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Universidade de São Paulo
Instituto de Química de São Carlos
Programa de Pós-graduação em Química
Andressa Ribeiro Pereira
Oligomerização da glicose oxidase utilizando ácidos de Brønsted para a
aplicação em bioeletroquímica
São Carlos
2017
1
Andressa Ribeiro Pereira
Oligomerização da glicose oxidase utilizando ácidos de Brønsted para a
aplicação em bioeletroquímica
São Carlos
2017
Tese apresentada ao Instituto de Química de São
Carlos da Universidade de São Paulo como
parte dos requisitos para obtenção do título de
doutor em ciências.
Área de concentração: Físico-Química
Orientador: Prof. Dr. Frank Nelson Crespilho
Exemplar revisado
O exemplar original encontra-se em
acervo reservado na Biblioteca do IQSC-
USP
2
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese a meus pais (Paulo E. R. V.
Pereira e Roseli R. R. Pereira) e a minha irmã
(Gianne R. P. Muramoto), especialmente a minha
mãe Roseli que sempre me incentivou e deu forças
para seguir meus sonhos.
3
AGRADECIMENTOS
A Deus que sempre me protegeu e me deu ânimo para seguir em frente;
A meus pais, Paulo e Roseli, que me deram apoio e suporte para esta longa caminhada,
mesmo preferindo que eu estivesse mais próxima. Agradeço porque compreenderam e
aceitaram que essa era a minha vontade;
Em especial a minha mãe Roseli que sempre me ouviu e me deu força nos momentos
mais difíceis e que em nenhum momento me deixou esmorecer. Obrigada por ser
presente sempre, obrigada pela forma como você me criou e me ensinou a levar tudo
até o fim e a sempre dar o meu melhor. Obrigada por me apoiar até mesmo nas decisões
que você não achou as mais sábias e também por alguns puxões de orelha que foram
necessários;
A minha irmã, Gianne, que sempre me apoiou e acreditou em mim. Obrigada por todas
as vezes que você demonstrou que se orgulha de mim e obrigada por estar sempre
presente com esse seu jeito divertido de ser;
A Agathinha, que embora considerada um ser irracional, foi meu apoio e consolo em
muitos momentos desde que chegou em casa;
Ao meu orientador prof. Dr. Frank Crespilho, o qual me acompanha desde a iniciação
científica, o meu obrigada por não deixar eu “jogar a toalha” nos momentos de estresse,
por entender os momentos em que me exaltei demais e ter paciência para lidar com eles,
pelas valorosas discussões cientificas, por ter me ensinado grande parte do que eu sei
hoje, enfim, pela orientação e amizade todos esses anos;
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de
doutorado direto concedida (2013/19908-2) e pelo apoio financeiro para a realização do
projeto de pesquisa e para a participação em congressos científicos;
Pelos amigos que fiz no IQSC-USP, os quais não citarei para não ser injusta me
esquecendo de ninguém;
Aos meus amigos do Grupo de Bioeletroquímica e Interfaces, que acabaram por se
tornar uma família aqui em São Carlos: Kamila Pagnoncelli, Fernanda Sales, Andressa
Dancini, Danielle Castro, Graziela Sedenho, Roberto Luz, Vítor Carvalho, Lucyano
Macedo, Rodrigo Iost, João Carlos Perbone, Thiago Bertaglia, Mian Abdul Ali, Tharik
Dahwache. Agradeço pelas inúmeras risadas, por vocês fazerem meus dias melhores,
4
por todas as gordices, pelas conversas sérias quando necessário e por muitas vezes
servirem de um ombro amigo;
Aos meus tios, tias e amigos de São José dos Campos que sempre torceram por mim e
estiveram juntos me incentivando, em especial a tia Eliane pelos nossas conversas e
cafés;
Ao prof. Dr. Júlio César Borges por me auxiliar com as técnicas de eletroforese SDS-
PAGE e dicroísmo circular e por ter colocado a estrutura de seu laboratório e seus alunos
a disposição para me ajudarem;
Ao grupo de Eletroquímica, em especial ao prof. Dr. Ernesto Gonzalez, por
disponibilizar a utilização do equipamento para as medidas de espalhamento dinâmico
de luz;
À CAQI e seus técnicos, principalmente ao Aldimar e ao André por auxiliarem em
alguns experimentos para a caracterização espectroscópica das enzimas;
Ao prof. Dr. Laudemir Varanda por ter disponibilizado a estrutura do laboratório para a
utilização da centrífuga;
Aos professores Dr. Germano Tremiliosi Filho e Dr. André Luiz Meleiro Porto pelas
valiosas contribuições durante o exame de qualificação do doutorado;
Aos professores do Instituto de Química de São Carlos (IQSC-USP) pela minha
formação profissional.
5
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas
lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que
deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era
antes.”
(Marthin Luther King)
“O verdadeiro homem mede a sua força quando se
defronta com o obstáculo.
(Antoine de Saint-Exupéry)
6
RESUMO
A eletroquímica direta de enzimas redox depende da distância entre os sítios redox da proteína
e a superfície do eletrodo e também da eficiência na imobilização dessas enzimas na superfície
eletródica. Dessa forma, a obtenção de enzimas com caráter mais hidrofóbico possibilita a
melhora na interação entre elas e a superfície de eletrodos sólidos, como os de carbono. Neste
estudo, foi desenvolvida uma rota para a obtenção da glicose oxidase oligomerizada (Ol-GOx)
com o objetivo de melhorar a interação entre a enzima e a superfície de fibras de carbono, uma
vez que enzimas oligomerizadas contêm suas porções hidrofóbicas expostas. Para tanto,
diferentes ácidos de Brønsted foram utilizados, sendo que a enzima obtida a partir da reação
com o ácido trifluorometanosulfônico (TFMS) foi a que se manteve ativa cataliticamente. A
Ol-GOx se mostrou um biocatalisador promissor devido a sua hidrofobicidade e seu tamanho,
os quais permitiram uma imobilização mais eficiente em superfícies de carbono. Após a
caracterização estrutural, concluiu-se que a Ol-GOx é formada por um oligômero composto por
várias unidades de GOx nativa, apresentando um raio hidrodinâmico de aproximadamente 96
nm. Por voltametria cíclica estudou-se a transferência direta de elétrons (TDE) entre o cofator
dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD) e a superfície das fibras de carbono, sendo observado
um aumento de 7 vezes nas correntes faradaicas em relação ao obtido para a GOx nativa. Além
disso, as propriedades bioeletrocatalíticas foram melhoradas em 30% quando analisada a
oxidação da glicose. Concluiu-se ainda que quanto maior a quantidade de folhas-β presente na
estrutura proteica, maior a TDE observada entre a enzima e a superfície das fibras de carbono.
Palavras-chave: glicose oxidase, oligomerização, agregação proteica, interação proteína-
proteína, transferência direta de elétrons, bioeletrocatálise
7
ABSTRACT
The direct electrochemistry of redox enzymes is dependent on the distance between the active
centers of the protein and the electrode surface, and also on the efficiency in the immobilization
of these enzymes on the electrodic surface. Thus, the synthesis of more hydrophobic enzymes
could lead to better interaction between the redox enzymes and the solid electrode surfaces,
such as carbon electrodes. In this study, it was proposed a chemical route to obtain oligomerized
glucose oxidase (Ol-GOx), aiming to improve the interaction between the enzyme and the
surface of carbon fibers, since oligomerized proteins have their hydrophobic chains exposed.
After structural characterization, it was concluded that Ol-GOx is formed by several dimeric
units of native GOx with a hydrodynamic radius corresponding to approximately 96 nm. By
cyclic voltammetry, it was studied the direct electron transfer (DET) between the flavin adenine
dinucleotide (FAD) cofactor and the surface of carbon fibers, where it was observed an increase
of 7-fold in the faradaic currents in comparison to that observed for native GOx. Besides,
bioelectrocatalytic properties are 30% improved, when analyzed the glucose oxidation by cyclic
voltammetry. It was also concluded that the greater the β-sheet content in protein structure, the
higher the DET observed between the enzyme and the carbon fibers surface.
Keywords: glucose oxidase, oligomerization, protein aggregation, protein-protein interaction,
direct electron transfer, bioelectrocatalysis
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – (a) Representação da estrutura da GOx proveniente da espécie Aspergillus niger
(PDB: 1CF3); (b) Representação do processo de oxidação da β-D-glicose catalisado pela GOx.
Quando o FADH2 reage com oxigênio ocorre a reoxidação do cofator......................................19
Figura 2 – (a) Representação da estrutura tridimensional da GOx proveniente da espécie
Aspergillus niger (PDB: 1CF3) com destaque para o cofator FAD; (b) Destaque para as
interações do FAD com a estrutura proteica..............................................................................20
Figura 3 – Representação estrutural do FAD e de sua densidade eletrônica, com destaque em
círculos amarelos para os aminoácidos de arginina presentes próximos ao sítio ativo
(PDB:1CF3)..............................................................................................................................22
Figura 4 – Representação das estruturas químicas do FAD e FADH2 e de sua reação com o
oxigênio molecular. O grupamento R representa a cadeia lateral...............................................22
Figura 5 – (a) Mecanismo de abstração de hidreto proposto para a reação de oxidação da
glicose, sendo B correspondente a um grupo básico presente na enzima; (b) Etapas do
mecanismo da semi-reação de oxidação da glicose....................................................................24
Figura 6 – Representação esquemática da (a) transferência mediada de elétrons, onde Mr
significa mediador redox e (b) transferência direta de elétrons..................................................25
Figura 7 – Representação esquemática de uma enzima glicosilada e deglicosilada tanto pela
rota enzimática, quanto pela rota química, sendo destacados os tipos de açúcares e seus
derivados presentes na estrutura proteica...................................................................................26
Figura 8 – Representação estrutural do ácido trifluorometanosulfônico (TFMS).....................30
Figura 9 – Fluxograma descrevendo as etapas desse estudo e as técnicas utilizadas em cada
uma............................................................................................................................................33
Figura 10 – Ilustração das etapas do tratamento químico ao qual as FFC são submetidas antes
de serem utilizadas como eletrodos de trabalho nos experimentos eletroquímicos....................41
Figura 11 – (a) Distribuição (por número) de tamanhos obtido pela medida de DLS para a GOx
após o tratamento com diferentes ácidos de Brønsted; (b) Comparação da atividade específica
para a GOx após o tratamento com os diferentes ácidos.............................................................44
9
Figura 12 – (a) Espectros de UV-Vis e (b) Espectros de FTIR de uma solução de GOx (3,0 mg
mL-1; linha vermelha), GOx-TFMS (3,0 mg mL-1; linha azul), GOx-H2SO4 (3,0 mg mL-1; linha
roxa), GOx- HCl (3,0 mg mL-1; linha laranja) e GOx-HNO3 (3,0 mg mL-1; linha verde)...........45
Figura 13 – Deconvolução das bandas de amida I para (a) GOx-H2SO4, (b) GOx-HCl and (c)
GOx-HNO3, obtidas utilizando a espectroscopia de FTIR; (d) Gráfico comparativo dos
diferentes componentes da estrutura secundária da GOx após a reação com os diferentes ácidos
de Brønsted................................................................................................................................46
Figura 14 – (a) Voltamograma cíclicos dos bioeletrodos FFC-GOx (linha vermelha), FFC-
GOx-TFMS (linha azul), FFC-GOx-HCl (linha roxa), FFC-GOx-H2SO4 (linha laranja) e FFC-
GOx-HNO3 (linha verde); (b) voltamogramas cíclicos após a subtração da corrente capacitiva.
Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-
1, pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera saturada com argônio; (c) Módulo da densidade de
corrente de pico catódico, após a subtração da corrente capacitiva, em função da quantidade de
folhas-β presente na estrutura proteica.......................................................................................47
Figura 15 – (a, d e g) Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos FFC-GOx-HCl, FFC-GOx-
H2SO4 e FFC-GOx-HNO3, respectivamente, em diferentes velocidades de varredura. Eletrólito
suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC; (b, e e h)
Dependência das densidades de corrente de pico anódico (jpa) e catódico (jpc) com a velocidade
de varredura; (c, f e i) Voltamogramas cíclicos referentes à a, d e g, respectivamente, após a
subtração das correntes capacitivas...........................................................................................48
Figura 16 – Eletroforese SDS-PAGE utilizando a coloração com o azul de Coomassie do (i)
padrão de massas moleculares (250 a 60 kDa), (ii) GOx e (iii) Ol-GOx.....................................50
Figura 17 – MALDI-TOF de uma solução de GOx em matriz ácido sinapínico.......................51
Figura 18 – (a) Espectros eletrônicos das soluções de GOx (3,0 mg mL-1; linha vermelha) e
Ol-GOx (3,0 mg mL-1; linha azul); (b) Imagens das soluções de (i) GOx e (ii) Ol-GOx............51
Figura 19 – Imagens de microscopia óptica para a (a e c) GOx e (b e d) Ol-GOx; c e d
correspondem a região ampliada em relação as regiões marcadas em (a) e (b),
respectivamente.........................................................................................................................53
Figura 20 – Absorbância em 276 nm versus a concentração de enzima para (a) GOx, (b) Ol-
GOx e (c) Ol-GOx após a subtração da radiação espalhada.......................................................54
10
Figura 21 – (a) Distribuição de tamanhos obtido pela medida de DLS para a GOx (linha
vermelha) e Ol-GOx (linha azul); Imagens de microscopia eletrônica de transmissão para a (b)
GOx e (c) Ol-GOx.....................................................................................................................55
Figura 22 – Espectros de dicroísmo circular de uma solução de GOx (linha vermelha) e Ol-
GOx (linha azul), ambas preparadas em tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5)...........56
Figura 23 – Espectros de dicroísmo circular a 25 ºC e a 90 ºC de uma solução de (a) GOx e (b)
Ol-GOx, ambas preparadas em tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5); (c) Estabilidade
térmica da GOx (linha vermelha) e da Ol-GOx (linha azul) com [θ] em 222 nm........................57
Figura 24 – (a) Espectros de FTIR da GOx (linha vermelha) e da Ol-GOx (linha azul); (b e c)
Deconvolução das bandas de amida I para a GOx e Ol-GOx, respectivamente, obtidas por
FTIR..........................................................................................................................................58
Figura 25 – Mapas químicos obtidos com base no sinal obtido por FTIR relativo a banda de
amida I; (a) GOx e (b) Ol-GOx..................................................................................................60
Figura 26 – Gráfico da concentração de glicose versus a formação de H2O2 e curva de
Michaelis-Menten para a catálise da glicose pela (a) GOx e (b) Ol-GOx; (c) Gráfico de
Lineweaver-Burk para a GOx (linha vermelha) e Ol-GOx (linha azul); (d) Região ampliada de
(c)..............................................................................................................................................62
Figura 27 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura das FFC (a) antes e (b) após o
tratamento com KMnO4 e H2SO4; (c e d) FFC após o tratamento químico e a adsorção de GOx
(5 mg mL-1) durante 36 horas.....................................................................................................63
Figura 28 – Voltamogramas cíclicos (a) dos bioeletrodos FFC-GOx (linha vermelha) e FFC-
Ol-GOx (linha azul). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato
de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera de argônio; (b) após a subtração
das correntes capacitivas...........................................................................................................64
Figura 29 – Estabilidade eletroquímica do bioeletrodo de FFC-Ol-GOx com 40 ciclos
consecutivos. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio
(0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera de argônio...........................................65
11
Figura 30 – Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos de (a) FFC -GOx e (b) FFC-Ol-GOx em
diferentes velocidades de varredura. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1;
pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Velocidade de varredura de 0,05 a 1,0 V s-1. Dependência das
densidades máximas de corrente de pico anódico (jpa) e catódico (jpc) em função da velocidade
de varredura para o bioeletrodo (c) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-GOx.............................................66
Figura 31 – Gráficos de Arrhenius para (a) FFC-GOx e (b FFC-Ol-GOx; Gráficos de Laviron
utilizados no cálculo de k0 (25 ºC) para (c) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-GOx..................................69
Figura 32 – Dependência do log (kred + koxi) com o sobrepotencial para os bioeletrodos FFC-
GOx (linha vermelha) e FFC-Ol-GOx (linha azul). As curvas foram simuladas utilizando a
equação 2 no software Matlab®................................................................................................70
Figura 33 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo FFC (a) antes (linha preta) e após sucessivas
adições de glicose. Concentração final de glicose no eletrólito: 17,6 mmol L-1; (b) antes (linha
preta) e após sucessivas adições de peróxido de hidrogênio. Concentração final de peróxido de
hidrogênio adicionada ao eletrólito: 13,3 mmol L-1; (c) Ampliação da região de 0,10 a 0,50 V
dos voltamogramas cíclicos de (b). Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Eletrólito suporte:
tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Sistema saturado com
oxigênio.....................................................................................................................................71
Figura 34 – Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos (a) FFC-GOx e (b) FFC Ol-GOx na
ausência de oxigênio (linha preta), na presença de oxigênio (linha vermelha) e na presença de
oxigênio após a adição de 13,3 mmol L-1 de glicose no eletrólito. Velocidade de varredura 50
mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25
ºC...............................................................................................................................................72
Figura 35 – Região ampliada da resposta catalítica dos voltamogramas cíclicos da figura 34.
(a) FFC-GOx e (b) FFC-Ol-GOx, ambos na presença de oxigênio, na ausência de glicose (linha
preta) e após sucessivas adições de glicose. Concentração final de glicose: 13,3 mmol L-1; (c)
Gráfico da concentração de glicose versus densidade de corrente em 0,45 V para a GOx (●) e
Ol-GOx (●)................................................................................................................................73
12
Figura 36 – Curvas de polarização na ausência de glicose para FFC-GOx (linha preta) e FFC-
Ol-GOx (linha cinza) e na presença de 36,7 mmol L-1 de glicose para FFC-GOx (linha
vermelha) e 28,3 mmol L-1 de glicose para FFC-Ol-GOx (linha azul). Eletrólito suporte: tampão
fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera sob saturação de
oxigênio.....................................................................................................................................73
Figura 37 – Resposta amperométrica na presença de diferentes concentrações de glicose
utilizando os bioeletrodos (a) FFC-GOx e (c) FFC-Ol-GOx; Gráfico de concentração de glicose
versus a densidade de corrente obtida na cronoamperometria para (b) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-
GOx. Potencial aplicado: 0,7 V (vs Ag/AgClsat). Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio
(0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera saturada com oxigênio........................74
Figura 38 – Gráficos de Lineweaver-Burk para (a) GOx and (c) Ol-GOx; Gráficos de Hanes-
Woolf para (b) GOx e (d) Ol-GOx. Dados obtidos das cronoamperometrias relativas a
bioeletrocatálise da glicose........................................................................................................75
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Parâmetros α e k0 obtidos por Laviron para a GOx nativa e para a GOx após a reação
com os diferentes ácidos de Brønsted........................................................................................49
Tabela 2 – Deconvolução dos dados do espectro de CD para a GOx e Ol-GOx........................56
Tabela 3 - Porcentagem dos diferentes tipos de estrutura secundária obtidas pela deconvolução
da banda amida I obtida no FTIR...............................................................................................60
Tabela 4 – Parâmetros cinéticos obtidos para a GOx e para a Ol-GOx......................................76
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
GOx – glicose oxidase
FAD – dinucleotídeo de flavina e adenina (flavin adenine dinucleotide)
PBD – Banco de dados de proteína (Protein Data Bank)
His – histidina
TDE – transferência direta de elétrons
TFMS – ácido trifluorometanosulfônico (trifluoromethanesulfonic acid)
HRP – peroxidase de raíz forte (horseradish peroxidase)
Ol-GOx – glicose oxidase oligomerizada
ABTS – 2,2’-azino-bis-(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) sal diamônio (2,2´-azino-bis(3-
ethylbenzothazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)
MWCO – molecular weight cut-off
UV-Vis – espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível
FTIR – espectroscopia vibracional na região do infravermelho com transformada de Fourier
(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida (Sodium dodecil sulfate-poliacrilamide gel
electrophoresis)
DLS – espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering)
FFC – fibras flexíveis de carbono
CD – dicroísmo circular (Circular Dichroism)
CDNN – programa de deconvolução de espectros de dicroísmo circular
Ag/AgClsat – eletrodo de referência de cloreto de prata em solução saturada de cloreto de
potássio
MALDI-TOF – Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-Time of flight
15
LISTA DE SÍMBOLOS
A – absorbância
𝜀 – absortividade molar
b – caminho óptico
c - concentração
[θ] – elipticidade molar
TM – temperatura de desnaturação
KM – constante de Michaelis
kcat – constante catalítica ou número de turnover
Vmáx – velocidade máxima da reação catalisada
j – densidade de corrente
jmax – densidade máxima de corrente
jpa – densidade de corrente de pico anódico
jpc – densidade de corrente de pico catódico
E – potencial
E-E0’ – sobrepotencial
∆E – separação do potencial de pico
λ – energia de reorganização
kred/oxi – constante de velocidade de transferência heterogênea de elétrons de oxidação e redução
kmáx – constante de velocidade máxima
R – constante universal dos gases
T – temperatura
F – constante de Faraday
∆G – energia livre de Gibbs
HAB – acoplamento eletrônico entre o doador e o aceptor de elétrons
h – constante de Planck
kB – constante de Boltzmann
V0 – grau de acoplamento eletrônico
r – distância entre o doador e o aceptor de elétrons
β – coeficiente de decaimento
k0 – constante de velocidade padrão em sobrepotencial zero
n – número de elétrons transferidos
16
α – coeficiente de transferência eletrônica (grau de simetria entre as constantes de velocidade
de oxidação e de redução)
v – velocidade de varredura
KMapp – constante de Michaelis aparente
ISS – corrente de estado estacionário após a adição de substrato
Imax – corrente máxima obtida sob condições de saturação do substrato
[S] – concentração de substrato
kcat/KM – limite de difusão
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19
1.1 Glicose Oxidase: estrutura e catálise ........................................................................... 19
1.2 Transferência direta de elétrons................................................................................... 24
1.3 Agregação e oligomerização proteica ......................................................................... 27
1.4 Síntese dos oligômeros utilizando o ácido trifluorometanosulfônico ......................... 29
2 OBJETIVO .......................................................................................................................... 32
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 33
3.1 Materiais e Reagentes .................................................................................................. 34
3.2 Oligomerização da glicose oxidase nativa .................................................................. 35
3.3 Caracterização ............................................................................................................. 35
3.3.1 Espetroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível ............................. 35
3.3.2 Dicroísmo circular ............................................................................................. 36
3.3.3 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho ................................... 37
3.3.4 Eletroforese SDS-PAGE ................................................................................... 37
3.3.5 MALDI-TOF ..................................................................................................... 38
3.3.6 Espalhamento dinâmico de luz .......................................................................... 39
3.3.7 Microespectroscopia-FTIR ................................................................................ 39
3.3.8 Microscopia eletrônica de transmissão.............................................................. 40
3.4 Cinética enzimática ..................................................................................................... 40
3.5 Eletroquímica: preparação dos eletrodos modificados ................................................ 40
3.6 Eletroquímica: voltametria cíclica e cronoamperometria............................................ 41
3.7 Modelagem cinética: eletroquímica da etapa não-catalítica ........................................ 42
3.8 Cinética: eletroquímica da etapa catalítica .................................................................. 42
18
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 44
4.1 Obtenção dos oligômeros de GOx ............................................................................... 44
4.2 Caracterização da GOx nativa e da Ol-GOx ............................................................... 50
4.3 Cinética enzimática ..................................................................................................... 61
4.4 Eletroquímica da GOx nativa e da Ol-GOx ................................................................ 62
4.4.1 Caracterização dos eletrodos de fibras flexíveis de carbono ............................. 62
4.4.2 Transferência direta de elétrons e cinética de transferência de elétrons ........... 64
4.4.3 Bioeletrocatálise da glicose ............................................................................... 71
5 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 77
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 79
APÊNDICES ........................................................................................................................... 92
PUBLICAÇÕES NO PERÍODO DO DOUTORADO ........................................................ 97
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Glicose oxidase: estrutura e catálise
A glicose oxidase (GOx) (β-D-glicose: oxigênio-oxidorredutase, EC 1.1.3.4) (figura 1a)
é uma enzima da classe das oxidorredutases, sendo responsável pela catálise da oxidação da β-
D-glicose a D-glucono-δ-lactona, além de utilizar o oxigênio molecular como aceptor de
elétrons. Esse produto é posteriormente hidrolisado, de forma não-enzimática, a ácido glicônico
e peróxido de hidrogênio (figura 1b).1
Figura 1 – (a) Representação da estrutura da GOx proveniente da espécie Aspergillus niger (PDB:
1CF3); (b) Representação do processo de oxidação da β-D-glicose catalisado pela GOx. Quando o
FADH2 reage com oxigênio ocorre a reoxidação do cofator.
Fonte: Adaptação de Pereira, A. R. (2017) a partir de PERICIN, D., 2005, p. 738.
A atividade da GOx pode ser identificada a partir de várias fontes, no entanto, para
grande parte da sua caracterização bioquímica, a enzima proveniente do fungo Aspergillus
niger2 tem sido utilizada devido a sua elevada estabilidade química em solução e alta
OHO
HO
OH
H
OHOH
OHO
HO
OH
OHO
GOx
FAD FADH2
O2 H2O2
β-D-Glicose Glucono-δ-Lactona
a)
b)
20
especificidade com a glicose. Assim, existe um grande interesse em sua utilização para o
desenvolvimento de biossensores3 e bioânodos para biocélulas a combustível.4
Figura 2 – (a) Representação da estrutura tridimensional da GOx proveniente da espécie Aspergillus
niger (PDB: 1CF3) com destaque para o cofator FAD; (b) Destaque para as interações do FAD com a
estrutura proteica.
Fonte: Autoria própria.
(a)
(b)
21
A GOx proveniente da espécie A. niger é um homodímero de massa molecular igual a
160 kDa contendo uma molécula do grupo prostético dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD)
(figura 2) por monômero ligada à estrutura proteica de forma não-covalente,5 sendo que a
dissociação dessas subunidades ocorre somente em condições desnaturantes e é acompanhada
pela perda do cofator.6 Ela é uma glicoproteína com carboidratos do tipo manose
correspondendo entre 10 e 16% de sua massa molecular7 e sua cadeia proteica é formada por
583 aminoácidos.8 As porções de carboidratos estão ligadas N e O-glicosidicamente à estrutura
proteica, sendo que a remoção dos mesmos não afeta de forma significativa a atividade
catalítica e a estabilidade da enzima.9; 10
A molécula da GOx pode ser dividida em dois grandes domínios estruturais. O primeiro
consiste em cinco folhas-β A enoveladas entre três folhas-β B e as hélices H1, H6 e H13,
formando o domínio do FAD. A hélice H1 pertence ao motivo βαβ do domínio do FAD e
possivelmente estabiliza a carga negativa presente no grupo pirofosfato do FAD.11 A hélice
H13 tem pontos similares com N terminal em direção ao anel pirimidínico presente no grupo
flavina, mas não está diretamente ligada ao grupo, sendo a flavina ancorada via ligações de
hidrogênio para o grupo hidroxil da mesma. O segundo domínio é caracterizado pela grande
porção de folhas-β antiparalelas, que suporta seis hélices. Na figura 2b é possível observar os
aminoácidos pertencentes a essas estruturas secundárias, nos quais o FAD está ligado a estrutura
proteica, sendo que as linhas pretas tracejadas representam as ligações de hidrogênio, as pontes
salinas e as interações metálicas, as linhas verdes evidenciam as interações hidrofóbicas e as
linhas verdes tracejadas mostram as interações π-π e π-cátion.
As moléculas de FAD estão localizadas próximas a interface dos dímeros, distante
aproximadamente em 27 Å entre os grupos flavina presentes em cada monômero e mais do que
22 Å entre os grupos adenina, indicando que não ocorre interação entre os grupos prostéticos
do dímero.12 O acesso à flavina no sítio ativo ocorre por uma fenda profunda na estrutura da
enzima, a qual é formada pelos resíduos 75 a 98 da superfície de ambas as subunidades do
dímero. Com exceção a arginina 512 que parece apresentar duas conformações diferentes de
cadeia, todos os resíduos revestem essa fenda, o que pode ser observado pela densidade de
elétrons presente na figura 3.
22
Figura 3 – Representação estrutural do FAD e de sua densidade eletrônica, com destaque em círculos
amarelos para os aminoácidos de arginina presentes próximos ao sítio ativo (PDB:1CF3).
Fonte: Autoria própria.
A região da enzima que contém os cofatores FAD é responsável pelo reconhecimento
das moléculas de glicose. A figura 4 apresenta a estrutura química simplificada do FAD, o qual
é capaz de se reduzir a FADH2 quando recebe dois prótons e dois elétrons. Ao reagir com o
oxigênio molecular, o FADH2 é reoxidado a FAD produzindo peróxido de hidrogênio.
Figura 4 – Representação das estruturas químicas do FAD e FADH2 e de sua reação com o oxigênio
molecular. O grupamento R representa a cadeia lateral.
Fonte: Autoria própria
O ciclo catalítico da GOx pode ser separado em duas semi-reações, assim como ocorre
em outras flavoenzimas. Durante muitos anos, persistiram duas descrições para a etapa de
oxidação da glicose. Na primeira descrição, o FAD abstrai um hidreto do substrato ligado em
N
N
NH
R
O
O
N
N
NH
R
O
OH
H
2H+, 2e-
FAD FADH2
+ O2 N
N
NH
R
O
O
+ H2O2
FAD
23
uma única etapa, já na segunda, duas etapas estão presentes, ocorrendo um ataque nucleofílico
sobre o anel isoaloxazina, que precede uma transferência intramolecular de um próton. No
entanto, estudos recentes da GOx contendo análogos de seu cofator revelaram que o mecanismo
mais consistente para a oxidação dos açúcares é pela abstração do hidreto.13 Assim, na primeira
semi-reação, ocorre a oxidação da β-D-glicose pelo mecanismo de abstração de hidreto, onde
um próton é removido do grupo hidroxila do C1 da glicose por um grupo básico da enzima,
com transferência direta da posição C1 da glicose para a posição N5 do FAD, em um
mecanismo concertado, como mostra a figura 5a.14 A molécula de água na enzima livre oxidada
é substituída pela glicose, assim, a molécula de água sai do sítio ativo simultaneamente ao
próton-N3 da histidina 516, ocorrendo também uma transferência concertada do próton da
histidina 516 e do ânion hidreto ao FAD que oxidou a glicose. A lactona subsequente é
substituída pela água, deixando o sítio ativo com a histidina 516 protonada e a coenzima na
forma FADH-, como mostrado no esquema presente na figura 5b. Para a regeneração do FAD
tem-se outra semi-reação, onde a coenzima reduzida (FADH-) é reoxidada a FAD pela molécula
de oxigênio, a qual é reduzida a peróxido de hidrogênio. Essa reação procede via duas
transferências de um elétron cada, sendo esse mecanismo proposto a partir de investigações
cristalográficas da estrutura terciária da glicose oxidase.14
Em resumo, uma semi-reação envolve a oxidação da β-D-glicose a glucono-δ-lactona
pela transferência de um hidreto da flavina, iniciando a abstração de um próton do grupo
hidroxil O1 da glicose. A glucono-δ-lactona formada é em seguida hidrolisada de forma não-
enzimática a ácido glicônico. Na outra semi-reação, dois prótons e dois elétrons são transferidos
da enzima para o oxigênio molecular, produzindo peróxido de hidrogênio e regenerando o
estado oxidado da enzima.15 Na primeira semi-reação, a GOx faz a mediação na transferência
de hidreto da ligação C–H da glicose para o FAD,16 e na segunda semi-reação, ocorre a oxidação
do cofator reduzido (FADH-) pelo oxigênio molecular, formando peróxido de hidrogênio como
produto. As evidências apontam que a transferência do elétron durante a oxidação do FADH- é
a etapa limitante da velocidade da reação.17
As flavinas são cofatores enzimáticos bastante versáteis que se submetem a reações de
transferência de elétrons e de transferência acoplada de prótons e elétrons,18; 19 fazendo com
que as flavoenzimas estejam envolvidas em diversos processos químicos e fotoquímicos desde
a oxidação de C–H20 até o transporte de elétrons.21 Como citado, a GOx é uma proteína
homodimérica encontrada predominantemente em fungos e cada subunidade dessa proteína
contém uma molécula de FAD ligada de forma não-covalente à estrutura proteica a
aproximadamente 15 Å da superfície.2 Enzimas que apresentam cofatores orgânicos não têm as
24
vantagens apresentadas pelas metaloenzimas, como por exemplo a ocorrência da transferência
de elétrons e estabilização eletrostática em uma única etapa22 e a modulação dos potenciais
redox, melhorando a afinidade pelo oxigênio molecular.23 No entanto, elas permitem usar o
ambiente proteico de forma especializada a fim de ajudar a superar as barreiras cinéticas e
termodinâmicas associadas com a ativação do oxigênio molecular. A caracterização física da
proteína como dielétrico pode ser a chave para entender como as proteínas, como a GOx,
facilitam as reações de transferência de carga envolvendo seus ciclos catalíticos, sendo que o
ambiente eletrostático no qual a proteína se encontra é importante para a catálise da
transferência dos elétrons devido as exigências energéticas.24; 25
Figura 5 – (a) Mecanismo de abstração de hidreto proposto para a reação de oxidação da glicose, sendo
B correspondente a um grupo básico presente na enzima; (b) Etapas do mecanismo da semi-reação de
oxidação da glicose.
Fonte: Adaptação de Pereira, A. R. (2017) a partir de PERICIN, D., 2005, p. 738.
1.2 Transferência direta de elétrons
As reações enzimáticas que ocorrem na superfície do eletrodo podem se proceder de
duas maneiras. A primeira é baseada na utilização de mediadores redox (figura 6a) e nesse caso,
a enzima catalisa a oxidação e redução do mediador.26 Nesse tipo de sistema, o processo
catalítico envolve a transformação do analito e do mediador, sendo que a utilização de espécies
mediadoras de elétrons se faz necessária devido a volumosa estrutura proteica de algumas
enzimas, que distancia o cofator redox da superfície do eletrodo. Já a segunda maneira
a)
b)
25
corresponde a transferência direta de elétrons (TDE) (figura 6b).27 Nesse caso, o elétron é
transferido diretamente do centro ativo da enzima para a superfície do eletrodo, sem o auxílio
de outras espécies, fornecendo informações importantes em relação à termodinâmica e à
cinética dos processos biológicos redox.
Figura 6 – Representação esquemática da (a) transferência mediada de elétrons, onde Mr significa
mediador redox e (b) transferência direta de elétrons.
Fonte: Autoria própria.
Obter a TDE entre o centro ativo de uma enzima e um eletrodo é muito importante para
o desenvolvimento de dispositivos bioeletrônicos,28 uma vez que a eficiência dessa
transferência e os métodos de imobilização enzimática refletem no desempenho dos
bioeletrodos. Para a ocorrência da TDE em proteínas redox, alguns pré-requisitos precisam ser
considerados. De acordo com a teoria de Marcus,29 a velocidade da TDE entre dois sítios redox
irá depender de três fatores: a energia de reorganização, que é dividida entre as contribuições
de esfera externa e interna, as quais correspondem a reorientação do solvente necessária devido
a alteração da molécula e de suas cargas e a energia necessária para alterar as distâncias de
ligações, respectivamente;30 a diferença de potencial entre os sítios redox e a distância entre
esses sítios redox.31 Dessa forma, a TDE tem sido observada em proteínas redox onde o sítio
ativo está localizado próximo a superfície da proteína. No entanto, o desafio está em conseguir
obter a TDE para enzimas nas quais o sítio ativo está localizado no interior da proteína em um
local de difícil acesso. Nesse caso, a transferência de elétrons entre o centro ativo e o eletrodo
é bastante lenta. Assim, apesar dessa transferência ser atrativa devido a simplicidade do
sistema,27; 32 além desse tipo de eletrodo poder trabalhar em uma faixa de potencial próxima a
do potencial redox da própria enzima, há um desafio importante em conseguir obter essa
transferência direta de forma eficiente, uma vez que em alguns casos, como o da GOx, por
b) a)
26
exemplo, seu centro redox, o FAD, está localizado profundamente na apoenzima,33; 34 cerca de
13-15 Å,2 fazendo com que a velocidade dessa transferência seja lenta.
Assim, com o intuito de promover uma TDE eficiente, interfaces de eletrodo precisam
ser criadas ou ainda modificações estruturais podem ser induzidas na proteína para melhorar a
resposta eletroquímica entre a proteína e a superfície do eletrodo. Uma das estratégias adotada
para isso é a utilização de eletrodos com nanotubos de carbono35; 36 ou ainda fibras flexíveis de
carbono (FFC) esfoliadas de forma a produzir grafeno em suas bordas.37 Em relação a utilização
das FFC, nosso grupo tem demonstrado nos últimos anos que elas são eletrodos altamente
eficientes,37; 38; 39 uma vez que permitem o desenvolvimento de bioeletrodos flexíveis e
biocompatíveis, os quais podem ser utilizados na miniaturização de dispositivos implantáveis,
por exemplo. Uma outra estratégia possível é a alteração da estrutura proteica por
procedimentos como o de deglicosilação, o qual é responsável por retirar glicanos da estrutura
proteica sem desnaturar a enzima,40; 41, como exemplificado na figura 7, na qual a estrutura em
azul representa uma proteína inicialmente glicosilada (1), após a etapa de deglicosilação
enzimática (2) e por fim após a etapa de deglicosilação química utilizando o TFMS (3). Esse
tipo de procedimento faz com que a enzima fique menor, aproximando seu cofator da superfície
do eletrodo.
Figura 7 – Representação esquemática de uma enzima glicosilada e deglicosilada tanto pela rota
enzimática, quanto pela rota química, sendo destacados os tipos de açúcares e seus derivados presentes
na estrutura proteica.
Fonte: Adaptação de Pereira, A. R. (2017) a partir de EDGE, A. S. B., 2005, p. 343.
27
Um outro tipo de modificação possível para a estrutura proteica é a oligomerização das
proteínas e nesse caso, as unidades da proteína nativa são aglomeradas, expondo as cadeias
hidrofóbicas,42 melhorando a interação da enzima com a superfície de eletrodos de carbono.
A associação entre subunidades pode variar em relação a força e a duração. Sabe-se que
muitas proteínas são encontradas em seu estado oligomérico e outras apresentam a tendência à
associação com a posterior oligomerização sendo dependentes das condições do ambiente no
qual elas se encontram.43 Além disso, as proteínas podem ser oligomerizadas em resposta a
diferentes estímulos, como a hidrólise de nucleotídeos ou o estado de fosforilação.
É importante destacar que as interações hidrofóbicas, e consequentemente o grau de
hidrofobicidade da molécula, são um ponto crucial para a definição de interfaces homo-
oligoméricas, uma vez que cerca de dois terços dos resíduos presentes na interface não são
polares,44; 45 correspondendo a uma fração muito maior em relação à superfície de resíduos que
não interagem. Como demonstrado por Hashimoto e Panchenko,46 a composição dos
aminoácidos nas interfaces oligoméricas difere daquela nas superfícies e nas regiões internas
da proteína,47 sendo confirmado que a maioria das interfaces dos dímeros contêm aminoácidos
hidrofóbicos e aromáticos. Além disso, propondo algumas substituições, Nishi e Ota48
demonstraram que a maioria das substituições que envolviam resíduos aromáticos e
hidrofóbicos aumentaram a afinidade de ligação e a estabilização dos oligômeros. Em relação
ao processo de agregação física, algumas evidências sugerem que a pequena população de
intermediários enovelados e desenovelados é a precursora do processo de agregação. Isso
ocorre porque esses intermediários expõem mais as porções hidrofóbicas, além de apresentarem
maior flexibilidade quando comparados com o estado enovelado. Proteínas completamente
enoveladas ou desenoveladas não se agregam facilmente, uma vez que as cadeias com os sítios
hidrofóbicos estão em sua maioria localizadas no interior da proteína, onde praticamente não
há contato com a água.49 Assim, nota-se que a oligomerização das proteínas está diretamente
relacionada a exposição das cadeias hidrofóbicas das mesmas durante o processo de agregação,
como será detalhado no tópico seguinte.
1.3 Agregação e oligomerização proteica
Algumas proteínas podem se associar fisicamente e formar agregados a partir de seu
estado nativo (enovelado) sem passar por um estado intermediário. Essas associações podem
ser simplesmente eletrostáticas ou eletrostáticas e hidrofóbicas, dependendo das condições
experimentais. Outras forças fracas, como as de van der Waals também podem iniciar o
28
processo de associação, sendo conhecido que a auto-associação proteica está relacionada
principalmente a estabilidade conformacional.50
A agregação proteica pode ocorrer por cinco mecanismos diferentes: o primeiro deles
corresponde a associação reversível do monômero nativo, sendo que a tendência à agregação é
intrínseca a forma nativa da proteína, uma vez que a superfície do monômero é auto-
complementar, promovendo a auto-associação de forma reversível para pequenos oligômeros.
O segundo corresponde a agregação a partir da alteração conformacional do monômero, sendo
o primeiro passo, a mudança conformacional do estado não-nativo. Nesse caso, a agregação é
promovida pelo estresse, como o aquecimento ou algo que inicie a mudança de conformação.
O terceiro mecanismo corresponde a agregação do produto modificado quimicamente, podendo
ser considerado uma variação do mecanismo anterior, onde a alteração na conformação proteica
que precede a agregação é causada pela diferença na estrutura covalente. O quarto mecanismo
envolve a agregação controlada pela nucleação,51 enquanto que o quinto corresponde a
agregação induzida pela superfície e nesse caso, ela tem início com a ligação do monômero
nativo a uma superfície. Por exemplo, para uma interface ar-líquido a ligação provavelmente é
guiada por interações hidrofóbicas, mas quando interações eletrostáticas são favoráveis, elas
também podem estar envolvidas.52
A agregação proteica pode ser induzida por diferentes fatores, os quais incluem a
temperatura, a concentração proteica, o pH e a força iônica. Dentre esses parâmetros, o pH da
solução é um muito importante, uma vez que ele determina a forma dominante dos aglomerados
por afetar o tipo e a densidade das cargas da superfície e ainda o grau de rompimento estrutural
da proteína.50; 53 Por influenciar o tipo e a distribuição das cargas na superfície da proteína, o
pH afeta também as interações de enovelamento intra e intermolecular proteína-proteína. Assim
o pH juntamente com a hidrofobicidade e a propensão a formação da estrutura secundária são
parâmetros chave na determinação da velocidade da agregação proteica. Em pH extremos, as
proteínas estão bastante carregadas e a densidade de carga na superfície pode aumentar
significativamente as interações repulsivas intra e intermoleculares, levando a pelo menos um
desenovelamento parcial. Dessa forma, as proteínas podem ou não se agregarem dependendo
da contribuição intermolecular da atração hidrofóbica e da repulsão eletrostática.50
Em alguns casos o monômero proteico apresenta uma alteração conformacional que leva
ao aumento das folhas-β ou a exposição de porções hidrofóbicas, o que confere ao monômero
uma maior propensão a agregação.54; 55 Pequenos e ordenados agregados apresentam maiores
proporções de resíduos hidrofóbicos em sua superfície, os quais normalmente estão enterrados
no interior da proteína enovelada56 e simulações têm previsto que a hidrofobicidade e a
29
propensão à conversão de α-hélice em folhas-β contribuem de forma positiva para a taxa de
agregação.57 Além disso, os efeitos hidrofóbicos constituem um ponto crucial na promoção do
processo de agregação. As cadeias polipeptídicas sofrem um colapso hidrofóbico que minimiza
a acessibilidade do solvente a área superficial da proteína, criando conformações compactas.58
As proteínas oligomerizadas são formadas pela a associação de várias cadeias
polipeptídicas e ocorrem em abundância na natureza,59 sendo as interações hidrofóbicas
bastante importante na definição das interfaces homo-oligoméricas.60 Além disso, interfaces
oligoméricas apresentam uma complementariedade significativa em relação a forma geométrica
e eletrostática, o que dá origem a especificidade da interação.61; 62
1.4 Síntese dos oligômeros utilizando o ácido trifluorometanosulfônico
Os conceitos de ácido e base foram debatidos por muitos anos até que definições
precisas fossem desenvolvidas. Entre as primeiras definições, encontra-se a do químico sueco
Svante Arrhenius que em 1884 sugeriu que um ácido é um composto que contém hidrogênio e
reage com a água a fim de formar íons hidrogênio, enquanto que a base foi definida como um
composto que produz íons hidróxido em água. No entanto, essa definição apresenta uma
limitação, uma vez que considera apenas a água como solvente. Assim, em 1923 dois químicos
trabalhando de forma independente: Thomas Lowry, na Inglaterra, e Johannes Brønsted, na
Dinamarca, definiram ácidos e bases com um novo conceito. Nesse caso, os ácidos são
considerados como doadores de prótons, enquanto que bases são consideradas receptoras de
prótons.63 Assim, ácidos como o clorídrico, nítrico, sulfúrico e trifluorometanosulfônico
(TFMS) podem ser definidos como ácidos de Brønsted.64; 65
O TFMS (figura 8) é conhecido como o ácido orgânico monoprótico mais forte dentre
os existentes, sendo que ele e sua base conjugada apresentam alta resistência e estabilidade
térmica tanto na clivagem relativa a oxidação, quanto a redução.66 A natureza não-oxidante do
TFMS pode ser benéfica em relação a eliminação ou minimização de reações secundárias, além
de diminuir os riscos associados a ácidos oxidantes fortes.
A síntese do TFMS foi descrita pela primeira vez em 1954 por Haszeldine e Kidd.67 Na
ocasião obteve-se o TFMS pela oxidação do bis(trifluormetiltiol)mercúrio com peróxido de
hidrogênio. Esse ácido é usado em diversos tipos de reações, dentre elas estão: (i) a formação
de sais, na qual o TFMS reage de forma exotérmica com hidróxidos de metais ou de carbonatos
metálicos; (ii) formação de ésteres e, nesse caso, a reação exotérmica de álcoois com o TFMS
produz ésteres, podendo também formar éteres e olefinas, o que limita a utilidade desse tipo de
30
reação; (iii) formação de anidridos e halogenetos ácidos; (iv) reações de Friedel-Crafts, nas
quais são formados anidridos de ácido carboxílico trifluormetanosulfônico após a adição de
cloreto de acilo ou de anidrido acético ao TFMS. Para condensações Friedel-Crafts de cloretos
de sulfonilo aromáticos com compostos aromáticos, o TFMS é usado como catalisador.66 Além
dessas reações, o TFMS tem sido utilizado para a remoção de carboidratos de glicoproteínas
mantendo o esqueleto da proteína intacto.68
Figura 8 – Representação estrutural do ácido trifluorometanosulfônico (TFMS).
Fonte: Autoria própria.
Como citado anteriormente, a deglicosilação mediada pelo TFMS tem como vantagem
a remoção de cadeias de carboidratos das glicoproteínas sem alteração da composição proteica.
O TFMS permite a deglicosilação de glicoproteínas com estrutura desconhecida, sendo que
ligações amida são estáveis em relação a ele e a base do procedimento está relacionada à
estabilidade das ligações glicosídicas, quando comparada as ligações peptídicas.69
Esse ácido é descrito como um dos melhores reagentes para a deglicosilação química de
diferentes proteínas, como a fetuína e a gonadotropina coriônica humana68 e também a HRP70,
dentre outras. Sendo mostrada a retenção da estrutura monomérica dessas proteínas e ainda a
retenção da atividade catalítica da HRP. Dessa forma, os resultados citados demonstram que
apesar de ser um ácido forte, o TFMS reage com as proteínas sem desnaturá-las, o que permite
sua utilização em outros tipos de reação, como em procedimentos de oligomerização proteica.
As proteínas oligomerizadas são interessantes devido ao fato delas poderem ser
reguladas alostericamente, introduzindo um nível adicional de controle, além de serem mais
resistentes a degradação e a desnaturação.60 A oligomerização das proteínas permite ainda a
formação de estruturas grandes sem a modificação do genoma, fornecendo estabilidade,
enquanto que a reduzida área do monômero em um complexo pode oferecer proteção contra a
desnaturação.43 Normalmente o centro ativo de uma proteína oligomerizada está localizado na
interface entre as subunidades, permitindo a ocorrência de movimentos sutis entre elas, o que
pode ser usado a favor da catálise ou dos mecanismos de regulação, além de melhorar a
31
eficiência e a especificidade.46 Uma outra vantagem da utilização de proteínas oligomerizadas
é a diminuição da área exposta na superfície da proteína, reduzindo o número de íons
necessários para neutralizar as cargas expostas e ainda a quantidade de moléculas de água
necessárias para hidratar a superfície proteica.46
Ressalta-se que na oligomerização proteica, assim como em outras reações envolvendo
proteínas, o pH é conhecido como um parâmetro chave, uma vez que ele atua na distribuição
de carga ao longo da superfície proteica, podendo afetar tanto seu enovelamento, quanto as
interações proteína-proteína.57 Nesse caso, a agregação irá depender de dois fatores: a atração
hidrofóbica e a repulsão eletrostática.50; 57 A literatura tem descrito que pequenos e ordenados
agregados apresentam altas proporções de resíduos hidrofóbicos expostos em suas superfícies,
o que não ocorre com as proteínas em seu estado nativo, já que esses resíduos costumam ser
encontrados no interior da estrutura proteica.56 Além disso, tem sido descrito que essa
hidrofobicidade e a propensão a conversão de estruturas α-hélice em folhas-β contribuem
positivamente na taxa de formação dos agregados.57
Assim, aliando-se o fato de que o pH é um parâmetro importante na formação dos
oligômeros e que o TFMS é um ácido forte, capaz de reduzir drasticamente o pH do meio
reacional sem, no entanto, promover a desnaturação da enzima, pressupõe-se que ele possa ser
utilizado para promover a oligomerização da glicose oxidase. Nesse contexto, esse trabalho
demonstra como pode ser obtida a glicose oxidase oligomerizada (Ol-GOx) a partir da forma
nativa da proteína (GOx) utilizando ácidos de Brønsted para promover a agregação proteica.
32
2 OBJETIVO
Esta tese de doutorado tem como objetivo apresentar um método para a modificação
estrutural da enzima glicose oxidase visando melhorar a interação entre a enzima e a superfície
de eletrodos de fibras flexíveis de carbono. É de interesse a produção de um biocatalisador mais
eficiente tanto na obtenção da transferência direta de elétrons entre o cofator enzimático e a
superfície do eletrodo, quanto na bioeletrocatálise da glicose. Como modificação estrutural foi
escolhida a oligomerização da glicose oxidase utilizando diferentes ácidos de Brønsted, dentre
eles, o ácido trifluorometanosulfônico. Após essa obtenção, utilizaram-se técnicas
espectroscópicas e microscópicas a fim de comparar as estruturas das enzimas nativa e
oligomerizada. Além disso, técnicas eletroquímicas foram utilizadas para estudar tanto a etapa
não-catalítica, quanto a etapa catalítica da reação envolvendo a glicose oxidase. Ou seja, nosso
interesse é analisar se é possível a obtenção de uma enzima com caráter mais hidrofóbico a fim
de melhorar sua interação com a superfície de eletrodos de carbono, permitindo o
desenvolvimento de bioeletrodos mais eficientes.
33
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
O procedimento experimental está dividido em sete partes. A figura 9 contém o
fluxograma que resume em quais etapas esse estudo está dividido e quais as técnicas utilizadas
em cada etapa.
Figura 9 – Fluxograma descrevendo as etapas desse estudo e as técnicas utilizadas em cada uma.
34
Primeiramente são descritos os materiais e reagentes utilizados ao longo do trabalho.
Em seguida, é descrita a rota química para a oligomerização utilizando o TFMS (tópico 3.2). O
tópico 3.3 descreve as técnicas utilizadas para a caracterização estrutural da enzima antes e após
a oligomerização. Após isso, o tópico 3.4 descreve a metodologia utilizada para o estudo da
cinética enzimática em solução. Por fim, os tópicos 3.5 a 3.8 descrevem a preparação dos
eletrodos, o tratamento químico da superfície dos mesmos e da imobilização enzimática da GOx
e da Ol-GOx, além das condições e os parâmetros utilizando nas técnicas eletroquímicas
empregadas e na modelagem cinética para o cálculo da constante heterogênea de transferência
de carga.
3.1 Materiais e reagentes
A glicose oxidase (GOx), proveniente da espécie Aspergillus niger, foi obtida da Sigma-
Aldrich. Os reagentes: ácido trifluorometanosulfônico 99%, 2,2’-azino-bis-(ácido 3-
etilbenzotiazolina-6-sulfônico) sal diamônio (ABTS) 98%, peroxidase de raíz forte (HRP),
náfion 5%, ácido clorídrico 37%, ácido nítrico 65%, ácido sulfúrico 95-99%, 2-mercaptoetanol
e ácido cítrico foram obtidos da Sigma-Aldrich e utilizados sem prévia purificação. Os sais
fosfato de sódio mono e bibásico utilizados na preparação do tampão fosfato de sódio,
permanganato de potássio P.A. e D-glicose anidra P.A. foram adquiridos da Synth e o KBr
espectroscópico foi obtido da Vetec. A membrana de celulose para diálise com MWCO de 14
kDa foi adquirida da Sigma-Aldrich. Para os experimentos de eletroforese SDS-PAGE foram
utilizados os géis mini-PROTEAN TGX, tampão de amostra Laemmli, solução tampão tris-
glicina-SDS e o corante de proteínas azul de Coomassie G-250, os quais foram adquiridos da
Bio-Rad. O padrão de massas moleculares (60 a 250 kDa) utilizado na eletroforese SDS-PAGE
foi adquirido da Thermoscientific. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada e
as vidrarias foram previamente limpas e secas. Para o controle da temperatura durante os
experimentos, utilizou-se um banho termostático de alta resolução proveniente da GE
Healthcare Life Sciences (MultiTemp IV Thermostatic Circulator). As fibras flexíveis de
carbono utilizadas como eletrodos de trabalho nos experimentos eletroquímicos foram extraídas
de um tecido de carbono (CCS 200) e nesse caso, elas são obtidas a partir do precursor
poliacrilonitrila (PAN).71
35
3.2 Oligomerização da glicose oxidase nativa
A GOx nativa foi incubada na presença de TFMS pré-resfriado (4 ºC) durante 30
minutos. Para isso, 2,0 mL de uma solução de GOx (3,0 mg mL-1 previamente preparada em
tampão fosfato de sódio, 0,10 mol L-1 e pH 7,5) foi misturada a 140 μL de TFMS, sendo a
temperatura da reação mantida a 20 ºC. Após o tempo de reação, a mistura contendo a Ol-GOx
foi colocada em uma membrana de diálise (com MWCO de 14 kDa) a fim de remover o ácido
residual e de purificar a amostra. Dois procedimentos de diálises foram realizados. No primeiro,
a membrana contendo a mistura com a Ol-GOx foi colocada em um béquer com 40 mL de
tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5) e o sistema foi agitado durante 3h a 25 ºC. Na
segunda diálise, a membrana foi trocada para outro béquer contendo 40 mL de tampão fosfato
de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5) e foi mantida a 4 ºC durante outras 3 horas. Após as diálises, a
Ol-GOx foi removida da membrana de diálise e armazenada a 4 ºC até que fosse utilizada.
Para os estudos relativos a influência dos diferentes ácidos de Brønsted na síntese dos
oligômeros de GOx, o mesmo procedimento descrito acima foi adotado, no entanto, a GOx
nativa foi incubada separadamente na presença de 140 μL de HCl, HNO3 e H2SO4, todos na
concentração de 11,2 mol L-1.
3.3 Caracterização
A fim de comparar as estruturas da GOx nativa e da Ol-GOx, as seguintes técnicas foram
utilizadas: espectroscopia eletrônica na região do UV-Vis, dicroísmo circular, espectroscopia
de FTIR, eletroforese SDS-PAGE, espectroscopia de massas MALDI-TOF, espalhamento
dinâmico de luz, microsespectroscopia FTIR e microscopia eletrônica de transmissão como
serão descritos nos tópicos seguintes.
3.3.1 Espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível
A espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível (UV-Vis) corresponde ao
estudo das transições entre níveis de energia eletrônica que resultam na absorção de radiação
eletromagnética nessa região do espectro. Essa técnica mede a transmitância (T) ou a
absorbância (A) de soluções ou suspensões coloidais contidas em cubetas, as quais seguem um
caminho óptico b (cm). Assim, a concentração (c) de um analito absorvente se relaciona com a
absorbância pela equação de Lambert-Beer (equação 1).
36
𝐴 = 𝜀𝑏𝑐 (1)
Em que 𝜀 corresponde a absortividade do analito. Um espectro de absorção é obtido
quando as moléculas interagem com a radiação, provocando a excitação dos elétrons a níveis
mais altos de energia. Essa transição pode ocorrer tanto em comprimentos de onda na região do
visível, quanto do ultravioleta, fazendo com que quantidades diferentes de energia sejam
absorvidas dependendo dos níveis que os elétrons podem atingir. Assim, o resultado obtido é
representado por uma banda de absorção.72
Dessa forma, utilizou-se a espectroscopia eletrônica na região do UV-Vis para
monitorar as bandas características do FAD durante a formação dos oligômeros de GOx e
também para acompanhar a formação dos oligômeros, uma vez que agregados proteicos tendem
a apresentar maior turbidez e, consequentemente, um espalhamento no espectro obtido. Para
tanto, os experimentos foram realizados utilizando um espectrofotômetro Jasco V-760 no
intervalo de 200 a 600 nm em uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm.
3.3.2 Dicroísmo circular
O dicroísmo circular (CD) é uma técnica espectroscópica usada para elucidar a
quiralidade dos compostos. Essa técnica corresponde a uma variação da espectroscopia de
absorção, embora utilize a diferença entre a absorção da luz circularmente polarizada para a
direita e para a esquerda na análise das amostras.73 Em relação ao estudo de macromoléculas
biológicas, o dicroísmo circular é utilizado na identificação de grupamentos amida, de porções
α-hélice e folhas-β presentes nessas moléculas,74; 75 ou seja, ele permite a identificação da
estrutura secundária de moléculas como proteínas, permitindo a análise de alterações
conformacionais na estrutura proteica.
Assim, os espectros de dicroísmo circular foram obtidos em um espectropolarímetro
Jasco J-815, a partir de uma média de 30 acumulações. Os espectros nas regiões de UV próximo
(300-250 nm) e distante (250-200 nm) foram obtidos em cubetas com 1,0 cm de caminho
óptico. Para analisar a estabilidade térmica da GOx e da Ol-GOx, variou-se a temperatura de
20 ºC a 90 ºC, sendo que os dados obtidos correspondem a uma média de 10 acumulações.
37
3.3.3 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho
A radiação de infravermelho consiste em fótons com energia de valor em torno da
diferença de energia entre os níveis vibracionais das moléculas, ou seja, a absorção desse tipo
de radiação provoca aumento na amplitude das vibrações moleculares, as quais são definidas
como movimentos periódicos que envolvem mudanças de posição relativa entre os átomos de
uma mesma molécula.76 Assim, a espectroscopia vibracional na região do infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR) é utilizada para obter informações a respeito de mudanças nos
modos de vibração ou modos de rotação das moléculas. Diferentemente da espectroscopia na
região do UV-Vis, com energia associada às transições eletrônicas, o FTIR utiliza uma radiação
de menor energia para que transições vibracionais sejam induzidas.76 Isso ocorre devido ao
grande número de estados vibracionais associados aos átomos presentes em uma molécula, o
que faz com que diferentes moléculas podem ser caracterizadas a partir de frequências de
vibração características.
Dessa forma, as medidas de FTIR foram realizadas no modo transmissão na região de
4000 a 600 cm-1 utilizando o espectrômetro de FTIR Bruker Vertex 70v com o detector HgCdTe
– MCT. A resolução espectral escolhida foi 4 cm-1 e 32 acumulações foram obtidas para cada
espectro. As pastilhas foram preparadas utilizando 1,0 mg de enzima (GOx ou Ol-GOx)
liofilizada e 99 mg de KBr.
Para a análise da estrutura secundária de ambas as enzimas utilizou-se a seguinte
metodologia: a região relativa a amida I (entre 1600 e 1700 cm-1) foi selecionada e a linha de
base foi subtraída de cada espectro. Em seguida, fez-se a segunda derivada de cada gráfico e os
picos presentes foram posteriormente simulados em funções Gaussianas no espectro original.
Como a área de cada curva Gaussiana é conhecida, é possível calcular a porcentagem de cada
tipo de estrutura secundária presente nas enzimas, sendo que a atribuição das bandas é feita
com base no que está descrito na literatura.77; 78
3.3.4 Eletroforese SDS-PAGE
A eletroforese é uma técnica simples, rápida e bastante sensível para o estudo das
propriedades das proteínas, sendo a separação das mesmas baseada na migração de moléculas
carregadas em uma matriz onde o campo elétrico está sendo aplicado.79 Existem diferentes
métodos eletroforéticos que utilizam o gel de poliacrilamida, no entanto, o mais utilizado é a
SDS-PAGE (Sodium dodecil sulfate-poliacrilamide gel electrophoresis) descontínua. Nesse
38
tipo de sistema, a mistura de proteínas é desnaturada pelo aquecimento na presença de excesso
de SDS e um reagente tiol, como o mercaptoetanol. Sob essas condições, as proteínas são
dissociadas em suas unidades individuais de polipeptídeos e se ligam ao SDS em uma razão
constante de massa (1,4 gramas de SDS por grama de proteína) formando complexos com
densidade de carga idêntica. Assim, nessa técnica as proteínas são separadas apenas pela
diferença em sua massa molecular.80; 81
Dessa forma, a eletroforese SDS-PAGE pode ser utilizada para estimar o tamanho da
proteína e sua pureza. Para tanto, primeiramente preparou-se a cuba de eletroforese: após o gel
mini-PROTEAN TGX ser colocado no suporte para a corrida, preencheu-se as câmaras interna
e externa com o tampão de corrida Tris-glicina-SDS diluído na proporção 1:10 com água
deionizada. Em seguida, prepararam-se as amostras da seguinte maneira: 5 μL de amostra, 4,75
μL do tampão de amostra Laemmli e 0,25 μL de 2-mercaptoetanol. As misturas reacionais
foram aquecidas a 70 ºC durante 10 minutos e foram adicionadas aos poços do gel de
eletroforese. Aplicou-se 100 V e a corrida se procedeu até que o corante chegasse ao limite
inferior do gel. Ao final da corrida, o gel foi retirado da cuba e removido do suporte por
flutuação na água. Lavou-se o gel três vezes, durante cinco minutos cada, com água deionizada
e após isso, prosseguiu-se com a coloração utilizando 50 mL do corante Bio-Safe azul de
Coomassie G-250 durante uma hora sob agitação. Após esse tempo, lavou-se o gel com água
deionizada por aproximadamente 30 minutos e este foi armazenado em água.
3.3.5 MALDI-TOF
A espectrometria de massas utilizando a técnica MALDI (Matrix-assisted Laser
Desorption/Ionization) promove a vaporização e ionização não-destrutiva tanto de
biomoléculas grandes, quanto pequenas. Nesse tipo de análise, a amostra é primeiramente co-
cristalizada em um grande excesso molar do componente da matriz, geralmente composta por
um ácido orgânico fraco que absorve radiação na região do ultravioleta. Após isso, a radiação
laser dessa mistura analito-matriz resultará na vaporização da matriz que carregará o analito
junto com ela.82 Dentre os tipos de analisadores de massa existentes, o TOF (time of flight) é o
mais simples deles, sendo a massa molecular da amostra determinada a partir do tempo de voo
do íon.
Dessa forma, as análises de espectrometria de massas utilizando a técnica MALDI-TOF
têm como objetivo comparar as massas moleculares da GOx nativa e do oligômero formado
após a reação com o TFMS. As análises foram realizadas na Central Analítica do IQ-USP no
39
modo de aquisição MS utilizando o equipamento UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF. Para a
GOx nativa, a matriz utilizada foi o ácido sinapínico (AS), enquanto que para a Ol-GOx foi o
α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA).
3.3.6 Espalhamento dinâmico de luz
O espalhamento dinâmico de luz (DLS) tem sido utilizado para a determinação do raio
hidrodinâmico de diversos tipos de partículas. Para tanto, o tamanho da partícula é determinado
pelo movimento Browniano da mesma em uma amostra, sendo este definido como um
movimento randômico das partículas em um líquido devido ao bombardeamento pelas
moléculas vizinhas à partícula.83 Ressalta-se que as partículas em um líquido se movem de
forma randômica e a velocidade de seu movimento é utilizada para determinar o tamanho da
partícula.
Assim, as medidas de DLS foram realizadas em um Zetasizer Nano Series Malvern, a
25 ºC. Primeiramente as amostras foram filtradas (utilizando membranas com poros da ordem
de 0,2 μm) com o intuito de remover qualquer impureza que pudesse comprometer as medidas.
As soluções foram diluídas para 0,5 mg mL-1 em tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH
7,5).
3.3.7 Microespectroscopia-FTIR
As imagens microscópicas foram obtidas no microscópio Hyperion 3000, o qual está
acoplado ao espectrômetro de FTIR Bruker Vertex 70v. Esse microscópio é equipado com um
detector FPA (Focal Plane Array), o qual permite a obtenção de espectros de 4096 diferentes
regiões separadas 2,7 μm entre si. Com esses espectros resolvidos no espaço é possível a
construção de imagens relativas à intensidade de modos vibracionais característicos da amostra.
Os mapas químicos foram gerados considerando a intensidade da banda de amida I
distribuída ao longo das amostras de GOx nativa e Ol-GOx. As amostras foram preparadas
gotejando-se 1 μL da solução aquosa de cada enzima (3 mg mL-1) em um substrato de fluoreto
de cálcio e em seguida foram secas em temperatura ambiente durante 12 horas e analisadas no
modo de transmissão.
40
3.3.8 Microscopia eletrônica de transmissão
As imagens de microscopia eletrônica de transmissão foram obtidas no equipamento
JEOL JEM2100 LaB6 – 200 kV com baixo tempo de exposição das amostras a fim de analisar
o tamanho e a morfologia característica da GOx antes e após o tratamento com o TFMS. As
soluções de enzima foram dialisadas em água deionizada para remover qualquer resíduo
relativo ao tampão fosfato de sódio, e após isso, gotejou-se as amostras de GOx e Ol-GOx nas
grades para microscopia e estas foram secas durante 12 horas.
3.4 Cinética enzimática
A cinética enzimática se refere a análise quantitativa de todos os fatores determinantes
para o potencial catalítico da enzima.84 Estudos sobre a cinética enzimática são importantes por
possibilitarem a determinação da afinidade enzimática com o substrato e sua eficiência
catalítica máxima.
Assim, a atividade catalítica da GOx e da Ol-GOx foi determinada de acordo com
protocolos já descritos na literatura.85; 86 Em resumo, 0,5 mL de ABTS (16 mmol L-1), 0,5 mL
de HRP (1,9 U mL-1) em tampão citrato-fosfato (0,10 mol L-1; pH 5,2) e 0,5 mL de glicose
(0,09 mol L-1) foram adicionados em um tubo de reação. A mistura reacional foi borbulhada
com oxigênio durante 60 segundos e após isso, 50 μL de GOx (3,0 mg mL-1) e Ol-GOx (3,0 mg
mL-1) foram adicionados em diferentes tubos de reação. Os frascos foram incubados por 30
minutos a 30 ºC e a reação foi parada com 0,10 mL de HCl (4,0 mol L-1). O produto formado
ao final da reação é o ABTS+, o qual é detectado por espetroscopia na região do visível, com
um máximo de absorbância em 420 nm.
3.5 Eletroquímica: preparação dos eletrodos modificados
Para as medidas eletroquímicas, utilizaram-se as fibras flexíveis de carbono (FFC) como
eletrodo de trabalho. Antes do processo de imobilização enzimática, as fibras foram submetidas
a um tratamento químico, como ilustrado na figura 10. Adicionaram-se as FFC, retiradas de um
tecido de carbono (CCS 200), em uma mistura de H2SO4/KMnO4 (120 mL) preparada pela
adição de 464 mg de KMnO4 em H2SO4 1,0 mol L-1. As FFC foram mantidas em banho
ultrassônico por 3 horas e após isso elas foram lavadas com HCl 37% para remover o MnO2
41
formado. Por fim, lavaram-se as FFC com água deionizada até que o pH da água de lavagem
fosse próximo do neutro.37
Figura 10 – Ilustração das etapas do tratamento químico ao qual as FFC são submetidas antes de serem
utilizadas como eletrodos de trabalho nos experimentos eletroquímicos.
Fonte: Adaptação de Pereira, A. R. (2017) a partir de MARTINS, M. V. A., 2014, p. 17349.
Os eletrodos modificados com GOx e Ol-GOx foram preparados pela adsorção física
das enzimas sendo as FFC colocadas em uma solução de enzima durante 36 horas e a 4 ºC.
Após isso, 20 μL de náfion® 2,5% foram adicionados ao bioeletrodo, o qual foi seco a vácuo
por 10 minutos.
3.6 Eletroquímica: voltametria cíclica e cronoamperometria
Os experimentos eletroquímicos foram realizados utilizando um sistema de três
eletrodos composto pelos bioeletrodos FFC-GOx e FFC-Ol-GOx como eletrodos de trabalho,
platina como contra-eletrodo e Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência. Como eletrólito,
utilizaram-se 20 mL de tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). A temperatura do
eletrólito foi controlada utilizando um banho termostático (GE-MultiTemp Thermostatic
Circulator) e os experimentos foram realizados utilizando um potenciostato/galvanostato
μAutolab tipo III.
Para o estudo da TDE, borbulhou-se argônio no eletrólito por 30 minutos antes dos
voltamogramas serem obtidos, sendo todos eles obtidos sob atmosfera de argônio. Já para os
testes bioeletrocatalíticos, utilizou-se uma solução de glicose 0,90 mol L-1 preparada em tampão
fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5), a qual foi mantida por 12 horas na geladeira antes dos
experimentos para que ocorresse a isomerização da glicose. Nesse caso, borbulhou-se oxigênio
42
no eletrólito por 10 minutos antes das medidas, sendo também mantida a atmosfera de oxigênio
durante os experimentos.
3.7 Modelagem cinética: eletroquímica da etapa não-catalítica
A teoria de Marcus aplicada a sistemas heterogêneos87; 88 foi utilizada para interpretar a
cinética de transferência de elétrons dos bioeletrodos. Calcularam-se as constantes de
velocidade eletroquímica em função do sobrepotencial com base na relação de Chidsey
(equação 2),89 obtida a partir da equação padrão de Marcus29 em combinação com a distribuição
de Fermi-Dirac.
𝑘𝑟𝑒𝑑/𝑜𝑥𝑖 =𝑘𝑚𝑎𝑥
√4πλ/RT∫
exp[−[(λ ± 𝐹(𝐸 − 𝐸0′))/𝑅𝑇 − 𝑥]2𝑅𝑇/4λ]
exp(𝑥) + 1𝑑𝑥
∞
−∞
(2)
Em que kmax corresponde a constante de velocidade máxima, λ é a energia de
reorganização, R é a constante ideal dos gases, T é a temperatura, (E – E0’) é o sobrepotencial,
considerando que em simulações voltamétricas, a função integral da equação 2 pode ser
numericamente aproximada pelo somatório sobre uma faixa suficientemente ampla de x. As
constantes heterogêneas de transferência de carga da GOx e da Ol-GOx e a energia de
reorganização dos sistemas foram encontradas com base na equação 2 e com o algoritmo
desenvolvido por Luz90 utilizando o software Matlab®.
3.8 Cinética: eletroquímica da etapa catalítica
O caso mais relevante de catálise heterogênea é representado pelas enzimas
imobilizadas, onde a reação ocorre na superfície ou dentro da molécula do biocatalisador.84 No
entanto, a imobilização enzimática pode produzir tanto efeitos conformacionais, quanto micro-
ambientais, afetando a cinética da reação catalisada, fazendo com que sejam obtidos parâmetros
aparentes em relação a cinética enzimática. Dessa forma, a partir da observação do perfil de
Michaelis-Menten, utilizaram-se as metodologias de Lineweaver-Burk e Hanes-Woolf a fim de
se determinar o KMapp para a GOx e a Ol-GOx imobilizadas nas FFC. Para Lineweaver-Burk, a
equação 3 foi utilizada, sendo ela correspondente a versão eletroquímica da equação de
Lineweaver-Burk.91; 92
43
1
𝐼𝑠𝑠=
1
𝐼𝑚𝑎𝑥+
𝐾𝑀𝑎𝑝𝑝
𝐼𝑚𝑎𝑥
1
𝑐 (3)
Em que Iss corresponde à corrente de estado estacionário após a adição do substrato, Imax
corresponde a corrente máxima obtida sob condições de saturação do substrato e c corresponde
a concentração do substrato.
Para a metodologia de Hanes-Woolf,93 a equação 4 pode ser usada para estimar os
mesmos parâmetros, considerando que jmax é proporcional a vmax.
[𝑆]
𝑉=
1
𝑉𝑚𝑎𝑥+
𝐾𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥 (4)
Em que [S] corresponde a concentração de substrato, V e Vmax correspondem a
velocidade e velocidade máxima da reação, respectivamente.
44
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Obtenção dos oligômeros de GOx
A oligomerização da GOx foi realizada pela desestabilização da estrutura terciária da
proteína em um processo conhecido como agregação proteica. Para tanto, a GOx nativa foi
incubada na presença de um ácido de Brønsted, o TFMS, em pH 1,0 e a 4 ºC. Esse ácido foi
escolhido para a síntese dos oligômeros de Ol-GOx por ser um ácido que não degrada a
proteína,41 preservando ainda sua atividade catalítica, como discutido anteriormente. A fim de
estabelecer as condições ótimas para a ocorrência da reação, alguns parâmetros foram variados,
são eles: a quantidade de TFMS pré-resfriado adicionado a reação, o tempo de reação e a
temperatura da mesma. Analisou-se ainda se a eficiência da reação seria maior em fase sólida
ou em solução tamponada. Outros ácidos de Brønsted como o sulfúrico, nítrico e clorídrico
foram avaliados para a obtenção da Ol-GOx, no entanto, apesar de promoverem a agregação
proteica de maneira similar ao TFMS, como observado na figura 11a, a qual mostra a
distribuição de tamanhos obtido pela medida de espalhamento dinâmico de luz (DLS) para a
GOx nativa (linha vermelha) e para a GOx após as reações com TFMS (linha azul), H2SO4
(linha roxa), HCl (linha laranja) e HNO3 (linha verde), apresentaram uma redução significativa
na atividade enzimática (85-94%), podendo assim considerar que as enzimas obtidas a partir
das reações com HCl, H2SO4 e HNO3 são inativas (figura 11b).
Figura 11 – (a) Distribuição (por número) de tamanhos obtido pela medida de DLS para a GOx após o
tratamento com diferentes ácidos de Brønsted; (b) Comparação da atividade específica para a GOx após
o tratamento com os diferentes ácidos.
0 5 10 15 20 50 100 150 200 250 3000
2
4
6
8
10
12
Inte
nsi
dad
e (%
)
dh (nm)
GOx
GOx-TFMS
GOx-H2SO
4
GOx-HCl
GOx-HNO3
(a)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
GO
x-H 2
SO 4
GO
x-H
NO 3
GO
x-H
Cl
GO
x-TFM
S
Ati
vid
ad
e e
specíf
ica (
mo
l m
in-1 m
g-1)
GO
x
(b)
45
A formação de agregados proteicos, com consequente formação de oligômeros pode ser
alcançada a partir da alteração do ambiente no qual a proteína está inserida, uma vez que esse
processo é influenciado por fatores como baixas temperaturas, concentração de solutos,
formação de interfaces água-gelo, alterações no pH e ainda pela separação de fases.50 Assim, a
Ol-GOx pode ser obtida utilizando diferentes ácidos de Brønsted, como o TFMS, HCl, H2SO4
e HNO3, uma vez que a diminuição abrupta do pH do meio reacional, de 7,5 para 1,0, durante
o processo de incubação, expõe cadeias hidrofóbicas levando a aglomeração proteica com o
intuito de evitar a desnaturação.94; 95
Uma vez confirmado por DLS (figura 11a) que todos os ácidos utilizados promovem a
formação de aglomerados proteicos com um raio hidrodinâmico ao menos oito vezes maior do
que para a GOx nativa, propõe-se aqui estudar como a estrutura da enzima é modificada quando
cada ácido é utilizado. A figura 12a mostra o espectro de UV-Vis para a GOx nativa e para a
GOx obtida a partir da reação com os diferentes ácidos testados, onde pode ser observado que
a formação dos aglomerados não afetou de forma significativa o grupo prostético FAD, já que
as bandas características estão presentes no espectro.96 Além disso, é observado em 350 nm
(linha cinza), um aumento na turbidez para todas as soluções de enzima, outra confirmação da
formação dos aglomerados.
Figura 12 – (a) Espectros de UV-Vis e (b) Espectros de FTIR de uma solução de GOx (3,0 mg mL-1;
linha vermelha), GOx-TFMS (3,0 mg mL-1; linha azul), GOx-H2SO4 (3,0 mg mL-1; linha roxa), GOx-
HCl (3,0 mg mL-1; linha laranja) e GOx-HNO3 (3,0 mg mL-1; linha verde).
Para determinar a estrutura secundária dessas proteínas, utilizaram-se os espectros de
FTIR (figura 12b). Em princípio, quando analisados os espectros, não há uma diferença entre
eles quando comparados ao da GOx nativa. No entanto, quando analisada a região da amida I
300 400 500 600
0,0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
to
tal =
ab
s +
es
p
Comprimento de onda / nm
GOx nativa
GOx-TFMS
GOx-HNO3
GOx-H2SO
4
GOx-HCl
(a)
5000 4000 3000 2000 1000
GOx-TFMS
Número de onda / cm-1
GOx
GOx-H2SO
4
GOx-HCl
GOx-HNO3
(b)
46
(figura 13), diferenças significativas podem ser notadas para as enzimas obtidas após as reações
com HCl, H2SO4 e HNO3, sendo que as figuras 13a, 13b e 13c correspondem as bandas de
amida I das seguintes enzimas: GOx-H2SO4, GOx-HCl e GOx-HNO3. Ressalta-se que para
todos os casos estão presentes tanto o gráfico relativo ao pico da amida I, quanto a curva obtida
após o somatório das gaussianas internas, sendo que ambos estão sobrepostos, como observado
nas linhas tracejadas dos gráficos. Como descrito no gráfico de barras (figura 13d), para a
enzima obtida pela reação com o HNO3 há um aumento considerável na quantidade de folhas-
β, enquanto que aquela obtida pela reação com o HCl apresentou a maior quantidade de α-
hélice. No geral, quando utilizados o HCl, HNO3 e H2SO4 para a oligomerização, as enzimas
apresentaram alterações significativas em sua estrutura secundária, quando comparadas a Ol-
GOx obtida pela reação com o TFMS, a qual apresentou pequenas alterações nas porções de
cada tipo de estrutura em relação à enzima nativa. Sendo que isso era esperado, uma vez que o
TFMS é conhecido por ser um ácido forte que não influencia na porção proteica da estrutura.41
Figura 13 – Deconvolução das bandas de amida I para (a) GOx-H2SO4, (b) GOx-HCl and (c) GOx-
HNO3, obtidas utilizando a espectroscopia de FTIR; (d) Gráfico comparativo dos diferentes
componentes da estrutura secundária da GOx após a reação com os diferentes ácidos de Brønsted.
1700 1650 1600
Número de onda / cm-1
GOx-H2SO4(a)
1700 1650 1600
Número de onda / cm-1
GOx-HCl(b)
1700 1650 1600
Número de onda / cm-1
GOx-HNO3
(c)
0
10
20
30
40
50
60
70
randômicavoltas--hélice
Po
rcen
tag
em
(%
)
folha
GOx
GOx-TFMS
GOx-H2SO
4
GOx-HCl
GOx-HNO3
(d)
47
Uma vez que nosso interesse é estudar a modificação da estrutura da proteína visando
melhorar a comunicação entre ela e a superfície do eletrodo, experimentos eletroquímicos
foram realizados para analisar a TDE após a oligomerização mesmo depois de terem ocorrido
alterações na estrutura secundária. A figura 14 mostra os voltamogramas cíclicos dos
bioeletrodos FFC-GOx (linha vermelha), FFC-GOx-TFMS (linha azul), FFC-GOx-HCl (linha
roxa), FFC-GOx-H2SO4 (linha laranja) e FFC-GOx-HNO3 (linha verde). Nota-se após a
subtração das correntes capacitivas que todos os oligômeros formados apresentam aumento na
corrente faradaica relativa a eletrooxidação do FAD-FADH2 quando comparado com a GOx
nativa. A maior densidade de corrente para a TDE foi obtida quando utilizado o bioeletrodo
contendo a GOx após a reação com HNO3, a qual contém a maior porcentagem de folhas-β em
sua estrutura. Essa diferença na densidade de corrente pode ser explicada pelas modificações
da estrutura secundária, uma vez que o centro ativo da enzima pode ter ficado mais exposto, de
forma que a distância entre ele e a superfície do eletrodo seja menor. Como observado na figura
14c, a qual mostra a densidade de corrente de pico catódico (em módulo) em função da
porcentagem de folhas-β presente na estrutura das enzimas, quanto maior essa quantidade,
maior a densidade de corrente. Sendo que o aumento na quantidade de folhas-β está relacionado
à exposição das cadeias hidrofóbicas42 e é sabido que quanto mais hidrofóbica for a enzima,
melhor será a interação com superfícies de carbono.
Figura 14 – (a) Voltamograma cíclicos dos bioeletrodos FFC-GOx (linha vermelha), FFC-GOx-TFMS
(linha azul), FFC-GOx-HCl (linha roxa), FFC-GOx-H2SO4 (linha laranja) e FFC-GOx-HNO3 (linha
verde); (b) voltamogramas cíclicos após a subtração da corrente capacitiva. Velocidade de varredura:
100 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1, pH 7,5). Temperatura: 25 ºC.
Atmosfera saturada com argônio; (c) Módulo da densidade de corrente de pico catódico, após a
subtração da corrente capacitiva, em função da quantidade de folhas-β presente na estrutura proteica.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(a)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-0,08
-0,04
0,00
0,04
0,08
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
GOx
GOx-TFMS
GOx-HCl
GOx-H2SO
4
GOx-HNO3
(b)
20 30 40 50 600,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
| j c|
/ m
A c
m-2
% de folhas-
GOx-HNO3
GOx-H2SO
4
GOx-TFMS
GOx-HCl
GOx nativa
(c)
48
Para todos os bioeletrodos foi observado um aumento linear da densidade de corrente
com o aumento da velocidade de varredura, como mostrado na figura 15, sendo esse
comportamento indicativo de um processo eletroquímico governado pela transferência de carga
na interface enzima/eletrodo, o que permite inferir que o FAD continua ligado à estrutura
proteica.
Figura 15 – (a, d e g) Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos FFC-GOx-HCl, FFC-GOx-H2SO4 e
FFC-GOx-HNO3, respectivamente, em diferentes velocidades de varredura. Eletrólito suporte: tampão
fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC; (b, e e h) Dependência das densidades de
corrente de pico anódico (jpa) e catódico (jpc) com a velocidade de varredura; (c, f e i) Voltamogramas
cíclicos referentes à a, d e g, respectivamente, após a subtração das correntes capacitivas.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3-4,65
-3,10
-1,55
0,00
1,55
3,10
4,65
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
GOx-H2SO
4
(d)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-2,85
-1,90
-0,95
0,00
0,95
1,90
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
GOx-HCl
(a)
0 200 400 600
-2,7
-1,8
-0,9
0,0
0,9
1,8
2,7
jpc
j p /
mA
cm
-2
v / mV s-1
jpa
(b)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-0,24
-0,12
0,00
0,12
0,24
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
50 mV s-1
200 mV s-1
400 mV s-1
(c)
0 300 600 900-4,5
-3,0
-1,5
0,0
1,5
3,0
4,5
jpc
j p /
mA
cm
-2
v / mV s-1
jpa
(e)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-0,42
-0,21
0,00
0,21
0,42
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
50 mV s-1
350 mV s-1
650 mV s-1
1000 mV s-1
(f)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3-5,70
-3,80
-1,90
0,00
1,90
3,80
5,70
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
GOx-HNO3
(g)
0 300 600 900-4,5
-3,0
-1,5
0,0
1,5
3,0
4,5
jpc
j p /
mA
cm
-2
v / mV s-1
jpa
(h)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-0,52
-0,26
0,00
0,26
0,52
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
50 mV s-1
350 mV s-1
650 mV s-1
1000 mV s-1
(i)
49
Assim, mesmo sabendo das limitações impostas quando utilizadas a metodologia de
Laviron, determinaram-se os valores de α e k0 para cada um dos bioeletrodos, a partir dos
gráficos mostrados no apêndice A. A tabela 1 mostra esses valores tanto para a GOx, quanto
para os oligômeros produzidos. Nota-se que há uma variação considerável para os valores de α
obtidos para cada enzima, lembrando que esse parâmetro está relacionado a simetria da barreira
de energia da reação redox. A enzima que mais se aproximou de α = 0,50 foi a Ol-GOx obtida
utilizando o TFMS, por outro lado, aquela com maior valor de k0 foi a obtida após a reação com
o HNO3.
Tabela 1 - Parâmetros α e k0 obtidos por Laviron para a GOx nativa e para a GOx após a reação com os
diferentes ácidos de Brønsted.
α k0
GOx 0,48 5,8 s-1
GOx-TFMS 0,51 7,9 s-1
GOx-HCl 0,56 6,2 s-1
GOx-H2SO4 0,57 6,7 s-1
GOx-HNO3 0,42 11,4 s-1
Uma vez obtida a TDE para todos os oligômeros, a atividade enzimática de cada uma
foi analisada, já que é de interesse obter maiores densidades de corrente tanto para a TDE,
quanto para a bioeletrocatálise. Assim, primeiramente realizaram-se os testes catalíticos, onde
foi observada uma redução significativa da atividade após a reação de oligomerização da GOx
nativa utilizando HCl (85%), H2SO4 (85%) e HNO3 (94%), como mostrado na figura 11b, ou
seja, as enzimas foram praticamente inativadas após a aglomeração, o que era esperado devido
as alterações na estrutura secundária. Assim, como a catálise enzimática foi afetada e os
oligômeros podem ser considerados inativos, os testes bioeletrocatalíticos não foram efetuados.
Portanto, de acordo com os resultados apresentados, conclui-se que os diferentes ácidos
de Brønsted utilizados promoveram a oligomerização da GOx, no entanto, foram obtidas
enzimas estruturalmente diferentes. A Ol-GOx obtida pela reação com o TFMS mantém
parcialmente sua atividade catalítica, enquanto que as demais, devido a alteração em suas
estruturas secundárias apresentaram maiores correntes para a TDE, no entanto, perderam sua
atividade catalítica.
50
4.2 Caracterização da GOx nativa e da Ol-GOx
De acordo com os resultados apresentados no tópico 4.1, a reação da proteína com o
TFMS foi considerada eficiente para a síntese da Ol-GOx. Nesse caso, a proteína não é
desnaturada, o que resulta em uma unidade monomérica intacta, como observado nos
experimentos de eletroforese SDS-PAGE (figura 16), onde não há alteração na massa molecular
do monômero da enzima após a reação com o TFMS. Ressalta-se que a eletroforese SDS-PAGE
é comumente utilizada para estimar o tamanho e a pureza de proteínas, quantificar e monitorar
a integridade das mesmas, além de comparar a composição polipeptídica em diferentes
amostras.80 Além disso, a Ol-GOx, como será chamada a partir desse ponto a enzima obtida a
partir da reação com o TFMS, manteve suas propriedades catalíticas relativas a oxidação da
glicose.
Figura 16 – Eletroforese SDS-PAGE utilizando a coloração com o azul de Coomassie do (i) padrão de
massas moleculares (250 a 60 kDa), (ii) GOx e (iii) Ol-GOx.
A espectrometria de massas utilizando a técnica MALDI-TOF foi utilizada visando
determinar a massa molecular tanto da GOx nativa, quanto da Ol-GOx. Para tanto, ambos os
espectros deveriam ser obtidos na matriz de ácido sinapínico (SA), a qual é usada para análise
de proteínas e peptídeos de alta massa molecular. A figura 17 refere-se ao espectro de massas
da GOx nativa, onde são observados dois picos, os quais são relativos a essa enzima com m/z
= +1 (figura 17 – pico II) e m/z = +2 ( figura 17 – pico I), sendo este em aproximadamente 73
kDa, valor próximo ao descrito na literatura para a GOx.40 Propõe-se que quando submetida a
análise, a GOx é decomposta de sua forma dimérica, apresentando-se na forma de monômero,
o que justifica o valor encontrado. No entanto, para a Ol-GOx não foi possível obter o espectro
(i) (ii) (iii)
51
de massas utilizando a mesma matriz, uma vez que a amostra não ionizou nessas condições.
Uma das razões para que essa ionização não tenha ocorrido é o tamanho da Ol-GOx, o que
permite inferir que uma enzima de grande massa molecular foi obtida após a reação com o
TFMS.
Figura 17 – MALDI-TOF de uma solução de GOx em matriz ácido sinapínico.
A figura 18 mostra os espectros de UV-Vis para a GOx e Ol-GOx e ainda a imagem de
ambas as soluções, onde pode ser observado um aumento na turbidez para a solução da Ol-
GOx, sugerindo a oligomerização da enzima após a reação com o TFMS, a qual é atribuída à
drástica diminuição no pH (pH 1,0) durante o processo de incubação, causando a aglomeração
da enzima. Nota-se que a reação de oligomerização não afeta o grupo prostético FAD e que a
absortividade molar (ε) se mantém, como será mostrado.
Figura 18 – (a) Espectros eletrônicos das soluções de GOx (3,0 mg mL-1; linha vermelha) e Ol-GOx
(3,0 mg mL-1; linha azul); (b) Imagens das soluções de (i) GOx e (ii) Ol-GOx.
73638.9
37334.9
0
100
200
300
400
500
Inte
ns. [a
.u.]
20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000m/z
300 400 500 600
0
1
2
3
to
tal =
ab
s +
esp
Comprimento de onda (nm)
(a) (b)
(i) (ii)
I II
52
Os espectros de UV-Vis mostram três bandas de absorbância em 276, 382 e 453 nm
(figura 18a, linha vermelha), em que a banda de mais alta intensidade está relacionada a
presença das cadeias de aminoácidos aromáticos97; 98 e ao grupamento riboflavina presente no
grupo prostético,96 enquanto as outras duas bandas estão relacionadas aos grupamentos
semiquinonas em estado oxidado presentes no FAD.96 Para a Ol-GOx (figura 18a, linha azul),
observa-se a presença da mesma banda em 276 nm em relação ao que é observado para a GOx
nativa, o que permite inferir que o grupo prostético FAD continua ligado após a oligomerização
proteica. Além disso, os grupamentos semiquinonas mostram uma absorbância mais discreta
para a Ol-GOx devido ao aumento da linha de base, uma consequência do espalhamento de luz
causado pelo aumento da turbidez, como observado na figura 18b, onde a solução de 3,0 mg
mL-1 de Ol-GOx tem uma aparência mais opaca, “leitosa”, do que a GOx nativa.
É necessário considerar que a turbidez não pode ser usada como um parâmetro
quantitativo para monitorar a formação da Ol-GOx, uma vez que ela não permite identificar o
número absoluto de monômeros no mesmo oligômero. É importante lembrar que isso se deve
ao fato do espalhamento de luz depender tanto do tamanho, quanto do número de partículas.99
Por outro lado, esses dados podem fornecer um meio de confirmar o que é observado
visualmente: as soluções mais turvas aos olhos apresentam maior absorbância em 350 nm. De
fato, há uma diferença na transmitância dessas duas enzimas em 350 nm, uma vez que para a
GOx nativa esse valor corresponde a 80%, enquanto que para a Ol-GOx corresponde a 59%,
evidenciando o aumento na turbidez após a oligomerização. Esse aumento é associado à
formação dos oligômeros e está relacionado as alterações na hidrofobicidade da proteína, sendo
que as interações hidrofóbicas são importantes quando são tratadas interfaces homo-
oligoméricas, uma vez que a organização das moléculas de água ao redor dessas estruturas é
afetada.
A alteração na hidrofobicidade das enzimas pode ser observada na figura 19, que
corresponde a imagem de microscopia óptica da GOx (figura 19a e 19c) e da Ol-GOx (figura
19b e 19d) depositadas em um substrato hidrofóbico. Nesse caso, 1 μL de uma solução de cada
enzima (3,0 mg mL-1) foi gotejado em um substrato de fluoreto de cálcio e a amostra foi seca
em temperatura ambiente por 12 horas. A janela de fluoreto de cálcio foi escolhida como
substrato devido a seu caráter apolar, permitindo diferenciar o comportamento da GOx e da Ol-
GOx quando interagindo com um substrato desse tipo, evidenciando a diferença na
hidrofobicidade de cada enzima. Além disso, por ser transparente na região do infravermelho,
a utilização desse substrato permite também a análise de FTIR dessas enzimas, visando a
construção de um mapa químico em função da banda de amida I. Como esperado, a interação
53
da GOx e da Ol-GOx com o substrato foi diferente, uma vez que a primeira se concentrou nas
bordas da gota, enquanto que a segunda se espalhou por toda a superfície do substrato. Isso se
deve ao fato da Ol-GOx ser mais hidrofóbica, uma vez que para a estabilização de sua estrutura
após a agregação proteica, sítios desse tipo são expostos ao longo da enzima.
Figura 19 – Imagens de microscopia óptica para a (a e c) GOx e (b e d) Ol-GOx; c e d correspondem a
região ampliada em relação as regiões marcadas em (a) e (b), respectivamente.
Em relação a absortividade molar, obtiveram-se os valores de ε para a GOx e para a Ol-
GOx. Utilizando as enzimas liofilizadas, prepararam-se soluções no intervalo de 0,05 a 1,0 mg
mL-1 para a construção da curva de calibração, a qual foi obtida em 276 nm para ambas as
enzimas (figura 20). No caso da Ol-GOx, uma segunda metodologia foi utilizada e o valor
obtido comparado com os demais, sendo a turbidez levada em consideração nesse segundo
método. Para isso, os espectros foram normalizados a fim de subtrair a luz espalhada,
garantindo que a absorbância em 276 nm correspondesse apenas a contribuição da luz
absorvida. Utilizando a Lei de Lamber-Beer100, ε pode ser obtido pela inclinação da curva de
(a) (b)
(c) (d)
54
calibração. A figura 20 mostra as curvas de calibração obtidas tanto para a GOx nativa (figura
20a), quanto para a Ol-GOx, considerando a turbidez (figura 20b) e após seu desconto (figura
20c). Para a GOx, 𝜀 = 1,30 ± 0,03g−1Lcm−1, enquanto para Ol-GOx, 𝜀 = 1,32 ±
0,04g−1Lcm−1. Utilizando a metodologia que considera a turbidez da Ol-GOx, obteve-se 𝜀 =
1,21 ± 0,03g−1Lcm−1, ou seja, os valores obtidos para ambas as enzimas podem ser
considerados os mesmos. Além disso, esses resultados estão em concordância com o descrito
na literatura para a GOx proveniente da espécie Aspergillus niger.101
Figura 20 – Absorbância em 276 nm versus a concentração de enzima para (a) GOx, (b) Ol-GOx e (c)
Ol-GOx após a subtração da radiação espalhada.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ab
sorb
ân
cia
em
27
6 n
m
CGOx
/ g L-1
y = 1,299x - 0,004
r2 = 0,998
(a)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
Ab
sorb
ânci
a em
27
6 n
m
COl-GOx
/ g L-1
y = 1,318x + 0,018
r2 = 0,995
(b)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ab
sorb
ân
cia
em
27
6 n
m
COl-GOx
/ g L-1
y = 1,213x +0,022
r2 = 0,996
(c)
Os experimentos de DLS foram utilizados a fim de confirmar as alterações no tamanho
da GOx após a reação com o TFMS (figura 21a). Nesse caso, as medidas de DLS foram
55
realizadas em pH 7,5 e a 25 ºC e mostraram um raio hidrodinâmico (hd) igual a 9 ± 1 nm para
a GOx nativa, valor este de acordo com a literatura,40 e 96 ± 15 nm para a Ol-GOx. Esse
aumento de 10 vezes no raio hidrodinâmico da enzima sugere que a Ol-GOx é composta em
média por 10 moléculas diméricas de GOx nativa, dados esses que foram confirmados pelas
imagens de microscopia eletrônica de transmissão (figuras 21b e 21c), as quais mostram os
diferentes tamanhos para a GOx e Ol-GOx.
Figura 21 – (a) Distribuição de tamanhos obtido pela medida de DLS para a GOx (linha vermelha) e
Ol-GOx (linha azul); Imagens de microscopia eletrônica de transmissão para a (b) GOx e (c) Ol-GOx.
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 100 200 300
dh (nm)
Inte
nsi
dad
e (
%)
Ol-GOx
GOx
(a)
Uma vez que o dicroísmo circular (CD) fornece informações sobre a estrutura
secundária das proteínas levando em consideração as ligações peptídicas como cromóforos, a
figura 22 mostra os espectros de CD para ambas as enzimas, onde é possível observar uma
banda em 220 nm, a qual é característica de estruturas α-hélice.102 Pela deconvolução do
espectro utilizando o software CDNN, esses resultados sugerem que não há alterações
significativas na estrutura secundária da proteína após a oligomerização, como mostrado na
(b) (c)
56
tabela 2, a qual evidencia as porcentagens de cada tipo de estrutura secundária para a GOx e a
Ol-GOx.
Figura 22 – Espectros de dicroísmo circular de uma solução de GOx (linha vermelha) e Ol-GOx (linha
azul), ambas preparadas em tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5).
220 240 260
-6
-4
-2
0
[]
/ deg c
m-2
dm
ol-1
x 1
03
Comprimento de onda / nm
GOx
Ol-GOx
Tabela 2 – Deconvolução dos dados do espectro de CD para a GOx e Ol-GOx.
GOx Ol-GOx
folhas-𝛃 31±1 % 30±1 %
𝛂-hélice 16±2 % 17±1 %
voltas-𝛃 21±1% 21±1%
randômica 48±2 % 48±2 %
Além da determinação da estrutura secundária, o CD pode ser utilizado para o estudo
do desenovelamento e da desnaturação proteica, uma vez que essa técnica permite o
acompanhamento dos efeitos causados por mutações no enovelamento e na estabilidade das
proteínas.103 Esse estudo é possível devido as alterações na elipticidade serem diretamente
proporcionais a alteração das formas nativas e desnaturada. Além disso, os parâmetros obtidos
nesse tipo de experimento permitem a comparação da estabilidade tanto para diferentes
proteínas ou mutantes de uma mesma proteína, quanto para uma única proteína em relação ao
efeito das modificações no ambiente no qual ela está inserida.104
Dessa forma, o CD também pode ser usado para estimar a temperatura de desnaturação
(TM) ou ainda se ocorre alteração na taxa das transições quando os oligômeros estão presentes.
A termodinâmica do desenovelamento baseado nas curvas de elipticidade em função da
57
temperatura, no intervalo de 20 a 90 ºC, mostra uma diminuição na elipticidade molar quando
a temperatura aumenta, como pode ser observado na figura 23, fato este que é devido a
desnaturação térmica da proteína.105; 106 A figura 23a mostra a comparação dos espectros de CD
para a GOx nativa a 25 ºC e a 90 ºC, onde é possível observar uma diminuição da elipticidade
molar após o aumento da temperatura e também um deslocamento de 8 nm da banda centrada
em 220 nm. Já a figura 23b corresponde a mesma comparação citada anteriormente, porém,
para a Ol-GOx. Nesse caso também foi observado a diminuição da elipticidade molar após o
aumento da temperatura, no entanto, o deslocamento da banda centrada em 220 nm foi de
apenas 3 nm, sendo que este deslocamento menor do que para a GOx nativa pode ser atribuído
a associação proteína-proteína que ocorre durante a oligomerização. Analisando a figura 23c, é
possível concluir que a TM para a GOx corresponde a 65 ºC e é maior do que a obtida para a
Ol-GOx, que é 59 ºC. Ressalta-se que o perfil obtido para ambas as enzimas está de acordo com
o que é proposto na literatura, onde primeiramente tem-se uma pequena variação na elipticidade
molar, até o momento no qual é atingido a temperatura de desnaturação, onde é observada uma
diminuição significativa desse parâmetro.
Figura 23 – Espectros de dicroísmo circular a 25 ºC e a 90 ºC de uma solução de (a) GOx e (b) Ol-GOx,
ambas preparadas em tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5); (c) Estabilidade térmica da GOx
(linha vermelha) e da Ol-GOx (linha azul) com [θ] em 222 nm.
220 240 260
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
[]
/ d
eg
cm
-2 d
mo
l-1 x
10
3
25 ºC
90 ºC
(a) GOx
Comprimento de onda / nm
220 240 260-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1 (b)
[]
/ d
eg
cm
-2 d
mo
l-1 x
10
3
Comprimento de onda / nm
25 ºC
90 ºC
Ol-GOx
0 25 50 75 100-6,0
-5,5
-5,0
-4,5
-4,0
-3,5
(c)
GOx
Ol-GOx
(deg
cm
-2 d
mo
l-1 x
10
3)
em
22
2 n
m
Temperatura / ºC
Além do dicroísmo circular, a espectroscopia de infravermelho com transformada de
Fourier (FTIR) foi utilizada para examinar as possíveis alterações que ocorreram na estrutura
da proteína após a oligomerização. A figura 24a mostra os espectros de FTIR para a GOx (linha
vermelha) e a Ol-GOx (linha azul), sendo possível observar que ambas apresentaram bandas
nos mesmos números de onda, embora quando analisadas as bandas relativas a amida I (figuras
24b e 24c), nota-se uma diferença em relação as duas amostras.
58
Figura 24 – (a) Espectros de FTIR da GOx (linha vermelha) e da Ol-GOx (linha azul); (b e c)
Deconvolução das bandas de amida I para a GOx e Ol-GOx, respectivamente, obtidas por FTIR.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Ol-GOx
Número de onda (cm-1)
GOx
3293
2919
1657
1536
12471106
(a)
1700 1650 1600
Número de onda (cm-1
)
GOx(b)
1700 1650 1600
Ol-GOx
Número de onda (cm-1
)
(c)
Sabe-se que o espectro de infravermelho de grupos peptídicos, ou seja, a unidade de
repetição das proteínas, é bem estabelecido na literatura na região de 4000-600 cm-1,
apresentando bandas características chamadas de amida A (~3300 cm-1), amida B (~3100 cm-
1), amida I (1600-1690 cm-1), amida II (1480-1575 cm-1), amida III (~1300 cm-1), amida IV
(625-700 cm-1) e amida V (640-800 cm-1).107; 108; 109 A banda de amida A aparece devido a
vibração de estiramento da ligação N-H e esse modo de vibração não depende da conformação
proteica. A banda de amida I é a de maior intensidade para as proteínas, sendo resultante de
vibrações e estiramentos C=O do grupo amida acoplado com o estiramento da ligação C-N.
Esses modos vibracionais são sensíveis a ligações de hidrogênio e ao acoplamento entre dipolos
de transição das ligações peptídicas adjacentes, consequentemente, são sensíveis à estrutura
secundária. A banda amida II envolve tanto o dobramento N-H, quanto o estiramento C-N,109;
110 já a banda amida III depende de detalhes do campo de força, da natureza das cadeias laterais
59
e das ligações de hidrogênio. As bandas de amida IV e V são, respectivamente, devidas ao
dobramento OCN e ao dobramento fora do plano do NH.111
Assim, pelos espectros contidos na figura 24a, as seguintes atribuições foram realizadas:
as bandas em aproximadamente 1657, 1536 e 3293 cm-1 correspondem as bandas de amida I,
amida II e estriramento –NH, respectivamente, sendo a banda de amida I utilizada para o
monitoramento conformacional de alterações em proteínas.107; 112 O pico presente em 2919 cm-
1 é atribuído ao alongamento e estiramento das ligações –CH na estrutura proteica e os picos
em 1247 e 1106 cm-1 são atribuídos a amida III e a ligações –CN, respectivamente. As bandas
em aproximadamente 600 e 800 cm-1 se referem as bandas de amida IV e V.107; 108
Apesar das mesmas bandas estarem presentes nos espectros de FTIR de ambas as
enzimas, quando analisada a região de amida I (1700-1600 cm-1), evidenciadas na figura 24b e
22c,77; 78; 113 nota-se uma diferença na estrutura secundária das mesmas. A linha vermelha na
figura 24b e a azul na figura 24c mostram as bandas de amida I para a GOx e Ol-GOx,
respectivamente, enquanto que as curvas Gaussianas contidas dentro de cada uma representam
a porção relativa a cada tipo de estrutura secundária presente e as linhas pontilhadas em preto
correspondem as curvas obtidas após o somatório dessas Gaussianas mostrando que não há
disparidade entre o que foi obtido de forma experimental e o somatório das curvas utilizadas
para o cálculo da quantidade dos diferentes tipos de estrutura secundária. A princípio esses
resultados diferem dos obtidos por dicroísmo circular, onde não foram observadas alterações
na estrutura secundária. No entanto, isso pode ser explicado pelo fato do FTIR ser uma técnica
mais precisa quando aglomerados estão presentes, uma vez que diferentemente do CD, ela não
é influenciada pela presença de aglomerados.114
Quando acoplada à microscopia, a espectroscopia vibracional de FTIR permite a
construção de mapas químicos com base na região da amida I, mostrando a distribuição dessas
enzimas quando depositadas em um substrato de fluoreto de cálcio, como pode ser observado
na figura 25, em que (a) corresponde ao mapa químico obtido para a GOx nativa e (b) àquele
obtido para a Ol-GOx.
A maioria dos métodos utilizados para a determinação da estrutura secundária por FTIR
se concentram na análise da banda de amida I, a qual está localizada entre 1700 e 1600 cm-1 e
é composta principalmente (~80%) pela vibração C=O da ligação peptídica, sendo que uma
maneira de analisar essa banda é pela decomposição da mesma em seus constituintes (α-hélice,
folhas-β, etc), os quais estão relacionados com as características estruturais da proteína.78
Assim, a tabela 3 contém as porcentagens de cada tipo de estrutura secundária determinadas
por FTIR.
60
Figura 25 – Mapas químicos obtidos com base no sinal obtido por FTIR relativo a banda de amida I;
(a) GOx e (b) Ol-GOx.
Tabela 3 - Porcentagem dos diferentes tipos de estrutura secundária obtidas pela deconvolução da banda
amida I obtida no FTIR.
GOx Ol-GOx
folhas-𝛃 26,5% 29,6%
𝛂-hélice 43,3% 43,4%
voltas-𝛃 20,4% 14,3%
randômica 9,8% 12,7%
Analisando a tabela 3 são observadas pequenas diferenças na porcentagem dos
conteúdos de folhas-β e voltas-β para a Ol-GOx, em relação a GOx nativa (3% e 7%,
respectivamente), o que sugere uma pequena alteração na estrutura secundária após a
oligomerização. Esse aumento nas folhas-β é esperado, uma vez que esse tipo de estrutura é
costuma estar presente em agregados proteicos.115
Assim, diante dos resultados apresentados, conclui-se que após a reação com o TFMS,
é formada a Ol-GOx: um oligômero composto por 10 unidades de GOx nativa, sem alterações
em sua estrutura monomérica e com pequenas alterações na estrutura secundária. No entanto, é
de interesse estudar tanto a cinética enzimática da Ol-GOx, embora resultados prévios (figura
11b) tenham mostrado a manutenção de 59% da atividade enzimática, quanto a TDE e a
bioeletrocatálise do bioeletrodo contendo Ol-GOx.
(a) (b)
61
4.3 Cinética enzimática
A cinética enzimática da GOx e da Ol-GOx foi analisada utilizando a espectroscopia
eletrônica. Nesse caso, a determinação é realizada de forma indireta. Para isso, a absorbância
do ABTS+ foi determinada após a reação com o peróxido de hidrogênio, o qual é formado após
a oxidação da glicose na reação catalisada pela GOx, de acordo com as equações 5 e 6.
β-D-glicose + O2 → D-glucono-1,5-lactona + H2O2 (5)
ABTS + H2O2 ⇌ ABTS+ + H2O (6)
O ABTS+ absorve em 420 nm, o que permitiu determinar a quantidade de produto
formado utilizando a Lei de Lambert-Beer.100
Para a determinação da cinética enzimática, utilizaram-se diferentes concentrações de
glicose (substrato). A figura 26 mostra o gráfico da concentração de glicose versus a formação
de peróxido de hidrogênio, também conhecido como curva de Michaelis-Menten para a GOx
(figura 26a) e para a Ol-GOx (figura 26b) e ainda o duplo-recíproco desses gráficos
(Lineweaver-Burk) (figuras 26c e 26d). Como descrito na equação 5, a glicose é oxidada a
gluconolactona e a enzima é regenerada pela transferência de dois elétrons e dois prótons para
o O2 formando o peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 é reduzido de forma catalítica pela
enzima HRP, enquanto o ABTS é oxidado a ABTS+ (equação 6), o qual apresenta um máximo
de absorbância em 420 nm. Assim, as reações da GOx e da Ol-GOx foram monitoradas
medindo-se a absorbância no comprimento de onda citado. As reações se procederam a uma
temperatura controlada em 30 ºC e mediu-se a absorbância após 30 minutos de reação, a qual
foi interrompida pela adição de 0,10 mL de HCl 4,0 mol L-1.
Para a GOx, obteve-se um valor de kcat igual 135 s-1, valor este que está de acordo com
a literatura,116; 117 lembrando que esse valor pode diferir bastante dependendo das condições
utilizadas no estudo cinético, uma vez que parâmetros como o pH e a temperatura do meio
podem alterar os valores obtidos nesse tipo de experimento.118 Uma vez confirmado que a Ol-
GOx continua ativa, ela foi imobilizada em eletrodos de FFC a fim de estudar tanto TDE, quanto
a bioeletrocatálise, como será descrito nos tópicos a seguir.
62
Figura 26 – Gráfico da concentração de glicose versus a formação de H2O2 e curva de Michaelis-Menten
para a catálise da glicose pela (a) GOx e (b) Ol-GOx; (c) Gráfico de Lineweaver-Burk para a GOx (linha
vermelha) e Ol-GOx (linha azul); (d) Região ampliada de (c).
0 5 10 15 20 25
0,000
0,008
0,016
0,024
0,032
v(f
orm
ação d
e H
2O
2)
(m
ol
L-1
s-1)
Cglicose
(mmol L-1
)
(a)
0 200 400 600 800 1000
0,000
0,003
0,006
0,009
0,012
v(f
orm
ação d
e H
2O
2)
(m
ol
L-1
s-1)
Cglicose
(mmol L-1
)
(b)
0 2000 4000
0
1
2
3
(c)
1/v
(
mo
l-1L
s)
1/CGlicose
(mM-1)
Ol-GOx
GOx
-100 0 100 200 300
0,0
0,1
0,2
GOx
Ol-GOx
1/v
(
mo
l-1L
s)
1/CGlicose
(mM-1)
(d)
4.4 Eletroquímica da GOx nativa e da Ol-GOx
4.4.1 Caracterização dos eletrodos de fibras flexíveis de carbono
Esse trabalho propõe que a Ol-GOx pode ser usada como um potencial biocatalisador
ao invés de sua forma nativa (GOx dimérica), uma vez que a hidrofobicidade e o tamanho da
Ol-GOx conferem a ela propriedades de superfície ideais para a imobilização em superfícies de
carbono. As FFC têm sido utilizadas para a produção de bioeletrodos para estudos fundamentais
e desenvolvimento de biosensores.71; 119; 120 Nesse caso, é utilizada a adsorção física das enzimas
63
na superfície do eletrodo, sendo conhecido que superfícies sólidas interagem com as proteínas
preferencialmente por forças de van der Waals. Assim, a eletroquímica direta da GOx e da Ol-
GOx pode ser avaliada utilizando a enzima adsorvida fisicamente na superfície dos eletrodos
de FFC. A figura 27 mostra as imagens da microscopia eletrônica de varredura das FFC, sendo
que a figura 27a corresponde a imagem antes do tratamento com ácido sulfúrico e permanganato
de potássio, a figura 27b corresponde a imagem das FFC após esse tratamento químico e as
figuras 27c e 27d correspondem as imagens, em diferentes magnitudes, das FFC após a
adsorção física da GOx.
Figura 27 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura das FFC (a) antes e (b) após o tratamento
com KMnO4 e H2SO4; (c e d) FFC após o tratamento químico e a adsorção de GOx (5 mg mL-1) durante
36 horas.
Embora as figuras 27a e 27b não evidenciem grandes diferenças na morfologia das FFC
antes e após o tratamento, uma vez que a técnica não é sensível o suficiente para essa
observação, sabe-se que este tratamento promove a esfoliação das FFC, como demonstrado por
nosso grupo.37 Já as figuras 27c e 27d possibilitam confirmar que após 36 horas de contato das
FFC com a solução de GOx, a enzima foi adsorvida. A partir desse momento, a seguinte
nomenclatura será adotada para os eletrodos modificados com a enzima nativa e a
oligomerizada: FFC-GOx e FFC-Ol-GOx, respectivamente.
2 µm
(a)
2 µm
(b)
2 µm
(c)
1 µm
(d)
64
Antes dos experimentos eletroquímicos, determinou-se a quantidade de enzima
adsorvida no eletrodo utilizando-se o seguinte procedimento: uma solução de cada enzima foi
separada em sete amostras, onde a primeira corresponde a amostra controle e as demais
correspondem às soluções nas quais as FFC foram colocadas para a adsorção da enzima. Mediu-
se a absorbância em 276 nm para cada solução antes e após a adsorção das enzimas. Assim,
utilizando a diferença entre a absorbância antes e após as 36 horas de adsorção da enzima na
superfície dos eletrodos, foi possível calcular a quantidade de enzima adsorvida em cada
eletrodo. Portanto, para a GOx nativa, essa quantidade corresponde a 0,21 ± 0,05 mg cm-2 e
para a Ol-GOx corresponde a 0,22 ± 0,07 mg cm-2. Uma vez demonstrado que a quantidade de
enzima adsorvida no eletrodo é a mesma para ambas as espécies, prosseguiu-se com o estudo
da TDE.
4.4.2 Transferência direta de elétrons e cinética de transferência de elétrons
As figuras 28a e 28b mostram os voltamogramas cíclicos obtidos referentes a TDE que
ocorre do FAD presente na enzima para a superfície do eletrodo, sendo que em (b) são
apresentados os voltamogramas cíclicos após a subtração das correntes capacitivas. O potencial
formal obtido para a Ol-GOx é -0,47 V em pH 7,5 e está de acordo com o valor teórico esperado
para o FAD dentro da proteína.121 O voltamograma cíclico mostra uma separação do potencial
de pico (∆E) de 30 mV, o que indica um processo reversível com rápida troca de carga.122
Figura 28 – Voltamogramas cíclicos (a) dos bioeletrodos FFC-GOx (linha vermelha) e FFC-Ol-GOx
(linha azul). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol
L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera de argônio; (b) após a subtração das correntes capacitivas.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3-0,40
-0,20
0,00
0,20
0,40
j /
mA
cm
-2
E / V (Ag/AgClsat
)
(a)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3-0,09
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
0,09
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
GOx
Ol-GOx
(b)
65
Observa-se, ainda, que as moléculas de Ol-GOx estão adsorvidas à superfície do
eletrodo, sendo obtidos mais de 40 voltamogramas cíclicos consecutivos sem ocorrer
significativa diminuição nas correntes faradaicas como mostrado na figura 29.
Figura 29 – Estabilidade eletroquímica do bioeletrodo de FFC-Ol-GOx com 40 ciclos consecutivos.
Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5).
Temperatura: 25 ºC. Atmosfera de argônio
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-0,18
-0,12
-0,06
0,00
0,06
0,12
0,18
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
A reação eletroquímica envolve dois elétrons para a eletrooxidação do FADH2 a FAD,
como mostrado na equação 7. Para ambos os bioeletrodos, observa-se um aumento linear da
densidade de corrente dos picos anódico (jpa) e catódico (jpc) com o aumento da velocidade de
varredura para o intervalo de 0,05 a 1,0 V s-1, como mostrado na figura 30, sendo que (a) e (b)
correspondem aos voltamogramas cíclicos variando-se a velocidade de varredura para os
bioeletrodos FFC-GOx e FFC-Ol-GOx, respectivamente e (c) e (d) mostram a dependência das
densidades máximas de corrente de pico anódico e catódico em função da velocidade de
varredura para os mesmos bioeletrodos. Este comportamento indica que o processo
eletroquímico é governado por transferência de carga na interface enzima/eletrodo e que elas
estão de fato adsorvidas na superfície das FFC. Para os bioeletrodos aqui utilizados, a enzima
está adsorvida no eletrodo e nesse tópico estudamos apenas a etapa não-catalítica da reação, ou
seja, não há transporte de massa, uma vez que não existem espécies presentes na solução que
devem chegar a superfície do eletrodo. Assim, era esperado o resultado obtido, ou seja, uma
reação governada por transferência de carga.
FAD + 2e− + 2H+ ⇌ FADH2 (7)
66
Figura 30 – Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos de (a) FFC -GOx e (b) FFC-Ol-GOx em
diferentes velocidades de varredura. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5).
Temperatura: 25 ºC. Velocidade de varredura de 0,05 a 1,0 V s-1. Dependência das densidades máximas
de corrente de pico anódico (jpa) e catódico (jpc) em função da velocidade de varredura para o bioeletrodo
(c) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-GOx.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,50
-0,75
0,00
0,75
1,50 (a)
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,00
-1,50
0,00
1,50
3,00 (b)
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
0 200 400 600 800 1000
-1,50
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
1,50(c)
jpc
jpa
j p (
mA
cm
-2)
v (mV s-1)
0 200 400 600 800 1000-4,20
-2,80
-1,40
0,00
1,40
2,80
4,20(d)
jpc
j p (
mA
cm
-2)
v (mV s-1)
jpa
O formalismo de Butler-Volmer tem sido utilizado para descrever a cinética de
transferência de elétrons, no entanto, essa teoria tem como pressuposto que as energias de
ativação para as curvas catódica e anódica são uma função linear do sobrepotencial, não levando
em consideração o efeito da energia de reorganização (λ) nas constantes de velocidade,122; 123
fazendo com que sejam obtidos valores superestimados de kred/oxi. Esses desvios estão presentes
pelo fato dessa teoria considerar as superfícies de reação lineares e não parabólicas. Dessa
forma, a teoria de Marcus é mais adequada para o estudo de reações de transferência de elétrons
67
em proteínas redox adsorvidas, apesar de ter sido desenvolvida para reações de transferência
homogênea de elétrons.124; 125
A teoria de Marcus prevê que a velocidade da transferência de elétrons entre um doador
e um aceptor será dependente da energia livre de Gibbs (∆G), da energia de reorganização (λ),
da temperatura (T) e do acoplamento eletrônico entre o doador de elétrons e o aceptor (HAB).126
A constante de velocidade da transferência eletrônica não-adiabática, ou seja, proveniente de
um acoplamento fraco entre um doador de elétron A e um aceptor de elétron B em solução é
descrita por Marcus pela expressão semi-clássica presente na equação 8.
𝑘𝑟𝑒𝑑/𝑜𝑥𝑖 =4𝜋2𝐻𝐴𝐵
2
ℎ√4𝜋𝜆𝑘𝐵𝑇exp[
−(∆𝐺+𝜆)2
4𝜆𝑘𝐵𝑇] (8)
Em que h é a constante de Planck e kB é a constante de Boltzmann. A energia de
reorganização corresponde a energia necessária para reorientar todos os átomos do estado de
equilíbrio para o estado do produto, sendo dividida em duas partes. A contribuição de esfera
interna considera a energia necessária para alterar as distâncias de ligações, já a contribuição
de esfera externa corresponde a reorientação do solvente necessária devido a alteração da
molécula e de suas cargas.30
Quando a energia de reorganização é próxima em magnitude ao potencial aplicado, uma
região de platô se torna evidente quando o sobrepotencial aumenta, fazendo com que a
constante de velocidade pare de aumentar. As equações propostas nessa teoria preveem que
quando há uma aproximação dos valores de sobrepotencial e da energia de reorganização, as
constantes de velocidade não continuarão aumentando de forma exponencial como proposto
pelas equações de Butler-Volmer, ao contrário, elas terão um valor máximo quando o valor do
sobrepotencial corresponder ao valor da energia de reorganização em módulo.127 Isso ocorre
pois quando o sobrepotencial é muito maior do que a energia de reorganização, a distribuição
total dos sítios ativos sobrepõe os estados no eletrodo que estão disponíveis para a transferência
de elétrons. Assim, aumentar a energia livre, e consequentemente, o sobrepotencial, não irá
aumentar a probabilidade da transferência eletrônica.128
Para a transferência de elétrons entre um eletrodo e uma espécie redox adsorvida,
Chidsey89 derivou uma relação entre as constantes de velocidade e o sobrepotencial pela
integração da equação de Marcus. Essa equação descreve a velocidade de transferência de
elétrons entre um doador e um receptor sob todos os níveis de Fermi do eletrodo, utilizando a
distribuição de Fermi-Dirac para explicar a probabilidade de ocupação de cada nível. Assim, a
68
constante de velocidade máxima (equação 9), kmax, é o k limite quando o sobrepotencial tende
ao infinito.
𝑘𝑚𝑎𝑥 =4𝜋2𝑉0
2
𝑁𝐴ℎ𝑅𝑇exp(−𝛽𝑟) (9)
Em que V0 é o grau de acoplamento eletrônico, r é a distância entre o doador e o receptor
(Å) e β é o coeficiente de decaimento (Å-1). Uma maneira semiempírica utilizada por diferentes
autores129; 130 para estimar a energia de reorganização é analisar a influência da temperatura nas
constantes de velocidade utilizando um gráfico de Arrhenius,131 que é derivado da formulação
de Chidsey89 e baseado no modelo de densidade de estados de Marcus.29; 124 Considerando que
a energia de reorganização é independente da temperatura, ela pode ser determinada a partir da
inclinação do gráfico ln[k0/T1/2] versus T-1, sendo a energia de ativação igual a λ/4:124; 129; 130
𝜆 = −4,03 𝑑ln[𝑘0 𝑇1 2⁄⁄ ] 𝑑[𝑇−1]⁄ (10)
Assim, para a obtenção de kmax e λ, variou-se a velocidade de varredura de 0,05 a 1,0 V
s-1 para as seguintes temperaturas: 15, 20, 25, 30 e 35 ºC, como mostrado nos apêndices B e C.
As figuras 31a e 31b mostram o gráfico de Arrhenius para FFC-GOx e FFC-Ol-GOx,
respectivamente, sendo observada uma relação linear do ln[k0/T1/2] em função de T-1 no
intervalo de temperatura de 293 a 308 K. Construiu-se o gráfico com base nas constantes de
velocidade padrão (𝑘0) obtidas pelo do método de Laviron, que é baseado na teoria de Butler-
Volmer. Nesse caso, as velocidades de transferência de elétrons podem ser descritas por uma
dependência exponencial das constantes de velocidade com o sobrepotencial, de acordo com as
seguintes equações:
𝑘𝑟𝑒𝑑 = 𝑘0 exp(−𝛼𝑛𝐹(𝐸 − 𝐸0′) 𝑅𝑇⁄ ) (11)
𝑘𝑜𝑥𝑖 = 𝑘0 exp((1 − 𝛼)𝑛𝐹(𝐸 − 𝐸0′) 𝑅𝑇⁄ ) (12)
Em que k0 é a constante de velocidade padrão (em sobrepotencial zero), n é o número
de elétrons transferidos e α é o coeficiente de transferência eletrônica, o qual representa o grau
de simetria entre as constantes de velocidade de oxidação e de redução. Os parâmetros α e k0
podem ser determinados a partir do tratamento matemático proposto por Laviron. Para estimar
69
o valor de α é necessário estudar os potenciais de pico anódico e catódico em função do log υ.
Assim, as figuras 31c e 31d mostram que em altas velocidades há uma relação linear entre os
potenciais de pico e o log ν com inclinações de -2.3RT/αnF e 2.3RT/(1-α)nF para os picos
catódico e anódico, respectivamente. Ressalta-se que a figura 31 corresponde aos gráficos
obtidos dos experimentos realizados a 25 ºC, sendo os demais mostrados nos apêndices D e E.
A partir da inclinação dessas retas, o coeficiente de transferência eletrônica (α) pode ser
estimado, o que permite calcular a constante de velocidade padrão k0 aplicando-se a condição
de E-E0’ = 0 na equação 13.
𝑘0 =𝛼𝑛𝐹𝑣𝑐
𝑅𝑇=
(1−𝛼)𝑛𝐹𝑣𝑎
𝑅𝑇 (13)
Figura 31 – Gráficos de Arrhenius para (a) FFC-GOx e (b FFC-Ol-GOx; Gráficos de Laviron utilizados
no cálculo de k0 (25 ºC) para (c) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-GOx.
3,24 3,30 3,36 3,42 3,48-1,20
-1,15
-1,10
-1,05
-1,00(a)
= 0,28
103 / (T / K)
ln [
(k0T
-1/2/s
-1K
-1/2)
3,24 3,30 3,36 3,42 3,48
-0,9
-0,8
-0,7
-0,6(b)
ln [
(k0T
-1/2/s
-1K
-1/2)
103 / (T / K)
= 0,43
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
log ( / V s-1
)
E
-E0
' / V
(c)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06 (d)
log ( / V s-1
)
E-E
0' /
V
70
Utilizando a equação 10, a energia de reorganização da GOx foi estimada em 0,28 eV,
enquanto que para a Ol-GOx foi estimada em 0,43 eV. Ressalta-se que esses valores de energia
de reorganização referem-se a etapa não-catalítica da reação. A literatura apresenta valores
como 2,95 eV13 e 2,0 eV91 para a energia de reorganização da GOx. No entanto, esses valores
são referentes as etapas de reação que ocorrem na presença de oxigênio, mais especificamente,
a etapa de abstração de hidreto no primeiro exemplo e a etapa de ativação do oxigênio molecular
no segundo.
A figura 32 mostra as curvas teóricas obtidas a partir das energias de reorganização
estimadas para a GOx e para a Ol-GOx. Essas curvas foram simuladas utilizando a equação 2
e o software Matlab®. Conforme previsto pela teoria de Marcus, em sobrepotenciais altos, as
constantes de velocidade atingem um valor máximo passando por kmáx/2 quando o potencial é
igual, em módulo, a energia de reorganização. Para a GOx, a constante de velocidade máxima
encontrada foi 380 s-1, enquanto que para a Ol-GOx foi 2630 s-1. Assim, conclui-se que a
transferência de carga é aumentada em 7 vezes quando a Ol-GOx é utilizada no eletrodo
modificado.
Figura 32 – Dependência do log (kred + koxi) com o sobrepotencial para os bioeletrodos FFC-GOx (linha
vermelha) e FFC-Ol-GOx (linha azul). As curvas foram simuladas utilizando a equação 2 no software
Matlab®.
-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8
1
2
3
4
Ol-GOx
0,43 eV
E-E0' / V
log
(k
red +
koxi)
0,28 eV
GOx
Esse resultado pode ser explicado em termos da teoria de Marcus (equação 2), uma vez
que a energia de reorganização foi alterada após a oligomerização. A energia de reorganização
descreve a energética do movimento nuclear de moléculas redox e da camada de solvente ao
redor dessa molécula, sendo resultante das alterações nas cargas e do deslocamento espacial
das cargas.92; 93; 129 O rearranjo de cargas promovido pela transferência de dois elétrons por
71
monômero de Ol-GOx e o tamanho da proteína influenciam de maneira significativa o ambiente
do solvente, resultando em um aumento da energia de reorganização para a Ol-GOx.
Uma vez confirmada a obtenção de maiores densidades de corrente para a TDE quando
utilizada a Ol-GOx no bioeletrodo, estudou-se a bioeletrocatálise da glicose na presença de
oxigênio a fim de verificar se essa nova enzima também é mais eficiente para esse tipo de
processo.
4.4.3 Bioeletrocatálise da glicose
Esse tópico abordará a bioeletrocatálise da glicose utilizando os bioeletrodos FFC-GOx
e FFC-Ol-GOx. No entanto, primeiramente, analisou-se a influência das FFC no processo de
interesse. Para tanto, utilizando as FFC como eletrodo de trabalho, adicionaram-se 50 μL de
uma solução de glicose 0,90 mol L-1 a cada cinco ciclos da voltametria. Como observado na
figura 33a, não há corrente catalítica relativa a oxidação da glicose na ausência da enzima. No
entanto, é observada uma diminuição das correntes no pico em -0,3 V, processo esse que está
relacionado ao oxigênio em contato com as FFC.
Figura 33 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo FFC (a) antes (linha preta) e após sucessivas adições
de glicose. Concentração final de glicose no eletrólito: 17,6 mmol L-1; (b) antes (linha preta) e após
sucessivas adições de peróxido de hidrogênio. Concentração final de peróxido de hidrogênio adicionada
ao eletrólito: 13,3 mmol L-1; (c) Ampliação da região de 0,10 a 0,50 V dos voltamogramas cíclicos de
(b). Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH
7,5). Temperatura: 25 ºC. Sistema saturado com oxigênio.
-0,6 -0,3 0,0 0,3 0,6
-2,40
-1,80
-1,20
-0,60
0,00
0,60 (a)
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
-0,6 -0,3 0,0 0,3 0,6
-3,00
-2,40
-1,80
-1,20
-0,60
0,00
0,60(b)
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5-0,45
0,00
0,45
0,90
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat)
(c)
Como a catálise da glicose pela GOx e Ol-GOx produz peróxido de hidrogênio, analisou-
se a resposta do eletrodo FFC na presença do peróxido de hidrogênio. Para isso, adicionaram-se
72
50 μL de uma solução de peróxido de hidrogênio 0,90 mol L-1 a cada cinco ciclos da voltametria.
Observa-se na figura 33b e 33c uma corrente catalítica referente à oxidação do peróxido de
hidrogênio presente no eletrólito, com potencial de onset próximo a 0,3 V. Assim, se após
imobilizada a enzima catalisar a oxidação da glicose, formando também peróxido de hidrogênio,
conclui-se que a enzima está ativa no eletrodo.
A figura 34 mostra a bioeletrocatálise da glicose utilizando os bioeletrodos FFC-GOx e
FFC-Ol-GOx, considerando que na presença de oxigênio molecular, a glicose é convertida a
ácido glicônico com a concomitante redução do oxigênio a peróxido de hidrogênio.14; 132 O
consumo do oxigênio está relacionado ao processo irreversível em -0,3 V, onde é observada
uma diminuição da corrente de redução relativa ao oxigênio após a adição de glicose (linha
azul), como esperado, uma vez que ele é utilizado durante a oxidação da mesma. Essa
diminuição na densidade de corrente é menor para a Ol-GOx do que para a GOx nativa
provavelmente devido a difusão do O2 ser mais eficiente quando utilizado o bioeletrodo
contendo a Ol-GOx. Este processo está ainda relacionado à produção de peróxido de hidrogênio
e sua oxidação que ocorre em 0,24 V para a GOx e 0,15 V para a Ol-GOx (figura 35).
Figura 34 – Voltamogramas cíclicos dos bioeletrodos (a) FFC-GOx e (b) FFC Ol-GOx na ausência de
oxigênio (linha preta), na presença de oxigênio (linha vermelha) e na presença de oxigênio após a adição
de 13,3 mmol L-1 de glicose no eletrólito. Velocidade de varredura 50 mV s-1. Eletrólito suporte: tampão
fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25 ºC
-0,4 0,0 0,4 0,8
-1,20
-0,80
-0,40
0,00
0,40
j /
mA
cm
-2
E / V (Ag/AgClsat
)
Argônio
O2
O2 + glicose
(a)
-0,4 0,0 0,4 0,8
-1,20
-0,80
-0,40
0,00
0,40
j /
mA
cm
-2
E / V (Ag/AgClsat
)
Argônio
O2
O2 + glicose
(b)
Observa-se que a densidade de corrente para a oxidação da glicose em 0,45 V aumentou
cerca de 30% quando utilizado FFC-Ol-GOx, como mostrado na região ampliada dos
voltamogramas cíclicos contidos na figura 34 (figuras 35a e 35b) e no gráfico da concentração
de glicose versus a densidade de corrente (figura 35c).
73
Figura 35 – Região ampliada da resposta catalítica dos voltamogramas cíclicos da figura 34. (a) FFC-
GOx e (b) FFC-Ol-GOx, ambos na presença de oxigênio, na ausência de glicose (linha preta) e após
sucessivas adições de glicose. Concentração final de glicose: 13,3 mmol L-1; (c) Gráfico da concentração
de glicose versus densidade de corrente em 0,45 V para a GOx (●) e Ol-GOx (●).
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-0,20
0,00
0,20
0,40
0,60
GOx
j /
mA
cm
-2
E / V (Ag/AgClsat
)
0,24 V
(a)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-0,20
0,00
0,20
0,40
0,60
Ol-GOx
j /
mA
cm
-2
E / V (Ag/AgClsat
)
0,15 V
(b)
0 4 8 120,20
0,25
0,30
0,35
0,40
j at
0.4
5 V
/ m
A c
m-2
Cglicose (mmol L-1)
(c)
Uma vez observada a corrente de detecção do peróxido de hidrogênio, o qual é gerado
a partir da oxidação da glicose catalisada pela GOx e pela Ol-GOx, obtiveram-se as curvas de
polarização para ambos os eletrodos, como mostrado na figura 36. Observa-se que o bioeletrodo
FFC-Ol-GOx é mais eficiente do que o FFC-GOx, uma vez que até mesmo para concentrações
menores de glicose, as densidades de corrente relativas a oxidação da glicose são maiores para
a Ol-GOx.
Figura 36 – Curvas de polarização na ausência de glicose para FFC-GOx (linha preta) e FFC-Ol-GOx
(linha cinza) e na presença de 36,7 mmol L-1 de glicose para FFC-GOx (linha vermelha) e 28,3 mmol
L-1 de glicose para FFC-Ol-GOx (linha azul). Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1;
pH 7,5). Temperatura: 25 ºC. Atmosfera sob saturação de oxigênio.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
74
Uma vez evidenciado que a para o bioeletrodo FFC-Ol-GOx, as correntes relativas a
oxidação da glicose são maiores do que para FFC-GOx, a cinética de ambas as enzimas nos
bioeletrodos foram estudadas utilizando a cronoamperometria (figura 37). Assim como nos
outros experimentos, a solução de glicose (0,90 mol L-1) foi preparada e armazenada a 4 ºC
durante 12 horas para a isomerização da glicose. Para todos os experimentos, oxigênio foi
borbulhado no eletrólito durante dez minutos antes das medidas. Como observado, o perfil de
Michaelis-Menten é seguido em ambos os casos, permitindo o cálculo dos parâmetros cinéticos
da reação.
Figura 37 – Resposta amperométrica na presença de diferentes concentrações de glicose utilizando os
bioeletrodos (a) FFC-GOx e (c) FFC-Ol-GOx; Gráfico de concentração de glicose versus a densidade
de corrente obtida na cronoamperometria para (b) FFC-GOx e (d) FFC-Ol-GOx. Potencial aplicado: 0,7
V (vs Ag/AgClsat). Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Temperatura: 25
ºC. Atmosfera saturada com oxigênio.
0 600 1200 1800
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
j /
mA
cm
-2
tempo / s
(a)
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
j /
mA
cm
-2
Cglicose
/ mol L-1
(b)
0 400 800 1200
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
j /
mA
cm
-2
tempo / s
(c)
0,00 0,01 0,02 0,03
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
j /
mA
cm
-2
Cglicose
/ mol L-1
(d)
75
A fim de obter o KMapp, utilizaram-se as metodologias de Lineweaver-Burk (figura 38a
e 38b) e Hanes-Woolf (figura 38c e 38d). Para Lineweaver-Burk, a equação 3 foi utilizada e
nos dá uma indicação da cinética enzima-substrato, correspondendo a uma versão eletroquímica
da equação de Lineweaver-Burk:133; 134 Para a metodologia de Hanes-Woolf,135 a equação 4
pode ser usada para estimar os mesmos parâmetros, considerando que jmax é proporcional a vmax.
Figura 38 – Gráficos de Lineweaver-Burk para (a) GOx and (c) Ol-GOx; Gráficos de Hanes-Woolf
para (b) GOx e (d) Ol-GOx. Dados obtidos das cronoamperometrias relativas a bioeletrocatálise da
glicose.
0 30 60 90 120
4
6
8
10
1/j
(m
A-1
cm
2)
1/Cglicose
(M-1
)
(a)
-10 0 10 20 30 40
40
80
120
160
200
Cg
lico
se/j
(M
A-1
cm
2)
Cglicose
(mM)
(b)
0 80 160 240
2
3
4
5
1/j
(m
A-1
cm
2)
1/Cglicose
(M-1
)
(c)
-10 0 10 20 30
0
20
40
60
80
Cg
lico
se/j
(M
A-1
cm
2)
Cglicose
(mM)
(d)
Assim, utilizando as duas metodologias de linearização a partir da curva de Michaelis-
Menten, os seguintes parâmetros foram obtidos para a GOx: KMapp igual a 11 mmol L-1 e jmax
igual 233 μA cm-2, enquanto que para a Ol-GOx esses valores correspondem a 4,2 mmol L-1 e
445 μA cm-2, respectivamente. Ressalta-se que os valores obtidos em cada metodologia para a
76
GOx apresentaram concordância entre si e que o mesmo ocorreu quando obtidos os parâmetros
cinéticos para a Ol-GOx.
Para calcular o kcat, a quantidade de enzima ativa no eletrodo foi encontrada pela
integração da resposta faradaica nos voltamogramas cíclicos na ausência da corrente capacitiva.
Considerou-se a equação 7, na qual dois elétrons estão envolvidos, sendo obtido 2,05 × 10-9
mol L-1 e 0,89 × 10-9 mol L-1 para a GOx e Ol-GOx respectivamente. Como a corrente catalítica
é proporcional à raiz quadrada do kcat em condições de saturação de glicose e do limite de
difusão,130 determinaram-se os valores de kcat para ambas as enzimas: 335 s-1 para a GOx e 708
s-1 para a Ol-GOx. Assim, o limite de difusão obtido utilizando os parâmetros calculados por
Hanes-Woolf, kcat/KM, corresponde a 21 mM-1 s-1 para a GOx e 106 mM-1 s-1 para a Ol-GOx,
indicando uma eficiência catalítica maior para a Ol-GOx. A tabela 4 resume os parâmetros
cinéticos obtidos para GOx e para a Ol-GOx.
Tabela 4 – Parâmetros cinéticos obtidos para a GOx e para a Ol-GOx.
GOx Ol-GOx
KMapp 11 mmol L-1 4,2 mmol L-1
jmax 233 μA cm-2 445 μA cm-2
kcat 335 s-1 708 s-1
kcat/KM 21 mM-1 s-1 106 mM-1 s-1
Diante dos resultados apresentados, conclui-se que apesar da reação com o TFMS, a
qual dá origem a GOx oligomerizada, fazer com que a atividade catalítica seja menor, a
utilização dessa nova enzima é válida, uma vez que ela permite a obtenção de densidades de
corrente maiores quando estudada tanto a transferência direta de elétrons, quanto a
bioeletrocatálise da glicose.
77
5 CONCLUSÃO
Nesta tese de doutorado propõe-se uma estratégia para a obtenção da glicose oxidase
oligomerizada (Ol-GOx). Assim, visando a obtenção de oligômeros da GOx, diferentes ácidos
de Brønsted (TFMS, HCl, H2SO4 e HNO3) foram usados para estudar a influência de cada um
deles na formação dos aglomerados proteicos. Por medidas de DLS e pelo aumento na turbidez,
observado pela espectroscopia eletrônica na região do UV-Vis, conclui-se que todos os ácidos
utilizados promoveram a oligomerização da GOx nativa. No entanto, a análise da estrutura
secundária por FTIR mostrou alterações significativas nos conteúdos de α-hélice e folhas-β
quando HCl, H2SO4 e HNO3 foram utilizados, diferentemente do resultado obtido para a reação
com o TFMS. O aumento nas folhas-β expõe as cadeias hidrofóbicas, melhorando a
comunicação entre a superfície do eletrodo e a proteína. Assim, a melhora na TDE pode ser
explicada pelas alterações na estrutura secundária da enzima. No entanto, por causa dessas
alterações, a atividade enzimática foi reduzida drasticamente (85-94%) após o tratamento com
HCl, HNO3 e H2SO4, tornando inviável a utilização dessas enzimas para a bioeletrocatálise, o
que não ocorre com a Ol-GOx obtida utilizando o TFMS, a qual apresentou uma manutenção
de 59% da atividade enzimática.
Uma vez que a Ol-GOx obtida a partir da reação com o TFMS manteve parcialmente
sua atividade catalítica, esta enzima foi caracterizada e utilizada para os estudos eletroquímicos.
Pela reação com o TFMS, as cadeias hidrofóbicas foram expostas, permitindo a oligomerização
da GOx como mostrado na microscopia eletrônica de transmissão e nas medidas de DLS, onde
foi observado um aumento de dez vezes no raio hidrodinâmico em relação a enzima nativa. Em
relação a caracterização, resultados de SDS-PAGE mostraram que a unidade monomérica não
foi alterada após a reação com o TFMS e por espectroscopia eletrônica na região do UV-Vis,
observou-se a presença das mesmas bandas características do FAD, além do aumento da
turbidez para a Ol-GOx, turbidez essa que é associada à formação dos oligômeros. As imagens
de microscopia confirmaram a diferença na hidrofobicidade de ambas as enzimas, uma vez que
a GOx e a Ol-GOx se comportam de forma diferente quando depositadas em um substrato de
fluoreto de cálcio. Por CD não foram observadas alterações na estrutura secundária da Ol-GOx,
no entanto, sabe-se que essa é uma técnica influenciada pela presença de agregados e por isso,
utilizou-se a espectroscopia de FTIR para a determinação dessa estrutura, uma vez que ela não
é influenciada por esse fator. Analisando os dados obtidos pela deconvolução da banda de
amida I, observaram-se pequenas diferenças na porcentagem dos conteúdos de folhas-β e
voltas-β para a Ol-GOx, em relação a GOx nativa (3% e 7%, respectivamente), o que sugere
78
uma pequena alteração na estrutura secundária após a oligomerização, sendo esse aumento nas
folhas-β esperado em agregados proteicos.
Em relação a cinética enzimática, observou-se que a Ol-GOx manteve sua atividade
catalítica, permitindo que prosseguíssemos com os testes eletroquímicos, mesmo que a
princípio essa enzima fosse menos ativa do que a GOx nativa.
Estudou-se tanto a etapa não-catalítica (transferência direta de elétrons), quanto a etapa
catalítica (bioeletrocatálise da glicose) da reação catalisada pela GOx e pela Ol-GOx. A etapa
não-catalítica da reação foi avaliada utilizando a voltametria cíclica, sendo obtido um aumento
linear das densidades de corrente dos picos anódico e catódico com o aumento da velocidade
de varredura, indicando que o processo eletroquímico é governado por transferência de carga.
Utilizando a teoria de Marcus determinou-se a constante heterogênea de transferência de carga
e a energia de reorganização para ambas as enzimas, sendo obtido um valor igual a 2630 s-1
para a Ol-GOx enquanto esse valor para a GOx nativa corresponde a 380 s-1, ou seja, a
transferência de carga é aumentada em sete vezes quando a Ol-GOx é utilizada no eletrodo
modificado. A bioeletrocatálise da glicose foi estudada tanto por voltametria cíclica, quanto por
cronoamperometria. Na voltametria cíclica, observou-se um aumento de 30% na densidade de
corrente obtida em 0,45 V quando utilizado o bioeletrodo FFC-Ol-GOx. Já a
cronoamperometria foi utilizada para estudar a cinética de ambas as enzimas adsorvidas nos
bioeletrodos, sendo obtido um KMapp igual a 11 mmol L-1 para a GOx e 4,2 mmol L-1 para a Ol-
GOx, enquanto a jmax obtida para a GOx foi 233 μA cm-2, e 445 μA cm-2 para a Ol-GOx. O
limite de difusão obtido para a GOx foi 21 mM-1 s-1, enquanto que para a Ol-GOx esse valor
corresponde a 106 mM-1 s-1, indicando uma eficiência catalítica maior para a Ol-GOx. Assim,
conclui-se que o oligômero formado após a reação com o TFMS pode ser utilizado como uma
enzima mais eficiente do que sua forma nativa, com características adequadas para sua
estabilização no estado sólido para aplicações em bioenergia, catálise heterogênea e
biomedicina.
79
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92
APÊNDICES
APÊNDICE A - Gráficos de Laviron utilizados no cálculo de k0 para (a) FFC-GOx-HCl, (b) FFC-GOx-
H2SO4 e (c) FFC-GOx-HNO3.
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2-0,12
-0,08
-0,04
0,00
0,04
0,08
E-E
0' /
V
log v
(a)
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
-0,03
0,00
0,03
0,06
E-E
0' /
V
log v
(b)
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
E-E
0' /
V
log v
(c)
93
APÊNDICE B - Voltamogramas cíclicos do bioeletrodo FFC-GOx em diferentes velocidades de
varredura nas temperaturas: (a) 15 ºC, (b) 20 ºC, (c) 25 ºC, (d) 30 ºC e (e) 35 ºC. Eletrólito suporte:
tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Velocidade de varredura de 0,05 a 1,0 V s-1; (f)
Dependência das correntes de pico catódico e anódico com a temperatura para a velocidade de varredura
igual a 100 mV s-1.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,10
-0,55
0,00
0,55
1,10
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(a)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,10
-0,55
0,00
0,55
1,10
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(b)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,10
-0,55
0,00
0,55
1,10
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(c)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,10
-0,55
0,00
0,55
1,10
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(d)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-1,10
-0,55
0,00
0,55
1,10
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(e)
15 20 25 30 35
-0,11
-0,09
0,06
0,09
jpc
jpa
j p (
mA
cm
-2)
Temperatura (ºC)
(f)
94
APÊNDICE C - Voltamogramas cíclicos do bioeletrodo FFC-Ol-GOx em diferentes velocidades de
varredura nas temperaturas: (a) 15 ºC, (b) 20 ºC, (c) 25 ºC, (d) 30 ºC e (e) 35 ºC. Eletrólito suporte:
tampão fosfato de sódio (0,10 mol L-1; pH 7,5). Velocidade de varredura de 0,05 a 1,0 V s-1; (f)
Dependência das correntes de pico catódico e anódico com a temperatura para a velocidade de varredura
igual a 100 mV s-1.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,60
-1,80
0,00
1,80
3,60
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(a)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,60
-1,80
0,00
1,80
3,60
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(b)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,60
-1,80
0,00
1,80
3,60
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(c)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,60
-1,80
0,00
1,80
3,60
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(d)
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3
-3,60
-1,80
0,00
1,80
3,60
j /
mA
cm
-2
E / V(Ag/AgClsat
)
(e)
15 20 25 30 35
-0,36
-0,30
0,24
0,30j p
/ m
A c
m-2
Temperatura / ºC
jpa
jpc
(f)
95
APÊNDICE D - Gráficos de Laviron utilizados no cálculo de k0 para FFC-GOx nas seguintes
temperaturas: (a) 15 ºC, (b) 20 ºC, (c) 25 ºC, (d) 30 ºC e (e) 35 ºC.
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
E
-E0
' / V
log ( / V s-1
)
(a)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
E-E
0' /
V
log ( / V s-1
)
(b)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
log ( / V s-1
)
E
-E0
' / V
(c)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
log ( / V s-1
)
E-E
0' /
V
(d)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
E-E
0' /
V
log ( / V s-1)
(e)
96
APÊNDICE E - Gráficos de Laviron utilizados no cálculo de k0 para FFC-Ol-GOx nas seguintes
temperaturas: (a) 15 ºC, (b) 20 ºC, (c) 25 ºC, (d) 30 ºC e (e) 35 ºC.
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3-0,09
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
log ( / V s-1
)
E-E
0' /
V
(a)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
E-E
0' /
V
log ( / V s-1)
(b)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
log ( / V s-1)
E-E
0' /
V
(c)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
log ( / V s-1
)
E-E
0' /
V
(d)
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3
-0,06
-0,03
0,00
0,03
0,06
E
-E0
' / V
log ( / V s-1
)
(e)
97
PUBLICAÇÕES NO PERÍODO DO DOUTORADO
1. MARTINS, M. V. A.; PEREIRA, A. R.; LUZ, R. A. S.; IOST, R. M.; CRESPILHO, F. N.
Evidence of short-range electron transfer of a redox enzyme on graphene oxide electrodes.
Physical Chemistry Chemical Physics, v. 16, p. 17426-17436, 2014.
2. LUZ, R. A. S.; PEREIRA, A. R.; DE SOUZA, J. C. P.; SALES, F. C. P. F.; CRESPILHO,
F. N. Enzyme biofuel cells: thermodynamics, kinetics and challenges in applicability.
ChemElectroChem. v. 1, n. 11, 1751-1777, 2014.
3. PEREIRA, A. R.; DE SOUZA, J. C. P.; IOST, R. M.; SALES, F. C. P. F.; CRESPILHO, F.
N. Application of carbon fibers to flexible enzyme electrodes. Journal of Electroanalytical
Chemistry, v. 780, p. 396-406, 2016.
4. PEREIRA, A. R.; DE SOUZA, J. C. P.; GONÇALVES, A. D.; PAGNONCELLI, K. C.;
CRESPILHO, F. N. Bioelectrooxidation of ethanol using NAD-dependent alcohol
dehydrogenase on oxidized flexible carbon fiber arrays. Journal of the Brazilian Chemical
Society, v. 28, n. 9, p. 1698-1707, 2017.
5. PEREIRA, A. R.; LUZ, R. S. A.; LIMA, F. C. D. A.; CRESPILHO, F. N. Protein
oligomerization based on Brønsted acid reaction. ACS Catalysis, v. 7, p. 3082-3088, 2017.
6. PEREIRA, A. R.; SEDENHO, C. R.; DE SOUZA, J. C. P.; CRESPILHO, F. N. Advances in
enzyme bioelectrochemistry. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 2017. In press.
7. LUZ, R. A. S.; PEREIRA, A. R.; IOST, R. M.; CRESPILHO, F. N. Biofuel cells. In: DE
SOUZA, F.; LEITE, E. (eds). Nanoenergy Springer, Cham, 2018.
8. PEREIRA, A. R.; CRESPILHO; F. N. Evidences that β-sheets are intrinsically correlated to
direct electron transfer process in catalase-free oligomerized-glucose oxidase, 2017. Submitted.
9. PAGNONCELLI, K. C.; PEREIRA, A. R.; SEDENHO, G. C.; CRESPILHO, F. N. Ethanol
generation and energy production in a cooperative bioelectrochemical system, 2017. Submitted.
98
10. SEDENHO, G. C.; PEREIRA, A. R.; PAGNONCELLI, K. C.; DE SOUZA, J. C. P.;
CRESPILHO, F. N. Implantable enzyme based biofuel cells. In: Encyclopedia of interfacial
chemistry: surface science and electrochemistry, 2017. Invited and Submitted.