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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos

Área de Produção e Controle Farmacêuticos

Desenvolvimento de formulações cosméticas hidratantes e

avaliação da eficácia por métodos biofísicos

Vânia Rodrigues Leite e Silva

Tese para obtenção do grau de DOUTOR

Orientadora: Profa. Dra. Telma Mary Kaneko

São Paulo

2009

Vânia Rodrigues Leite e Silva

Desenvolvimento de formulações cosméticas hidratantes e

avaliação da eficácia por métodos biofísicos

Comissão Julgadora da Tese para obtenção do grau de Doutor

Profa. Dra. Telma Mary Kaneko

orientador/presidente

____________________________ 1o. examinador

____________________________ 2o. examinador

____________________________ 3o. examinador

____________________________ 4o. examinador

São Paulo, 24 de abril de 2009.

Dedicatória

A Deus, pela vida.

“Em todas estas coisas, porém

somos mais que vencedores,

por meio daquele que nos ama”

Romano 8:37

A meus pais Dan e Celina,

pelo amor, dedicação e exemplo de vida que foram a base da minha

formação humana.

AMO VOCÊS

A meus filhos Laura, Bruna e David, que são a razão do meu viver.

Não encontrei nenhuma frase à altura do amor que sinto por eles.

A meu marido Nelson, grande amor da minha vida, que sempre esteve

presente e compartilha comigo mais este momento

de emoção e vitória.

A meus irmãos Gustavo e Augusto,

pelo amor e por tudo que representam.

À Professora Telma Mary Kaneko,

que tive a oportunidade de conhecer na universidade e descobrir que além

de uma excelente profissional é uma pessoa maravilhosa. A sua

disponibilidade irrestrita, sua forma exigente, crítica e criativa de

argüir as idéias apresentadas, creio que deram norte a este

trabalho, facilitando o alcance dos objetivos. Pela orientação,

incentivo e confiança em mim depositados durante a realização

deste trabalho, meus irrestritos agradecimentos.

Agradecimentos Especiais

Uma vez, eu li que a elaboração de uma tese de doutorado é um produto

coletivo, embora sua redação, responsabilidade e estresse sejam

predominantemente individuais. Concordo plenamente e várias pessoas

contribuíram para o enriquecimento deste trabalho. A todas elas, registro

minha gratidão.

Aos Professores Maria Valéria Robles Velasco, Maria Elena Takeda e

André Rolim Baby, pela demonstração de interesse e pelas valiosas

sugestões.

A meu querido irmão Augusto, pela preciosa revisão na redação do texto.

À minha grande amiga Patricia Lopes, por ser a responsável pela minha

volta à pesquisa.

Ao Professor Geraldo Alécio, pelo incentivo constante.

Às minhas estagiárias Gisele Oliveira e Cibeli Ferelli, pela grande ajuda

na revisão e digitação do trabalho.

A meus sogros Nelson , Maria Luiza e D.Laura, por serem verdadeiros

“anjos da guarda” para os meus filhos, apoio fundamental para que eu

pudesse exercer o meu trabalho.

À Jailma, pelo grande carinho e atenção com todos em minha casa.

Às minhas amigas Janine Gimenis e Cristiane Coelho, pelo incentivo,

paciência e grande torcida durante todo o projeto.

As empresas: Laboratório Scientia, EVIC Brasil, ISIC (Instituto

Schulman de Investigação Científica) e Flowsciencie, pelo empréstimo

do espaço, tempo e equipamentos utilizados.

A Vitaderm, pelas amostras cedidas para os experimentos.

Ao Dr. Marcelo Schulman e à Dona Sandra Schulman, pela confiança

em mim depositada.

Aos colegas Gabriela , Elisa , Satiko , José e Mirian , pelo apoio, ajuda e

amizade.

À minha Tia Lili, sempre em meu coração, pela grande oportunidade de

estudo e pela carinhosa e fundamental acolhida.

A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

Obrigada!

RReessuummoo SILVA, V.R.L Desenvolvimento de formulações cosméticas hidratantes e avaliação da eficácia por métodos biofísicos 2009, p. Tese (Doutorado) –

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Introdução: A comprovação da eficiência de formulações hidratantes deve ser criteriosa e analisada com métodos adequados. Objetivo: O objetivo principal do trabalho foi avaliar in vivo a eficácia hidratante de formulações contendo diferentes componentes ativos por capacitância elétrica e perda de água transepidérmica. Compararam-se os desempenhos entre Corneometer® e Moisturemeter® e entre o Vapometer® e Tewlmeter®. Verificou-se o comportamento in vitro das alterações causadas pelas substâncias hidratantes, em modelo de estrato córneo alternativo. Material e Métodos: Os compostos ativos selecionados (4% p/p) para incorporação nos géis à base de carbômero foram: uréia, extrato vegetal de Imperata cylindrica; complexo contendo fatores de hidratação natural; e os derivados do açúcar, sacarídeo isomerato e a mistura de xilitilglicosídeo e anidroxilitilglicosídeo. A avaliação in vivo da eficácia hidratante teve o delineamento experimental baseado no projeto fatorial ANOVA three way. Os tempos estudados foram: após a aplicação e 30, 60, 120; 240 e 360 minutos. O estudo de estabilidade acelerada das formulações envolveu condições drásticas de armazenamento (temperatura, umidade e luminosidade) durante 90 dias. Na avaliação in vitro do comportamento das substâncias hidratantes utilizou-se a espectroscopia Raman com transformada de Fourier (FT-Raman) e Calorimetria exploratória diferencial (DSC). Resultados: A análise estatística da capacitânia elétrica obtida por Corneometer® e do Moisturemeter® mostraram que houve diferenças significativas entre os géis e o tempo de aplicação. Com relação às medidas de perda de água transepidérmica, os resultados obtidos por Vapometer® e Tewlmeter® não apresentaram concordância. As bandas encontradas nos espectros FT-Raman mostraram que os ativos hidratantes não provocaram alterações na estrutura conformacional do estrato córneo alternativo. A análise da calorimetria (DSC) mostrou que o gel de uréia aumentou o conteúdo hídrico da membrana. Conclusão: Os géis contendo 4% (p/p) de uréia e de 4% (p/p) de derivado de açúcar apresentaram melhor eficácia hidratante in vivo, capacitância elétrica quando analisado por Corneometer® e Moisturemeter®. Em relação à perda de água transepidérmica, o gel base sem ativo obteve o melhor resultado. Com relação às medidas de capacitância, o Corneometer® e o Moisturemeter® mostraram-se estaticamente semelhantes. Comparando-se as medidas de perda de água transepidérmica, a análise estatística indicou que o Vapometer® tem precisão inferior comparada com o Tewlmeter®. A avaliação do comportamento in vitro das substâncias hidratantes sugeriram que as mesmas são seguras.

Palavras-chave: hidratação, perda de água transepidérmica, capacitância elétrica,

Corneometer® , Moisturemeter® , Vapometer®, Tewlmeter®. .

AAbbssttrraacctt SILVA, V.R.L Development of cosmetic moisturizer formulations and evaluation of hydrating efficacy by biophysical methods 2009, p. Tese (Doutorado) –

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Introduction: Hydration of the corneal layer varies according to the amount of water present; the transportation of water from the lower layers; evaporation speed and quantity and composition of epicutaneous emulsion. Proof of moisturizer formula efficiency must be prudent and analyzed using appropriate methods. Objective: The study’s main objective was to assess the in vivo efficacy of moisturizer formulas with different active components by means of electrical capacitance and transepidermal water loss. The accelerated stability of the referred to formulas was also observed and assessed. Performances between Corneometer® and Moisturemeter® and between Vapometer® and Tewlmeter® were compared. In vitro behavior of alterations caused by moisturizing substances was verified in an alternative corneal stratum model. Material and Methods: The active compounds selected (4% p/p) for use in carbomer-based gels were: urea, Imperata cylindrica vegetal extract; a complex with natural moisturizing factors; sugar byproducts, saccharide isomerate and the mix of xylitol glucoside and anhydro xylitol glicoside. In vivo assessment of moisturizing efficacy of the formulas by means of electrical capacitance and transepidermal water loss was designed based in ANOVA three way factorial design. The gels were applied on both arms of volunteers aged 20 to 30 and a control application (base gel) and an untreated area were used. Study times were: after application and at 30, 60, 120; 240 and 360 minutes. The accelerated stability study of the formulations involved drastic storage conditions (temperature, humidity, luminosity) over 90 days. For the in vitro assessment of moisturizing substance behavior, Raman spectroscopy was used with Fourier Transform (FT-Raman) and differential scanning calorimetry (DSC). Results: Statistical analysis of electrical capacitance using Corneometer® and Moisturemeter® revealed significant differences between the gels and application time. With regard to transepidermal water loss measures, the results obtained from Vapometer® and Tewlmeter® did not reveal concordance. The bands found in the FT-Raman spectrum revealed that the active moisturizers did not cause changes in the alternative cornea stratum conformation structure. Calorimetry (DSC) analysis showed the urea gel increased membrane water content. Conclusion: Gels containing 4% (p/p) urea and 4% (p/p) of sugar byproduct had the best in vivo moisturizing efficacy, electrical capacitance when analyzed with Corneometer® and Moisturemeter®. In relation to transepidermal water loss, the base gel without active ingredients had the best result in both Vapometer® and Tewlmeter®. The formulas were stable for a period of three months in the studied storage conditions. In relation to capacitance measures, Corneometer® and Moisturemeter® proved to be statistically similar. When comparing transepidermal water loss measures, statistical analysis indicated that Vapometer® is not as precise as Tewlmeter®. In vitro assessment of behavior of moisturizing substances suggested they are safe. Key-words: moisturizing, transepidermal water loss, electrical capacitance, Corneometer® , Moisturemeter® , Vapometer®, Tewlmeter®.

Lista de Quadros e Tabelas

Quadro 1. Composição química do FHN 8

Quadro 2. Fototipos de pele 51 Tabela 1. Composição quali e quantitativa (% p/p) das formulações utilizadas

durante a Primeira e Segunda Etapas. 40

Tabela 2. Composição quali e quantitativa (% p/p) das formulações utilizadas na

Terceira Etapa. 41

Tabela 3. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de

variação e aspectos organolépticos do Gel A (gel base sem ativo) nos tempos 7, 15,

30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada. 58


variação e aspectos organolépticos do Gel B (gel com uréia) nos tempos 7, 15, 30,

60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada. 61


variação e aspectos organolépticos do Gel C (gel com extrato vegetal) nos tempos 7,

15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada. 64


variação e aspectos organolépticos do Gel D (gel com componentes do FHN) nos

tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada. 67


variação e aspectos organolépticos do Gel G (gel com derivado de açúcar) nos

tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada. 70

Tabela 8. ANOVA para os dados obtidos segundo o esquema da Figura 11, para as

medidas realizadas com o Corneometer®. 77

Tabela 9. Grupos homogêneos de médias para a variável Voluntário, obtidos pelo

teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Corneometer®. 79

Tabela 10. Grupos homogêneos de médias para a variável Tempo, obtidos pelo










Tabela 15. Grupos homogêneos de médias para a variável Produto, obtidos pelo











medidas realizadas com o Moisturemeter®. 100


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Moisturemeter®. 102






medidas realizadas com o Tewlmeter®. 109


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Tewlmeter®. 111






medidas realizadas com o Vapometer®. 116


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Vapometer®. 118





Tabela 32. Entalpia e temperaturas de pico das soluções a 4%. 129

Tabela 33. Entalpia e temperaturas de pico dos géis a 4%. 131

Lista de Figuras

Figura 1. Camadas da Pele. 5

Figura 2. Camadas da Epiderme. 6

Figura 3. Cascata Bioquímica na Recuperação da Barreira. 14

Figura 4. Xerose. 17

Figura 5. MoistureMeter®. 33

Figura 6. Fluxograma das Análises. 49

Figura 7. Dedeira de Látex. 52

Figura 8. Locais de Aplicação. 52

Figura 9. Equipamento para medir Capacitância elétrica da pele (Corneometer).53

Figura 10. Equipamento para verificar a Perda de Água Transepidérmica

(Tewlmeter). 54

Figura 11. Arranjo para obtenção de dados para análise de variância dos ensaios

realizados. 54

Figura 12. Variação (%) de pH Gel A durante 90 dias em relação ao tempo inicial 59

Figura 13. Variação (%) de Viscosidade do Gel A durante 90 dias em relação

ao tempo inicial.. 59

Figura 14. Variação (%) de Densidade do Gel A durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 60

Figura 15. Variação (%) de pH Gel B durante 90 dias em relação ao tempo inicial.62

Figura 16. Variação (%) de Viscosidade do Gel B durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 62

Figura 17. Variação (%) de Densidade do Gel B durante 90 dias em relação ao

;tempo inicial. 63

Figura 18.Variação (%) de pH Gel C durante 90 dias em relação ao tempo inicial 65

Figura 19. Variação (%) de Viscosidade do Gel C durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 65

Figura 20. Variação (%) de Densidade do Gel C durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 66

Figura 21. Variação (%) de pH Gel D durante 90 dias em relação ao tempo inicial 68

Figura 22. Variação (%) de Viscosidade do Gel D durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 69

Figura 23. Variação (%) de Densidade do Gel D durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 69

Figura 24. Variação (%) de pH Gel G durante 90 dias em relação ao tempo inicial 71

Figura 25. Variação (%) de Viscosidade do Gel G durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 71

Figura 26. Variação (%) de Densidade do Gel G durante 90 dias em relação ao

tempo inicial. 72

Figura 27. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis após 90 dias no

Refrigerador a 4 ºC, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel B (Uréia), Gel C

(extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar) e Gel D (componentes do NMF). 73

Figura 28. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis após 90 dias no

Refrigerador a 4ºC, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel B (Uréia), Gel C


Figura 29. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis, após 90 dias na

Estufa a 37 ºC, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel B (Uréia), Gel C


Figura 30. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis, após 90 dias à

Temperatura Ambiente, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel B (Uréia), Gel

C (extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar) e Gel D (componentes do NMF). 75

Figura 31. Histograma de resíduos, para a ANOVA dos resultados obtidos na leitura

do Corneometer. 78

Figura 32. Reta de 45% (valores preditos versus valores observados), para projeto

fatorial three way (ANOVA), construído com os dados obtidos pelo esquema da

Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®. 79

Figura 33. Médias dos voluntários, exibindo o intervalo de confiança (95%), para o

modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da Figura 11 e

pelas medidas realizadas com o Corneometer®. 81

Figura 34. Médias dos níveis de tempo, exibindo o intervalo de confiança (95%),

para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da Figura

11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®. 82

Figura 35. Médias dos Produtos e o Controle, exibindo o intervalo de confiança

(95%), para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema

da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®. 82

Figura 36. Interação Voluntário versus Tempo, exibindo o intervalo de confiança



Figura 37. Voluntário versus Produto, exibindo o intervalo de confiança (95%), para

o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da Figura 11 e


Figura 38. Interação Tempo versus Produto, exibindo o intervalo de confiança (95%),




do Corneometer®. 86

Figura 40. Reta de 45º, para o modelo indicado pela ANOVA dos resultados obtidos

na leitura do Corneometer®. 86

Figura 41. Grupos homogêneos de médias para a variável Produto, obtidos pelo


Figura 42. Médias dos níveis de Tempo, exibindo o intervalo de confiança (95%),



Figura 43. Médias dos Produtos, exibindo o intervalo de confiança (95%), para o






Figura 45. Interação Voluntário versus Produto, exibindo o intervalo de confiança



Figura 46. Interação Tempo versus Voluntário, exibindo o intervalo de confiança




do Corneometer®. 94


na leitura do Corneometer®. 94

Figura 49. Médias dos Voluntários, exibindo o intervalo de confiança (95%), para o









Figura 52. Interação ProdutoTempo, exibindo o intervalo de confiança (95%), para

o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da Figura 11 e









do Moisturemeter®. 101


na leitura do Moisturemeter®. 101



pelas medidas realizadas com o Moisturemeter®. 103



11 e pelas medidas realizadas com o Moisturemeter®. 103









da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Moisturemeter®. 105








do Tewlmeter®. 110


na leitura do Tewlmeter®. 110



pelas medidas realizadas com o Tewlmeter®. 113



11 e pelas medidas realizadas com o Tewlmeter®. 113









da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Tewlmeter®. 115



11 e pelas medidas realizadas com o Tewlmeter®. 115


do Vapometer®. 117


na leitura do Vapometer®. 117



pelas medidas realizadas com o Vapometer®. 120









da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Vapometer®. 121



da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Vapometer®. 122



11 e pelas medidas realizadas com o Vapometer®. 122



11 e pelas medidas realizadas com o Vapometer®. 123

Figura 81. Espectro FT-Raman das soluções a 4% dos ativos hidratantes. 125

Figura 82. Espectro FT-Raman dos géis a 4% dos ativos hidratantes. 126

Figura 83. Curva DSC da primeira corrida da Solução S1 (controle). 128

Figura 84. Curva DSC da segunda corrida da Solução S1 (controle). 129

Figura 85. Curva DSC da primeira corrida do Gel G1 (controle). 130

Figura 86. Curva DSC da segunda corrida do Gel G1 (controle). 130

LLiissttaa ddee AAbbrreevviiaattuurraass

FHN - Fator de Hidratação Natural.

TEWL- Transepidermal Water Loss.

ATR-FTIR - espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier e acessório

de refletância total atenuada.

PAS-FTIR - espectroscopia fotoacústica no infravermelho.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

TEA - Teste de estabilidade acelerada.

DSC - Calorimetria exploratória diferencial.

SSuummáárriioo

1. Introdução 1

2. Revisão Bibliográfica 4

2.1. Importância da Pele no Mecanismo de Hidratação 4

2.1.1. Estrutura e Funções da Pele 4

2.1.1.1. Epiderme 5

2.1.1.2. Derme 8

2.1.1.3. Hipoderme 9

2.1.1.4. Funções da Pele 10

2.1.2. Permeabilidade da Barreira Cutânea 11

2.1.3. Formação da Barreira Hidrolipídica Cutânea 13

2.2. Hidratação Cutânea 15

2.2.1. Desidratação 15

2.2.2. Mecanismos de Hidratação 17

2.2.3. Produtos hidratantes 19

2.2.3.1. Componentes do FHN 19

2.2.3.2. Emolientes 20

2.2.3.3. Extrato Vegetal 21

2.2.3.4. Derivados de Açúcares 23

2.2.3.5. Silício Orgânico 24

2.2.3.6. Reações Adversas dos Hidratantes 25

2.3. Avaliação da Hidratação Cutânea 26

2.3.1 Avaliação in vitro do comportamento das substâncias hidratantes

na pele utilizando técnicas espectrométricas e termoanalíticas 26

2.3.2. Avaliação da Hidratação Cutânea in vivo 29

2.3.2.1. Mensuração de Propriedades Elétricas das Camadas

Superiores da Epiderme 31

2.3.2.2. Avaliação da Perda de Água Transepidérmica (TEWL-

Transepidermal Water Loss) 33

2.4 Estudos de estabilidade de produtos cosméticos 35

2.4.1. Teste de estabilidade acelerada (TEA) 36

3. Objetivos 38

4. Material e Métodos 39

4.1 Material 39

4.1.1. Matérias-primas 39

4.1.2. Membrana 39

4.1.3. Formulações 39

4.1.4. Equipamentos 42

4.2. Métodos 42

4.2.1. Preparo das Fórmulas Utilizadas: 42

4.2.1.1. Gel base (Gel A) 42

4.2.1.2. Gel base com Uréia (Gel B) 43

4.2.1.3. Gel base com extrato vegetal (Gel C) 43

4.2.1.4. Gel base com componentes do NMF (Gel D) 43

4.2.1.5. Gel base com derivado de açúcar (Gel G) 44

4.2.2. Avaliação da Estabilidade 44

4.2.2.1. Estudo da Estabilidade Preliminar ou Acelerada 44

4.2.2.1.1. Estufa 44

4.2.2.1.2. Refrigerador 44

4.2.2.1.3. Luz 45

4.2.2.1.4.Temperatura Ambiente 45

4.2.2.2. Métodos de Avaliação da Estabilidade 45

4.2.2.2.1. Viscosidade Aparente 45

4.2.2.2.2. pH 46

4.2.2.2.3. Centrifugação 46

4.2.2.2.4. Características Organolépticas 47

4.2.2.2.5. Densidade 47

4.2.3 .Avaliação in vitro do comportamento das substâncias hidratantes

utilizando técnicas espectrométricas e termoanalíticas 47

4.2.3.1 Preparação da muda de pele da cobra 47

4.2.3.2 Espectroscopia Raman com transformada de Fourier

(FT-Raman) 48

4.2.3.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 48

4.2.4. Avaliação da Eficácia das Formulações in vivo 49

4.2.4.1. Condições Ambientais Controladas 50

4.2.4.2. Sujeito de Pesquisa 50

4.2.4.2.1. Critérios de Inclusão 50

4.2.4.2.2. Critérios de Não-inclusão 50

4.2.4.3. Condições de Aplicação do Produto 51 4.2.4.4. Determinação da Hidratação cutânea pelo método de

Capacitância 52

4.2.4.5. Avaliação da Perda de Água transepidérmica 53

4.2.5 Planejamento Experimental 54

5. Resultados e Discussão 56 6. Conclusões 133

7. Referências bibliográficas 134

Anexo

1

1. Introdução

Além de ser essencial para a vida, a água é a molécula mais importante da

pele. A capacidade cutânea de retenção hídrica é altamente dependente da sua

camada mais superficial, a camada córnea, bem como de substâncias com poder

higroscópico (COUTEAU, COIFFARD, SÉBILLE-RIVAIN, 2006; RAWLINGS, 2006).

A pele atua na interface entre o corpo e o ambiente, tendo como principal

função a proteção do organismo e, por estar exposta ao meio externo, exerce

expressivo impacto estético e atrativo sobre os indivíduos.

Nela está presente uma barreira que evita a perda de fluidos e eletrólitos para

o ambiente. Ela sofre, entretanto, alterações ao longo do tempo. Fatores exógenos

como, por exemplo, radiação ultravioleta, somados ao envelhecimento intrínseco ou

cronológico, podem resultar em sua degeneração (ELIAS, 2006; CHIU, KIMBALL,

2003).

As alterações fisiológicas associadas ao envelhecimento incluem a redução

da água corpórea, a diminuição da sensação da sede através do sistema nervoso

(hipotálamo), além das alterações plasmáticas na concentração do hormônio

antidiurético, o que pode ocasionar intensa desidratação, muito freqüente em idosos

(BOSSINGAM, CARNELL, CAMPBELL, 2005).

Pode-se tratar, e até mesmo prevenir, os problemas dermatológicos oriundos

da desidratação com o uso de cosméticos. Há uma grande variedade desses

produtos disponíveis no mercado, podendo eles agir por diferentes mecanismos. Os

óleos retardam a perda de água transepidérmica pela capacidade de oclusão. As

substâncias umectantes possuem a capacidade de atrair a água, e assim

conseguem hidratar. No estrato córneo, há a presença de algumas substâncias

umectantes, altamente higroscópicas, que fazem parte do Fator de Hidratação

Natural e também podem ser adicionadas nesses produtos (YOKOTA, MAIBACH,

2006; RAWLINGS, HARDING, 2004).

2

Com o avanço tecnológico e a competitividade entre as indústrias cosméticas,

é possível cada vez mais o desenvolvimento de novos ativos, que prometem

inúmeros benefícios em seus produtos e estão disponíveis no mercado a um custo

elevado.

Porém, entre tantos ativos disponíveis e apelos cosméticos promissores,

deve-se estudar cuidadosamente a eficácia clínica desses produtos, com o intuito de

comprovar cientificamente a veracidade desses apelos, sendo principalmente

importante para o consumidor, que deverá obter o resultado prometido pelo produto,

sem riscos à saúde.

Existem vários métodos disponíveis para verificar a eficácia dos produtos

cosméticos. Pode-se realizar o estudo utilizando cultura de células ou também o

estudo com humanos, sendo esse último mais confiável, por mais se aproximar do

uso do consumidor no dia-a-dia (DYKES, 2002).

A análise em humanos pode ser simplesmente visual, por meio de uma

avaliação sensorial, ou, também, com a utilização de equipamentos capazes de

analisar as alterações, como, por exemplo, usando a videomicroscopia. No entanto,

essas técnicas não são capazes de detectar mudanças sutis na morfologia e função

da pele (RAWLINGS, CANESTRARI, DOBKOWSKI, 2004; HARRIS, 2003).

Com o avanço da tecnologia cosmética, e a fim de se obterem resultados mais

precisos e reprodutíveis, surge então a biometrologia cutânea, cujo objetivo é

estudar as características biológicas, mecânicas e funcionais da pele com a

aplicação de procedimentos científicos não-invasivos, com mínimo desconforto para

o voluntário.

Várias propriedades podem ser mensuradas pelos métodos biofísicos

existentes, tais como a elasticidade cutânea, a hidratação, o teor de gordura, a perda

de água transepidérmica, pH da pele e o relevo cutâneo.

A hidratação cutânea pode ser avaliada por métodos espectroscópicos, como

a ressonância magnética nuclear, ou com aparelhos capazes de medir indiretamente

as propriedades elétricas da camada córnea. Tais métodos podem se basear na

impedância, condutância ou capacitância elétrica da pele.

3

Além de verificar a hidratação, é importante avaliar a integridade da barreira

cutânea, utilizando equipamentos capazes de verificar a percentagem de água que

evapora na superfície da pele. Quando a barreira está danificada, há um aumento na

perda de água transepidérmica (BURACZEWSKA et al., 2007).

Devido à vasta opção de produtos no mercado cosmético com o apelo de

hidratação, no presente trabalho a proposição foi avaliar formulações que contêm

alguns novos ativos e a uréia tradicional, por meio de métodos biofísicos existentes,

que permitem avaliar /in vivo/ a hidratação cutânea e, igualmente, a perda de água

transepidérmica.

4

2. Revisão Bibliográfica

2.1.Importância da Pele no Mecanismo de Hidratação 2.1.1. Estrutura e Funções da Pele

Para entender como agem os hidratantes, faz-se necessário estudar a

estrutura e a fisiologia da pele, local de ação destes produtos, ressaltando que um

produto cosmético deve ter alta eficácia e baixa toxicidade sistêmica, devendo

permanecer na pele e não alcançar a corrente sangüínea. A interação entre os

componentes das formulações hidratantes deve ser muito bem estudada e

conhecida, a fim de que se possa obter uma formulação estável e eficaz sobre a

cútis (LODÉN, 2003; LEONARDI, 2004).

Considerada o maior e também um dos mais complexos órgãos do corpo

humano, a pele é o único órgão que pode ser totalmente visualizado no meio

externo, possuindo uma área de superfície maior que 2 m2 (OREN, BARTEK, 2007;

AHMAD, MUKHTAR, 2004; HENDRIKS et al., 2004).

Ela é formada por uma dupla camada que divide o organismo do ambiente e

está dividida em duas principais estruturas: epiderme e derme. A hipoderme está

localizada abaixo da derme e é considerada um tecido subcutâneo de reserva. Essas

camadas podem ser visualizadas na Figura 1 (YOUNG, 2006; YIER, KIEVSKY,

SOKOLOV, 2007; VERMA et al., 2003).

A pele é responsável por aproximadamente 12% do peso corporal, podendo a

sua espessura ser de até 2 mm, em áreas como palmas das mãos e planta dos pés

e de apenas 0,5 mm, na região dos olhos (IOBST, SANTHANAM, WEINKAUF,

2006).

5

Figura 1. Camadas da Pele. Disponível em < www.scf-

online.com/english/27_e/frontpage27_e.htm > Acesso em 09.10.07.

2.1.1.1. Epiderme

A camada mais externa, denominada epiderme, é avascular e impermeável

devido à presença, no espaço intercelular, de lipídeos como colesterol, ésteres e

ceramidas (IOBST, SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

A região superficial da epiderme apresenta somente 10-20 micrômetros de

espessura. É a barreira primária da absorção percutânea e também da perda de

água transepidérmica (BOUWSTRA, PILGRAN, PONEC, 2006).

Substâncias químicas, com exceção da água, só conseguem permear a pele

através das camadas lipídicas presentes entre as células. Esse mecanismo permite

que essa camada seja nutrida pela derme por capilaridade (BENY, 2000; HARRIS,

2003).

A epiderme é um tecido dinâmico que está constantemente em auto-

renovação, sendo a perda de células pela superfície do estrato córneo balanceada

pelo crescimento de células nas camadas inferiores da epiderme. Essa camada é

mantida por células-tronco pluripotentes que residem na camada basal e estão

presentes durante a vida inteira (KOCH, ROOP, ZHOU, 2006).

Cada camada da epiderme é definida pela posição, forma, morfologia e

estado de diferenciação dos queratinócitos. Podem ser distinguidas cinco camadas

da epiderme, conforme se observa na Figura 2 (BOUWSTRA, PILGRAN, PONEC,

2006; HARRIS, 2003; LEONARDI, 2004).

6

Figura 2. Camadas da Epiderme (RAWLINGS; HARDIND, 2004).

O estrato basal, ou germinativo, é composto por uma única fileira de células

cúbicas ou cilíndricas, conhecidas como queratinócitos basais, que estão em

constante divisão, dando origem às camadas epidérmicas restantes. Essas células

recém produzidas migram para a superfície com a finalidade de substituir as que

descamam, contribuindo com os processos de queratinização ou de renovação do

estrato córneo. O processo de migração usualmente ocorre em 28 dias (IOBST,

SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

Essa camada basal é uma barreira permeável que dá suporte à epiderme e

estabelece união com a derme. Na camada basal, também estão presentes os

melanócitos, responsáveis pela síntese de melanina, que, por sua vez, garante a

pigmentação da pele e proteção contra a radiação ultravioleta (BENY, 2000;

LEONARDI, 2004).

O estrato espinhoso possui células poligonais cubóides, de núcleo central com

pequenas expansões citoplasmáticas que se unem por desmossomas, dando à

célula um aspecto espinhoso. É o local onde se inicia o processo de queratinização,

por meio de pequenos filamentos de queratina que atravessam o citoplasma das

células, unindo-as a suas vizinhas. Há formação dos corpos lamelares, responsáveis

pela formação do manto hidrolipídico, assim como dos grânulos de querato-hialina

(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 1995; HARRIS, 2003).

7

O estrato granuloso contém células poligonais com núcleo central, cujo

citoplasma está repleto de grânulos de queratina. Após a maturação celular, há

perda do núcleo e achatamento dos queratinócitos, formando-se placas de queratina

(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 1995).

O estrato lúcido é uma camada intermediária muito fina que contém células

com o processo de queratinização bem avançado. Essa camada pode ser

encontrada apenas nas regiões em que a camada córnea é espessa (GASSER,

MAZZARINO, DJIAN, 2004).

O estrato córneo, cujas células são aplanadas e anucleadas, constituídas em

sua maior parte por uma proteína fibrosa denominada queratina, é a camada mais

superficial da epiderme. Pode ser definido como um mosaico de várias camadas,

composto por “tijolos” hidrofílicos (corneócitos) e “cimento” hidrofóbico (estruturas

lipídicas). A capacidade do estrato córneo em evitar a perda de água corpórea e

reter água nos corneócitos é devida à sua composição e arquitetura (BENY, 2000;

RAWLINGS, 2006).

O Fator de Hidratação Natural (FHN), que representa de 15 a 20% do peso

total do estrato córneo, é composto de substâncias umectantes, que são geradas no

estrato córneo. Este é responsável por manter a hidratação da pele, em razão de sua

capacidade de atração e retenção da água, ou seja, pela higroscopicidade. Essas

substâncias previnem a evaporação hídrica por meio da ligação molecular com a

água. A composição do FHN está demonstrada no Quadro 1 (LODÉN, 2003; MAC-

MARY et al., 2006).

8

Quadro 1 – Composição Química do FHN (RAWLINGS, 2006).

Constituintes Concentração (%)

Aminoácidos 40,0

Ácido pirrolidono-carboxílico 12,0

Lactato 12,0

Uréia 7,0

Açúcares 8,5

Cloro 6,0

Sódio 5,0

Potássio 4,0

Amônia, ácido úrico, glicosamina e creatina 1,5

Cálcio 1,5

Magnésio 1,5

Fosfato 0,5

Citrato 0,5

O estrato córneo é a barreira de proteção da pele, constituindo notável

importância para a manutenção da hidratação cutânea. Os corneócitos retêm água

tanto da derme quanto do ambiente, visando conservar o estado saudável e a

maciez da pele (BENY, 2000; LEONARDI, 2004; MAC-MARY et al., 2006).

2.1.1.2. Derme

A Derme está situada abaixo da epiderme, sendo separada por uma

membrana basal. É formada por um tecido conjuntivo, constituído de vasos e nervos,

tecido este responsável pelo suporte estrutural da pele e pela nutrição da epiderme e

de seus apêndices, além de proteger o corpo contra lesões mecânicas. Em seu

interior, há glândulas sebáceas, raízes dos pêlos e músculos (HERNANDEZ,

FRESNEL, 1999; HARRIS, 2003; MAC-MARY et al., 2006).

9

Os fibroblastos são as células mais freqüentes na derme e têm como função

primária elaborar a rede de fibras. Ao redor das células e fibras existem

mucopolissacarídeos, glicosaminoglicanas e água (IOBST, SANTHANAM,

WEINKAUF, 2006).

As glicosaminoglicanas são macromoléculas formadas principalmente pelo

ácido hialurônico e pelo condroitinsulfato, que possuem a capacidade de retenção

hídrica. O ácido hialurônico, quando submetido à hidrólise, promove diminuição da

viscosidade das glicosaminoglicanas, o que é de suma importância para fins

medicamentosos, pois meios menos viscosos facilitam a penetração dos ativos

(LEONARDI, 2004).

As fibras têm função de unir a epiderme e a derme. Fibras elásticas, formadas

por elastina, interceptam as bandas de colágeno. Essa rede de fibras confere

propriedades mecânicas para a pele; o colágeno fornece à pele resistência frente à

força mecânica e as fibras elásticas restabelecem a forma após deformação

(HARRIS, 2003; IOBST, SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

As fibras de colágeno e elastina apresentam tempo de meia-vida de 60 e 180

dias respectivamente e são degradadas por enzimas específicas: a colagenase e a

elastase. Tais enzimas são produzidas em excesso quando a pele é exposta à luz

solar, ocasionando a aceleração do envelhecimento (LEONARDI, 2004).

Portanto, a derme atua como suporte físico e fisiológico para a epiderme. Ela

gera firmeza, força e propriedades elásticas para a pele, garantindo, também,

suporte para as estruturas anexas, vasculares e nervosas. A epiderme, sendo

avascular, é suprida com nutrientes oriundos da derme. Também atua como

repositório dos fatores de crescimento, enzimas etc. (IOBST, SANTHANAM,

WEINKAUF, 2006).

2.1.1.3. Hipoderme

A hipoderme exerce função no isolamento térmico e na proteção mecânica

contra choques externos e, dependendo da sua localização, possui camada variável

10

de tecido adiposo (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 1995; BENY, 2000; HARRIS, 2003;

LEONARDI, 2004; IOBST, SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

Está envolvida com a lipogênse, armazenamento da gordura e lipólise, sendo

influenciada por fatores nutricionais e hormonais (HERNANDEZ, FRESNEL, 1999;

HARRIS, 2003).

2.1.1.4. Funções da Pele

A junção dessas diferentes camadas determina as várias funções que esse

órgão possui. A pele atua primariamente na interface entre o corpo e o ambiente,

tendo como principal função a proteção (ELIAS, 2007).

A camada mais externa da epiderme é feita de células mortas, imperceptíveis,

designadas para resistir ao estresse mecânico. Está envolvida firmemente com

células lisas, cimentadas por lipídeos e proteínas que servem como uma barreira

impermeável para o ambiente, garantindo a proteção da pele contra injúrias químicas

e biológicas. A ação protetora contra raios solares ultravioleta, causadores do foto-

envelhecimento cutâneo, é garantida pelos melanócitos, que têm uma importante

função em transferir melanina para os queratinócitos basais (IOBST, SANTHANAM,

WEINKAUF, 2006).

Sensibilidade ao toque, à dor e à temperatura representa uma função

importante para a manutenção do equilíbrio fisiológico, já que a pele é a estrutura

que viabiliza o contato do organismo com o meio externo. Tal propriedade permite a

captação de estímulos nervosos, transmitindo-os ao sistema nervoso central, que

responde ao estímulo, fornecendo ao organismo as ferramentas necessárias para

reagir de acordo com determinada situação (SHAI, MAIBACH, BARAN, 2001).

Outra importante função da pele é a termorregulação. Quando exposta a altas

temperaturas ou atividades físicas árduas, há então a secreção de suor, formada por

uma solução diluída de sal, que esfria a pele quando evapora na superfície. A

microcirculação também ajuda a controlar o calor por meio das artérias cutâneas

presentes na derme (IOBST, SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

11

A secreção de sebo, pelas glândulas sebáceas, juntamente com o suor, pelas

glândulas sudoríparas, formam a emulsão natural da pele, importante para a

manutenção da hidratação (HERNANDEZ, FRESNEL, 1999; INOUE, 2006).

A pele ainda apresenta um mecanismo de eliminação de substâncias nocivas

e tem capacidade de se regenerar facilmente, além de apresentar, também, ação

imunológica devido à presença de células de Langerhans (que, após o contato com

alérgenos, tumores e microrganismos, emitem um sinal sensibilizante para iniciar a

resposta imune mediada pelas células T) (PYHN, SANTOS, 2002; IOBST,

SANTHANAM, WEINKAUF, 2006).

A absorção de fármacos pela camada córnea e pelos folículos pilossebáceos

permite que formulações terapêuticas cutâneas possam ser administradas com

vantagem pelo paciente, em formas como fitas adesivas transepidérmicas. Essa

absorção será influenciada pela integridade e espessura da epiderme, hidratação do

estrato córneo, coeficiente de lipossolubilidade, vasodilatação, e ações mecânicas e

elétricas (HERNANDEZ, FRESNEL, 1999).

Restringindo-se à epiderme, sua principal função é prover e manter a

hidratação. A hidratação dos corneócitos é essencial para a função do estrato

córneo. A água é retida na superfície da pele e o estrato córneo previne a sua perda,

sendo a água presente nessa camada um determinante importante da aparência e

propriedades físicas da pele, incluindo flexibilidade. Lipídeos da superfície da pele,

que são derivados das glândulas sebáceas, possuem um papel importante na

hidratação cutânea (RAWLINGS, 2006, INOUE, 2006).

2.1.2. Permeabilidade da Barreira Cutânea

Embora o estrato córneo seja reconhecido como a barreira física mais

importante, as camadas mais baixas da epiderme também são significantes na

função de barreira (BRANDNER, PROKSCH, 2006; MAC-MARY et al., 2006).

A permeabilidade é influenciada pela organização dos lipídios extracelulares

do estrato córneo, visando à formação de uma barreira protetora que previne a perda

de fluidos e eletrólitos (ELIAS, 2006).

12

A secreção de lipídeos nos corpos lamelares não forma uma barreira efetiva.

É necessária a acidificação, pois a concentração de H+ no estrato córneo ativa ou

inibe enzimas específicas pH-sensíveis para estabelecer a permeabilidade e a

integridade do estrato córneo (MAURO, 2006).

O estresse psicológico traz conseqüências negativas para a epiderme, pois

verifica-se a redução de sua permeabilidade com o aumento dos glicocorticóides

endógenos (ELIAS, 2007).

Devido à relativa complexidade da pele humana e muitas moléculas de

interesse para penetrar através dela, deve-se estudar cuidadosamente a sua

permeabilidade (FITZPATRICK, CORISH, HAYES, 2004).

As substâncias podem permear na pele por difusão do ativo, pelos folículos

sebáceos, ou, ainda, pelos queratinócitos. A permeabilidade pode ser influenciada

pelo tamanho da molécula; lipofilicidade do ativo; tipo de formulação; além do estado

físico do estrato córneo, pois verifica-se que a penetração se torna mais fácil quando

o estrato córneo é pouco espesso (LODÉN, 2003; BENY, 2000; LEONARDI, 2004;

VERMA et al., 2003).

O veículo utilizado na formulação também tem papel fundamental na

permeação cutânea. Há alguns veículos que podem ser considerados facilitadores

de permeação, como o ácido láctico, uréia, tensoativos, entre outros. Essas

substâncias interagem com o estrato córneo, alteram sua estrutura de forma

reversível e assim conseguem promover a liberação dos ativos (LEONARDI, 2004).

A permeabilidade cutânea também pode ser alterada pelo grau de hidratação

do estrato córneo. A pele hidratada tem maior flexibilidade e elasticidade, o que

facilita a entrada de substâncias. A hidratação excessiva aumenta a permeabilidade,

podendo ser uma metodologia para melhorar a biodisponibilidade de fármacos por

essa via (ESPOSITO et al., 2007).

Utilizando métodos físicos, como o ultra-som (fonoforese ou sonoforese) e a

corrente galvânica (iontoforese), consegue-se melhorar a permeação de substâncias

na pele. Vibrações de alta freqüência, como no ultra-som, ajudam na penetração de

ativos através do efeito térmico e vasodilatador. Na iontoforese, a substância ativa

deve estar na forma iônica, carregada de cargas elétricas negativas ou positivas para

13

exercer efeito na permeabilidade a partir do princípio da Física de atração e repulsão

(ROSSI, VERGANINI, 2000).

2.1.3. Formação da Barreira Hidrolipídica Cutânea

A barreira cutânea se desenvolve durante a fase embrionária e é

estabelecida, aproximadamente, na 34ª semana de gestação. As crianças

prematuras apresentam aumento na perda de água transepidérmica, estando, desta

maneira, altamente suscetíveis às infecções (KOCH, ROOP, ZHOU, 2006).

A barreira cutânea é renovada de maneira contínua e organizada. O processo

de queratinização é iniciado quando a barreira sofre agressões para recompô-la.

Este processo nada mais é do que uma renovação ou diferenciação celular que leva

à formação da camada córnea. Onde quer que o estrato córneo seja severamente

danificado, a epiderme rapidamente restaura a função da barreira, em

aproximadamente 4 dias (GERARD, MARTINI, CHIVOT, 1998; HARRIS, 2003;

TAGAMI, KIKUCHI, 2006).

O uso de tensoativos reduz a força da barreira hidratante natural. Os sabões

podem fragilizar a barreira, além de retirar os lipídeos da superfície da pele

(RAWLINGS, 2006).

Os corpos lamelares aparecem nas células granulares e têm importante

função na formação do estrato córneo. São formados por organelas ovais

enriquecidas principalmente com lipídeos polares e enzimas catabólicas, que

fornecem os lipídeos necessários para a formação do estrato córneo (BOUWSTRA,

PILGRAN, PONEC, 2006).

Possivelmente, a estratificação é sinalizada por alteração no gradiente de

concentração de cálcio entre as diferentes camadas. A camada basal contém menor

quantidade de íons cálcio e, quando ocorre o processo de estratificação ou

queratinização, essa concentração aumenta, estimulando a secreção dos corpos

lamelares (GERARD, MARTINI, CHIVOT, 1998; HARRIS, 2003; LODÉN, 2003).

Os corpos lamelares se movem para o ápice e, na periferia das células

granulares, aderem à membrana plasmática e secretam o conteúdo dentro dos

14

espaços intracelulares por exocitose. Os lipídeos derivados dos corpos lamelares

são modificados e rearranjados dentro da lamela intercelular. Esses corpos

lamelares servem como carreadores dos precursores de lipídeos da barreira

cutânea, formados principalmente por glicoesfingolipídeos, esteróis livres e

fosfolipídeos. A hidrólise dos glicolipídeos gera ceramidas, ao passo que os

fosfolipídeos são convertidos em ácidos graxos livres. Tal cascata de reações é

ilustrada na Figura 3 (BOUWSTRA, PILGRAN, PONEC, 2006).

Figura 3. Cascata bioquímica na recuperação da barreira (HARRIS, 2003)

15

A formação da barreira cutânea também envolve a presença de várias

enzimas pH-dependentes, principalmente para a descamação, denominadas

hidrolases. No estrato granuloso, há a liberação de hidrolases ácidas dos corpos

lamelares para a diferenciação dos queratinócitos. Várias investigações têm revelado

que pH baixo no espaço extracelular tem uma importante função na regulação da

atividade enzimática, especialmente na queratinização e regeneração da barreira

(SCHMID-WENDTNER, KORTING, 2006). Segundo Lóden (2003), mudanças

extremas do pH da pele estimulam a queratinização, atuando como um sistema de

defesa do organismo.

Existem diversos fatores que modificam a queratinização, como por exemplo,

radiação solar, ação de detergentes, massagem cutânea e cicatrização. A radiação

solar ativa os queratinócitos da camada basal, que, por sua vez, promove a migração

de células para a camada córnea, resultando em espessamento desta última

camada. A massagem cutânea tem capacidade de estimular a atividade das células

germinativas, contribuindo para o processo de queratinização (GERARD, MARTINI,

CHIVOT, 1998).

2.2. Hidratação Cutânea 2.2.1.Desidratação

Descamação, prurido, opacificação, vermelhidão, rachaduras e repuxamento

da pele são sintomas clínicos característicos de pele seca ou xerose (Figura 4).

Essas modificações cutâneas podem ser notadas visualmente ou pelo tato (ROSSI,

VERGNANINI, 1997; LODÉN, 2003).

Diversos fatores fisiopatológicos alteram a integridade da barreira cutânea,

como, por exemplo: mudanças no estrato córneo, anormalidades no processo de

queratinização, alterações dos lipídeos intercelulares e do filme hidrolipídico,

rompimento do metabolismo de água transepidérmica e mudanças do pH cutâneo

(PONS-GUIRAUD, 2007).

A xerose pode ser influenciada por: fatores genéticos, devido a desordens na

estrutura e função da epiderme; fatores ambientais, como umidade e temperatura

16

baixas; e por fatores comportamentais, por meio da exposição a produtos químicos,

como tensoativos, ácidos e bases, entre outros. Também pode ocorrer xerose como

conseqüência da falta de adaptação aos produtos cosméticos (COUTEAU,

COIFFARD, SÉBILLE-RIVAIN, 2006; LODÉN, 2005).

A xerose é caracterizada pela diminuição da água contida no estrato córneo,

ocasionando uma descamação anormal dos corneócitos que perdem a coesividade.

A xerose não altera a quantidade total de lipídios do estrato córneo, porém há a

diminuição na proporção de lipídios neutros e aumento na quantidade de ácidos

graxos livres associados à severidade da desidratação (INOUE, 2006; LODÉN,

2003).

Com essa alteração, o pH cutâneo também é prejudicado. Entretanto, a

acidez natural da pele é essencial para manter a atividade inibitória contra bactérias

patogênicas (PONS-GUIRAUD, 2007). A epiderme se desidrata devido às desordens no processo de queratinização

e à diminuição do conteúdo de água do estrato córneo abaixo de 10%, cuja causa

pode ser devida ao desequilíbrio entre a evaporação e a reposição de água pelas

camadas inferiores (ROSSI, VERGNANINI, 1997; PONS-GUIRAUD, 2007).

A derme também se desidrata no decorrer do envelhecimento cutâneo. As

macromoléculas hidratáveis, como o ácido hialurônico da matriz intercelular, se

ramificam e o teor da derme na água extracelular diminui, devido à diminuição da

produção de profilagrina, precursora do FHN - Fator de Hidratação Natural

(HERNANDEZ, FRESNEL, 1999; LODÉN, 2003).

Fatores ambientais, temperatura corporal, uso de produtos tópicos e alguns

fatores endógenos podem alterar a membrana dos corneócitos, acarretando em

perda da capacidade de retenção dos componentes do FHN, que são responsáveis

por reter água no estrato córneo. Como conseqüência, ocorre aumento da perda de

água transepidérmica (TEWL), podendo resultar em desidratação cutânea (ROSSI,

VERGNANINI, 1997; HERNANDEZ, FRESNEL, 1999; SHAI, MAIBACH, BARAN,

2001; HARRIS, 2003).

A desidratação é mais profunda a partir dos cinqüenta anos devido à genética,

à redução quantitativa das proteínas responsáveis pela manutenção da hidratação e

17

à morte celular. Ou seja, o envelhecimento traz danos ao manto hidrolipídico, que,

por sua vez, perde gradativamente sua função protetora (RIEGER, 1996;

HERNANDEZ, FRESNEL, 1999).

Figura 4. Xerose (PONS-GUIRAUD, 2007).

Para manter as funções da pele discutidas anteriormente, a hidratação

cutânea torna-se indispensável, visto que a pele desidratada causa danos à

integridade da barreira hidrolipídica, responsável pela homeostase cutânea (BENY,

2000).

A manutenção da hidratação cutânea, bem como a capacidade de renovação

celular do organismo, atuam de maneira expressiva na conservação da saúde,

maciez, flexibilidade, elasticidade e jovialidade cutânea (LEONARDI, 2004).

2.2.2. Mecanismos de Hidratação

Todas as células viáveis necessitam de água para exercer suas funções e

para a sobrevivência humana, devendo a perda de água através da pele ser

cuidadosamente regulada (RAWLINGS, 2006).

18

A água atua como um polímero fisiológico no estrato córneo e vários fatores

influenciam o estado de hidratação, tais como: a percentagem em que a água

alcança o estrato córneo (a partir dos tecidos abaixo); a percentagem de água

perdida na superfície por evaporação; e a habilidade do estrato córneo em reter

água (RAWLINGS, 2006). Segundo Paula (2001), a quantidade e a qualidade do

fator de hidratação natural e do sebo cutâneo também interferem no grau de

hidratação.

A pele humana de um adulto contém aproximadamente 70% de água, porém

ela não está uniformemente distribuída nas diferentes camadas. A maior parte se

encontra na derme, em razão da ação das glicosaminoglicanas (GIRARD, BERAUD,

SIVENT, 2000).

Na pele normal, o nível de água do estrato córneo reduz gradualmente em

direção à superfície. O predomínio de substâncias hidrofóbicas no espaço

intercelular é um fator regulatório importante que retarda a desidratação do

corneócito e assegura a atividade enzimática (PONS-GUIRAUD, 2007).

O estado de hidratação da camada córnea varia de acordo com a quantidade

de água nela presente, com o transporte de água das camadas inferiores, com a

velocidade de evaporação e de queratinização, além de variar conforme a

quantidade e a composição da emulsão epicutânea. A capacidade de retenção de

água pelo estrato córneo está relacionada à quantidade e à qualidade dos fatores de

hidratação natural e dos lipídios, principais responsáveis pela impermeabilização

(ROSSI, VERGNANINI, 1997).

Portanto, para evitar a desidratação é necessário manter a integridade da

barreira cutânea. Existem diferentes mecanismos de hidratação que atuam na

proteção da barreira hidrolipídica. Dentre eles podemos citar: oclusão, umectação e

hidratação ativa (HERNANDEZ, FRESNEL, 1999; SHAI, MAIBACH, BARAN, 2001).

O mecanismo de oclusão é alcançado por meio do uso de substâncias

oleosas, que produzem uma fina camada de óleo sobre a pele, o que enriquece a

ação do manto hidrolipídico e retarda a evaporação da água. Estas substâncias

emolientes produzem mais efeito quando aplicadas na pele após o banho, tendo em

vista que apreendem a água no estrato córneo. Tais substâncias conferem maciez e

19

aspecto aveludado à cútis. São exemplos dessas substâncias: a lanolina, o miristato

de isopropila e o óleo mineral (SHAI, MAIBACH, BARAN, 2001; YOKOTA,

MAIBACH, 2006).

A absorção hídrica é conferida pela ação dos umectantes, que atraem e retêm

a água tanto do ambiente quanto da derme (RAWLINGS, CANESTRARI,

DOBKOWSKI, 2004). Dentre eles, podemos citar: sorbitol, glicerol, propilenoglicol,

glicosaminoglicano, elastina e colágeno. O uso destes é debatido, pois, em

ambientes secos, tais componentes podem absorver água da pele, aumentando o

ressecamento desta. Portanto, seu uso é mais indicado em ambientes úmidos (SHAI,

MAIBACH, BARAN, 2001).

Ingredientes intracelulares com capacidade higroscópica, como os

constituintes do FHN, têm capacidade de promover hidratação ativa, conhecida

como hidratação terapêutica, por meio da reposição desses componentes. Tais

componentes são freqüentemente prescritos no tratamento de xerose, ou pele seca,

por serem semelhantes estruturalmente às substâncias naturais do estrato córneo,

resultando em maior compatibilidade com as células epiteliais e conseqüente

melhora dos resultados terapêuticos ou até mesmo estéticos (ROSSI, VERGNANINI,

1997; PADAMWAR et al., 2005).

2.2.3. Produtos hidratantes 2.2.3.1. Componentes do FHN (Fator de Hidratação Natural)

O FHN está presente nos corneócitos em altas concentrações e é composto

de substâncias umectantes, intensamente higroscópicas e por meio das quais a

água intracelular é retida. Assim, as camadas mais externas do estrato córneo

conseguem hidratação suficiente para evitar a ação desidratante do ambiente. Os

constituintes do FHN estão descritos no Quadro 1 (RAWLINGS, 2006).

Nem todos os umectantes são integrantes do FHN, como a glicerina e o ácido

hialurônico, que não o integram. Dependendo do peso molecular, eles permeiam a

pele ou permanecem na superfície cutânea. A maioria dos umectantes é formada por

moléculas de baixo peso molecular (LODÉN, 2003; FLYN, 2004).

20

Uma das substâncias mais solúveis no estrato córneo, a uréia, vem sendo

freqüentemente empregada em tratamentos cosméticos e dermatológicos. Tal

substância tem propriedades queratolítica ou queraplástica, dependendo de sua

concentração. Soluções contendo 20% de uréia têm mostrado redução em coceiras,

ao passo que para tratamento de ictiose e hiperqueratose deve ser usada na

concentração de 10%, em emulsões (LODÉN, 2003).

A uréia é encontrada naturalmente nos corneócitos a 1%. Também está

presente na urina, em concentração média de 2%, na qual é hidrolisada em amônia

e dióxido de carbono. Pode ser utilizada no tratamento de pele seca em formulações

cosméticas, em concentrações que variam de 3 a 5% (VIGLIOGLIA, RUBIN, 1989;

LODÉN, 2003).

A glicerina é outro umectante importante utilizado em produtos cosméticos.

Pode ser usada na forma de emulsões em altas concentrações, como 20%, e não

causar efeitos adversos (LODÉN, 2003). Estudos mostram que uma única aplicação

de solução aquosa de glicerina em pele normal reduz a perda transepidérmica de

água (TEWL) por algumas horas, já a sua aplicação a 20%, em emulsões, não

proporcionou efeitos significativos sobre a TEWL (LODÉN et al., 2001).

Segundo Lodén et al. (2001), após testes comparativos in vivo entre a uréia e

a glicerina, a primeira resultou em maior redução na perda transepidérmica de água

em pacientes com dermatite atópica em relação à segunda. Portanto, a uréia

apresentou-se mais eficaz no tratamento de pele seca do que a glicerina. Entretanto,

a medida da capacitância da superfície cutânea não mostrou diferenças significativas

entre as áreas tratadas com uréia e glicerina. Estudos realizados por Lodén et al.

(2002), mostraram que não há diferenças significativas entre uréia e glicerina no

tratamento de dermatites atópicas.

2.2.3.2. Emolientes

Os emolientes são substâncias líquidas na temperatura ambiente que

suavizam e amaciam a pele. Representados pelos óleos, especialmente os vegetais,

os emolientes são freqüentemente utilizados nas formulações para melhorar a

21

espalhabilidade do produto e melhorar o sensorial cutâneo. Além disto, certamente

os lipídios geram benefícios ao tecido cutâneo, uma vez serem os principais

constituintes das membranas celulares e, também, responsáveis por manter o nível

de água adequado no estrato córneo, permitindo, desta forma, maior flexibilidade

(MAC-MARY et al., 2006; LEONARDI, 2004).

Os emolientes auxiliam na função da impermeabilização da barreira

hidrolipídica, resultando em uma maior quantidade de água retida e permitindo a

hidratação e a melhora da aparência do estrato córneo. Conforme anteriormente

exposto, a presença de umidade no interior das células córneas mantém a

elasticidade, a flexibilidade e a maciez da pele (HERNANDEZ, FRESNEL, 1999;

SHAI, MAIBACH, BARAN, 2001; LEONARDI, 2004; RAWLINGS, CANESTRARI,

DOBKOWSKI, 2004).

O estrato córneo contém, naturalmente, substâncias emolientes como

ceramidas, ácidos graxos livres e colesterol. Os óleos vegetais vêm sendo

constantemente empregados em formulações de uso tópico em virtude de terem em

sua composição ácidos graxos semelhantes aos encontrados na epiderme

(LEONARDI, 2004).

2.2.3.3. Extrato Vegetal

Desde 7000 a.C., a humanidade vem se utilizando da química das plantas na

produção de óleos emolientes, xampus, cremes e medicamentos. Com o auxílio da

tecnologia e de avançadas pesquisas científicas, os benefícios de matérias-primas

desse tipo em produtos de beleza estão sendo explorados com maior eficiência. As

novas descobertas podem aumentar os benefícios de cada óleo ou extrato vegetal,

já que cada um pode conter centenas de componentes e substâncias orgânicas com

finalidades diferentes (WILLCOX, 1993).

O uso de plantas e seus extratos revolucionou a química cosmética moderna,

pois o uso de muitas preparações cosméticas com produtos sintéticos ocasionou

situações graves de reações na pele. (CUNHA, SILVA, 2004).

Atualmente, há uma tendência pela utilização de produtos vegetais, devido ao

forte apelo de consciência ambiental e à diversificada fonte de substâncias ativas

22

que tais produtos apresentam, muitas delas ainda inexploradas, encontradas em

abundância na natureza, o que incentiva as empresas cosméticas a buscarem novos

ingredientes (BLOISE, 2003; OLIVEIRA, 2003; SILVA, 2003).

Adicionalmente, os extratos vegetais são utilizados por razões de marketing,

visto que a mensagem do efeito dos “ingredientes naturais” é muito mais

compreendida pelo consumidor (LODÉN, 2005).

Os extratos vegetais são os ativos mais utilizados na formulação de produtos

para a pele e para o cabelo. No setor de produtos destinados ao tratamento cutâneo

os extratos podem hidratar, suavizar e reestruturar a pele (WERNER, 2004).

Os diferentes componentes vegetais, assim como qualquer outro ativo, atuam

de maneira particular para alcançar um objetivo em comum. Por exemplo, o extrato

do vegetal Imperata cylindrica é vendido no mercado com o apelo de hidratar a pele

por um período de 24 horas devido a um componente osmoregulador celular. Já a

trealose, um dissacarídeo encontrado em plantas do deserto, é comercializada com

o apelo de aumentar o nível de hidratação natural da pele por preservar a

integridade morfológica das membranas biológicas, minimizando a perda de água

transepidérmica (CRODA).

Porém, nem todas as plantas possuem os requisitos necessários para serem

utilizadas como ativos cosméticos. Existem extratos vegetais altamente tóxicos e

irritantes à cútis. Por isto, testes dermatológicos e toxicológicos são indispensáveis

para evitar danos à pele (WERNER, 2004).

As variações dos processos de produção, estações do ano e formas de cultivo

limitam a utilização desses ingredientes nos produtos cosméticos. Há, também, a

necessidade de se estabelecer condições ótimas e concentrações de estabilidade e

eficácia clínica desses produtos (CHIU, KIMBALL, 2003; LODÉN, 2005).

A seleção do material vegetal bruto, a validação do processo de extração do

ativo e a produção destes ativos com controle analítico rígido e eficaz são pré-

requisitos indispensáveis para garantir a qualidade do produto cosmético final

(WERNER, 2004).

23

2.2.3.4. Derivados de Açúcares

Os carboidratos, devido ao grande número de grupos hidroxila, interagem

fortemente com a água (LIU et al., 1997). Tem-se verificado que alguns açúcares

podem ser usados como tensoativos em produtos cosméticos, como é o caso, a

título exemplificativo, do raminosídeo. Estudos com esse açúcar em novas

formulações apresentaram cosméticos com alto poder de hidratação e de rápida

penetração cutânea (HOLMONT et al., 2001).

Outros açúcares, como o sorbitol e a tagatose, têm sido adicionados em

preparações cosméticas, principalmente em cremes dentais, devido às propriedades

umectantes, além de garantirem um sabor agradável aos produtos (LU, 2001).

Combinando-se, em um mesmo produto, lipídeos e açúcares com poder

umectante, como a trealose, faz-se possível aumentar grandemente a hidratação do

estrato córneo. Verificou-se, em um estudo, que a capacitância da pele aumentou

cerca de 40%, enquanto a perda de água transepidérmica reduziu 15% em duas

semanas com o uso dessas substâncias. Pôde-se constatar, igualmente, o reparo da

barreira cutânea por conta da restauração dos lipídeos da matriz extracelular, bem

como o efeito imediato na hidratação cutânea (GUGLIELMINI, BERARDESCA,

2007).

Segundo Kim et al. (2005), um polissacarídeo contendo frutose produzido pela

bactéria anaeróbia Zymomonas mobilis apresentou efeito hidratante semelhante ao

ácido hialurônico.

Os carboidratos, a exemplo das enzimas, exercem papel importante na

barreira cutânea. A enzima glicosidase é capaz de converter a glicosilceramida em

ceramida, passo indispensável no desenvolvimento e maturação dos lipídeos que

estabelecem a barreira cutânea. Devido a esse conceito, os derivados de açúcar

estão sendo amplamente explorados e já patenteados com o apelo de estimular as

glicosidades. Quando essas enzimas estão estimuladas, favorecem o aumento dos

lipídeos, promovendo, conseqüentemente, uma melhora na função da barreira

cutânea (BRUNO, 2004).

24

2.2.3.5. Silício Orgânico

O silício é um oligoelemento constituinte das glicosaminoglicanas e está

firmemente ligado à matriz polissacarídica. No ser humano, o silício e seus derivados

são encontrados principalmente no tecido conectivo, sendo essenciais para o

crescimento normal do indivíduo (SCHWARZ, 1977).

Os derivados do silício orgânico, também chamados silanóis, são

responsáveis pelo metabolismo de regeneração e pela divisão celular. Como são

patentes, não temos muitas referencias. Promovem, inclusive, a hidratação da

epiderme e da derme, em razão da habilidade de manter a água ligada aos tecidos

(PAILLET, 2000).

O envelhecimento diminui o teor de silício, acarretando em desestruturação do

tecido conjuntivo. A reposição do silício no tecido dérmico é feita na forma de silício

orgânico; biologicamente ativo. O silício orgânico atua diretamente sobre o

metabolismo celular, estimulando a biosíntese das fibras de colágeno, elastina e

proteoglicanas, conferindo firmeza e tonicidade aos tecidos. Isto ocorre devido à

estimulação das citocinas, mensageiras da comunicação celular entre os

queratinócitos e fibroblastos. Além do mais, tal oligoelemento reforça a membrana

celular, tornando-a mais resistente ao ataque dos radicais livres responsáveis pela

aceleração do envelhecimento (EXSIMOL).

Na epiderme, o silício está situado nas camadas queratinizadas, contribuindo

para a proliferação e diferenciação dos queratinócitos. Na derme, ele participa de

macromoléculas que sintetizam fibroblastos. Os silanóis são elementos constitutivos

da matriz extracelular e apresentam vários grupos hidroxilas. Estão envolvidos na

regulação do metabolismo dos tecidos, assim como na restauração da homeostase e

na comunicação celular. Apresentam, ainda, propriedades contra o envelhecimento

cutâneo por conta da proteção face os efeitos dos radicais livres, além de garantirem

firmeza, suavidade e hidratação cutânea (PAILLET, 2000).

25

A hidratação cutânea natural é dependente do bom funcionamento do

metabolismo celular. Deste modo, quando o metabolismo sofre danos, a hidratação

cutânea é afetada, de modo que a suplementação de silício orgânico irá restabelecer

o sistema de hidratação natural da pele, auxiliando na retenção de moléculas de

água sobre a pele. O silício auxilia a pele na recuperação de sua capacidade de

defesa natural, afetada pela exposição aos raios UV e pelo envelhecimento. Há uma

grande quantidade de silícios orgânicos disponíveis no mercado, como Methylsilanol

Mannuronate, Ascorbyl Methylsilanol Pectinate e Dimethylsilanol Hyaluronate. Cada

um destes ativos atua de maneira específica, dependente do radical agregado à

molécula (EXSYMOL).

O Methylsilanol Mannuronate previne a perda de elasticidade dos tecidos

cutâneos, protege as células do ataque de radicais livres, ajuda a pele a recuperar

sua capacidade de defesa natural contra os raios UV e, ainda, possui ação

antiinflamatória e anti-edema. O Ascorbyl Methylsilanol Pectinate tem ação

maximizada de redução dos radicais livres, devido à presença do ácido ascórbico,

além de regenerar o tecido cutâneo e normalizar a pigmentação cutânea. O

Dimethylsilanol Hyaluronate atua como hidratante biológico, regenerando o sistema

de auto-hidratação e protegendo as fibras elásticas (EXSYMOL).

2.2.3.6. Reações Adversas dos Hidratantes

Pode-se considerar que os hidratantes são dotados de segurança favorável,

se comparados aos ativos usados em dermatologia. Ainda que usados em áreas

extensas do corpo, e por um período longo de tempo, eles raramente estão

associados a sérios riscos de saúde (HALVARSSON, LODÉN, 2007).

Pessoas com a pele sensível apresentam uma alta incidência de reações

adversas a produtos cosméticos (BORNKESSEL, 2005).

Reações cutâneas desagradáveis provenientes de preparações tópicas

podem ser encontradas. As mais comuns são as reações sensoriais, como

queimação e ardência, ou as subjetivas (sem sinais de inflamação) imediatamente

após a aplicação dessas preparações tópicas (HALVARSSON; LODÉN, 2007).

26

Umectantes, como ácidos láticos e uréia, assim como os conservantes,

causam reações subjetivas. Porém, formulações isentas destas substâncias

potencialmente irritantes podem induzir sensações subjetivas ou alergia. Cada

organismo reage de uma maneira particular à exposição de determinadas

substâncias. Em formulações tópicas, fragrâncias e conservantes são identificados

como os maiores sensibilizadores (HALVARSSON, LODÉN, 2007).

Para minimizar a irritação cutânea aos hidratantes, imperiosa se faz a

existência de métodos sensíveis e de confiança para testar esses produtos (AGNER

et al., 2000). De acordo com BURACZEWSKA et al. (2007), há uma falta de

conhecimento sobre os efeitos dos hidratantes na função de barreira cutânea,

principalmente após um longo prazo. Alguns hidratantes podem fragilizar a função da

barreira, enquanto outros podem fortalecê-la, influenciando na sua recuperação.

2.3. Avaliação da Hidratação Cutânea 2.3.1 Avaliação in vitro do comportamento das substâncias hidratantes

na pele utilizando técnicas espectrométricas e termoanalíticas

Uma variedade de técnicas espectroscópicas vibracionais tem sido

empregada recentemente no estudo da estrutura do stratum corneum e das

modificações causadas pela ação de substâncias aplicadas (BABY et al., 2006 a;

BABY et al., 2006 b;HANH et al., 2001; SCHENDZIELORZ et al.,1999). Essas

técnicas são métodos analíticos capazes de fornecer informações complementares

sobre a composição e disposição das moléculas constituintes da pele. Permitem,

inclusive, o surgimento de novos estudos mais detalhados sobre os diversos

constituintes da pele, que possibilitam avaliar as diferentes funções do manto

hidrolipídico, ou ainda, quantificar os efeitos dos cosméticos ou medicamentos de

uso tópico sobre a cútis. Os métodos, como a espectroscopia infravermelha com

transformada de Fourier e acessório de refletância total atenuada (ATR-FTIR),

podem avaliar alterações no grau de ordem dos lipídeos do estrato córneo

(PRASCH, et.al., 2000). Foi demonstrada que a espectroscopia fotoacústica no

27

infravermelho (PAS-FTIR) é uma técnica útil de avaliar o comportamento de

substâncias ativas na pele.

Na espectroscopia fotoacústica, de uma maneira geral, a luz modulada

proveniente de qualquer região (ultravioleta, visível ou Infra-vermelho) incide sobre a

amostra, sendo absorvida e gerando, assim, calor no interior da amostra. Após a

difusão do calor para a superfície da amostra, há geração de pressão (som) no gás

de transferência circundante, sendo o sinal de som registrado por um microfone

sensível, acoplado à câmara fotoacústica. Este som fornece informações sobre as

propriedades da amostra. No caso de espectrômetro infravermelho, a leitura é

fornecida na forma de um interferograma (HANH et al., 2001). As amostras podem

ser prontamente utilizadas sem preparação prévia. Trata-se de uma técnica aplicável

a meios não transparentes e que espalham fortemente a luz, como é o caso do

stratum corneum (HANH et al., 2001; HANH et al., 2000; ROSENCWAIG & PINES,

1977).

A espectroscopia de Raman FT-Raman pode ser mais adequada para a

investigação de amostras biológicas, visto que, por este método, a água absorve em

regiões de baixa freqüência e de maneira profunda, o que permite maior precisão

nos resultados (SCHRADER, et. al., 1997). A Calorimetria Exploratória Diferencial é

uma técnica amplamente utilizada para a avaliação de mudanças estruturais do

stratum corneum, permitindo a avaliação dos efeitos gerados pelos compostos

aplicados sobre a pele. Modificações nas entalpias envolvidas nas transições de

fases de lipídeos e alterações no pico de desnaturação da queratina indicam uma

interação dos compostos aplicados com o stratum corneum, permitindo uma melhor

compreensão dos mecanismos envolvidos e auxiliando no desenvolvimento de

bases para produtos de uso dérmicos e transdérmico (BABY et al, 2006 b;

LEOPOLD & LIPPOLD, 1994).

Espectroscopia Fotoacústica no Infravermelho (FTIR-PAS), Espectroscopia de

Raman com transformada de Fourier (FT-Raman) e Calorimetria Exploratória

Diferencial (DSC) são técnicas comprovadamente seguras que, quando utilizadas

em conjunto, fornecem resultados precisos e confiáveis.

28

A espectroscopia no infravermelho e a espectroscopia Raman são técnicas

complementares, baseadas nos modos vibracionais das ligações atômicas de uma

molécula. São técnicas muito utilizadas quanti e qualitativamente em análises

farmacêuticas, na quantificação de droga num sistema semi-sólido ou sólido, na

caracterização da influência de modificadores de penetração no estrato córneo, na

realização do monitoramento não-invasivo da penetração da droga na membrana, na

visualização da distribuição da droga e na caracterização de sistemas coloidais.

A Calorimetria Exploratória Diferencial é usada na indústria farmacêutica e de

polímeros para caracterizar o comportamento térmico dos componentes do fármaco.

Além disso, permite determinar as temperaturas de transição vítrea, de fusão, de

cristalização e de cura, bem como os calores de fusão e de cristalização. Utiliza uma

pequena quantidade de amostra que, contudo, não é recuperada (BABY et al., 2006;

LACERDA, 2003). Este método também é amplamente utilizado para a avaliação de

mudanças estruturais do estrato córneo, permitindo-se a avaliação dos efeitos que

compostos aplicados sobre a pele exercem sobre a sua estrutura. (LEOPOLD &

LIPPOLD, 1994).

Considerando-se as técnicas acima descritas, torna-se possível avaliar e

comparar in vitro as alterações do estrato córneo causadas por substâncias

aplicadas na pele, como os compostos hidratantes. A situação ideal é a utilização da

pele humana em modelos in vitro, porém a pouca disponibilidade de amostras de

pele em quantidade suficiente para estes estudos, aliada às dificuldades de

armazenamento, tornam seu uso limitado (SCHMOOK, MEINGASSENER, BILLICH,

2001; RIGG & BARRY, 1990).

Como alternativas de membranas, muitos pesquisadores utilizam-se de pele

de animais de experimentação, membranas sintéticas e culturas tridimensionais,

como a epiderme reconstruída, a pele equivalente (LOPES & KANEKO, 2000).

Existe, atualmente, interesse no uso da pele de muda de cobra como modelo para

pele humana. Diversos pesquisadores têm avaliado a aplicabilidade da pele de muda

de cobra em estudos de permeação com diferentes graus de sucesso (BABY et al.,

2006 a; BABY et al., 2006 b; RIGG & BARRY, 1990; WIDLER, SIGRIST, GAFNER,

2002). Podendo ser obtida naturalmente sem a morte do animal, a pele de cobra

29

fornece barreira similar ao estrato córneo humano, desprovida, todavia, de folículos

pilosos e epiderme viável. Possui as vantagens de não sofrer degradação

microbiológica e de ter armazenamento facilitado (RIGG & BARRY, 1990).

A estrutura da pele de cobra é formada por 3 camadas distintas, quais sejam:

a pele mais externa, ou camada β, composta basicamente por β queratina; abaixo

dela está localizada a camada meso, ou intermediária, similar ao stratum corneum

humano, composta de 3 a 5 camadas de células achatadas e extremamente finas,

circundadas por lipídeos intercelulares; e, por fim, a parte mais interna, ou camada

que é composta por -queratina. A camada intermediária é o principal depósito de

lipídeos na pele de cobra e constitui, também, a principal barreira à permeabilidade

da água (ITOH et al., 1990; TAKAHASHI et al.,1993).

2.3.2. Avaliação da Hidratação Cutânea in vivo

A Bioengenharia cutânea, ou Biometria cutânea, consiste no estudo das

características biológicas, mecânicas e funcionais da pele por meio da medição de

diferentes variáveis por métodos cientificamente comprovados e não-invasivos, que

podem ser usados sozinhos ou em combinação (RODRIGUES, 1996; ROSSI,

VERGNANINI, 1997).

Vários métodos não-invasivos têm sido desenvolvidos para estudar os

aspectos fisiológicos da pele com desconforto mínimo para o voluntário (BAZIN,

FANCHON, 2006).

O mercado cosmético vem crescendo a cada ano, acarretando aumento da

concorrência, o que requer inovação por parte das empresas que os produzem.

Surge, desta feita, a necessidade de se destacar no mercado, oferecendo-se

serviços diferenciados aos clientes. Em virtude disso, os testes de eficácia de

cosméticos têm sido amplamente utilizados (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999;

HARRIS, 2003).

A bioengenharia cutânea possibilita avaliar tanto quantitativamente quanto

qualitativamente as características da pele, permitindo que se comprove a eficácia

30

de um produto cosmético in vivo (RODRIGUES, 1996; BAREL, CLARYS, GABARD,

1999).

A combinação de diferentes técnicas de biometrologia não apenas permite

avaliar os apelos mercadológicos, como, também, fornece informações sobre a

segurança do uso de formulações com metodologias não-invasivas mais confiáveis,

viabilizando a detecção quantitativa de propriedades da pele e de reações

bioquímicas em estados iniciais do processo (HARRIS, 2003).

Em se tratando de cosméticos, a mensuração da hidratação da pele é o apelo

mais desejado pelas indústrias cosméticas, uma vez existirem diversos produtos

hidratantes no mercado para combater a desidratação e prevenir o envelhecimento

cutâneo precoce (BERARDESCA et al., 1997; BAREL, CLARYS, GABARD, 1999).

Clinicamente, os hidratantes são importantes aliados no tratamento de

patologias dermatológicas. Portanto, a avaliação da hidratação cutânea também é

desejada neste caso, seja na investigação, seja no tratamento de uma afecção

dermatológica, como a xerodermia (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999).

A auto-avaliação dos voluntários ou a avaliação do examinador é muito

subjetiva, necessitando de técnicas que podem ser mensuradas por um método

objetivo, permitindo-se, assim, a detecção de mudanças sutis na morfologia e função

da pele, que não são detectadas na avaliação sensorial, e que forneça informações

mais precisas e reprodutíveis. Desta forma, o mais sensato a se fazer é correlacionar

os métodos biotecnológicos com as avaliações visual e tátil (BAREL, CLARYS,

GABARD, 1999; PAEPE et al., 2000; HARRIS, 2003).

A mensuração da hidratação na superfície da pele fornece informações

importantes sobre as propriedades biofísicas e sobre a função da barreira cutânea.

Com uma quantidade de água adequada, a pele mantém a função de barreira,

mantendo-se macia, flexível e com uma aparência saudável (BAZIN, FANCHON,

2006).

É extremamente difícil avaliar a hidratação das camadas da epiderme in vivo

de modo não-invasivo. Diferentes técnicas biotecnológicas têm sido desenvolvidas

para esta finalidade, envolvendo mensuração de propriedades elétricas, além de

31

métodos espectroscópicos, propriedades mecânicas, ressonância magnética nuclear

e topografia da superfície cutânea (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999).

Vale ressaltar que a medida da perda de água transepidérmica não é um

indicador da hidratação do estrato córneo, mas sim um indicador da função da

barreira cutânea, sendo usada principalmente para dar suporte aos apelos dos

produtos que têm como objetivo melhorar ou restaurar a função da barreira cutânea

(DYKES, 2002).

Em todos estes casos, o controle ambiental, a temperatura, a umidade, a

fonte de luz, a circulação de ar, as variáveis instrumentais, a calibração de

equipamentos, as propriedades da sonda, a qualidade e a integridade dos produtos,

o sexo, a idade, a raça e a limpeza na área dos voluntários são de extrema

importância para garantir obtenção de resultados confiáveis. A ampla variabilidade

entre os objetos de estudo é uma limitação dos testes que utilizam a bioengenharia

cutânea (HARRIS, 2003; TANAKA et al., 2008).

Estudos da hidratação da pele são executados principalmente a curto prazo,

sendo as medidas realizadas entre 1 e 8h após a aplicação do produto,

possibilitando-se verificar a hidratação cutânea, mesmo após uma única aplicação

(DAL’BELO, GASPAR, CAMPOS, 2006).

2.3.2.1 Mensuração de Propriedades Elétricas das Camadas Superiores da Epiderme

A quantidade de água presente na epiderme está relacionada às suas

condições e propriedades, podendo a sua monitoração diagnosticar alterações não

perceptíveis a olho nu. O teor de água presente no estrato córneo altera a passagem

de corrente alternada de baixa freqüência através da pele, permitindo a monitoração

das alterações da barreira por meio de equipamentos capazes de medir

indiretamente a hidratação cutânea (HARRIS, 2003).

A hidratação da superfície da pele pode ser mensurada pela medida da

condutância, impedância ou, ainda, pela capacitância elétrica (CLARYS, BAREL,

GABARD, 1999; HEINRICH et al., 2003).

32

As medidas realizadas pelos equipamentos baseados na impedância e na

capacitância da pele são expressas em unidades arbitrárias (u.a.), enquanto as feitas

por meio da condutância são expressas em unidades reais, denominadas µsiemens

(FLUHRL et al. 1999; CLARYS, BAREL, GABARD, 1999; O´GOSHI, SERUP, 2005;

CRAVELO, FERRI, 2008).

A impedância elétrica é definida como a resistência elétrica total da pele a

uma corrente alternada. Além da resistência, a impedância da pele está relacionada,

também, com a capacitância e com as múltiplas freqüências que podem ser

aplicadas na pele. A medida da impedância reflete as alterações estruturais e

químicas dos tecidos vivos, e é altamente dependente da quantidade de lipídeos no

estrato córneo (HILDERBRANT, ZIEGLER, WOLLINA, 1998; FLUHR et al., 1999;

NICANDER, OLLMAR, 2004; FERREIRA, SILVA, SOUZA, 2007).

A condutância das camadas superiores da epiderme, mais particularmente da

camada córnea, também pode ser considerada um importante parâmetro da

hidratação da superfície da pele. Nesse método, há um contato galvânico direto

entre os eletrodos e a superfície da pele (BAREL, CLARYS, 1997; FLUHR et al.,

1999).

A avaliação da capacitância envolve a aplicação de uma corrente à baixa

freqüência e intensidade, de modo que atinja o estrato córneo. São realizadas

medidas repetidas da capacitância elétrica, efetuando comparação entre uma região

sem o produto e com o produto aplicado, a fim de avaliar o efeito hidratante de um

produto cosmético sobre o estrato córneo (HARRIS, 2003).

Estudos com vários equipamentos que medem indiretamente a quantidade de

água presente nas camadas superiores da pele, baseados em diferentes métodos,

mostram que há uma alta correlação entre as técnicas existentes (FLUHR et al.,

1999; CLARYS, BAREL, GABARD, 1999; HARRIS, 2003).

O Corneometer é um dos aparelhos mais utilizados para verificar a

hidratação cutânea através da capacitância. A sonda é constituída de duas placas

metálicas, estando uma ao lado da outra, medindo a uma profundidade de até 30

micrômetros. Esse instrumento tem ganhado considerável aceitação pela sua

satisfatória eficiência, sua alta reprodutibilidade e seu fácil manuseio, além de ser

33

econômico (ALANEN et al., 2004; O´GOSHI, SERUP, 2005; MAC-MARY et al.,

2006).

O MoistureMeter também é um aparelho que mede a capacitância da pele,

sendo formado por uma sonda e por um eletrodo interno de 5 milímetros de

diâmetro, como mostra a Figura 5. A sonda é equipada com um sensor de força,

permitindo ao usuário selecionar a pressão adequada em cada medição (ALANEN et

al., 2004).

Figura 5 . MoistureMeter® (ALANEN et al., 2004).

O resultado das medições pela capacitância elétrica é influenciado por

diversos fatores. Dentre os fatores químicos, podem ser citados: hidratação da

camada córnea; presença de proteínas e de outros compostos químicos, como a

glicerina e a uréia; e ligações de hidrogênio da estrutura da água. Entre os fatores

físicos, estão: freqüência da carga elétrica usada; tipo de eletrodo aplicado na

superfície da pele; temperaturas da pele e externa do corpo; umidade do ambiente; e

pressão aplicada sobre o eletrodo (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999; HARRIS,

2003).

34

A avaliação elétrica da hidratação cutânea permite, tão-somente, indicar

valores relativos, mas não medidas absolutas, devendo-se, por conseguinte, ter

muito cuidado na interpretação do teste (BERARDESCA et al., 1997).

2.3.2.2. Avaliação da Perda de Água Transepidérmica (TEWL-

Transepidermal Water Loss)

Os corneócitos estão organizados compactamente de maneira a constituir

uma barreira bilipídica impermeável, a fim de reter o máximo de água possível no

estrato córneo para manter a hidratação cutânea necessária à homeostase. A

composição e a organização dos lipídios são fatores importantes para restringir a

perda de água transepidérmica (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999; HARRIS, 2003;

LODÉN, 2003).

A perda de água através da epiderme é um dos parâmetros biofísicos mais

importantes para avaliar a eficiência da barreira cutânea. Quando ela está danificada

pelos agentes físicos ou químicos, há um aumento na perda de água

transepidérmica (GIOIA, CELLENO, 2002; PAEPE et al., 2005; BURACZEWSKA et

al., 2007).

Em condições normais, a perda de água através da epiderme é de 3-6

g/hora/m2, e ocorre por difusão passiva da água pelo estrato córneo (NICANDER,

ABERG, OLLMAR, 2003; TAGAMI, KIKUCHI, 2006).

A oclusão decorrente do uso de emulsões e óleos reduz a perda de água

transepidérmica e também promove um aumento na quantidade de água no estrato

córneo (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999; COMACCHI, HERCOGOVA, 2004).

Avaliar a perda de água transepidérmica é importante não só para analisar a

integridade e a eficiência desta barreira, mas também para constatar o efeito de

substâncias químicas sobre a superfície cutânea. É possível, ainda, investigar a ação

de preparações farmacêuticas oclusivas sobre a epiderme, considerando que

processos patológicos, como ferimentos e dermatites, induzem acréscimo da perda

de água transepidérmica. O nível de TEWL serve como indicador da permeabilidade

35

da pele na aplicação de substâncias tópicas (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999;

HARRIS, 2003; LODÉN, 2003).

Esse método pode ser avaliado em câmaras abertas, sendo os equipamentos

mais utilizados o Tewlmeter e o Evaporimeter. Utilizam-se, também, câmaras

fechadas, como é o caso do Vapometer (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999;

HARRIS, 2003; ZHAI et al., 2007).

Outros agentes voláteis, que não a água, como o álcool, podem influenciar os

resultados, desde que a medição seja efetuada logo após a aplicação do hidratante

contendo a substância interferente. A aplicação de formulações aquosas resulta em

um aumento imediato nos resultados, enquanto a aplicação de formulações isentas

de água reduzem os valores (HARRIS, 2003; LODÉN, 2003).

TEWL pode ser mensurado por um método que mede o gradiente de

evaporação usado no TEWA-meter ou Tewlmeter. A técnica consiste em utilizar

um cilindro aberto contendo dois higrosensores acoplados com dois termômetros

dispostos a distâncias diferentes da superfície da pele. A diferença entre a pressão

do vapor dos dois pontos está diretamente relacionada ao grau de perda de água por

evaporação naquela região específica delimitada da pele, na qual os resultados são

expressos em g/m2.h. (LODÉN, 2003).

Por ser um sistema que utiliza câmaras abertas, possui algumas limitações

relacionadas ao ambiente e a fluxos de ar perto da sonda, ao seu tamanho e aos

locais da medida (NUUTINEM et al., 2003).

O Vapometer é um sistema pequeno de câmara fechada que possui um

diâmetro interno de 11 milímetros e abrange uma área de 95 m2. Esse método

consiste em uma sonda que é aplicada na pele para coletar o vapor de água perdido

em sua superfície, sendo a umidade relativa dentro da sonda obtida por um

higrosensor eletrônico. Esse método não permite registrar medidas contínuas da

perda de água transepidérmica, pois quando o ar dentro da câmara fica saturado, a

evaporação cutânea cessa. As medidas são expressas também em g/m2.h e o valor

máximo obtido é de 300 g/m2.h. (SHAI, ZHAI, MAIBACH, 2005; FLUHRL,

FEINGOLD, ELIAS, 2006).

36

2.4 Estudos de estabilidade de produtos cosméticos

Segundo o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), o estudo de estabilidade de produtos

cosméticos fornece informações que indicam o grau de estabilidade, visando avaliar

o tempo durante o qual o produto a ser testado mantém, dentro dos limites

especificados, as mesmas propriedades e características que possuía na época de

sua fabricação.

Variáveis relacionadas ao processo de fabricação ou incompatibilidades dos

componentes da formulação são exemplos de fatores intrínsecos que podem alterar

a estabilidade do produto. Temperatura, presença de luz e oxigênio, umidade e

contaminação microbiológica são exemplos de fatores extrínsecos responsáveis por

alterar a estabilidade de um produto (BRASIL, 2004).

A avaliação da estabilidade é essencial para assegurar a qualidade do

produto final. Os testes são feitos visando estabelecer o prazo de validade da

fórmula, além de indicarem as condições mais adequadas para o armazenamento

(MONTAGNER, CORRÊA, 2004).

No ramo cosmético, as previsões realizadas que se baseiam apenas em

parâmetros químicos não podem ser totalmente confiáveis, sendo a avaliação da

estabilidade física de extrema importância (GUARATINI, GIANETI, CAMPOS, 2006).

A degradação de um produto depende da cinética de reação, sendo os testes mais

utilizados os de estabilidade acelerada (MAGARI et al., 2004).

2.4.1.Teste de estabilidade acelerada (TEA)

Para avaliação da estabilidade, os produtos são submetidos a condições de

estresse, visando acelerar o surgimento de possíveis sinais de instabilidade. Os

testes de aceleração mais comuns são: o armazenamento da formulação a ser

testada em estufa a 37 e a 40 °C ± 2 °C, e em geladeira a 5 °C ± 2 °C; exposição do

produto à radiação luminosa, a ciclos de congelamento e descongelamento e ao

teste da centrífuga. O tempo mais usual utilizado neste estudo acelerado é de 90

dias, sendo que as amostras devem ser avaliadas no tempo zero e aos 7°, 15°, 30°,

60° e 90° dias (BRASIL, 2004).

37

Em tais testes, são avaliados principalmente os parâmetros organolépticos,

como aspecto, cor e odor, e os parâmetros físico-químicos, como pH e viscosidade

(BRASIL, 2004).

O termo reologia é amplamente empregado no estudo de formulações

cosméticas, a fim de se conhecer a velocidade de deformação a que estão sujeitas,

por meio da observação dos materiais após a aplicação de forças externas

(LEONARDI, CAMPOS, 2001; CAMARGO, 2006).

O comportamento reológico está diretamente relacionado à facilidade de

utilização do produto, à estabilidade física e à percepção cutânea (MILLER,

LOFFLER, 2006).

Os polímeros utilizados na preparação de géis têm grande influência no

comportamento reológico, afetando, conseqüentemente, a estabilidade do produto e,

também, interferindo na aceitação do consumidor (CORRÊA et.al., 2005).

38

3. Objetivos

O presente estudo teve como principal escopo avaliar in vivo a eficácia

hidratante de formulações contendo diferentes substâncias ativas por capacitância

elétrica e perda de água transepidérmica. Os compostos ativos selecionados para

incorporação nos géis à base de carbômero foram: uréia; extrato vegetal de Imperata

cylindrica; complexo contendo fatores de hidratação natural; derivados do açúcar,

sacarídeo isomerato; e a mistura de xilitilglicosídeo e anidroxilitilglicosídeo.

Os objetivos secundários foram:

- Avaliar a estabilidade acelerada das formulações

- Comparar o desempenho entre Corneometer® e Moisturemeter® quanto à

capacitância elétrica e, quanto à perda de água transepidérmica, o Vapometer® e o

Tewlmeter®.

- Verificar o comportamento in vitro das alterações causadas pelas substâncias

hidratantes, em modelo alternativo de estrato córneo.

39

4. Material e Métodos

4.1 Material

4.1.1 Matérias-primas

Carbomer® 940 – Pharma Special

Glicerina – Matric Produtos Farmacêuticos e Cosméticos Ltda.

Fenoben® – Volp Indústria e Comércio Ltda.

Trietanolamina – Henrifarma Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda.

Água deionizada – Produzida no próprio laboratório

Uréia – Natural Pharma produtos Famacêuticos Ltda.

Silício orgânico (Dimethylsilanol Hyaluronate - DMSH®)

Extrato vegetal (Imperata cylindrica – Moist 24®)

Reação de Xilitol + Glucose (Xylitylglucoside and anhydroxylitol and xylitol ) -

Componentes do FHN (lactato de sódio, glicerina, ácido lático – Propilenoglicol, uréia, -

Glucose, sacarose, Frutose - Lactose – Colágeno hidrolisado, cloreto de sódio, cloreto de

potássio, conservantes)

Isômero de D-Glucose (Saccharide Isomerate)

4.1.2 Membrana

Muda da pele de cobra de Crotalus durissus (amostras cedidas gentilmente

pelo Instituto Butantã).

4.1.3 Formulações

As formulações apresentadas a seguir, nas Tabelas 1 e 2, foram objetos de

estudo no trabalho.

40

Tabela 1. Composição quali e quantitativa (% p/p) das formulações utilizadas durante experimento in vivo.

Componentes Composição (% p/p)

Nome químico Nome INCI Gel A Gel B Gel C Gel D Gel E Gel F Gel G Carbômero Carbomer 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Glicerina

Glycerin

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Metildibromo glutaronitrila

fenoxietanol

Methyldibromo Glutaronitrile (and)

Phenoxyethanol

0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15

Trietanolamina Triethanolamine

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

Água deionizada

Aqua

qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100

Uréia Urea --- 4 --- --- --- --- ---

Extrato vegetal

Extrato de Imperata cylindrica

Imperata cylindrical –(Root Extract) –

Aqua- Glycerin- PEG8-Carbomer

--- --- 4 --- --- --- ---

Componentes do FHN ** --- --- --- 4 --- --- ---

Silício Orgânico Dimethylsilanol Hyaluronate --- --- --- --- 4 --- ---

Isômero de D-Glucose Saccharide Isomerate --- --- --- --- --- 4 ---

Derivado de Açúcar Xylitylglucoside (and)anhydroxylitol

(and) xylitol

--- --- --- --- --- --- 4

INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredient)**Sodium lactate; glycerin, lactic acid, propylene glycol, dextrose, fructose, lactose, hydroxyproline, aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine, sodium chloride, phenoxyethanol, methylparaben, propylparaben, ethylparaben, potassium chloride. (Disponível em http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/cosing/)

41

Tabela 2. Composição quali e quantitativa (% p/p) das formulações durante experimento in vivo.

Componentes Composição (% p/p)

Nome químico Nome INCI Gel A Gel B Gel C Gel D Gel G Carbômero Carbomer 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Glicerina

Glycerin

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Metildibromo glutaronitrila

fenoxietanol

Methyldibromo Glutaronitrile (and)

Phenoxyethanol

0,15 0,15 0,15 0,15 0,15

Trietanolamina Triethanolamine

qsp pH 5,5

– 6,5

qsp pH 5,5

– 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

qsp pH

5,5 – 6,5

Água deionizada

Aqua

qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100 qsp 100

Uréia Urea --- 4 --- --- ---

Extrato vegetal

Extrato de Imperata cylindrica

Imperata cylindrical –(Root Extract) –

Aqua- Glycerin- PEG8-Carbomer

--- --- 4 --- ---

Componentes do FHN ** --- --- --- 4 ---

Derivado de Açúcar Xylitylglucoside (and )anhydroxylitol (and)

xylitol

--- --- --- --- 4

INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredient)**Sodium lactate; glycerin, lactic acid, propylene glycol, dextrose, fructose, lactose, hydroxyproline, aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine, sodium chloride, phenoxyethanol, methylparaben, propylparaben, ethylparaben, potassium chloride. (Disponível em http://ec.europa.eu/enterprise/cosmetics/cosing/)

42

4.1.4 Equipamentos

Balança Gehaka BG 2000

Peagômetro Micronal B474

Viscosímetro Fungilab S.A. (Visco basic – R) spindle B

Estufa Olidef cz

Agitador mecânico Kika Labortechnik RW 20.n

Centrífuga Fanem 206 BL

Corneometer® CM 825 (Courage&Khazaka)

Moisturemeter-SC® (Delfin)

Tewlmeter® (Courage&Khazaka)

Vapometer® (Delfin)

Espectrômetro Raman, FT Raman - BRUKER RFS 100/S

DSC Q10 – Differential Scanning Calorimeter – TA Instruments

Refrigerador 5 °C

Picnômetro

4.2 Métodos

4.2.1 Preparo das fórmulas utilizadas

4.2.1.1 Gel base (Gel A)

Foram pesados 1698,3 g de água e 9,0 g do carbômero em recipiente de

aço inox. O carbômero foi solubilizado na água em uma única etapa, com o

auxílio de um agitador mecânico. Depois, foram adicionados 2,7 g de

metildibromo glutaronitrila e fenoxietanol e 90,0 g de glicerina, que foram

dispersos por agitação mecânica na velocidade de 800 rpm. O valor de pH da

formulação foi determinado com auxílio do peagômetro e, em seguida, corrigido

com trietanolamina, com o intuito de que o pH final estivesse no intervalo entre

5,5 – 6,5.

43

4.2.1.2 Preparação do gel com uréia (Gel B)

Em um béquer de vidro, foram pesados 270,0 g de água e solubilizados

72,0 g de uréia. Foram pesados, também, 1356,3 g de água e 9,0 g do

carbômero, em recipiente de aço inox, e agitados com o auxílio de um agitador

mecânico na velocidade de 800 rpm. Depois, foram adicionados 2,7 g de

metildibromo glutaronitrila fenoxietanol, 90,0 g de glicerina e a uréia

previamente solubilizada em água no béquer de vidro. Após completa

dispersão, o valor de pH da formulação foi determinado com auxílio do

peagômetro e, em seguida, corrigido com trietanolamina, para que o pH final

estivesse no intervalo entre 5,5 – 6,5.

4.2.1.3 Gel base com extrato vegetal (Gel C)


aço inox. O carbômero foi previamente disperso em água com auxílio de um

agitador mecânico na velocidade de 800 rpm. Depois, foram acrescentados 2,7

g de metildibromo glutaronitrila fenoxietanol, 90,0 g de glicerina e 72,0 g do

extrato vegetal de Imperata cylindrical. Após completa dispersão, o valor de pH

da formulação foi determinado com auxílio do peagômetro e, em seguida,

corrigido com trietanolamina, a fim de que o pH final estivesse no intervalo

entre 5,5 – 6,5.

4.2.1.4 Gel base com componentes do FHN (Gel D)


aço inox e dispersos com auxílio de um agitador mecânico na velocidade de

800 rpm. Em seguida, foram acrescentados 2,7 g de metildibromo glutaronitrila

fenoxietanol, 90,0 g de glicerina e 72,0 g dos componentes do FHN, os quais

foram dispersos por agitação mecânica. Após completa dispersão, o valor de

pH da formulação foi determinado com auxílio do peagômetro e, em seguida,

corrigido com trietanolamina, para que o pH final estivesse no intervalo entre

5,5 – 6,5.

44

4.2.1.5 Gel base com Derivado de Açúcar (Gel G)


aço inox. O carbômero foi disperso na água com auxílio de um agitador

mecânico na velocidade de 800 rpm. Posteriormente, foram acrescentados 2,7

g de metildibromo glutaronitrila fenoxietanol, 90,0 g de glicerina e 72,0 g do

derivado de açúcar (Xylitylglucoside and anhydroxylitol and xylitol), os quais

foram dispersos por agitação mecânica. Após completa dispersão, o valor de

pH da formulação foi determinado com auxílio do peagômetro e, em seguida,

corrigido com trietanolamina, para que o pH final estivesse no intervalo entre

5,5 – 6,5.

4.2.2 Preparo das soluções

As soluções foram preparadas em balões volumétricos de 100 ml. Pesaram-

se aproximadamente 4,0 g de cada hidratante, separadamente, e completou-se o

volume com água destilada livre de gás carbônico.

4.2.2. Avaliação da estabilidade

4.2.2.1 Estabilidade Preliminar ou Acelerada

Somente os Géis A, B, C, D e G foram usados para o estudo da

estabilidade. As formulações foram avaliadas durante 90 dias, com medidas

nos tempos: 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias após o preparo. O material de

acondicionamento utilizado foi vidro, com um terço de espaço livre.

4.2.2.1.1. Estufa

As formulações foram armazenadas na estufa Olidez cz à temperatura

de 37 °C.

4.2.2.1.2. Refrigerador

As formulações foram armazenadas no refrigerador à temperatura de 5

°C ± 2 °C.

45

4.2.2.1.3 Luz

As formulações foram armazenadas em uma bancada exposta às

radiações luminosas naturais à temperatura ambiente (25 °C).

4.2.2.1.4 Temperatura Ambiente

As formulações foram mantidas em um armário cuja temperatura é

equivalente à temperatura ambiente (25 °C). Usufruiu-se da luz solar indireta,

em razão de ela poder alterar significativamente a cor e o odor do produto,

assim como levar à degradação de componentes da formulação.

4.2.2.2 Métodos Físicos de Avaliação da Estabilidade

4.2.2.2.1 Viscosidade Aparente

O viscosímetro Fungilab S.A. Visco basic-R foi estabilizado 30 minutos

antes de iniciar a avaliação do produto. Os produtos armazenados no

refrigerador (5 °C ± 2 °C ) e na estufa Olidez cz (37 °C) foram retirados da

temperatura extrema e analisados após atingirem a temperatura ambiente.

Antes de medir a viscosidade, foi verificado o spindle correto para

executar tal medição e acoplado ao equipamento. Então, o spin foi colocado na

formulação, diretamente no recipiente original, exposto à luz, temperatura

ambiente, refrigerador e estufa.

A opção referente ao spin correto (B) foi selecionada para que o

equipamento pudesse ser ligado para medir a viscosidade da formulação em

teste. Foram usados 250 gramas de cada amostra para a realização do estudo.

Para obter resultados mais precisos, foram registrados 10 valores referentes à

mesma amostra, os quais resultaram no valor final da viscosidade a partir da

média aritmética de 10 valores. A cada nova medição o spin foi devidamente

higienizado com água destilada, visando evitar contaminação cruzada entre as

diferentes formulações. A variação percentual da viscosidade (%) foi calculada

na forma da Equação 1:

46

Viscosidade aparente = (Visc.f – Visc.i) x 100 (Equação 1)

Visc.i

Onde: Visc.i = valor de viscosidade aparente em to (inicial)

Visc.f = valor de viscosidade aparente final

4.2.2.2.2 Valor de pH

O peagômetro B 474 Micronal foi ligado 30 minutos antes de se iniciar a

avaliação do produto. Os produtos armazenados no refrigerador (± 2 °C) e na

estufa Olidez cz (37 °C) foram retirados da temperatura extrema a que

estavam submetidos e analisados à temperatura ambiente para equilíbrio (25

°C).

O aparelho foi calibrado com solução tampão pH 7,0 e com solução

tampão pH 4,0. O eletrodo responsável pela medição do pH foi devidamente

higienizado com água destilada, com o propósito de evitar contaminação

cruzada entre as diferentes formulações.

Para obter o pH das formulações, inseriu-se o eletrodo nas formulações

a serem testadas, onde permaneceram armazenadas em seu recipiente

original. Aguardou-se a estabilização do pH, e obteve-se o valor do pH correto.

Foi calculada a % de variação da seguinte maneira:

pH = (pHf – pHi) x 100 (Equação 2)

pHi

Onde:

pHi= valor de pH em to (inicial)

pHf = valor de pH final

to = 24 horas após manipulação

4.2.2.2.3 Centrifugação

47

As amostras foram retiradas das condições a serem analisadas e

depositadas em tubos de ensaio pertencentes à centrífuga 206 BL da Fanem.

O equipamento funcionou a 3000 rpm (rotações por minuto) durante 20 minutos

com o intuito de que fossem verificadas as alterações no aspecto físico.

4.2.2.2.4 Características Organolépticas

Foram avaliadas as características organolépticas de todas as

formulações diante das condições de estresse para verificar as modificações

no odor, aspecto e coloração, que sinalizam alterações na estabilidade das

formulações.

4.2.2.2.5. Densidade (USP, 2008)

A densidade das formulações foi avaliada com auxílio de um picnômetro

de metal, no qual a amostra do produto a ser testado preencheu sua

capacidade máxima. A medida foi feita à temperatura ambiente.

4.2.3 . Avaliação in vitro do comportamento das substâncias hidratantes utilizando técnicas espectrométricas e termoanalíticas

4.2.3.1 Preparação da muda de pele da cobra

Pesaram-se aproximadamente 61,5 mg de cada hidratante (matéria-prima),

separadamente e completou-se o volume com água destilada livre de gás carbônico.

Os estratos córneos foram preparados com porções ventrais de membrana de

muda de Cascavel (Crotalus durissus) que foram recortadas com tesoura e lavadas

com água destilada corrente à temperatura ambiente. Permaneceram imersas em

água em placas de Petri por 1 hora para re-hidratação. Após esse período, foram

retiradas, secas entre folhas de papel de filtro quantitativo, sob leve compressão, e

deixadas à temperatura ambiente por trinta minutos. Em seguida, foi realizada a

técnica de “tape-stripping” com fita TransporeTM, uma única vez, com o objetivo de

retirar a camada de beta queratina.

Posteriormente, as membranas foram transferidas para placas de Petri, local em

que permaneceram em contato com as soluções ou os géis por 2 horas,

separadamente. Decorrido o tempo indicado, as amostras de pele de cobra foram

48

retiradas, lavadas com água destilada, e, por fim, secas entre folhas de papel de filtro

quantitativo, sob leve compressão, permanecendo, posteriormente, armazenadas em

dessecador até o momento do uso. As membranas foram utilizadas para os

experimentos com espectroscopia de Raman com transformação de Fourier (FT-

Raman) e calorimetria exploratória diferencial (DSC).

4.2.3.2 Espectroscopia Raman com transformada de Fourier (FT-Raman)

Na análise com espectrômetro Raman FT Raman - BRUKER RFS 100/S,

software OPUS, as amostras de muda de pele de cobra tratadas foram

acondicionadas no compartimento destinado à análise. As condições do experimento

foram as seguintes: 1) Potência do laser: 250 mW; 2) Resolução: 4 cm-1; 3) Abertura:

10 mm; 4) Número de varreduras: 128; 5) Modo de preparo das amostras: uma

camada com espelho e sem lamínula. 4.2.3.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

Na técnica do DSC, as amostras da pele de muda de cobra de

aproximadamente 2,5 mg de massa seca foram seladas hermeticamente em cadinho

de alumínio. As amostras foram submetidas às condições descritas a seguir,

utilizando–se o equipamento DSC 10 – Differential Scanning Calorimeter – TA

Instruments. As condições do experimento da calorimetria exploratória diferencial

(DSC) foram: 1) Temperatura inicial: 25,00 C; 2)Rampa de resfriamento: 20,00

C/min até 0C; 3) Isoterma: 5 min; 4) Rampa de aquecimento: 10,00 ºC/min até

200ºC; 5) Rampa de resfriamento: 20,00 ºC/min até 0 ºC; 6) Isoterma: 5 min; 7)

Rampa de reaquecimento: 10,00 ºC/min até 200 ºC; 8) Temperatura final: 25,00 ºC.

49

4.2.4. Avaliação da Eficácia das Formulações in vivo

Para a avaliação da eficácia hidratante, foram realizadas três etapas de

estudo, conforme demonstra a Figura 6. Na primeira etapa, foi utilizada uma

maior quantidade de voluntários (11), além de 7 produtos e de um equipamento

de medição por capacitância (Corneometer®), sendo o tempo total das

medições de duas horas. Já na segunda etapa, utlizou-se uma menor

quantidade de voluntários (6), porém realizou-se um número maior de

medições em um único equipamento (Corneometer®). E, por fim, na terceira

etapa, experimentou-se um número médio de voluntários (8), uma menor

quantidade de formulações (5) e uma maior quantidade de equipamentos (4)

para efeito de comparação entre eles.

Figura 6. Fluxograma das análises para avaliações da eficácia das

formulações hidratantes.

Voluntários

1ª Etapa 2ª Etapa 3ª Etapa

11 06 08

Número de Medidas 05 07 06

Tempo das medições (minutos) 0, 30, 60, 90, 120 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 0, 30, 60,120, 240, 360

Tempo total de duração das medições 02h 03h 06h

Número de formulações analisadas

07 07 05

Nº de Controle (área não tratada)

01 01 01

Equipamento(s) utilizado(s)

1 Corneometer 1 Corneometer

1 Corneometer 1 Moisturemeter 1 Tewlmeter 1 Vapometer

50

4.2.4.1. Condições ambientais controladas

As avaliações foram realizadas em local com ambiente controlado e

climatizado, com temperatura e umidade relativa do ar, a 20 ± 2 °C e 45% ±

5%, respectivamente (BAREL, CLARYS, GABARD, 1999).

4.2.4.2. Sujeito de Pesquisa

O número de voluntários foi planejado para permitir análise estatística

das alterações na pele após exposição aos produtos analisados, de acordo

com a literatura e com o planejamento experimental que consta no item 4.2.4

(BERARDESCA et al., 1997).

O projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

do Hospital Maternidade Leonor Mendes de Barros, nos termos do Processo n°

EMG 1481 (Protocolo CEP 158-06), que se encontra em anexo.

4.2.4.2.1 Critérios de inclusão

Os critérios de inclusão foram os seguintes:

- idade: 20 a 30 anos

- sexo: feminino

- fototipo de pele: I a IV (Quadro 2)

- a pele deve se apresentar íntegra e com ausência de patologia aparente

- as voluntárias foram orientadas para não utilizar cremes hidratantes no corpo

três dias antes do experimento.

4.2.4.2.2 Critérios de não-inclusão

Os critérios de não-inclusão foram os seguintes:

- pêlo no lado anterior do antebraço

- alergia ou reatividade a categoria do produto testado

- aplicação de outro produto hidratante na área experimental, três dias antes do

início do estudo.

51

Quadro 2 - Fototipos de pele (PATHAK, FITZPATRICK, 1993)

Fototipos Descrição Sensibilidade ao sol

I – Branca Queima com facilidade,

nunca se bronzeia

Muito sensível

II – Branca Queima com facilidade,

bronzeia muito pouco

Sensível

III – Morena Clara Queima

moderadamente,

bronzeia

moderadamente

Normal

IV – Morena Moderada Queima pouco,

bronzeia com facilidade

Normal

V – Morena Escura Queima raramente,

bronzeia bastante

Pouco sensível

VI- Negra Nunca queima,

totalmente pigmentada

Insensível

4.2.4.3. Condições de Aplicação do Produto

A sonda e a área a ser analisada foram higienizadas e as voluntárias

ficaram em repouso durante 20 minutos antes da medição, para maior

confiabilidade dos resultados.

O produto foi pesado em uma dedeira de látex (Figura 7) e aplicado com

uma leve massagem no antebraço das voluntárias (Figura 8), em área

delimitada de 9 cm2, na razão de 2 mg/cm2 de produto, e após meia hora da

aplicação do produto efetuaram-se as leituras.

52

Figura 7. Dedeira de látex.

Figura 8. Locais de Aplicação.

4.2.4.4. Determinação da hidratação cutânea pelo método de Capacitância

Para determinar o conteúdo aquoso presente no estrato, utilizou-se o

princípio da capacitância elétrica. Os aparelhos utilizados foram o

Corneometer CM 825 (Courage&Khazaka) e o MoistureMeter (Delfin),

estando esse último presente na última etapa do estudo, visando à

comparação dos resultados.

53

Figura 9. Equipamento para medir a Capacitância elétrica da pele

(Corneometer).

4.2.4.5. Avaliação da Perda de Água Transepidérmica

Para avaliar a perda de água transepidérmica, foi utilizado o Tewlmeter

(Figura 9), equipamento usado para avaliar o gradiente de evaporação em

câmara aberta. E, na última etapa do estudo, verificou-se a perda de água

transepidérmica utilizando também o Vapometer, que possui um sistema de

câmara fechada, para a comparação dos resultados. Os equipamentos foram

calibrados com soluções de pressão de vapor conhecidas e recomendadas

pelos fabricantes. (HARRIS, 2003)

54

Figura 10. Equipamento para verificar a perda de água transepidérmica

(Tewlmeter).

4.2.5. Planejamento Experimental

Para alcançar o objetivo da pesquisa, foi empregado o projeto fatorial

ANOVA three way, que considerou dois fatores de interesse (produto e tempo)

e um fator que se desejou eliminar (voluntário).

Os dados foram organizados para a realização da análise de variância,

como a estrutura apresentada na Figura 11. Para melhor compreensão da

figura, só foram mostrados dois voluntários, mas é sabido que, dependendo do

grupo de dados, há variação do número de voluntários, do número de níveis de

tempo e do número de produtos a serem estudados.

Figura 11. Arranjo para obtenção de dados para análise de variância dos

ensaios realizados.

55

O modelo geral da análise de variância para todos os grupos de dados é

o apresentado na Equação 3:

y

(Equação 3)

Em que:

, e são os efeitos principais das variáveis: produto, tempo e voluntário;

, e são as interações de dois fatores das respectivas

variáveis; e é o erro residual do modelo assumido, aproximado pela

interação de três fatores, isto é: x x .

Todas as análises seguem o modelo da Equação 3, alterando-se apenas

os níveis de cada variável, que são apresentados em cada caso, e o

equipamento empregado para a medida do grau de hidratação ou da perda de

água transepidérmica.

56

5. Resultados e Discussão

Estabilidade acelerada das formulações desenvolvidas

O desenvolvimento de uma formulação cosmética requer seleção

criteriosa das matérias-primas, a fim de obter um produto final com eficácia,

segurança e perfil sensorial aceitável pelo consumidor. Para avaliação do

desempenho hidratante das substâncias em estudo, o gel foi eleito como

veículo, em virtude de ser transparente, incolor e de fácil aplicação,

corroborando com Shai e colaboradores, que afirmam que o gel é a forma

farmacêutica mais adequada, quando se deseja uma preparação contendo o

mínimo de lipídios possíveis (SHAI, MAIBACH, BARAN; 2001).

Na seqüência do desenvolvimento cosmético, a avaliação das

características do produto deve ser realizada de forma rápida, para que se

possam predizer informações sobre seu comportamento durante o prazo de

validade, que são fornecidas pelas diversas etapas do estudo de estabilidade

(BRASIL, 2004; CADWALLADER, 1989; SCHUELLER & PERRY, 2002). A

avaliação da estabilidade é essencial para assegurar a qualidade do produto

final, sendo, desta forma, o primeiro teste a ser realizado no desenvolvimento

de uma nova fórmula. Os testes são feitos visando estabelecer o prazo de

validade da fórmula, além de indicarem as condições mais adequadas para o

armazenamento (MONTAGNER, CORRÊA, 2004).

A estabilidade pode ser definida como a capacidade de um produto,

contendo ou não substâncias ativas, de manter suas propriedades físicas,

químicas, microbiológicas, toxicológicas e bioativas, dentro dos limites

especificados previamente, durante todo seu prazo de validade. Isso é

necessário, considerando que esses produtos, quando comercializados,

passam por um sistema de estocagem e distribuição e podem ser submetidos

ao calor prolongado e à umidade (BRASIL, 2004; IFSCC MONOGRAF Nº 2,

1992; MORETTO, 1999). Por conseguinte, um produto é considerado estável

quando não apresenta alterações em suas características, além das

57

determinadas pelas especificações técnicas, durante o tempo de prazo de

validade (USP 24, 2000; BRASIL, 2004; MORETO, 1999).

Depreende-se da Tabela 3, em reação ao Gel A, base sem os ativos,

que ocorreram modificações classificadas como levemente modificada (LM)

com as características organolépticas, quando submetido ao aquecimento da

estufa, a partir de 60 dias e na luz, a partir de 90 dias. Em relação ao valor de

pH (Figura 12), as formulações foram consideradas adequadas ao estudo,

considerando como 10% a variação de pH aceitável, conforme algumas

especificações técnicas de produtos cosméticos e que não comprometam sua

integridade (BABY, 2005).

Na variação da viscosidade do Gel A (Figura 13), verificou-se que ele,

quando submetido a presença de luz e a aumento da temperatura, apresentou

um decréscimo detectado pelo viscosímetro, mas não expressivo visualmente,

quando comparado com o controle. Segundo pesquisa de Correa e

colaboradores, o Carbopol® 940 incorporado nas formulações estudadas não

apresentou modificações relevantes com o aumento da temperatura (CORREA

et al., 2005). Em outro estudo, com Carbopol® 2020, Martinez e colaboradores

observaram o mesmo comportamento do polímero frente à variação da

temperatura (MARTINEZ et al., 2006). Na avaliação da densidade, a variação

máxima foi menor que 7% (Figura 14), sendo considerada aceitável pela

especificação técnica estabelecida neste trabalho, qual seja, de 10%.

58

Tabela 3. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de variação e aspectos organolépticos do Gel A (gel base sem ativo) nos tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada.

Refrigerador

Ambiente Estufa Luz

Tempo (dias)

T0

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

pH % variação

6,17

6,25

1,30

6,12

-0,81

6,12

-0,81

6,12

-0,81

6,05

-1,94

6,06

-1,78

6,01

-2,59

6,14

-0,49

6,10

-1,13

6,03

-2,27

6,30

2,11

6,01

-2,59

6,13

-0,65

6,16

-0,16

6,04

-2,11

6,14

-0,49

6,14

-0,49

6,20

-0,49

6,03

-2,27

5,99

-2,92

Viscosidade (Centipoise) % variação

97014

96247

-0,79

97169

0,16

78701

-18,88

78983

-18,59

77856

-19,75

92236

-4,93

87243

-10,07

93104

-4,03

93125

-4,01

76924

-20,71

98865

1,91

12365

27,46

96454

-0,58

68249

-29,65

62566

-35,51

95681

-1,37

93810

-3,30

75073

-22,62

48021

-50,50

32240

-56,46

Densidade % variação

0,95

1,01

6,32

1,013

6,63

1,013

6,63

1,009

6,21

0,999

5,16

1,007

6,00

0,998

5,05

1,015

6,84

1,007

6,00

0,992

4,42

1,004

5,68

1,014

6,74

1,014

6,74

1,015

6,84

0,98

3,16

1,1015

6,84

1,011

6,42

1,016

6,95

1,016

6,95

0,975

2,63

Aspecto

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

N

LM

Cor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

N

N

Odor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

N

N

N

N

LM

Legenda: N – normal, sem alteração; LM – levemente modificado; M – Intensamente Modificado.

59

Figura 12. Variação (%) de pH do Gel A durante 90 dias em relação ao tempo

inicial.

Figura 13. Variação (%) de Viscosidade do Gel A durante 90 dias em relação

ao tempo inicial.

60

Figura 14. Variação (%) de Densidade do Gel A durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

O Gel B, formulado com uréia, foi a formulação que mais sofreu

alteração. De acordo com a Tabela 4, as modificações ocorridas com as

características organolépticas foram relevantes. A Figura 29 apresenta a

grande alteração na cor do gel em relação aos demais. Quando armazenado

em temperatura elevada e na presença da luz, o valor do pH foi alterado de

forma acentuada. Reparou-se que, na medida em que o valor de pH aumenta,

devido à decomposição da uréia em amônia, a viscosidade diminui e a

densidade pouco altera. Nas Figuras 15 e 16, verificou-se o aumento

aproximado de 30% no valor de pH e, conseqüentemente, uma queda na

viscosidade de quase 100%. Segundo Montagner e Corrêa (2004), o estudo de

estabilidade de formulação cosmética formulada com uréia a 5%, corroborou

com resultados do experimento, sugerindo que um produto formulado com

uréia não pode ter pH alcalino, nem deve ser submetido a calor.

61

Tabela 4. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de variação e aspectos organolépticos do Gel B (gel base com uréia) nos tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada.

Refrigerador

Ambiente Estufa Luz

Tempo (dias)

T0

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

pH % variação

6,35

6,18

-2,68

6,05

-4,72

6,15

-3,15

6,09

-4,09

5,99

-5,67

6,17

-2,83

6,20

-2,36

6,34

-0,16

6,41

0,94

6,37

0,31

6,42

1,10

6,5

2,36

7,1

11,81

7,62

20,00

7,85

23,62

6,04

-4,88

6,26

-1,42

6,11

-3,78

6,16

-2,99

6,15

-3,15


1257

42

127738

1,59

112025

-10,91

98178

-21,92

124529

-0,97

97438

-22,51

118885

-5,45

96560

-23,21

94104

-25,16

96923

-22,92

96023

-23,63

95838

-23,78

64591

-48,63

29842

-76,27

9329

-92,58

5771

-95,41

12367

-1,64

96278

-23,43

76974

-38,78

63852

-49,22

59156

-52,95


1,021

1,023

0,20

1,025

0,39

1,029

0,78

1,026

0,49

1,007

-1,37

1,008

-1,27

1,017

-0,39

1,027

0,59

1,027

0,59

0,991

-2,94

1,020

-0,10

1,026

0,49

1,027

0,59

1,021

0,00

1,016

-0,49

1,01

-1,08

1,022

0,10

1,025

0,39

1,016

-0,49

1,007

-1,37

Aspecto

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

M

N

N

N

N

LM

Cor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

M

M

N

N

N

N

LM

Odor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

N

LM


62

Figura 15. Variação (%) de pH do Gel B durante 90 dias em relação ao tempo

inicial.

Figura 16. Variação (%) de Viscosidade do Gel B durante 90 dias em relação

ao tempo inicial.

63

Figura 17. Variação (%) de Densidade do Gel B durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

Da análise do Gel C, formulado com extrato vegetal, puderam ser

constatadas pequenas alterações organolépticas com a influência do calor e da

luz (Tabela 5). Com relação à viscosidade (Figura 19), foram observadas

alterações que não atingiram 20%, não sendo visualmente perceptível, não

comprometendo, desta maneira, o aspecto final do produto.

64

Tabela 5. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de variação e aspectos organolépticos do Gel C (Gel base com

Extrato Vegetal) nos tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada.

Refrigerador Ambiente Estufa Luz

Tempo (dias)

T0

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

pH % variação

6,09

6,32

3,78

5,92

-2,79

6,18

1,48

6,18

0,66

6,11

-0,66

6,16

1,15

6,06

-0,49

6,18

1,48

6,13

0,66

6,05

-0,66

6,08

-0,16

5,88

-3,45

5,99

-1,64

5,98

-1,81

5,88

-3,45

6,16

1,15

6,02

-1,15

6,04

-0,82

6,14

0,82

6,01

-1,31


35282

37410

6,03

37806

7,15

37817

7,18

38552

9,27

38140

8,10

38100

7,99

32385

-8,21

46079

2,26

31222

-11,51

31674

-10,23

38607

9,42

30808

-12,68

31658

-10,27

30166

-14,50

29045

-17,68

36562

3,63

31419

-10,95

31205

-11,56

31463

-10,82

31674

-10,23


1,014

1,010 -0,39

1,018

0,39

1,020

0,59

1,020

0,59

0,998

-1,58

1,007

-0,69

1,015

0,10

1,021

0,69

1,018

0,39

1,000

-1,38

1,014

0,00

1,018

0,39

1,020

0,59

1,019

0,49

1,000

-1,38

1,007

-0,69

1,014

0,00

1,014

0,00

1,020

0,59

0,997

-1,68

Aspecto

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

LM

N

N

N

LM

LM

Cor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

LM

N

N

LM

LM

LM

Odor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

LM

LM


65

Figura 18. Variação (%) de pH do Gel C durante 90 dias em relação ao tempo

inicial.

Figura 19. Variação (%) de Viscosidade do Gel C durante 90 dias em relação

ao tempo inicial.

66

Figura 20. Variação (%) de Densidade do Gel C durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

No Gel D, gel base com componentes do FHN, podem-se observar,

na Tabela 6, apenas leves modificações nas características organolépticas,

mesmo quando submetido ao aquecimento na estufa, a partir de 60 dias, e com

a exposição à luz, a partir de 90 dias.

As alterações do valor de pH (Figura 21) e de densidade (Figura 23) não

foram expressivas. Ocorre que, a viscosidade (Figura 22) apresentou alteração

maior que 20%, após 90 dias, na presença da luz.

67

Tabela 6. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de variação e aspectos organolépticos do Gel D (Gel com

Componentes do FHN) nos tempos 7, 15, 30, 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada.


Tempo (dias)

T0

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

pH % variação

6,08

6,22

2,30

5,97

-1,81

6,13

0,82

6,15

1,15

6,06

-0,33

6,14

0,99

6,07

-0,16

6,16

1,32

6,14

0,99

6,06

-0,33

6,23

2,47

5,99

-1,48

6,13

0,82

6,12

0,66

6,02

-0,99

6,11

0,49

6,11

0,49

6,19

1,81

6,17

1,48

5,98

-1,64


36673

38338

4,54

38835

5,90

38281

4,38

38459

4,87

38705

5,54

39175

6,82

37413

2,01

38251

4,30

37646

2,65

37696

2,79

38420

4,76

38754

5,67

32203

-12,19

32493

-11,40

31080

-15,25

35277

-3,81

38223

4,23

36914

0,65

31465

-14,20

17258

-25,67


1,013

1,016

0,30

1,016

0,30

1,012

-0,10

1,015

0,20

0,986

-2,67

1,010

-0,30

1,013

0,00

1,014

0,10

1,014

0,10

0,989

-2,37

1,015

0,20

1,016

0,30

1,016

0,30

1,012

-0,10

0,994

-1,88

1,008

-0,49

1,010

-0,30

1,013

0,00

1,018

0,49

0,995

-1,78

Aspecto

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

N

N

N

LM

LM

Cor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

N

N

N

LM

LM

Odor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

N

N

N

N

N


68

Figura 21. Variação (%) de pH do Gel D durante 90 dias em relação ao tempo

inicial.

Figura 22. Variação (%) de Viscosidade do Gel D durante 90 dias em relação

ao tempo inicial.

69

Figura 23. Variação (%) de Densidade do Gel D durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

Poucas mudanças ocorreram no Gel G, formulado com derivado de açúcar, em relação ao valor de pH e à densidade, não passando de 3% de

variação (Figuras 24 e 26).

Como nos demais géis, as características organolépticas tiveram poucas

modificações, contudo, nesse caso, essas modificações iniciaram-se com 30

dias de formulação em ambiente, estufa e na presença da luz. A diminuição

expressiva da viscosidade ocorreu a partir do 15º dia, quando exposto à luz, e

no 90º dia, na estufa, chegando a 50% de diferença.

70

Tabela 7. Valores de pH, viscosidade, densidade com suas respectivas % de variação e aspectos organolépticos do Gel G (Gel com Derivado de Açúcar) nos tempos 7, 15, 30. 60 e 90 dias no estudo de estabilidade acelerada.


Tempo (dias)

T0

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

7

15

30

60

90

pH % variação

6,03

6,16

2,16

5,94

-1,49

6,05

0,33

6,06

0,50

5,96

-1,16

5,97

-1,00

5,93

-1,66

6,03

0,00

6,00

-0,50

5,93

-1,66

6,11

1,33

5,84

-3,15

6,01

-0,33

5,96

-1,16

5,85

-2,99

6,01

-0,33

5,93

-1,66

5,99

-0,66

5,99

-0,66

5,85

-2,99


30831

31460

2,04

29661

-3,79

30195

-2,06

30002

-2,69

29860

-3,15

59993

-2,72

29612

-3,95

29221

-5,22

28947

-6,11

28641

-7,10

29518

-4,26

29704

-3,66

19496

-4,33

29189

-5,33

15644

-49,26

52348

4,92

19544

-36,61

14919

-51,61

14576

-52,72

14515

-52,92


1,019

1,011

-0,79

1,026

0,69

1,029

0,98

1,027

0,79

1,008

-1,08

1,024

0,49

1,016

-0,29

1,027

0,79

1,026

0,69

1,017

-0,20

1,020

0,10

1,023

0,39

1,020

0,10

1,026

0,69

1,016

-0,29

1,021

0,20

1,023

0,39

1,026

0,69

1,027

0,79

1,005

-1,37

Aspecto

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

LM

N

N

LM

LM

LM

Cor

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

LM

N

N

LM

LM

LM

N

N

N

LM

LM

Odor

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

LM

LM

LM

N

N

N

N

N


71

Figura 24. Variação (%) de pH do Gel G durante 90 dias em relação ao tempo inicial.

Figura 25. Variação (%) de Viscosidade do Gel G durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

72

Figura 26. Variação (%) de Densidade do Gel G durante 90 dias em relação ao

tempo inicial.

Em relação à avaliação visual da Estabilidade Acelerada após 90 dias,

constatou-se que não ocorreram modificações relevantes dos géis A, C, D e G

(Figuras 27, 28 29 e 30, respectivamente). Notou-se, também, alteração expressiva

na coloração do Gel B formulado com a uréia (Figura 29). Esse resultado confirma a

instabilidade da uréia em formulações expostas a altas temperatura, nas quais houve

aumento do pH, liberação de amônia e dióxido de carbono e, conseqüentemente,

decaimento expressivo da viscosidade (HIRAKI et al., 1998).

Os resultados sugeriram que o aumento da temperatura e do tempo de

armazenamento influenciaram nas características organolépticas das formulações

com maior intensidade no aspecto e na cor. Verificou-se, inclusive, que o aumento

73

de temperatura e a exposição à luz influenciaram na diminuição da viscosidade em

todas as formulações testadas, após 90 dias.

Estas observações estão de acordo com estudos de estabilidade citados na

literatura, sendo a ação do calor e o tempo de exposição fatores relevantes

(LEONARDI, MAIA, 2001; SCHUELLER & ROMANOWSKI, 2002; VELASCO-DE-

PAOLA, 2001).

Portanto, os testes de estabilidade acelerada realizados nos géis em estudo

sugerem que os produtos podem manter-se estáveis durante um período de

armazenamento de três meses, desde que ajustado o valor de pH entre 5,5 e 6,5 e

mantido ao abrigo do calor e da luz.

Figura 27. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis após 90

dias no Refrigerador a 5 ºC, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel

B (Uréia), Gel C (extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar) e Gel

D(componentes do FHN).

74

Figura 28. Avaliação visual da Estabilidade Acelerada dos géis, após 90

dias em contato direto com a Luz, da esquerda para a direita: Gel A

(base), Gel B (Uréia), Gel C (extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar)

e Gel D (componentes do FHN).


dias na Estufa a 37 ºC, da esquerda para a direita: Gel A (base), Gel B

(Uréia), Gel C (extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar) e Gel D

(componentes do FHN).

75


dias à Temperatura Ambiente, da esquerda para a direita: Gel A (base),

Gel B (Uréia), Gel C (extrato vegetal), Gel G (derivado de açúcar) e Gel D

(componentes do FHN).

76

Avaliação in vivo da eficácia hidratante das formulações estudadas

Na avaliação da eficácia hidratante das formulações, as condições

ambientais, tais como a umidade e a temperatura, devem ser consideradas, com o

fim de se atingirem resultados confiáveis. O aumento da temperatura pode provocar

aumento nos resultados da hidratação no estrato córneo (BAREL, CLARYS,

GABARD, 1999).

É importante que haja, também, o controle das condições ambientais durante

todo o experimento com os equipamentos que medem a perda de água

transepidérmica, já que os valores são inversamente proporcionais à umidade do

ambiente. Em outras palavras, quanto maior a umidade do ar, menor será a perda de

água transepidérmica. Correntes de ar podem afetar a precisão dos resultados,

sendo recomendado, portanto, proteger o aparelho destas correntes (HARRIS,

2003).

Avaliar a perda de água transepidérmica é importante para analisar não só a

integridade e a eficiência desta barreira, mas também o efeito de substâncias

químicas sobre a superfície cutânea. O nível de TEWL serve como indicador da

permeabilidade da pele na aplicação de substâncias tópicas. (BAREL, CLARYS,

GABARD, 1999; HARRIS, 2003; LODÉN, 2003)

Quanto à condição de aplicação do produto, é necessário que a quantidade

seja suficiente para promover o efeito desejado. Não se deve realizar a medição sob

exposição direta de luz (solar ou elétrica) e deixar os voluntários em repouso durante

20 minutos, uma vez que o estresse psicológico retarda a recuperação da

permeabilidade cutânea (LODÉN, 2003 ; BAREL, CLARYS, GABARD, 1999; LI et al.,

2001).

Em relação ao local de aplicação, escolheu-se o antebraço para realizar as

medições devido à reduzida quantidade de pêlos presentes e à facilidade de

manuseio nesta área específica (SIVAMANI et.al., 2003).

A aplicação de formulações contendo proporção elevada de água resulta em

aumento imediato nos resultados, enquanto a aplicação de fórmulas isenta de água

reduz esses valores, tanto para medida de hidratação, quanto para perda de água

(LODÉN, 2003).

77

O estudo foi conduzido de acordo com o projeto fatorial three way (ANOVA).

Nessa estrutura (Figura 11), havia três variáveis, duas delas de interesse para o

presente trabalho, sendo uma delas os diferentes géis hidratantes (gel base e quatro

formulações com substâncias ativas) e a outra a variável tempo. A terceira variável

foi o voluntário, que apresenta inevitável fonte de variação. A presença desse tipo de

fator requer que o experimento seja conduzido em bloco para a eliminação da

variabilidade entre os indivíduos. (SILVA et al., 2009).

Primeira Etapa Na primeira etapa, de acordo com a Figura 6, utilizaram-se 7 produtos (Tabela

1) e o controle; 5 níveis de tempo (0, 30, 60, 90, 120 minutos); e participação de 11

voluntários. A análise de variância para os dados organizados está apresentada na

Tabela 8.

Tabela 8 - ANOVA para os dados obtidos segundo o esquema da Figura 11, para as

medidas realizadas com o Corneometer®.

Fonte de variação Soma dos Quadrados

Grau de Liberdade

Variância Estimada Razão F Valor p

Constante 1309718 1 1309718 206683 0,00000 Voluntário 14259 10 1426 225 0,00000 Tempo 24225 4 6056 956 0,00000 Produto 7104 7 1015 160 0,00000 Voluntário*Tempo 1866 40 47 7,4 0,00000 Voluntário*Produto 8446 70 121 19 0,00000 Tempo*Produto 1845 28 66 10,4 0,00000 Erro 1774 280 6

Na análise da variância apresentada na Tabela 8, observa-se que as variáveis

(voluntário, tempo, produto, e as interações) apresentaram diferenças significativas

nessa etapa com nível de significância menor que 0,0001.

78

O experimento foi conduzido de forma adequada, visto que os resultados

obtidos representam bem o modelo do planejamento. O histograma de resíduo

(Figura 31) apresenta simetria. Adicionalmente, os valores preditos e os valores

encontrados, quando relacionados à reta de 45° (Figura 32), estão ajustados com

dispersão próximos à reta. Portanto, os resultados encontrados são confiáveis.

Figura 31. Histograma de resíduos, para a ANOVA dos resultados obtidos na

leitura do Corneometer®.

79

Figura 32. Reta de 45% (valores preditos versus valores observados), para o

projeto fatorial three way (ANOVA), construído com os dados obtidos

pelo esquema da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o

Corneometer®.

A comparação das médias para os grupos homogêneos entre as variáveis

voluntário, tempo e com o Corneometer® são apresentadas a seguir, na Tabela 9.

Tabela 9 - Grupos homogêneos de médias para a variável Voluntário, obtidos pelo

teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Corneometer®.

Voluntário Corneometer 1 2 3 4 5 6 7 8 7 42,00 ****

10 47,89 **** 8 50,26 **** 1 52,54 **** 6 54,80 **** 4 55,62 **** **** 9 56,13 **** **** 2 57,04 **** 3 57,27 **** 5 61,62 ****

11 63,98 ****

80

Os resultados corroboraram com a literatura frente à variação individual do

voluntário (BERARDESCA et al., 1997). Observa-se, na Tabela 9, que os voluntários

são muito diferentes quanto à média da leitura da capacitância elétrica após o

tratamento. O voluntário 7 foi o que apresentou a menor média, enquanto o

voluntário 11 foi o que apresentou a maior média. Os voluntários 4, 6 e 9 foram

estatisticamente equivalentes (grupo 5) e, pela análise de Tukey HSD, agruparam-se

os voluntários 2, 3, 4 e 9, que não apresentaram diferenças significativas. Assim, as

respostas individuais dos voluntários podem comprometer a análise dos efeitos das

outras variáveis, produto e tempo, tendo sida eliminada, portanto, essa fonte de

variação, a fim de tornar mais sensível a análise (BOX, HUNTER, 2005).

Tabela 10- Grupos homogêneos de médias para a variável Tempo, obtidos pelo

teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Corneometer.

Tempo (minutos)

Corneometer 1 2 3

0 39,77 **** 90 57,27 ****

120 58,08 **** **** 30 58,63 **** 60 59,04 ****

A Tabela 10 apresenta apenas 3 grupos homogêneos. O grupo 1, com o

tempo zero; o grupo 2 com os tempos 90 e 120 minutos; e o grupo 3, com os tempos

120, 30 e 60 minutos, estatisticamente equivalentes. Com intuito de verificar a

influência do tempo no experimento, ampliou-se o número desta variável de 2 horas

para 3 horas na segunda etapa (Figura 6).

81

Tabela 11- Grupos homogêneos de médias para a variável Produto, obtidos pelo


Produto Coneometer® 1 2 3 4 Controle 46,07 **** Gel E 53,63 **** Gel D 54,00 **** Gel F 54,55 **** **** Gel A 54,80 **** **** Gel G 55,71 **** Gel C 55,87 **** Gel B 61,83 ****

Para o produto, foram gerados 4 grupos homogêneos. O destaque, com maior

média foi o Gel B (uréia). O controle, como já imaginado, apresentou menor média e

os demais produtos se distribuíram nos grupos 2 (Géis E, D, F e A) e 3 (Géis F, A, G

e C).

Com o objetivo de tornar ainda mais claras as diferenças de média dos níveis

dos fatores, a seguir serão apresentados gráficos que revelam o comportamento dos

efeitos principais e das interações dos fatores para os dados dessa primeira etapa.

Figura 33. Médias dos voluntários, exibindo o intervalo de confiança (95%), para o

modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da

Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®.

82

Figura 34. Médias dos níveis de tempo, exibindo o intervalo de confiança (95%),

para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo

esquema da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o

Corneometer®.

Figura 35. Médias dos Produtos e o Controle, exibindo o intervalo de confiança

(95%), para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo

esquema da Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®.

83


(95%), para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos


Corneometer®.

Figura 37. Voluntário versus Produto, exibindo o intervalo de confiança (95%),



Corneometer®.

84

Figura 38. Interação Tempo versus Produto, exibindo o intervalo de confiança



Corneometer®.

Analisando-se as Figuras 33 a 38, percebem-se, claramente, as indicações

dos efeitos principais e dos efeitos interativos. Essa interação pode ser analisada

pelo cruzamento das linhas.

Verifica-se diferença estatística significante da capacitância cutânea nos Géis

B, C e G comparando com a área não-tratada. Não se observou diferença cutânea

quando comparou-se o Gel E (silício orgânico) 4% com a área não-tratada. Não

houve, também, diferença na capacitância do Gel A (base) e de outros géis, quando

comparados em blocos de 30, 60, 90 e 120 minutos após aplicação. Os

comportamentos de todos os géis foram os mesmos nos tempos 30 e 60 minutos

(Figura 38). Todavia, no tempo 90 e 120 minutos houve diferença no

comportamento, sugerindo a necessidade de mais tempo de estudo. (SILVA et al.,

2006)

85

Como a variável de interesse é o Produto, vê-se que o Gel B se destaca em

relação aos demais, comprovando a eficácia da uréia, com referência a hidratação.

Esses resultados confirmam o estudo de COUTEAU, COIFFARD & SÉBILLE-RIVAIN

(2006).

Segunda Etapa

Análise das medidas feitas com o Corneometer®

No segundo grupo de dados, conforme demonstrado à Figura 5, utilizou-se

um número de 6 voluntários, pois foi verificado que a realização da análise estatística

com essa quantidade era possível (CODERCH et al., 2002); aumentou-se o nível de

tempo para 7; e utilizaram-se, novamente, os 7 produtos (Tabela 1) e o controle. Os

dados foram analisados seguindo um esquema semelhante ao da Figura 11,

substituindo em cada fator os níveis analisados nessa segunda etapa. A ANOVA

para estes dados é encontrada na Tabela 12.

Tabela 12 - ANOVA para os dados obtidos segundo o esquema da Figura 11, para

as medidas realizadas com o Corneometer®.


Grau de Liberdade

Variância estimada Razão F Valor p

Constante 1304731 1 1304731 239926 0,000000 Voluntário 22995 5 4599 846 0,000000 Tempo 8865 6 1478 272 0,000000 Produto 5677 7 811 149 0,000000 Voluntário*Tempo 2505 30 84 15 0,000000 Voluntário*Produto 3676 35 105 19 0,000000 Tempo*Produto 1072 42 26 4,7 0,000000 Erro 1142 210 5

Todos os fatores e suas interações também foram significantes ao nível de

significância de 5%. O histograma de resíduos e a reta de 45º estão apresentados

nas Figuras 39 e 40.

86



Figura 40. Reta de 45º, para o modelo indicado pela ANOVA dos resultados

obtidos na leitura do Corneometer®.

As Figuras 39 e 40 indicam que o modelo representa bem este conjunto de

dados. Ou seja, distribuição simétrica dos resíduos e forte dependência linear entre

valores preditos e valores observados.

87

A comparação das médias dos efeitos principais dos Voluntários, Tempo e

Produto, pelo teste de Tukey HSD pode ser feita pela observância das Tabelas 13,

14 e 15. Essas tabelas apresentam as médias em ordem crescente e separadas em

grupos homogêneos, de acordo com os limites das diferenças entre elas serem ou

não significativas.



Voluntário Corneometer 1 2 3 4 5 6 3 48,42 **** 2 57,03 **** 6 59,71 **** 1 66,71 **** 5 69,28 **** 4 73,02 ****

Observa-se que todos os voluntários são diferentes entre si, justificando o

estudo dos mesmos, como variável de bloco. Assim, pode-se eliminar estes desvios

do erro, tornando a análise dos produtos e dos níveis de tempo mais sensível.

Tabela 14 - Grupos homogêneos de médias para a variável Tempo, obtidos pelo


Tempo(minutos) Corneometer 1 2 3 4 0 50,18 ****

30 61,14 **** 90 62,96 ****

180 63,89 **** 120 65,87 ****

60 65,98 **** 150 66,29 ****

Os níveis de tempo apresentaram 4 grupos homogêneos, sendo que a

primeira medida (correspondente ao primeiro nível de tempo, tempo zero) foi a que

apresentou menor média, como o esperado.

88

Tabela 15 - Grupos homogêneos de médias para a variável Produto, obtidos pelo


Produto Corneometer 1 2 3 4 5 Controle 54,14 **** Gel D 60,57 **** Gel F 60,79 **** Gel E 61,01 **** Gel A 63,08 **** Gel C 64,53 **** **** Gel G 65,56 **** Gel B 69,22 ****

O controle, como esperado apresentou menor valor. Os géis D, F e E são

estatisticamente equivalentes. O Gel A (base) e o Gel C pertencem ao mesmo grupo.

O grupo homogêneo 4 apresenta o Gel C e Gel G, estatisticamente iguais. Mais uma

vez, o destaque é dado ao Gel B com a maior média apresentada, no grupo

homogêneo número 5.

A seguir, a exemplo do caso anterior, serão apresentadas as figuras com os

efeitos principais e de interações entre os fatores.

89



Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Corneometer®. Pode-se ver

nitidamente a grande discrepância entre o Voluntário 3 e o Voluntário 4.

Figura42. Médias dos níveis de Tempo, exibindo o intervalo de confiança (95%),



90







91




Figura 46. Interação Tempo versus Voluntário, exibindo o intervalo de confiança



92

Terceira Etapa

Este grupo de dados foi obtido com medidas feitas em vários equipamentos

distintos. Foram utilizados dois equipamentos que medem indiretamente a

capacitância elétrica (Corneometer® e Moisturemeter®) e dois equipamentos que

avaliam a perda de água transepidérmica (Tewlmeter® e Vapometer®).

Posteriormente, o Corneometer® e o Moisturemeter® serão comparados ao

Tewlmeter® e ao Vapometer® quanto à precisão das medidas.

O terceiro grupo de dados apresentou níveis diferentes de variáveis, conforme

apresenta a Figura 6. Utilizaram-se 8 voluntários (LOFLER, DREHER, MAIBACH,

2004; PAYE et al., 2007) ; 6 níveis de tempo e 5 produtos, como mostra a Tabela 3,

pois foram excluídos aqueles que não apresentavam resultados expressivos e o

controle. Os dados foram analisados seguindo um esquema semelhante ao da

Figura 11, substituindo para cada fator os níveis analisados nessa terceira etapa. A

análise de variância para estes dados está na Tabela 16.

93

Análise das medidas feitas com o Corneometer® Tabela 16 - ANOVA para os dados obtidos segundo o esquema da Figura 11, para

as medidas realizadas com o Corneometer®.


Grau de Liberdade

Variância Estimada

Razão F

Valor p

Constante 463631 1 463631 55745 0,000000 Voluntário 7388 7 1055 127 0,000000 Tempo 3492 5 698 84 0,000000 Produto 3938 5 788 95 0,000000 Voluntário*Tempo 693 35 19,8 2,38 0,000120 Voluntário*Produto 3804 35 109 13 0,000000 Tempo*Produto 798 25 31,9 3,84 0,000000 Erro 1456 175 8,3

Mais uma vez, observou-se que todos os efeitos foram significantes ao nível

de significância 5%, indicando que as variáveis selecionadas e suas interações eram

importantes para explicar o conjunto de dados. As Figuras 47 e 48 ilustram o ajuste

do modelo da ANOVA, assim como os anteriores.

94




obtidos na leitura do Corneometer®.

95

O histograma do resíduo e a reta de 45º indicam que o modelo é adequado

para representar o conjunto de dados.

A comparação das médias foi feita segundo o teste de Tukey HSD. Os grupos

homogêneos estão apresentados nas Tabelas de 17 a 19.



Voluntário Corneometer 1 2 3 4 2 30,37 **** 3 34,18 **** 6 39,26 **** 7 41,17 **** 4 41,19 **** 1 44,10 **** 5 44,60 **** 8 46,11 ****

Essa etapa foi a que apresentou menor quantidade de grupos homogêneos. O

teste de Tukey HSD mostrou que os voluntários foram divididos em 4 grupos, sendo

que os Voluntários 2 e 3 apresentaram médias isoladas, em relação aos 6

voluntários restantes; os Voluntários 6, 7 e 4 são estatisticamente equivalentes; e os

Voluntários 1 e 5 são estatisticamente iguais ao Voluntário 8, ficando estes 3 últimos

no 4º grupo homogêneo, conforme explicitado na Tabela 17.



Tempo (minutos)

Corneometer 1 2 3

0 32,43 **** 240 40,80 **** 360 41,23 **** **** 120 41,83 **** ****

30 41,97 **** **** 60 42,49 ****

96

Neste caso, os níveis de tempo apresentaram 3 grupos homogêneos, sendo

que o primeiro nível de tempo (tempo zero) apresentou menor média. Os 5 níveis

restantes, por sua vez, foram postos nos Grupos 3 e 4. Os tempos 360, 120 e 30

minutos são comuns aos dois grupos.



Produto Corneometer 1 2 3 Controle 32,60 **** Gel D 39,55 **** Gel A 40,28 **** Gel C 41,18 **** Gel G 43,20 **** Gel B 43,92 ****

Os produtos propriamente ditos foram separados em dois grupos (2 e 3),

enquanto o controle, como esperado, apresentou menor média. Novamente, a Uréia

(Gel B) apresentou as maiores médias, seguida do Gel G, estatisticamente

equivalentes. O Géis A e C são estatisticamente iguais ao Gel D.

A exemplo dos outros casos, as figuras a seguir revelam o que foi dito pelos testes

estatísticos anteriores.

97







98




....

Figura 52. Interação ProdutoTempo, exibindo o intervalo de confiança (95%), para

o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos pelo esquema da


99







100

Houve evidências de diferenças estatísticas com os tempos das medidas

entre os géis, conforme se depreende da Figura 54. Foi observada, inclusive,

diferença estatística significante da capacitância cutânea no tratamento com os Géis

B, C e E em comparação com a área não-tratada. (SILVA et al., 2007)

Análise das Medidas feitas com o Moisturemeter®

O planejamento empregado foi o mesmo do Corneometer®, e as medidas foram

feitas no mesmo dia. A Tabela 20 apresenta a análise de variância para estes dados.


as medidas realizadas com o Moisturemeter®.


Grau de Liberdade

Variância Estimada

Razão F

Valor p

Constante 213096 1 213096 7508 0,000000 Voluntário 18221 7 2603 92 0,000000 Tempo 10987 5 2197 772 0,000000 Produto 8127 5 1626 572 0,000000 Voluntário*Tempo 1590 35 45 1,601 0,026089 Voluntário*Produto 10884 35 311 11 0,000000 Tempo*Produto 1999 25 80 2,817 0,000041 Erro 4967 175 28 Pela tabela, nota-se que todos os efeitos foram significativos ao nível de significância

de 5%.

101


leitura do Moisturemeter®.


obtidos na leitura do Moisturemeter®.

Tanto o histograma de resíduos quanto a reta de 45º indicam que os dados

representam bem o modelo. A comparação das médias e a separação em grupos

homogêneos foram feitas por meio de teste de Tukey HSD.

102


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Moisturemeter®

.Voluntário Moisturemeter 1 2 3 4 5 6 2 11,74 **** 3 19,73 **** 6 23,99 **** 7 28,06 **** 4 28,77 **** 1 33,12 **** 8 34,63 **** **** 5 37,57 ****

O comportamento das medidas para separação dos grupos homogêneos para

os voluntários foi muito parecido entre o Corneometer® e Moisturemeter®. Houve

apenas uma inversão nas médias dos voluntários 5 e 8 no Corneometer® e 8 e 5 no

Moisturemeter®. Tal fato não é preocupante, tendo em vista que as médias são

estatisticamente iguais em ambos os casos.


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Moisturemeter®.

Tempo (minuto)

Moisturemeter 1 2 3

0 13,89 **** 30 27,25 **** 60 28,35 ****

120 30,28 **** **** 360 31,66 **** 240 31,79 ****


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Moisturemeter®.

Produto Moisturemeter 1 2 3 Controle 17,44 **** Gel A 25,98 **** Gel D 26,08 **** Gel C 27,80 **** Gel G 31,44 **** Gel B 34,47 ****

103



Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Moisturemeter®.




Moisturemeter®.

104



Figura 11 e pelas medidas realizadas com o Moisturemeter®.




Moisturemeter®.

105




Moisturemeter®.




Moisturemeter®.

106

Comparação entre Corneometer® e Moisturemeter®

Figura 63. Intervalo de confiança para os desvios padrões das medidas feitas com 1-

Corneometer® e 2- Moisturemeter® e Teste F para comparação de

variâncias das medidas feitas com os referidos equipamentos.

107

Por não haver repetições genuínas dessas medidas, tomou-se o grupo de

controle usando como repetição os níveis de tempo e eliminando-se o efeito das

diferenças entre voluntários.

Os dados apresentados nas Tabelas 16 e 20 indicam que os efeitos principais

da interação dos dois fatores foram estatisticamente significantes ao nível de α=0,05.

Ambos os equipamentos apresentaram perfórmance similar.

Os valores preditos e valores observados (Figuras 48 e 56) apresentam uma

relação linear em ambos os equipamentos. As Figuras 49 e 57 mostram a

importância do uso de blocos para esse fator. A variabilidade dos voluntários poderia

impossibilitar a verificação dos efeitos dos outros fatores, que, no caso, são mais

importantes (produto e tempo). Após a eliminação do efeito de bloco, a análise

revelou que gel e tempo também são variáveis significativas, assim como a interação

entre eles (SILVA et al., 2009).

Os efeitos de gel e tempo não podem ser interpretados separadamente,

devido à interação. As Figuras 50 e 58 ilustram essa confirmação e apresentam

diferentes comportamentos de tempo em resposta aos géis, em relação ao controle.

Para ambos os equipamentos, a melhor hidratação cutânea aconteceu com o Gel B

após 30 minutos. Entretanto, foi observado que os valores das medidas com o

Corneometer® foram maiores que no MoistureMeter®, pois as médias para ambos

equipamentos foram 40 ± 3 e 27 ± 5 unidades arbitrárias, respectivamente.

O método para comparações múltiplas de Tukey HSD foi utilizado para

comparar todas as médias de níveis de tempo e produto, levando em consideração

que todas foram simultaneamente estudadas. Os resultados estão apresentados nas

Tabelas 19 e 23 para o Corneometer® e MoistureMeter® respectivamente (SILVA et

al., 2009).

Em relação à média das medidas dos níveis de hidratação na superfície

cutânea (Tabelas 19 e 23), foi observado que o gel contendo uréia 4% (Gel B) e o

gel contendo composto derivado de açúcar (xylityglucoside, anhydroxylitol and xylitol)

4% (Gel G) apresentaram o maior efeito hidratante, de acordo com a análises

estatísticas (p< 0,05). Foi verificado, também por esses dois equipamentos, que o

108

gel contendo extrato vegetal (I. cylindrica) 4% (Gel C) e o gel contendo componentes

do FHN 4% (Gel D) foram estatisticamente equivalentes ao Gel A (base, sem ativo).

As formulações contendo uréia são conhecidas por influenciar as

propriedades da barreira cutânea, reduzindo a perda de água transepidérmica,

aumentando a capacitância cutânea e reduzindo reações irritantes. Embora o

mecanismo exato da ação da uréia seja desconhecido, a melhora na função da

barreira pode ser relacionada com um aumento do tamanho do corneócito (LODEN,

MAIBACH, 2000).

Imperata cylindrica é uma planta subtropical encontrada no hemisfério sul que

contém componentes osmoprotetivos naturais. Os rizomas contêm açúcar, 3-

dimetilsulfonilpropionato (DMSP) e alta concentração de potássio. DMSP foi

recentemente descoberta como uma substância osmoprotetiva que permite acumular

água nas células da planta (TAPIA, 2006).

Com relação ao tratamento estatístico de ambos os equipamentos, a

interpretação dos resultados prova a equidade do efeito hidratante para as

formulações testadas. Entretanto, os valores numéricos obtidos por equipamento

apresentam diferenças; por exemplo, a área não-tratada apresentou 33 unidades

arbitrárias no Corneometer® e 17 unidades arbitrárias no Moisturemeter® (SILVA et

al., 2009).

O Corneometer® e Moisturemeter® apresentaram precisão estatisticamente

equivalente, de acordo com a estimativa das variâncias para o controle, eliminando o

efeito do voluntário, conforme anteriormente descrito. Foi verificada a sobreposição

dos desvios padrões, comprovando a precisão de ambos os equipamentos e

corroborando com os resultados de Alanen et al. (2004). O resultado do teste para

comparação dos equipamentos pode ser verificado na Figura 63.

Análise das medidas feitas com o Tewlmeter®

O planejamento foi idêntico ao anterior, inclusive em relação ao número de

níveis. A ANOVA para este modelo está apresentada na Tabela 24. A adequação do

109

modelo foi feita por meio dos resíduos na Figura 64 e da reta de 45o, Figura 65. As

figuras indicam que os resultados representam bem o modelo.


as medidas realizadas com o Tewlmeter®.


Grau de Liberdade

Variância Estimada

Razão F

Valor p

Constante 3062 1 3062 3159 0,000000 Voluntário 93 7 13 13,72 0,000000 Tempo 192 5 38 39,68 0,000000 Produto 103 5 21 21,34 0,000000 Voluntário*Tempo 95 35 2,73 2,81 0,000005 Voluntário*Produto 162 35 4,62 4,77 0,000000 Tempo*Produto 36 25 1,45 1,50 0,069343 Erro 170 175 0,97

110


leitura do Tewlmeter®.


na leitura do Tewlmeter ®.

111

Embora o modelo represente o conjunto de dados, nota-se que os resíduos

para esta medida são relativamente maiores, o que pode ser observado pelo maior

espalhamento dos pontos em torno da reta.

A comparação das médias e a separação em grupos homogêneos foram

feitas por meio de teste de Tukey HSD.

Tabela 25- Grupos homogêneos de médias para a variável Voluntário, obtidos pelo

teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Tewlmeter®.

Voluntário Tewlmeter 1 2 3 4 2 2,258 **** 5 2,794 **** **** 1 2,969 **** 6 3,217 **** 3 3,361 **** **** 8 3,381 **** **** **** 7 4,025 **** **** 4 4,078 ****

Os Voluntários foram divididos em 4 grupos homogêneos, sendo que o

segundo grupo, representado pelos Voluntários 5, 1, 6, 3 e 8, apresentou médias

estatisticamente iguais, ao passo que os Grupos 3 e 4 apresentaram três médias

(Voluntários 3, 8 e 7 no Grupo 3; e Voluntários 8, 7 e 4 no Grupo 4).

Tabela 26- Grupos homogêneos de médias para a variável Tempo, obtidos pelo


Tempo(minutos) Tewlmeter 1 2 3

30 2,548 **** 120 2,588 **** 60 2,633 ****

240 3,373 **** 360 3,565 ****

0 4,856 ****

112

Houve maior perda de água transepidérmica no tempo zero, seguida do

segundo grupo homogêneo (240 e 360 minutos). Os tempos 30, 20 e 60 minutos são

estatisticamente equivalentes, apresentando valores menores.



Produto Tewlmeter 1 2 3

Gel A 2,165 ****

Gel C 2,783 ****

Gel G 3,383 ****

Controle 3,665 ****

Gel D 3,765 ****

Gel B 3,802 ****

O teste de Tukey apresentou 3 grupos homogêneos, sendo que os géis G, D

e B pertencem ao 3º grupo e são estatisticamente iguais ao Controle.

As figuras a seguir, a exemplo das outras análises, revelam os resultados

apresentados nas tabelas.

113


modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos segundo o

esquema da Figura 11 e das medidas realizadas com o Tewlmeter®.


para o modelo da ANOVA, construído com os dados obtidos segundo o


114

Observa-se maior redução da perda de água transepidérmica nos tempos

intermediários 30, 60 e 120 minutos.






segundo o esquema da Figura 11 e das medidas realizadas com o

Tewlmeter®.

115




Tewlmeter®.




Em relação ao Tewlmeter®, não foi verificada evidência estatisticamente

significante da interação entre formulações e tempo (SILVA et al., 2007).

116

Análise das medidas feitas com o Vapometer®

O planejamento foi idêntico ao anterior, inclusive em relação ao número de

níveis. A ANOVA para este modelo está apresentada na Tabela 28.

A adequação do modelo foi feita por meio dos resíduos apresentados na

Figura 72 e da reta de 45o, Figura 73. As figuras indicam que os resultados

representam bem o modelo, embora neste caso também haja um espalhamento

razoável dos resíduos em relação aos valores das medidas.


as medidas realizadas com o Vapometer®.


Grau de Liberdade

Variância Estimada

Razão F Valor p

Constante 7481 1 7481 1703 0,000000 Voluntário 460 7 66 15 0,000000 Tempo 262 5 52 12 0,000000 Produto 46 5 9,136 2,080 0,070097 Voluntário*Tempo 148 35 4,238 0,965 0,530838 Voluntário*Produto 125 35 3,569 0,812 0,762512 Tempo*Produto 93 25 3,701 0,843 0,683246 Erro 768,710 175 4,393

117


leitura do Vapometer®.


na leitura do Vapometer®.

A comparação das médias e a separação em grupos homogêneos foram

feitas por meio de teste de Tukey HSD.

118


teste de Tukey HSD, para as medidas feitas com o Vapometer®.

Voluntário Vapometer 1 2 3 4 2 3,025 **** 1 4,297 **** **** 6 4,469 **** **** 5 4,739 **** 3 5,008 **** 8 5,278 **** **** 4 6,664 **** **** 7 7,292 ****

A resposta dos voluntários frente a medida no Vapometer® foi diferente da

apresentada pelo Tewlmeter. Embora o número de grupos homogêneos fosse o

mesmo (4 grupos), nem todos os indivíduos pertencem ao mesmo grupo.

119



Tempo (minutos)

Vapometer 1 2

30 4,312 **** 60 4,348 ****

120 4,390 **** 240 5,054 **** 360 5,473 ****

0 7,002 ****

No caso do tempo, nota-se que apenas o nível de tempo zero apresentou

média estatisticamente diferente das demais. Neste caso, também houve uma

diferença em relação ao Tewlmeter. Esta diferença é devida ao fato de o

Vapometer® apresentar uma maior dispersão em suas medidas, isto é, maior

variabilidade.



Produto Vapometer 1 2 Gel A 4,515 **** Gel G 4,815 **** **** Gel D 5,048 **** **** Gel C 5,123 **** **** Gel B 5,277 **** **** Controle 5,802 ****

Nos produtos, também o Vapometer® só apresentou 2 grupos homogêneos;

já o Tewlmeter®, apresentou 3. O valor do erro do modelo também justifica esta

diferença.

120

As figuras a seguir ilustram melhor o que foi retro apresentado. A presença do

erro maior das medidas também pode ser vista na barra que representa o intervalo

de confiança nas figuras do tempo e dos produtos.



esquema da Figura 11 e das medidas realizadas com o Vapometer®.




121







Vapometer®.

122




Vapometer®.




123

Comparação entre Tewlmeter® e Vapometer®

Figura 80. Intervalo de confiança para os desvios padrões das medidas feitas com 1

(Vapometer®) e 2 (Tewlmeter®), e Teste F para comparação de

variâncias das medidas feitas com os referidos equipamentos.

A análise já indicava que estes dois equipamentos apresentavam precisões

diferentes, mas, mesmo assim, foi feita uma comparação das variâncias tomando as

medidas do controle para o primeiro nível de tempo, vez que foram feitas 3 medidas

em cada voluntário.

A Figura 83 mostra a diferença marcante dos desvios padrões, isto é, não há

superposição dos intervalos de confiança. Também o teste F para comparação das

variâncias indica que elas são estatisticamente diferentes a um nível de significância

de 5% (p<0,0001). Assim, conclui-se que o Vapometer® tem uma precisão menor do

que o Tewlmeter®.

Nuutinem et al. (2003) compararam métodos de avaliação da perda de água

transepidérmica em câmara aberta (DermaLab) e fechada (Vapometer), porém

encontraram uma boa correlação dos resultados.

124

Segundo LODÉN (1997) e BURACZEWSKA et al. (2007), a uréia teria a

capacidade de reduzir artificialmente a perda de água transepidérmica após um

tratamento longo. Ocorre que, os resultados obtidos tanto com o Vapometer, quanto

com o Tewlmeter, medidos após uma única aplicação, mostraram que ela não foi

capaz de reduzir significativamente a perda de água.

Avaliação do comportamento in vitro das alterações causadas pelas substâncias hidratantes em modelo de estrato córneo

Com a finalidade de complementar e refinar o estudo in vivo, foi desenvolvido o

estudo in vitro. Atualmente, os testes de toxicidade em animais são contestados pelos

pesquisadores da Comunidade Européia, levando ao desenvolvimento de diversos

métodos alternativos in vitro. As técnicas espectroscópicas vibracionais são utilizadas no

estudo da estrutura do stratum corneum (BABY et al, 2006 a; BABY et al, 2006 b;HANH et

al., 2002; SCHENDZIELORZ et al.,1999). Tais métodos oferecem dados complementares

sobre a composição, disposição das moléculas constituintes da pele. No experimento, foi

utilizado como membrana o modelo da pele de cobra, com hidratação prévia devido à sua

natureza queratinosa não maleável e frágil (BABY, 2007).

Willians, Barry & Edwards (1992) utilizaram a espectroscopia Raman com

transformada de Fourier para estudar a estrutura do estrato córneo verificando o espectro

vibracional e comparando-o com o espectro obtido com a espectroscopia no infravermelho

com transformada de Fourier.

Nos experimentos, as amostras de muda de pele de cobra apresentaram espectros

FT-Raman de boa definição, principalmente na região relativa a vibrações de estiramento

C-H assimétrico e simétrico, como, por exemplo, dos Grupos CH2 e CH3 que absorvem na

região de 3100-2700 cm-1 e estão relacionados aos lipídeos.

Na Figura 81, observa-se que a amostra Solução B (uréia) apresentou maior

intensidade, seguida das amostras Solução G (derivado de açúcar) e Solução D

(compostos do FMN); as amostras da Solução E (silício orgânico) e Solução C (extrato

vegetal) apresentaram intensidades menores que a Solução A (controle). Na Figura 82, as

amostras Gel E (gel com silício orgânico) e Gel C (gel com extrato vegetal) apresentaram

125

intensidades iguais e maiores que as demais, seguidas da amostra Gel G (gel com

derivado de açúcar); a amostra do Gel B (gel com uréia) apresentou intensidade

semelhante à do Gel A (gel controle) e a amostra do Gel D (gel com componentes do FMN)

apresentou a menor intensidade.

Figura 81. Espectro FT-Raman das soluções a 4% dos ativos hidratantes

Sol A – solução controle; Sol B – solução de uréia; Sol E – solução de silício orgânico; Sol

C – solução de extrato vegetal; Sol G – solução de derivado de açúcar; Sol D – solução de

componentes do FMN

Em estruturas helicoidais, uma forte banda Raman para amida I ocorre próximo de

1652 cm-1 (AKHTAR et al., 1997). Uma outra banda evidente em espectros de estrato

córneo humano e que são facilmente reconhecidos utilizando o FT-Raman, são as bandas

que aparecem em torno de 1438 cm-1 e estão relacionadas com a deformação angular do

CH2. Ao analisar a Figura 81, verifica-se a presença de bandas fortes nas amostras da

Solução G (derivado de açúcar) e Solução B (uréia), seguida da amostra da Solução G

(compostos do FMN); a amostra Solução C (extrato vegetal) apresentou resultado

semelhante ao da Solução A (solução controle) e a amostra da Solução E (solução de

126

silício orgânico) teve intensidade menor que este. No caso da Figura 82, as bandas com

maior intensidade correspondem às amostras Gel E (gel com silício orgânico), Gel C (gel

com extrato vegetal) e Gel G (gel com derivado de açúcar); seguidas da amostra Gel B (gel

com uréia). A amostra Gel D (gel com componentes do FMN) teve a menor intensidade.

Os efeitos da hidratação do tecido nos espectros FT-Raman são mínimos e causam

poucas mudanças na intensidade das bandas das moléculas ou na posição de número de

onda das bandas espectrais. Segundo Willians, Barry & Edwards (1992), a variação dos

espectros inter e intramostras é mínima. A diferença entre a intensidade das bandas de

diferentes doadores é esperada devido ao conteúdo lipídico do estrato córneo.

Assim, as bandas encontradas nos espectros FT-Raman das amostras de muda de

pele de cobra corroboram com a literatura, podendo-se sugerir que os ativos hidratantes

estudados deram os primeiros indícios de segurança, haja vista não provocarem alterações

significativas na estrutura conformacional do estrato córneo.

Figura 82. Espectro FT-Raman dos géis a 4% dos ativos hidratantes Gel A – gel controle; Gel B – gel com uréia; Gel E – gel com silício orgânico; Gel C – gel com extrato vegetal, Gel G – gel

com derivado de açúcar; Gel D – gel com componentes do FMN

127

Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

O estudo do estrato córneo utilizando DSC vem evoluindo ao longo dos anos. Van

Duzee (1975) utilizou esta técnica para estudar as propriedades termo-estruturais dos

lipídeos e proteínas do estrato córneo humano.

Golden et al. (1987) estudou o estrato córneo utilizando a calorimetria exploratória

diferencial (DSC) e espectroscopia infravermelho. Estas técnicas eram anteriormente

usadas para estudos de transição de lipídeos e proteínas em uma variedade de sistemas

biológicos e sintéticos, fornecendo informações independentes, porém complementares,

sobre a estrutura das cadeias de hidrocarboneto dos lipídeos.

Já Moghimi, Williams & Barry (1996), estudaram um modelo de matriz lamelar para os

lipídeos do estrato córneo, caracterizando-o e comparando-o com a estrutura intercelular

do estrato córneo humano, propondo que este modelo fosse utilizado para estudos de

interação entre promotores, fármacos e os lipídeos intercelulares.

A técnica DSC tem sido utilizada para estudar as transições térmicas em estrato

córneo de mamíferos. Tipicamente, as transições térmicas (Tpico) ocorrem a 35-42 C, 60-

77 C, 70-90 C e 95-120 C e referem-se a T1, T2, T3 e T4, respectivamente (AL-SAIDAN,

BARRY & WILLIAMS, 1998). T1, T2 e T3 são atribuídas a mudanças de fase nas

bicamadas lipídicas intercelulares, estando, por sua vez, a T4 associada à desnaturação de

proteínas. No estrato córneo humano, uma quinta transição, a 51-55 C, foi encontrada e

atribuída à ligação covalente de lipídeos ao envelope de queratinócitos (CORNWELL et al.,

1996).

As transições no perfil térmico obtido com o DSC refletem a fusão dos domínios

estruturais que resultam em mudanças na capacidade de calor e fornecem informações a

nível macroscópico. Utilizando esse método, quando a amostra é submetida a

aquecimento, a taxa de calor que flui por ela é proporcional à sua capacidade de calor.

Esse gráfico fornece dois dados importantes: a temperatura de pico (Tpico) e a entalpia. A

Tpico corresponde à máxima taxa de evolução do aquecimento detectado; não

representando, porém, a taxa máxima de mudança, nem o fim do processo endotérmico

(DODD & TONGE, 1987). A entalpia representa a quantidade de calor necessária para que

haja a evaporação da água presente na amostra e/ou a fusão da sua estrutura cristalina.

128

Pode-se dizer que quanto maior a entalpia, mais elevada era quantidade de água presente

na amostra.

Segundo Caspers (2003), o estrato córneo é uma barreira que separa as células

viáveis da epiderme do meio externo. Esta camada é recoberta por uma camada de células

mais interna do estrato córneo, que contém aproximadamente 75% de água. As células

mais externas do estrato córneo ficam em contato com o meio ambiente e são menos

hidratadas, dependendo amplamente da umidade ambiente. Assim, há um visível gradiente

hídrico no estrato córneo. Pode-se sugerir que quanto mais elevada a Tpico, mais profunda é

a camada da pele em que a água se encontra.

Durante a varredura DSC, notam-se duas transições térmicas. A transição térmica da

primeira corrida deve-se, principalmente, à evaporação da água presente na membrana,

enquanto a que ocorre na segunda corrida é devida, principalmente, à fusão da estrutura

cristalina do estrato córneo. Tanto as amostras tratadas com as soluções, como as que

ficaram em contato com os géis, apresentaram curvas DSC semelhantes às apresentadas

nas Figuras 83, 84, 85 e 86. A transição térmica (Tpico) e a entalpia observadas durante a

primeira corrida são apresentadas nas Tabelas 32 e 33.

Figura 83. Curva DSC da primeira corrida da Solução A (controle)

129

Figura 84. Curva DSC da segunda corrida da Solução A (controle)

Tabela 32 – Entalpia e temperaturas de pico das soluções a 4%

Entalpia (J/g) Tpico (ºC)

Sol. A 193,2 74,45

Sol. B 225,2 71,71

Sol. E 241,3 83,05

Sol. C 160,2 77,09

Sol. G 207,7 68,31

Sol. D 191,7 71,83 Sol. A – solução controle; Sol. B – solução de uréia; Sol. E – solução de silício orgânico; Sol. C – solução de extrato

vegetal; Sol. G – solução de derivado de açúcar; Sol. D – solução de componentes do FMN

130

Figura 85. Curva DSC da primeira corrida do Gel A (controle)

Figura 86. Curva DSC da segunda corrida do Gel A (controle)

131

Tabela 33 – Entalpia e temperaturas de pico dos géis a 4%

Entalpia

(J/g) Tpico (ºC)

Gel A 246,7 87,26

Gel B 261,4 83,75

Gel E 144 79,13

Gel C 162,8 68,09

Gel G 205,3 66,96

Gel D 195,3 70,69

Considerando que medidas termodinâmicas estão sujeitas a um erro de 10%, pode-se

sugerir que em todas as amostras, tratadas com solução ou gel, a água encontra-se numa

camada com profundidade semelhante, já que as Tpico variaram numa mesma faixa.

Portanto, não ocorrem alterações na muda de pele de cobra, após a aplicação dos ativos,

permitindo maior hidratação cutânea.

Comparando as entalpias das soluções a 4%, as amostras da Solução B (solução de

uréia), Solução E (solução de silício orgânico) e Solução G (solução de derivado de açúcar)

apresentaram maior conteúdo de água em relação ao controle, após a aplicação das

respectivas soluções. A membrana da Solução C (solução de extrato vegetal) teve seu

conteúdo de água reduzido e a amostra da Solução D (solução de componentes do FMN)

apresentou, aproximadamente, o mesmo conteúdo hídrico do controle. Neste caso, pode-

se sugerir que a solução de silício orgânico apresenta melhor poder hidratante.

Comparando as entalpias dos géis a 4%, somente a amostra do Gel B (gel de uréia)

aumentou o conteúdo hídrico da membrana. Todos os outros géis utilizados diminuíram a

quantidade de água presente na amostra. Sugere-se que esta redução pode ser devida à

maior afinidade dos princípios ativos com componentes da formulação do gel base do que

com a estrutura da membrana e devido à natureza higroscópica destes compostos.

De acordo com o desenvolvimento do trabalho experimental apresentado, ressaltam-

se as principais considerações:

132

a) No estudo da estabilidade, os resultados sugerem que os aumentos da

temperatura e do tempo de armazenamento influenciam nas características

organolépticas das formulações com maior intensidade no aspecto e cor. O aumento

de temperatura e a exposição à luz influenciaram na diminuição da viscosidade em

todas as formulações testadas. Os testes de estabilidade acelerada realizados nos

géis sugerem que os produtos podem manter-se estáveis durante um período de

armazenamento de três meses, desde que ajustado o valor de pH entre 5,5 e 6,5 e

mantido ao abrigo do calor e da luz. O gel formulado com uréia, foi a formulação que

mais sofreu alteração.Quando armazenado em temperatura elevada e na presença

da luz, o valor do pH foi alterado de forma acentuada. Observa-se que na medida em

que o valor de pH aumenta, devido à decomposição da uréia em amônia, a

viscosidade diminui e a densidade pouco altera.

b) Quanto à utilização dos diferentes equipamentos para análise in vivo, em

relação à hidratação, o maior valor médio de capacitância elétrica foi com o Gel B

(uréia). Como esperado, o controle apresentou menor média, com relação à medida

da hidratação realizada com o Corneometer® e com o Moisturemeter®.

c) Com relação às medidas de perda de água pela pele realizadas com dois

aparelhos, a análise estatística mostrou que o Gel A, independentemente do

equipamento utilizado, foi diferente do controle. Esses aparelhos mostraram erro de

768,710 para o Vapometer® e 170,0 para Tewlmeter.

d) Quanto ao estudo das alterações no estrato córneo, as bandas encontradas

nos espectros FT-Raman das amostras de muda de pele sugerem que os ativos

hidratantes estudados são seguros, visto que não provocaram alterações na

estrutura conformacional do estrato córneo. Com a Calorimetria exploratória

diferencial (DSC), somente a amostra gel de uréia aumentou o conteúdo hídrico da

membrana. Todos os outros géis utilizados diminuíram a quantidade de água

presente na amostra. Sugere-se que esta redução pode ser devida à maior afinidade

dos princípios ativos com componentes da formulação do gel base do que com a

estrutura da membrana e devido à natureza higroscópica destes compostos.

133

6. Conclusões

- Os géis contendo 4% (p/p) de uréia e de 4% (p/p) de derivado de açúcar

apresentaram melhor eficácia hidratante in vivo, capacitância elétrica quando

analisados por Corneometer® e Moisturemeter®.

- Em relação à perda de água transepidérmica, o Gel A (base sem ativo)

obteve o melhor resultado tanto no Vapometer® quanto no Tewlmeter®.

- As formulações estudadas podem manter-se estáveis durante um período de

armazenamento de três meses, desde que ajustado o valor de pH entre 5,5 e

6,5 e mantido ao abrigo do calor e da luz.

- Com relação às medidas de capacitância, o Corneometer® e Moisturemeter®

apresentaram a mesma precisão.

- Comparando-se às medidas de perda de água transepidérmica, a análise

estatística indicou que o Vapometer® tem uma precisão menor do que o

Tewlmeter®.

- A avaliação do comportamento in vitro das substâncias e misturas hidratantes

estudadas sugere, em primeira análise, que estas podem ser seguras, já que

não provocaram alterações na estrutura conformacional do estrato córneo.

134

7. Referências bibliográficas

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