreu divisão).

Não se observou divisão às 24 e 48 horas nos seguintes poços: 0,1mM NAD19 (figura

4.4 a), 1mM LCD93 (figura 4.5 c) e DMSO dos ensaios com LCD93 a 1mM (figura 4.5 c) e

2,5mM (figura 4.6 c).

Em geral, das 24 para as 48h observaram-se estados de divisão mais avançados, com

excepção para os ensaios de 1mM de NAD17 e NAD19 nos quais às 48h apenas se

observaram células que não tinham sofrido divisão (1t/T) (figura 4.5).

Observaram-se estados mais avançados de divisão nos poços expostos a 2mM NAD19

que nas restantes doses testadas do fármaco.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 36 40 44 68 72 76

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

par

asit

a

Tempo (h)

0 dias a 4ºC

1 dia a 4ºC

34


endoperóxido a 0,1mM de NAD17 (a), NAD19 (b) e LCD93 (c) às 24h e às 48h (n =

variável). Consultar tabela 3.3.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

NA

D1

7

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

NA

D1

7

24h 48h(a)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

NA

D1

9

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

NA

D1

9

24h 48h(b)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

LC

D9

3

Co

ntr

olo

DM

SO

0,1

mM

LC

D 9

3

24h 48h(c)

35


endoperóxido a 1mM de NAD17 (a), NAD19 (b), LCD93 (c) e LCD67A (d) às 24h e às 48h

(n = variável). Consultar tabela 3.3.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

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1 m

M N

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Co

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olo

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1 m

M N

AD

17

24h 48h(a)

0%

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40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

1 m

M N

AD

19

Co

ntr

olo

DM

SO

1 m

M N

AD

19

24h 48h(b)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

1m

M L

CD

93

Co

ntr

olo

DM

SO

1m

M L

CD

93

24h 48h(c)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

1m

M L

CD

67

A

Co

ntr

olo

DM

SO

1m

M L

CD

67

A

24h 48h(d)

36


endoperóxido a 2 e 2,5mM de NAD17 (a), NAD19 (b) e LCD67A (c) às 24h e às 48h (n =

variável). Consultar tabela 3.3.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

2m

M N

AD

17

Co

ntr

olo

DM

SO

2m

M N

AD

17

24h 48h(a)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

2M

m N

AD

19

Co

ntr

olo

DM

SO

2M

m N

AD

19

24h 48h(b)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Co

ntr

olo

DM

SO

2,5

mM

LC

D6

7A

Co

ntr

olo

DM

SO

2,5

mM

LC

D6

7A

24h 48h(c)

37

4.2.3. Índice de desenvolvimento do parasita

O índice de desenvolvimento do parasita tem geralmente valores menores quando o

parasita é exposto a doses menores e tende a aumentar das 24 para as 48 horas (figura 4.7 a, b,

c e d), com excepção para o NAD19 a 2mM (figura 4.7 b).

O NAD 19 a 0,1mM (figura 4.7 b) foi o único endoperóxido que mantiveram o índice

de desenvolvimento de 1 das 24 para as 48 horas. O endoperóxido com um maior índice de

desenvolvimento foi o NAD17 a 0,1mM (figura 4.7 a).

Figura 4.7 - Índice de desenvolvimento do parasita quando exposto a NAD17 (a), NAD19 (b),

LCD93 (c) e LCD67A (d) a diferentes concentrações às 24 e 48 horas.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

24 48

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

par

asit

a

Tempo (h) (a)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

24 48

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

par

asit

a

Tempo (h) (b)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

24 48

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

par

asit

a

Tempo (h) (c)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

24 48

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

par

asit

a

Tempo (h) (d)

38

Os valores do índice de desenvolvimento de todas as concentrações testadas de

NAD19 encontram-se representados na figura 4.8, onde é possível observar que os valores às

24h são iguais aos das 48h com excepção das concentrações de 1 e 2mM.

Figura 4.8 – Índice de desenvolvimento do parasita quando exposto a NAD19 a diferentes

concentrações às 24 e 48 horas.

O quociente do índice de desenvolvimento do parasita do NAD19 e do respectivo

controlo para cada dose (figura 4.9) é muito próximo para as concentrações 0,01; 0,05; 0,1 e

0,25 aumentando na concentração 1mM e 2mM tanto às 24 como às 48 horas. Com excepção

da concentração 2mM o quociente é superior às 24 horas.

Figura 4.9 – Quociente do Índice de desenvolvimento do parasita do NAD19 e do respectivo

índice do controlo às 24h e 48h.

0

1

2

3

4

5

6

0,01 0,05 0,1 0,25 1 2

Índ

ice

de

de

sen

volv

ime

nto

do

p

aras

ita

Concentrações (mM)

24h

48h

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,01 0,05 0,1 0,25 1 2

Índ

. de

s. p

aras

. NA

D1

9/Í

nd

. d

es.

par

as. c

on

tro

lo

Concentração (mM)

24h

48h

39

4.3.Ensaios in vivo

4.3.1. Animais

Durante o período de aclimatização morreu uma dourada em cada um dos seguintes

aquários: 3 (DMSO), 19 (NAD17) e 22 (LCD93). Quanto à ingestão de alimento durante o

período de aclimatização dos animais à ração tratada com uma dose de 10µmol/kg, não se

observou regurgitação da ração nem sinais de toxicidade (por exemplo, natação errática ou

perda de equilíbrio).

Após o início da infecção, as douradas ingeriram sempre toda a ração fornecida com

excepção das douradas do aquário 10 (LCD93) que ao 33º, 34º e 35º dia ingeriram cerca de

80% da ração fornecida.

4.3.2. Infecção

O exame microscópio óptico das preparações a fresco de esfregaços da pele,

realizados ao 5ºdia após a infecção, permitiu identificar morfologicamente o estado trofonte

do A. ocellatum e observar que as douradas pertencentes ao grupo “não infectados”

encontravam-se infectadas. No entanto, optou-se por manter a classificação como

“infectados” e “não infectados”, para analisar se existiam diferenças entre as douradas que

foram infectadas de acordo com o protocolo e as que foram contaminadas.

A maioria dos trofontes observados eram de pequena dimensão e de coloração clara.

Observaram-se menos trofontes nas douradas que receberam tratamento NAD17 e

NAD19 na 1ª amostragem (figura 4.10 a) e nas que receberam DMSO e LCD67A na 2ª

amostragem (figura 4.10 b). Por outro lado, foi nas douradas que receberam tratamento oral

LCD93 (figura 4.10 a e b) em que se observaram maior número de trofontes nos 20

filamentos branquiais observados.

As douradas infectadas com A. ocellatum tinham um maior número de parasitas, com

excepção na 1ª amostragem (figura 4.10 a) para as que receberam tratamento oral NAD17 e

na 2ª amostragem (figura 4.10 b) as que receberam tratamento oral LCD93.

Apenas na 2ª amostragem (figura 4.10 b) existe diferença estatisticamente significativa

(p<0,05) entre o controlo das douradas não infectadas e as que receberam os tratamentos com

40

NAD17, NAD19 e LCD67A, nos quais o numero médio de parasitas é menor que o do

controlo.

Da 1ª para a 2ª amostragem há uma redução do número de parasitas observados em

todos os grupos.

Figura 4.10 – Abundância média (número total de parasitas observados em 20 filamentos

branquiais/número de peixes examinados) de douradas infectadas ( ) e não infectadas ( )

com A. ocellatum em diferentes tratamentos na 1ª (a) e 2ª amostragem (b). Os valores são as

médias ± erro-padrão (n 1ªamostragem = 12; n 2ª amostragem = 17-18).

Letras diferentes - Indicam diferenças estatisticamente significativas (P<0,05) entre

tratamentos em peixes infectados ou não infectados (ANOVA de um factor);

*- Indica diferença estatisticamente significativa entre infectados e não infectados no mesmo

tratamento (teste t-Student);

# - Indica diferença estatisticamente significativa entre a 1ª e 2ª amostragem para o mesmo

tratamento e grau de infecção (teste t-Student).

Apesar de na 1ªamostragem o número de parasitas em 20 filamentos branquiais ser

menor nas douradas tratadas com NAD19 (figura 4.10 a), os peixes infectados que receberam

este tratamento tinham uma prevalência branquial de 100% (fig. 4.11 a).

A prevalência do parasita nas brânquias (figura 4.10 a e b) foi de modo geral maior

nos peixes infectados e diminuindo da 1ª para a 2ª amostragem.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Nº

par

asit

as/2

0 f

ilam

en

tos

bra

nq

uia

is

Tratamento

a

a

a

a

a

a

ab

a

ab

ab

b

ab *

(a)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Nº

par

asit

as/2

0 f

ilam

en

tos

bra

nq

uia

is

Tratamento

a

ac

a abc

a

ab

a

b

a

c

a

b

* * *

#

#

#

(b)

41

Figura 4.11 – Prevalência ((número peixes parasitados/ número de peixes examinados) x 100)

nas brânquias em douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum submetidas

a diferentes tratamentos orais na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n 1ª amostragem = 12; n 2ª

amostragem = 17-18).

Em relação à eficácia dos tratamentos existiu uma grande variabilidade para o mesmo

tratamento comparando a eficácia do tratamento nas douradas infectadas com as não

infectadas e da 1ª para a 2ª amostragem (figura 4.12 a e b), apenas o DMSO, o qual não é

considerado tratamento mas sim o controlo do solvente, registou valores mais próximos de

eficácia tanto em relação ao tipo de infecção como entre amostragens. Quanto ao

endoperóxido menos eficaz foi o LCD93.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pre

valê

nci

a n

as b

rân

qu

ias

(%)

Tratamento (a)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pre

valê

nci

a n

as b

rân

qu

ias

(%)

Tratamento (b)

42

Figura 4.12 – Eficácia (%) (100 – (100 x (média da abundância de parasitas no grupo de

tratamento/media da abundância de parasitas no grupo de controlo)) dos tratamentos em

douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum na 1ª e 2ª amostragem. n=12

(1ªamostragem) e n=17-18 (2ªamostragem) (n 1ªamostragem = 12; n 2ª amostragem = 17-18).

Na dose testada nenhum dos endoperóxido conseguiu eliminar completamente o

parasita (figura 4.10 e 4.11) e obter uma eficácia de 100% (figura 4.12).

4.3.3. Metabolitos

No ensaio preliminar no qual se recolheu sangue de peixes que se encontravam

infectados, que tinham recuperado e outros que nunca tinham estado em contacto com o

parasita (näive) e se mediu o nível de cortisol não houve diferença estatisticamente

significativa (p < 0,05) (figura 4.13).

-200

-150

-100

-50

0

50

100

Efic

ácia

(%

)

Tratamento (a)

-200

-150

-100

-50

0

50

100

Efic

ácia

(%

) Tratamento

(b)

43


) em plasma sanguíneo de diferentes grupos de peixes

expostos ao parasita. Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 5).

Não existe diferença estatisticamente significativa (p<0,05) (ANOVA de um factor).

Relativamente ao ensaio in vivo, na 1ª amostragem (figura 4.14 a) não existe diferença

estatisticamente significante dos níveis de cortisol entre tratamentos, no entanto as douradas

que receberam o tratamento oral LCD67A foram as que tiveram níveis de cortisol

ligeiramente mais elevados (±40 ng ml-1

). Já na 2ª amostragem (figura 4.14 b) douradas não

infectadas e tratadas com DMSO e as infectadas tratadas com NAD19, LCD93 e LCD67A

tinham níveis mais elevados de cortisol (superior a 40 ng ml-1

) que as restantes douradas.

As concentrações plasmáticas de cortisol apresentaram uma grande variabilidade, o

que dificultou a análise e interpretação dos resultados.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Infectados Recuperaram näive

Co

rtis

ol (

ng

ml-1

)

Peixes

a

a a

44


) em plasma de douradas infectadas ( ) e não

infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos na 1ª (a) e 2ª amostragem

(b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8).

Letras diferentes - Indicam diferenças estatisticamente significativa (P<0,05) entre

tratamentos em peixes infectados e não infectados (ANOVA de um factor);

*- Indica diferença estatística significativa no mesmo tratamento entre infectados e não

infectados (teste t-Student);

# - Indica diferença estatística significativa entre a 1ª e 2ª amostragem no mesmo tratamento e

infecção (teste t-Student).

Pela análise da figura 4.15 a e b, não existe relação entre o número de parasitas em 20

filamentos branquiais e o nível de cortisol (ng ml-1

) em plasma de douradas infectadas e não

infectadas tanto na 1ª como na 2ª amostragem, comprovado pelo teste de correlação de

Pearson (p<0,05).

0102030405060708090

100110120130140150160

Co

rtis

ol (

ng

ml-

1)

Tratamento

a a a

a a

a a a a

a

a

a

(a)

0102030405060708090

100110120130140150160

Co

rtis

ol (

ng

ml-1

)

Tratamento

a a

a

bc bc

bc

a

b

a a

a ab

* #

#

* #

#

*

#

*

(b)

45


cortisol (ng ml-1

) no plasma das douradas infectadas e não infectadas na 1ª (a) e 2ª

amostragem (b) (n=47-48).

Infectados ( ): y = 0,846x + 11,103 R2 = 0,0365; Teste de correlação de Pearson r=0,0803,

p=0,592 (1ª amostragem). y = 0,6911x + 42,553 R2

= 0,0082; Teste de correlação de Pearson

r= 0,0904; p=0,541 (2ª amostragem).

Não infectados ( ): y = 0,0364x + 11,088 R2


r=0,191; p=0,194 (1ª amostragem). y = - 0,1795x + 17,326 R2 = 0,0036; Teste de correlação

de Pearson r=-0,0599; p=0,686 (2ª amostragem).

Os níveis de glucose (mmol l-1

) (figura 4.16 a e b) no plasma das douradas tem valores

muito próximos dos 4 mmol l-1

, não existindo diferença estatisticamente significante.

0

50

100

150

200

250

300

0 20 40 60

Co

rtis

ol (

ng

ml-

1)

Nº parasitas/20 filamentos branquiais

(a)

0

50

100

150

200

250

300

0 20 40 60

Co

rtis

ol (

ng

ml-1

)


(b)

46

Figura 4.16 – Níveis de glucose (mmol l-1



amostragem (b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8).

Letras diferentes - Indicam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre






Pela análise da figura 4.17a e b, não existe relação entre o número de parasitas em 20

filamentos branquiais e o nível de glucose (mmol l-1


infectadas com A. ocellatum, tanto na 1ª como na 2ª amostragem, comprovado pelo teste de

correlação de Pearson (p<0,05).

0

1

2

3

4

5

6

Glu

cose

(m

mo

l l-1

)

Tratamento

a

a a a

a a a

a

a

a a a

(a)

0

1

2

3

4

5

6

Glu

cose

(m

mo

l l-1

)

Tratamento

a a a a a a

a

a a a

a a

(b)

47


glucose (mmol l-1


ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48). Infectados ( ): y = -0,013x + 3,8748 R

2 = 0,0155; Teste de correlação de Pearson r=-0,137;


= 0,0172; Teste de correlação r=0,131;

p=0,375 (2ª amostragem).



r=0,0221; p=0,881 (1ª amostragem). y = - 0,0053x + 3,547 R2 = 0,00109; Teste de correlação

de Pearson r=-0,165; p=0,261 (2ª amostragem).

Os níveis de proteína (mg ml-1

) medidos foram de cerda de 20 ng ml-1

, tendo sido

ligeiramente superiores na 1ª amostragem (figura 4.18 a).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60

Glu

cose

(m

mo

l l-1

)

Nº parasitas/20 filamentos branquiais (a)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60

Glu

cose

(m

mo

l l-1

)


(b)

48

Figura 4.18 – Níveis de proteína (mmol l-1

) em plasma sanguíneo de douradas infectadas ( )

e não infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos orais na 1ª (a) e 2ª



tratamentos em peixes infectados e não infectados (ANOVA de um factor) ;






filamentos branquiais e o nível de proteína (mg ml-1




0

5

10

15

20

25

30

Pro

teín

a (m

g m

l-1)

Tratamento

a a

a a

a a ab

ab

a

b b b

* *

*

(a)

0

5

10

15

20

25

30

Pro

teín

a (m

g m

l-1)

Tratamento

a a a a a a

a a a a a a #

# #

(b)

49


proteína (mg ml-1


ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48).

Infectados ( ): y = -0,0639x + 19,194 R2 = 0,0414; Teste de correlação de Pearson r=-0,223;

p=0,133 (1ª amostragem). y = -0,0861x + 18,939 R2


r=-0,165; p=0,263 (2ª amostragem).

Não infectados ( ): y = -0,1345x + 30,912 R2

= 0,00281; Teste de correlação de Pearson r=-

0,168; p=0,255 (1ª amostragem); y = 0,0402x + 18,813 R2 = 0,0132; Teste de correlação de

Pearson r=0,115; p=0,437 (2ª amostragem).

4.3.4. Osmorregulação

Como é possível observar na figura 4.20 b, os níveis de osmolaridade (mOsm kg-1

)

diminuíram no plasma sanguíneo de douradas não infectadas tratadas com DMSO e LCD93

da 1ª para a 2ª amostragem.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60

Pro

teín

a (m

g m

l)

Nº parasitas/20 filamentos branquiais (a)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60

Pro

teín

a (m

g m

l-1)


(b)

50

Figura 4.20 – Níveis de osmolaridade (mOsm kg-1

) em plasma sanguíneo de douradas

infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum expostas a diferentes tratamentos orais

na 1ª (a) e 2ª amostragem (b). Os valores são as médias ± erro-padrão (n = 8).








filamentos branquiais e o nível de osmolaridade (mOsm kg-1

) em plasma sanguíneo de

douradas infectadas e não infectadas com A. ocellatum, tanto na 1ª como na 2ª amostragem,

comprovado pelo teste de correlação de Pearson (p<0,05).

330

340

350

360

370

380

390

400

410

420

430

Osm

ola

rid

ade

(m

Osm

Kg-1

)

Tratamento

a

a

a

a

a a

a

a

a a

a

a

(a)

330

340

350

360

370

380

390

400

410

420

430

Osm

ola

rid

ade

(m

Osm

Kg-1

) Tratamento

a a

a

a

a

a

a ab # a

a

b

a

# *

(b)

51



) em plasma sanguíneo de douradas infectadas e não infectadas com

A. ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48).

Infectados ( ): y = -0,2189x + 389,57 R2 = 0,0054; Teste de correlação de Pearson r=-

0,0717; p=0,632 (1ª amostragem). y = -0,0109x + 378,85 R2

= 5E-06; Teste de correlação de

Pearson r=-0,00221; p=0,988 (2ª amostragem).



r=0,05467; p=0,712 (1ª amostragem). y = 0,082x + 363,68 R2 = 0,0011; Teste de correlação

de Pearson r=0,0324; p=0,827 (2ª amostragem).

As concentrações plasmáticas de cloro apresentaram uma grande variabilidade. No

entanto, os níveis de cloro (mmol l-1

) são na maioria dos tratamentos superiores nos peixes

infectados (fig. 4.22 a e b) e diminuíram nos peixes tratados com endoperóxidos da 1ª para a

2ª amostragem.

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

0 20 40 60

Osm

ola

rid

ade

(m

Osm

l-1)


(a)

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

0 20 40 60

Osm

ola

rid

ade

(m

Osm

Kg-1

) Nº parasitas/20 filamentos

branquiais (b)

52

Figura 4.22 – Níveis de cloro (mmol l-1











filamentos branquiais e o nível de cloro (mmol l-1




120

125

130

135

140

145

150

155

Cl-

(m

mo

l l-1

)

Tratamento

a

a *

a

a *

a

a *

a

ac * a

bc

a

b *

(a)

120

125

130

135

140

145

150

155

Cl- (

mm

ol l

-1)

Tratamento

ab

a

a

a *

b # a

ab #

a

ab

a * #

ab a #

(b)

53


cloro (mmol l-1

) em plasma sanguíneo das douradas infectadas e não infectadas com A.

ocellatum na 1ª (a) e 2ª amostragem (b) (n=47-48).

Infectadas ( ): y = -0,2138x + 141,91 R2 = 0,0792; Teste de correlação de Pearson r=-0,207;


= 5E-05; Teste de correlação de Pearson

r=0,00703; p=0,962 (2ª amostragem).

Não infectadas ( ): y = 0,3177x + 133,89 R2


r=0,274; p=0,0597 (1ª amostragem). y = - 0,0809x + 130,65 R2 = 0,00273; Teste de

correlação de Pearson r=-0,165; p=0,261 (2ª amostragem).

Na actividade de Na+,K

+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) (figura 4.24) não existe

diferença estatisticamente significativa entre os peixes do grupo controlo e os que receberam

tratamento oral NAD19. No entanto, existe diferença no grupo controlo entre os peixes

infectados e os não infectados, tendo os infectados menor actividade nas brânquias.

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

0 20 40 60

Cl- (

mm

ol l

-1)


(a)

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

0 20 40 60C

l (m

mo

l l-1

)

Nº parasitas/20 filamentos branquiais (b)

54

Figura 4.24 – Actividade de Na+,K

+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) nas brânquias de

douradas infectadas ( ) e não infectadas ( ) com A. ocellatum de douradas do grupo controlo

e do grupo exposto ao tratamento oral com o endoperóxido NAD19 na 2ª amostragem. Os

valores são as médias ± erro-padrão (n = 3).


tratamentos em peixes infectados e não infectados;


infectados;


filamentos branquiais e a actividade Na+,K+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) nas

brânquias de douradas infectadas e não infectadas com A. ocellatum, comprovado pelo teste

de correlação de Pearson (p<0,05).

0

1

2

3

4

5

6

7

Controlo NAD19

Na+

, K+

- A

TPas

e

(µm

ol A

DP

/mg

pro

teín

a/h

)

Tratamento

a

a

a a

*

55

Figura 4.25 – Relação entre o número de parasitas em 20 filamentos branquiais e a actividade

Na+,K+ - ATPase (µmol ADP/mg proteína/h) nas brânquias de douradas infectadas e não

infectadas com A. ocellatum na 2ª amostragem (n=12).

Infectadas ( ): y = -0,0239x+3,4880 R2=0,0141; Teste de correlação de Pearson r=-0,119;

p=0,713.

Não infectadas ( ):y = -0,1331x + 4,6693 R2 = 0,0597; Teste de correlação de Pearson

r=0,244; p=0,444.

4.3.5. Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo

Na 1ª amostragem existe relação positiva entre a osmolaridade (mOsm kg-1

) e o

cloro (mmol l-1

) do plasma sanguíneo de douradas infectadas (tabela 4.2), enquanto no plasma

sanguíneo das douradas não infectadas (tabela 4.3) a osmolaridade (mOsm kg-1

) tem relação

positiva com o cloro (mmol l-1

), a glucose (mmol l-1

) e o cortisol (ng ml-1

).

Tabela 4.2 – Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo de douradas


p<0,05.

Osmolaridade

(mOsm kg-1

)

Cloro

(mmol l-1

)

Glucose

(mmol l-1

)

Proteína

(mmol l-1

)

Cortisol

(ng ml-1

)

Osmolaridade

(mOsm kg-1

) -

r=0,455

p=0,00133

r=0,132

p=0,378

r=0,146

p=0,326

r=0,0803

p=0,922

Cloro

(mmol l-1

) - -

r=0,186

p=0,210

r=0,0293

p=0,845

r=-0,0097

p=0,949

Glucose

(mmol l-1

) - - -

r=0,0396

p=0,791

r=-0,0176

p=0,906

Proteína

(mmol l-1

) - - - -

r=0,164

p=0,270

Cortisol

(ng ml-1

) - - - - -

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30

Na+

, K+

- A

TPas

e

(µm

ol A

DP

/m

g p

rote

ína/

h)


56



p<0,05.

Osmolaridade

(mOsm kg-1

)

Cloro

(mmol l-1

)

Glucose

(mmol l-1

)

Proteína

(mmol l-1

)

Cortisol

(ng ml-1

)

Osmolaridade

(mOsm kg-1

) -

r=0,429

p=0,00237

r=0,297

p=0,0406

r=-0,0693

p=0,640

r=0,492

p=0,000388

Cloro

(mmol l-1

) - -

r=-0,0988

p=0,504

r=-0,274

p=0,0598

r=0,164

p=0,265

Glucose

(mmol l-1

) - - -

r=-0,0372

p=0,802

r=0,226

p=0,122

Proteína

(mmol l-1

) - - - -

r=-0,128

p=0,388

Cortisol

(ng ml-1

) - - - - -

Na 2ª amostragem (tabela 4.4) a osmolaridade (mOsm kg-1

) do plasma sanguíneo de

douradas infectadas tem relação positiva com o cloro (mmol l-1

), a glucose (mmol l-1

) e a

proteína (mmol l-1

), e o cloro (mmol l-1

) tem relação positiva com a proteína (mmol l-1

).

Enquanto nas douradas não infectadas a osmolaridade (mOsm kg-1

) apenas tem relação

positiva com o cloro (mmol l-1

) e a glucose (mmol l-1

) (tabela 4.5).

Tabela 4.4 - Relações entre as análises bioquímicas ao plasma sanguíneo de douradas


p<0,05.

Osmolaridade

(mOsm kg-1

)

Cloro

(mmol l-1

)

Glucose

(mmol l-1

)

Proteína

(mmol l-1

)

Cortisol

(ng ml-1

)

Osmolaridade

(mOsm kg-1

) -

r=0,424

p=0,00270

r=0,317

p=0,0280

r=0,333

p=0,0207

r=0,0219

p=0,883

Cloro

(mmol l-1

) - -

r=0,0994

p=0,501

r=0,250

p=0,0870

r=-0,0694

p=0,639

Glucose

(mmol l-1

) - - -

r=0,0129

p=0,931

r=0,213

p=0,146

Proteína

(mmol l-1

) - - - -

r=-0,0747

p=0,614

Cortisol

(ng ml-1

) - - - - -

57



p<0,05.

Osmolaridade

(mOsm kg-1

)

Cloro

(mmol l-1

)

Glucose

(mmol l-1

)

Proteína

(mmol l-1

)

Cortisol

(ng ml-1

)

Osmolaridade

(mOsm kg-1

) -

r=0,389

p=0,00627

r=0,306

p=0,0345

r=0,00217

p=0,988

r=-0,0869

p=0,557

Cloro

(mmol l-1

) - -

r=-0,00445

p=0,976

r=-0,185

p=0,207

r=0,0757

p=0,609

Glucose

(mmol l-1

) - - -

r=-0,216

p=0,141

r=-0,0240

p=0,872

Proteína

(mmol l-1

) - - - -

r=0,108

p=0,465

Cortisol

(ng ml-1

) - - - - -

58

5. Discussão

A. ocellatum é um agente patogénico que afecta vários peixes marinhos e euralianos,

especialmente espécies marinhas comerciais (Oestmann e Lewis, 1996), como a dourada

(Sparus aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax) nas aquaculturas semi-intensivas de

Portugal. Os surtos iniciam-se, normalmente, na Primavera quando a temperatura da água

aumenta e são especialmente epizoóticos no Verão, coincidindo com o período de elevada

procura comercial. Com base na necessidade de desenvolver estratégias para a profilaxia e

controlo de A. ocellatum, realizaram-se ensaios in vitro e in vivo com novos fármacos, uma

vez que os correntes métodos não são efectivos a eliminar todas as formas do parasita e

requerem longos períodos de exposição. Neste caso, foram usados os endoperóxidos, que

demonstraram a sua eficácia em outros protozoários, como o Plasmodium falciparum

(Opsenica e Šolaja, 2009; O’neill et al., 2010, Delves et al., 2012) e o Perkinsus sp.

(Cristiano, 2010).

Para a realização de ensaios in vitro, foi necessário isolar o parasita de peixes

infectados, uma vez que, não se conhece nenhum método que possibilite o isolamento do

parasita através da água ou do solo. A descoberta de um método capaz de obter o parasita do

solo ou da água evitaria o recurso a animais saudáveis, o que estaria de acordo com o

princípio dos 3R’s (Replacement, Reduction e Refinement). Além disso, seria ainda um

contributo para o estudo da biologia do parasita, do qual apenas se sabe até à data que o

parasita completa o seu ciclo de vida, quando a célula-mãe foi isolada de um peixe.

O método adaptado de Bower et al. (1987) não demonstrou ser o mais eficaz neste

estudo pois suspeita-se da perda de tomontes através da sinfonagem, que para além de ser um

método muito moroso, não pode ser aplicado a espécies menos tolerantes a meios

hipossalinos. O outro método adoptado de Roberts-Thomson et al. (2006), apesar de também

ser stressante para o peixe, é realizado num menor espaço de tempo. De modo a estudar o A.

ocellatum, uma técnica de propagação do parasita in vitro é necessária para que seja possível

ter parasitas sempre que se pretenda iniciar um ensaio e em quantidades suficientes que

permitam obter resultados fiáveis. Por exemplo, Ullal (2006) para testar o efeito de HbβP-1

em A. ocellatum utilizou parasitas isolados de Morone saxatilis propagados numa linha de

células das brânquias. Vários outros autores desenvolveram e melhoraram meios de cultura

capazes de produzir o parasita (Bower et al., 1987; Noga,1987; Oestmann e Lewis, 1995;

Oestmann e Lewis, 1996).

59

Em relação aos métodos utilizados para contar o parasita, alguns autores optaram por

uma “sedgwick-rafter counting cell” para contar o número total de dinosporos imobilizados

com formol (Bower et al., 1987, Masson et al., 2011), enquanto outros optaram pela

utilização de uma técnica especifica de PCR (Levy et al., 2007).

Os parasitas observados no isolamento mantiveram a sua forma e realizaram a

encapsulação em contacto com água doce e mesmo tendo-se observado contracção do

citoplasma dos tomontes, isto não pareceu afectar a sua divisão e consequente esporulação, tal

como observaram Bower et al. (1987).

Durante os ensaios in vitro observaram-se tomontes em diferentes estados de divisão,

devido ao facto de não existir sincronia de divisões entre tomontes, resultando numa

variabilidade no tempo de esporulação entre estes (Paperna, 1984b). O intervalo de

temperatura de 23-27ºC deveria ter sido o ideal para ocorrer um “sucesso de divisão” de

100% ao fim de 2-3 dias (Paperna, 1984b), porém nos primeiros ensaios in vitro tal não

aconteceu. Existem várias razões para não se terem observado dinosporos, tais como, os

trofontes não terem o tamanho ideal a quando do desprendimento das brânquias (Paperna,

1984b), a sua rápida mobilidade o que torna difícil a sua pipetagem e observação ao

microscópio, neste caso, à quantidade de água pipetada deveria ter-se adicionado anestésico

para imobilizar os dinosporos. Para além da dessincronização entre tomontes, observou-se

ainda dessincronização na divisão dos tomitos dentro do mesmo tomonte, contrariamente ao

observado por Paperna (1984b).

Após incubação 1 dia a 4ºC os tomontes demonstraram uma diminuição na capacidade

de divisão. Segundo (Paperna, 1984b), a divisão após incubação a 8ºC vai sendo adiada

progressivamente à medida que o período de incubação é prolongado. No entanto, no estudo

de criopreservação do A. ocellatum desenvolvido por Yang (2005), apenas após 48 horas de

armazenamento a 4ºC é que existe uma divisão irregular e mais lenta do parasita.

Nos ensaios in vitro de exposição do parasita aos endoperóxidos observaram-se

tomontes em estado mais avançado de divisão nos poços de controlo que nos restantes poços.

No entanto, o mesmo não aconteceu nos poços que continham apenas solvente, nestes

observou-se um efeito inibitório na divisão do parasita por vezes superior ao observado nos

poços que continham endoperóxido. Segundo Yang (2005) é possível conservar o parasita a

uma concentração de 3-10% de DMSO. Em próximos ensaios seria interessante testar o efeito

de outros solventes na divisão do parasita, como por exemplo o etanol.

Nos ensaios in vitro com NAD17 e NAD19 a 2mM observaram-se tomontes em

estados de divisão mais avançados que nos ensaios com os mesmos fármacos a menores

60

concentrações. Estes fármacos quando testados a 1mM, foi possível observar tomontes no

primeiro estado de divisão (2t/T) às 24 horas, porém às 48 horas apenas se observaram

tomontes que não tinham entrado em divisão. Uma vez que o tomonte ao dividir-se torna-se

mais pequeno, possivelmente a teca (parede externa da célula) fica mais sensível e mais

vulnerável à actuação dos endoperóxidos. Além disso nos vários ensaios in vitro, para além da

dessincronização na divisão entre tomontes também observada por Paperna (1984b),

observou-se uma dessincronização na divisão dos tomitos dentro do mesmo tomonte. Alguma

desta variabilidade pode ser atribuída a defeitos que ocorram nas tecas de células em divisão

ou resultado de uma incompleta vedação da parede celular durante a transformação de

trofonte em tomonte (Paperna, 1984b). No ensaio com LCD93, no qual o volume de DMSO

foi superior (40 µl) na concentração mais elevada (1mM), observou-se inibição do

desenvolvimento do parasita. Apesar de não ter sido possível comparar directamente o efeito

do endoperóxido LCD67A a 0,1mM com os restantes endoperóxidos uma vez que não se

realizou nenhum ensaio com este endoperóxido a esta concentração, observou-se tal como no

LCD93 estados menos avançados de divisão, porém este foi o fármaco no qual se observou

estados mais avançados de divisão. Apesar do solvente parecer ter um efeito inibitório, este

efeito parece ser mais notório em conjunto com um endoperóxido. As concentrações testadas

encontram-se dentro do intervalo de concentrações de antiprotozoários testados em Perkinsus

olseni (Elandalloussi et al., 2005).

O índice de desenvolvimento do parasita para além de comprovar as observações dos

gráficos de abundância relativa do parasita, teria como objectivo calcular o LC50,no entanto

não foi possível calcular o LC50 pois testaram-se apenas três concentrações devido à

dificuldade em obter parasitas para a realização de mais ensaios a diferentes concentrações.

No ensaio in vivo, para a infecção dos peixes do grupo “não infectados” utilizou-se

uma quantidade conhecida (Bower et al., 1987; Roberts-Thomson et al., 2006) de parasita

(±667dinosporos por aquário) em vez de colocar um peixe infectado em cada aquário

(Masson, 2009).

Após a distribuição dos dinosporos pelos aquário os peixes infectados deveriam

demonstrar sinais clínicos (anorexia, respiração rápida e superficial, natação errática)

associados à amiloodiniose após 5-8 dias (Bower et al., 1987), porém só as douradas do

aquário 10 que revelaram uma ligeira anorexia.

Durante o ensaio in vivo ocorreu contaminação das douradas do grupo “não

infectados”, esta contaminação pode ter ocorrido devido aos pequenos salpicos durante a

renovação da água com a mesma mangueira, além disso os aquários deviam estar noutro

61

compartimento para evitar a contaminação. Segundo Roberts-Thomson et al. (2006), o A.

ocellatum pode ser transportado em gotas de aerossol entre tanques muito próximos, outros

autores defendem ainda que o parasita pode ser transmitido através de fómites, como

equipamentos e mãos dos utilizados (Francis-Floyd e Floyd, 2011).

Para a análise parasitológica, realizou-se a contagem de trofontes em 20 filamentos

branquiais, porém num outro estudo realizado com o parasita o autor optou pela fixação de

brânquias em formalina a 5% e após 24 horas descartar o sobrenadante e acrescentar álcool a

70%, homogeneizado de seguida a mistura retirando 3 alíquotas para observação em câmara

de Mac Máster (Santos, 2011). Durante a contagem dos trofontes, observaram-se trofontes de

cor clara e pequenas dimensões. Dado que tanto na primeira amostragem como na segunda

observaram-se trofontes com estas características, a hipótese de não ter ocorrido nenhum surto

capaz de provocar a morte do peixe é apresentada. Esta hipótese tem como base o trabalho de

Paperna (1984b), segundo o qual o desalojamento dos trofontes inicia-se ao 3º dia de infecção

e está completo ao 6º dia a 9-24ºC. De modo a perceber o nível de infecção em futuras

experiências dever-se-á medir os trofontes e comparar com outros trabalhos (Paperna, 1984b;

Severino, 2008).

Uma vez que no ensaio in vivo nenhum dos fármacos teve uma eficácia de 100%, tal

pode dever-se à dose testada ter sido baixa. Para que um fármaco seja eficaz, este tem de ser

absorvido e distribuído pelo hospedeiro, atingindo os tecidos alvo onde o parasita se encontra

na forma activa em doses suficientes (Williams, 2009). E actualmente nada se sabe sobre a

biodisponibilidade e a farmacocinética dos endoperóxidos em peixes. Para se investigar a

eficácia de um composto contra um parasita, é necessário planeamento, ensaios, amostragem,

parasitas em quantidade suficiente e análise estatística dos dados.

Para além da dose testada, o método escolhido para administrar os fármacos aos peixes

pode não ter sido o mais apropriado para o tipo de fármacos em estudo. A principal limitação

na medicação através do alimento é que o peixe tem realmente de se alimentar e uma vez que

os peixes doentes, principalmente com amiloodiniose, têm tendência a deixar de se alimentar,

os tratamentos orais são mais um método profiláctico do que um método terapêutico (Daniel,

2009). Apesar do método mais utilizado de tratamento oral em peixes ser através da

alimentação, existem outros sistemas de disponibilidade oral, como a bioencapsulação e as

microesferas (Daniel, 2009). Os tratamentos orais requerem menos trabalho que os

tratamentos através de banhos, uma vez que o peixe pode ser tratado como parte do seu

normal regime de alimentação e têm menos impacto em outros organismos (Grant, 2002).

62

Para além dos banhos e dos tratamentos orais, a administração de medicação em

peixes pode ser feita através de injecção. Apesar de a injecção ser a opção mais efectiva,

existem contudo várias limitações para este método. Para além da manipulação, da anestesia e

da injecção serem stressantes para o peixe, exige também um trabalho intensivo, é mais

custosa e não é praticável em grandes quantidades de peixes com menos de 20g (Plant e

LaPrata, 2011).

O grupo endoperóxido é o farmacóforo que confere aos endoperóxidos a sua

capacidade antimalárica, dependendo esta acção farmacológica da bioactivação pelo ferro

existente no vacúolo alimentar do parasita da malária (Opsenica e Šolaja, 2009), deste modo é

necessário estudar a biologia do A. ocellatum.

A palavra stress é um termo largamente utilizado quer em linguagem corrente, quer

em linguagem científica. No entanto, este termo gera grande confusão, pelo que necessita de

ser definido com clareza. Um peixe de uma dada espécie colocado num meio onde as

características físico-químicas e biológicas são óptimas, não desenvolve qualquer reacção de

adaptação, independentemente do tempo de exposição a esse meio. Se, no entanto, se

produzirem alterações das características do meio que ultrapassem o intervalo de intensidade

e/ou tempo ultrapassando as capacidades de adaptação do organismo, fala-se então de stress

(Henrique, 2000). Apesar do conceito de stress ser largamente aceite pelos biólogos, a

definição de stress varia (Chrousos e Gold, 1992). Nesta tese, o stress é definido como uma

condição na qual a homeostase está ameaçada ou alterada devido à exposição de peixes à

amiloodiniose. O stress em si mesmo não pode ser medido, podendo-se apenas determinar

quantitativamente indicadores da resposta fisiológica ao stress provocado pela amiloodiniose.

Neste estudo mediram-se os níveis de cortisol como indicador da resposta primária ao stress e

de glucose, proteína, cloro e osmolaridade no plasma sanguíneo de douradas comoindicadres

de respostas secundárias ao stress.

Os resultados das análises realizadas com o plasma sanguíneo dos peixes amostrados

foram comparados com os resultados obtidos num estudo sobre resposta osmorregulatória

branquial à salinidade em douradas (Laiz-Carrión et al., 2005), no qual as douradas

encontravam-se em condições semelhantes às do estudo.

Os níveis de cortisol e glucose plasmáticos para além de serem geralmente usados

como indicadores de uma resposta primária e secundária ao stress, respectivamente, são

também usados como indicadores para determinar a duração e severidade do stress (Henrique

et al., 1996). No ensaio in vivo a maioria dos níveis de cortisol medidos foram elevados,

acima de 3,3±0,33 ng ml-1

. As douradas infectadas tratadas com LCD67A (na 1ª amostragem)

63

e as douradas infectadas tratadas com NAD17 e NAD19 (na 2ª amostragem) tiveram níveis de

cortisol normais (±3,3 ng ml-1

). Quanto ao grupo controlo, tanto na 1ª como na 2ª

amostragem, os níveis de cortisol foram inferiores aos níveis de cortisol do ensaio preliminar

em peixes infectados. Existem no entanto alguns estudos com parasitas - em truta arco-íris

infectada com o parasita sanguíneo Cryptobia salmositica (Laidley et al., 1988) e com

Ichthyophonus hoferi (Rand e Cone, 1990) - nos quais não foram encontrados aumentos do

cortisol plasmático, sugerindo que a parasitologia não activa o eixo hipotálamo.

O facto de não se ter utilizado anestésico deve-se a que alguns autores referirem que

estes podem fornecer falsos negativos relativamente à presença de A. ocellatum (Francis-

Floyd e Floyd, 2011), o que poderá ter tido efeito nos valores elevados de cortisol plasmático.

No entanto os resultados no que referem à utilização de anestésicos para bloquear ou diminuir

o stress não são concordantes. O anestésico MS-222 (tricaina), que é utilizado com frequência

em aquacultura, evidenciou ter quer um supressor quer um efeito indutor de stress em

douradas, dependendo da dose utilizada (Molinero e Gonzales, 1995).No entanto devido à

discrepância e aos elevados valores (por exemplo 120 ng ml-1

) obtidos de cortisol nalgumas

amostras é possível que tenha ocorrido algum erro durante as medições de cortisol por parte

do manipulador.

Os níveis de glucose medidos no plasma sanguíneo de douradas sujeitas a diferentes

tratamentos, tanto na 1ª como na 2ª amostragem foram próximos do valor considerado padrão

(3,66±0,24 mmol l-1

). Quanto aos níveis de proteína (mg ml-1

) medidos, estes foram mais

baixos (± 20 mg ml-1

) que os medidos no ensaio de condições semelhantes (37.5±4.3 mg ml-1

)

(Laíz-Carrión et al., 2005). Tal como noutro estudo (Rotllant et al., 1997) não se observou um

aumento da glicemia, apesar dos níveis de cortisol plasmático serem elevados. No entanto, a

ausência de hiperglicemia não pode ser considerada como a ausência de stress, pois deve-se

ter em conta outros factores que interferem directamente com a glicemia, como é o caso da

composição do alimento (Hemre et al., 1991) e as características genéticas da população em

estudo (Fevolden e Røed, 1993).

Os valores de osmolaridade (mOsm kg-1

) foram elevados (> 312±3.2 mOsm kg-1

), as

douradas tratadas com LCD93 foram as que tiveram valores mais baixos de osmolaridade

assim como as douradas da 2ª amostragem não infectadas dos grupos controlo, DMSO e

NAD17. Já os níveis de cloro medidos no ensaio in vivo foram menores (< 152±3 mmol l-1

)

que os medidos no ensaio semelhante. Este desequilíbrio nos valores de osmolaridade e de

cloro podem ser devido ao stress que os peixes estavam sujeitos devido à infecção com A.

ocellatum.

64

Segundo Noga e Levy (2006), a redução da osmorregulação e as infecções

microbianas secundárias devido às lesões severas no epitélio podem também ser importantes

causas de debilitação e morte. Uma vez que a actividade de Na+,K

+ - ATPase medida nas

brânquias, que é o principal órgão na osmorregulação (Laíz-Carrion et al., 2005), de douradas

infectadas e não infectadas com A. ocellatum foi baixa (<15 µmol ADP/mg proteína/h) e visto

não ter ocorrido mortalidade durante o ensaio, talvez a redução da osmorregulação não seja

uma das causas de morte. Além disso, uma vez que os valores de cortisol foram altos, era de

esperar um aumento da actividade branquial de Na+,K

+ - ATPase, pois nos peixes teleósteos

euralianos o cortisol actua em órgãos de osmorregulação aumentando em algumas espécies a

sua actividade branquial de Na+,K

+ - ATPase (Mancera et al., 1994). No entanto, será

necessário realizar mais medições pois apenas se mediu a actividade de Na+,K

+ - ATPase

(µmol ADP/mg proteína/h) em 6 peixes de cada grupo.

De acordo com os dados recolhidos não existe uma relação entre a quantidade de

trofontes em 20 filamentos branquiais e as respostas fisiológicas ao stress analisadas (cortisol,

cloro, glucose, proteína, osmolaridade e actividade de Na+,K

+ - ATPase). No entanto existe

uma relação positiva entre a osmolaridade (mOsm kg-1

) e o cloro (mmol l-1

) no plasma

sanguíneo de douradas infectadas e não infectadas, tanto na 1ª como na 2ª amostragem, pois o

aumento dos níveis de Cl- induz o aumento da osmolaridade do plasma (Lichtstein et al.,

1992; Widmaier et al., 2008). Existe ainda uma relação positiva entre a osmolaridade e a

glucose (mmol l-1

) no plasma de douradas não infectadas na 1ª amostragem e de douradas

infectadas e não infectadas na 2ª amostragem. A glucose é um dos componentes do plasma

(Weisberg, 1989), alterações nos seus níveis poderão alterar os níveis de osmolaridade. O

teste de Pearson revelou também a existência de uma relação positiva entre a osmolaridade

(mOsm kg-1

) e o cortisol (ng ml-1

) nas douradas não infectadas da 1ª amostragem, entre a


) e a proteína (mmol l-1

) e o cloro (mmol l-1

) e a proteína (mmol l-1

)

no plasma de douradas infectadas na 2ª amostragem. É possível que na realidade não exista

uma verdadeira relação entre certos indicadores, mas sim que ambos tenham aumentado

devido aos animais estarem sujeitos a uma situação de stress.

As medições realizadas ao plasma sanguíneo e às brânquias de douradas com

diferentes níveis de infecção de A. ocellatum revelam que não existe diferença significativa

entre os controlos e os endoperóxidos para a dose testada.

65

6. Conclusão

Durante o presente trabalho avaliou-se o efeito dos endoperóxidos na divisão do

parasita e em douradas quando administrados oralmente.

Nos ensaios in vitro o NAD19 a 0,1mM e o LCD93 a 1mM inibiram a divisão do

parasita tanto na observação realizada às 24 horas como após 48 horas. Para além do volume

de solvente (DMSO) utilizado no ensaio ter sido elevado, o solvente parece ter um efeito

inibitório na divisão do parasita.

Uma vez que no ensaio in vivo ocorreu contaminação dos peixes do grupo “não

infectados” não foi possível comparar o efeito dos fármacos entre peixes infectados e não

infectados. Nas análises efectuadas ao plasma sanguíneo, com excepção das medições de

cortisol e cloro, não existe diferença estatisticamente significativa nos valores medidos tanto

entre infectados e não infectados como da primeira para a segunda amostragem.

Será necessário realizar mais ensaios para obter conclusões sobre o efeito dos

endoperóxidos no controlo do parasita de peixes A. ocellatum.

7. Considerações finais

O presente estudo assume importância a nível mundial, uma vez que o A. ocellatum é

um ectoparasita de distribuição mundial para o qual não existe nenhuma metodologia que

permita a sua erradicação dos sistemas piscícolas.

Com base na informação recolhida é importante realizar mais ensaios sobre o ciclo de

vida do A. ocellatum, principalmente para averiguar se o parasita tem ferro, o qual é essencial

para a actuação deste tipo de fármacos. Caso se comprove a sua existência será necessário

realizar ensaios in vitro em que se testem os fármacos utilizando a mesma quantidade de

solvente em pequenas quantidades e comprovar que o solvente não afecta a divisão do

parasita. Para a realização dos ensaios in vitro é aconselhado o desenvolvimento de um

meio de cultura ou o desenvolvimento de um método capaz de obter o parasita da água ou

solo contaminados.

Os ensaios in vivo só deverão ser realizados após se comprovar a eficácia dos

endoperóxidos in vitro. Durante os ensaios in vivo é sugerido que os peixes infectados estejam

num compartimento diferente dos peixes não infectados para evitar contaminação cruzada e

para se poder avaliar o efeito dos fármacos tanto na sua eficácia como no seu modo de

actuação na fisiologia dos animais.

66

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