UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos

Área de Bromatologia

Avaliação do efeito de extratos de compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (Myrciaria

jaboticaba (Vell.) Berg) administrados a camundongos C57BL/6 alimentados com

dieta hiperlipídica com alto teor de sacarose

MARIA GABRIELA DA CUNHA

Dissertação para obtenção do título de Mestre

Orientadora: Prof. Dr. Maria Inés Genovese

São Paulo

2016

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos

Área de Bromatologia

Avaliação do efeito de extratos de compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (Myrciaria

jaboticaba (Vell.) Berg) administrados a camundongos C57BL/6 alimentados com

dieta hiperlipídica com alto teor de sacarose

MARIA GABRIELA DA CUNHA

Versão Original

Dissertação para obtenção do título de Mestre

Orientadora: Prof. Dr. Maria Inés Genovese

São Paulo

2016

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Maria Gabriela da Cunha

Avaliação do efeito de extratos de compostos fenólicos da jabuticaba Sabará

(Myrciaria jaboticaba (Vell) Berg) administrados a camundongos C57BL/6

alimentados com dieta hiperlipídica com alto teor de sacarose

Comissão julgadora

da

Tese para obtenção do Título de Mestre

_______________________________

Prof. Dr. Maria Inés Genovese orientador/presidente

___________________________

1º examinador

__________________________

2º examinador

__________________________

3º examinador

São Paulo, ____ de _____________ de 2016.

Dedicatória

Ao Autor da vida, pois sem Ele, eu nada seria.

A meus pais, pelo amor e por me tornarem o que sou hoje.

Agradecimentos

À Universidade de São Paulo, que mais uma vez me deu a oportunidade

crescer.

À minha orientadora, Prof. Dr. Maria Inés Genovese, por ter me recebido

e compartilhado seus conhecimentos de forma generosa. Serei eternamente grata

pela confiança e por todo o aprendizado que me proporcionou.

À Universidade Laval, em especial ao Prof. Dr. Andrè Marette e à toda a

equipe de seu laboratório, por todo o apoio a este projeto e aprendizado

proporcionado. De igual forma, agradeço ao governo federal canadense, pelo

fornecimento da bolsa de estudos ELAP, que me possibilitou ter a experiência

única e inesquecível de desenvolver grande parte das análises deste trabalho neste

país incrível.

Aos amigos e colegas do nosso grupo de pesquisas, por todo o

aprendizado compartilhado e todo o apoio, que sempre veio regado a muitas

risadas e união. Meus dias foram muito alegres ao lado de vocês.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos, e às demais instituições

que direta ou indiretamente colaboraram com a realização deste trabalho.

RESUMO

CUNHA, M.G. Avaliação do efeito de extratos de compostos fenólicos da jabuticaba Sabará

(Myrciaria jaboticaba (Vell) Berg) administrada a camundongos C57BL/6 alimentados com

dieta hiperlipídica com alto teor de sacarose. 2016. 51f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade

de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Crescem a cada dia os índices globais de obesidade associada à síndrome metabólica

(SM) e à inflamação. Sob este aspecto, os compostos fenólicos (CFs) exercem papel importante,

especialmente no que diz respeito às suas propriedades anti-inflamatória e antiobesogênica. A

jabuticaba Sabará (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg) é uma fruta nativa bem aceita pelos

brasileiros e rica em CFs. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da administração diária de

extratos ricos em CFs desta fruta a camundongos C57BL/6, alimentados com dieta hiperlipídica

com alto teor de sacarose (HFHS) por 8 semanas. Os extratos ricos em CFs foram obtidos por

extração do fruto inteiro em solução metanol/água (80:20, v/v), seguida de rotaevaporação e

extração em fase sólida (EFS). Os animais foram distribuídos em 5 grupos: o grupo Padrão

recebeu dieta padrão de laboratório e veículo (água) por gavagem, o grupo HFHS recebeu dieta

HFHS e veículo, o grupo EB recebeu 200 mg b. s. (base seca)/kg de peso corporal (PC) de

extrato bruto (EB), o grupo C18 recebeu 50 mg EAG (equivalentes de ácido gálico)/kg de PC do

extrato obtido em sorvente octadecil silano (C18) (que permite a obtenção de todos os CFs da

fruta) e o grupo PA recebeu 50 mg EAG/kg de PC do extrato obtido em sorvente poliamida (PA)

(que permite a obtenção de todos os CFs da fruta, exceto os elagitaninos). O grupo C18

apresentou menores ganho de peso, adiposidade e eficiência energética, comparado ao grupo

HFHS. Já o grupo EB teve menor expressão gênica do fator de necrose tumoral alfa (TNF- α) no tecido adiposo branco epididimal, e menor concentração deste mesmo marcador no fígado.

Estes resultados sugerem que os elagitaninos têm um papel importante na redução do risco do

desenvolvimento de obesidade em camundongos que receberam dieta indutora de obesidade e

SM, enquanto o EB da fruta parece contribuir para a redução da inflamação destes animais,

porém os mecanismos para tal ainda não estão esclarecidos.

PALAVRAS-CHAVE: obesidade, síndrome metabólica, inflamação, compostos fenólicos,

jabuticaba Sabará.

ABSTRACT

CUNHA, M.G. Evaluation of effects of phenolic-rich jaboticaba Sabará (Myrciaria

jaboticaba (Vell.) Berg) extract in mice C57BL/6 fed a high fat / high sucrose diet 2016. 51f.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2016.

The incidence of obesity is increasing associated with other disorders as metabolic

syndrome (MS) and low-grade inflammation. Phenolic compounds (PC) have some well-known

properties, such as anti-inflammatory, antidiabetic and antiobesity capacities. Jaboticaba Sabará

(Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg) is a brazilian fruit well accepted in this country and it has a

high PCs amount. The aim of this study was to investigate the effects of phenolic-rich jaboticaba

extracts in C57Bl/6J mice fed a high fat/high sucrose (HF/HS) diet during 8 weeks. The

phenolic-rich jaboticaba extracts were prepared from fruit extraction in methanol/water solution

(80:20, v/v), followed by rotary evaporation and solid phase extraction (SPE). The mice were

distributed in 5 groups: the Chow group was fed a chow diet and gavaged daily with vehicle

(water), the HFHS group was fed a HF/HS diet vehicle as well, the CE group received 200 mg of

jaboticaba crude extract (CE)/kg body weight (BW), the C18 group received 50 mg AGE (acid

galic equivalent)/kg BW of phenolic-rich jaboticaba extract obtained by octadecyl silane (C18)

sorbent (which permits to extract every PCs from the fruit) and the PA group were gavaged with

50 mg AGE/kg BW of this fruit extract obtained by polyamide (PA) sorbent (which allows to

extract every PCs from jaboticaba, excepting ellagitannins). The C18 group had the lowest BW

gain, adiposity and energy efficiency, compared to the HFHS group. The CE group presented

low tumor necrose factor-α (TNF-α) gene expression on epididymal white adipose tissue and it

had also a low hepatic concentration of this inflammatory marker, compared to HFHS group.

These results suggest ellagitannins has an important role on reducing risk of obesity in HF/HS-

fed mice, while jaboticaba CE seems to contribute on reduction of inflammation in these

animals, but the mechanisms are still not understood.

KEY WORDS: obesity, metabolic syndrome, inflammation, phenolic compounds, jaboticaba

Sabará.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 11

1.1 Obesidade: epidemia mundial ...................................................................................................... 11

1.1.1 Fisiopatologia da obesidade .......................................................................................................... 11

1.1.1.1 Obesidade e inflamação ................................................................................................................. 11

1.1.1.2 A influência do intestino na obesidade e na inflamação ....................................................... 12

1.1.2 Medidas para ajudar a reverter o quadro mundial da obesidade ......................................... 14

1.2 Compostos fenólicos na inflamação e na obesidade .............................................................. 15

1.2.1 Compostos fenólicos: definição, classificação e principais fontes alimentares ............. 15

1.2.2 Efeitos dos compostos fenólicos na saúde ................................................................................ 16

1.2.3 Jabuticaba Sabará: fruta brasileira rica em compostos fenólicos........................................ 17

3. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 19

3.1 Objetivo geral.................................................................................................................................... 19

3.2 Objetivos específicos ..................................................................................................................... 19

4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 20

4.1 Preparo dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará ...................... 20

4.1.2 Caracterização dos extratos .......................................................................................................... 21

4.1.2.1 Capacidade redutora do Folin-Ciocalteu .................................................................................. 21

4.1.2.2 Teor de proantocianidinas pelo método do butanol acidificado ........................................ 21

4.1.2.3 Teor de proantocianidinas pelo método DMAC ...................................................................... 21

4.1.2.4 Teor de ácido elágico total por hidrólise ácida ....................................................................... 22

4.1.2.6 Teor de açúcares totais pelo método Dubois ........................................................................... 22

4.2 Modelo animal .................................................................................................................................. 23

4.2.1 Avaliação de marcadores inflamatórios no fígado, no plasma e no tecido adiposo branco

epididimal ............................................................................................................................................................. 26

4.2.1.1 Concentração de IL-6 e de TNF-α no fígado e no plasma ....................................................... 26

4.2.1.2 Expressão gênica de IL-6 e de TNF-α pelo método de reação em cadeia da polimerase 27

4.2.2 Expressões gênicas de LPL e FAS no tecido adiposo branco epididimal e de UCP-1 no

tecido adiposo marrom pelo método de reação em cadeia da polimerase .......................................... 28

4.2.3 Concentração de triacilglicerol hepático ........................................................................................ 29

4.3 Análise de resultados ........................................................................................................................... 29

5. RESULTADOS ................................................................................................................................... 30

5.1 Caracterização dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará ................ 30

5.2 Avaliação dos efeitos biológicos dos extratos obtidos a partir da jabuticaba Sabará em

camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídicas com alto teor de sacarose ............. 30

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................................ 42

7. CONCLUSÃO .................................................................................................................................... 45

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 46

11

1. INTRODUÇÃO

1.1 Obesidade: uma epidemia mundial

Em termos gerais, a obesidade é caracterizada pelo desequilíbrio entre a quantidade de

energia consumida e a gasta pelo corpo, que gera acúmulo excessivo de tecido adiposo e,

consequentemente, complicações à saúde. Dentre as principais causas da obesidade, destacam-se

o consumo excessivo de produtos de alta densidade energética e com alto teor de gorduras

saturadas e/ou açúcares, além do aumento da inatividade física associado a mudanças de estilo de

vida geradas pela urbanização (WHO, 2015; SAMPLE et al., 2015).

Segundo a Organização Mundial da Saúde, a prevalência de casos de obesidade em todo

o mundo duplicou entre 1980 e 2014, quando o número de adultos (com 18 anos de idade ou

mais) com sobrepeso já ultrapassava 1,9 bilhões e, dentre estes, 600 milhões já eram

considerados obesos. No que se refere às crianças com idade inferior a 5 anos, em 2013, 42

milhões delas já apresentavam obesidade ou sobrepeso (WHO, 2015).

1.1.1 Fisiopatologia da obesidade

1.1.1.1.1 Obesidade e inflamação

O tecido adiposo é considerado um órgão endócrino que exerce papel fundamental no

desenvolvimento da obesidade e do quadro inflamatório crônico de baixo grau que a acompanha

(DOYLE et al., 2012). Existem 3 diferentes tipos de adipócitos:

- branco: responsável por estocar lipídeos, produzir hormônios e substâncias

inflamatórias (KROTKIEWSKI, 1983). O acúmulo de triacilglicerol (TG) no adipócito é uma das

principais formas de estoque de lipídeos, dependente de enzimas lipogênicas como a lipase

lipoproteica (LPL, do inglês, lipoprotein lipase) e a ácido graxo sintase (FAS, do inglês, fatty

acid synthase) (FONSECA-ALANIZ et al., 2006; VERLENGIA; LIMA, 2002);

- marrom: exerce papel importante na manutenção da temperatura corporal e no

metabolismo energético (termogênese). Sob este aspecto, destaca-se a importância da

termogenina ou uncoupling protein-1 (UCP-1), proteína expressa por estes adipócitos e

12

abundantemente encontrada na membrana interna de suas mitocôndrias, onde participa do seu

desacoplamento e da liberação de calor (energia). Estudos recentes também sugerem que os

adipócitos marrons exercem influência no controle da sensibilidade à insulina

(CHONDRONIKOLA et al., 2014; VIRTANEN et al., 2009);

- bege: encontrado no tecido adiposo branco subcutâneo (junto aos adipócitos brancos).

Apresenta características similares às de ambos os adipócitos citados acima, como o fato de

serem capazes de armazenar lipídeos, mas também de dissipar calor através da UCP-1 (WU, J. et

al., 2012).

O tecido adiposo branco (formado basicamente por adipócitos brancos e células dos

sistemas imunitário, vascular e neuronal) é classificado basicamente como visceral e subcutâneo,

dependendo de sua localização. Sob este aspecto, o tecido adiposo branco visceral destaca-se por

apresentar maior capacidade proinflamatória, a qual é bem evidenciada na obesidade, quando

favorece o risco de desenvolvimento das complicações associadas à síndrome metabólica (SM),

tais como resistência à insulina (RI), diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias, hipertensão arterial,

doenças cardiovasculares e hepáticas como a esteatohepatite não-alcoólica (FAROOQ; FARWA;

KHAN, 2015; GUSTAFSON; SMITH, 2015).

Esta inflamação inicia-se com o acúmulo de lipídeos nos adipócitos brancos (obesidade

hipertrófica), a qual faz com que estas células secretem proteína quimiotática de monócitos

(MCP-1), uma quimiocina que sinaliza a infiltração de macrófagos e de outras células do sistema

imunitário no tecido adiposo branco. Com a infiltração dos macrófagos, os adipócitos também

são estimulados a secretar a citocina fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Além disso, tanto os

adipócitos quanto os macrófagos, uma vez estimulados pela obesidade hipertrófica, têm ativada

uma série de proteínas inflamatórias, tais como as interleucinas 1β e 6 (IL-1β e IL-6,

respectivamente), entre outras. É a ativação desta cascata proinflamatória que está diretamente

relacionada ao aumento do risco de SM (GUSTAFSON; SMITH, 2015; GAO et al., 2014;

NORSEEN et al., 2012; KANDA et al., 2006).

1.1.1.2 A influência do intestino na obesidade e na inflamação

Outro fator importante a ser considerado na relação entre obesidade, inflamação e SM é

a condição intestinal. Indivíduos obesos apresentam alteração na microbiota intestinal, mais

13

especificamente um aumento na proporção entre bactérias intestinais gram-positivas dos filos

Firmicutes e Actinobacteria e uma redução das gram-negativas Bacteroidetes; essa mudança

implica em diferenças no metabolismo energético, as quais induzem à obesidade, uma vez que a

microbiota de indivíduos obesos parece ter maior habilidade para favorecer o acúmulo de

energia. Além disso, esta alteração na população bacteriana intestinal de obesos aumenta a

permeabilidade intestinal, o que é evidenciado pelos altos níveis plasmáticos de

lipopolissacarídeo (LPS), principal componente da membrana de bactérias gram-negativas. Uma

vez em níveis elevados na corrente sanguínea, o LPS também induz à inflamação e,

consequentemente à SM (ANHÊ et al., 2015; CARICILLI; SAAD, 2013; DING, 2010;

TURNBAUGH, 2009; CANI et al., 2007; BACKHED et al., 2004).

A Figura 1 a seguir ilustra a relação entre o aumento dos níveis de LPS no plasma e a

RI. No tecido adiposo e no músculo esquelético, o processo normal de entrada de glicose nas

células inicia-se com a chegada da insulina à corrente sanguínea, a qual, em contato com seu

receptor celular, localizado na parte externa da membrana plasmática, ativa a sua autofosforilação

em resíduos de tirosina, bem como a fosforilação de proteínas denominadas substratos de

receptores de insulina (IRSs) – como os IRSs 1 e 2, também ilustrados nesta figura. Uma vez

fosforilados em tirosina, os IRSs 1 e 2 ativam alostericamente a fosfatidilinositol 3 quinase (PI3

quinase) e consequentemente, a proteína quinase B (Akt), que promove a translocação do

GLUT4 (do inglês, glucose transporter type 4) para a membrana celular, e assim, a captação de

glicose (CARICILLI; SAAD, 2013).

14

Figura 1. Relação entre presença de LPS (lipopolissacarídeo) na circulação sanguínea e redução

da sensibilidade à insulina (adaptado de Caricilli e Saad, 2013). TLR4: tool like receptor tipo 4;

IRS-1/2: substratos de receptores de insulina tipos 1 e 2; PI3 kinase: fosfatidilinositol 3 quinase;

AKT: proteína quinase B; IKK: IkB quinase; JNK: c-Jun N-terminal quinase.

Porém, na presença de processo inflamatório, ocorre a ativação de proteínas da família

TLR (do inglês, Toll Like Receptor) que interferem nesta sinalização intracelular da insulina.

Mais especificamente, o TLR do tipo 4 é ativado na presença de LPS e de gorduras saturadas,

quando promove a fosforilação de diversas outras proteínas quinases, até finalmente ativar as

proteínas c-Jun N-terminal quinase (JNK) e IkB quinase (IKK), que são gatilho para a produção

de citocinas inflamatórias como a IL-6 e o TNF-α. Além disso, a ativação do TLR4 também

promove a fosforilação da serina em lugar da tirosina, o que reduz a ação dos IRSs e,

consequentemente, a entrada de glicose na célula (CARICILLI; SAAD, 2013).

1.1.2 Medidas para ajudar a reverter o quadro mundial da obesidade

Para ajudar a reverter esta epidemia mundial, que é a obesidade, as medidas mais

conhecidas são: a restrição do consumo de alimentos ricos em gorduras (especialmente as do tipo

15

saturadas) e açúcares, além da prática regular de atividade física. Porém, nos últimos anos,

também tem sido destacada a importância do aumento do consumo de fontes de compostos

bioativos para esta finalidade, tais como frutas, verduras, legumes, grãos integrais e oleaginosas

(WHO, 2015; SAMPLE et al, 2015; BASTOS; ROGERO; ARÊAS, 2009).

1.2 Compostos fenólicos na inflamação e na obesidade

1.2.1 Compostos fenólicos: definição, classificação e principais fontes alimentares

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), compostos bioativos

são não-nutrientes de ação metabólica ou fisiológica específica no organismo. Dentre eles,

destacam-se os compostos fenólicos (CFs), que são os compostos bioativos mais abundantes na

dieta e mais relacionados a benefícios à saúde (CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009).

Os CFs são produtos do metabolismo secundário de plantas, denominados desta forma

por possuírem ao menos um anel aromático ligado a pelo menos um grupo hidroxila. No reino

vegetal, já foram identificadas mais de 8.000 estruturas fenólicas, sendo que uma parte

considerável destas foi detectada em alimentos (CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009;

STRACK, 1997).

Os CFs são comumente classificados conforme a quantidade e a disposição de seus

átomos de carbono e podem ser encontrados conjugados a moléculas de açúcar e/ou a ácidos

orgânicos. As principais classes de CFs são:

- flavonoides: apresentam 15 carbonos e 2 anéis aromáticos unidos por 3

carbonos. São os CFs mais encontrados no Reino Vegetal, especialmente nas folhas e frutos das

plantas. Suas principais subclasses são: flavonóis, flavonas, flavan-3-óis (que abrangem

catequinas e epicatequinas), antocianidinas, flavanonas e isoflavonas;

- não-flavonoides: compreendem os ácidos fenólicos (dentre os quais destacam-

se os ácidos gálico e elágico) e os taninos (condensados, que incluem as proantocianidinas, e

hidrolisáveis, que incluem os elagitaninos) (CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009;

SCALBERT; WILLIAMSON, 2000; STRACK, 1997).

16

Dentre as principais fontes de CFs consumidas na maior parte do mundo estão os chás

verde e preto, o café, o cacau/chocolate, a cebola, as oleaginosas, as bebidas alcoólicas

fermentadas tais como vinho tinto, cerveja e cidra, além de frutas como as berries, a romã e a

jabuticaba (ALEZANDRO et al., 2013a; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009).

1.2.2 Efeitos dos compostos fenólicos na saúde

Dentre as propriedades mais conhecidas dos CFs estão seu grande potencial anti-

inflamatório, antioxidante, hipoglicêmico, hipolipidêmico e até mesmo antifúngico e

antibacteriano. Estas características são bem consolidadas através de estudos que comprovam os

efeitos positivos dos mesmos, por exemplo, na redução de dislipidemias, RI, inflamação,

obesidade, disbiose intestinal, complicações cardiovasculares e hepáticas, e até mesmo em alguns

tipos de câncer (ANHÊ et al., 2015; KUBATKA, P. et al., 2015; ROOPCHAND et al., 2015;

BORGES; CONCEIÇÃO; SILVEIRA, 2014; YOSHIMURA et al., 2013; PARK et al., 2011;

SHRESTHA et al., 2009).

Um estudo desenvolvido por Anhê et al. (2015) mostrou que a administração de 200 mg

de base seca (b. s.)/kg de peso corporal do extrato bruto (EB) de cranberry (rico em CFs, tais

como flavonóis e proantocianidinas) a camundongos que receberam dieta com alto teor de

gorduras e sacarose (conhecida como dieta HFHS, do inglês high-fat high-sucrose) por 8

semanas foi eficaz em evitar o acúmulo de tecido adiposo branco, melhorar a sensibilidade à

insulina, bem como em reduzir os níveis plasmáticos de LPS e da síntese de marcadores

inflamatórios no fígado e no intestino (tais como TNF-α, COX-2 (cicloxigenase 2) e NF-kB

(fator nuclear kappaB)). O extrato também ajudou a evitar o acúmulo hepático de TG e melhorou

significativamente a microbiota intestinal, tornando-a similar à de indivíduos magros (em termos

de equilíbrio entre as populações bacterianas Bacteroidetes e Firmicutes).

Já outro estudo de Yoshimura et al. (2013) mostrou que a administração de 0,1% de

ácido elágico (CF presente em frutas como morango e framboesa), na forma livre, adicionado à

dieta hiperlipídica de ratos obesos e hiperglicêmicos por 68 dias, promoveu a melhora dos níveis

glicêmicos e insulinêmicos destes animais, além de uma melhora do perfil lipídico sérico

(redução dos níveis de ácidos graxos livres e de TG, associada ao aumento dos níveis de HDL-

col (do inglês, high density lipoprotein-cholesterol). Análises histológicas do fígado destes ratos

17

também indicaram que houve formação de poucas microvesículas lipídicas, em comparação às

muitas macrovesículas encontradas no grupo controle.

Outra classe de CFs que tem sido foco de muitos estudos são as antocianinas,

responsáveis pela coloração vermelha, azul e violeta de diversos vegetais, dentre eles a

framboesa, o morango e a jabuticaba. Diversos estudos mostram suas propriedades antioxidante,

antimicrobiana, anticarcinogênica e antiviral (BORGES; CONCEIÇÃO; SILVEIRA, 2014; WU,

S. et al., 2012). Além disso, seus efeitos associados à melhora da RI e da inflamação também têm

sido comprovados, por exemplo, através de um estudo realizado por Jennings et al. (2014), que

calculou, através de questionário alimentar, a quantidade de antocianinas presente na dieta de

1.997 mulheres saudáveis com idade entre 18 e 76 anos. Os resultados mostraram que o alto

consumo de fontes de antocianinas estava associado a baixos níveis séricos de marcadores de

inflamação (como a proteína C-reativa) e a menores níveis insulinêmicos.

1.2.3 Jabuticaba Sabará: fruta brasileira rica em compostos fenólicos

O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, atrás apenas da China e da Índia.

A produção brasileira é de cerca de 41,5 milhões de toneladas por ano, o que corresponde a 5%

da produção mundial (SEAB/DERAL, 2015).

Dentre as frutas brasileiras de grande aceitação, destaca-se a jabuticaba (Myrciaria spp.).

Pertencente à família botânica Myrtaceae, a jabuticaba é uma fruta cultivada na Mata Atlântica,

especialmente no estado de São Paulo. Consumida não apenas na forma in natura, mas também

em sucos, geleias, vinhos e licores, ela apresenta grande potencial junto à indústria de alimentos

(DONADIO, 2000).

Um estudo de Alezandro et al. (2013a) caracterizou o perfil de CFs da jabuticaba e

concluiu que nas suas sementes há altas concentrações de elagitaninos e de proantocianidinas,

enquanto na sua casca existem elevados teores de antocianinas e de derivados de quercetina.

Comparada a outras 35 frutas comercializadas no Brasil (de diferentes famílias botânicas),

a jabuticaba Sabará (Myrciaria jaboticaba) também se destaca pelo alto teor de ácido elágico,

que chega a ser maior que o das berries, tais como blueberry, cranberry e morango. Estes altos

teores de ácido elágico total são derivados dos elagitaninos, uma vez que o teor de ácido elágico

18

livre desses frutos é muito baixo (em torno de 2 a 5% do total de ácido elágico) (ABE et al.,

2012).

No que diz respeito às antocianinas e aos derivados de quercetina, presentes

predominantemente na casca da jabuticaba Sabará, um experimento de 10 semanas com ratos da

linhagem Sprague-Dawley que receberam dieta hiperlipídica junto com a casca da fruta

liofilizada comprovou que a presença da mesma reduziu os níveis de insulina sérica e aumentou

os níveis de HDL-col plasmático (LENQUISTE et al., 2012).

Outro estudo desenvolvido por Alezandro et al. (2013b) comparou 2 diferentes tipos de

extratos de jabuticaba Sabará – um obtido em coluna octadecil silano (C18, que permite a

obtenção de todos os CFs da fruta) e outro, obtido em coluna poliamida (PA, para obtenção de

todos os CFs, exceto os elagitaninos). Cada grupo de camundongos recebeu doses diárias de

extrato (calculadas a partir de 3 g de fruta liofilizada/kg de peso corporal, o que equivale a cerca

de 50 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/kg de peso corporal quando purificado em coluna

C18) durante 8 semanas, concomitantemente com a dieta HFHS. Os resultados mostraram que o

grupo que recebeu o extrato obtido em coluna C18 apresentou menor ganho de peso corporal,

menor acúmulo de TG hepático e melhor sensibilidade à insulina, evidenciando a influência dos

elagitaninos (ou de sua ação sinérgica com o restante dos CFs da jabuticaba Sabará) no controle

destes fatores.

19

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral:

- Avaliar o efeito de CFs da jabuticaba Sabará sobre a adiposidade e outros fatores

relacionados à SM (como esteatohepatite não-alcoólica, inflamação, sensibilidade à insulina e

integridade intestinal) de camundongos que receberam dieta indutora de SM.

2.2 Objetivos específicos:

- Caracterizar quimicamente os extratos ricos em CFs da jabuticaba Sabará em relação ao

conteúdo de fenólicos totais, ácidos fenólicos, flavonoides e outros compostos.

- Determinar o efeito da administração diária destes extratos sobre a adiposidade,

avaliando especificamente enzimas relacionadas ao metabolismo de gorduras, sobre a eficiência

energética, a sensibilidade à insulina, a concentração de marcadores inflamatórios e de

integridade intestinal em camundongos machos da linhagem C57BL/6 alimentados com dieta

HFHS por 8 semanas.

20

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Preparo dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará

A jabuticaba Sabará madura foi colhida em janeiro de 2014 em São João da Boa Vista

(latitude 21º 58' 09" S e longitude 46º 47' 53" W), no estado de São Paulo, e obtida de plantação

comercial na mesma época através da Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São

Paulo (CEAGESP), um dos principais distribuidores de frutas, verduras e legumes do Estado.

As amostras foram lavadas, congeladas (-20º C) e liofilizadas. Depois, foram

homogeneizadas em gral e pistilo, com auxílio de nitrogênio líquido, uniformizadas em tamis 80

mesh e armazenadas a -20° C.

Para a obtenção dos extratos ricos em CFs, as amostras foram extraídas em solução de

metanol/água/ácido acético (70:29,5:0,5), na proporção de 1:50 (m/v) por 2 horas sob agitação a

5º C. O procedimento se repetiu por mais 2 vezes (1 hora por vez). A mistura foi filtrada a vácuo

com papel de filtro (Whatman nº 1) e rotaevaporada (RE 120 Buchi®; Danderyd, Suécia) a 37º C

até secagem e ressuspendida em água destilada. A partir desta etapa, foram preparados os 3

diferentes extratos a serem administrados aos animais no experimento in vivo, de acordo com as

etapas a seguir:

- extrato bruto (EB): a amostra ressuspendida em água foi congelada, liofilizada para

obtenção de 200 mg (b. s.)/kg de peso corporal e rediluída em 200 a 250 µL de água destilada por

dose administrada a cada animal;

- extrato C18: um volume de amostra ressuspendida equivalente a 0,5 g de extrato

liofilizado foi adicionado a um tubo de extração em fase sólida com 1 g de sorvente C18

(Supelclean® LC-18 SPE; Sigma-Aldrich Co., St Louis, Estados Unidos) para obtenção de todos

os CFs da jabuticaba. Em seguida, foi feita lavagem do tubo com água destilada e eluição com 20

mL de metanol. A amostra foi rotaevaporada novamente (RE 120 Buchi®; Danderyd, Suécia) a

37º C até secagem e ressuspendida em volume de água destilada suficiente para conter 50 mg

EAG/kg peso corporal do animal;

- extrato PA: o mesmo procedimento descrito acima foi seguido para obtenção dos CFs da

jabuticaba, com exceção dos elagitaninos. Porém, para esta extração, ao invés de se utilizar

sorvente C18, utilizou-se PA (PA CC6 Macherey-Nagel GmbH & Co.; Düren, Alemanha). Para

21

eluição, foi utilizado mesmo volume de metanol, seguido de 60 mL de metanol/amônia (99,5:0,5

v/v). Ao final, obteve-se a mesma concentração de extrato (50 mg EAG/kg peso).

4.1.2 Caracterização dos extratos

4.1.2.1 Capacidade redutora do Folin-Ciocalteu

O teor de CFs totais foi determinado através do método Folin-Ciocalteu (SINGLETON;

ORTHOFER; LAMUELA-RAVENTOS, 1999), com adaptações. A 250 μL de extrato diluído

adicionaram-se 2 mL de água destilada e 250 μL do reagente Folin-Ciocalteu (ácido

fosfotúngstico-fosfomolíbdico) (Sigma-Aldrich Co.; St Louis, Estados Unidos). Após 3 minutos à

temperatura ambiente, foram adicionados 250 μL de solução saturada de carbonato de sódio

(Na2CO3) e os tubos foram levados a banho em água (37º C) por 30 minutos, quando surgiu a

coloração azulada. Os resultados foram expressos em equivalentes de ácido gálico /mL extrato. O

ácido gálico também foi adquirido da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, Estados Unidos).

4.1.2.2 Teor de proantocianidinas pelo método do butanol acidificado

A quantificação de proantocianidinas foi realizada conforme descrito por Skerget et al.

(2005) com adaptações. Foram adicionados 250 µL de amostra devidamente diluída em um tubo

com solução de n-butanol/HCl, o qual foi tampado e levado a banho em água (95ºC) por 15

minutos. Após atingir temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 540 nm. Os resultados

foram expressos em mg equivalentes de cianidina-3-rutinosídeo/mL extrato. O padrão foi

adquirido da empresa Extrasynthèse (Genay, France).

4.1.2.3 Teor de proantocianidinas pelo método DMAC

De acordo com a metodologia de Prior et al. (2010) com algumas modificações, 70 µL de

amostra previamente diluída foi colocada em microplaca transparente de 96 poços, seguida pela

adição de 210 µL de solução 4-dimetilaminocinamaldeído (DMAC), adquirida pela empresa

Sigma-Aldrich Co. (St Louis, USA). Em seguida, a microplaca foi incubada a 25ºC por 30

minutos, enquanto foi medida a cada minuto a absorbância a 640 nm. Ao final, foi selecionada a

absorbância de máximo valor, dentro deste intervalo de tempo. A concentração de

22

proantocianidinas por amostra foi expressa em equivalentes de procianidina B2 (Extrasynthèse;

Genay, France) por 1 mL de extrato.

4.1.2.4 Teor de ácido elágico total por hidrólise ácida

A quantificação de ácido elágico total foi feita de acordo com Pinto, Lajolo e Genovese

(2008), com adaptações. A 1 mL de amostra, foi adicionado 1 mL de ácido trifluoroacético (4N)

a 120º C por 90 minutos para ocorrer hidrólise. Em seguida, a solução foi seca sob nitrogênio,

ressuspendida em metanol e filtrada para análise em cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE), segundo Arabbi, Genovese e Lajolo (2004). As amostras de extrato PA foram

rotaevaporadas a 38ºC, ressuspendidas em 1 mL de metanol para cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) e filtradas em filtros de politetrafluoroetileno (PTFE) (Millipore Ltd, Bedford,

MA). Para identificação e quantificação dos compostos, foi utilizada coluna Prodigy 5 μm ODS(3) (250 x 4.6 mm, Phenomenex Ltd, Torrance, CA). O gradiente de solventes utilizado foi

constituído por A (água : tetrahidrofuroano : ácido trifluoroacético – 98 : 2 : 0,1) e B

(acetonitrila), de forma a ter 17% de B por 2 min., 25% de B após 5 min., 35% de B após 8 min.

e 50% de B após mais 5 min. Utilizou-se cromatógrafo do sistema Hewlett-Packard 1100 com

injetor automático de amostras, bomba quaternária e detector de arranjo de diodo (DAD), sob

controle do software ChemStation. As amostras foram injetadas e o composto fenólico foi

avaliados, por meio da comparação do tempo de retenção e espectro com os padrões. A

quantificação foi baseada em calibração externa e os padrões foram adquiridos da Sigma-Aldrich

Co. (St. Louis, EUA) e da Extrasynthèse (Genay, França).

4.1.2.6 Teor de açúcares totais pelo método Dubois

De acordo com Dubois et al. (1956) com modificações, foram adicionados 500 μL da

amostra previamente diluída, 500 μL de fenol (5%) e 5 mL de ácido sulfúrico em um tubo. Após

10 min., a solução foi agitada e, ao atingir temperatura ambiente, foi feita leitura da absorbância a

490 nm. Os resultados foram expressos em mg equivalentes de glicose por mL de extrato. O

padrão de glicose foi adquirido da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EUA).

23

4.2 Modelo animal

Foi realizado o experimento in vivo durante 8 semanas, com 60 camundongos machos da

linhagem C57BL/6, que receberam dieta padrão de laboratório (Quadro 1) ou dieta HFHS

(Quadro 2) indutora de obesidade e de SM. Os animais foram mantidos em ambiente com

temperatura de 25ºC, 75% de umidade, ciclos alternados de 12 h luz/12 h escuro, com ração e

água ad libitum. Eles foram separados aleatoriamente em 5 grupos, conforme a seguir:

- Grupo Padrão (n=12): animais alimentados com dieta padrão de laboratório e água por gavagem;

- Grupo HFHS (n=12): animais controle alimentados com dieta HFHS e água (gavagem);

- Grupo EB (n=12): animais alimentados com dieta HFHS, e o EB da jabuticaba na dose

de 200 mg (b. s.)/kg de peso corporal (correspondentes a 10 mg EAG/kg de peso corporal) por

gavagem;

- Grupo C18 (n=12): animais alimentados com dieta HFHS e extrato C18 (para conter

todos os CFs da fruta), na mesma dose de 50 mg EAG/kg de peso corporal (gavagem);

- Grupo PA (n=12): animais alimentados com dieta HFHS e extrato PA (para conter os

CFs da fruta, exceto elagitaninos), em dose correspondente a 50 mg EAG/kg de peso corporal

(gavagem).

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Proteção aos Animais da

Universidade Laval (Québec City, Canada) e todos os procedimentos foram realizados em

completa conformidade com a legislação canadense do assunto.

O peso corpóreo e a ingestão alimentar dos animais foram monitorados 2 vezes por

semana. Os tecidos adiposos retroperitoneal, epididimal e inguinal foram coletados ao final para

avaliação da variação de adiposidade dos animais.

24

Quadro 1. Composição centesimal da dieta padrão 2018 Teklad Global® utilizada no

experimento in vivo, conforme informação fornecida pelo fabricante (Harlan Laboratories).

Componentes Quantidade Valor energético Valor energético

(g/100g) (kcal/100g) (%)

Proteína bruta 18,6 74,4 24,0

Extrato etéreo 6,2 55,8 18,0

Matéria fibrosa 3,5 - -

Carboidratos 45,0 180,0 58,0

(calculados por diferença)

Cálcio 1,0 - -

Fósforo 0,7 - -

Sódio 0,2 - -

Potássio 0,6 - -

Cloro 0,4 - -

Magnésio 0,2 - -

Total 310,0 100,00

Quadro 2. Composição de ingredientes da dieta HFHS utilizada no experimento in vivo.

Componentes Quantidade Valor energético Valor energético

(g/100 g) (kcal/100 g) (%)

Caseína 20,0 80,0 14,7

L-cistina 0,2 0,7 0,1

Sacarose 26,9 107,6 19,8

Celulose 5,0 - -

Mistura de minerais 6,7 - -

Mistura de vitaminas 1,4 - -

Gordura de porco 19,8 178,2 32,7

Óleo de milho 19,8 178,2 32,7

Bitartarato de colina 0,2 - -

Total 100,0 544,7 100,0

Fonte: Anhê et al. 2015

25

Na 6ª semana os animais foram avaliados por teste de tolerância à insulina

intraperitoneal (TTIIP), segundo a metodologia descrita por Protzek et al. (2010) com

modificações. Antes da administração de insulina, foram coletadas alíquotas de sangue via

caudal, correspondentes ao tempo zero (T0). A seguir, foi injetada solução de insulina por via

intraperitoneal (0,65 UI/kg peso corporal), e então, foram coletadas novas alíquotas de sangue

(também por via caudal) após 5, 10, 15, 20, 30 e 60 minutos, para determinação da glicemia

(determinada por glicosímetro Accu-Check Active Roche® C.15198 (Hoffman-La Roche AG,

Basel, Suíça)).

Na 7ª semana foram coletadas as fezes produzidas por cada animal dentro do período de

24 horas e, em seguida, as mesmas foram congeladas a -80º C para avaliação de seu conteúdo

energético. As amostras fecais foram secas em capela e inseridas em bomba calorimétrica 6100

Compensed Jack Calorimeter® (Parr Instrument Company, Moline, EUA) para determinação de

seu conteúdo energético. Os resultados foram expressos em kcal/amostra (24 h).

Na 8ª semana, os animais foram avaliados por meio de teste oral de tolerância à glicose

(TOTG), conforme descrito por Xu et al. (2009), com adaptações. Após jejum de 12 horas, foram

coletadas alíquotas de sangue por veia safena referentes aos tempos zero (T0, que precede a

administração da dextrose), 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração de 2 µL de solução de

dextrose / g de peso corporal. Para o índice HOMA-IR (do inglês, homeostatic model assessment – insulin resistance), a glicemia foi determinada através do glicosímetro Accu-Check Active

Roche® C.15198 (Hoffman-La Roche AG, Basel, Suiça) e a insulina foi avaliada através de kit

bioquímico comercial ELISA Alpco® (American Laboratory Products Company, Salem, EUA);

o cálculo do índice foi feito com base na fórmula: [insulinemia de jejum (µUI/mL) x glicemia de

jejum (mmol/L)] / 22,5.

Ao final do experimento, os animais foram eutanasiados, após jejum de 6 horas, com a

administração inalatória de isofluorano (5%) diluído em oxigênio (através de máscara facial),

seguida de punção cardíaca.

A Figura 2 a seguir descreve resumidamente o cronograma do experimento animal

detalhado acima.

26

Figura 2. Modelo animal com dieta indutora de síndrome metabólica e análises de avaliação

de seu efeito. HFHS: do inglês, high-fat high-sucrose diet; EB: extrato bruto; C18 (octadecil

silano, referente a outro sorvente utilizado para o mesmo fim); PA: poliamida (referente ao

sorvente utilizado para preparo de extrato a ser administrado aos animais); TTIIP: teste de

tolerância à insulina via intraperitoneal; TOTG: teste oral de tolerância à glicose.

4.2.1 Avaliação de marcadores inflamatórios no fígado, no plasma e no tecido adiposo

branco epididimal

4.2.1.1 Concentração de IL-6 e de TNF-α no fígado e no plasma

As concentrações plasmáticas e hepáticas de IL-6 e de TNF-α foram avaliadas por meio

de kits bioquímicos comerciais ELISA R&D Systems® (R&D Systems, Inc., Minneapolis,

EUA). Já a análises da concentração de LPS foi realizada com uso do kit bioquímico comercial

ELISA MyBiosource® (MyBiosource, Inc., San Diego, EUA).

27

4.2.1.2 Expressão gênica de IL-6 e de TNF-α pelo método de reação em cadeia da

polimerase

O ácido ribonucléico (RNA) dos tecidos hepático e adiposo branco epididimal foram

extraídos com o reagente Trizol® (50 a 100 mg tecido/mL Trizol®) e posterior homogeneização.

(No caso do tecido adiposo epididimal, foi necessária incubação por 5 minutos, à temperatura

ambiente, ao final desta etapa.)

Em seguida, foram adicionados 200 µL de clorofórmio, quando surgiu a coloração rósea.

As amostras foram, então, homogeneizadas e centrifugadas por 15 minutos a 21.913 g e a 4° C.

Da fase sobrenadante, foram coletados 300 µL e adicionado o mesmo volume de etanol (100%).

O conteúdo foi transferido para tubo com coluna de lã de vidro e centrifugado por 1 minuto a

25.155 g, a 4°C. A lavagem e a eluição da coluna foi feita com uso de kit comercial Gene JET

RNA Purification - Thermo Fisher Scientific® (Life Technologies Ltd., Waltham, EUA).

Para cálculo da concentração de RNA, as amostras foram diluídas em água (1:25) e

submetidas à leitura espectofotométrica em comprimentos de onda de 260 e 280 nm, para

avaliação da concentração e pureza do RNA total (RNAtot). A razão A260/280 é proporcional à

concentração de RNA total na amostra (SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS, 1989).

Ajustadas as concentrações de RNA, foi adicionado kit comercial Thermo Fisher

Scientific® (Life Technologies Ltd., Waltham, EUA) às amostras, que foram então incubadas em

termociclador Rotor-Gene RG-3000A RCobertt Research®, controlado pelo software Rotor Gene

- Cobertt Research® (ambos da empresa Montreal Biotech, Inc., Kirkland, Canadá) com ajuste de

temperaturas adequadas para que ocorra a transcrição reversa (geração de cDNA), de forma

cíclica.

Para amplificação do cDNA, foi utilizado termociclador Rotor-Gene RG-3000A Cobertt

Research® e a quantificação de cópias do gene foi realizada através do software Rotor Gene -

Cobertt Research® (ambos da Montreal Biotech, Inc., Kirkland, Canadá).

Optou-se por amplificar o cDNA destes tecidos hepático e adiposo epididimal por meio

do sistema TaqMan®. As sondas utilizadas descritas no Quadro 3, e foram adquiridos pela

empresa Integrated DNA Technologies (Coralville, EUA). Já os reagentes foram adquiridos

através da empresa Life Technologies Ltd. (Waltham, EUA).

28

Quadro 3. Localização das sondas TaqMan® referentes a genes de camundongos (Mus

musculus).

Gene (abreviação – nome) Acesso nº

Act β – actina beta Mm 01205647_g1

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa Mm00443258_m1

IL-6 – interleucina-6 Mm 00446190_m1

Os resultados foram expressos como razão entre a expressão do gene-alvo e do gene

housekeeping (Act β). A escolha do gene housekeeping se deu porque sua expressão não se altera

com a administração de extratos de jabuticaba.

4.2.2 Expressões gênicas de LPL e FAS no tecido adiposo branco epididimal e de UCP-1 no

tecido adiposo marrom pelo método de reação em cadeia da polimerase

O RNA dos tecidos adiposos marrom e branco epididimal foi extraído conforme

metodologia descrita no tópico anterior. A amplificação do cDNA de ambos os tecidos foi

realizada por meio do sistema SYBR Green® (também pertencente à empresa Life Technologies

Ltd., Waltham, EUA). Os primers utilizados estão detalhados no Quadro 4, e também foram

adquiridos pela empresa Integrated DNA Technologies (Coralville, EUA) e os reagentes, da

empresa Life Technologies Ltd. (Waltham, EUA).

Quadro 4. Sequência de nucleotídeos de primers (SYBR Green®) referentes a genes de

camundongos (Mus musculus).

Gene Acesso nº Sequência de nucleotídeos (primers)

(abreviação – nome)

Act β – actina beta NM_007393.3 forward 5'-CTC TAG ACT TCG AGC AGG AG-3' /

reverse 5'-AGA GTA CTT GCG CTC AGG AG-3'

UCP1 – termogenina NC_000074.6 forward 5’- GCA GTG TTC ATT GGG CAG CC -3’

/ reverse 5’ – GGA CAT CGC ACA GCT TGG TAC

-3’

FAS – ácido graxo NM_007988 forward 5’-CCGAGTCAGAGAACCTACAG-3’ /

sintase reverse 5′-CCTGGATAGCATTCCGAACCT-3'

LPL –lipase NM_008509 forward 5’-CTTCATTGACTCCCTGCTGAATG-3’ /

lipoproteica reverse 5’-GAAGGCCTGGTTGTGTTGCTT-3’

Fonte: Genebank

29

4.2.3 Concentração de triacilglicerol hepático

Foi feita a dosagem do conteúdo TG hepático segundo a metodologia desenvolvida por

Folch, Lees e Sloane Stanley (1957). Para tal, cerca de 0,1 g de amostra foi homogeneizada com

3 mL de solução clorofórmio / metanol, na proporção 2:1 (v/v), seguida de centrifugação por 10

minutos a 447,2 g, incubação por 12 horas a temperatura ambiente, transferência do sobrenadante

para novos tubos e adição de 750 µL de solução salina clorofórmio/metanol/cloreto de sódio, na

proporção 2:1:0,75 (v/v/v) para cada 3 mL da solução de clorofórmio. Em seguida, foi feita nova

centrifugação por 5 minutos a 447,2 g. A fase superior foi descartada e a fase restante foi seca em

nitrogênio líquido Reacti-Therm III (Thermo Scientific, Bellefonte, EUA). Ao final, o pellet

formado foi ressuspendido em 1 mL de etanol 100% e o conteúdo do TG foi analisado por meio

de kit comercial Randox TG® (Randox Laboratories Ltd., Kearneysville, EUA).

4.3 Análise de resultados

Os dados referentes à caracterização química dos extratos foram calculados com base

em média ± desvio-padrão (DP). Já os dados biológicos foram calculados com base na média ±

erro-padrão (EP).

Foi aplicado o teste de normalidade Shapiro-Wilk e, para dados paramétricos, foi

aplicada análise de variância ANOVA One-way seguida por teste post hoc de Fisher LSD (Least

Significant Difference). Já os dados não-paramétricos foram avaliados por ANOVA Kruskal-

Wallis & Median Test. Para tanto, foi utilizado o software Statistica ® versão 12 (Tulsa, EUA),

exceto o cálculo de kITT (referente ao ipITT), realizado por meio do software GraphPad Prism®

versão 6.01 (San Diego, EUA).

30

5. RESULTADOS

5.1 Caracterização dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará

Conforme descrito na Tabela, os animais dos grupos C18 e PA receberam 5 vezes mais

compostos fenólicos totais do que o grupo EB. A quantidade de ácido elágico total em cada uma

das doses diárias de extratos variou, principalmente, em função da presença de elagitaninos: o

extrato C18 apresentou a maior quantidade de ácido elágico total (correspondente à maior

presença de elagitaninos neste extrato, conforme explicado anteriormente).

Tabela. Caracterização química dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará,

expressa em concentração (mg/mL) e por dose diária administrada aos animais*.

EB C18 PA

Compostos

mg/mL mg/dia

mg/mL mg/dia

mg/mL mg/dia

Fenólicos totais (mg EAG/mL) 1,02 ± 0,01 10,0 5,85 ± 0,01 50,0 3,06 ± 0,01 50

Ácido elágico total (mg/mL) 1,21 ± 0,09 0,58 14,6 ± 0,31 1,36 5,33 ± 0,22 0,89

Proantocianidinas por:

n-butanol (mg eq cianidina-3- 19,6 ± 2,21 9,5 427 ± 28,3 39,7 573 ± 14,1 95,7

rutinosídeo/mL)

DMAC (mg eq procianidina B2/mL) 7,5 ± 0,69 3,6 526 ± 17,6 48,9 441 ± 8,0 73,6

Açúcares totais 18,9 ± 0,65 4,64 6,83 ± 0,02 1,46 5,65 ± 0,15 2,31

Dados expressos como média ± desvio-padrão. * cálculo com base em animal com peso corporal de

25 g.

5.2 Avaliação dos efeitos dos compostos fenólicos da jabuticaba Sabará sobre a adiposidade

em modelo animal

Dentre os grupos que receberam os extratos preparados a partir da jabuticaba Sabará, o

grupo C18 apresentou o menor ganho de peso (Figuras 1A e 1B) e menor eficiência energética

(Figura 1C) em comparação ao grupo HFHS.

31

(A)

Padrão HFHS PA C18 EB

(g)

34

32

co

rpo

ral 30

28

26

24

Pe

so

22

20

Tempo (dias)

(C) (B)

)

1 0

b

ta

l (g

8 b ,c b ,c t o

c

o

6

p e s

e

4 a

d

h o

2

G

a

n

0

o S A 8 B ã H P 1 E

r

C

d

H F

a

P

Figura 1. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre o peso

corporal (A), ganho de peso corporal total (B) e eficiência energética (C) em camundongos

alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão

(controle), por 8 semanas. n = 11-12. Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b,

c) representam diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

Embora tenha havido esta diferença de ganho de peso entre os animais que receberam os

extratos preparados a partir da jabuticaba Sabará, o mesmo não foi observado em relação à

quantidade de dieta consumida por cada um destes grupos (Figuras 2A e 2B), tampouco em

relação ao conteúdo energético ingerido (Figuras 2C e 2D) e o eliminado pelas fezes destes

animais (Figuras 2E e 2F).

32

(A)

Padrão HFHS PA C18 EB

5

(g/d

ia) 4

3

Die

ta

2

1

0 7 14 22 29 36 43 51 58 Tempo (dias)

(C)

Padrão HFHS PA C18 EB

(kc

al/

dia

) 15

10

En

erg

ia

5

0 7 14 22 29 36 43 51 58 Tempo (dias)

(E)

3 a

(k c

a l

)

2

fe z

e s

i a

1

b

b

b

r g

b

E

n

e

0 o S A 8 B ã H P 1 E r

C

d H

F

a

P

(B)

2 5 0

2 0 0

a

(g )

1 5 0 b

t a

b b b

i e

1 0 0 D

5 0

0 o

H S

P A 8

E B

rã F

C

1 d

H

P a

(D)

8 0 0 a ,b a ,b

a ,b

b

a

l)

6 0 0

(k c

a

ia

4 0 0

E n

e r

g

2 0 0

0

o S A 8 B ã H P 1 E

r

C

d F

a H

P

(F)

3 0 a

sta

)

n e

rg

ia f

e z

e

e n

e r

g ia

d ie

2 0

1 0 b b b

b

E ( %

0 o S A 8 B ã H P 1 E r

F

C

d H

a

P

Figura 2. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre o consumo

da dieta (A), consumo total da dieta (B), consumo energético (C), consumo energético total (D),

eliminação de energia pelas fezes em 24 h (E) e eliminação de energia pelas fezes relativa à da

dieta (F) em camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo

que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 11-12 (A, B, C, D); n = 9-12 (E, F).

Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b) representam diferenças

significativas entre os grupos (p < 0,05).

33

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Figura 3. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre os tecidos

adiposos brancos: inguinal absoluto (A), inguinal relativo ao peso corporal (B), retroperitoneal

absoluto (C), retroperitoneal relativo ao peso corporal (D), epididimal absoluto (E) e epididimal

relativo ao peso corporal (F) em camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-

sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 11-12. Dados

expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b, c) representam diferenças significativas

entre os grupos (p < 0,05).

34

Em relação ao peso dos tecidos adiposos brancos, não houve diferença estatística entre

os grupos que receberam os extratos da jabuticaba no que diz respeito aos pesos absoluto e

relativo do tecido inguinal (Figuras 3A e 3B). Já em relação aos tecidos retroperitoneal e

epididimal, o grupo C18 apresentou menores pesos absolutos, em comparação com o grupo

HFHS (Figuras 3C e 3E); porém estas diferenças não foram significativas quando avaliados os

pesos relativos ao corporal (Figuras 3D e 3F). No que diz respeito aos tecidos adiposos totais

(representados pelo inguinal, retroperitoneal e epididimal), o grupo C18 destacou-se novamente

por apresentar os menores pesos absoluto e relativo ao corporal (Figuras 4A e 4B).

(A) (B)

Figura 4. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre os tecidos

adiposos brancos total absoluto (A) e total relativo ao peso corporal (B) em camundongos

alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão

(controle), por 8 semanas. n = 11-12. Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b,

c) representam diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

Embora o grupo C18 tenha apresentado peso corporal significativamente menor e baixa

eficiência energética, a expressão gênica de UCP-1 do tecido adiposo marrom deste grupo não foi

diferente do grupo HFHS. O mesmo observou-se nos demais grupos que receberam os outros

extratos (Figura 5).

35

Figura 5. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a expressão

gênica da proteína UCP1 (do inglês, uncopling protein 1 ou termogenina) no tecido adiposo

marrom de camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo

que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 9-12. Dados expressos como média +/-

EP. Diferentes letras (a, b) representam diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

Já as análises de expressão gênica dos marcadores inflamatórios TNF-α e IL-6 no tecido

adiposo epididimal mostraram que o grupo EB apresentou menor expressão de TNF-α em

comparação ao grupo HFHS (Figura 6A). Nenhuma diferença significativa foi encontrada em

relação à expressão de IL-6 neste órgão (Figura 6B).

(A) (B)

Figura 6. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a expressão

gênica das proteínas TNF-α (fator de necrose tumoral – alfa) (A) e IL-6 (interleucina-6) (B) no

tecido adiposo epididimal de camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose),

além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 8-12. Dados expressos

como média +/- EP. Diferentes letras (a, b) representam diferenças significativas entre os grupos

(p < 0,05).

36

Quando a análise de expressão gênica destes mesmos marcadores inflamatórios foi

realizada no fígado, não foi encontrada nenhuma diferença estatística significativa (Figuras 7A e

7B). Porém a dosagem da concentração hepática de TNF-α e de IL-6 demonstrou que o grupo EB

teve menor concentração de TNF-α em relação ao grupo HFHS (Figura 7C). Nenhuma diferença

estatística significativa foi encontrada em relação à concentração de IL-6 no fígado (Figura 7D).

(A) (B)

(C) (D)

Figura 7. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a expressão

gênica das proteínas TNF-α (fator de necrose tumoral – alfa) (A) e IL-6 (interleucina-6) (B) e

sobre a concentração de TNF-α (C) e de IL-6 (D) no fígado de camundongos alimentados com

dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8

semanas. n = 10-12 (A, B, D); n = 11-12 (C). Dados expressos como média +/- EP. Diferentes

letras (a, b) representam diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

37

Ao ser investigada a expressão gênica das enzimas LPL e FAS no tecido adiposo branco

epididimal, notou-se não haver diferença estatística significativa entre os grupos que receberam

os extratos da jabuticaba Sabará em relação ao grupo HFHS (Figuras 8A e 8B).

(A) (B)

Figura 8. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a expressão

gênica das proteínas LPL (lipase lipoproteica) e FAS (do inglês, fatty acid synthase) no tecido

adiposo branco epididimal de camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-

sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n=9-11 (A); n=5-8 (B). Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b) representam diferenças

significativas entre os grupos (p < 0,05).

As análises de glicemia (Figuras 9A e 9B), insulinemia (Figuras 9C e 9D), bem como o

cálculo do índice HOMA-IR (Figura 9E) obtidos a partir do TOTG mostraram que não houve

diferença significativa entre os grupos que receberam os diferentes extratos da jabuticaba, em

comparação com o grupo HFHS. O mesmo foi observado nos resultados glicemia e kitt referentes

ao TTIIP (Figuras 10A e 10B).

38

(A) (B) G

licem

iaTO

TG

Padrão 22 HFHS

(mm

ol/L

) 20 PA C18

18

EB 16

14

12

10

8

6

4

0 30 60 90 120

Tempo (minutos)

(C) (D)

2,5

Padrão

(ng/

ml)

HFHS

2,0 PA

C18

TOTG

1,5 EB

Insu

lin

emia

1,0

0,5

0,0 0 30 60 90 120 Tempo (minutos)

(E)

Figura 9. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a curva

glicêmica (A), a área sob a curva (ASC) da glicemia total, a curva insulinêmica (C), a área sob a

curva da insulinemia total e o índice HOMA-IR (do inglês, homeostatic model assessment –

insulin resistance) obtidos através de teste oral de tolerância à glicose (TOTG) aplicado em

camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu

dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 11-12. Dados expressos como média +/- EP.

Diferentes letras (a, b) representam diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

39

(A)

(B)

Figura 10. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a curva

glicêmica (A), o índice kitt (B) obtidos através de TTIIP aplicado em camundongos alimentados

com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por

8 semanas. n = 11-12. Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b) representam

diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

Em relação à dosagem plasmática de LPS, não foi encontrada diferença estatística

significativa entre os grupos que receberam extratos da jabuticaba Sabará em relação ao grupo

HFHS (Figura 11).

40

4

b b

) 3

L

g /

m

a ,b

a ,b

2 a

(n

L P

S

1

0 o S A 8 B ã H P 1 E

r

F

C

d H

a

P

Figura 11. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre a

concentração plasmática de LPS (lipopolissacarídeos) em camundongos alimentados com dieta

HFHS (high-fat high-sucrose), além do grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8

semanas. n = 11-12. Dados expressos como média +/- EP. Diferentes letras (a, b) representam

diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05).

Análises complementares foram feitas no fígado no intuito de investigar sinais de

esteatohepatite não-alcoólica. Foram elas: peso hepático absoluto e relativo, além da dosagem de

TG hepático. Entre os grupos que receberam extratos preparados a partir da jabuticaba Sabará, o

grupo C18 apresentou menor peso absoluto do fígado, comparado ao grupo HFHS; porém, esta

diferença não foi mantida quando avaliado o peso hepático relativo ao corporal (Figuras 12A e

12B). No que diz respeito à dosagem de TG, o grupo EB apresentou níveis mais elevados em

relação ao grupo HFHS (Figura 12C).

41

(A) (B)

(C)

Figura 12. Efeito dos extratos ricos em compostos fenólicos da jabuticaba Sabará (extrato bruto

(EB) e extratos obtidos em sorventes octadecil silano (C18) e poliamida (PA)) sobre os pesos

hepáticos absoluto (A) e relativo ao corporal (B), e sobre a dosagem de triacilglicerol total no

fígado (C) em camundongos alimentados com dieta HFHS (high-fat high-sucrose), além do

grupo que recebeu dieta padrão (controle), por 8 semanas. n = 11-12. Dados expressos como

média +/- EP. Diferentes letras (a, b, c) representam diferenças significativas entre os grupos (p <

0,05).

42

6. DISCUSSÃO

Uma das principais razões para que a obesidade seja considerada uma epidemia mundial

atualmente é o alto consumo de alimentos ricos em gorduras saturadas e açúcares, o que leva

também à inflamação crônica de baixo grau associada à SM. Estudos com camundongos que

recebem dieta similar mostram que estes animais desenvolvem complicações de saúde similares

às observadas em humanos. Em contrapartida, também tem merecido destaque o papel dos CFs

presentes em frutas como a jabuticaba Sabará e nas berries por exemplo, já que exercem

importante papel no auxílio à redução do risco de desenvolvimento de obesidade e na melhora

deste quadro de inflamação e SM (ANHÊ et al., 2015; SAMPLE et al., 2015; ALEZANDRO et

al., 2013b; LENQUISTE et al., 2012; FRAULOB et al., 2010; GALLOU-KABANI et al., 2007).

O presente estudo demonstrou que os animais que receberam o extrato contendo todos

os fenólicos da jabuticaba Sabará (grupo C18) apresentaram não apenas menor ganho de peso e

de tecido adiposo, mas também menor eficiência energética, de forma similar à observada no

estudo de Alezandro et al. (2013b). Com o intuito de identificar a razão para este menor ganho de

peso, foi investigada a termogênese dos animais através da análise da expressão gênica da

proteína UCP-1 no tecido adiposo marrom; contudo, não foi encontrada nenhuma diferença

significativa entre os grupos que receberam os extratos da jabuticaba Sabará, em relação ao grupo

HFHS. Também não foi possível encontrar indícios para esta explicação através das análises de

consumo da dieta e de energia, ou mesmo pela eliminação de energia através das fezes, uma vez

que não houve diferença entre estes grupos. Tampouco foram encontrados indícios para esta

explicação através da avaliação da expressão gênica das proteínas relacionadas ao metabolismo

lipídico (FAS e LPL) ou à inflamação (TNF-α e IL-6). Desta forma, mais estudos são necessários

para que sejam descobertos os mecanismos pelos quais os compostos presentes no extrato C18

geram este menor ganho de peso nos animais.

No que diz respeito à caracterização química dos extratos, as diferenças observadas até

então comprovam que, conforme esperado, os extratos obtidos em colunas de resinas C18 e PA

concentram maior quantidade de CFs (cerca de 5 vezes mais), em comparação com o EB. Em

relação aos elagitaninos, o extrato C18 apresentou maiores teores deste corroborando com o que

já havia sido comprovado por Alezandro et al. (2013a). Embora não tenha sido feita a análise

direta deste CF, as análises de ácido elágico total oferecem uma estimativa importante da

43

concentração do mesmo, visto que elagitaninos são derivados de ácido elágico, conforme

demonstrado neste mesmo estudo citado.

Já em relação ao grupo de animais que recebeu o EB da jabuticaba Sabará, notou-se uma

melhora do quadro inflamatório através da baixa concentração de TNF-α no fígado e da menor

expressão gênica deste mesmo marcador inflamatório no tecido adiposo epididimal. No estudo

desenvolvido por Anhê et al. (2015), o grupo de camundongos que recebeu dieta HFHS por 8

semanas e a mesma dose de 200 mg EB de cranberry (fruta cujo perfil de fenólicos é similar ao

da jabuticaba, segundo Alezandro et al., 2013a), também apresentou melhora do quadro

inflamatório, porém, evidenciada pela menor síntese proteica dos marcadores inflamatórios

hepáticos COX-2 e NF-kB. Logo, o presente estudo corrobora com o que já foi evidenciado

anteriormente e traz à tona outras vias pelas quais a inflamação também é suprimida através da

administração do EB de frutas com perfil de CFs similares, como é o caso da jabuticaba Sabará e

da cranberry.

Em relação à sensibilidade à insulina, estudos anteriores já comprovaram que os CFs da

jabuticaba foram efetivos na melhora deste quadro em camundongos que receberam dieta HFHS

por 8 semanas (ALEZANDRO et al., 2013b). Contudo, no presente estudo não foi encontrada

diferença significativa entre os grupos de animais que receberam os extratos da fruta em relação

ao grupo HFHS. Uma das possíveis explicações para tal diferença pode estar na composição da

dieta: enquanto o estudo de Alezandro et al. (2013b) utilizou dieta HFHS com 40% de energia

proveniente da sacarose e 40% vinda de gorduras, o presente experimento administrou aos

camundongos dieta HFHS com menor teor de sacarose (correspondente a 25% da energia total da

dieta) e teor mais elevado de gorduras (65% da energia total). Porém, de qualquer forma, o

gráfico de curva glicêmica obtido através do TTIIP sugere que, apesar de não ter havido diferença

estatística significativa entre os grupos que receberam os extratos, o grupo C18 apresentou

valores menores em alguns pontos de ambas as curvas, em comparação com o grupo HFHS, o

que permite que seja levantada a hipótese de que futuros estudos com maior duração de tempo

poderiam confirmar se haveria melhora significativa da sensibilidade à insulina neste grupo.

Em relação à permeabilidade intestinal dos animais, o mesmo estudo desenvolvido por

Anhê et al. (2015) comprovou haver melhora significativa entre camundongos que receberam

44

dieta HFHS e o EB de cranberry, em comparação com os animais que receberam apenas dieta

HFHS. Porém, o mesmo não foi observado no presente estudo, já que não houve diferença

estatística significativa entre os grupos que receberam os extratos, em comparação com o grupo

HFHS. Contudo, é possível notar na Figura 11 que os grupos C18 e EB apresentaram as menores

médias de concentração plasmática de LPS, comparáveis até mesmo ao grupo Padrão. Esta

consideração permite sugerir que futuros estudos de protocolo similar, porém desenvolvidos por

maior período de tempo, poderiam encontrar diferenças significativas nos níveis de LPS

plasmático.

E, por fim, as análises complementares realizadas no fígado tiveram o intuito de

investigar se os animais desenvolveram esteatohepatite não-alcoólica, já que esta é uma

complicação comumente associada à SM e à obesidade (FAROOQ; FARWA; KHAN, 2015).

Porém, os resultados de peso do fígado e de dosagem de triglicérides mostraram que não houve

diferença significativa entre os grupos que receberam os extratos produzidos a partir da

jabuticaba Sabará e o grupo HFHS. Possivelmente esta diferença não foi observada porque

experimentos com camundongos para avaliação de comprometimentos hepáticos induzidos por

dieta, em geral, têm maior duração de período (pelo menos, 12 semanas) e dietas com diferente

composição (em geral, são apenas hiperlipídicas, ou hiperlipídicas com alto teor de outro tipo de

açúcar, como a frutose) (CLAPPER et al., 2013).

45

7. CONCLUSÃO

Os elagitaninos presentes na jabuticaba Sabará (ou a ação sinérgica entre eles e outros

CFs da jabuticaba) parecem favorecer o menor ganho de peso corporal e de tecido adiposo, além

de reduzir a eficiência energética em camundongos que receberam dieta indutora de obesidade e

de SM, porém não interferiram no quadro pró-inflamatório induzido por esta mesma dieta. Já o

EB da jabuticaba Sabará favoreceu a redução da inflamação nestes animais, porém, sem alterar o

ganho de peso, nem a eficiência energética destes animais, provavelmente devido à concentração

muito menor de CFs.

Novos estudos fazem-se necessários para investigação dos mecanismos que geram, tanto

o menor ganho de peso entre animais que receberam todos os CFs da jabuticaba Sabará, quanto a

menor inflamação entre os que receberam o EB da fruta. Para tal, sugere-se também o

desenvolvimento de novo experimento in vivo com camundongos C57BL/6, de protocolo similar,

porém, por período superior ao de 8 semanas para que fatores como alteração de sensibilidade à

insulina e esteatohepatite não-alcoólica associadas à SM possam ser melhor investigadas.

46

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABE, L. T.; LAJOLO, F. M.; GENOVESE, M. I. Potential dietary sources of ellagic acid and

other antioxidants among fruits consumed in Brazil: Jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.)

Berg). Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 92, p. 1679-87, 2012. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Regulamento técnico de substâncias

bioativas e probióticos isolados em alegação de propriedade funcional e/ou de saúde.

Resolução RDC nº 2, de 7 de janeiro de 2002. ALEZANDRO, M. R. et al. Comparative study of chemical and phenolic compositions of two

species of jaboticaba: Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg and Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. Food Research International, v. 54, p. 478-477, 2013a.

ALEZANDRO, M. R. et al. Polyphenols of jaboticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg), a

Brazilian grape-like fruit, attenuate hyperlipidemia, inflammation and insulin resistance.

Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos). Faculdade de Farmácia, Universidade de São

Paulo, São Paulo, 2013b. ANHÊ, F. F. et al. A polyphenol-rich extract protects from diet-induces obesity, insulin

resistance and intestinal inflammation in association with increased Akkermansia spp. population

in the gut microbiota of mice. Gut, v. 64, n. 6, p. 872-883, 2015. ARABBI, P. R.; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Flavonoids in vegetable foods commonly

consumed in Brazil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, p. 1124-1131, 2004.

ARIAS, N. et al. The combination of resveratrol and quercetin enhances the individual effects of

these molecules on triacylglycerol metabolism in white adipose tissue. European Journal of

Nutrition, 2015. In press. BACKHED, F. et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 101, n.

44, p. 15718-15723, 2004. BASTOS, D. H. M.; ROGERO, M. M.; ARÊAS, J. A. G. Mecanismos de ação de compostos

bioativos dos alimentos no contexto de processos inflamatórios relacionados à obesidade. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, v. 53, n. 5, p. 646-656, 2009.

BORGES, L. l.; CONCEIÇÃO, E. C.; SILVEIRA, D. Active compounds and medicinal

properties of Myrciaria genus. Food Chemistry, v. 153, p. 224-233, 2014.

47

CANI, P. D. et al. Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes, v.

56, p. 1761-1772, 2007. CAO, H. e SHOCKEY, J. M. Comparison of TaqMan and SYBR Green qPCR methods for

quantitative gene expression in tung tree tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

v. 60, p. 12296-12303, 2012. CHONDRONIKOLA, M. et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis

and insulin sensitivity in humans. Diabetes, v. 63, p. 4089-4099, 2014. CLAPPER, J. R. et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and non-alcoholic

steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American

Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 305, p. 483–495, 2013. CROZIER, A.; JAGANATH, I. B.; CLIFFORD, M. N. Dietary phenolics: chemistry,

bioavailability and effects on health. Natural Product Reports, v. 26, p. 1001-1043, 2009.

DING, S. et al. High-Fat Diet: Bacteria Interactions Promote Intestinal Inflammation Which

Precedes and Correlates with Obesity and Insulin Resistance in Mouse. Plos One, v. 5, n. 8, p. 1-

13, 2010. DONADIO, L. C. Jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg. Jaboticabal: FUNEP. 2000,

55 p. DOYLE, S. L. et al. Visceral obesity, metabolic syndrome, insulin resistance and cancer.

Proceedings of Nutrition Society, v. 71, n. 1, p. 181-189, 2012.

DRAGANO, N. R. V.; MARÓSTICA, M. R. Avaliação do efeito da casca de jabuticaba

liofilizada sobre o ganho de peso, perfil lipídico e resistência à insulina em camundongos

alimentados com dieta hiperlipídica. Dissertação (mestrado). Faculdade de Engenharia dos

Alimentos Unicamp, 2011. FAROOQ, W.; FARWA, U.; KHAN, F.R. The metabolic syndrome and inflammation: role of

insulin resistance and increased adiposity. Oman Medical Journal, v. 30, n. 2, p. 100-103, 2015.

FOLCH, J.; LEES, M.; SLOANE STANLEY, G. H. A simple method for the isolation and

purification of total lipids from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry, v. 226, n.

1, p. 497-509, 1957. FONSECA-ALANIZ, M.R. et al. O tecido adiposo como centro regulador do metabolismo.

Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabolismo, v. 50, n. 2, p. 216-229, 2006.

48

FRAULOB et al. A mouse model of metabolic syndrome: insulin resistance, fatty liver and non-

alcoholic fatty pancreas disease (NAFPD) in C57BL/6 mice fed a high fat diet. Journal of

Clinical Biochemistry and Nutrition, v. 46, p. 212-223, 2010. GALLOU-KABANI, C. et al. C57BL/6J and A/J mice fed a high-fat diet delineate Components

of metabolic syndrome. Obesity, v. 15, n. 8, p. 1996-2005, 2007. GASPEROTTI, M. et al. Profiling and Accurate Quantification of Rubus Ellagitannins and

Ellagic Acid Conjugates Using Direct UPLC-Q-TOF HDMS and HPLC-DAD Analysis. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, p. 4602-4616, 2010. GAO, D. et al. Interleukin-1β mediates macrophage-induced impairment of insulin signaling in

human primary adipocytes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism,

v. 307, p. 289-304, 2014. GUSTAFSON, B.; SMITH, U. Regulation of white adipogenesis and its relation to ectopic fat

accumulation and cardiovascular risk. Atherosclerosis, v. 241, p. 27-35, 2015. JENNINGS, A. et al. Intakes of anthocyanins and flavones are associated with biomarkers of

insulin resistance and inflammation in women. Journal of Nutrition, v. 144, n. 2, p. 202-208,

2014. KANDA, H. et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin

resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation, v. 116, n. 6, p.

1494-1505, 2006.

KROTKIEWSKI, M. et al. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of

regional adipose tissue distribution. Journal of Clinical Investigation, v. 72, p.1150-1162, 1983.

KUBATKA, P. et al. Fruit peel polyphenols demonstrate substantial anti‑tumour effects in the

model of breast cancer. European Journal of Nutrition, 2015. In press.

LEE, M. S.; KIM, C. T.; KIM, Y. Green tea (-)-epigallocatechin-3-gallate reduces body weight

with regulation of multiple genes expression in adipose tissue of diet-induced obese mice. Annals of Nutrition and Metabolism, v. 54, n. 2, p. 151-157, 2009.

LENQUISTE, S. A. et al. Freeze-dried jaboticaba peel added to high-fat diet increases HDL

cholesterol and improves insulin resistance in obese rats. Food Research International, v. 49,

n.1, p. 153–160. 2012.

49

NASCIMENTO, S.; SUAREZ, E. R.; PINHAL, M. A. S. Tecnologia de PCR e RT-PCR em

tempo real e suas aplicações na área médica. Revista Brasileira de Medicina, v.10, p. 7-19,

2012. NORSEEN, J. et al. Retinol-Binding Protein 4 Inhibits Insulin Signaling in Adipocytes by

Inducing Proinflammatory Cytokines in Macrophages through a c-Jun N-Terminal Kinase- and

Toll-Like Receptor 4-Dependent and Retinol-Independent Mechanism. Molecular and Cellular

Biology, v. 32, n. 10, p. 2010-2019, 2012. PARK, H. J. et al. Green tea extract attenuates hepatic steatosis by decreasing adipose lipogenesis

and enhancing hepatic oxidant defenses in ob/ob mice (review). Journal of Nutritional

Biochemistry, v. 22, p. 393-400, 2011. PINTO, M. S.; LAJOLO, F. M.; GENOVESE, M. I. Bioactive compounds and quantification of

total ellagic acid in strawberry (Fragaria x ananassa Duch). Food Chemistry, v. 107, p. 1629-

1635, 2008. PRIOR, R. L. et al. Assays for Hydrophilic Antioxidant Capacity (oxygen radical absorbance

capacity (ORAC)) of Plasma and Other Biological and Food Samples. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, v. 51, p. 3273-3279, 2003. PRIOR, R. L. et al. Multi-laboratory validation of a standard method for quantifying

proanthocyanidins in cranberry powders. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.

90, p. 1473–1478, 2010. PORTER, L.J.; HRSTICH, L.N.; CHAN, B.G. The conversion of procyanidins and

prodelphinidins to cyanidin and delphinidin. Phytochemistry, v. 25, p. 223-230, 1986.

PROTZEK, A. O. P. et al. Insulin and glucose sensitivity, insulin secretion and β-cell distribution

in endocrine pancreas of the fruit bat Artibeus lituratus. Comparative Biochemistry and

Physiology, v. 157, p. 142–148, 2010. Robbins, R. J. et al. Method performance and multi-laboratory assessment of a normal phase high

pressure liquid chromatography–fluorescence detection method for the quantitation of flavanols

and procyanidins in cocoa and chocolate containing samples. Journal of Chromatography v.

1216, p. 4831–4840, 2009. ROOPCHAND, D. E. et al. Dietary polyphenols promote growth of the gut bacterium

Akkermansia muciniphila and attenuate high fat diet-induced metabolic syndrome. Diabetes,

2015. In press.

50

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2°

edition, New York: Cold Spring Habour Laboratory Press, 1989. SAMPLE, C. H. et al. Western-style diet impairs stimulus control by food deprivation state

cues. Implications for obesogenic environments. Appetite, 2015. In press. SCALBERT, A. e WILLIAMSON, G. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. Journal

of Nutrition, v. 130, p. 2073-2085, 2000. SECRETARIA DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO (SEAB).

Departamento de Economia Rural (DERAL). Fruticultura – Maio de 2015. Disponível em

http://www.agricultura.pr.gov.br/arquivos/File/deral/Prognosticos/fruticultura_2014_15.pdf. Acesso em: 01 Jun. 2015.

SHRESTHA, S. et al. Dietary green tea extract lowers plasma and hepatic triglycerides and

decreases the expression of sterol regulatory element-binding protein-1c mRNA and its

responsive genes in fructose-fed, ovariectomized rats. Journal of Nutrition, v. 139, p. 640-645,

2009. SINGLETON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA-RAVENTOS, R. M. Analysis of total

phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology, v, 229, p. 152–178, 1999.

SKERGET, M. et al. Phenols, proanthocyanidins, flavones and flavonols in some plant materials

and their antioxidant activities. Food Chemistry, v. 89, p. 191-198, 2005. STRACK, D. In Plant Biochemistry, ed. P. M. Dey and J. B. Harborne, Academic Press,

London, p. 387–416, 1997. TURNBAUGH, P. J. et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature, v. 457, n.

7228, p. 480-484, 2009. VIRTANEN, K. A. et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England

Journal of Medicine, v. 360, n. 15, p.1518-1525, 2009. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Obesity and overweight. 2015. Disponível em:

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/ . Acesso em: 13 Mai. 2015. WU, J. et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.

Cell, v. 150, p. 366-376, 2012.

WU, S. B. et al. Metabolite profiling of jaboticaba (Myrciaria cauliflora) and other dark-colored

fruit juices. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, p. 7513–7525, 2012.

51

WU, X., e PRIOR, R. L. Systematic identification and characterization of anthocyanins by

HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: fruits and berries. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, v. 53, p. 2589-2599, 2005. XU, E. et al. Targeted disruption of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1

promotes diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance. Endocrinology, v. 150, p. 3503-

3512, 2009. YOSHIMURA, Y. et al. Ellagic acid improves hepatic steatosis and serum lipid composition

through reduction of serum resistin levels and transcriptional activation of hepatic ppara in obese,

diabetic KK-Ay mice. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 434 p.

486-491, 2013.