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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-
OESTE DONA LINDU – CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ADRIANA BENATTI BILHEIRO
BIOLOGIA E ÍNDICES DE INFECÇÃO NATURAL POR TRIPANOSOMATÍDEOS
EM Rhodnius montenegrensis (HEMIPTERA, REDUVIIDAE, TRIATOMINAE) NO
ESTADO DE RONDÔNIA, BRASIL.
DIVINÓPOLIS/MG
JULHO/2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-
OESTE DONA LINDU – CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ADRIANA BENATTI BILHEIRO
BIOLOGIA E ÍNDICES DE INFECÇÃO NATURAL POR TRIPANOSOMATÍDEOS
EM Rhodnius montenegrensis (HEMIPTERA, REDUVIIDAE, TRIATOMINAE) NO
ESTADO DE RONDÔNIA, BRASIL.
Orientador: Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo
DIVINÓPOLIS/MG
JULHO/2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde, da
Universidade Federal de São João Del Rei,
como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre.
Agradecimentos:
À minha família, meu pai Benone e minha mãe Marcia pelo apoio, o carinho, a
atenção e principalmente a fé no meu trabalho que me renovava a cada momento
em que a minha própria fé falhava. Ao meu companheiro Willian pela presença
constante, por todas as contribuições que foram inúmeras e essenciais, pelo amor
de sempre e pelo cuidado de sempre.
Ao meu orientador Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo, pela oportunidade de
trabalhar lado a lado, pela acolhida carinhosa e pelos inúmeros exemplos dados que
seguirei sempre. Demonstro aqui a minha mais profunda admiração e carinho pelo
profissional grandioso com o qual tive a honra de conviver.
Ao grande mestre Dr. Gilberto Fontes, pelas lições valiosas e pelo cuidado de
sempre. Desde a graduação até aqui me inspirando e me ajudando a crescer e me
superar a cada dia. Seu trabalho primoroso influencia gerações de estudantes e
transforma vidas. Sou grata pelo convívio, pelo aprendizado, pelo exemplo.
Ás Universidade Federal de São João del Rei, Universidade de São Paulo e á
FAPEMIG pelo auxílio e pela estrutura oferecida que possibilitou a conclusão deste
projeto.
Aos colaboradores Dr. Jansen Medeiros da FioCruz de Rondônia, Dr. João
Aristeu da Rosa da UNESP de Araraquara e Dra. Paola Ortiz da USP de São Paulo.
Agradeço imensamente pelo auxílio e pelo apoio na conclusão deste trabalho.
Por fim, agradeço aos amigos de Monte Negro que colaboraram direta ou
indiretamente no desenvolvimento do projeto seja trabalhando lado a lado ou
dividindo comigo momentos de descanso fundamentais. O carinho de vocês estará
sempre no meu coração, espero brevemente estar novamente no convívio de todos
vocês.
“Quem atribui à crise seus fracassos e penúrias, violenta seu próprio talento e
respeita mais os problemas do que as soluções (...) sem crise não há mérito e é na
crise que se aflora o melhor de cada um.”
(Albert Einstein)
I
Resumo
Triatomíneos (“barbeiros”) são vetores do agente etiológico da doença de Chagas,
Trypanosoma cruzi, além de outros tripanosomatídeos. O gênero Rhodnius, apesar
de majoritariamente silvestre, pode colonizar domicílios tendo, portanto, potencial
para transmissão da doença de Chagas. A espécie Rhodnius montenegrensis foi
descrita em 2012, sendo divulgados relatos desta espécie em palmáceas próximas a
residências rurais em três municípios no estado de Rondônia e em um município no
estado do Acre. O objetivo deste estudo foi analisar a biologia de R. montenegrensis
em condições de laboratório e a infecção natural por tripanosomatídeos em Monte
Negro, Rondônia. Foram capturados espécimes de R. montenegrensis em
palmáceas da espécie Obgnya speciosa, identificados por morfometria tradicional e
por amplificação por reação em cadeia da polimerase. Os parâmetros biológicos
foram analisados em espécimes provenientes de colônias mantidas no Instituto de
Ciências Biomédicas 5-USP. A análise biométrica foi realizada a partir de amostra de
184 ovos, observados diariamente até a eclosão e no decorrer de todo o ciclo de
desenvolvimento dos triatomíneos gerados. Para determinação da positividade para
tripanosomatídeos foi realizado o exame a fresco de material fecal de 60 espécimes,
sendo que dos positivos foi extraído o trato intestinal para realização da PCR
específica para T. cruzi e T. rangeli. São descritos parâmetros biológicos com
relação à viabilidade de ovos, a massa total dos ovos embrionados e eclodidos, o
período de incubação, a massa dos triatomíneos antes e após o repasto sanguíneo,
os percentuais de ecdises por estádio, o percentual de mortalidade, a razão de sexo
e duração do ciclo de desenvolvimento. A partir do exame a fresco de material fecal
de 60 espécimes capturados em palmáceas, observou-se que 22 (36,7%) estavam
infectados por tripanosomatídeos e pela análise molecular 16 (72,7%) estavam
infectados por T. cruzi, dois (9,1%) por T. rangeli, dois (9,1%) por T. rangeli e T. cruzi
(infecção mista) Esse estudo fornece informações relevantes para o entendimento
dos parâmetros biológicos da espécie R. montenegrensis. Além disso, é relatado
pela primeira vez a infecção natural de R. montenegrensis por T. cruzi no estado de
Rondônia. Os dados obtidos mostram a necessidade de uma maior atenção pelo
sistema de vigilância epidemiológica da doença de Chagas na região.
Palavras-Chave: Triatominae, Rhodnius montenegrensis, Trypanosoma cruzi,
Trypanosoma rangeli, biologia, Rondônia.
II
Abstract
Triatominae (“kissing bugs”) are insects notorious as the vectors of Trypanosoma
cruzi, the etiologyc agent of Chagas disease. The triatomines of the genus Rhodnius
are primarily silvatic, nevertheless, the widespread occurrence of native species that
invade households are suggesting their possible role in the transmission of the
disease. Rhodnius montenegrensis was described in 2012. Since them, reports of
the occourence of this specie associated with palm trees near households in
Rondônia and Acre have been published. This study aimed to analyze the biologial
aspects of Rhodnius montenegrensis and the contamination of triatomines by
trypanosomatids in Monte Negro, Rondônia. The capture of triatomines occoured in
Obgnya speciosa (babassus) specimens around the households. For the
identification of the collected triatomines, morphologic and molecular analysis were
made by the tradicional morphometric analysis followed by amplification of the DNA
using PCR. For the study of the biological parameters of the colonies maintained in
the laboratory three groups of triatomines were used for obttaining 184 eggs that
were observed daily and analysed in accordance to Rabinovich, 1972. The positivity
for trypanosomatids were confirm by examining the intestinal contente followed by
PCR amplification of the Catepsina L-like gene specific for T. cruzi and T. rangeli. A
serie of biometric parameters were observed, as: Viability of the eggs, total mass of
eggs, incubation period, total mass of the triatomines before and after the blood
meal, sex ratio, mortality ratio and duration of the egg to adult development cycle.
The analysis for contamination by trypanosomatids showed a total of 22 (36,7%)
positive triatomines by examining the intestinal contente and after the molecular
analysis 16 (72,7) were positive for T. cruzi, two (9,1%) were positive for T. rangeli
and tow (9,1%) were positive for both T. cruzi and T. rangeli. This data provides
relevant informations that can be useful to create new strategies for vector control
and suggests the need to reassess the actual status of Chagas disease in the state
of Rondônia.
Key words: Triatominae, Rhodnius montenegrensis, Trypanosoma cruzi, biology,
Rondônia.
III
Sumário
Resumo I
Abstract II
Lista de Figuras V
Lista de Tabelas VI
Lista de Gráfico VII
Lista de Quadros VII
1.Introdução 1
1.1.Revisão de literatura 4
2.Objetivos 17
2.1.Objetivos gerais 17
2.2.Objetivos específicos 17
3.Materiais e Métodos 18
3.1.Área de estudo 18
3.2.Capturas 20
3.3.Identificação de triatomíneos
3.3.1Identificação morfológica de triatomíneos
3.3.2 Caracterização específica ou diagnose
3.3.3 Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de
Triatomíneos
3.3.4 Extração e amplificação do DNA genômico
3.3.5 Purificação e sequenciamento do DNA amplificado
3.3.6 Identificação molecular
3.3.7 Análises filogenéticas
3.3.8 Inferência Bayesiana
22
22
22
23
23
25
25
25
25
3.4.Dados biométricos 27
3.4.1.Material biológico 27
3.4.2.Ciclo biológico do triatomíneo 28
3.5.Análise estatística 31
3.6.Identificação dos tripanosomatídeos 32
3.6.1.Exame a fresco do material fecal de triatomíneos 32
3.6.1. Amplificação por PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL)
para T. rangeli (PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL)
33
IV
4.Resultados 35
4.1.Identificação de triatomíneos
4.1.1 Identificação morfológica de triatomíneos
4.1.2 Caracterização específica ou diagnose
4.1.3 Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de triatomíneos
35
35
35
36
4.2.Ciclo biológico dos triatomíneos 38
4.2.1.Viabilidade de ovos 38
4.2.2.Peso dos ovos 38
4.2.2.Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento 39
4.2.3.Ecdises por estádio 41
4.2.4.Razão de sexo 42
4.2.5.Peso em gramas por estádio de desenvolvimento 42
4.2.6.Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade 44
4.3.Identificação de tripanosomatídeos 46
4.3.1.Resultados obtidos a partir do exame a fresco de material fecal 46
4.3.2. Resultados obtidos a partir da análise molecular por amplificação por
PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL) para T. rangeli (PCR
DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL)
47
5.Discussão 50
5.1.Dados biométicos 50
5.1.1.Viabilidade de ovos em Rhodnius montenegrensis 50
5.1.2.Peso dos ovos 50
5.1.3.Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento 51
5.1.4.Ecdises por estádio 52
5.1.5.Razão de sexo 52
5.1.6.Peso em gramas por estádio de desenvolvimento 53
5.1.7.Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade 54
5.2.Infecção por tripanosomatídeos
6.Conclusão
55
59
7.Considerações Finais 61
8.Referências Bibliográficas 63
V
Lista de Figuras
Figura 1 Diferenças morfológicas dos hemípteros 4
Figura 2 Via de transmissão clássica (vetorial) do Trypanosoma cruzi. 11
Figura 3 Mapa do município de Monte Negro, Rondônia 19
Figura 4 Acondicionamento de espécimes para análise biométrica. (A) e (C):
Bandejas contendo frascos para acondicionamento de espécimes. (B):
Espécime de Rhodnius montenegrensis adulto observado em análise
biométrica.
29
Figura 5 Fotos do aparelho genital externo de Rhodnius montenegrensis. (A):
Genital externa em machos; (B): Genital externa em fêmeas.
30
Figura 6 Imagem por microscopia de luz das estruturas genitais de Rhodnius
montenegrensis. A - Phallus of R. montenegrensis : En, endosoma; EPlb,
extensão mediana da placa basal; Plb, Placa basal. B – Parâmeros e C –
Processo media do pigoforo.
35
Figura 7 Imagem do gel de agarose com os resultados da PCR com as
bandas referentes à amplificação do gene do DNA mitocondrial citocromo b
(Cytb) para as amostras de 1 a 12 obtidas a partir de 12 espécimes de
Rhodnius montenegrensis e controle positivo (CP).
36
Figura 8 Análise Bayesiana baseada em parâmetros de semelhança entre 5
espécies do gênero Rhodnius e a espécie Rhodnius montenegrensis baseada
no gene Cyt b mitocondrial. Triatoma infestans e Panstrongylus megistus
foram utilizados como outgroups.
37
Figura 9 Fotos de ovos de Rhodnius montenegrensis. (A): Ovos embrionados,
(B): Ovos após eclosão da ninfa de 1⁰ estádio.
39
Figura 10 Fotos de espécimes de Rhodnius montenegrensis. (A): Vista frontal
da cabeça, (B): Vista frontal do abdômen da fêmea, (C): Vista frontal do
abdômen do macho, (D): Vista dorsal do abdômen do macho, (E): Vista dorsal
do abdômen da fêmea, (F): Vista dorsal do abdômen.
Figura 11 Lâminas contendo forma flagelada semelhante a Trypanosoma
cruzi corado com Giemsa obtido no Insetário do ICB5-USP, Monte Negro-RO.
Figura 12 Gel contendo fragmentos de CATL gerados a partir da amplificação
por PCR diagnóstico das amostras 1 a 22, obtidas a partir do trato gastro-
intestinal de Rhodnius montenegrensis.
41
47
48
VI
Lista de Tabelas
Tabela 1 Peso em gramas para ovos em Rhodnius montenegrensis antes e
após a ecosão da ninfa de 1⁰ estádio.
34
Tabela 2 Duração em dias do ciclo de desenvolvimento do ovo à fase adulta
em Rhodnius montenegrensis.
35
Tabela 3 Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis em
jejum.
39
Tabela 4 Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis após
alimentação em camundongos.
39
Tabela 5 Número de alimentações realizadas por estádio de desenvolvimento
em Rhodnius montenegrensis
45
Tabela 6 Percentual de mortalidade por estádio de desenvolvimento em
Rhodnius montenegresis
Tabela 7 Positividade para formas flageladas semelhantes a Trypanosoma
cruzi por exame a fresco de material fecal em ninfas de 5⁰ estádio e indivíduos
adultos.
45
46
VII
Lista de Gráficos:
Gráfico 1 Percentual de ovos eclodidos e ovos inviáveis em Rhodnius
montenegrensis
33
Gráfico 2 Número de ecdises por estádio ninfal em Rhodnius
montenegrensis.
37
Gráfico 3 Número de indivíduos por sexo em Rhodnius montenegrensis.
38
Lista de Quadros:
Quadro 1 Códigos de acesso no GenBank dos genes do citocromo b 37
mitocondrial (Cytb) de triatomíneos e outgroups (*) utilizados neste estudo.
Quadro 2 Identificação das amostras obtidas a partir da extração do trato
gastro-intestinal dos triatomíneos, a respectiva localidade onde o
espécime foi coletado e a espécie de tripanosoma encontrado na amostra.
45
1
1. Introdução:
Os Triatomíneos são insetos hematófagos pertencentes à Família Reduviidae
(Hemíptera, Heteróptera) que possuem aparelho do tipo picador sugador,
originando-se anteriormente aos olhos. Estes insetos alimentam-se do sangue de
vertebrados, inclusive de humanos. Possuem importância epidemiológica por serem
vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas e
outros protozoários flagelados como o Trypanosoma rangeli (Abad-Franch et al.,
2013). A subfamília Triatominae é composta de 151 espécies, todas susceptíveis ao
protozoário T. cruzi sendo, portanto, vetores em potencial do agente etiológico da
doença de Chagas (Diotaiuti et al., 2005, Alevi et al., 2015).
A doença de Chagas era inicialmente uma doença de caráter enzoótico,
mantida entre triatomíneos e mamíferos silvestres e posteriormente passou a ser
transmitida a seres humanos quando estes invadiram os ecótopos silvestres ou
quando vetores e mamíferos invadiram áreas domiciliares em decorrência dos
processos de desflorestamento de áreas preservadas (Coura et al., 2015). Esse
processo levou à adaptação dos vetores e colonização de domicílios e áreas
peridomiciliares contribuindo para o aumento da transmissão aos seres humanos
(Coura et al., 2015).
A doença de Chagas, ou tripanossomíase americana, é uma doença crônica
potencialmente fatal, cujo principal mecanismo de transmissão é a deposição de
fezes e/ou urina do vetor contaminadas com formas infectatntes do T. cruzi sobre os
tecidos cutâneos, mucosa ou ferimento causado pelo aparelho bucal dos
triatomíneos. Além deste, existem outros mecanismos de infecção como a
transmissão congênita, por transfusões de sangue, doação de órgãos, a partir da
ingestão de alimentos contaminados com o T. cruzi e a partir de fezes e/ou urina de
triatomíneos infectados ou secreções das glândulas odoríferas de marsupiais
infectados. Nenhuma vacina ou tratamento efetivo para a fase crônica da doença
está disponível, portanto, o controle de vetores domiciliares ainda é a principal
estratégia para prevenir a infecção humana (Massaro et al., 2008, Gurgel-Gonçalvez
et al., 2012).
Aproximadamente 100 anos após a sua descoberta, a doença de Chagas
continua representando um importante problema de saúde pública principalmente na
América Latina. Estima-se que cerca de 7,7 milhões de pessoas estejam infectadas
e 109 milhões ainda vivendo em áreas de risco (Dias et al., 2014). Nos últimos anos,
2
a Amazônia brasileira vem chamando a atenção devido à constante ocorrência de
surtos de doença de Chagas. O primeiro caso autóctone na Amazônia brasileira foi
registrado em 1969 em Belém, no estado do Pará (Shaw et al., 1969). Em 2008,
Pinto e cols. observaram 233 casos agudos no período de 1968 a 2005 também no
estado do Pará (Pinto et al., 2008). Desde então, o número de casos agudos da
doença tem aumentado na Amazônia brasileira, sendo registrados 568 novos casos
no período de 2002 a 2008 (Brum-Soares et al., 2010).
Entre outros hemoflagelados transmitidos por triatomíneos está o protozoário
T. rangeli que possui ampla distribuição entre as Américas do Sul e Central e pode
causar infecções mistas tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Apesar de
considerado não patogênico para o hospedeiro vertebrado, a resposta imune
humoral induzida pelo T. rangeli no hospedeiro leva a produção de anticorpos que
podem gerar reações cruzadas com antígenos do T. cruzi interferindo no diagnóstico
da doença de Chagas (Ferreira et al., 2014).
Apesar de todas as espécies de triatomíneos serem consideradas
potencialmente transmissoras do T. cruzi, a sua importância epidemiológica está
diretamente relacionada à sua capacidade de invadir e colonizar domicílios.
Considerando-se que a invasão e colonização de ambientes artificiais por
triatomíneos é uma condição adaptativa impulsionada pelas modificações dos seus
ecótopos naturais, torna-se necessário fazer uma reavaliação constante sobre os
riscos da transmissão vetorial (Lent & Wygodzinsky 1979, Zárate, 1984; Carcavallo
et al., 1997; Molina et al., 2000).
Observa-se que a invasão de domicílios por vetores silvestres do T. cruzi na
região da Amazônia brasileira é comum e o encontro destes nas áreas domiciliares
já foi reportada em diversas localidades. Além disso, são comuns nessa região as
atividades extrativistas como a coleta da piassava, açaí, castanha, óleo de copaíba e
borracha. Esse tipo de atividade aumenta a exposição dos trabalhadores a vetores
silvestres aumentando assim, os eventos de transmissão ativa da doença de Chagas
na região (Aguillar et al., 2007, Coura, 2015).
Assim como na maioria das regiões neotropicais, as ocorrências de invasão
domiciliar e peridomiciliar pelos triatomíneos na região Amazônica ocorrem
majoritariamente por espécies do gênero Rhodnius associados a palmeiras, sendo
3
esta a principal causa da ocorrência de eventos de transmissão tanto na forma de
infecção endêmica ou hipoendêmica quanto na forma de surtos por transmissão oral
do T. cruzi (Grijalva et al. 2003, Coura & Junqueira 2012).
A espécie R. montenegrensis Rosa, Rocha, Gardim et al. 2013, foi descrita
em 2012 a partir de espécimes capturados no município de Monte Negro, Rondônia
(Rosa et al., 2012). Em 2013 foi registrada pela primeira vez, em estudos na região
de Buritis, Rondônia, a infecção desta espécie pelo protozoário T. rangeli,
demonstrando um aumento no número de espécies do gênero Rhodnius infectados
por esse protozoário (Meneguetti et al., 2013).
Devido à invasão dessas espécies do gênero Rhodnius ao domicílio, o estudo
de parâmetros biológicos que influenciam a capacidade de transmissão de
tripanosomatídeos pode contribuir para melhorar a compreensão da importância
epidemiológica desses vetores. Parâmetros como duração do ciclo de vida e
mortalidade devem ser considerados, pois são variáveis diretamente relacionadas
com o tamanho das populações dos vetores (Barreto-Santana, 2011).
Este estudo, portanto, tem por objetivo a análise de parâmetros biológicos da
espécie descrita recentemente Rhodnius montenegrensis e a determinação da
infecção natural por tripanosomatídeos no município de Monte Negro, Rondônia.
4
1.1. Revisão de literatura:
Os Triatomíneos:
Os triatomíneos são insetos taxonômicamente incluídos na Ordem Hemiptera,
Subordem Heteroptera, Família Reduviidae e Subfamília Triatominae (Abad-Franch
et al., 2013; Alevi et al., 2013; Jurberg et al., 2013; Poinar, 2013). Estão incluídos na
Ordem Hemiptera os insetos com aparelho do tipo picador sugador originando-se
anteriormente aos olhos. Este é constituído por um par de mandíbulas e um de
maxilas, envolvidos por um lábio tri ou tetrassegmentado, e sem palpos (Diotaiuti et
al., 2005).
Os insetos que compõem a Ordem Hemíptera se dividem entre três tipos de
insetos, os hematófagos que se alimentam de sangue de vertebrados, incluindo
humanos, os fitófagos que se alimentam de seiva de plantas e os predadores que se
alimentam da hemolinfa de outros insetos. De uma maneira geral são
morfologicamente parecidos e essa semelhança faz com que os triatomíneos
(hematófagos), vetores do T. cruzi, sejam facilmente confundidos com os insetos
fitófagos e predadores (Brener et al., 2000). Uma das carcaterísticas que distinguem
os três tipos de hemípeteros é a morfologia da probóscida. Nos hemípteros fitófagos
ela é reta, constituída de quatro segmentos sempre ultrapassando o primeiro par de
patas. Nos hemípteros predadores, a probóscida é curva e não ultrapassa o primeiro
par de patas. Já nos hemípteros hematófagos (triatomíneos), a probóscida é reta
composta de três segmentos e não ultrapassa o primeiro par de patas (Diotaiuti et
al., 2005). As diferenças morfológicas básicas que distinguem os três tipos de
hemípteros podem ser visualizadas na Figura 1.
Figura 1: Diferenças morfológicas do aparelho bucal dos hemípteros. Adaptado de Diotaiuti et al., 2005.
5
A subfamília Triatominae compreende um grupo distinto da família Reduviidae
definidos pela sua obrigatoriedade a hematofagia (Monteiro et al., 2000).
Comumente conhecidos como barbeiros ou chupões, são amplamente distribuídos
pelas Américas podendo ser encontrados desde o sul dos Estados Unidos até o sul
da Argentina (Meneguetti et al., 2011a).
Esses insetos possuem o desenvolvimento paurometábulo ou incompleto e
assim, a partir do ovo é gerada uma forma imatura chamada de ninfa ou imago.
Essas formas imaturas possuem os mesmos hábitos alimentares e morfologia
semelhante ao inseto adulto, exceto pela ausência de asas e pela ausência de
sistema reprodutor desenvolvido. Na subfamília Triatominae, o desenvolvimento se
dá a partir de cinco estádios ou ínstares ninfais anteriores a fase adulta alada. Em
todos os seus cinco estádios ninfais, além dos estádios adultos machos e fêmeas,
estes insetos são obrigatoriamente hematófagos. Com isso, necessitam repetidos e
massivos repastos sanguíneos tanto para seu desenvolvimento ninfal, quanto para
sua reprodução e dispersão. Como herança de sua origem predadora, algumas
espécies, quando em jejum prolongado, são capazes de se alimentar da hemolinfa
de outros insetos (Lent & Wygodzinsky 1979, Lorosa et al. 2000, Garrouste 2009,
Pontes et al. 2011).
Atualmente, são reconhecidas e descritas 151 espécies de triatomíneos.
Entre elas, 67 espécies são encontradas no Brasil, onde se observa uma grande
variedade de biomas como a floresta Amazônica, a floresta Atlântica, o pantanal e o
cerrado. Essa variedade de biomas, além da rica biodiversidade, faz com que o
Brasil albergue a mais diversificada fauna de triatomíneos do mundo (Galvão et al.
2003, IBAMA, 2009).
Os triatomíneos são, ainda, responsáveis pela manutenção do ciclo zoonótico
do T. cruzi entre animais selvagens em ambientes domésticos e peridomésticos
(Rosa et al., 2012).
A Tribo Rhodninii:
A tribo Rhodniini inclui dois gêneros sendo eles Rhodnius, com 18 espécies
descritas e Psammolestes, com três espécies descritas aceitas como sendo de
origem monofilética. A maioria deles possui hábitos silvestres, entretanto, diversas
espécies do gênero Rhodnius colonizam áreas domésticas e peridomésticas
6
tornando-se, por esta razão, importantes vetores do agente etiológico da doença de
Chagas humana (Coura, 2015). Em países da América Latina como a Colômbia, por
exemplo, a maior parte dos eventos de transmissão vetorial em ambientes
domésticos e peridomésticos está atribuída à espécie Rhodnius prolixus Stal, 1872
(Jácome-Pinilla et al., 2015). A espécie Rhodnius ecuadoriensis Lent & León 1958,
vetor autóctone do Equador, também tem papel ativo na transmissão da doença de
Chagas nos embientes domésticos e peridomésticos e está distribuído desde o sul
do Equador até o norte do Peru (Monteiro et al., 2000).
Na região Amazônica, as espécies do gênero Rhodnius também já foram
encontradas colonizando áreas domésticas e peridomésticas em diversas sub-
regiões, sugerindo seu papel como vetor. A espécie Rhodnius stali Lent, Jurberg &
Galvão, 1993, foi documentada em ambientes domésticos na sub-região do Alto
Beni na Bolívia e na região da Amazônia brasileira, foram encontrados focos da
espécie Rhodnius brethesi Matta, 1919, em áreas peridomésticas em domicílios de
coletores de piassaba na micro-região de Rio Negro no estado do Amazonas (Coura
& Junqueira, 2012, Coura, 2015).
Infelizmente a distribuição geográfica de algumas espécies ainda permanece
imprecisa devido a dificuldades de identificação. Enquanto a identificação
morfológica em nível de gênero é simples, ainda existem dificuldades na
identificação específica dos triatomíneos do gênero Rhodnius devido a similaridades
morfológicas. Essas dificuldades são observadas principalmente nas espécies do
grupo Prolixus que inclui as espécies R. prolixus Stal 1872, R. robustus Larrousse,
1927, R. neglectus Lent, 1954, e R. nasutus Stal, 1859. Por essa razão, são
constantemente observados erros quanto à identificação dos triatomíneos deste
grupo (Lent & Wygodzinsky 1979, Monteiro et al., 2000, Abad-Franch et al. 2009).
A ocorrência disseminada de populações do gênero Rhodnius colonizando
palmáceas na região Amazônica, juntamente às evidencias epidemiológicas,
sugerem seu papel ativo na transmissão da doença de Chagas. Com isso, há a
necessidade de um maior entendimento quanto aos hábitos destes vetores para
uma maior compreensão dos eventos de transmissão mediados por eles (Abad-
Franch et al., 2010).
O contato entre humanos e palmeiras colonizadas por triatomíneos do gênero
Rhodnius pode aumentar como resultado de modificações ambientais
antropogênicas. O desflorestamento seletivo é um dos fatores determinantes para a
7
proximidade entre essas palmeiras e os domicílios em muitas regiões (Henderson et
al. 1995; Palomeque et al. 2005). Como resultado de uma pré-adaptação dos insetos
do gênero Rhodnius a essas palmeiras e a variedade de mamíferos reservatórios do
T. cruzi associados às mesmas, o que se observa é a formação de grandes colônias
de triatomíneos como já reportado para espécies como R. pictipes Stal, 1872, R.
robustus Larrousse, 1927, R. pallescens Barber, 1932, e R. colombiensis Moreno,
Jurberg & Galvão, 1999 (Jaramillo et al. 2000, Vallejo et al. 2000, Palomeque et al.
2005).
A espécie Rhodnius montenegrensis:
A espécie R. montenegrensis (Figura 2) foi primeiramente descrita em 2012 a
partir de espécimes capturadas em palmáceas próximas a residências na zona rural
do município de Monte Negro, estado de Rondônia (Rosa et al., 2012).
Os primeiros espécimes foram encontrados em 2007, a partir de capturas
realizadas em 100 propriedades do município de Monte Negro. Estes espécimes
geraram dúvidas quanto sua definição específica. Assim, assumiu-se que se tratava
de espécimes de Rhodnius robustus devido a sua localização geográfica (Rosa et
al., 2012). Posteriormente, em 2008, foram coletados mais oito espécimes de
triatomíneos na mesma região com as mesmas características observados em
relação àqueles capturados anteriormente. Para que fossem esclarecidas as dúvidas
levantadas, colônias foram montadas a partir destes espécimes para observação
posterior. A descrição da nova espécie se deu a partir da comparação de estruturas
fenotipicamente relacionadas à espécie R. robustus (Rosa et al., 2012). Entre as
características que distinguem as espécies R. robustus e R. montenegrensis estão o
comprimento mais largo da cabeça em R. montenegrensis, as veias bem
demarcadas e tonalidade amarelada observada em R. montenegrensis e ausente
em R. robustus, pontos amarelados observados no abdômen ventral de R.
montenegrensis ausentes em R. robustus e estrutura do exocório dos ovos com
claras distinções entre as duas espécies (Rosa et al., 2012).
Além das diferenças morfológicas descritas, demonstrou-se a partir da
amplificação por PCR do produto da digestão do gene 5.8S/ITS-2 pela enzima BstUI,
uma clara distinção entre os perfis de bandas observadas nas duas espécies (Rosa
et al., 2012).
8
Visto que não se conhecia a existência da espécie R. montenegrensis, acredita-
se que, em estudos anteriores, essa espécie pode ter sido confundida com R.
robustus, principalmente em estudos realizados em palmeiras, pois a ocorrência de
insetos do gênero Rhodnius nessas plantas é relatada em estudos nas regiões de
vegetação desmatada de Manaus, Amazonas (Naiff et al., 1998). Carvalho e cols.
(2011) em estudos realizados no município de Monte Negro, Rondônia, observaram
que 100% dos triatomíneos capturados em babaçus neste município pertenciam a
espécie R. robustus em uma amostra de 848 espécimes. Além disso, neste mesmo
estudo, foram encontrados cinco espécimes de triatomíneos em áreas domiciliares.
No município de Ouro Preto do Oeste, Rondônia, também foi relatada a ocorrência
de triatomíneos do gênero Rhodnius associados a palmáceas, (Meneguetti et al.,
2011c), sendo, também, observada a sua ocorrência em residências rurais nesse
mesmo município (Meneguetti et al., 2011c).
Desde a sua identificação em 2012, esta espécie também foi encontrada em
uma habitação rural em Rio Branco, Acre em setembro de 2014 (Meneguetti et al.,
2015). Observou-se que, nas proximidades da habitação, havia uma área de mata
preservada contendo exemplares de palmáceas do gênero Attalea que
possivelmente forneciam um ecótopo natural a esses espécimes (Meneguetti et al.,
2015)
Em 2013 foi reportada na região de Buritis, Rondônia, a infecção desta
espécie pelo protozoário T. rangeli e esses dados demonstraram um aumento no
número de espécies do gênero Rhodnius infectados por T. rangeli (Meneguetti et al.,
2013).
Devido às evidências de invasão de espécies do gênero Rhodnius em
ambientes domiciliares, o estudo de parâmetros biológicos que influenciam a
capacidade de transmissão de tripanosomatídeos pode contribuir para a melhor
compreensão da importância epidemiológica desses insetos vetores de
tripanosomatídeos (Barreto-Santana et al., 2011). Com isso, torna-se importante o
estudo da biologia de espécies recém-descobertas como a espécie R.
montenegrensis.
9
Breve histórico da doença de Chagas:
A doença de Chagas, ou tripanossomíase Americana, é uma doença crônica
potencialmente fatal que continua representando um importante problema sanitário
na América Latina (Silva et al., 2012).
O agente etiológico e a doença foram descritos pelo médico sanitarista Carlos
Ribeiro Justiniano das Chagas (Chagas, 1909), enquanto chefiava os trabalhos de
combate à malária no estado de Minas Gerais, onde estava sendo construída a
estrada de ferro Central do Brasil. Carlos Chagas conseguiu, naquela época,
identificar o agente etiológico, T cruzi, sua biologia no hospedeiro vertebrado e
invertebrado, seus reservatórios e diversos aspectos da patogenia e sintomatologia
da doença (Lana & Tafuri, 2005).
A prevalência da doença de Chagas no Brasil na década de 1980 era
estimada em 4,2%, entretanto, estava vigente o programa nacional de controle
vetorial do principal vetor domiciliar Triatoma infestans. Naquela época, 711
municípios apresentavam infestação domiciliar. O sucesso da campanha de controle
vetorial, em adição ao controle dos bancos de sangue e melhoria de condições de
moradia em regiões endêmicas, levou a um declínio significativo nos testes de
prevalência e incidência da doença nas últimas décadas (Coutinho et al., 2014).
Em 1991 o Brasil se juntou à iniciativa internacional dos países do Cone Sul
Americano, cujo principal objetivo era a redução da transmissão vetorial a partir do
uso de inseticidas com ação residual contra o vetor T. infestans. O impacto dessa
iniciativa levou a uma redução de 94% na incidência da doença nos países do Cone
Sul (Gurgel-Gonçalvez, 2012).
Entretanto, apesar da redução na incidência da doença de Chagas em
regiões onde espécies de triatomíneos autóctones são comuns, a interação parasito-
vetor-reservatório é mantida e gera riscos quando os sistemas de vigilância em
saúde falham (Coutinho et al., 2014).
Atualmente, a doença de Chagas continua representando um importante
problema de saúde pública nos países da América Latina, principalmente nos nove
países da região Amazônica, onde o número de casos agudos da doença é
crescente. Com isso, torna-se necessária à implementação de um programa de
vigilância que contemple de forma continuada e uniforme os perfis de transmissão
10
nessas regiões com o intuito de se evitar a endemização da doença (Coura &
Junqueira, 2012, Dias et al., 2014).
O Agente etiológico:
O T. cruzi (Chagas, 1909), é um protozoário hemoflagelado pertencente ao
Filo Sarcomastigophora, Subfilo Mastigophora, Classe Zoomastigophora, Ordem
Kinetoplastida, Subordem Trypanosomatina e Família Trypanosomatidae. Essa
espécie de parasito desenvolve o seu ciclo biológico em hospedeiros vertebrados
(mamíferos) e invertebrados (triatomíneos), onde assume formas evolutivas distintas
(Junqueira et al., 2011).
Nos insetos vetores, formas tripomastigotas ingeridas no momento do repasto
sanguíneo diferenciam-se em formas epimastigotas (apresentando cinetoplasto e
bolsa flagelar na posição anterior ao núcleo) que se multiplicam. Na região posterior
do intestino do triatomíneo as mesmas se diferenciam em formas infectantes
denominadas tripomastigotas metacíclicas (com cinetoplasto localizado na
extremidade posterior ao núcleo). No hospedeiro vertebrado, as formas
tripomastigotas metacíclicas invadem células e se diferenciam em formas
amastigotas (arredondadas e com flagelo interiorizado). Após diversos ciclos de
reprodutição binária, as formas amastigotas se diferenciam em tripomastigotas
sanguíneos, forma responsável pela disseminação da infecção e presente em
grande número na circulação sanguínea periférica do hospedeiro vertebrado durante
a fase aguda da doença (Coura e Castro, 2002; Tonelli et al, 2004; Caetano e Silva,
2007).
Há diversas formas de transmissão da doença de Chagas. Entre as habituais,
observa-se a vetorial, caracterizada pela transmissão do T. cruzi pelas fezes e urina
do barbeiro durante o repasto sanguíneo (Figura 2), sendo esta correspondente a
aproximadamente 70% das formas de transmissão. Entretanto, existem outras
formas de transmissão denominadas secundárias, ou seja, vias alternativas ao ciclo
biológico clássico do parasito. Entre elas, podem ser citadas as infecções por
transplante de órgãos, transfusões sanguíneas, transmissão congênita, acidentes de
laboratório e por via oral (Pinto Dias et al., 2011).
11
Figura 2: Via de transmissão clássica (vetorial) do Trypanosoma cruzi.
Adaptado de: http://www.fcfrp.usp.br/dactb/Parasitologia/Arquivos/Genero_Trypanosoma_
arquivos/image003.jpg Acesso em: 04/01/2016.
A doença de Chagas na Amazônia Brasileira:
A região da Amazônia brasileira vem chamando atenção pela constante
ocorrência de surtos agudos da doença de Chagas. Assim como no restante da
Pan-Amazônia, a doença é considerada de caráter enzoótico, entretanto, em 2008
Pinto e cols. descreveram 233 casos agudos no período de 1968 a 2005 sendo
78,5% destes casos decorrentes de transmissão por via oral (Coura & Junqueira,
2012, Dias et al., 2014). Segundo o Ministério da Saúde, no período de 2005 a 2010
cerca de 1000 novos casos agudos da doença de Chagas foram reportados na
região amazônica, sendo 87% deles ocorrendo nos estados que constituem a
Amazônia legal (Barbosa et al., 2015).
12
Há uma série de fatores de risco envolvidos no aumento das notificações de
surtos por transmissão oral do T. cruzi na Amazônia brasileira que representam
riscos de uma possível endemia nesta região. Entre estes fatores, destacam-se a
presença de uma grande variedade de triatomíneos, especialmente dos gêneros
Rhodnius, Panstrongylus e Triatoma, com grande variedade de mamíferos atuando
como reservatórios do T. cruzi. A alta incidência de surtos ocorridos pela ingestão de
alimentos contaminados com fezes e urina de triatomíneos e secreções de
marsupiais infectados especialmente sucos e polpas de açaí. Os processos de
desflorestamento desordenado, que podem reduzir o ecótopo dos triatomíneos
silvestres e ao esgotamento das fontes alimentares, podem levar ocasionalmente, a
invasões domiciliares. E, por fim, o crescente aumento da imigração de regiões
endêmicas para a Amazônia, induzida pela construção de novas estradas,
hidroelétricas e pela exploração de óleo e gás natural, atividades geradoras de
empregos, que também são considerados fatores de risco (Coura & Junqueira,
2012).
Observa-se que a invasão de domicílios por vetores silvestres do T. cruzi na
região da Amazônia brasileira é comum. Assim como na maioria das regiões
neotropicais elas ocorrem majoritariamente por espécies do gênero Rhodnius
associados a palmeiras. Assim, a proximidade entre as residências rurais e
palmeiras ocupadas por triatomíneos e mamíferos atuando como reservatórios é o
principal fator de risco observado tanto para a transmissão na forma de infecção
endêmica ou hipoendêmica quanto na forma de surtos por infecção oral (Abad-
Franch, 2010, Coura & Junqueira 2012).
Além da invasão de domicílios já documentada anteriormente, triatomíneos do
gênero Rhodnius também estão envolvidos em um foco de transmissão silvestre da
doença de Chagas em coletores de piaçaba no Alto Rio Negro, Amazonas (Dias et
al. 2002). Estudos realizados por Coura e cols. (1999) demonstraram que indivíduos
soropositivos para anticorpos de T. cruzi, relataram a presença de triatomíneos em
seus locais de trabalho (piaçabais), mencionando também a ocorrência de picadas
nas cabanas utilizadas como abrigo nestas áreas.
As manifestações da fase aguda da doença de Chagas em pacientes na
região Amazônica são geralmente severas. Estas manifestações diferem daquelas
observadas em pacientes em fase aguda em outras regiões endêmicas devido ao
principal mecanismo de transmissão nesta região ser a via oral. Nestes casos, a
13
quantidade de parasitos ingeridos é maior do que àquela observada no mecanismo
de transmissão vetorial em que a maioria dos casos agudos é assintomática (Coura,
2015). Entre as manifestações observadas destacam-se febre, edema facial,
exantema, miocardites e anormalidades no eletrocardiograma (Coura, 2015).
O Estado de Rondônia:
O estado de Rondônia, localizado na Amazônia Ocidental, possui um meio
ambiente constantemente modificado pelas ações transformadoras do ser humano.
Essas ações resultam em um desequilíbrio que pode facilitar a transmissão de
inúmeros patógenos. Uma grande variedade e quantidade de palmáceas, em
especial o babaçu, bem como mamíferos e triatomíneos, podem ser encontrados
neste complexo ecossistema (Massaro et al., 2008).
No referido estado, tem-se registros de sete espécies de triatomíneos
distribuídas em quatro gêneros, Panstrongylus geniculatus, Eratyrus mucronatus,
Rhodnius robustus, R. pictipes, R. milesi e R. montenegrensis, além de um registro
isolado de Triatoma rubrovaria (Massaro et al., 2008; Meneguetti et al., 2011a;
Meneguetti et al., 2011b; Meneguetti et al., 2011c; Rosa et al., 2012).
Apesar dessa biodiversidade, o estado de Rondônia não é considerado de risco
para a transmissão vetorial da doença de Chagas (Consenso, 2005). De fato,
observa-se que as espécies encontradas comumente no estado de Rondônia são
majoritariamente silvestres reduzindo assim, a sua importância epidemiológica.
Entretanto, considerando-se que todas as espécies de triatomíneos são vetores em
potencial da doença de Chagas e o principal fator a induzir a invasão e colonização
de triatomíneos em domicílio é a adaptação a modificações de seus ecótopos
naturais, torna-se necessário fazer uma reavaliação sobre a transmissão vetorial no
estado (Lent & Wygodzinsky 1979, Zárate, 1984; Carcavallo et al., 1997; Molina et
al., 2000).
A infecção natural por tripanosomatídeos:
O ciclo natural de transmissão do T. cruzi é complexo, principalmente na
região Amazônica, e envolve grande diversidade de animais silvestres atuando como
reservatórios e grande número de espécies de vetores. Os hospedeiros silvestres do
14
T. cruzi incluem espécies de oito ordens, sendo eles, Artiodactyla, Carnivora,
Chiroptera, Cingulata, Didelphimorphia, Pilosa, Primatas e Rodentia (Noireau et al.,
2009, Jansen & Roque, 2010).
A infecção de mamíferos pode ocorrer pela via contaminativa vetorial ou pela
via oral. A via vetorial, entretanto, é ineficiente sendo necessários cerca de 1700
encontros entre o vetor e o hospedeiro para que ocorra a infecção. Já a infecção por
via oral é extremamente eficiente podendo ocorrer pela ingestão de fezes/urina de
triatomíneos infectados, alimentos contaminados ou pela predação de insetos ou
mamíferos infectados. Por essa razão, mamíferos carnívoros e onívoros como os
quatis (Nasua nasua), ocupam o topo da cadeia de transmissão do T. cruzi em meio
silvestre devido à sua dieta incluir tanto insetos como mamíferos menores,
resultando em diversas vias que possibilitam a transmissão (Nouvellet et al., 2013,
Lima et al., 2015).
Esses fatores levam às altas taxas de infecção nos hospedeiros observadas
em meio silvestre contribuindo, assim, para a manutenção do ciclo enzoótico da
doença de Chagas (Monteiro et al., 2012).
O T. cruzi pode ser encontrado infectando triatomíneos e hospedeiros
vertebrados nos mais diferentes ecótopos. Dentre esses ecótopos, alguns albergam
outras espécies de tripanossomatídeos, como o T. rangeli, que compartilha com o T.
cruzi a capacidade de infectar mamíferos e triatomíneos.
O T. rangeli, é um protozoário hemoflagelado descoberto na Venezuela no
conteúdo intestinal de espécimes de R. prolixus (Junqueira et al., 2011). Assim como
o T. cruzi, é encontrado majoritariamente na América do Sul e Central. Este
protozoário, entretanto, não é patogênico para o ser humano apesar de ser
encontrado infectando o mesmo (Ramirez et al., 2002, Junqueira et al., 2011).
A forma infectante do T. rangeli, diferentemente do T. cruzi, é encontrada na
hemolinfa de triatomíneos atingindo, posteriormente, as glândulas salivares do vetor.
Por essa razão o mecanismo de transmissão do T. rangeli se da pela forma
inoculativa, ou seja, a partir da picada do vetor durante o repasto sanguíneo. No ser
humano a infecção é considerada benigna podendo persistir por até um ano e meio,
sem manifestações clínicas. (Junqueira et al., 2011).
Apesar da infecção por T. rangeli ser benigna ao ser humano, a resposta
imune humoral desencadeada por este protozoário leva a produção de anticorpos
que podem reagir com antígenos do T. cruzi interfirindo no diagnóstico diferencial da
15
doença de Chagas (Ferreira et al., 2014). No Brasil, foram reportados três casos
humanos de tripanossomíase rangeli na região Amazônica e dois casos de co-
infecção com T. cruzi (De Sousa et al., 2008).
Vetores silvestres e o controle vetorial:
A transmissão do T. cruzi originalmente se restringia aos ambientes silvestres
passando a representar riscos às populações humanas a partir do momento em que
vetores silvestres adquiriram a habilidade de colonizar e sustentar populações em
domicílios humanos permitindo, assim, a transmissão do T. cruzi nestes ambientes
(Grijalva et al., 2014).
Por esta razão, as estretégias de controle da doença de Chagas na América
Latina tem sido baseadas na interrupção da transmissão vetorial a partir da
eliminação das populações de insetos domésticos com o uso de inseticidas
residuais. Essa estratégia foi implementada em 1991 para eliminação do principal
vetor domiciliado T. infestans nos países do Cone Sul e foi responsável por uma
redução de 94% do número de casos da doença de Chagas humana nestes países
(Moncayo & Ortiz 2006, Hashimoto & Schofield 2012)
Entretanto, alguns fatores ainda contribuem para impedir uma completa
redução na transmissão vetorial da doença. Entre eles, a reinfestação de domicílios
por triatomíneos silvestres considerados, atualmente, como vetores secundários e o
reestabelecimento de populações residuais que não foram completamente
eliminadas pelos iseticidas químicos (Jácome-Pinilla et al., 2015).
Estudos realizados em países da América Latina como Bolívia, Brasil e
Argentina vem demonstrando que espécies de triatomíneos silvestres
frequentemente são encontradas invadindo e colonizando ambientes domiciliares e
podem ter papel significativo no ciclo de transmissão do T. cruzi (Noireau et al.,
1995, Ceballos et al., 2011, Gurgel-Gonçalves et al., 2012). Além disso, estudos
recentes no Equador indicam que a infestação de domicílios a partir de espécimes
silvestres limita a efetividade das intervenções de controle baseadas em inseticidas
químicos (Grijalva et al., 2014). Observa-se que a eficácia dos inseticidas
tradicionais é diretamente afetada pelo grau de domicialização do vetor, com isso, é
necessário o desenvolvimento de estratégias de controle alternativas específicas
contra vetores não domiciliados (Waleckx et al., 2015).
16
Considerando-se que, a invasão de domicílios por triatomíneos silvestres
limita a eficácia dos inseticidas químicos, passa a ser necessário o desenvolvimento
de estratégias que possam limitar a entrada destes triatomíneos no interior dos
domicílios. Essas estratégias envolvem melhorias estruturais em casas situadas em
áreas de risco, instalação de telas em janelas e impregnação de cortinas com
inseticidas residuais (Waleckx et al., 2015).
Apesar da importância dos vetores silvestres nos eventos de transmissão da
doença de Chagas humana serem reconhecidos, os ecótopos naturais de certas
espécies de triatomíneos assim como a sua relação específica com o hospedeiro
permanece ainda pouco elucidada. Com isso, observações sobre a bioecologia e o
comportamento de triatomíneos silvestres e as suas interações com o hospedeiro
são fundamentais para o entendimento dos fatores envolvidos na manutenção do
ciclo enzoótico do T. cruzi, da dinâmica das diferentes espécies de triatomíneos
silvestres e do papel epidemiológico destes vetores na transmissão da doença de
Chagas (Lima et al., 2015).
17
2. Objetivos:
2.1. Objetivos gerais:
Estudar a biologia, em condições controladas de laboratório, da espécie de
triatomíneo Rhodnius montenegrensis e verificar os índices de infecção natural por
tripanosomatídeos.
2.2. Objetivos específicos:
- Verificar os parâmetros biológicos da espécie Rhodnius montenegrensis, em
condições controladas em laboratório.
- Avaliar as taxas de infecção natural por tripanosomatídeos na espécie Rhodnius
montenegrensis no município de Monte Negro, Rondônia.
- Identificar as espécies de tripanosomatídeos ocorrentes no trato digestivo do
Rhodnius montenegrensis no município de Monte Negro, Rondônia.
18
3. Materiais e Métodos:
3.1. Área de estudo:
O estado de Rondônia está localizado na região norte do Brasil e faz divisa ao
norte com o estado do Amazonas a leste com o estado do Mato Grosso, ao sul com
a República da Bolívia, e a oeste com o estado do Acre.
O município de Monte Negro (Figura 3), situa-se entre o paralelo (10º 15’ 35”)
latitude sul e meridiano (63º 18’ 06”) longitude oeste, limitando-se ao norte com o
município de Ariquemes, ao sul com Governador Jorge Teixeira, ao leste com
Cacaulândia e a oeste Buritis e Campo Novo de Rondônia. Localizado na região
centro norte do estado de Rondônia, tem uma população estimada de
14.091habitantes (sendo 60% em área rural), ocupando uma área de 1.931,381 km²
(densidade populacional de 7,3 hab/km²) e distando 250 km da capital do estado,
Porto Velho (IBGE, 2011).
Em geral, a maior parte da população é composta de jovens imigrantes
oriundos das regiões Sul e Sudoeste do país, que se estabeleceram no município ao
longo da década de 1980 (Camargo et al., 2002).
O clima é equatorial superúmido, com média anual de precipitação
pluviométrica entre 1800 e 2200 mm, maior que a do Estado, e temperatura média
de 25,8º C, próxima à do Estado, oscilando entre 12 e 37º C, e umidade relativa
entre 40 a 80% durante todo o ano (IBGE, 2011).
Tem como vegetação áreas de florestas equatoriais e de campos (área de
solo pobre), apresentando regime hidrográfico de enchentes e vazantes
relacionados a chuvas, tendo características de rios de planaltos e planícies. O
relevo é constituído de planícies e baixos planaltos, variando entre 90 a 350 m acima
do nível do mar (IBGE, 2011).
Há considerável ação antrópica na região, principalmente às margens da
rodovia BR421 que corta o município e seus distritos vicinais. A mata original foi
substituída majoritariamente, por plantações de gêneros alimentícios como soja e
café e por vastas áras de pastagem.
19
Figura 3: Mapa do município de Monte Negro, Rondônia. Original de Dr. Marcelo Zagonel-
INAGEMP/UFRGS
20
3.2. Capturas:
Os exemplares de R. montenegrensis foram coletados na região peri-urbana
do município de Monte Negro, Rondônia sendo definida área peri-urbana como:
"áreas localizadas na linha entre rural e urbana, perto da periferia de um limite legal
e administrativo de uma cidade, dentro ou fora de um plano de área e normalmente
caracterizada pela ocupação de terra e tendência informal e poucos serviços
básicos" (Smit, 1996).
Seguindo está definição estipulou-se que as coletas seriam realizadas em
toda propriedade inserida em um raio de 10 quilomêtros da sede do município.
Essas coletas foram feitas diáriamente no período de março a junho de 2015.
Segundo estudos realizados por Urbano e colaboradores (2015), observando
a densidade populacional de triatomíneos do gênero Rhodnius em palmáceas,
demonstrou-se que esta se relaciona à localização e a estrutura física das palmeiras.
Observou-se ainda que, a mais alta densidade populacional de triatomíneos
encontrava-se em palmeiras altas com copa densa, localizadas em regiões de
interseção entre as bordas de florestas preservadas e áreas de pastagem. Partindo-
se desta premissa, foram selecionadas entre as propriedades visitadas, aquelas com
ocorrência de palmeiras nas condições acima referidas.
Dentro do limite anteriormente estipulado e, seguidas as condições acima
estabelecidas, 18 propriedades foram selecionadas e sua localização geográfica
obtida no momento da coleta a partir de aferição por sistema de posicionamento
global.
Para obtenção de espécimes de R. montenegrensis, foram selecionados em
cada propriedade visitada, quatro exemplares de Obgnya speciosa (babaçu) que
tiveram suas brácteas removidas com auxílio de motosserra à gasolina Sthil® MS
08. As brácteas, onde podem se alojar uma grande quantidade de invertebrados e
pequenos vertebrados, foram removidas uma por vez na busca de triatomíneos.
Foi obtido um total de 228 triatomíneos identificados segundo Jurberg e cols.
(2014) como sendo R. montenegrensis. Destes, 12 espécimes foram submetidos à
identificação por morfometria tradicional e por morfologia na genital interna, seguida
de análise molecular e análise Bayesiana. Sessenta espécimes foram utilizados em
estudo para investigação do percentual de infecção natural por tripanosomatídeos e
o restante foi utilizado como matriz para formação das colônias que originaram os
21
triatomíneos utilizados nos estudos relativos à biometria da espécie Rhodnius
montenegrensis.
Após a captura, os espécimes foram acondicionados em recipientes
plásticos transparentes de aproximadamente 20 centímetros de altura. Estes foram
forrados com três camadas de papel filtro e uma tira de papel cartão dobrada em
sanfona, com altura aproximada à altura dos recipientes. Esta tira de papel
sanfonado tem por objetivo aumentar a superfície interna do recipiente
proporcionando um ambiente menos estressante aos triatomíneos.
Os espécimes foram acondicionados individualmente nos recipientes acima
descritos, identificados segundo a localização onde foram capturados e mantidos em
laboratório à temperatura variando entre 27 e 29°C e umidade relativa do ar variando
entre 55 e 75% registrados diariamente com auxílio de um Termo-higrômetro digital
Jprolab, sendo de uso interno com máxima/mínima e função “reset” - Escala de
10+50°C / -14+122°F (Mod. 7429.02.0.00). Foram realizados intervalos de 12 horas
de escotofase e 12 horas de fotofase.
22
3.3. Identificação de triatomíneos:
3.3.1. Identificação morfológica de triatomíneos:
3.3.2. Caracterização específica ou diagnose:
Os espécimes de triatomíneos foram capturados na região peri-urbana de
Monte Negro e foram indentificados por meio de caracteres morfológicos e
morfométricos (cabeça, tórax e abdômen). A identificação foi realizada com auxílio
do quadro de caracteres diferenciais propostos por Rosa e cols. (2012) e a chave
dicotômica proposta por Galvão (2014).
Utilizou-se também, a identificação baseada na morfologia da genitália interna
masculina de 12 espécimes de triatomíneos, sendo estes, dois representantes de
cada localidade da região peri-urbana do município de Monte Negro. A análise da
genitália interna masculina dos triatomíneos também foi feita com o auxílio dos
caracteres diferenciais propostos por Rosa e cols. (2012).
O preparo da genitália interna masculina foi realizado segundo protocolo
adaptado por Jader de Oliveira com base no protocolo da Apostila Disciplina
Bioecologia e Identificação de Phlebotominae (2015).
Para clarificação, as genitálias foram colocadas inteiras em recipiente de
porcelana (Chiarotti) e foram cobertas com solução de Hidróxido de Potássio a 10%
por um período de 24 horas.
Posteriormente, a genitália foi seccionada separando-se os parâmeros, falo e
processo mediano do pigóforo que foram clarificados por 12 horas em solução de
Hidróxido de Potássio a 10%.
Após a retirada das peças da solução de Hidróxido de Potássio a 10%, estas
foram submetidas à desidratação com álcool 70% por 10 minutos e,
sucessivamente, realizou-se o mesmo procedimento com álcool 90%, 95% e álcool
absoluto. As peças foram então, secas para que fosse removido o excesso de
álcool.
Às peças já clarificadas e desidratadas, adcionou-se eugenol e estas foram
mantidas por no mínimo três horas nessas condições antes da montagem.
Por fim, as peças foram montadas em lâminas de vidro com bálsamo do
Canadá e secas por cinco dias em temperatura ambiente.
As imagens foram feitas em microscópio estereoscópio Leica MZ APO e pelo
sistema de análise de imagem Motic Advanced 3.2 plus.
23
3.3.3. Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de
triatomíneos:
3.3.4. Extração e amplificação do DNA genômico:
Foram avaliados dois espécimes de cada localidade do município de Monte
Negro onde foram realizadas capturas. Para a extração do DNA genômico, foi
utilizada a musculatura das pernas de cada um dos espécimes, separadamente.
O protocolo utilizado para a extração do DNA genômico é referente ao kit
comercial “WIZARD - GENOMIC DNA PURIFICATION KIT” e está descrito a seguir.
Para cada amostra a ser processada, adicionou-se 120 µl de EDTA 0,5M-
pH 8,0 + 500 µl de “Nucley Lysis Solution” em um eppendorf de 1,5 mL que foi
posteriormente homogeneizado. As patas dos triatomíneos foram previamente
fragmentadas e colocandas em eppendorfs de 1,5 mL que foram então, imersas em
nitrogênio liquido e trituradas ao máximo com o auxílio de ponteiras.
Adicionou-se 600 µl de EDTA/”Nuclei Lysis Solution”, preparada
anteriormente e 17,5 µl de proteinase K 20 mg/mL. As amostras foram encubadas a
55°C por 3 horas, e a cada 30 minutos foram levadas ao vórtex.
Adicionou-se 3µL de RNAse ao lisado e homogeneizou-se por inversão de
2 a 5x. Posteriormente, as amostras foram incubadas por 30 minutos a 37°C e
esfriaram por 5 minutos.
Adicionou-se 200µL de “Protein Precipitation Solution” e a amostra foi
levada ao vortex por 20 segundos. Esta amostra foi mantida em gelo por cinco
minutos.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 4
minutos sob refrigeração até que a proteína precipitada formasse um pellet. O
sobrenadante foi removido cuidadosamente e o DNA transferido para um eppendorf
novo de 1,5 onde se adicionou 600µL de isopropanol absoluto. Essa mostra foi
homogeneizada vigorosamente por inversão.
A amostra obtida foi centrifugada por 1 minuto a 14.000 rpm em centrifuga
refrigerada ate que o DNA ficasse visível como um pequeno pellet branco.
Cuidadosamente removeu-se o sobrenadante.
Adicionou-se 600µL de etanol 70% gelado e inverteu-se o tubo
rigorosamente por várias vezes para lavar o DNA. Essa amostra foi centrifugada a
14.000 rpm por 1 minuto (refrigerado a 4°C).
24
Por inversão removeu-se o etanol deixando o tubo invertido por alguns
instantes sobre um papel absorvente, a fim de esgotar o etanol. Centrifugou-se para
concentrar um possível resíduo de etanol que foi removido com uma pipeta
automática. O tubo permaneceu aberto de 10 a 15 min.
Por fim, adicionou-se 100µL “DNA Rehidration Solution” e reidratou-se o
DNA por incubação a 65°C por 30 minutos agitando-o em vórtex periodicamente. O
DNA foi armazenado a 2-8°C.
O DNA obtido teve sua pureza estimada por meio de eletroforese em gel de
agarose 0,8%. A corrida do gel foi realizada horizontalmente e orientada por um
campo elétrico constante. Cada amostra de DNA correu por aproximadamente 30
minutos a 100V utilizando tampão TAE 1X. A migração do DNA (conjugado ao
brometo de etídeo) foi analisada em luz ultravioleta em transluminador (Sambrook et
al., 1989).
Os iniciadores utilizados nas amplificações do gene do DNA mitocondrial
citocromo b (Cytb) foram aqueles descritos por Monteiro e cols. (2003).
Para amplificação do DNA por PCR foi utilizada uma mistura típica para
PCR (Saiki et al., 1988) consistindo em: 5 a 10 ng de DNA molde em solução
tampão de Taq polimerase 1X (200mM Tris pH 8,4, 500mM KCL); uma mistura de
dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNTP’s) [0,2mM]; 5p moles de cada iniciador e 1,25
unidades de Taq polimerase.
Para as reações em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction- PCR)
foram utilizado o termociclador T100TM Thermal Cycler – BIORAD. A amplificação
dos fragmentos de interesse foi realizada utilizando a seguinte condição de reação:
- Gene Cytb
Desnaturação inicial do DNA a 94°C, por 3 minutos;
Desnaturação (94°C, por 60 segundos)
Anelamento (45°C, por 90 segundos),
Extensão (72°C, por 90 segundos),
Extensão final com um ciclo de 10 minutos a 72°C.
O fragmento amplificado foi avaliado em gel de agarose 1%, utilizando peso
molecular (O’ GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder-Fermentas) com padrão de
75,200,300,400,500,700,1.000,1.500 e 2.000 pb.
35 ciclos
25
3.3.5. Purificação e sequenciamento do DNA amplificado:
O produto da PCR foi purificado utilizando o kit “Illustra GFX PCR DNA
and Gel Band Purification Kit” (GE Life Sciences), de acordo com as instruções do
fabricante e para avaliar a concentração do DNA purificado.
O produto purificado foi processado no Departamento de Tecnologia da
aculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) na Universidade Estadual
Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal, onde foram utilizados os seqüenciadores
da Applied (Life Technologies) ABI3100 e ABI3730XL, que utilizam o BigDye na
versão
A reação de sequenciamento foi feita com o kit BygDye (PE Applied
Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram
processadas em seqüenciador automático ABI 3730XL. Análise das seqüências foi
feita com o auxílio do software “Sequence analysis”.
3.3.6. Identificação molecular:
As sequências obtidas foram avaliadas em sua qualidade por meio de
eletroferograma no programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.25 (Hall,
1999) e alinhadas no programa ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no
programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.25 (Hall, 1999).
Com finalidade de verificar se os genes sequenciados representavam o esperado
para espécie, avaliou-se meio da ferramenta BLAST (Basic Local Aligment Search
Tool) disponível em plataforma online pelo site do NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), a ferramenta procura correlacionar as
sequências obtidas com as depositadas no banco de dados do GenBank®.
3.3.7. Análises filogenéticas:
3.3.8. Inferência bayesiana:
Os alinhamentos foram realizados em três etapas: alinhamento inicial (AI),
no qual foi extraída uma sequência consenso a partir das sequências senso e
antisenso obtidas para cada fragmento sequenciado, sendo três para cada espécime
(triplicata); depois foi realizado o alinhamento por espécie (AE), para obtenção de
uma sequência para cada espécime; e a terceira etapa o alinhamento geral (AG),
26
que se baseia nos alinhamentos das sequências AE com as de Triatominae
disponíveis no GenBank® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
As análises filogenéticas foram realizadas utilizando-se do programa Mega
7.0.14 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis- http://www.megasoftware.net/) e
os parâmetros analíticos de máxima parcimônia (Maximum Parsimony - MP) e de
distância (Neighbor-Joining- NJ). Para as análises de distâncias foram utilizados dois
parâmetros para a construção das matrizes: o Kimura de dois parâmetros (Kimura 2)
e o Maximum Composite Likelihood (MCL) (Kumar et al., 2005).
Os filogramas foram gerados pelo programa Mega e os valores de Bootstrap
foram suportados por 1.000 replicações. Nessas análises utilizou-se do alinhamento
AG.
As análises bayesianas com o gene Cyt b foram realizadas usando o
programa MrBayes versão 3.2 (Ronquist et al, 2011). Para atribuir o melhor ajuste de
substituição nucleotídica para os dados obtidos usamos o programa MrModeltest 2.3
(Nylander, 2004), definindo o melhor ajuste para GTR + G segundo critério de
informação Akaike gerado pelo programa.
Os filogramas consenso foram gerados no programa FigTree versão 1.4.2
(http://tree.bio.ed.ac.uk/).
27
3.4. Dados Biométricos:
3.4.1. Material biológico:
Para o estudo dos parâmetros biológicos da espécie R. montenegrensis,
foram utilizados espécimes provenientes de colônias mantidas no insetário do
Instituto de Ciências Biomédicas Cinco (ICB-5-USP), no município de Monte Negro,
Rondônia.
As colônias utilizadas foram obtidas a partir de espécimes matrizes
capturados em O. speciosa (babaçu) encontrados próximos a domicílios rurais na
região peri-urbana do município de Monte Negro, previamente identificados por
morfometria tradicional como descrito anteriormente.
As colônias foram mantidas à temperatura entre 27⁰C e 29⁰C e umidade
relativa do ar entre 55% e 75% registrados diariamente com auxílio de um Termo-
higrômetro sendo de uso interno com máxima/mínima e função “reset” - Escala de
10+50°C / -14+122°F (Mod. 7429.02.0.00). Foram realizados intervalos de 12 horas
de escotofase e 12 horas de fotofase.
28
3.4.2. Ciclo biológico do triatomíneo:
Inicialmente, foram obtidas aleatoriamente 30 ninfas de 5⁰ estádio
provenientes das colônias de 4⁰ geração de R. montenegrensis para obtenção de
adultos virgens. Após a muda imaginal, foram formados três grupos compostos por
seis fêmeas e dois machos para obtenção de ovos. A partir dos três grupos de
espécimes adultos virgens foi obtido um total de 184 ovos. Estes foram então,
individualizados, numerados e observados diariamente até a eclosão.
Após a eclosão dos ovos, as ninfas geradas foram pesadas e acondicionadas
em frascos de coleta universal. Estes frascos foram forrados por três camadas de
papel filtro e uma tira de papel cartão de aproximadamente cinco centímetros de
altura dobrada em forma de sanfona foi introduzida em cada frasco para aumentar a
sua superfície interna. Os frascos foram fechados com tecido de algodão de trama
fina (Figura 4).
Foram realizadas observações diárias para registro de ecdises e mortes, com
auxilio de lupas de aumento, estereomicroscópio binocular, com iluminação dupla
episcópica, diascópica (Mod. SQF-F) e pinças entomológicas para coleta e
manuseio dos triatomíneos.
A primeira alimentação foi realizada cinco dias após a eclosão, a fonte
sanguínea foi oferecida diariamente até a ocorrência do primeiro repasto, passando
posteriormente a ser oferecida semanalmente. Foram utilizados como fonte
alimentar, camundongos Balb/C anestesiados com 100mg/kg de Cetamina
intraperitoneal segundo protocolo 2014/15 aprovado pela CEUA-FioCruz. O tempo
de oferecimento da fonte alimentar foi de no máximo 30 minutos sendo feita
observação contínua durante todo o processo de alimentação. Somente aqueles
espécimes que se recusavam a sugar ou sugavam pouca quantidade de sangue
eram submetidos à nova tentativa de alimentação. Durante o período de
observação, todos os espécimes foram pesados em balança semi-analítica
Shimadzu com precisão de 0,001g, antes e depois do repasto em todas as fases.
29
Figura 4: Acondicionamento de espécimes para análise biométrica. (A) e (C): Bandejas contendo
frascos para acondicionamento de espécimes. (B): Espécime de Rhodnius montenegrensis adulto
observado em análise biométrica.
Com base nos valores obtidos foram calculados:
- Viabilidade dos ovos;
- Massa total dos ovos;
- Massa dos ovos após a eclosão da ninfa de 1⁰ estádio;
- Período de incubação de ovos;
- Massa dos triatomíneos por fase de desenvolvimento antes e depois do repasto;
- Percentuais de ecdises por estádio;
- Percentual de mortalidade por estádio;
- Expectativa de vida e vida média;
- Razão de sexo;
Todas as análises foram feitas com base em estudo realizado por
Rabinovich (1972), que teve como objetivo prover informações estatísticas sobre
populações de triatomíneos mantidas em condições controladas de laboratório além
de possibilitar a comparação de espécies relacionadas em termos de suas
características biológicas. Este estudo foi pioneiro na análise de parâmetros
demográficos como ciclo biológico e padrões de reprodução e mortalidade além de
parâmetros populacionais de uma diversidade de reduvídeos.
30
A construção deste tipo de modelo juntamente a técnicas de simulação tem
papel fundamental na elaboração das estratégias de controle vetorial para que se
reduzam custos e aumentem sua eficiência.
Para a determinação da razão de sexo de triatomíneos, observações feitas a
partir da morfologia do aparelho genital externo dos triatomíneos adultos levaram a
distinção entre machos e fêmeas (Figura 5).
Figura 5: Fotos do aparelho genital externo de Rhodnius montenegrensis. (A): Genital externa em machos; (B): Genital externa em fêmeas.
31
3.4.3. Análise estatística:
Para se avaliar a normalidade das variáveis observadas foram utilizados os
testes não paramétricos de aderência à distribuição normal de Kolmogorov e
Smirnov e de Shapiro Wilk. Ambos os testes foram realizados no programa
Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 17.0 (SPSS, 2008).
Esses testes fornecem o parâmetro valor de prova (valor-p, p-value ou
significância), que pode ser interpretado como a medida do grau de concordância
entre os dados e a hipótese nula (H0), sendo H0 correspondente à distribuição
Normal. Quanto menor for o valor-p, menor é a consistência entre os dados e a
hipótese nula. Então, a regra de decisão adotada para saber se a distribuição é
Normal ou não é rejeitar H0: (i) se valor-p ≤ α , rejeita-se H0, ou seja, não se pode
admitir que o conjunto de dados em questão tenha distribuição Normal; (ii) se valor-p
> α , não se rejeita H0, ou seja, a distribuição Normal é uma distribuição possível
para o conjunto de dados em questão (Lopes et al., 2013).O teste de Kolmogorov e
Smirnov possui como limitação sua alta sensibilidade a valores extremos, por esta
razão se utiliza comumente a correção de Lilliefors que torna o teste menos
conservador.
Além do teste de Kolmogorov-Smirnov, também se utilizou no presente estudo o
teste de Shapiro-Wilk. Este teste também é baseado na correlação da amostra de
interesse a uma amostra correspondente com distribuição normal. O teste de
Shapiro-Wilk é considerado a melhor escolha para se avaliar a normalidade de uma
amostra, pois apresenta um maior poder quando submetido à correção de Lilliefors.
O poder de um teste é a medida mais frequente para se avaliar a habilidade do teste
em detectar a não normalidade de uma amostra.
Após a análise para verificação da normalidade das amostras observadas, foram
calculadas a média e desvio padrão para as variáveis analisadas.
Para a se avaliar a significância da diferença entre pares na amostra se utilizou o
teste T de Student, um teste paramétrico para comparação entre médias baseado
em hipóteses. Utilizou-se também o teste de análise de variância (ANOVA), também
utilizado para comparação entre médias baseado em hipóteses. Utilizou-se o teste
de Qui Quadrado (X2), que substitui o teste T de Student para amostras pareadas
quando os dados não satisfazem as exigências deste último. O teste de Qui
Quadrado é um método não paramétrico para comparação entre duas proporções
baseado em hipóteses sendo a hipótese nula a de que não há diferença entre os
32
grupos relacionados, e a hipótese alternativa a de que há diferença entre os grupos
relacionados. Se o p valor for inferior a 0.05, a hipótese alternativa é verdadeira e
rejeita-se a hipótese nula.
Para as variáveia razão de sexo e viabilidade de ovos utilizou-se o teste de Qui-
quadrado de heterogeneidade feito com base na relação teórica de 50% entre
indivíduos nascidos machos e fêmeas e ovos viáveis e não viáveis para se verificar
se essa relação teórica seria válida.
3.5. Identificação dos tripanosomatídeos:
3.5.1. Exame a fresco de material fecal de triatomíneos:
Foram analisados 60 espécimes de R. montenegrensis sendo 30 ninfas de 5⁰
estádio e 30 adultos, coletados em O. speciosa na região peri-urbana do município
de Monte Negro, Rondônia. Esses espécimes foram identificados de acordo com o
local de captura e a residência onde foram encontrados.
Para determinação do percentual de triatomíneos positivos para
tripanosomatídeos foi realizado o exame a fresco de material fecal.
Para obtenção do material fecal a ser analisado, os espécimes foram
anestesiados em solução diluída de éter etílico e, posteriormente, submetidos à
compressão abdominal. O material obtido (fezes ou urina) foi depositado sobre
lâmina contendo um pequeno volume de solução salina que foi, posteriormente,
homogeneizado e coberto com lamínula de vidro.
Posteriormente, foi realizada a leitura de todos os campos das lâminas
obtidas em microscópio óptico Olympus CX41 em poder ampliador de 40X para
busca de formas flageladas semelhantes a T. cruzi.
Os espécimes cujo exame demonstrou-se positivo para formas flageladas
semelhantes a T. cruzi foram, então, submetidos à extração intestinal a partir da
remoção dos dois últimos segmentos do abdômen. Os intestinos foram então
conservados em álcool etílico 70% para posterior análise molecular.
33
3.5.2. Amplificação por PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like
(CATL) para T. rangeli (PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL):
A Catepsina L-like (CatL-like), é uma cisteíno protease envolvida em
numerosos eventos no ciclo de vida de tripanosomas possuindo funções no
metabolismo, infectividade, multiplicação e diferenciação celular. Além disso,
influenciam na patogenicidade do parasito e na modulação da resposta imune do
hospedeiro (Ortiz el al., 2009).
Ortiz e cols. (2009), fizeram a caracterização dos genes que codificam a
enzima CatL-like e examinaram suas propriedades proteolíticas em isolados de T.
rangeli. Foram, também, analisadas sequencias a partir de 17 isolados
representativos de todas as linhagens conhecidas para determinar a relação
filogenética entre os genes para CatL-like de T. rangeli e genes homólogos de outras
espécies de tripanosomas. Dessa forma foi possível demonstrar que essas
sequências podem ser alvos para marcadores de diagnósticos sensíveis e
específicos podendo ser de grande utilidade para a genotipagem de linhagens de
tripanosomas em análises estruturais de população.
No estudo acima citado foi padronizado o modelo de PCR diagnóstico
específico para T. rangeli baseado no gene cdCatL-like que detecta todos os
isolados das Américas do Sul e Central a partir de fragmentos de DNA de tamanho
similar (380pb) gerados para quaisquer isolados de T. rangeli independente da
linhagem. Foi também padronizada a PCR diagnóstico específica para T. cruzi,
desenvolvida para amplificar uma banda de DNA de 270pb. Esta PCR detecta todos
os isolados de T. cruzi pertencentes às linhagens TCI, TCIIa, TCIIb, TCIIc e TCIId.
Com isso, definiu-se para este estudo, a metodologia de amplificação pela
PCR diagnóstico do domínio catalítico da catepsina L-like para a análise da
contaminação por tripanosomas nas amostras obtidas a partir do trato gastro-
intestinal de R. montenegrensis.
Foram utilizados os primers espécie-específicos para T. rangeli Tra-CatL 5´
ACA CCG GCC GTG TAG GAC ATG 3´ e para T. cruzi TcrCatL 5´ GGT AAT CGT
CCG AAC CAC CGT 3´. O primer DTO154 foi empregado como primer foward em
todas as reações. As condições para um PCR com volume total de 50µl são:
100ng de DNA;
34
200µM de dNTP;
100ng de primer DTO 154;
100ng de cada primer específico (Tra-CatL ou Tcr-CatL);
1,25U de Taq DNA polimerase.
O perfil térmico para realizar esta reação inclui desnaturação inicial a 94⁰ C
por 3 minutos, 35 ciclos de amplificação a 94⁰C por 1 minuto, 68⁰C por 1 minuto,
72⁰C por 1 minuto e um ciclo para extensão final de 10 minutos a 72⁰C.
Os produtos amplificados (380pb e 270pb) foram analisados em gel de
agarose 2% (10ul de cada amostra).
35
4. Resultados:
4.1 Identificação de triatomíneos:
4.1.1. Identificação morfológica de triatomíneos:
4.1.2. Caracterização específica ou diagnose:
Foram capturados na região periurbana do município de Monte Negro,
Rondônia, 228 triatomíneos previamente identificados segundo Galvão (2014) e
Rosa e cols (2012) como pertencentes à espécie R. montenegrensis, 12 espécimes
foram submetidos à identificação por morfometria tradicional e identificação a partir
da morfologia interna por meio da análise da genitália interna masculina.
Observou-se que a genitália interna masculina dos 12 espécimes de R.
montenegrensis observados apresentaram o seguinte padrão: Falo distendido em
vista dorsal possui tamanho médio da placa basal (EPlb) onde não envolve o
endossoma. A placa basal (Plb) tem uma forma regular de arco. (Figura 6A). Os
parâmetros apresentaram borda externa muito saliente e ápice arredondado com
uma ponta mais quitinizada (Figura 6B). Processo mediano do pigóforo inserido em
uma base triangular largo rodeado por uma forma de ranhura- cutícula, 2/3 anterior
mais larga do que a parte posterior 1/3, a qual se estreita para um ponto rombo
(Figura 6C). O padrão observado no presente estudo corrobora com o padrão
descrito por Rosa e cols. (2012) para a morfologia do aparelho genital interno
masculino da espécie R. montenegrensis.
Figura 6: Imagem por microscopia de luz das estruturas genitais de Rhodnius montenegrensis. A -
Phallus of R. montenegrensis : En, endosoma; EPlb, extensão mediana da placa basal; Plb, Placa
basal. B – Parâmeros e C – Processo media do pigoforo.
36
4.1.3. Estudos moleculares e por análise filogenética Bayesiana de
triatomíneos:
A análise molecular foi conduzida por meio de amplificações do gene do DNA
mitocondrial citocromo b (Cytb) utilizando-se os iniciadores descritos por Monteiro e
cols. (2003). Os resultados obtidos podem ser visualizados na Figura 7.
Figura 7: Imagem do gel de agarose com os resultados da PCR com as bandas referentes à
amplificação do gene do DNA mitocondrial citocromo b (Cytb) para as amostras de 1 a 12 obtidas
a partir de 12 espécimes de Rhodnius montenegrensis e controle positivo (CP).
A partir da ferramenta BLAST, certificou-se que as sequências obtidas para o
citocromo b mitocondrial (Cytb) foram realmente as esperadas para a espécie R.
montenegrensis. Com esta ferramenta, foi possível correlacionar a sequência obtida
para o Cytb com as sequências depositadas no banco de dados (Quadro 1). Os
valores utilizados nesse trabalho foram os de máxima identidade, similaridade e e-
evalue.
A análise filogenética (Figura 8) mostrou que, há uma relação próxima entre a
espécie R. montenegrensis e a espécie R. robustus. O produto da digestão do gene
do Cytb pela enzima BstUI também demonstrou perfis distintos entre essas
espécies. Os resultados obtidos pela análise molecular e análise filogenética
Bayesiana demonstram que os espécimes analisados pertencem à espécie
Rhodnius montenegrensis.
37
Figura 8: Análise Bayesiana baseada em parâmetros de semelhança entre 5 espécies do gênero
Rhodnius e a espécie Rhodnius montenegrensis baseada no gene Cyt b mitocondrial. Triatoma
infestans e Panstrongylus megistus foram utilizados como outgroups.
Quadro 1: Códigos de acesso no GenBank dos genes do citocromo b mitocondrial (Cytb) de
triatomíneos e outgroups (*) utilizados neste estudo.
Espécie Cytb gene COI
Rhodnius robustus Isolado roBR1j EF011710
Rhodnius robustus Isolado roBR11v EF011724
Rhodnius prolixus Isolado prVE6x EF011726
Rhodnius neglectus Isolado CG1882 KT317068
Rhodnius brethesi Isolado 197 KC249235
Panstrongylus megistus* Isolado 183 KC249232
Triatoma infestans* Isolado 44 KC249255
38
4.2. Ciclo biológico dos triatomíneos:
4.2.1. Viabilidade de ovos:
Entre os 184 ovos obtidos, 116 (63,04%) eclodiram gerando ninfas em 1⁰
estádio enquanto 68 (36,96%) não eclodiram sendo, portanto considerados inviáveis
(Gráfico 1). A viabilidade dos ovos foi determinada a partir de observações feitas por
Rocha e cols. (2011) em triatomíneos da espécia Rhodnius robustos, onde o período
de incubação de ovos máximo observado para esta espécie foi de 21 dias. Partindo-
se dessa premissa, os ovos que não eclodiram até um período de observação de 21
dias foi considerado inviável no presente estudo. Segundo o teste de Qui-Quadrado
de heterogeneidade observou-se diferença significativa entre ovos eclodidos e não
eclodidos (p<0,05), sendo o percentual de ovos eclodidos significativamente maior
do que o percentual observado para ovos inviáveis.
Gráfico 1: Percentual de ovos eclodidos e ovos inviáveis em Rhodnius montenegrensis
4.2.2. Peso dos ovos:
O peso em gramas para ovos embrionados para e espécie R. montenegrensis
a partir de 116 ovos viáveis observados foi em média 0,000662g, enquanto o
peso para esses mesmos ovos após a eclosão da ninfa de 1⁰ estádio foi em
média 0,000231g. O valor máximo obtido para ovos embrionados
39
foi de 0,0008g e mínimo de 0,0005g. Já o valor máximo observado para ovos
eclodidos foi de 0,0003g e o valor mínimo observado foi de 0,0002g (Tabela 1).
Os ovos de R. montenegrensis embrionados e após a eclosão da ninfa de 1⁰
estádio podem ser visualizados na Figura 9.
Figura 9: Fotos de ovos de Rhodnius montenegrensis. (A): Ovos embrionados, (B): Ovos após eclosão
da ninfa de 1⁰ estádio.
Tabela 1: Peso em gramas para ovos em Rhodnius montenegrensis antes e após a ecosão da ninfa de
1⁰ estádio.
Numero de ovos
Peso dos ovos
Min Max Med ± Desv. Pad
Ovo embrionado 116 0,0005 0,0008 0,000662 ± 0,0001027
Ovo eclodido 116 0,0002 0,0003 0,000231 ± 0,0000577
4.2.3. Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento:
A espécie R. montenegrensis (Figura 10), necessitou de um período de
incubação (intervalo entre a postura e a eclosão dos ovos) médio de 13,90 ± 1,71
dias. Quanto ao desenvolvimento ninfal, observou-se que as ninfas em 1⁰ estádio
necessitam de 13,73 ± 4,72 dias em média para atingir o 2⁰ estádio ninfal, as
ninfas de 2⁰ estádio necessitam em média 13,38 ± 2,98 dias para atingir o 3⁰
estádio ninfal, as ninfas de 3⁰ estádio necessitam em média 15,20 ± 2,61 dias em
média para atingir o 4⁰ estádio ninfal, as ninfas de 4⁰ estádio necessitam em
40
média de 17,5 ± 3,49 dias para atingir o 5⁰ estádio ninfal e as ninfas de 5⁰ estádio
necessitam de 31,44 ± 6,72 dias em média para atingir a fase adulta. A duração
em dias do ciclo de desenvolvimento do ovo a fase adulta observada para esta
espécie foi em média 105,22 ± 9,18 dias (Tabela 2).
O período de incubação mínimo observado para R. montenegrensis foi de 11
dias enquanto o valor máximo observado foi de 18 dias. Quanto à duração do
primeiro estádio ninfal o valor mínimo observado foi de oito dias enquanto o valor
máximo observado foi de 28 dias. A duração mínima observada do segundo
estádio ninfal para esta espécie foi de sete dias enquanto o valor máximo
observado foi de 23 dias. Quanto ao terceiro estádio ninfal, a duração mínima
observada foi de 12 dias enquanto a duração máxima foi de 24 dias. Já o quarto
estádio ninfal teve duração mínima de oito dias e máxima de 32 dias. A duração
mínima observada para o quinto estádio ninfal foi de 14 dias enquanto a duração
máxima observada foi de 47 dias (Tabela 2).
Utilizando-se o teste para análise de variância (ANOVA), observou-se
diferença significativa entre as médias de duração de todas as etapas do ciclo de
desenvolvimento em R. montenegrensis (p<0,0000001).
Tabela 2: Duração em dias do ciclo de desenvolvimento do ovo à fase adulta em Rhodnius montenegrensis.
Estádio Numero de
Ninfas
Duração de estádio dias
Min Max Med ± Desv. Pad
OVO-NI
116 11 18 13,90 ± 1,71 NI-NII
90 8 28 13,73 ± 4,72
NII-NIII
87 7 23 13,38 ± 2,98 NIII-NIV
86 12 24 15,2 ± 2,61
NIV-NV
82 8 32 17,5 ± 3,49 NV-AD
81 14 47 31,44 ± 6,72
Total 81 84 130 105,22 ± 9,18
NI: Ninfa em 1⁰ estádio, NII: Ninfa em 2⁰ estádio, NIII: Ninfa em 3⁰ estádio, NIV: Ninfa em 4⁰ estádio, NV: Ninfa em 5⁰ estádio, AD: Espécime em fase adulta.
41
Figura 10: Fotos de espécimes de Rhodnius montenegrensis. (A): Vista frontal da cabeça, (B): Vista
frontal do abdômen da fêmea, (C): Vista frontal do abdômen do macho, (D): Vista dorsal do abdômen
do macho, (E): Vista dorsal do abdômen da fêmea, (F): Vista dorsal do abdômen.
4.2.4. Ecdises por estádio:
Entre os 116 espécimes em 1⁰ estádio ninfal 90 (77,6%) realizaram ecdises,
entre os 90 espécimes em 2⁰ estádio ninfal 87 (93,55%) realizaram ecdises, entre os
87 espécimes em 3⁰ estádio 86 (93,48%) realizaram ecdises, entre os 86 espécimes
em 4⁰ estádio ninfal 82 (89,14%) realizaram ecdises e entre os 82 espécimes em 5⁰
estádio ninfal 81 (88,05%) realizaram ecdises (Gráfico 2). A partir do teste de Qui-
Quadrado observou-se diferença significativa entre o percentual de ecdises entre o
1⁰ e 2⁰ estádio ninfal, entre o 2⁰ e 3⁰ estádio ninfal, entre o 3⁰ e 4⁰ estádio ninfal e o
4⁰ e 5⁰ estádio ninfal (p<0,001).
Gráfico 2: Número de ecdises por estádio ninfal em Rhodnius montenegrensis.
42
4.2.5. Razão de sexo: O número de espécimes gerados fêmeas foi maior do que o número de
espécimes machos para a espécie R. montenegrensis no presente estudo. Entre os
81 espécimes que atingiram a fase adulta 44 deles eram fêmeas enquanto 37 eram
machos (Gráfico 3). Apesar do número de fêmeas ter sido superior ao de machos a
razão de sexo em R. montenegrensis pode ser estipulada neste estudo como sendo
de 1 macho para 1 fêmea aproximadamente. Após análise pelo teste de Qui-
quadrado de heterogeneidade foi possível afirmar que não há diferença significativa
entre o número de espécimes nascidos machos e fêmeas em R. montenegrensis
(p<0,05).
Gráfico 3: Número de indivíduos por sexo em Rhodnius montenegrensis.
4.2.6. Peso em gramas por estádio de desenvolvimento:
A partir da tabela 3, observa-se que houve um aumento gradativo do peso em
jejum em R. montenegrensis ao longo do seu desenvolvimento nos diferentes
estádios ninfais com a aproximação da fase adulta. Observou-se que o peso médio
em gramas para ninfas de 1⁰ estádio ninfal foi de 0,000333 ± 0,000053 g, para ninfas
em 2⁰ estádio 0,006505 ± 0,000502 g, para ninfas em 3⁰ estádio 0,01886 ± 0,000819
g, para ninfas em 4⁰ estádio 0,05386 ± 0,001112 g, para ninfas em 5⁰ estádio
0,08731 ± 0,000836 g, para espécimes em fase adulta machos 0,10953 ± 0,006311
g e fêmeas 0,14414 ± 0,015187 g.
43
Utilizando-se o teste de análise de variância (ANOVA) observou-se diferença
significativa entre o peso em gramas dos espécimes entre o primeiro e quinto
estádio do desenvolvimento ninfal (p<<0.0000001). Para se analisar a diferença
entre o peso em gramas em espécimes adultos machos e fêmeas utilizou-se o teste
T de Student onde observou-se que o peso em fêmeas é significativamente maior
que peso em machos (p<0,0000001).
Tabela 3: Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis em jejum.
Estádio Número
de Ninfas Peso por estádio em jejum
Min Max Med ± Desv. Pad
1⁰ estádio 116 0,0003 0,0004 0,000333 ± 0,000053
2⁰ estádio 93 0,006 0,007 0,006505 ± 0,000502
3⁰ estádio 92 0,018 0,02 0,01886 ± 0,000819
4⁰ estádio 92 0,053 0,056 0,05386 ± 0,001112
5⁰ estádio 92 0,086 0,089 0,08731 ± 0,000836
adulto macho 37 0,104 0,117 0,10953 ± 0,006311
adulto fêmea 44 0,125 0,157 0,14414 ± 0,015187
Após o repasto sanguíneo, os espécimes foram novamente pesados para
avaliar o aumento do peso ocasionado pela ingestão de sangue em R.
montenegrensis. Os dados obtidos estão expostos na Tabela 4. Observou-se um
peso médio em gramas após o repasto em ninfas de 1⁰ estádio de 0,003532 ±
0,000501 g, em ninfas de 2⁰ estádio 0,04302± 0,003936 g, em ninfas de 3⁰ estádio
0,10187 ± 0,004435 g, em ninfas de 4⁰ estádio 0,31864± 0,000792 g, em ninfas de 5⁰
estádio 0,34254 ± 0,000502 g, em espécimes em fase adulta machos 0,17958 ±
0,025576 g e em espécimes em fase adulta fêmeas 0,31670 ± 0,076672 g. A partir
da análise de variância (ANOVA) observou-se diferença significativa entre o peso em
gramas após o repasto sanguíneo entre os espécimes do primeiro ao quinto estádio
do desenvolvimento ninfal (p<0,0000001). Para se avaliar a diferença entre o peso
em gramas entre os espécimes em fase adulta machos e fêmeas utilizou-se o teste
T de Student onde se observou que o peso em fêmeas após o repasto sanguíneo é
significativamente maior do que o peso em machos (P<0,0000001).
44
Tabela 4: Peso em gramas por estádio em Rhodnius montenegrensis após alimentação em camundongos.
Estádio Número de
Ninfas Peso por estádio ingurgitada
Min Max Med ± Desv. Pad
1⁰ estádio 116 0,003 0,004 0,003532 ± 0,000501
2⁰ estádio 93 0,04 0,05 0,04302± 0,003936
3⁰ estádio 92 0,099 0,109 0,10187 ± 0,004435
4⁰ estádio 92 0,318 0,32 0,31864± 0,000792
5⁰ estádio 92 0,342 0,343 0,34254 ± 0,000502
adulto macho 37 0,159 0,215 0,17958 ± 0,025576
adulto fêmea 44 0,202 0,369 0,31670 ± 0,076672
4.2.7. Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade:
Pela alimentação semanal e a manutenção dos espécimes que se recusavam
a sugar, foi possível conhecer o número de repastos sanguíneos necessários para
que o grupo de triatomíneos observado no presente estudo atingisse o estádio
seguinte. Demonstrou-se que a espécie R. montenegrensis necessitou de um
número de repastos aproximadamente constante até o terceiro estádio ninfal e a
partir do quarto estádio observou-se um aumento gradual no número de
alimentações com a aproximação da fase adulta. Não se observou diferença
significativa entre o número de alimentações em indivíduos em 1⁰, 2⁰ e 3⁰ estádio
ninfal que apresentaram uma média de alimentações de 2,56, 2,51 e 2,87
respectivamente. Já os indivíduos em 4⁰ estádio ninfal apresentaram uma média de
alimentações de 3,1 e os indivíduos em 5⁰ estádio ninfal de 5,06 (Tabela 5). A partir
da análise de variância (ANOVA), observou-se diferença significativa entre o número
de alimentações realizadas entre todos os cinco estádios do desenvolvimento ninfal
para a espécie R. montenegrensis.
45
Tabela 5: Número de alimentações realizadas por estádio de desenvolvimento em Rhodnius montenegrensis:
Estádio Numero de
Ninfas Alimentações por estádio
Min Max Med ± Desv. Pad
1⁰ estádio 90 2 5 2,56 ± 0,751
2⁰ estádio 87 2 4 2,51 ± 0,588
3⁰ estádio 86 2 4 2,87 ± 0,504
4⁰ estádio 82 2 5 3,10 ± 0,404
5⁰ estádio 81 3 7 5,06 ± 0,979
Os percentuais de mortalidade em cada fase de desenvolvimento ninfal estão
representados na Tabela 6. Observou-se que a mortalidade varia em relação aos
diferentes estádios de desenvolvimento na espécie R. montenegrensis. Os maiores
percentuais de mortalidade foram observados no 1⁰ estádio ninfal (22,4%) e 5⁰
estádio ninfal (11,95%), seguidos pelo 4⁰ estádio ninfal (10,86%), 3⁰ estádio ninfal
(6,52%) e 2⁰ estádio ninfal (6,45%). O percentual de mortalidade total observado
durante todo o período de desenvolvimento ninfal foi de 30,01%, partindo-se de um
N amostral de 90 ninfas em 1⁰ estádio, 81 ninfas atingiram o 5⁰ e último estádio de
desenvolvimento. Após análise pelo teste de Qui Quadrado de Yates observou-se
diferença significativa no percentual de mortalidade entre os espécimes em primeiro
e segundo estádio do desenvolvimento ninfal (p=0,0006078).
Tabela 6: Percentual de mortalidade por estádio de desenvolvimento em Rhodnius montenegresis:
Estádio de desenvolvimento
Nº de ninfas inicial
Nº de ninfas final
% de mortalidade por estádio
1⁰ estádio 116 90 22,41
2⁰ estádio 90 87 3,33
3⁰ estádio 87 86 1,14
4⁰ estádio 86 82 4,65
5⁰ estádio 82 81 1,14
Total 32,67
46
4.3. Identificação de tripanossomatídeos:
4.3.1. Resultados obtidos a partir do exame a fresco do material fecal:
Após a leitura de todos os campos das lâminas obtidas pelo exame a fresco
de material fecal em aumento de 40X para busca de formas flageladas semelhantes
a T. cruzi (Figura 11), obteve-se um percentual de 36,7% de positividade total para
espécimes em 5⁰ estádio ninfal e adultos.
Devido ao maior número de alimentações realizadas pelos triatomíneos em 5⁰
estádio ninfal e fase adulta em relação ao que se observa nos estádios anteriores,
utilizou-se apenas espécimes nestes dois estádios. O maior número de repastos
aumenta significativamente a chance de contaminação destes insetos por formas
hemoflageladas.
Observou-se que entre os 30 espécimes em fase adulta, 15 (50%) estavam
positivos para tripanosomatídeos e entre as 30 ninfas em 5⁰ estádio, 7 (23,3%)
estavam positivos (Tabela 6), sendo esta diferença estatisticamente significativa
segundo análise pelo teste de Qui-quadrado (p<0,05).
Tabela 7: Positividade para formas flageladas semelhantes à Trypanosoma cruzi por exame a fresco
de material fecal em ninfas de 5⁰ estádio e indivíduos adultos.
N Positividade
(números absolutos) Positividade
(%)
Ninfas em 5⁰ estádio 30 7 23,3%
Adultos 30 15 50%
Total 60 22 36,7%
47
Figura 11: Lâminas contendo forma flagelada semelhante a Trypanosoma cruzi corado com Giemsa obtido no Insetário do ICB5-USP, Monte Negro-RO.
4.3.2. Resultados obtidos a partir da análise molecular por amplificação por
PCR do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL) para T. rangeli
(PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL):
Após a análise molecular por amplificação do DNA a partir do PCR
diagnóstico do domínio catalítico de Catepsina L-like (CATL) específico para T.
rangeli (PCR DTraCatL) e T. cruzi (PCR DTcrCatL), observou-se que, entre os 22
espécimes considerados positivos para tripanosomatídeos pelo exame a fresco de
material fecal, 16 (72,7%) estavam contaminados por T. cruzi, dois (9,1%) por T.
rangeli e dois (9,1%) por T. rangeli e T. cruzi caracterizando assim, infecção mista.
Observou-se ainda que, dois espécimes considerados positivos pelo exame a fresco
de material fecal não apresentaram bandas correspondentes a nenhuma das
espécies de tripanosomatídeos analisadas (Figura 12). A identificação das amostras
amplificadas a partir do trato gastro-intestinal de triatomíneos e a respectiva
localidade de captura podem ser visualizadas no Quadro 2.
48
Figura 12: Gel contendo fragmentos de CATL gerados a partir da amplificação por PCR diagnóstico
das amostras 1 a 22, obtidas a partir do trato gastro-intestinal de Rhodnius montenegrensis.
49
Quadro 2: Identificação das amostras obtidas a partir da extração do trato gastro-intestinal dos
triatomíneos, a respectiva localidade onde o espécime foi coletado e a espécie de tripanosoma
encontrado na amostra.
Isolado Hospedeiro Localidade: Linha Coordenada
Espécies de Tripanosoma
1 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.201’ WO 63⁰ 18.949’
T. cruzi
2 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.201’ WO 63⁰ 18.949’
T. rangeli
3 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.201’ WO 63⁰ 18.949’
T. cruzi
4 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.201’ WO 63⁰ 18.949’
T. cruzi
5 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.774’ WO 63⁰ 18.521’
Indeterminado
6 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.774’ WO 63⁰ 18.521’
T. cruzi
7 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.774’ WO 63⁰ 18.521’
Indeterminado
8 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 14.774’ WO 63⁰ 18.521’
T. cruzi
9 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 13.708’ WO 63⁰ 18.824’
T. cruzi
10 R. montenegrensis C 25 S 10⁰ 13.708’ WO 63⁰ 18.824’
T. cruzi
11 R. montenegrensis C 10 S 10⁰ 18.954’ WO 63⁰ 19.929’
T. cruzi
12 R. montenegrensis C 10 S 10⁰ 19.059’ WO 63⁰ 20.070’
T. cruzi
13 R. montenegrensis Quinzinha do Gado Roxo
S 10⁰ 20.103’ WO 63⁰ 22.598
T. cruzi
14 R. montenegrensis Quinzinha do Gado Roxo
S 10⁰ 20.103’ WO 63⁰ 22.598
T. cruzi
15 R. montenegrensis Br 421 km 54 S 10⁰ 18.250’ WO 63⁰ 19.487’
T. rangeli
16 R. montenegrensis Br 421 km 54 S 10⁰ 18.250’ WO 63⁰ 19.487’
T. cruzi
17 R. montenegrensis Br 421 km 53 S 10⁰ 17.238’ WO 63⁰ 18.941’
T. cruzi/T.rangeli
18 R. montenegrensis Br 421 km 53 S 10⁰ 17.238’ WO 63⁰ 18.941’
T. cruzi
19 R. montenegrensis Br 421 km 53 S 10⁰ 17.238’ WO 63⁰ 18.941’
T. cruzi
20 R. montenegrensis Br 421 km 63 S 10⁰ 20.589’ WO 63⁰ 22.598’
T. cruzi/T.rangeli
21 R. montenegrensis Br 421 km 63 S 10⁰ 20.589’ WO 63⁰ 22.598’
T. cruzi
22 R. montenegrensis Br 421 km 63 S 10⁰ 20.589’ WO 63⁰ 22.598’
T. cruzi
50
5. Discussão:
5.1. Dados biométricos:
5.1.1. Viabilidade de ovos de R. montenegrensis:
As taxas de eclosão em ovos na espécie R. montenegrensis observadas
nesse estudo após 21 dias de observação foram de 63,04%. Segundo estudos
realizados por Gómez-Núñes (1964), em espécimes de Rhodnius prolixus, observou-
se que apesar de ocorrerem eclosões em temperaturas constantes entre 16 e 34⁰C
as taxas de eclosão próximas a 100% só ocorrem em temperaturas variando entre
20 e 29⁰C.
Estudos realizados por Szumlewicz (1975) e Sherlock (1979) demonstraram
que as taxas de eclosão para o gênero Rhodnius são geralmente superiores a 80%,
entretanto, taxas inferiores já foram documentadas em outros estudos. Soares e cols
(1995), observaram taxas de 64,9% de eclosão em R. nasutus em uma amostra de
30 ovos e Guarneri e cols. (1998), analisando espécimes de R. domesticus,
observaram uma taxa de eclosão de 57% em uma amostra de 100 ovos.
Segundo Guarneri e cols. (1998), as baixas taxas de eclosão observadas
podem estar relacionadas a questões de fertilidade das fêmeas utilizadas para a
geração dos ovos, o que também pode justificar os valores obtidos no presente
estudo.
5.1.2. Peso dos ovos:
A partir da pesagem dos ovos individualmente antes e após a eclosão da
ninfa de 1⁰ estádio foi possível determinar o peso em gramas para ovos
embrionados e eclodidos. Observou-se que o peso em gramas para ovos
embrionados foi em média 0,000662g, enquanto o peso para ovos após a eclosão
da ninfa de 1⁰ estádio foi em média 0,000231g.
Apesar de a variável peso em ovos de triatomíneos não estar amplamente
discutida na literatura científica sabe-se que as características morfológicas dos
ovos, como a estrutura do exocório, tem sido de grade importância na caracterização
de novas espécies como discutido por Rosa e cols (2012) em estudo referente à
identificação de caracteres morfológicos que identificam a espécie R.
montenegrensis.
51
5.1.3. Período de incubação e duração do ciclo de desenvolvimento:
No presente estudo, o período de incubação médio observado para R.
montenegrensis foi de 13 dias variando entre 11 e 18 dias. Segundo Gómez-Núñes
(1964), observando espécimes de R. prolixus a partir de uma amostra de 4000 ovos,
constatou que o período de incubação varia de acordo com a temperatura a qual os
ovos estão submetidos. Quando submetidos à temperatura de 28⁰C, observou-se um
período de incubação de 14 dias em R. prolixus, duração esta que corrobora com os
valores obtidos neste estudo para R. montenegrensis.
Rocha e cols. (2001a), observando espécimes de R. neglectus a partir de
uma amostra de 100 ovos, mantidos a temperatura de 28⁰C e 70% de umidade
relativa do ar, obtiveram um período de incubação médio de 14,8 dias variando entre
12 e 18 dias.
Rocha e cols. (2001b), em estudo realizado com espécimes de R. robustus a
partir de uma amostra de 100 ovos, observou que em temperatura de 28⁰C e 70% de
umidade relativa do ar, o período de incubação tinha uma média de 16,3 dias
variando entre 14 e 21 dias.
Os três estudos anteriormente citados concordam que em temperaturas
superiores a 28⁰C ocorre uma queda significativa no período de incubação dos ovos
em triatomíneos do gênero Rhodnius.
O ciclo de desenvolvimento em Triatominae varia de acordo com a espécie e
as condições ambientais as quais esses indivíduos estão submetidos. A
disponibilidade de fontes alimentares apropriadas também tem grande influência
sobre este parâmetro (Schofield 1985).
A duração média do ciclo de desenvolvimento em R. montenegrensis do ovo
à fase adulta observada no presente estudo foi de 105,22 ± 9,18 dias em média. Os
valores obtidos neste estudo se aproximam aos valores obtidos por Guarneri e cols.
(1998), para espécimes de R. domesticus. No estudo acima citado, foi observado um
ciclo de desenvolvimento médio de 93,8 dias a partir de uma amostra de 100 ovos.
Entretanto, os valores obtidos no presente estudo se demonstraram mais
baixos do que os valores obtidos em estudos com outras espécies do gênero
Rhodnius. Lent & Valderrama (1977) obtiveram um ciclo de desenvolvimento médio
de 114 dias para R. prolixus, 181,2 dias para R. neivai e 190,7 dias para R. pictipes.
Jurberg & Rangel (1984), analisando espécimes de R. pallescens a partir de uma
52
amostra de 200 ovos, obtiveram uma média de ciclo de desenvolvimento de 358
dias.
5.1.4. Ecdises por Estádio:
Avaliou-se no presente estudo, o percentual de ecdises por estádio de
desenvolvimento em R. montenegrensis. Os maiores percentuais foram observados
no 2⁰ (93,55%) e 3⁰ (93,48%) estádios ninfais, seguidos do 4⁰ estádio ninfal
(89,14%), 5⁰ estádio ninfal (88,05%) e por fim pelo 1⁰ estádio ninfal (77,6%).
Rocha e cols. (2004), observando espécimes de R. brethesi obtiveram um
percentual de 89,2% de ecidises no 1⁰ estádio ninfal, 97,62% no 2⁰ estádio, 99,19%
no 3⁰ estádio, 98,8% no 4⁰ estádio e 98,86% no 5⁰ estádio ninfal.
Rocha e cols. (1997), a partir de observações em espécimes de R. pictipes,
obtiveram um percentual de ecdises de 84% no 1⁰ estádio ninfal, 94% no 2⁰ e 3⁰
estádios, 100% no 4⁰ estádio e 94% no 5⁰ estádio ninfal.
Os valores observados no presente estudo foram relativamente menores do
que aqueles observados para outras espécies do gênero Rhodnius. Entretanto, os
menores percentuais de ecdises ocorreram no primeiro e quinto estádio ninfal, dados
que corroboram com os dados observados em estudos pregressos. O menor
percentual de ecdises nesses dois estádios ninfais se deve ao fato de ocorreram
mais ecdises defeituosas e interrupções no processo de muda imaginal, que é mais
complexa nesses dois estádios do que nos demais.
5.1.5. Razão de sexo:
Observou-se no presente estudo, que o número de fêmeas geradas foi maior
do que o número de machos em R. montenegrensis. Entretanto, a partir do teste de
Qui-quadrado de heterogeneidade não se observou diferença significativa entre o
número de espécimes gerados fêmeas e machos.
Esses dados se demonstraram discrepantes aos valores encontrados para
outras espécies do gênero Rhodnius. Gomes-Nuñes (1964), em estudo realizado a
partir de uma amostra de 4000 ovos de R. prolixus, observou um número maior de
machos, com razão de sexo de aproximadamente dois machos para uma fêmea.
53
5.1.6. Peso em gramas por estádio de desenvolvimento:
A partir da pesagem dos triatomíneos antes e após o repasto foi possível
calcular o aumento de peso corporal induzido pelo ingurgitamento em R.
montenegrensis. Esse aumento foi mais pronunciado nos dois primeiros estádios
ninfais decaindo gradativamente com a aproximação da fase adulta.
Os espécimes em 1⁰ estádio ninfal foram os que apresentaram o maior
aumento de peso corporal após o repasto (10,6X). Os espécimes em 2⁰ estádio
ninfal apresentaram aumento de peso corporal de 6,6X, os espécimes em 3⁰ estádio
ninfal apresentaram aumento de 5,4X, em 4⁰ estádio ninfal 5,9X e em 5⁰ estádio
ninfal 3,9X. Os espécimes em fase adulta foram os que apresentaram o menor
aumento de peso corporal, sendo o aumento do peso em fêmeas (2,2X)
significativamente maior do que em machos (1,6X).
Rocha e cols. (1997), analisando espécimes de R. pictipes a partir de uma
amostra composta por 50 ninfas de cada estádio, 30 machos e 30 fêmeas observou
um maior aumento de peso corporal no 1⁰ etádio (6,5X), 2⁰ estádio (8,2X) e 3⁰
estádio ninfal (8,5X) ocorrendo redução no aumento de peso a partir do 4⁰ estádio
ninfal até a fase adulta, fase em que se registrou o menor aumento de peso corporal
(2,2X e 2,3X para machos e fêmeas, respectivamente).
Rocha e cols. (2004), em estudo analisando R. brethesi a partir de uma
amostra de 54 espécimes também observou um maior aumento de peso corporal
nos 3 primeiros estádios de desenvolvimento (5,1X, 5,0X e 5,5X respectivamente)
ocorrendo diminuição do aumento de peso corporal a partir 4⁰ estádio com a
aproximação da fase adulta, onde se observou o aumento de peso mais baixo
(1,4X). Esses dados corroboram com os dados observados no presente estudo.
A importância da quantidade de sangue ingerido no desenvolvimento de
triatomíneos já foi ressaltada por diversos autores. A ingesta de sangue está
relacionada diretamente com o número de ovos produzidos, com o risco de se
infectar com tripanosomatídeos, com a capacidade de dispersão pelo voo e com a
taxa de dejeção nesses insetos (Buxton 1930, Friend et al. 1965, Regis 1979).
54
5.1.7. Número de alimentações por estádio e percentual de mortalidade: O número de repastos sanguíneos realizados por estádio é
reconhecidamente, um dos aspectos mais relevantes quanto à probabilidade de
infecção e ou transmissão do T. cruzi, uma vez que o contato ativo entre o vetor e o
hospedeiro ocorre no momento da alimentação (Juarez 1970, Rocha et al. 1994,
1997).
No presente estudo, R. montenegrensis apresentou uma média de duas
alimentações nos três primeiros estádios ninfais com aumento gradual a partir do 4⁰
estádio ninfal. Esses dados demonstram um maior número de alimentações por
estádio nesta espécie do que aqueles observados em outras espécies do gênero
Rhodnius.
Guarneri e cols. (1998), em estudo realizado com espécimes de R. prolixus a
partir de uma amostra de 57 indivíduos, observou que não houve diferença
significativa entre o número de repastos realizados por estádio, sendo necessários
em média 1,2 repastos sanguíneos para que houvesse a muda imaginal.
Rocha e cols. (1997), analisando uma amostra de 310 indivíduos da espécie
R. pictipes também observaram um pequeno número de repastos sanguíneos
necessários para a muda imaginal. Entre o 1⁰ e 4⁰ estádio ninfal foi necessária
apenas uma alimentação para que ocorresse a muda. Para os espécimes em 5⁰
estádio ninfal foram necessárias duas alimentações.
Rocha e cols. (2001), analisando populações de R. robustus a partir de uma
amostra de 100 ovos, observou um aumento gradual do número de repastos com a
aproximação da fase adulta. As médias observadas do 1º ao 5º estádio foram 1,5;
1,8; 2,7; 2,8; 4,4, respectivamente. Esses dados foram os que mais se aproximaram
dos dados observados para R. montenegrensis no presente estudo.
Segundo Galvão e cols. (2003), o número de repastos sanguíneos realizados
tem grande relevância epidemiológica já que quanto maior o número de contatos
entre o vetor e o hospedeiro maiores são as possibilidades de infecção e
transmissão do T. cruzi. Os espécimes de R. montenegrensis observados no
presente estudo apresentaram em média mais alimentações para atingir o estádio
seguinte do que outras espécies do gênero Rhodnius. Entretanto, quanto menor a
exposição do vetor na procura por alimento, maiores são as suas chances de
sobrevivência (Galvão et al., 2001). Com isso, a necessidade de um maior número
55
de repastos tem impacto na capacidade vetorial já que pode levar a um aumento da
mortalidade.
Quanto ao percentual de mortalidade por estádio em R. montenegrensis,
observou-se que as taxas mais elevadas ocorreram no 1⁰ estádio (22,4%) e 5⁰
estádio (11,95%). De um modo geral, as taxas de mortalidade mais elevadas são
observadas no 1⁰ e 5⁰ estádio de desenvolvimento. No 1⁰ estádio os percentuais de
mortalidade geralmente são mais altos pela dificuldade na realização do primeiro
repasto devido a fragilidade do aparelho bucal e a dificuldade de alcançar o
hospedeiro e atingir um capilar (Rocha et al., 1997) Já no 5⁰ estádio ninfal o alto
percentual de mortalidade se dá principalmente pela ocorrência de ecdises
defeituosas e interrupções na muda imaginal, que é mais complexa que nas demais
fases (Rocha et al., 2001). Nos demais estádios, os percentuais observados no
presente estudo foram 6,45%, 6,52% e 10,86% para o 2⁰, 3⁰ e 4⁰ estádio
respectivamente. Quanto à taxa de mortalidade total o percentual observado no
presente estudo foi de 30,01%.
Em estudos realizados por Lent e Valderrama (1977), usando pombos como
fonte alimentar, constataram 33% de mortalidade para R. pictipes durante todo o
ciclo. Resultados similares foram obtidos por Rocha e cols. (1994) que registraram
percentual de mortalidade de 38% durante todo o ciclo também para R. pictipes.
Estudos realizados por Arévalo e cols (2007), observando espécimes de R.
colombiensis, constataram um percentual de mortalidade de 31,5% a partir de uma
amostra de 92 insetos.
5.2. Infecção por tripanosomatídeos:
A partir do exame a fresco de material fecal de triatomíneos em 5⁰ estádio
ninfal e fase adulta por microscopia, obteve-se um percentual de infecção por formas
flageladas de 36,7%. Observou-se um percentual significativamente mais alto de
positividade para tripanossomatídeos entre os indivíduos adultos do que entre os
indivíduos em 5° estádio ninfal. Esse fato se deve ao maior número de repastos
realizados por indivíduos adultos o que aumenta de forma significativa as chances
de contaminação por hemoflagelados semelhantes a T. cruzi.
Estudos anteriores realizados no município de Monte Negro, Rondônia,
reportaram a presença de formas flageladas em análise por microscopia do trato
56
digestivo de triatomíneos capturados em palmeiras. Carvalho e cols., em estudo
realizado em 2011, observaram a partir de uma amostra de 322 triatomíneos um
percentual de 50% de infecção por formas flageladas semelhantes a T. cruzi.
Em estudos realizados no município de Ouro Preto do Oeste, Rondônia, em
2012 por Meneguetti e colaboradores, observou-se a contaminação por formas
flageladas semelhantes a T. cruzi em espécies coletados em O. speciosa (babaçu)
em uma amostra de 494 espécimes onde obteve-se um percetual de contaminação
de 35,6%.
Em estudos realizados no município de Monte Negro, Rondônia, Massaro e
cols. (2008), obtiveram a partir da análise por microscopia do tubo digestivo de uma
amostra de 249 espécimes coletados em áreas peridomiciliares, um percentual de
contaminação por formas flageladas de 23,7%.
Sabe-se que, de uma maneira geral, espécies do gênero Rhodnius estão
associadas a diferentes espécies de palmeiras. Estas árvores fornecem um
microambiente ideal para a colonização destes insetos. Entretanto, quando próximos
a ambientes domiciliares, triatomíneos podem optar por outros tipos de abrigos e as
áreas peridomiciliares oferecem opções com microclima ideal para desenvolvimento
destas populações (Coutinho et al., 2014).
Segundo estudos de Meneguetti e cols. (2011), no município de Ouro Preto
do Oeste, Rondônia, a maior ocorrência de triatomíneos em palmeiras se encontrava
nas regiões de pastagem e em proximidade a áreas domiciliares. Esses dados são
preocupantes visto que a proximidade de palmeiras colonizadas por triatomíneos às
residências pode levar a infestação de habitações por espécimes contaminados pelo
T. cruzi.
Segundo Coura e Junqueira, em artigo publicado em 2012, há uma série de
fatores contribuindo para a ocorrência disseminada de surtos agudos na região da
Amazônia brasileira. Entre elas destacam-se a ocorrência de triatomíneos silvestres
contaminados pelo T. cruzi colonizando palmáceas e a intensa ação humana sobre
os ecótopos naturais dos triatomíneos o que leva a invasão dos mesmos em áreas
domiciliares e peri-domiciliares além da contaminação de gêneros alimentícios como
o açaí e outras polpas de frutas.
O estado de Rondônia abriga um ecossistema constantemente ameaçado
pela ação transformadora do homem, resultando em um desequilíbrio que pode
57
facilitar a aproximação do vetor ao homem, consequentemente, facilitando a
transmissão de patógenos como o T. cruzi (Massaro et al., 2008).
Coura, em artigo publicado em 2015, chama a atenção ao aumento do
número de casos recentes por transmissão oral que levaram a região da Amazônia
brasileira a ser considerada como região endêmica para a doença de Chagas e
ainda, ao problema da subnotificação de casos agudos por esta via de transmissão.
Ainda segundo Coura, a questão da subnotificação se deve ao profundo
descaso das autoridades com o atendimento a saúde na região e ao despreparo dos
agentes de saúde em realizar o diagnóstico diferencial da doença de Chagas devido
à inespecificidade dos sintomas.
Após a análise molecular a partir da PCR diagnóstico para amplificação do
domínio catalítico da catepsina L-like (CatL-like) das 22 amostras positivas pelo
exame a fresco de material fecal, observou-se um percentual de 9,1% de
contaminação de triatomíneos da espécie R. montenegrensis entre o 5° estádio
ninfal e a fase adulta por T. rangeli, 72,7% de contaminação dos mesmos por T.
cruzi e 9,1% de contaminação por T. rangeli e T. cruzi.
Em estudo realizado por Meneguetti e colaboradores em 2013 no município
de Buritis, Rondônia, foi registrada a contaminação por T. rangeli em R.
montenegrensis coletados em palmáceas. Foi realizada a análise molecular por
PCR, em uma amostra de 120 especimes coletados. Observou-se a partir desta
amostra um percentual de 100% de contaminação por T. rangeli.
Dias e cols. (2008), em estudo realizado no estado do Ceará, para
investigação da infecção natural por T. rangeli em triatomíneos capturados em
palmáceas observaram que, entre 26 espécimes positivos para tripanosomatídeos a
partir de exame a fresco de material fecal e hemolinfa, 7,7% se demonstraram
positivos para T. rangeli após análise molecular.
Dias e cols. (2014), observando a infecção por tripanosomatídeos na região
do rio Tapajós no estado do Pará, obtiveram um percentual de 7,6% de infecção por
T. cruzi a partir de análise molecular em uma amostra de 423 triatomíneos do gênero
Rhodnius.
Dias e cols. (2007), analisando espécimes de triatomíneos capturados em
palmáceas na chapada do Araripe, Ceará, observaram um percentual de infecção
natural por T. cruzi de 16,8% a partir de uma amostra de 382 espécimes.
58
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram um índice de infecção
natural por T. cruzi em triatomíneos capturados em palmeiras mais alto do que
aqueles observados em estudos posteriores em estados do Norte e Nordeste do
país. Estudos realizados em outras regiões do país também apresentaram
resultados inferiores àqueles observados no presente estudo. Cominetti e cols.
(2013), observando espécimes de triatomíneos no estado do Mato Grosso do Sul,
obtiveram um percentual de infecção por T. cruzi de 19,6% a partir de uma amostra
de 515 espécimes.
A análise molecular para detecção de T. cruzi e para infecções mistas de T.
cruzi e T. rangeli a partir de amostras do trato gastro-intestinal de triatomíneos é a
primeira a ser realizada no município de Monte Negro, Rondônia, e os resultados
possuem grande relevância epidemiológica, pois apontam o triatomíneo como
potecial vetor para a transmissão da doença de Chagas no município.
Além disso, considerando-se que a distribuição do T. rangeli muitas vezes
coincide com a distribuição do T. cruzi, as análises que permitem a distinção entre
as duas espécies é de suma importância para o diagnóstico diferencial da doença e
para os estudos de infecção natural de triatomíneos e do ciclo silvestre do T. cruzi.
Dado as similaridades entre as duas espécies de tripanosomatídeos no que se
refere à superfície de antígenos expressos pelos mesmos, podem ocorrer prejuízos
nos inquéritos sorológicos dificultando assim, o diagnóstico diferencial da doença de
Chagas.
Os dados obtidos neste estudo complementam a necessidade de reavaliação do
quadro da doença de Chagas na região da Amazônia brasileira e demonstram a
necessidade de uma maior atenção pelo sistema de vigilância epidemiológica da
doença de Chagas no estado de Rondônia, localidade onde também se observam a
ação antrópica disseminada e a ocorrência de triatomíneos do gênero Rhodnius
associados a palmeiras contaminados por tripanossomatídeos
59
6. Conclusão:
Quanto aos estudos referentes a biologia da espécie R. montenegrensis,
observou-se no presente estudo que as taxas de eclosão em ovos foram de 63,04%,
dados estes que corroboram com os valores obtidos em estudos anteriores para
outras espécies do gênero Rhodnius. O período de incubação médio observado para
ovos em R. montenegrensis foi de 13 dias variando entre 11 e 18 dias valores que
também se aproximam daqueles obtidos em estudos antoriores para o mesmo
gênero.
Observou-se que os maiores percentuais de ecdises por estádio de
desenvolvimento em R. montenegrensis ocorreram no 2⁰ (93,55%) e 3⁰ (93,48%)
estádios ninfais, seguidos do 4⁰ estádio ninfal (89,14%), 5⁰ estádio ninfal (88,05%) e,
por fim, pelo 1⁰ estádio ninfal (77,6%). Os dados obtidos se demonstraram inferiores
àqueles observados em estudos anteriores para outras espécies do mesmo gênero.
Quanto à razão de sexo em R. montenegresis, observou-se no presente
estudo, a partir do teste de Qui-quadrado de heterogeneidade, que não há diferença
significativa entre a proporção entre espécimes nascidos machos e fêmeas. Os
dados obtidos se demonstraram discrepantes daqueles obtidos para espécimes de
R. prolixus em estudos prévios realizados por Gómes-Núñes (1964), sendo a
proporção de machos maior do que o de fêmeas no estudo acima citado.
Quanto ao aumento de peso após o repasto em R. montenegrensis, os
espécimes em 1⁰ estádio ninfal foram os que apresentaram o maior aumento de
peso corporal (10,6X). Os espécimes em 2⁰ estádio ninfal apresentaram aumento de
peso corporal de 6,6X, os espécimes em 3⁰ estádio ninfal apresentaram aumento de
5,4X, em 4⁰ estádio ninfal 5,9X e em 5⁰ estádio ninfal 3,9X. Os espécimes em fase
adulta foram os que apresentaram o menor aumento de peso corporal, sendo o
aumento do peso em fêmeas (2,2X) significativamente maior do que em machos
(1,6X). Esses dados também corroboram aos dados obitidos para este gênero em
estudos anteriores.
No presente estudo, R. montenegrensis apresentou uma média de duas
alimentações nos três primeiros estádios ninfais com aumento gradual a partir do 4⁰
estádio ninfal. Esses dados demonstram um maior número de alimentações por
60
estádio nesta espécie do que aqueles observados em outras espécies do gênero
Rhodnius.
Com relação à análise da infecção natural por tripanosomatídeos em R.
montenegrensis na região peri-urbana de Monte Negro, Rondônia, observou-se a
partir do exame a fresco de material fecal de espécimes em 5⁰ estádio ninfal e fase
adulta uma taxa de infecção natural de 36,7%. Observou-se um maior percentual de
infecção nos espécimes adultos (50%) do que entre os espécimes em 5⁰ estádio
ninfal (23,3%), esses dados são esperados devido ao maior número de repastos
realizados pelos espécimes em fase adulta.
Após a análise molecular, entre as 22 amostras positivas pelo exame a fresco
de material fecal, observou-se um percentual de 9,1% de contaminação de
triatomíneos da espécie R. montenegrensis entre o 5° estádio ninfal e a fase adulta
por T. rangeli, 72,7% de contaminação dos mesmos por T. cruzi e 9,1% de
contaminação por T. rangeli e T. cruzi. Os resultados obtidos demonstram uma taxa
de infecção natural por T. cruzi superior àquelas observadas em estudos posteriores
em estados do Norte e Nordeste do país.
61
7. Considerações Finais:
Estudos realizados na Amazônia brasileira vêm demonstrando que o índice
de transmissão da doença de Chagas humana tem sido crescente nas últimas
décadas e que essa transmissão é mantida majoritariamente por triatomíneos
silvestres que invadem, mas não colonizam áreas domiciliares e peri-domiciliares.
Destaca-se também na região Amazônica, o aumento do número de casos de
transmissão pela via oral a partir da ingestão de gêneros alimentícios contaminados
com fezes/urina de triatomíneos infectados, em especial o açaí e outras polpas de
frutas.
Entre as espécies de triatomíneos responsáveis pela manutenção deste
quadro destaca-se o gênero Rhodnius, constantemente encontrados associados a
diferentes espécies de palmeiras. Entretanto, pouco se sabe quanto aos hábitos
destes vetores, sua distribuição geográfica e sua biologia. Esses dados podem
contribuir significativamente para a compreensão dos eventos de transmissão
mediados por esses vetores e para a determinação do seu papel na epidemiologia
da doença de Chagas.
A ocorrência de indivíduos da espécie R. montenegrensis infectados por T.
cruzi observada neste estudo é um indicador de que esta espécie possui um papel
ativo na manutenção do ciclo enzoótico do agente etiológico da doença de Chagas.
Estudos anteriores apontam que os eventos de transmissão estão intimamente
relacionados à biologia dos triatomíneos infectados no que se refere à frequência de
alimentação, à quantidade de sangue ingerido e ao intervalo de defecações e sua
frequência. Esses fatores indicam a importância do entendimento da biologia de
vetores recém-descobertos como a espécie R. montenegrensis.
Outros aspectos da biologia de triatomíneos de grande relevância a serem
considerados, são aqueles relacionados ao ciclo biológico dos mesmos. Informações
quanto ao tempo de vida médio desses vetores, viabilidade de ovos e percentuais de
mortalidade por estádio, são de grande importância para a construção de modelos e
técnicas de simulação que podem auxiliar no delineamento de estratégias de
controle vetorial mais eficientes e de menor custo.
Como comprovado pelo sucesso da campanha de eliminação do principal
vetor T. infestans nos países do cone sul em 1991, estratégia esta que foi
responsável por uma redução de 94% do número de casos da doença de Chagas,
62
conclui-se que o controle vetorial ainda está entre as estratégias mais eficazes
contra essa enfermidade. Entretanto, essa estratégia demonstra-se pouco eficiente
diante de espécies silvestres que invadem, mas não colononizam domicílios.
Considerando-se que as espécies de vetores silvestres são as maiores
responsáveis pelos casos de reinfestação de domicílios e ainda atuam de forma a
diminuir a eficiência dos inseticidas residuais, é necessária a criação de novas
estratégias de controle que possam reduzir os eventos de transmissão mediados por
esses vetores.
Apesar de o estado de Rondônia, até o momento, não ser considerado de
risco para a transmissão da doença de Chagas, os dados obtidos neste estudo,
juntamente aos dados obtidos em estudos anteriores, indicam que existe o potencial
para que a região se torne endêmica devido à alta prevalência de triatomíneos
associados a palmeiras e a frequência com que se encontram infectados. Conclui-se
que a presença de palmeiras da espécie O. speciosa, abundantes no estado,
representam um indicador em potencial da presença de triatomíneos e o crescente
risco dos eventos de transmissão ativa.
Além disso, como constatado em diversos estudos, a ação antrópica sobre os
ecótopos desses vetores, a crescente ocupação de áreas de mata antes
preservadas e o deflorestamento seletivo, observados tanto no estado de Rondônia
quanto nas demais regiões da Amazônia brasileira, são também fortes indicadores
do risco de endemização da doença de Chagas nessas regiões.
Recomenda-se um estudo epidemiológico e entomológico de maior
abrangência em diferentes regiões do Estado para se investigar este fenômeno,
além da implementação de estratégias governamentais com o objetivo de qualificar
agentes de saúde no diagnóstico da doença de Chagas, dado aos altos índices de
subnotificação observados em diversas regiões na Amazônia brasileira.
63
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