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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos

Desenvolvimento de método de análise e estudo de estabilidade do

ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico em formulações tópicas

Rosa Fernanda Ignácio

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientador:

Prafa. Ora. Erika Rosa Maria Kedor

Hackmann

São Paulo 2005

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos

Desenvolvimento de método de análise e estudo de estabilidade do

ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico em formulações tópicas

Rosa Fernanda Ignácio

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientador:

Prafa. Ora. Erika Rosa Maria Kedor

Hackmann

São Paulo 2005

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DEDAlUS - Acervo - CQ

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Ficha Cata log rá fica

E laborada pela Di v isào de Bibli o teca e Doc um ent açào d o Co njunto das Quím icas da US P.

Ign ác io. Rosa F e r na nda

12 4d D e" ': nvo lv im e nt o de mé t o d o de a ná l ise e es tud o d e es tab ilid ade

de áci d o kój ico assoc iado ou nào a ác ido g li có li co em formu lações

tó pic as / Rosa Fern a nda Ig náci o -- São Paulo , 200 5 .

228p.

T ese (do ut oraclo) f ac ul dad e de C i ê nc ias Farmacê uti ca s da

U ni versidade d e São Paul o. Departamen to de Farmácia.

O ri e ntador: K e d or- H ack m a nn , E rik a Ros a M a ria

I . Cos méti cos: Co ntro le d e qua l idad e 2. Es pec tro fotom etri a

3. C r o m a t ografia em l íquido d e a lt o desemp enho : Q uím ica an a l ític a

4. Es tabilidad e Medi ca m ento: A ná li se far macê utica I. T. 11.

Ke d or- H ac kmann . E rik a Ro sa M a ri a, o ri e nt ado r .

668.55 C DD

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AGRADECIMENTOS

À Profa. Ora. Maria Inês Rocha Miritello Santoro, pela amizade, incentivo e por ter

me recebido no Laboratório de Controle Físico-Químico de Qualidade de

Medicamentos e Cosméticos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.

À Profa. Ora. Valentina Porta, à Farm. Chefe Eunice Kazue Kano e à Farm. Simone

Schramm Andrade, do BIOFAR, pelo uso do cromatógrafo líquido e apoio técnico

prestado.

À funcionária Leila Aparecida Bonadio, da Biblioteca do Conjunto das Químicas, pela

conferência das referências bibliográficas utilizadas neste trabalho.

À Farm. Kátia Cirlene Alves Botelho, do Laboratório de Química Farmacêutica, pelo

auxílio na análise dos espectros de infravermelho.

Aos colegas de laboratório Elizângela, Andréia Peraro, Nájla, Tatiane, Helena,

Pedro, Ricardo, Renata, Ivani, Joyce, Angel, Carla, Fábio e Alexandre, pela amizade,

ajuda e apoio em todos os momentos.

Aos meus irmãos Rita e Renato e aos meus queridos sobrinhos Gabriela e Leandro,

por compreenderem tantas ausências e pelo amor incondicional.

Aos professores Jorge Luiz Seferin Martins e Anil Kumar Singh e às funcionárias Iria

Raimunda da Silva e Regina Maura Rojas, pela colaboração e amizade.

À acadêmica Larissa Maria Hilsdorf Bernardi, pela colaboração técnica no início

desse trabalho, por sua dedicação e amizade.

Às distribuidoras farmacêuticas Galena, lonquímica, Purifarma, Pharma-Special, ISP

e Merck, por gentilmente terem cedido parte das matérias-primas usadas nesse

trabalho.

RESUMO

o desenvolvimento de métodos analíticos e o estudo de estabilidade de

formulações cosméticas e farmacêuticas fazem parte do processo de garantia de

qualidade, o qual tem por objetivo assegurar a eficácia e segurança no uso de tais

produtos pelo consumidor. O ácido kójico é um agente despigmentante que pode

estar associado ao ácido glicólico, um agente esfoliante, a fim de ter sua ação

potencializada. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um método

analítico para determinação do ácido kójico a 1 % associado ou não ao ácido

glicólico a 5% em formulações tópicas na forma creme e gel, a base de excipientes

comumente utilizados em farmácias de manipulação, e a realização de um estudo

acelerado para avaliar a estabilidade das mesmas. Para a determinação do ácido

kójico isolado empregou-se a espectrofotometria derivada de 1 a ordem no

ultravioleta (UVD), usando-se o método "zero crossing" a 256,8 nm, onde a

interferência dos excipientes da matriz foi anulada. Para a determinação dos dois

ativos associados, foi validado um método por CLAE em fase reversa, com

pareamento iônico, empregando-se coluna Synergi Hidro® C18, fase móvel tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM pH 3,0 com TBA (brometo de tetrabutilamônio) 2 mM :

acetonitrila (95:5), vazão 0,7 mLlmin e detector PDA fixado em 220 nm. As amostras

foram extraídas sem grande complexidade e os ativos puderam ser determinados

em 12 mino As mesmas condições experimentais foram usadas para o

desenvolvimento de um método para a determinação do ácido kójico isolado nas

formulações creme e gel por CLAE, sendo que a comparação com o método UVD

não mostrou diferença estatisticamente significante para p = 95% quanto à precisão

e exatidão. As amostras submetidas ao estudo de estabilidade acelerado, com

duração de 90 dias, foram armazenadas em estufa a 40±2°C e luz a 25±2°C e

também acompanhadas em armário fechado à temperatura ambiente, sendo

avaliadas quanto aos caracteres organolépticos, pH, doseamento e comportamento

reológico. As formulações submetidas ao estudo mostraram-se estáveis fisicamente,

mas as amostras apresentaram decaimento do teor de ácido kójico acima de 5%

quando armazenadas em estufa a 40±2°C. Considerada a condição normal de

armazenagem as formulações mantiveram-se dentro da faixa de 90% do teor inicial,

podendo o prazo de validade de 90 dias ser considerado como referência para

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wa sepepJen6 anb apsap 'wa6eleqwa a o~!sodwoo wa salueLuawas saQóelnWJoJ

ABSTRACT

The development of analytical methods and the stability study of cosmetics

and pharmaceuticals are part of the quality assurance, which has for objective to

guarantee the effectiveness and security in the use of such products for the

consumer. Kojic acid is a depigmentant agent that can be used in association with

glycolic acid, an exfoliant agent, in order to have its action maximized. The aim of this

work was the development of an analytical method to assay kojic acid 1 % associated

or not with 5% glycolic acid in cream and gel form, based on excipients normally

used in compounding formulations, and carried out an accelerated study to evaluate

its stability. To determine kojic acid in such formulations it was employed an UV first

derivative spectrophotometric method (UVD), with "zero crossing" set in 256,8 nm,

where the excipients interference could be annulled. To assay both acids in

association it was validated a reversed phase HPLC method with ion pairing,

employed a Synergi Hidro® C18 column, mobile phase NH4H2POJH3P04 buffer 30

mmor1 pH 3,0 plus TBA (tetrabutylammonium bromide) 2 mM : acetonitrila (95:5),

flow rate of 0,7 mUmin and detector PDA set in 220 nm. The samples were easily

extracted and the run time was 12 mino The same experimental conditions were used

to the development of a HPLC method in order to determine the kojic acid isolated in

cream and gel formulations. The UVD e HPLC methods were not statistically different

in terms of accuracy and precision (p = 95%). The samples submiUed to the

accelerated stability study, for 90 days, were stored at 40±2°C and light 25±2°C. Ali

samples were also stored at room temperature protected from light. Appearance, pH,

rheology and amount of kojic and glycolic acids (by HPLC) were evaluated. At the

end of the study, ali the samples showed physical stability, but presented decline in

kojic acid above 5% at 40±2°C. Samples stored at not accelerated conditions

preserved 90% of kojic acid concentration. Therefore, a 90 days expiration date may

be considered for formulations with similar composition and packing, when stored at

room temperature and protected from light.

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 10

LISTA DE TABELAS

Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e

ácido glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,

armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem

plástica (polipropileno) .


ácido glicólico associados, usando como excipiente creme aniônico,




ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,


plástica (polipropileno).


ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de amigel®,




ácido glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,

expostas à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.


ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,

expostas à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.

Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,

usando como excipiente creme não iônico, armazenadas à temperatura

de 45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).


usando como excipiente o creme aniônico, armazenadas à temperatura



usando como excipiente gel de natrosol®, armazenadas à temperatura

de 45±2°C em estufa em embalagem plástica (polipropileno).


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Tabela 11

Tabela 12

Tabela 13

Tabela 14

Tabela 15

Tabela 16

Tabela 17

Tabela 18

Tabela 19

usando como excipiente gel de amigel®, annazenadas à temperatura


Resultados da avaliação das fonnulações contendo ácido kójico

usando como excipiente creme não iônico, expostas à luz (temperatura

ambiente) em embalagem de vidro incolor.

Resultados da avaliação das fonnulações contendo ácido kójico

usando como excipiente gel de natrosol®, expostas à luz (temperatura


Absorbâncias e llA/l1A obtidas na construção da curva de calibração

do ácido kójico em metanol, nas concentrações de 2 a 18 J.Jg/mL.

Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico

1 % creme, por espectrofotometria derivada de primeira ordem no

ultravioleta, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente

metanol.

Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico

1 % gel , por espectrofotometria derivada de primeira ordem no


metano!.

Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra

ácido kójico 1 % creme por espectrofotometria derivada de primeira

ordem, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente

metano!.

Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra

ácido kójico 1 % gel por espectrofotometria derivada de primeira ordem,

método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente metano!.

Sistemas cromatográficos testados no desenvolvimento do método.

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex,

vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm;

temperatura ambiente.

Valores do fator de retenção (k) nos diferentes sistemas

cromatográficos testados no desenvolvimento do método. Condições

cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

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Tabela 20

Tabela 21

Tabela 22

Tabela 23

Tabela 24

Tabela 25

Tabela 26

Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico

(intervalo de concentração de 08 a 48 ~g/mL) associado a ácido

glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 ~g/mL) por CLAE, fase

móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN

(95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;


Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na

amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase

móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :

ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220

nm; temperatura ambiente.

Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra

ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel

18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN

(95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;



amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase


ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220



ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18:

Tampão NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) ,

vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;


Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 J.Lg/mL)

na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE,

fase móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00

: ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a

220 nm; temperatura ambiente.

Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160

J.Lg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por

CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL,

detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

127

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139

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141

141

Tabela 27

Tabela 28

Tabela 29

Tabela 30

Tabela 31

Tabela 32

Tabela 33

Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Ilg/mL)

na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase

móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :

ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220


Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160

Ilg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por

CLAE, fase móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,





ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220

nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.


ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel

18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN

(95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm

(detector UV-VIS); temperatura ambiente.



tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) ,

vazão 0,7 mUmin ; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector

UV-VIS); temperatura ambiente.

Resultados obtidos no teste de precisão na determinação do ácido

kójico (K) e do ácido glicólico (G) na amostra ácido kójico 1 %

associado a ácido glicólico 5% creme e gel por CLAE, fase móvel 18:

tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05),

vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector

UV-VIS); temperatura ambiente.

Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico

(intervalo de concentração de 08 a 48 IJg/mL), fase móvel: tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV

VIS) ; temperatura ambiente.

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Tabela 34

Tabela 35

Tabela 36

Tabela 37

Tabela 38

Tabela 39

Tabela 40

Tabela 41


ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04

30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente.


ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30

mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente.

Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 j.!g/mL)

na amostra ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV

VIS); temperatura ambiente.

Resultados obtidos na detenminação do teor de ácido kójico (32 j.!g/mL)

na amostra ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão


0,7 mUmin; volume injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV

VIS); temperatura ambiente.

Resultados obtidos na comparação da precisão e exatidão dos

métodos propostos (EDUV e CLAE) para determinação de ácido kójico

nas amostras creme e gelo

Resultados da avaliação macroscópica das fonmulações contendo

ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como

excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico

(polipropileno), nas diferentes condições de anmazenamento.

Resultados da avaliação macroscópica das fonmulações contendo

ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como

excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno),

nas diferentes condições de armazenamento.

Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo

ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas

em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de

armazenamento.

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153

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156

Tabela 42

Tabela 43

Tabela 44

Tabela 45

Tabela 46

Tabela 47

Tabela 48

Tabela 49

Tabela 50

Tabela 51

Resultados da avaliação macroscoplca das formulações contendo

ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas

em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes condições de

armazenamento.

Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido kójico

1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes

condições de armazenamento.


1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de

natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes



1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote

plástico (polipropileno) , nas diferentes condições de armazenamento.


1%, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote

plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.

Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações

contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como

excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico

(polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.


contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% , usando como

excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno),

nas diferentes condições de armazenamento.


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico,

embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições

de armazenamento.


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições

de armazenamento . .

Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %

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Tabela 52

Tabela 53

Tabela 54

Tabela 55

Tabela 56

Tabela 57

Tabela 58

Tabela 59

associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em

estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.



iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a

25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.



iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em

armário à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.


associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de

natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas

em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.



natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz

a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.



natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas

em armário à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.

Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,

usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes

plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos

diferentes tempos de leitura.



plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos

de leitura.



plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à temperatura

ambiente, nos diferentes tempos de leitura.

166

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172

174

176

178

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Tabela 60

Tabela 61

Tabela 62


usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes

plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos




plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos

de leitura.



plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à temperatura

ambiente, nos diferentes tempos de leitura.

182

184

186

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

LISTA DE FIGURAS

Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do infravermelho

(pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda cm-1) :

1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922 (

CH aromático) ; 3172 (-OH) .

Espectro do ácido kójico substância de referência na região do

infravermelho (pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de

onda cm-1): 1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH

alifático) ; 2922 (-CH aromático); 3175 (-OH).

Espectro do ácido glicólico matéria-prima na região do infravermelho

(filme líquido). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1732

(-C=O de ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH).

Espectro do ácido glicólico substância de referência do

infravermelho (pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de

onda cm-\ 1721 (-C=O de ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH) .

Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do UV,

concentração de 10 ~g/mL, tendo como solvente água destilada.

Picos em 216,4 e 268,6 nm.

Espectro do ácido kój ico substância de referência na região do UV,

concentração de 1 O ~g/mL, tendo como solvente água destilada.

Picos em 216,2 e 268,6 nm.

Espectro do ácido glicólico substância de referência na região do

UV, na concentração de 1 00 ~g/mL , tendo como solvente água

destilada.

Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico substância

de referência , razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente

a 550°C.

Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria

prima, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a

550°C.

Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido glicólico

substância de referência, razão de aquecimento 5°C/min,

temperatura ambiente a 550°C.

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Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Figura 17

Figura 18

Figura 19

Figura 20

Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido

glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência, razão de

aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C.

Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido


aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C.

Sobreposição das curvas DTG do ácido glicólico substância de

referência, ácido kójico substância de referência , da mistura do

ácido glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência e da

mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência,

aproximadamente 5 mg de amostra, razão de aquecimento 5°C/min.,

temperatura ambiente a 400°C, obtidas sob atmosfera dinâmica de

ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.

Sobreposição das curvas DSC do ácido glicólico substância de

referência, ácido kójico substância de referência, da mistura do

ácido glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência e da

mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência,

aproximadamente 2 mg de amostra, razão de aquecimento 5°C/min.,

temperatura ambiente a 400°C, obtidas sob atmosfera dinâmica de

N2 de 100 mUmin, em cadinho de alumínio.

Sobreposição das curvas TG isotérmicas da mistura ácido


aquecimento 5°C/min. (temperatura ambiente a Tiso-10°C) seguida

de 2°C/min. até ocorrência de 10% de perda de massa , obtidas sob

atmosfera dinâmica de ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.

Gráfico de Arrhenius (y = a + bx) da mistura ácido glicólico/ácido

kójico 5:1 substâncias de referência .

Espectro de absorção direto e de primeira derivada do ácido kójico

substância de referência (1 O ~g/mL) em metano!.

Espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico

em metanol, intervalo de concentração de 2 a 18 IJg/mL.

Espectro de absorção em derivada de primeira ordem da curva de

calibração do ácido kójico em metanol, intervalo de concentração de

2 a 18 IJg/mL.

Curva de calibração do ácido kójico em metanol, obtida por

87

88

89

90

91

92

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104

105

107

Figura 21

Figura 22

Figura 23

Figura 24

Figura 25

Figura 26

Figura 27

Figura 28

espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta a

256,8 nm.

Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração

do ácido kójico em metanol a 256,8 nm, obtida pelo método dos

mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente

angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de

significância de a) .

Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 J.l.g/mL,

da amostra ácido kójico creme 10 J.l.g/mL e do creme base, em

metanol , com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.

Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão de

ácido kójico a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico creme 10 J.l.g/mL e

do creme base, em metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320

nm. Ponto de anulação do creme base a 256,8 nm (método

quantitativo "zero crossing") .

Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 J.l.g/mL,

da amostra ácido kójico gel 10 J.l.g/mL e do gel base, em metanol,

com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.

Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão de

ácido kójico a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico gel 10 J.l.g/mL e do

gel base, em metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.

Ponto de anulação do gel base a 256,8 nm (método quantitativo

"zero crossing").

Espectro direto, em metanol, da amostra ácido kójico creme a 10

J.l.g/mL, da amostra ácido kójico creme a 10 J.l.g/mL submetido a

envelhecimento acelerado e da solução padrão de ácido kójico a 10

J.l.g/mL.

Espectro de absorção em primeira derivada, em metanol, da

amostra ácido kójico creme a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico

creme a 10 J.l.g/mL submetido a envelhecimento acelerado e da

solução padrão a 10 J.l.g/mL.

Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160

J.l.g/mL). Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP

Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume

107

108

109

110

111

112

113

122

Figura 29

Figura 30

Figura 31

Figura 32

Figura 33

Figura 34

injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

Perfil cromatográfico do ácido glicólico matéria-prima (160 Ilg/mL).

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®,

fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH

3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,


Perfil cromatográfico do ácido kójico substância de referência (32

Ilg/mL). Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP

Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

Perfil cromatográfico do ácido kójico matéria-prima (32 Ilg/mL).

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®,

fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH

3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,



f.!g/mL) com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de

referência (32 Ilg/mL) - tR a 5,99 mino Condições cromatográficas:

coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN (95:05) , vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 f.!L, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8

a 48j..1g/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04

30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin;

volume injetado 20 f.!L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.


do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 j..Ig/mL) obtida

por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2

mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20

f.!L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método

dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta , b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado

(teste de significância de a).

123

124

125

126

128

129

Figura 35

Figura 36

Figura 37

Figura 38

Figura 39

Figura 40

Figura 41

Curva de calibração do ácido glicólico (intervalo de concentração de

40 a 240 IJg/mL) obtida por CLAE, fase móvel : tampão


0,7 mUmin ; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.


do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 2401Jg/mL)

obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM +


injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida

pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta ,

b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t

calculado (teste de significância de a).

Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 fl9/mL) associado

a ácido glicólico (160 flg/mL) creme. Condições cromatográficas:


NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 flL , detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

Perfil cromatográfico do creme base. Condições cromatográficas:



0,7 mUmin; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 flg/mL) associado

a ácido glicólico (160 fl9/mL) gel. Condições cromatográficas: coluna

Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão


0,7 mUmin; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

Perfil cromatográfico do gel base. Condições cromatográficas:



0,7 mUmin ; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 fl9/mL) associado

130

131

132

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135

137

Figura 42

Figura 43

Figura 44

Figura 45

Figura 46

a ácido glicólico (160 ~g/mL) creme, submetida a envelhecimento

acelerado em estufa a 45°C por 30 dias. Condições cromatográficas:


NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.


~g/mL) com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de

referência (32 ~g/mL) - tR a 5,99 mino Condições cromatográficas:


NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.


do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL) obtida


mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20

~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS) ; temperatura ambiente,

obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção

da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de significância de a).


do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 IJg/mL)

obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +


injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente, obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de

correlação e te = t calculado (teste de significância de a).

Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8

a 48 IJg/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04

30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin;

volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);



do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL) obtida


137

143

144

149

150

Figura 47

Figura 48

Figura 49

Figura 50

Figura 51

Figura 52

mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20

J..lL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente,

obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção

da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t

calculado (teste de significância de a).

Representação gráfica das medidas reológicas das formulações

contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando

como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos

(poli estireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes

tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e

Tgo.




(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de

leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.




(poliestireno) , armazenadas em armário fechado à temperatura

ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque

(abaixo) apenas os To e T go.


contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando

como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos

(poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes

tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e

Tgo.




(poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de



contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando


(poliestireno), armazenadas em armário fechado a temperatura

165

167

169

171

173

175

Figura 53

Figura 54

Figura 55

Figura 56

Figura 57

Figura 58

ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque

(abaixo) apenas os To e Tgo.


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas

em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em

destaque (abaixo) apenas os To e T go.



iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a

25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque




iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas

em armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos

de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e T 90.


contendo ácido kójico 1%, usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em

estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em

destaque (abaixo) apenas os To e T 90.


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a

25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque



contendo ácido kójico 1 % , usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em

armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de


177

179

181

183

185

187

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 . Distúrbios hiperpigmentares

SUMÁRIO

2.2. Melanogênese e substâncias despigmentantes

2.3. Ácido kójico

2.4. Ácido glicólico

2.5. Desenvolvimento de formulações contendo ácido kójico

2.6. Métodos de quantificação do ácido kójico

2.7. Métodos de quantificação do ácido glicólico

2.8. Métodos utilizados no presente trabalho

2.8.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

2.8.2. Espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVD)

3. OBJETIVO

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 . Material

4.1.1. Substâncias de referência

4.1.2. Matérias-primas farmacêuticas

4.1.3. Reagentes, solventes e materiais

4.1.4. Equipamentos e acessórios

4.1.5. Formulações utilizadas como excipientes

4.2. Métodos

4.2.1 . Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima

4.2.1.1. Espectroscopia no infravermelho

4.2.1.2. Espectrofotometria no ultravioleta (UV)

4.2.2. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico

4.2.2.1. Estudo termogravimétrico

4.2.2.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

4.2.3. Estudo preliminar de estabilidade das formulações

1

3

3

7

11

16

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20

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25

25

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31

31

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36

36

36

36

36

36

38

39

4.2.3.1. Obtenção dos excipientes creme e gel 29

4.2.3.2. Obtenção das formulações para o estudo preliminar de estabilidade 39

4.2.3.3. Condições de armazenamento 47

4.2.3.4. Avaliação das formulações 47

4.2.4. Validação do método de determinação do ác. kójico por espectrofotometria UV 48

4.2.4.1.

4.2.4.2.

4.2.4.3.

Amostra ácido kójico 1 % creme e gel

Ensaios espectrofotométricos preliminares

Padronização das condições experimentais

4.2.4.4. Construção da curva de calibração

4.2.4.5. Especificidade

4.2.4.5.1. Interferência dos excipientes

4.2.4.5.2. Interferência dos produtos de degradação

4.2.2.6. Exatidão (Recuperação)

4.2.2.7. Precisão

48

49

50

50

51

51

52

53

54

4.2.5. Validação do método de determinação dos ácidos associados por CLAE 55

4.2.5.1. Amostras contendo ácido kójico 1 % e ácido glicólico 5% 55

4.2.5.2. Ensaios cromatográficos preliminares 56

4.2.5.2.1. Condições gerais 56

4.2.5.2.2. Preparo da fase móvel

4.2.5.2.3. Sistemas testados

4.2.5.3. Padronização das condições experimentais






4.2.5.7. Precisão

4.2.5.8. Robustez

4.2.6. Validação do método de determinação do ácido kójico por CLAE



4.2.6.3. Precisão

4.2.7

4.2.8.

Comparação dos métodos analíticos UVD e CLAE

Estudo de estabilidade acelerado

4.2.8.1. Preparo das formulações

4.2.8.2. Condições de armazenamento

4.2.8.3. Freqüência de análise

4.2.8.4. Análises realizadas

5. RESULTADOS

5.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima

57

57

59

60

60

60

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66

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70

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74

74

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77

77

5.1.1. Espectroscopia no infravermelho 77

5.1.2. Espectrofotometria no UV 80

5.1.3. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico 84

5.2. Estudo preliminar de estabilidade das formulações 93

5.2.1. Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico 93

5.2.2. Formulações contendo ácido kójico 98

5.3. Validação do método de determinação do ác. kójico por espectrofotometria UVD 103

5.3.1. Espectro de absorção do ácido kójico 103

5.3.2. Curva de calibração do ac. kójico por espectrofotometria derivada de 1 a ordem 104

5.3.3. Especificidade

5.3.3.1 . Interferência dos excipientes

5.3.3.2. Interferência dos produtos de degradação

5.3.4. Exatidão (Recuperação)

5.3.5. Precisão

5.4. Validação do método de determinação dos ácidos associados por CLAE

108

108

112

113

115

117

5.4.1. Ensaios cromatográficos preliminares 117

5.4.2. Perfil cromatográfico do ác. kójico e ác. glicólico na fase móvel selecionada 121

5.4.3. Curva de calibração do ácido kójico associado a ácido glicólico por CLAE 127

5.4.4. Especificidade 131

5.4.4.1. Interferência dos excipientes



5.4.6. Precisão

5.4.7. Robustez

5.5. Validação do método de determinação do ácido kójico por CLAE

5.5.1. Curva de calibração do ácido kójico por CLAE


5.5.3. Precisão

5.6. Comparação dos métodos de determinação do ác. kójico por UVD e CLAE

5.7. Estudo de estabilidade acelerado

5.7.1. Caracteres organolépticos

5.7.2. Análise de pH

5.7.3. Doseamento

5.7.4. Comportamento reológico

6. DISCUSSÃO

131

136

138

140

143

148

148

151

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155

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188

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1. INTRODUÇÃO

B I B L i O'! .:. '-' ,-\ Faculdade de Ciências F aímélcêutlcilS

" Universidade de São Paulo 1

o desenvolvimento e a formulação apropriados de uma forma farmacêutica

requerem a consideração das características físicas, químicas, físico-químicas e

biológicas de todos os princípios ativos e de todas as matérias-primas usadas na

elaboração do produto, assim como o conhecimento anatômico e fisiológico do local

de administração e absorção. O produto deve ser manufaturado de acordo com as

medidas apropriadas de garantia de qualidade, e acondicionados em recipientes que

contribuam para a estabilidade. O produto deve ser rotulado de modo a promover o

seu uso correto, e ser armazenado sob condições que contribuam para um prazo

máximo de validade (ANSEL et aI., 2000).

A qualidade final do produto farmacêutico já começa na sua pré-formulação.

Os estudos de pré-formulação e a prática de GMP ("Good Manufacturing Practices")

colaboram para a máxima eficácia e segurança do produto. A garantia de qualidade

é extremamente importante para assegurar ao consumidor a confiabilidade do

produto acabado (ANSEL et aI., 2000).

O fabricante é o maior responsável pela qualidade do medicamento que

produz, mediante vigilância intensa de seus processos de fabricação e controle.

Porém, cabe ao governo de cada país a proteção de seus cidadãos. No que diz

respeito à proteção à vida, deve garantir a cada um o direito à saúde, sendo

encarregado de fazer cumprir esse dever constitucional de assegurar o consumo de

medicamentos com qualidade, segurança e adequação aos fins a que se destinam.

No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), criada em

1999 pelo Ministério da Saúde, com modelo semelhante ao das agências européias

e americanas, constitui-se numa autarquia com a missão de proteger a saúde da

população, mediante controle de produtos, bens e serviços submetidos à vigilância

sanitária, bem como de processos, insumos e tecnologias a eles relacionados. Com

a finalidade de fixar uma referência para a inspeção de instalações dos

estabelecimentos farmacêuticos, processos de produção e controle de qualidade, a

ANVISA publicou, em 19/04/00, um regulamento técnico importante para o setor de

2

medicamentos, a Resolução da Diretoria Colegiada nº 33, denominada RDC-33.

Dentre outros, o referido instrumento legal estabelece que as farmácias de

manipulação deverão estabelecer o prazo de validade dos produtos manipulados

com base em estudos de estabilidade de formulações, o que representa a

necessidade de tais estabelecimentos criarem condições para a realização dos

mesmos, ou basear-se em estudos técnico-científicos que reflitam as condições e

características do setor.

A instabilidade das formulações farmacêuticas pode ser detectada em alguns

casos por uma mudança na aparência física, na cor, no odor, no gosto ou na textura;

em outros casos podem ocorrer alterações químicas que não são evidentes e que só

podem ser verificadas por análise química. Os dados científicos que fazem parte do

estudo da estabilidade do produto levam à previsão do prazo de validade para o

mesmo e, se necessário para a reformulação de sua forma farmacêutica (ANSEL et

aI. , 2000; LACHMAN et aI. , 2001 ; VADAS, 1998).

O ácido kójico, associado ou não a substâncias esfoliantes como o ácido

glicólico, é amplamente utilizado no tratamento de hiperpigmentações cutâneas. No

Brasil , a prescrição médica de medicamentos a base deste princípio ativo implica,

para o estabelecimento farmacêutico que o manipula, na necessidade de cuidados

especiais referentes à seleção de bases galênicas e adjuvantes farmacotécnicos

específicos, a fim de se garantir a estabilidade da formulação e conseqüentemente,

a eficácia e segurança do produto. Uma vez que o produto manipulado representa

no país uma forma mais acessível à terapia medicamentosa, em função do menor

custo, torna-se importante que tais estabelecimentos baseiem-se em estudos

científicos de estabilidade de formulações a fim de perseguir a reconhecida

qualidade dos produtos industrializados.

Assim o objetivo do presente trabalho é a determinação da estabilidade físico

química de formulações tópicas a base de ácido kójico, associado ou não ao ácido

glicólico, mediante o desenvolvimento de metodologia analítica que possibilite sua

quantificação.

3

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Distúrbios hiperpigmentares

Os pacientes com alterações pigmentares na pele procuram tratamento

principalmente por razões estéticas. As alterações pigmentares são geralmente

assintomáticas e podem ser classificadas em hipopigmentares e hiperpigmentares. A

produção aumentada de melanina caracteriza um grande número de doenças da

pele, que podem se manifestar na epiderme, derme ou ambas (ARNDT, 1990;

HALDER; RICHARDS, 2004; STRA TIGOS; KA TSAMBAS, 2004).

As desordens hiperpigmentares da pele são comuns e se manifestam sob

diferentes formas. Por causa da natureza visível das doenças dermatológicas, elas

têm um considerável efeito psicológico nos pacientes. Lesões faciais desfigurantes

podem afetar significantemente o estado emocional de uma pessoa, podendo

contribuir para a diminuição de sua inserção social, produtividade no trabalho e na

escola e prejudicar a auto-estima. Como resultado de sua localização prevalente em

áreas expostas ao sol, a hiperpigmentação adquirida tem relevância psicossocial e

cosmética (BRIGANTI et aI., 2003; CAYCE et aI., 2004; RICHARDS, 2004;

STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004).

As desordens de hiperpigmentação mais comuns são melasma (ou cloasma),

lentigos, hiperpigmentação pós-inflamatória e as efélides ou sardas (BRIGANTI et

aI., 2003; CAYCE et aI., 2004; RICHARDS, 2004; STRATIGOS; KATSAMBAS,

2004).

A luz ultravioleta, inflamação crônica, fricção da pele, tanto quanto uma

liberação anormal de hormônio estimulador de melanócito (MSH), são fatores

desencadeantes desses distúrbios (BRIGANTI et aI., 2003).

A hiperpigmentação dérmica ou epidérmica pode ser dependente do número

aumentado de melanócitos ou de uma maior atividade das enzimas melanogênicas,

ou seja, da produção aumentada de melanina (BRIGANTI et aI., 2003). A maioria

das hipermelanoses ocorre como resultado da produção aumentada de melanina na

4

presença de um número normal de melanócitos. Entretanto, nos lentigos simples

ocorre proliferação de melanócitos ativos (CAYCE et aI., 2004).

o melas ma é uma desordem comum de hiperpigmentação macular adquirida

que ocorre na maior parte das vezes em áreas da face e colo expostas ao sol.

Múltiplos fatores têm sido postulados na etiologia e patogenia, incluindo fatores

genéticos, altos níveis estrogênicos (gravidez, uso de contraceptivos orais), uso de

cosméticos, de medicamentos anticonvulsivantes e de drogas fototóxicas, raça e

doença auto-imune da tireóide. A influência genética e em especial a exposição ao

sol parecem ser fundamentais para seu desenvolvimento, na medida em que

aparece exclusivamente nas áreas expostas à radiação solar (GRIMES, 1995;

LAWRENCE et aI., 1997; KAUH; ZACHIAN,1999; PÉREZ-BERNAL et aI., 2000;

VICTOR et aI., 2004; CAYCE et aI., 2004).

Esta hipermelanose simétrica é caracterizada por manchas irregulares claras

a cinza amarronzadas, em locais envolvendo áreas expostas ao sol. Os três

padrões de melasma reconhecidos são centro facial, malar e mandibular, que

acometem regiões da testa, bochechas, nariz, queixo e sobre os lábios. Existem três

subtipos histológicos: epidérmico, com predominância de pigmento na epiderme

basal, suprabasal e na camada córnea, o qual é intensificado pelo exame à luz de

Wood1; dérmico, com macrófagos ou melanófagos carregadores de melanina numa

distribuição perivascular (na derme superficial ou profunda), o qual não é

intensificado com a luz de Wood, e o melasma misto. A classificação clínica dos

subtipos de melasma corresponde à classificação histológica, com o acréscimo do

melasma indeterminado, que é descrito em indivíduos de pele tipo VI (Quadro 1), no

qual o exame com a luz de Wood não é de nenhum auxílio. O melasma epidérmico

responde melhor à terapia tópica (GRIMES, 1995; LAWRENCE et aI., 1997; VICTOR

et aI., 2004).

Em comparação à pele normal, a pele com melasma apresenta um conteúdo

aumentado de melanina em todas as camadas da epiderme e na derme,

dependendo do tipo de melasma. Em adição, o número de melanócitos é maior e

1 Lâmpada ultravioleta, com pico em 365 nm, que permite realçar áreas pigmentadas da pele, bem como determinar a profundidade da lesão (PARASKEVAS et ai, 2005).

5

contém uma maior quantidade de melanossomos em estágio IV, em contraste com

os da pele normal (somente os melanossomos em estágio 111 e IV são capazes de

sintetizar melanina). As lesões de melasma apresentam melanócitos com um

número aumentado de organelas (mitocôndrias, complexo de golgi , retículo

endoplasmático rugoso, ribossomos, etc.) sugerindo uma maior capacidade de

produção dessas células. Além de uma maior síntese de melanossomos, parece

ocorrer também um aumento na transferência para os queratinócitos. A síntese de

tirosinase e de proteínas relacionadas é maior nas lesões de melasma (VICTOR et

aI., 2004).

Melasma é difícil de tratar (L1M, 1999). É uma doença terapeuticamente

desafiante, que afeta principalmente as mulheres, em especial a asiática; os homens

representam apenas 10% dos casos. Todos os grupos raciais são afetados, mas sua

prevalência é maior em indivíduos de compleição mais escura (tipos de pele de IV a

VI), e em mulheres de descendência hispânica que vivem em áreas de intensa

radiação ultravioleta. Dentre os negros, um estudo revelou que desordens de

pigmentação, como hiperpigmentação pós-inflamatória e melasma, são a terceira

causa de problemas de pele. No caso dos fatores desencadeantes, como gravidez e

uso de anticoncepcionais orais, o parto ou a descontinuidade do uso de tais

medicações pode não representar a solução do problema (GRIMES, 1995).

Quadro 1 - Classificação dos tipos de pele segundo Fitzpatrick (SCHMITT, 1992)

Tipo de pele classificação Reação ao sol

I Sensível Queima facilmente , nunca bronzeia

II Sensível Queima facilmente, bronzeia minimamente

111 Normal Queima moderadamente, bronzeia gradualmente

IV Normal Queima minimamente, sempre bronzeia

V Não sensível Raramente queima, bronzeia intensamente

VI Não sensível Nunca queima, profundamente pigmentada -

6

o tratamento é geralmente insatisfatório. Os tratamentos correntes envolvem

o uso de hipopigmentantes, "peelings" químicos e laser (GRIMES, 1995;

LAWRENCE et aI. , 1997; UM; THAM, 1997; CAYCE et aI. , 2004; VICTOR, et aI.,

2004).

Lentigos são distúrbios hiperpigmentares que compreendem uma vasta gama

de lesões como o lentigo simples, o lentigo maligno, nevus e o lentigo solar. Em

geral são lesões de cor marrom, circunscritas, e embora todas as formas de lentigo

apresentem algum grau de conteúdo aumentado de melanócito na epiderme,

apenas no lentigo simples esse aumento é característico. Por outro lado, os lentigos

solares são tipificados pela produção aumentada de melanina, por um leve aumento

do número de melanócitos e por não apresentarem qualquer tipo de atipia celular

(CAYCE et aI. , 2004).

Os lentigos solares são mais prevalentes com o aumento da idade e são

considerados um sinal da pele que sofreu dano solar. O sol, mais do que a idade, é

o agente causador, na medida em que tais lesões não aparecem na pele protegida

da exposição solar. Diferentes denominações têm sido dadas para essas manchas,

de aproximadamente 1 cm de diâmetro, refletindo sua relação com a idade e a

exposição crônica ao sol: sardas induzidas pelo sol, sardas de adulto, manchas de

idade, lentigos senis e lentigos actínicos (BAUMANN, 2002; BASTIAENS et aI. ,

2004).

Cerca de 90% dos pacientes com idade de 65 anos ou mais terão lentigo

solar. Os homens parecem ser mais atingidos. As costas da mão e a face são áreas

tipicamente afetadas, mas prevalecem no tronco. Lentigo solar nas costas parece

estar associado ao efeito cumulativo e intermitente da exposição ao sol e à

queimadura solar sofrida antes dos 20 anos e na infância. Na face, está associado

aos sinais cutâneos do fotoenvelhecimento, como elastose e queratose actínica. O

desenvolvimento de lentigo após terapia com psoralen UVA (PUVA) sugere um

papel para a luz ultravioleta A na etiologia do lentigo solar (BASTIAENS et aI. , 1999;

BAUMANN, 2002; BASTIAENS et aI., 2004).

As efélides ou sardas e os lentigos solares são tipos diferentes de lesões

pigmentares da pele. Ambas as lesões são indicadores de risco para câncer de pele

7

do tipo melanoma ou não melanoma. A associação com o fator idade é fortemente

positiva no caso do lentigo solar, mas comprovou ser negativa para as efélides. Elas

são menos prevalentes que os lentigos solares e tornam-se igualmente distribuídas

na face, braços e tronco. Ocorrem mais freqüentemente no sexo feminino, aparecem

na infância e diminuem com a idade e estão intimamente relacionadas com o

fenótipo de cabelo ruivo, ou seja, são geneticamente determinadas e provavelmente

necessitam da ocorrência de queimadura solar na juventude para se tornarem

visíveis. As efélides do rosto parecem não estar associadas com as lesões comuns

ao dano solar, como elastose e queratose actínica (BASTIAENS et aI., 1999;

BASTIAENS et aI. , 2004).

A hiperpigmentação pós-inflamatória pode ser causada por trauma, cirurgias,

queimaduras, esfoliação química, laser, irritação da pele e dermatoses, estando

freqüentemente relacionada à acne, eczema e reações alérgicas. Embora seja mais

freqüente em indivíduos de pele mais escura, pode afligir indivíduos de qualquer tipo

de pele. As manchas escurecidas são irregulares e aparecem em áreas previamente

inflamadas. Pode ocorrer um aumento da produção e da transferência da melanina

para os queratinócitos e um acúmulo de melanófagos na derme superior causado

pela destruição da camada basal da pele inflamada, que poderia explicar a

hiperpigmentação. Muitos mediadores do processo inflamatório são conhecidos por

estimular o melanócito (BAUMANN, 2002; STULBERG et aI. , 2003; CAYCE et aI.,

2004).

Embora possa ocorrer em qualquer parte do corpo, a hiperpigmentação pós

inflamatória causa estresse ao paciente quando surge na face. Com a resolução do

processo inflamatório a alteração pigmentar tende a normalizar. O tratamento, por

processos químicos ou físicos, é difícil em função de que tais agentes podem piorar

o quadro inflamatório (BAUMANN, 2002; STULBERG et aI., 2003).

2.2. Melanogênese e substâncias despigmentantes

A pigmentação nos mamíferos é importante em numerosos processos, mas

muito permanece desconhecido a respeito da função da melanina em certas partes

do cérebro, olhos e ouvidos, sua natureza foto protetora e sua determinação

8

fenotípica. A cor da pele e do cabelo depende da quantidade, tamanho e tipo da

melanina produzida pelos melanócitos (VIRADOR et aI., 1999).

A tirosinase ou polifenoloxidase, complexo de proteína ferro bifuncional,

largamente distribuído na escala filogenética, é responsável pela melanização em

animais e produção de pigmentos marrons em plantas. Três diferentes formas de

cobre binuclear no sítio ativo são envolvidos nas reações de hidroxilação de

monofenóis a o-difenóis (atividade creolase) e a oxidação de o-difenóis a o-quinonas

(atividade catecolase) (CABANES et aI., 1994; SEO et aI., 1999).

A tirosinase dos mamíferos catalisa os passos limitantes na biosíntese de

melanina, a hidroxilação do aminoácido L-tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L

dopa) e a subsequente oxidação a dopaquinona. A dopaquinona formada passa por

um rápido e espontâneo rearranjo, levando a dopacroma e, finalmente ao polímero

de melanina. Ao menos duas outras enzimas melanossomiais estão envolvidas na

via de produção da eumelanina, que produz pigmento marron e preto, as quais são

DHICA-oxidase e a DOPAcromo tautomerase. A incorporação de reagentes

contendo enxofre, como cisteína ou glutationa, promove diferenciação da via de

produção para formação de eumelanina (pigmento marrom) ou feomelanina

(pigmento vermelho), ou ambas, conforme mostra o esquema na página a seguir

(BAUMANN, 2002; SLOMINSKI et aI. , 2004) .

A produção de melanina ocorre nos melanossomas, uma organela similar aos

lisossomos, sendo depois transferida dos melanócitos (células encontradas na

junção derme-epiderme) para os queratinócitos, e eventualmente desaparecendo

com a descamação da pele (CURTO et aI., 1999; SEO et aI., 1999; VIRADOR et aI.,

1999; SLOMINSKI et aI., 2004).

Várias desordens dermatológicas resultam no acúmulo de níveis excessivos

de pigmentação epidérmica. Essas hiperpigmentações incluem hiperpigmentação

pós-inflamatória, melasma, efélides e lentigos (CURTO et aI., 1999; SEO et aI.,

1999; VIRADOR et aI., 1999; BAUMANN, 2002; HALDER; RICHARDS, 2004;

CAYCE et aI., 2004).

o

HO ~ .... OH

~ I 'IH,

tirosinase ~ ~0

HO

L-OOPA (3,4-dihidroxi-L-fenilalanina)

L-tirosina 1 tims;" ...

/ o ~HOyO

HO ~/OH

>lill'"'-\~ o ~ OH

leucoOOPA croma

1 O

~ O N

: OH

O

I OOPA croma \ DOPA croma tautomerase

o~ OOPAquinona

HO~,~'õ

HO~ Hü& " o ~ N,

~) ~ II OH

OHI (dihidroxi indol)

I tirosinase e/ou -.lt peroxidase

OHICA (ácido carboxílico OHI)

1 DHICA oxidase

NH,

glutationa ou ~ cisteína

H." 4!~ 1 '"~ 1.," ::"... '$ - T

HH:OH

o

cisteinilOOPA

1 intermediários benzotiazínicos

1 FEOMELANINAS

Indol-5,6-quinona Indol-5,6-hidroquinona-2-ácido carboxílico

~ / EUMELANINAS

9

Esquema: síntese de melanina (adaptado de BAUMANN, 2002; SLOMINSKI et aI. ,

2004).

10

Complexos mecanismos genéticos, bioquímicos e hormonais estão

envolvidos na pigmentação da pele, os quais compreendem o controle

transcripcional da expressão da tirosinase, ativação da enzima, síntese e

transferência para os queratinócitos e taxa de renovação da pele (BRIGANTI et aI.,

2003; SLOMINSKI et aI., 2004; AGAR; YOUNG, 2005). Embora a literatura relate a

possibilidade de controle da pigmentação pelo uso de agentes que possam atuar em

qualquer um dos mecanismos envolvidos, a maior parte dos agentes

despigmentantes propostos atualmente agem por inibição (competitiva ou não

competitiva) da tirosinase, como substratos alternativos ou como quelantes de cobre,

co-fator da enzima (BRIGANTI et aI., 2003).

Vários agentes químicos como hidroquinona, arbutin, ácido kójico, tretinoína e

ácido azeláico, associados ou não a substâncias como ácido glicólico, ácido

salicílico, ácido tricloroacético, ou a corticosteróides, são usados correntemente no

tratamento de hiperpigmentações cutâneas (CABANES et aI., 1994; GRIMES, 1995;

LAWRENCE et aI., 1997; KAKITA; LOWE, 1998; COTELLESSA et aI., 1999; UM,

1999; CURTO et aI., 1999; VIRADOR et aI., 1999; GLADSTONE et aI., 2000;

PÉREZ-BERNAL et aI., 2000; HURLEY et aI., 2002; SARKAR et aI., 2002;

GUEVARA; PANDYA, 2003; COLEMAN; BRODY, 2003; BRIGANTI et aI., 2003;

HALDER; RICHARDS, 2004; STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004; VICTOR et aI.,

2004; CAYCE et aI., 2004).

A hidroquinona, um derivado fenólico, inibe a conversão de dopa a melanina

por inibição da enzima tirosinase, atuando como substrato alternativo. É o mais

popular agente despigmentante, introduzido na clinica médica desde 1961. Vários

estudos têm demonstrado sua eficácia terapêutica sozinha ou em combinação com

outros compostos. Exerce sue efeito principalmente sobre melanócitos com intensa

atividade tirosinase, como os epidérmicos e é considerada um padrão de referência

para avaliação de outros agentes despigmentantes. Sob a forma de cremes

clareadores em concentrações de 2 a 4% ou superiores, é o produto mais

comumente utilizado para terapia do melasma e imperfeições pigmentares

caracterizadas por hiperpigmentação. Outros mecanismos de ação propostos para

este despigmentante são inibição da síntese de DNA e RNA, degradação dos

melanossomas, e destruição dos melanócitos. A eficácia da hidroquinona pode ser

aumentada quando usada em combinação com outros agentes como tretinoína 0,05

11

a 0,1%, por exemplo. Reações adversas associadas ao uso de hidroquinona incluem

complicações agudas e crônicas como irritação e dermatite de contato alérgica,

descoloração da unha, hiperpigmentação pós-inflamatória, hipopigmentação e,

raramente, despigmentação da área tratada e das regiões adjacentes. Mais

recentemente, tem sido atribuído ao uso crônico e em altas doses de hidroquinona o

surgimento de ocronose, um distúrbio desfigurante caracterizado pelo

desenvolvimento de lesões onduladas e acinzentadas na testa, bochechas e região

periorbital (GRIMES, 1995; HALDER; BRIGANTI et aI., 2003; RICHARDS, 2004).

Em função da toxicidade da hidroquinona (citotoxicidade frente aos

melanócitos, potencial mutagênico em células de mamíferos, e possível atividade

carcinogênica), outros compostos têm sido propostos para tratamento de

hiperpigmentações cutâneas, como exemplo o ácido kójico (GRIMES, 1995; CURTO

et aI., 1999; BRIGANTI et aI., 2003; STULBERG et aI., 2003; VICTOR et aI., 2004;

CAYCE et aI., 2004).

2.3. Ácido Kójico

O ácido kójico (5-hidroxi-2-hidroximetil-8-pirona), cujas características físico

químicas são apresentadas no Quadro 2, foi isolado do "koji", ou arroz maltado, no

início de 1900. Desde então tem sido conhecido por suas características

antibacterianas, como seqüestrador de metais pesados que aceleram reações de

oxidação, para tratamento do melanismo e inibição das enzimas que deterioram

produtos alimentícios.

Utilizado na indústria farmacêutica, cosmética e alimentícia, é produzido, por

mecanismos ainda não totalmente esclarecidos, pelo Aspergíllus flavus. Diferentes

espécies de Aspergillus são conhecidas por produzirem grandes quantidades de

ácido kójico. Acredita-se que sua fermentação ocorra por biotransformação direta da

glicose (EL SHARKAWY, 1995).

12

Quadro 2 - Características físico-químicas do ácido kójico (BUDAVARI, 1996).

substância Ácido kójico (5-hidroxi-2-(hidroximetil)-4H-pirano-4-ona

fórmula molecular C6 H6 0 4

fórmula estrutural

~OH HO I

o

massa molecular 142,11

ponto de fusão 153-154°C

solubilidade facilmente solúvel em água, etanol e acetona

pKa 7,9; 8,03

Usando tirosinase de cogumelo, Kahn (1995) verificou in vitro que o ácido

kójico inibe efetivamente a formação de pigmento e a incorporação de oxigênio

quando L-dopa, norepinefrina e dopamina são oxidadas pela enzima. O ácido kójico

também tem seu espectro UV-VIS alterado, devido à habilidade das o-qui nonas

destes substratos a oxidar o ácido kójico a um produto amarelo.

Curto et aI. (1999) estudaram in vitro a ação do ácido kójico sobre a enzima

tirosinase e encontraram IC50 (concentração responsável por 50% de inibição) de 6

Ilg/mL, contra 72 e 149 Ilg/mL para hidroquinona e arbutin, respectivamente,

demonstrando ser um potente inibidor. Entretanto, o ácido kójico não exerceu

inibição de pigmentação em cultura de melanócitos intactos, em concentrações

superiores a 200 Ilg/mL. No mesmo estudo, hidroquinona apresentou IC50 de 3,1

Ilg/mL para citoxicidade de melanócito, demonstrando ser altamente tóxica, sendo

que o ácido kójico apresentou IC50 maior que 200 Ilg/mL, confirmando sua baixa

13

toxicidade. Os autores especularam que o ácido kójico, um quelante de cobre, tem

atividade inibitória enzimática contra a enzima livre, mas pode falhar em atravessar

as membranas celulares existentes para inibir a enzima dentro do melanócito.

Virador et aI. (1999), estudaram a ação do ácido kójico, arbutin e hidroquinona

(0,04 a 0,1 mg/mL) em cultura de melanócitos. Todos os agentes tiveram significante

efeito inibitório na viabilidade e proliferação do melanócito, particularmente a altas

concentrações. Todos os três compostos diminuíram o conteúdo de melanina total e

inibiram a atividade enzimática melanogênica, embora os dados não tenham sido

correlacionados com o conteúdo de proteína, o que deve ser considerado em função

do crescimento dos melanócitos.

Nakajima et aI. (1998) verificaram o efeito do ácido kójico na pigmentação de

cultura de melanócitos normais humanos. O ácido kójico, em concentrações de 0,5 a

4 mmol. L-1, diminuiu a pigmentação.

Usando epiderme humana reconstruída, Bessou et aI. (1997), estudaram ex

vivo a ação do ácido kójico a 0,1 % e encontraram uma diminuição da pigmentação,

quando comparado com o controle. Os melanócitos apresentaram-se não

dendríticos, com uma diminuição do conteúdo de melanina.

Cabanes et aI. (1994) demonstraram que a inibição da atividade catecolase

da tirosinase pelo ácido kójico ocorre de uma maneira não clássica. Uma diminuição

na velocidade inicial, a um estado de inibição constante da velocidade, pode ser

observada após alguns minutos. Essa inibição tempo dependente, que é inalterada

pela incubação prévia da enzima com o inibidor, é compatível com uma transição de

primeira ordem. Os dados obtidos sugerem um mecanismo que envolve a formação

rápida de um complexo inibidor, que passa posteriormente a uma reação lentamente

reversível.

A inibição da atividade catecolase (oxidação de L-dopa a dopaquinona exibida

pelos três complexos di nucleares de cobre 11) pelo ácido kójico foi estudada por

BaUani et aI. (2000). O mecanismo de ação da atividade catecolase ocorre em duas

etapas e para ambas a inibição pelo ácido kójico se dá de modo competitivo. O

inibidor se liga fortemente ao complexo di-cobre II da enzima em uma primeira etapa

e, após, ao complexo di-cobre/di-oxigênio em uma segunda etapa, prevenindo em

14

ambos os casos a ligação do substrato catecol. Os autores concluíram que o ácido

kójico atua fazendo "pontes" como ligante entre os centros metálicos do complexo di

cobre" na enzima.

Moon et aI. (2001) e Ahn et aI. (2003) estudaram a ação do ácido kójico sobre

o fator nuclear kappaB (NF-kappaB) em cultura de queratinócitos modificados. A

exposição das células da pele, particularmente os queratinócitos, a vários

ativadores como interleucina-1 , lipopolissacárides, fator alfa de necrose de tumor e

luz ultravioleta, levam à degradação da proteína inibitória IkappaB. O NF-kappaB

liberado é translocado ao núcleo onde pode mudar ou alterar a expressão de genes

alvos, resultando na secreção de sinalizadores extracelulares melanotróficos que

alteram a atividade do melanócito. Os autores incubaram inibidores de

melanogênese como ácido kójico, ácido glicólico, arbutin, hidroquinona e outros com

os queratinócitos modificados, os quais foram posteriormente irradiados com luz

ultravioleta B (UVB). A ativação do NF-kappaB foi medida por método de detecção

por fluorescência. O ácido kójico foi o inibidor mais potente da ativação do NF

kappaB mediada pela regulação UVB e inibiu a síntese de um dos fatores

melanotróficos ativados. Os resultados sugeriram que a ação despigmentante do

mesmo não está apenas relacionada à sua capacidade de inibição da tirosinase.

Garcia e Fulton (1996) relataram que 39 pacientes com melasma foram

tratados com ácido kójicolácido glicólico de um lado da face e com

hidroquinona/ácido glicólico, em um veículo similar, do outro lado. Os resultados

foram documentados por exame à luz de Wood combinado com fotografia com luz

ultravioleta. Responderam igualmente a hidroquinona e ácido kójico 51 % dos

pacientes; 28% dos pacientes tiveram uma maior redução na pigmentação no lado

tratado com o ácido kójico, enquanto 21 % obtiveram uma melhora mais dramática

com a hidroquinona (diferença estatisticamente não significativa). A preparação

contendo ácido kójico foi mais irritante. Os autores concluíram que ambos os

tratamentos foram altamente efetivos.

Com o propósito de avaliar a eficácia de "peelings" de ácido tricloroacético e

de ácido glicólico associado a ácido kójico, no tratamento de hiperpigmentações

cutâneas, Cotellessa et aI. (1999) trataram 20 pacientes com melasma difuso com

uma solução composta de 50% de ácido glicólico e 10% de ácido kójico, enquanto

15

20 pacientes com hiperpigmentação localizada (Ientigos) foram tratados com 15-25%

de ácido tricloroacético. Completa regressão do melasma difuso foi observada em

30% dos pacientes, regressão parcial em 60% dos pacientes e nenhuma regressão

em 10% dos pacientes tratados com a solução ácido glicólico/ácido kójico. Completa

regressão dos lentigos foi observada em 40% dos pacientes, regressão parcial em

50% dos pacientes e nenhuma regressão em 10% dos pacientes tratados com ácido

tricloroacético, tendo os autores concluído que ambos os "peelings" podem ser

considerados efetivos.

Lim (1999) avaliou, em 40 mulheres chinesas com melasma epidérmico, a

ação de um gel contendo 2% de ácido kójico, 10% de ácido glicólico e 2% de

hidroquinona, usados em um lado da face, quando comparada à mesma formulação,

mas sem o ácido kójico, aplicada no outro lado da face. A partir de dados clínicos,

obtidos até 12 semanas de tratamento, os autores verificaram que o lado que

recebeu o ácido kójico foi melhor. O melasma clareou em 60% dos pacientes que

usaram a formulação contendo o ácido kójico, contra 47,5% dos pacientes que

usaram a fórmula sem o ácido kójico. Os efeitos colaterais, vermelhidão, ardência e

esfoliação se manifestaram em ambos os lados da face, mas regrediram na terceira

semana.

Dessa maneira, o ácido kójico, associado ou não a agentes esfoliantes, tem

sido proposto para o tratamento de hiperpigmentações cutâneas, em função da

eficácia apresentada e por apresentar-se mais estável quimicamente do que a

hidroquinona (BRAVO; PABLO, 1997).

Produtos contendo ácido kójico constituem diversas patentes de companhias

asiáticas e européias. Os produtos mencionam o uso do ácido kójico em

concentrações de 0,01 , 0,05, 0,1, 0,5, 0,6, 1, 2, 3, 4 e 6%, na forma de soluções

aquosas, loções, cremes, emulsões múltiplas, gel, base para maquiagem,

antitranspirantes, dentifrícios, adesivos clareadores para os dentes e enxaguatórios

bucais (IZUMIDA et aI. , 1990; KAMEYAMA et aI., 1991 ; ONIZUKA, 1995; ARNAUD

SEBILLOTTE; SEGOT, 1995; YOKOGAWA et aI., 1997; HIKIMA, 1997; FURUYA,

1989; GERNY, 1998; SUZUKI; ONO, 1998; INOUE et aI., 1990; SANO; WATANABE,

1999; HAYASHI; TAKEI, 1999a; HAYASHI; TAKEI, 1999b; WATANABE; OHSATO,

1999; MAEDA; NAGANUMA, 2000; HONDA, 2000a; HONDA, 2000b).

16

Diversos autores têm estudado a toxicidade do ácido kójico. Camundongos ou

ratos submetidos à dieta contendo ácido kójico (em concentrações de até 4%)

sofrem um aumento do peso da tireóide (com formação de adenomas), redução dos

níveis de T3 e T4 e aumento do TSH sangüíneo. A função tireoideana é interrompida

primariamente pela inibição da incorporação de iodo pela glândula, causando uma

diminuição de T3 e T4 no soro, sendo o aumento dos níveis de TSH responsáveis

pela hiperplasia da glândula, efeito reversível com a suspensão da dieta (FUJIMOTO

et aI. , 1998; FUJIMOTO et aI. , 1999; MITSUMORI et aI., 1999; TAMURA et aI.,

1999).

Nohynek et aI. (2004) realizaram um amplo estudo sobre a genotoxicidade do

ácido kójico usando cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e Salmonella ssp.),

células de mamíferos, queratinócitos e hepatócitos humanos, para avaliar sua

mutagenicidade, capacidade de provocar aberrações cromossômicas ou alterações

dos componentes do sangue, além de determinar a toxicidade sub crônica após

administração por via oral a 1 % em ratos ou tópica a 0,5%. Os autores também

realizaram estudo in vitro de absorção percutânea em pele humana e

farmacocinético (absorção, metabolismo, distribuição e excreção) em ratos, após

dose única oral , subcutânea ou dérmica (creme a 1 %). A partir dos resultados foi

sugerido que os níveis de exposição sistêmica no homem após aplicação tópica são

da ordem de 0,03-0,06 mg/kg/dia. Os autores concluíram que o uso tópico do ácido

kójico como agente clareador resulta em negligenciável ou nenhum risco de

genotoxicidade ou toxicidade para o consumidor.

O ácido kójico é comercializado como cosmético de venda livre em países da

América do Norte, sob a forma de cremes, géis e loções tópicas clareadoras da pele.

2.4. Ácido Glicólico

O ácido glicólico, cujas características físico-químicas estão relacionadas no

Quadro 3, é o menor de um grupo de ácidos orgânicos naturais, conhecidos como

alfa-hidroxi ácidos (THIBAULT et aI., 1998). É o mais popular dos ácidos extraídos

de frutas, usado em concentrações que variam de 5 a 15%. Concentrações

superiores são usadas em "peelings" químicos (MANALOTO; ALSTER, 1999).

17

É usado topicamente, em baixas concentrações, para reduzir a espessura do

extrato córneo hiperqueratinizado, mediada pela diminuição da coesão dos

corneócitos. Tal propriedade permite seu uso clínico no controle da pele seca, da

icitiose, da hiperqueratose folicular e outras condições que afetam essa estrutura da

pele. Quando aplicado em altas concentrações, acima de 12-15%, causa

epidermólise, podendo ser usado profissionalmente para o tratamento de queratoses

seborrêicas, manchas de idade, queratoses actínicas, verrugas vulgares, condições

estas associadas tanto à hiperplasia epidérmica quanto à retenção do extrato córneo

(VAN SCOTT; YU, 1989; MANALOTO; ALSTER, 1999).

Quadro 3 - Características físico-químicas do ácido glicólico (BUDAVARI, 1996;

POURCHET, 1975).

Substância ácido glicólico (ácido hidróxi acético)

fórmula molecular C2H403

fórmula estrutural HOII

OH

° massa molecular 76,05

ponto de fusão 77-79°C

solubilidade facilmente solúvel em água, metanol , etanol e acetona

pKa 3,83

pH sol. aquosa 2% = 2,16/ sol. aquosa 5% = 1,91 - - ----- -

18

Estudos in vitro mostraram que o ácido glicólico causa um aumento da

produção de colágeno pelos fibroblastos (THIBAULT et aI., 1998), de

glicosaminoglicanos e possivelmente, de elastina (MANALOTO; ALSTER, 1999).

o uso de creme contendo ácido glicólico a 5%, não neutralizado, por 3

meses, promoveu significativa redução de lentigos e hipermelamose induzida pelo

sol. Os autores creditam os resultados a diversos fatores como: a possibilidade de o

ácido glicólico remover a pigmentação excessiva pela maior proliferação de células

normais abaixo da lesão, pelos queratinócitos conterem menos melanossomas em

uma epiderme hiperproliferativa, pelo afinamento do extrato córneo, que

indiretamente clareia a pele uma vez que cada camada de corneócitos contém

melanina, pelo aumento da dispersão do pigmento e ainda, por uma possível ação

direta do ácido glicólico sobre a tirosinase, inibindo a formação de melanina

(THIBAUL T et aI., 1998; MANOLO; ALSTER, 1999; USUKI et aI., 2003;

STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004).

Em 1996 o "Cosmetic Ingredient Review Expert Panel" concluiu que os alfa

hidroxi ácidos são seguros para uso em cosméticos a concentrações que não

excedam os 10%, com pH não inferior a 3,5, a fim de se evitar maior sensibilidade

da pele ao sol (BERGFELD et aI., 1998; JOHNSON et aI. , 2000).

2.5. Desenvolvimento de formulações contendo ácido kójico

A estabilidade de uma formulação farmacêutica está relacionada não só à

estabilidade intrínseca do fármaco (estabilidade química), como também à forma

farmacêutica que o veicula (estabilidade física). Além disso, a interação entre os

constituintes de uma formulação pode levar ao aparecimento de incompatibilidades,

que resultam em perda da eficácia ou segurança do produto.

Segundo Ha et aI. (1998), o ácido kójico possui instabilidade sob luz, pH e

temperatura. É incompatível com agentes oxidantes fortes, sofre degradação em pH

9,0-10,0, sendo estável em pH 3,0 e 5,0 (SHINSHI et aI., 1984).

19

Lan (1998), propôs, sob a forma de patente, que a oxidação de cosméticos

clareadores pode ser inibida acondicionando-se o ácido kójico e o creme base em

embalagens separadas, sendo as preparações estáveis por dois anos.

Patente de autoria de Yamamoto (1988), registra que o uso de ácido kójico

purificado pelo método de sublimação, quando formulado em creme, não mostrou

alteração de cor por 20 dias, enquanto um creme controle contendo ácido kójico

purificado pelo método padrão escureceu em 5 dias.

A patente de Onizuka (1995), menciona o desenvolvimento de uma emulsão

múltipla óleo/água/óleo incorporada de ácido kójico e/ou seus derivados na fase

aquosa, com a finalidade de melhorar a estabilidade da emulsão.

Patente de autoria de Inoue et aI. (1997), menciona a formulação de

cosméticos clareadores contendo ácido ascórbico ou seus derivados, hidroquinona

glucosídeo ou seus derivados e/ou ácido kójico e seus derivados, além de outros

constituintes, adicionados de agentes estabilizadores como quelantes de metal ,

sulfitos, bissulfitos, tiossulfatos ou pirossulfitos. As preparações foram resistentes à

luz.

Um creme contendo ácido kójico e uma triazina que absorve na região UV-B

usada como estabilizante, foi armazenado a 50°C por dois meses e quase não

mostrou descoloração e precipitação da triazina, segundo patente de autoria de

Honda (1997).

Uma solução aquosa tópica contendo ácido kójico 1 %, ácido salicílico 1,5%, e

dietilenoglicol monoetil éter 25%, como solvente do ácido salicílico e para aumentar

a penetração do ácido kójico pela pele, foi adicionada ainda de citrato de sódio

4,5%, ácido cítrico 6%, Na2S20s 0,25%, com pH final de 3,4, segundo patente de

Sakoda e Toyama (1998).

De acordo com Su et aI. (1999), a adição de bissulfito de sódio a um creme

contendo ácido kójico preveniu sua instabilidade.

No Brasil, não há produtos farmacêuticos ou cosméticos industrializados a

base de ácido kójico, associado ou não a ácido glicólico. O seu uso se dá a partir de

prescrições dermatológicas, preparadas em farmácias de manipulação.

20

Não há relatos na literatura a respeito da estabilidade do ácido kójico

associado a ácido glicólico, quando veiculado nas bases farmacêuticas

habitualmente usadas no Brasil para incorporá-los, como base autoemulsionante

aniônica (álcoois graxos superiores associados a lauril sulfato de sódio), base

autoemulsionante não iônica (álcoois graxos superiores associados a álcool

etoxilado) ou géis não iônicos.

Em função do caráter ácido de ambos, que pode representar existência de

incompatibilidade com constituintes do veículo, em especial com agentes emulsivos

e outras substâncias sujeitas à degradação ou perda de atividade em pH ácido (por

exemplo, ésteres emolientes), e da necessidade de selecionar adjuvantes

adequados, torna-se relevante o desenvolvimento e a determinação da estabilidade

de formulações contendo ácido kójico, associado ou não a ácido glicólico.

2.6. Métodos de quantificação do ácido Kójico

Majmudar et aI. (1998), usando uma coluna octil dodecil silanol (OOS) 150 x

4,5 mm (Metachem® 0297), dosaram ácido kójico em preparações aquosas ou

anidras, por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando detector de

fotodiodo a 254 nm. As amostras foram diluídas com água:acetonitrila (50:50 v/v) e a

fase móvel consistiu de água:acetonitrila (20:80 v/v).

Kimura et aI. (2000) desenvolveram um método para dosagem de ácido kójico

em alimentos. O ácido foi extraído com metanol 50% e filtrado, após centrifugação,

em uma membrana de 0,45 I-lm. A separação foi realizada por cromatografia líquida,

usando-se uma coluna OOS, tendo como fase móvel fosfato monobásico de sódio

0,1 moI. L-1 : metanol (97:3 v/v) e detector de fotodiodo. As taxas de recuperação de

ácido kójico inoculado em alimentos ao nível de 0,10 g/kg foram de 73-96% e o limite

de detecção foi de 0,005 g/kg.

Sottofattori e Anzoldi (2000) dosaram ácido kójico por CLAE em um creme

contendo parabenos, triclosan e gama-orizanol, separados em uma coluna

cianopropil (20 cm x 4,6 mm) por gradiente de eluição com metano I até 90% e

detector de fotodiodo em comprimento de onda de 220 a 240 nm. Separações

21

satisfatórias foram também alcançadas usando uma coluna LiChroCART -CN® (25

cm x 4 mm). Para separação da amostra, o creme foi misturado com THF/tampão

fosfato 25 mmol. L-1 pH 3,5 (3:7 v/v) e a suspensão homogênea foi analisada

satisfatoriamente sem posterior pré-tratamento.

Ácido kójico extraído de alimentos com Na2S04 e acetona foi analisado por

cromatografia líquida em coluna OOS (25 cm x 4,6 mm), operada a 40°C em

gradiente linear (1 mLlmin) com 0,1% de ácido propiônico (100 a 20%) e metanol,

com detecção a 270 nm. O método mostrou linearidade para a faixa de

concentração de 1 a 50 jJg/mL. Usando o método de adição de padrão, a taxa de

recuperação foi de 78,S a 90,4% (SATO et aI., 2000).

Masse et aI. (2001) analisaram cosméticos contendo ácido kójico e arbutin por

cromatografia líquida, usando coluna diol (fase normal) 250 x 4,6 mm, tendo como

fase móvel acetonitrila : KH2P0450 mmol. L-1 pH 2,5 (70:30 v/v). A amostra foi

extraída com acetonitrila, dispersada em ultra-som e filtrada em membrana de 0,45

I-lm ou centrifugada a 4.000 rpm por 20 minutos. A detecção (detector de fotodiodo)

ocorreu a 270 nm para o ácido kójico. O tempo de retenção foi de 3,4 minutos. A

curva de calibração foi construída com concentrações de 9,375 jJg/mL a 150 I-lg/mL,

mostrando desvio padrão relativo (OPR) de 0,09 a 1,85% e coeficiente de

determinação (~) igual a 0,998. A precisão do método em amostras comerciais

apresentou OPR de 0,4% e 6,77%.

Usando uma coluna Intertsil® OOS 150 x 1, O mm Shih (2001) quantificou

ácido kójico e fosfato de ascorbil magnésio em cosméticos clareadores. A detecção

do ácido kójico ocorreu a 254 nm (detector de fotodiodo), em eluição isocrática. A

mistura tampão Na2HPOJH3P04 50 mmol. L-1 pH 5,0 com brometo de

tetrabutilamônio (TBABr) 0,5 mmol. L-1 : metanol (95:5) foi usada como fase móvel. A

amostra foi extraída com água destilada e filtrada em membrana de 0,22 I-lm. A

curva de calibração foi construída com concentrações de 0,05 a 100 I-lg/mL, com

coeficiente de regressão linear (r) de 0,999. A precisão do método apresentou OPR

de 2,19, 0,38 e 0,31% para concentrações de 1, 10 e 100 ppm de ácido kójico,

respectivamente. A precisão em amostra comercial creme foi de 0,62% OPR e as

taxas de recuperação variaram de 95,18 ± 0,99 a 101,82 ± 2,10% para creme e de

97,65 ± 0,52 a 103,80 ± 1,59% para loção.

22

Outros métodos, como análise por voltametria (SHIH; ZEN, 1999),

cromatografia gasosa com detector de captura de elétrons (MANABE et aI., 1988) e

cromatografia de exclusão em gel (YAMAMOTO et aI., 1997) são mencionados.

A revisão da literatura mostrou não haver, até o presente momento,

metodologia validada de doseamento do ácido kójico por espectrofotometria UV-VIS.

2.7. Métodos de quantificação do ácido glicólico

Para avaliar a estabilidade de ácido glicólico e ácido láctico em sistemas

aquosos, De Villiers et aI. (1997) usaram análise por CLAE em uma coluna Micro

Bondapack® ODS 25 x 3,9 mm com fase móvel NH4H2P04 3 mmol. L-1 : acetonitrila

(60:40) e detecção a 214 nm. Concentrações de 200 a 1000 IJg/mL de ácido glicólico

foram usadas para a curva de calibração que teve coeficiente de correlação de

0,9999.

Scalia et aI. (1998) desenvolveram um método para determinação de ácido

glicólico em produtos cosméticos por CLAE de fase reversa, usando pareamento

iônico. Após dissolução em THF-H20 (90:10 v/v) as amostras foram extraídas em

fase sólida (cartucho SAX) e analisadas diretamente em uma coluna Ultrasphere®

ODS 150 x 4,6 mm. A detecção ocorreu a 210 nm, e a fase móvel usada foi tampão

fosfato de sódio 25 mmol. L-1 pH 7,2: metanol (98:2 vlv) contendo iodeto de

tetrabutilamônio (TBAI) 2 mmol. L-1. O ácido glicólico eluiu em 4,1 minutos. A curva

de calibração, com concentrações de 15 a 500 IJg/mL de ácido glicólico foi linear

com coeficiente de correlação linear de 0,998. O método foi considerado preciso em

níveis que variaram de 1,5 a 5,4% de DPR para amostras comerciais. A taxa de

recuperação de ácido glicólico em creme e gel variou de 92,4 a 96,2%.

Um método de determinação de alfa hidróxiácidos em cosméticos por CLAE

foi proposto por Hempel (1998). O autor usou coluna LiChrospher® 100 C-8

capeada, 250 x 4 mm, e gradiente de eluição de 10 a 100% de KH2POJH3P04 10

mmol. L-1 adicionado de 1,5 mLlL de TBA 1 moI. L-1, pH 2,3 (solvente B) em solvente

A (mesmo sistema com pH ajustado para 2,7), em temperatura de 40°C. A detecção

foi a 210 nm.

23

Usando coluna OOS Micro Bondapack® 25 x 3,9 mm, Oe Villiers et aI. (1998)

determinaram ácido glicólico em cremes não iônicos por CLAE, usando como fase

móvel KH2POJH3P04 0,01 mmol. L-1 pH 2,25 : acetonitrila (60:40). A detecção

ocorreu a 214 nm, com tempo de retenção de 11 minutos. O coeficiente de

correlação (r) do método foi de 0,9998 para a faixa de concentração de 50 a 100

f.Jg/mL e de 0,9999 para 200 a 1000 j.Jg/mL. A recuperação de amostra sintética

adicionada de padrão foi de 99,6% (0,6% OPR). Amostras do creme foram

analisadas quanto à precisão do método e mostraram OPR de 0,42%.

Yates e Havery (1999) descreveram um método para determinação de ácido

glicólico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido salicílico, fenol , resorcinol , ácido alfa

hidroxioctanóico e ácido alfa hidroxidecanóico em cremes e loções cosméticas. Os

componentes foram extraídos em fase sólida, filtrados e submetidos à cromatografia

líquida em coluna Prodigy® Ca com capeamento, 250 x 4,6 mm. A análise foi feita a

210 nm, usando NH40H/H3P04 100 mmol. L-1 pH 2,5 como fase móvel. A taxa de

recuperação de ácido glicólico em uma formulação de creme foi da ordem de 93%.

NicoleUi et aI. (1999a) descreveram um método para determinação por CLAE

de ácidos glicólico, láctico e tartárico em cosméticos, empregando uma coluna OOS

Alltech Altima® 250 x 2,1 mm, usando como fase móvel tampão fosfato 10 mmol. L-1

adicionado de cloreto de tetrabutilamônio (TBACI) 10 mmol. L-1, pH 2,2. A detecção

foi a 210 nm. As amostras foram extraídas com metanol, dispersas em ultra-som e

filtradas em membrana de 0,22 j.Jm. O tempo de retenção do ácido glicólico foi de

4,31 minutos com OPR de 0,64%. A curva de calibração foi obtida com

concentrações de 92 a 736 f.Jg/mL demonstrando linearidade (coeficiente de

correlação igual a 0,99996). Concentrações conhecidas de padrão foram

recuperadas da amostra em níveis de 98,21 a 101,51 %.

NicoleUi et aI. (1999b) descreveram um método para determinação por CLAE

de ácidos glicólico, láctico e tartárico em cosméticos, empregando uma coluna OOS

Alltech Altima®, usando como fase móvel tampão fosfato 10 mmol. L-1 adicionado de

TBACI 5 mmol. L-1, pH 2,2.

Usando coluna OOS Capcell® PAK UG 120S 250 x 4,6 nm, Huang et aI.

(2002) propuseram um método para determinação de alfa hidróxiácidos em

24

cosméticos. A fase móvel consistiu de H3P04 2% pH 2,0 ajustado com NH40H e a

detecção se deu a 210 nm. As amostras foram extraídas em água, sonicadas,

centrifugadas e filtradas em membrana de 0,45 I-Im. A curva de calibração foi

construída com concentrações na faixa de 25 a 500 I-Ig/mL usando padrão interno

(ácido malêico) a 2 I-Ig/mL, com r de 0,9994 para o ácido glicólico. O tempo de

retenção foi de 6,4 minutos. A taxa de recuperação em amostra sintética contendo

ácido glicólico foi da ordem de 98,2 a 100,0%, (0,95% OPR).

Couch e Howard (2002) desenvolveram um método de quantificação de ácido

glicólico por CLAE de fase reversa, usando uma coluna OOS Prodigy® 250 x 4,6

mm. A fase móvel consistiu de tampão NH4H2P04 50 mmol. L-1 pH 3,0 em gradiente

de eluição até a proporção de 1: 1 com acetonitrila. Um creme contendo ácido

glicólico a 10% foi extraído em fase sólida (cartuchos SAX) e submetido à análise. O

tempo de retenção do ácido glicólico, detectado a 210 nm, foi de 11 minutos. O

método foi linear na faixa de 23,1 a 462 I-Ig/mL, com coeficiente de correlação de

0,998. A recuperação de padrão em amostra sintética foi de 100,1 a 109,8% (média

de 104,2 ± 4,1%).

Chang e Chang (2003) propuseram a determinação de agentes

branqueadores hidrofílicos em cosméticos por CLAE, usando coluna OOS Mightysil®

GP 250 x 4,6 mm e fase móvel KH2P04 5 mmol. L-1 adicionada de hidróxido de

tetrabutilamônio (TBAH) 10 mmol. L-1 pH 2,5 : metano I (90:10). O tempo de retenção

do ácido glicólico a 220 nm foi de aproximadamente 3 minutos. O coeficiente de

correlação da curva de calibração (8 a 36 mg/mL) foi de 0,9974. A precisão para

amostra comercial contendo o ácido foi de 2,2% OPR. A taxa de recuperação de

padrão adicionado a amostra sintética variou de 99,6 a 100,1 %.

Outros métodos de determinação de ácido glicólico por CLAE em alimentos e

amostras biológicas são mencionados (ACCORSI; BLO, 1991; BUENO et al.,1997;

DEL NOZAL et aI., 1998; NARAYANAN et aI., 1999) além dos que reportam o uso de

eletroforese capilar, cromatografia gasosa-espectrometria de massas ou outros

métodos para sua determinação em soro, alimentos ou bebidas alcoólicas (PORTER

et aI., 1999; NG et aI., 2000; TSIAFOULlS et aI., 2002; VORARAT et aI., 2002; VAN

HEE et aI., 2004; SHAO; GIESE, 2004).

25

2.8. Métodos utilizados no presente trabalho

2.8.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A cromatografia pode ser conceituada como um "método físico-químico de

separação, no qual os constituintes da amostra a serem separados são

particionados entre duas fases, uma estacionária, geralmente de grande área, e a

outra um fluído insolúvel na fase estacionária, que percorre a primeira". A fase

estacionária, ou adsorvente, tem tomado várias formas no decorrer do tempo,

incluindo papel, camada delgada de sólidos sobre placa de vidro, líquidos

imobilizados, géis e partículas sólidas empacotadas em colunas. O componente que

flui, ou fase móvel, é um líquido ou um gás (WESTON; BROWN, 1997; CIOlA,

1998).

A separação cromatográfica é o resultado de interações específicas entre as

moléculas da amostra e as fases móvel e estacionária. Uma vez que a migração

diferencial é dinâmica e depende do equilíbrio de distribuição de cada componente

entre a fase móvel e a fase estacionária, a composição de ambas as fases e a

temperatura de separação serão as variáveis que afetarão o processo. A mobilidade

exibida pelo soluto dar-se-á em função de diferenças na adsorção, partição,

solubilidade, pressão de vapor, tamanho da molécula ou densidade de carga iônica

(CASS; DEGANI, 2001; USP 2005).

Na cromatografia líquida de alta eficiência, surgida na década de 60, a

enorme variedade de fases estacionárias disponíveis (colunas) e a ampla faixa de

temperatura utilizada permitem uma grande variação no tipo de interação específica,

multiplicando as possibilidades de separação. O método permite o uso de vários

tipos de detectores (UV-VIS, PDA, eletroquímico, fluorescência, índice de refração,

espectrometria de massas, etc) e a amostra pode ser facilmente recuperada. O uso

da alta pressão, necessária em função do tamanho das micropartículas utilizadas (3-

5 IJ), menos permeáveis em comparação com as usadas na cromatografia líquida

clássica, permite separações melhores e mais rápidas (SNYDER et aI., 1997).

A sílica-gel é a matéria-prima mais importante das fases estacionárias usadas

na ClAE. É um material versátil , podendo ter sua superfície alterada por derivação

química dos grupos silanóis, possibilitando o surgimento das fases ligadas polares

26

(ciano, diol e amino, etc.) ou apoiares (butila, octila ou Cs, octadecila ou C1S, etc.).

Tradicionalmente as fases ligadas não polares são conhecidas por fases reversas. A

cromatografia de fase reversa é o modo mais largamente empregado e envolve a

separação de compostos com base na sua hidrofobicidade, por meio do uso de uma

fase estacionária não polar e de uma fase móvel polar. Assim, a diminuição da

polaridade da fase móvel é acompanhada da diminuição da retenção do soluto

(WESTON; BROWN, 1997).

A derivação química, por razões estéricas, não atinge todos os grupos

silanóis. Os silanóis livres restantes ou silanóis residuais, com carga negativa,

podem interferir com a separação de compostos de caráter básico, promovendo o

rabeamento dos picos. Além disso, fases móveis acima de pH 8 podem reagir com

os silanóis residuais o que provoca a dissolução da sílica. Atualmente já existem no

mercado colunas cujos silanóis residuais sofreram um processo de capeamento

químico com grupos polares menores ("end-capping"), que permitiu seu uso numa

ampla faixa de pH e conferiu considerável estabilidade química (CASS; DEGANI,

2001; SILVA, et aI., 2004).

Separações de compostos iônicos tendem a ser mais complexas que a de

moléculas neutras. A maior parte das substâncias farmacêuticas e cosméticas

contém funções ionizáveis como ácidos carboxílicos e amino grupos. A separação

de compostos ionizáveis pode ser conseguida por supressão iônica (uso de tampão

na fase móvel e controle do pH a fim de deslocar o equilíbrio da dissociação da

espécie para a forma não dissociada ou mais hidrofóbica, aumentando assim a

retenção nas colunas de fase reversa), por pareamento iônico ou usando-se colunas

de troca iônica (WESTON; BROWN, 1997; CASS; DEGANI, 2001).

No caso de substâncias de caráter ácido, como as usadas no presente

trabalho, a supressão iônica só é possível usando-se um pH na fase móvel inferior

ao valor do pKa dos compostos envolvidos na separação, ou seja, tampão com pH

ácido, muitas vezes agressivo, o que pode restringir a técnica dependendo do tipo

de coluna utilizada (HEINISCH; ROCCA, 2004).

Na cromatografia de pareamento iônico o pH da fase móvel é ajustado de

forma a "encorajar" a ionização da amostra. A retenção é alcançada pela introdução

27

de um reagente de pareamento iônico no eluente, uma molécula orgânica dotada de

carga positiva (separação de ácidos) ou de carga negativa (separação de bases). A

amostra interage com o contra-íon do pareador e o par iônico formado terá maior

afinidade pela coluna de fase reversa em função da hidrofobicidade da cadeia

carbônica do reagente pareador (SNYDER et aI. , 1997).

Alguns mecanismos são postulados na tentativa de explicar a forma como

ocorre a interação entre pareador, analito e fase estacionária. Além de outros mais

complexos (formação de micelas, complexação), os mecanismos fundamentais

envolveriam a interação do pareador com o analíto ionizado já na fase móvel e a

posterior partição do par não carregado com a fase estacionária elou então a

interação do pareador com a fase estacionária, expondo sua carga para a superfície

e a posterior interação do analíto de carga oposta que passa pela coluna, o que se

assemelharia com o mecanismo da cromatografia de troca iônica (GLOOR;

JOHNSON, 1977; SNYDER et aI. , 1997; WAKSMUNDZKA-HAJNOS, 1998).

Na cromatografia de pareamento iônico a retenção e separação são

influenciadas pelo pH e concentração do tampão, tamanho e concentração do

reagente de pareamento, tipo e concentração do solvente orgânico e fase

estacionária utilizada (GLOOR; JOHNSON, 1977; SNYDER et aI. , 1997).

2.8.2. Espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVO)

A espectroscopia na região do ultravioleta e visível (UV-VIS) compreende o

espectro eletromagnético que vai de 160 a 780 nm. A absorção molecular

espectroscópica está baseada na medida da transmitância T ou da absorbância A

de uma solução, contida em uma célula transparente, tendo um caminho óptico de b

centímetros. A concentração de um analito absorvente c é linearmente relacionada à

absorbância, como dado pela equação que representa matematicamente a lei de

Beer (SKOOG et aI., 2002):

A = - log T = ebc

A medida da absorção baseada na radiação UV-VIS encontra larga aplicação

na determinação quantitativa de uma grande variedade de compostos orgânicos e

28

inorgânicos. As variáveis que influenciam o espectro de absorção de uma substância

incluem a natureza do solvente empregado, o pH da solução, a temperatura, a

concentração de eletrólitos e os componentes da amostra (SKOOG et aI. , 2002).

Embora tenha grande aplicação na química analítica, por se tratar de um

método instrumental de relativa simplicidade e baixo custo, a maior parte dos

métodos espectrofotométricos UV-VIS refere-se à determinação de amostras

contendo um único componente. A análise de sistemas multicomponentes é uma

limitação da técnica, que tem sido contornada pelo uso de métodos de separação,

em especial os cromatográficos, os quais consomem mais tempo e são mais

dispendiosos (THOMAS, 1996).

Com o desenvolvimento da espectroscopia acoplada a computadores, foi

possível o desenvolvimento de técnicas que permitiram a análise direta de misturas,

dentre as quais pode-se citar a espectrofotometria derivada.

A espectrofotometria derivada UV-VIS envolve a transformação matemática

da curva espectral promovendo uma abordagem alternativa à análise de amostras

mais complexas como medicamentos, cosméticos e matrizes biológicas

(KARPINSKA, 2004).

o termo espectrofotometria derivada se refere à técnica de medida espectral

na qual a inclinação do espectro, isto é, a taxa de alteração da absorbância que

ocorre com a mudança do comprimento de onda durante a varredura, é medida em

função do comprimento de onda. A derivação do espectro original (zero-ordem) dá

origem ao espectro de primeira derivada, que após derivação originará o de segunda

derivada e assim, sucessivamente (PERKAMPUS, 1992):

dAldÀ, d2A1dÀ2, d3A1dÀ3, ... f (À); onde dAldÀ = A2 - A1//À2 -1À1 .

Se a diferença de absorbância for calculada em vários pontos para um

intervalo dado de À (~À usualmente igual a 2, 4 ou 8 nm), obtém-se o espectro

derivado. Os máximos de absorbância do espectro original corresponderão a zero no

29

espectro derivado. Se a medida da altura de um pico derivado for realizada no

comprimento de onda no qual o espectro dos demais componentes cruza a linha do

zero, a medida é proporcional somente à concentração do composto analisado. Tal

abordagem de determinação quantitativa é denominada de método "zero-crossing"

ou ponto de anulação (THOMAS, 1996; KARPINSKA, 2004).

A informação contida no espectro derivado é apresentada de uma forma mais

útil , tornando possível resolver muitas das diferentes dificuldades analíticas por

meio do aumento dos detalhes espectrais, como a resolução de sistemas

multicomponentes, remoção de interferências da matriz ou turbidez da amostra

(BERZEAS et aI. , 1997; RODENAS et aI., 2000; KARPINSKA, 2004).

30

3. OBJETIVO

Este trabalho de pesquisa foi planejado para ser desenvolvido nas seguintes

etapas:

1. Desenvolver e validar métodos analíticos para a quantificação do ácido

kójico a 1 %, associado ou não ao ácido glicólico a 5% em formulações

tópicas.

2. Desenvolver formulações contendo ácido kójico associado ou não a ácido

glicólico, nas formas creme e gel, utilizando excipientes e adjuvantes

farmacotécnicos habitualmente empregados por farmácias de

manipulação no Brasil.

3. Selecionar as formulações contendo ácido kójico associado ou não a

ácido glicólico desenvolvidas mediante a realização de estudo preliminar

de estabilidade (curto prazo), com a finalidade de submetê-Ias

posteriormente ao estudo acelerado de estabilidade.

4. Avaliar a estabilidade das formulações pré - selecionadas por meio de

estudo acelerado de estabilidade, quanto à influência da temperatura e da

luz, usando-se como parâmetros: caracteres organolépticos, pH,

comportamento reológico e doseamento.

31

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material

Os reagentes e matérias-primas utilizados foram de grau analítico, reagente,

cromatográfico ou farmacêutico de pureza e, conforme o caso, acompanhados do

respectivo certificado de análise.

4.1.1. Substâncias de referência

- Ácido glicólico teor 99% (Sigma Aldrich®)

- Ácido kójico teor 100,0% (Sigma Aldrich®)

4.1.2. Matérias-primas farmacêuticas

- Ácido ascórbico - grau p.a ACS (Synth)

- Ácido cítrico anidro (MercK)

- Ácido glicólico 70% (Ionquímica)

- Ácido kójico 99,4% (Galena)

- Água destilada

- Amigel® "sclerotium gum"(Pharma Special)

Butilidroxitolueno - BHT (Ali Chemistry)

Cera autoemulsionante aniônica (Galena)

Cera Polawax NF® (Croda/Galena)

Citrato de sódio 3 H20 - grau p.a. ACS - (Synth)

Dióxido de titânio (ISP)

EDTA dissódico - grau p.a. ACS (Synth)

Escalol 577® - benzofenona - 4 (ISP)

Escalol UVAB Liquid® - associação de metoxicinamato de octila,

benzofenona - 3, benzoato de 2 feniletil, salicilato de octila e copolímero

PVP hexadeceno (ISP)

Eusolex 4360® - benzofenona -3 (Merck)

Fluído de Silicone 1214 GE® - ciclometicone dimeticone (Galena)

Glicerina - grau p.a. ACS - (Synth)

Goma xantana (Via Farma)

Hidróxido de amônia 25% (MercK)

Hidróxido de sódio (Reagen)

Metabissulfito de sódio - grau p.a. ACS (Synth)

Meti Iparabeno (Via F arma)

Natrosol 250 HHR® - hidroxietilcelulose (Galena)

Propilenoglicol (Galena)

Propilparabeno (Via Farma)

Sulfito de sódio - grau p.a. ACS (Synth)

- Vaselina líquida (Galena)

4.1.3. Reagentes, solventes e materiais

- Acetonitrila grau cromatográfico (Merck)

- Ácido fosfórico 85% (MercK)

- Água purificada Milli Q

Brometo de tetrabutilamônio (Sigma Aldrich)

Filtro de papel qualitativo grau 104 (Millipore)

Fosfato de amônia monobásico (Merck)

Fosfato de potássio monobásico (Merck)

Membrana filtrante HV Millex 0,45 I-lm 47 mm (Millipore)

Metanol grau cromatográfico (Merck)

Potes de vidro incolor 30 g

Potes plásticos de poliestireno 30 g

Seringa de vidro 100 I-lL (Hamilton)

- Trietilamina (Merck)

32

Unidade filtrante HV em PE com membrana Durapore 0,45 I-lm 13 mm,

não estéril (Millipore)

- Vidraria volumétrica classe A

4.1.4. Equipamentos e acessórios

- Agitador mecânico de hélice Nova Ética®

- Aparelho de ultrassom UNIQUE® - USC 1450

Balança analítica AG 200 Gehaka®

Balança analítica OHAUS®

Célula OSC Shimadzu® modelo OSC-50

33

Coluna cromatográfica Synergi Hidro® RP Phenomenex 25 x 0,46 cm,

partícula de 41-1,80 A de poro, C18 com capeamento polar

Cromatógrafo líquido modelo CG® 480C, loop de 20 ~L, detector UV CG®

435 e integrador CG® 200

Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC-10 AO VP com detector POA ("photo

diode array detector"), sistema controlador SLC-10A VP, injeção

automática e sistema desgaseificador OGU-14A, acoplado ao software

Class VP®

Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC-10 AO VP com detector UV-VIS,

sistema controlador SLC-10A VP, injeção automática e sistema

desgaseificador OGU-14A, acoplado ao software Class VP®

Cromatógrafo líquido Varian® 5000, loop de 20 ~L, detector UV-100 e

integrador Varian® 4400

Espectrofotômetro Shimadzu® UV 1601 - PC, duplo feixe, acoplado a

computador e impressora, com cubeta de quartzo com 1 cm de caminho

ótico

Espectrômetro infravermelho Bomem MB-100

Estufa Biolabor® com fotoperíodo modo 131 FC

Estufa Nova Ética®

Potenciômetro OIGIMEO® OM 21

Termobalança Shimadzu® modelo TGA-50

- Viscosímetro Brookfield® modelo RVT

34

4.1.5. Formulações utilizadas como excipientes

Creme Aniônico

Substância % função

Fase Oleosa

Cera autoemulsionante aniônica 12,0 ag.consistência/ag. emulsivo

Vaselina líquida 10,0 emoliente

Fluído de silicone 2,0 emoliente

Propilparabeno 0,1 conservante

Fase Aquosa

Meti Iparabeno 0,2 conservante

Propilenoglicol 10,0 umectante

Goma xantana ou HEC* 0,2 espessante

Água destilada q.s.p 100,0 veículo

* hidroxietilcelulose

Creme Não Iônico


Fase Oleosa

Cera polawax® 12,0 ag.consistência/ag. emulsivo

Vaselina líquida 10,0 emoliente

Fluído de silicone 2,0 emoliente

Propilparabeno 0,1 conservante

Fase Aquosa


Goma xantana ou HEC* 0,2 espessante

Propilenoglicol 10,0 umectante

Água destilada q.s.p 100,0 veículo

* hidroxietilcelulose

35

Gel de Natrosol®


hidroxietilcelulose (Natrosol®) 2,0 polímero espessante


Glicerina 40,0 umectante

água destilada q.s.p 100,0 veículo

Gel de Amigel®


Amigel® 2,0 polímero espessante

Metilparabeno 0,2 conservante

Glicerina 40,0 umectante

água destilada q.s.p 100,0 veículo

36

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima

4.2.1.1. Espectrofotometria no infravermelho

A matéria-prima ácido kójico foi identificada por análise em espectrofotômetro

de infravermelho, em pastilha de KBr, sendo o espectro obtido comparado ao

espectro da substância de referência obtido da mesma maneira. Os espectros

referentes à matéria-prima e à substância de referência também foram comparados

ao espectro relatado na literatura.

Ácido glicólico substância de referência foi analisado da mesma forma, sendo

a matéria-prima, por tratar-se de solução aquosa do ácido glicólico a 70%, preparada

em filme. Os espectros obtidos foram comparados entre si e ao espectro relatado na

literatura.

As análises foram realizadas pela Central Analítica do Instituto de Química da

USP.

4.2.1.2. Espectrofotometria no ultravioleta (UV)

As substâncias de referência e matérias-primas dos ácidos kójico e glicólico

foram analisadas por espectrofotometria no ultravioleta (UV) na faixa de

comprimento de onda de 200 a 320 nm, tendo água destilada como veículo. A

velocidade de varredura utilizada foi de 370 nm/min, intervalo de leitura de 0,2 nm,

usando-se cubeta de quartzo de 1 cm de caminho ótico.

4.2.2. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico

4.2.2.1. Estudo termogravimétrico

O estudo termogravimétrico foi realizado nas seguintes condições:

amostra: em torno de 5 mg

razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente a 400°C)

atmosfera: ar (50 mLlmin)

cadinho: platina

37

As curvas em branco para os ensaios foram obtidas nas mesmas condições e

utilizando um cadinho vazio.

As amostras estudadas foram:

ácido glicólico (substância de referência)

ácido kójico (substância de referência)

ácido kójico matéria-prima

ácido glicólico (substância de referência) I ácido kójico (substância de

referência) mistura 5 : 1



Com o objetivo de estudar o comportamento cinético da degradação dos dois

ácidos associados foram realizadas curvas isotermas nas temperaturas de 65, 70,

75, 80, e 90°C para a amostra ácido glicólico (substância de referência) I ácido

kójico (substância de referência) mistura 5 : 1, usando-se as seguintes condições:

amostra: 4,9 - 5,1 mg

razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente) a 10°C abaixo da

Tiso, seguido de 2°C/min até a T iso e mantendo-se o tempo necessário

para ocorrência de 10% de perda de massa

atmosfera: ar (50 mLlmin)

cadinho: platina

38

Foram registrados os tempos em que a perda de massa correspondeu a 10%,

utilizados posteriormente para construção do gráfico de Arrhenius (In t vs 1fT K1) a

fim de se obter o tempo de vida útil extrapolado a 25°C.

Todas as amostras foram pulverizadas em almofariz de ágata antes da

pesagem. As misturas de ácido glicólico e kójico foram obtidas por simples mistura

física através de pulverização conjunta das substâncias no almofariz.

vazio.

4.2.2.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

o estudo de calorimetria exploratória diferencial foi realizado nas seguintes

condições:

amostra: em torno de 2 mg

razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente a 400°C)

atmosfera: N2 (100 mLlmin)

cadinho: alumínio

o branco das análises foi obtido nas mesmas condições, com o cadinho

Antes dos ensaios foram verificados os parâmetros de calibração da

instrumentação, empregando-se índio metálico (Tfusão 156,6°C e ilHfusão = 28,4 J/g) e

zinco metálico (Tfusão 419,4°C).

As amostras estudadas foram:

ácido glicólico (substância de referência)

ácido kójico (substância de referência)

ácido kójico matéria-prima





39

4.2.3. Estudo preliminar da estabilidade das formulações

4.2.3.1. Obtenção das formulações base creme e gel

As formulações na forma creme apresentadas no item 4.1.5. foram obtidas

por pesagem dos componentes e posterior aquecimento, a 75°C, das fases aquosa

e oleosa, separadamente. A fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa (método de

emulsificação por inversão de fases) e a emulsão foi agitada manualmente até o

resfriamento. Os cremes assim obtidos foram armazenados em embalagem de

polietileno à temperatura ambiente (25±3°C).

As formulações na forma gel apresentadas no item 4.1 .5. foram obtidas por

pesagem dos componentes e posterior aquecimento a 60°C, mediante agitação

contínua. Os géis foram então armazenados em embalagem de polietileno à

temperatura ambiente (25±3°C).

4.2.3.2. Obtenção das formulações para o estudo preliminar de

estabilidade

Os excipientes nas formas creme e gel descritos anteriormente foram

acrescentados dos princípios ativos e de adjuvantes farmacotécnicos, em diferentes

combinações, como mostrado no Quadro 3.

Para as substâncias sólidas considerou-se % p/p. Para as substâncias

líquidas % v/p, sendo utilizada a densidade para conversão do volume obtido em

massa, a fim de que todos os constituintes pudessem ser pesados.

As formulações foram produzidas em gral. Os constituintes sólidos foram

triturados e a eles foi incorporada a formulação base, incorporando-se por último as

substâncias líquidas.

Os princípios ativos foram utilizados associados ou não (ácido kójico ou ácido

kójico associado a ácido glicól ico), iniciando-se os testes de seleção por formulações

com elevados teores de ácido glicólico e kójico (8% e 3%, respectivamente). À

medida que as formulações foram ajustadas, as concentrações passaram a 5% e

1 % de ácido glicólico e kójico, respectivamente, concentrações estas adotadas para

validação do método analítico e para o estudo acelerado de estabilidade.

40

Quadro 3: Lista geral das matérias-primas usadas no desenvolvimento

farmacotécnico das formulações através do estudo preliminar de

estabi I idade.

Substância função concentração

ácido kójico princípio ativo 3%; 1%

ácido glicólico princípio ativo 8%; 5%

ácido ascórbico antioxidante 0,1%

EDTA quelante 0,1%; 0,15%

metabissulfito de sódio antioxidante 0,3%; 0,5; 0,75%

BHT antioxidante 0,05%

sulfito de sódio antioxidante 0,3%

ác.cítrico/ citrato de sódio tampão 6%; 4%,3%; 2%

dióxido de titânio fotoestabilizador 1,5%

Benzofenona - 3 fotoestabilizador 2,5%

benzofenona - 4 fotoestabi I izador 2,5%

Escalol UVAB Liquid® fotoestabilizador 5%

tampão citrato pH 3,5 tampão 0,1 M/1 ,OM a 10%

tampão citrato pH 4,0 tampão 1,OM a 10%

NH40H (sol. 25%) alcalinizante q.s. pH 3,5 ou 4,0

_ NaOH (5 M) alcalinizante q.s. pH 3,5 - -

Os adjuvantes farmacotécnicos foram usados em conjunto ou isoladamente,

em diversas combinações. Foram produzidas também as formulações contendo os

diversos adjuvantes farmacotécnicos mas isentas dos ácidos kójico e glicólico, em

todas as situações possíveis.

Adjuvantes lipossolúveis como BHT, benzofenona - 3 e Escalol UVAB Liquid®

foram usados apenas nas formulações creme. A combinação ácido cítrico/citrato de

sódio a 6%/4% ou 3%/2% foi testada apenas nas formulações base gel, em função

da perda de estabilidade de emulsões na presença de altas concentrações de

eletrólitos.

41

Os alcalinizantes hidróxido de sódio ou hidróxido de amônio foram utilizados

para neutralização parcial das fórmulas apenas nos casos em que as mesmas

continham ácido glicólico, em função da necessidade de ajustar o pH a valores

recomendados internacionalmente (BERGFELD et aI. , 1998) para formulações de

uso não profissional, o qual corresponde a 3,5.

Emulsões formadas com lauril sulfato de sódio ou outros tensoativos

aniônicos não são habitualmente usadas para incorporação de princípios ativos

ácidos em função da incompatibilidade entre esse tipo de tensoativo e os íons H+.

Entretanto, uma vez que há relato na literatura (WADE; WELLER, 1994) de que tal

incompatibilidade ocorre apenas quando o valor de pH for abaixo de 2,5,

mantivemos o creme aniônico como base para as formulações, já que as mesmas

foram parcialmente neutralizadas a valores de pH acima dessa faixa.

Foi excluída a possibilidade de obtenção de formulações gel a base de

polímero carboxivinílico (Carbopol®) em função da sua incompatibilidade com pH

ácido.

a) Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico

Os quadros mostrados a seguir apresentam as formulações testadas no

estudo preliminar de estabilidade, considerando os excipientes creme não iônico,

creme aniônico, gel de natrosol® e gel de amigel®, contendo os princípios ativos

ácido kójico e ácido glicólico associados.

42

Quadro 4: Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico usando

como excipiente creme não iônico (valores em %).

F ak ag ed aa ms bt ss dt 83 es T3,5 T4,o ha* hs*

1 3 8 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

2 3 8 0,1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

3 3 8 0,1 0,1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

4 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

5 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

6 3 8 0,1 -- 0,75 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5

7 3 8 0,1 -- -- 0,05 -- -- -- -- -- -- -- 3,5

8 3 8 0,1 -- 0,5 0,05 -- -- -- -- -- -- -- 3,5

9 1 5 0,15 -- 0,3 -- 0,3 -- -- -- 10 -- 3,5 --10 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- 3,5 --11 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- -- 10 4,0 --12 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- 1,5 2,5 -- -- 10 4,0 --13 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- 5,0 10 -- -- 3,5

14 1 5 0,15 -- -- -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5

15+ 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5

16 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5 ~ ---

Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ag = ácido glicólico; ed = edta; aa = ácido

ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; bt = butilhidroxitolueno; ss = sulfito de sódio; dt

= dióxido de titânio; B3 = benzofenona - 3; es = escalol UVAB liquid®; T 3,5 = tampão

citrato pH 3,50 1 M; T4 ,o = tampão citrato pH 4,00 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs =

hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado; + = formulação

sem conservantes.

43


como excipiente creme aniônico (valores em %)

F ak ag Ed aa ms T3,5 T4,o ha* hs*

17 3 8 -- -- -- -- -- -- 3,5

18 3 8 0,1 0,1 -- -- -- -- 3,5

19 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- -- 3,5

20 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- -- 3,5

21 1 5 0,15 -- 0,3 10 -- 3,5 --

22 1 5 0,15 -- 0,3 10 -- -- 3,5 -- - --- -


ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; T4,o = tampão

citrato pH 4,00 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade

suficiente para valor de pH indicado


como excipiente gel de natrosol® (valores em %)

F ak ag ed aa ms ac cs T3,5 ha* hs*

23 3 8 -- -- -- -- -- -- -- 3,5

24 3 8 0,1 0,1 -- -- -- 3,5

25 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- 3,5

26 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- 3,5

27 1 5 0,15 -- 0,3 10 3,5 --

28 1 5 0,15 -- 0,3 6,0 4,0 -- 3,5 --

29 1 5 0,15 -- 0,3 3,0 2,0 -- 3,5 --30 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- 10 -- 3,5

--- _ ._-- - --


ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; ac = ácido cítrico; cs = citrato de sódio; T 3 ,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado.

44


como excipiente gel de amigel® (valores em %)

F ak ag ed aa ms T3,5 ha* hs*

31 3 8 3,5

32 3 8 0,1 0,1 3,5

33 3 8 0,1 0,3 3,5

34 3 8 0,1 0,5 3,5

35 1 5 0,15 0,3 10 3,5


ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; ha = hidróxido

de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado.

b) Formulações contendo ácido kójico

A seguir são mostrados os quadros contendo as formulações testadas no

estudo preliminar de estabilidade, considerando os excipientes creme não iônico,

creme aniônico, gel de natrosol® e gel de amigel®, com apenas ácido kójico.

45

Quadro 8: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente creme não

iônico (valores em %)

F ak Ed ms 84 es T3,5

36 3 -- -- -- -- --

37 3 0,1 -- -- -- --38 3 0,1 0,5 -- -- --

39 1 0,15 -- -- -- 10

40 1 0,15 0,3 -- 5,0 10

41 1 0,15 0,3 2,5 -- 10

42 1 0,15 0,3 -- -- 10

Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; B4

= benzofenona - 4; es = Escalol UVAB liquid®; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M.

Quadro 9: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente creme

aniônico (valores em %).

F Ak ed ms T3,5

43 3

44 1 0,15 0,3 10 - ----

Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio;

T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M.

46

Quadro 10: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente gel de

natrosol® (valores em %)

F ak ed ms T3,5

45 3

46 1 0,15 0,3 10

Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; T3,5

= tampão citrato pH 3,50 1 M.

Quadro 11: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente gel de

amigel® (valores em %)

F ak ed ms T3,5

1 47 3

48 0,15 0,3 10

Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; T 3,5

= tampão citrato pH 3,50 1 M.

47

4.2.3.3. Condições de armazenamento

Foram obtidas 20 gramas de cada fórmula, divididas nas seguintes

embalagens e formas de armazenamento (BRASIL, 2004a):

- potes de poliestireno branco em estufa a 45°C, e

- embalagem de vidro incolor, exposta à luz artificial e natural indireta

(apenas para formulações selecionadas no teste da estufa ou contendo

fotoestabilizadores ).

De cada formulação foi mantida uma amostra armazenada em geladeira (8°-

1 QOC) para controle.

4.2.3.4. Avaliação das formulações

As formulações submetidas a 45°C em estufa foram avaliadas no tempo zero

(To) e após 30 dias (T30), quanto ao aspecto (cor, odor, consistência e

homogeneidade) e pH (BRASIL, 2004a). Os resultados foram compilados sob a

forma de tabela.

As formulações expostas à luz foram avaliadas no To e após 30 dias (T 30).

Para análise de pH pesou-se 1 g de cada formulação em tubo de ensaio,

acrescentando-se 9 mL de água destilada (PRISTA, 1996). Após dispersão da

mistura o pH foi determinado à temperatura ambiente.

48

4.2.4. Validação do método de determinação do ác. kójico por

espectrofotometria UV

A validação do método fo i conduzida experimentalmente de acordo com as

recomendações da ICH (International Conference on Harmonization) , instrumento

Q2A (ICH, 1994) e Q2B (ICH, 1996b) e da USP 28.

4.2.4.1. Amostra ácido kójico 1 % creme e gel

Após a realização do estudo preliminar de estabilidade foram selecionadas as

formulações 42 e 46 (descritas abaixo) para o desenvolvimento do método de

doseamento do ácido kójico por espectrofotometria no ultravioleta.

a) Ácido kójico 1 % creme


Ácido kójico 1,0 princípio ativo

Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante

EdtaNa2 0,15 quelante

Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão

Creme Polawax® com 0,2% HEC* q.s.p 100,0 excipiente

*hidroxietilcelulose

o creme base foi obtido da mesma forma, sem a adição do ácido kójico.

49

b) Ácido kójico 1 % gel






Gel de Natrosol® q.s.p 100,0 excipiente

o gel base foi obtido da mesma forma, sem a adição do ácido kójico.

4.2.4.2. Ensaios espectrofotométricos preliminares

Para desenvolvimento do método de doseamento do ácido kójico por

espectrofotometria no ultravioleta foram usadas as seguintes condições iniciais:

velocidade de varredura: 370 nm/min

Intervalo de varredura: 200 - 320 nm

Intervalo de leitura: 0,2 nm

cubeta de quartzo de 1 cm

ordem do espectro: ordem zero e primeira derivada

solventes testados: água, etanol e metanol

50


Após realização dos ensaios preliminares, as seguintes condições foram

adotadas para validação do método:

intervalo de varredura: 200 a 320 nm

velocidade de varredura: 370 nm/min

solvente: metano I

ordem do espectro: primeira derivada

método: zero "crossing" a 256,8 nm

L1À: 2 nm

assentamento das ordenadas: +/- 0,08

o uso do metanol na extração das amostras foi necessário pelo fato de não

ter sido possível eliminar a interferência dos excipientes na curva derivada quando

se utilizou água destilada ou etanol como solvente.

Todas as leituras foram realizadas usando-se metanol como branco.


Para o preparo da solução padrão estoque pesou-se 125,0 mg de ácido kójico

substância de referência em um balão volumétrico de 100 mL âmbar. O volume foi

completado com metano I. Do primeiro balão transferiu-se 10 mL, medidos

volumetricamente, para um segundo balão volumétrico de 250 mL, sendo o volume

completado com metanol (concentração final de 50 Ilg/mL).

Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 mL da solução padrão a 50 Ilg/mL foram

transferidos para balões âmbar de 25 mL. O volume final de cada balão foi

completado com metanol. As soluções nas concentrações de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16 e 18 Ilg/mL foram obtidas em triplicata.

51

Foram obtidas as leituras do conteúdo dos balões nas condições

experimentais mencionadas no item 4.2.4.3.



a) Amostra ácido kójico 1 % creme

Para verificação da interferência dos excipientes no método pesou-se 0,5000

9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido Kójico 1% creme) em béquer

plástico. O metanol foi adicionado aos poucos e a dispersão do creme foi feita com

auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão

volumétrico de 100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A amostra foi

filtrada em funil de vidro usando-se papel de filtro e desprezando-se os 10 mL

iniciais. O filtrado obtido, na concentração de 50 ~g/mL, foi armazenado em vidro

âmbar.

Pipetou-se 5 mL do filtrado obtido em balão âmbar de 25 mL, completando-se

o volume com metanol, obtendo-se a concentração de 1 O ~g1mL de ácido kójico.

A amostra do creme base foi obtida da mesma forma.

A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque a 50 ~g/mL obtida

conforme o item 4.2.4.4, transferindo-se 5 mL para balão de 25 mL e completando

se o volume com metanol (concentração final de 1 O ~g/mL).

Foram obtidas as leituras das soluções nas condições experimentais

mencionadas no item 4.2.4.3.

b) Amostra ácido kójico 1% gel


9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido kójico 1 % gel) em béquer plástico.

O metanol foi adicionado aos poucos e a dispersão do gel foi feita com auxílio de

bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de

52

100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A amostra foi filtrada em

funil de vidro usando-se papel de filtro e desprezando-se os 10 mL iniciais. O filtrado

obtido, na concentração de 50 !lg/mL, foi armazenado em vidro âmbar.

Pipetou-se 5 mL do filtrado obtido em balão âmbar de 25 mL, completando-se

o volume com metanol, obtendo-se a concentração de 10 f.lg/mL de ácido kójico.

A amostra do gel base foi obtida da mesma forma.

A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque a 50 f.lg/mL obtida

conforme o item 4.2.4.4, transferindo-se 5 mL para balão de 25 mL e completando

se o volume com metanol (concentração final de 10 f.lg/mL).

Foram obtidas as leituras das soluções nas condições experimentais



Para verificação da interferência dos produtos de degradação no método

pesou-se em béquer 0,5000 9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido kójico

1 % creme) após o mesmo ter permanecido em estufa a 45°C pelo período de 30

dias. O metano I foi adicionado aos poucos e a dispersão do creme degradado foi

feita com auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um

balão volumétrico de 100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A

amostra foi então filtrada em funil de vidro, usando-se papel de filtro e desprezando

se os 10 mL iniciais. O filtrado obtido, na concentração de 50 f.lg/mL, foi armazenado

em vidro âmbar.

Pipetou-se 5 mL do filtrado assim obtido em balão âmbar de 25 mL,

completando-se o volume com metanol.

A solução foi lida nas condições experimentais mencionadas no item 4.2.4.3.

A presença de interferentes na forma de produtos de degradação pode ser

observada por alterações no formato do pico, quando comparado à amostra não

53

envelhecida, em especial quando analisados por espectrofotometria derivada

(BAKSHI; SINGH, 2002).



Para o teste de recuperação usou-se a solução padrão a 50 /lg/mL, preparada

conforme descrito no item 4.2.4.4 e o filtrado da amostra creme a 1 %

(correspondendo à concentração de 50 /lg/mL) obtido conforme descrito no item

4.2.4.5.

Os volumes de ambas as soluções foram pipetados para balões volumétricos

âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o volume final completado

com metanol:

Sol. Padrão Amostra creme Concentração 50 /lg/mL (mL) 50 /lg/mL (ml) (J.lg/mL)

1 3,0 6,00

2 3,0 6,00

3 1,0 3,0 8,00

4 2,0 3,0 10,00

5 3,0 3,0 12,00

Foram obtidas as leituras das soluções nas mesmas condições experimentais


b) Amostra ácido kójico 1 % gel

Para o teste de recuperação foram usados a solução padrão a 50 /lg/mL,

preparada conforme descrito no item 4.2.4.4 e o filtrado da amostra gel a 1 %

(correspondendo à concentração de 50 J.lg/mL) obtido conforme descrito no item

4.2.4.5.

54

Os volumes de ambas as soluções foram pipetados para balões volumétricos

âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o volume final completado

com metanol:

Sol. Padrão Amostra gel Concentração 50 J.lg/mL (mL) 50 J.lg/mL (ml) (J.lg/mL)

1 3,0 6,00

2 3,0 6,00

3 1,0 3,0 8,00

4 2,0 3,0 10,00

5 3,0 3,0 12,00

Foram obtidas as leituras das soluções nas mesmas condições experimentais


4.2.4.7. Precisão

a) Amostra ácido kójico 1% creme

O preparo da amostra foi realizado nas mesmas condições do item 4.2.4.5.,

obtendo-se o filtrado na concentração de 50 J.lg/mL. Alíquotas de 5 mL do filtrado

foram transferidas para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com

metanol (concentração final de 10 J.lg/mL). As soluções foram obtidas em 10

replicatas.


O preparo da amostra foi realizado nas mesmas condições do item 4.2.4.5.,

obtendo-se o filtrado na concentração de 50 J.lg/mL. Alíquotas de 5 mL do filtrado

foram transferidas para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com

metanol (concentração final de 10 J.lg/mL). As soluções foram obtidas em 10

replicatas.

55

Para ambos os ensaios, o padrão foi obtido a partir da solução estoque a 50

~g/mL preparada conforme o item 4.2.4.4. Da solução estoque foram transferidos 5

mL para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com metanol

(concentração final de 10 ~g/mL) . As soluções foram obtidas em triplicata.

4.2.5. Validação do método de determinação dos ácidos associados por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A validação do método foi conduzida experimentalmente de acordo com as

recomendações da ICH (International Conference on Harmonization) , instrumentos

Q2A (ICH, 1994) e Q2B (ICH, 1996b) e da USP 28.

4.2.5.1. Amostras contendo ácido kójico 1% e ácido glicólico 5%

Após a realização do estudo preliminar de estabilidade das formulações foram

selecionadas as formulações 16 e 30 (descritas abaixo) para o desenvolvimento do

método de doseamento do ácido kójico associado ao ácido glicólico por CLAE:

a) Amostra ácido kójico 1% asociado a ácido glicólico 5% creme



Ácido glicólico 5,0 princípio ativo




NaOH 5 M q.s. pH 3,50 7,5 alcalinizante



56

o creme base foi obtido da mesma forma, sem a adição dos ácidos kójico e

glicólico e do agente alcalinizante (NaOH).

b) Amostra ácido kójico 1% asociado a ácido glicólico 5% gel









o gel base foi obtido da mesma forma, sem a adição dos ácidos kójico e

glicólico e do agente alcalinizante (NaOH).

4.2.5.2. Ensaios cromatográficos preliminares

4.2.5.2.1. Condições gerais

Para separação cromatográfica dos ácidos kójico e glicólico, foram usadas as

seguintes condições:

coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex 25 x 0,46 cm, partícula de 411,80

A de poro, contendo fase ligada de octadecil silano (C1s) com capeamento

polar e faixa de pH de 1,5 a 7,5.

modo: fase reversa

fluxo de trabalho: 0,7 mLlmin

temperatura: ambiente

57

comprimentos de onda testados: 210 e 220 nm.

4.2.5.2.2. Preparo da fase móvel

As fases móveis testadas foram preparadas em balão volumétrico por

dissolução dos constituintes do tampão e dos aditivos brometo de tetrabutilamônio

(TBA) ou trietilamina (TEA) em água purificada Milli Q ®, sendo o pH ajustado

potenciometricamente a temperatura ambiente. A proporção de solvente orgânico foi

adicionada posteriormente e o pH ajustado novamente, exceto para o sistema 18,

cujo pH foi ajustado apenas inicialmente. O volume final foi filtrado a vácuo em

membrana filtrante de 0,45 !-Im. Procedeu-se a desgaseificação do sistema em

aparelho de ultra-som por 15 minutos.

4.2.5.2.2. Sistemas testados

Foram testados os seguintes sistemas (fases móveis):

58

Quadro 12: CLAE fase reversa - sistemas cromatográficos testados. Condições:

coluna Synergi Hidro RP Phenomenex® 25 x 0,46 cm, fluxo de trabalho

0,7 mLlmin.

FM A B AB pH

01 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50


03 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00


05 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30


07 Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30



10 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00

11 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM -- -- 3,00

12 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 - -- --

Legenda: FM= fase móvel; A=conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;

MET= metanol; TEA= trietilamina.

59

Quadro 13: CLAE fase reversa com pareamento iônico - sistemas cromatográficos

testados. Condições: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex® 25 x 0,46

cm, fluxo de trabalho 0,7 mLlmin.

FM A S AS pH

13 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM 2,20

14 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM ACN 98:02 2,20





Legenda: FM= fase móvel; A=conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;

MET= metanol; TBA= brometo de tetrabutilamônio.


Após realização dos ensaios preliminares, as seguintes condições foram

adotadas para validação do método:

equipamento: cromatógrafo líquido Shimadzu®, descrito no item 4.1.4.

modo: fase reversa, com pareamento iônico

- fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM pH

3,00/ACN (95:05)

fluxo de trabalho: 0,7 mLlmin

injeção: automática

60

volume injetado ("Ioop"): 20 IJL

detecção: POA ("photo diode array") a 220 nm

tempo de corrida: 12 minutos para amostras e 08 minutos para padrões

temperatura: ambiente


Para o preparo da solução padrão pesou-se 100 mg de ácido kójico

substância de referência e 500 mg de ácido glicólico substância de referência em um

balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi completado com a fase móvel

descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos volumetricamente, para um

segundo balão volumétrico de 100 mL, sendo o volume completado com fase móvel

(concentração final de 1000 !lg/mL de ácido glicólico e 200 !lg/mL de ácido kójico).

Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, e 6 mL da solução anterior foram transferidos para

balões âmbar de 25 mL, em duplicata. O volume final de cada balão foi completado

com fase móvel, perfazendo concentrações de 40, 80, 120, 160, 200 e 240 Ilg/mL

de ácido glicólico e 8, 16, 24, 32, 40 e 48 Ilg/mL de ácido kójico. Após filtração em

seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 Ilm (descrita no

item 4.1.3) as soluções foram transferidas para frascos próprios para injeção

automática.



a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme


9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em béquer plástico. A fase móvel

foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio de bastão de vidro.

Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de 100 mL âmbar, o

qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume final foi

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completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de vidro com papel de

filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais. Do filtrado obtido 10 mL foram transferidos

para balão volumétrico de 25 mL, obtendo-se concentrações finais de 32 Ilg/mL e

160 Ilg/mL de ácido kójico e de ácido glicólico, respectivamente.

o mesmo procedimento foi realizado para a formulação creme base.

b) Amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5% gel


9 da amostra gel (especificada no item 4.2.5.1) em béquer plástico. A fase móvel foi

adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio de bastão de vidro.

Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de 100 mL âmbar, o

qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume final foi

completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de vidro com papel de

filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais. Do filtrado obtido 10 mL foram transferidos

para balão volumétrico de 25 mL, obtendo-se concentrações finais de 32 Ilg/mL e

160 Ilg/mL de ácido kójico e de ácido glicólico, respectivamente.

O mesmo procedimento foi realizado para a formulação gel base.

c) Solução Padrão

A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque contendo 1000

Ilg/mL de ácido glicólico e 200 Ilg/mL de ácido kójico obtida conforme o item 4.2.5.4.

Transferiu-se 4 mL para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com

fase móvel (concentrações finais de 32 Ilg/mL e 160 Ilg/mL de ácido kójico e de

ácido glicólico, respectivamente) .

As soluções de amostras, creme e gel base e padrão foram filtradas em

seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 Ilm (descrita no

item 4.1.3) e transferidas para frascos próprios para injeção automática.

4.2.5.5.2. Interferência do produto de degradação

Para verificação da interferência do produto de degradação no método pesou

se em béquer 0,8000 9 da amostra creme especificada no item 4.2.5.1 após o

62

mesmo ter permanecido em estufa a 45°C pelo período de 30 dias. A fase móvel foi

adicionada aos poucos e a dispersão do creme degradado foi feita com auxílio de

bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de

100 mL âmbar, que foi colocado no aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume

final foi completado com fase móvel e a amostra foi filtrada em papel de filtro,

desprezando-se os 10 mL iniciais. Transferiu-se 10 mL do filtrado para balão

volumétrico de 25 mL, sendo o volume completado com fase móvel.

A amostra obtida a partir do creme degradado foi filtrada em seringa de vidro

acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 11m (descrita no item 4.1.3) e

transferida para frasco próprio para injeção automática.

Após a análise, os picos obtidos no cromatograma foram analisados quanto à

sua pureza por meio do uso de ferramentas de software relacionadas ao detector

PDA ("photo diode array,,2).



Pesou-se 1,0000 9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em

béquer plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com


volumétrico de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15

minutos. O volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em

funil de vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se

concentrações finais de 500 Ilg/mL de ácido glicólico e 100 Ilg/mL de ácido kójico.


Pesou-se 1,0000 9 da amostra gel (especificada no item 4.2.5.1) em béquer

plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio

de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico

2 A análise de pureza do pico ("peak puriry") por meio do detector PDA demonstra o grau de pureza de um pico cromatográfico ao comparar a similaridade de todo o espectro do pico com o espectro relativo ao ápice. O cálculo é feito a partir da porção pura dividido pela área total do pico.

63

de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O

volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de

vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se

concentrações finais de 500 ~g/mL de ácido glicólico e 1 00 ~g/mL de ácido kójico.


Para o preparo da solução padrão pesou-se 100,0 mg de ácido kójico

substância de referência e 500,0 mg de ácido glicólico substância de referência em

um balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi completado com a fase móvel

descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos volumetricamente, para um

segundo balão volumétrico de 200 mL, sendo o volume completado com fase móvel

(concentração final de 500 ~g/mL de ácido glicólico e 1 00 ~g/mL de ácido kójico).

Alíquotas da solução padrão e dos filtrados das amostras foram transferidas

para balões volumétricos âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o

volume final completado com fase móvel:

Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme

Sol. Padrão Amostra creme [G] 1 [K]

G (500~g/mL) 1 K (1 OO~g/mL) G (500~g/mL) 1 K (1 00 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)

1 4,0 80/16

2 4,0 80/16

3 2,0 4,0 120/24

4 4,0 4,0 160/32

5 6,0 4,0 200/40

G= ácido glicólico, K= ácido kójico

64

Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel

Sol. Padrão Amostra gel [G] 1 [K]

G (500j.lg/mL) 1 K (1 OOj.lg/mL) G (500j.lg/mL) 1 K (100 j.lg/mL) volume (mL) volume (mL) (j.lg/mL)

1 4,0 80116

2 4,0 80/16

3 2,0 4,0 120/24

4 4,0 4,0 160/32

5 6,0 4,0 200/40

G= ácido glicólico, K= ácido kójico

Os conteúdos dos balões volumétricos de 25 mL contendo padrões e

amostras foram filtrados em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com

membrana de 0,45 j.lm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios

para injeção automática.

4.2.5.7. Precisão

Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme

Pesou-se 0,8000 9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em

béquer plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com


volumétrico de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15

minutos. O volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em

funil de vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se

concentrações de 400 j.lg/mL de ácido glicólico e 80 j.lg/mL de ácido kójico.

Transferiu-se 10 mL do filtrado obtido para balão volumétrico âmbar de 25

mL, completando-se o volume com fase móvel. Foram obtidas 10 replicatas

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99

66

4.2.5.8. Robustez

A robustez do método cromatográfico foi avaliada utilizando-se um outro

equipamento acoplado não de um detector PDA, mas sim de um detector UV-VIS

(cromatógrafo líquido Shimadzu® com detector UV-VIS indicado no item 4.1.4).

Foram realizados os testes de linearidade, precisão e exatidão para as amostras

creme e gel contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, nas mesmas

condições experimentais estabelecidas nos itens 4.2.5.3, 4.2.5.4,4.2.5.6 e 4.2.5.7.

4.2.6 Validação do método de determinação do ácido kójico por


A partir do desenvolvimento do método cromatográfico para determinação dos

ácidos kójico e glicólico associados, as mesmas condições experimentais indicadas

no item 4.2.5.3 foram usadas para validação do método, quanto aos parâmetros de

linearidade, exatidão e precisão, para determinação do ácido kójico isoladamente

em formulações tópicas.

o equipamento utilizado foi o cromatógrafo líquido Shimadzu® acoplado de

detector UV-VIS.

As amostras contendo ácido kójico 1 % creme e gel utilizadas foram as

mesmas descritas no item 4.2.4.1, usadas no desenvolvimento do método

espectrofotométrico por derivada de 1a ordem.


Para o preparo da solução padrão pesou-se 100 mg de ácido kójico


completado com a fase móvel descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos


completado com fase móvel (concentração final de 1000 Ilg/mL de ácido glicólico).

67

Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, e 6 mL da solução anterior foram transferidos para

balões âmbar de 25 mL, em duplicata. O volume final de cada balão foi completado

com fase móvel, perfazendo concentrações de 8, 16, 24, 32,40 e 48 Ilg/mL de ácido

kójico. Após filtração em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com

membrana de 0,45 11m (descrita no item 4.1.3) as soluções foram transferidas para

frascos próprios para injeção automática.



Pesou-se 1,0000 9 da amostra creme especificada no item 4.2.4.1 em béquer






concentrações finais de 100 Ilg/mL de ácido kójico.


Pesou-se 1,0000 9 da amostra gel especificada no item 4.2.4.1 em béquer






concentrações finais de 100 Ilg/mL de ácido kójico.


Para o preparo da solução padrão pesou-se 100,0 mg de ácido kójico



68


completado com fase móvel (concentração final de 100 ~g/mL de ácido kójico).

Alíquotas da solução padrão e dos filtrados das amostras foram transferidas

para balões volumétricos âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o

volume final completado com fase móvel:

Amostra ácido kójico 1 % creme

Sol. Padrão Amostra creme [K]

K (100~g/mL) K (1 00 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)

1 4,0 16

2 4,0 16

3 2,0 4,0 24

4 4,0 4,0 32

5 6,0 4,0 40

K= ácido kójico

Amostra ácido kójico 1 % gel

Sol. Padrão Amostra gel [K]

K (100~g/mL) K (100 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)

1 4,0 16

2 4,0 16

3 2,0 4,0 24

4 4,0 4,0 32

5 6,0 4,0 40

K= ácido kójico

69



membrana de 0,45 Ilm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios


4.2.6.3. Precisão

a) Amostra ácido kõjico 1 % creme

Pesou-se 0,8000 g da amostra creme especificada no item 4.2.4.1 em béquer






concentrações de 80 Ilg/mL de ácido kójico.



correspondendo à concentração de 32 Ilg/mL de ácido kójico.

b) Amostra ácido kõjico 1 % gel

Pesou-se 0,8000 9 da amostra gel especificada no item 4.2.4.1 em béquer






concentrações de 80 Ilg/mL de ácido kójico.



correspondendo à concentração de 32 Ilg/mL de ácido kójico.


70

Para o preparo da solução padrão estoque pesou-se 100,0 mg de ácido kójico




completado com fase móvel (concentração de 200 Jlg/mL de ácido kójico).

Da solução estoque preparada foram transferidos 4 mL para balão

volumétrico âmbar de 25 mL, completando-se o volume com fase móvel

(concentração final de 32 Jlg/mL de ácido kójico). As soluções foram obtidas em

triplicata.



membrana de 0,45 Jlm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios


4.2.7. Comparação dos métodos analíticos UVD e CLAE

O método de determinação do ácido kójico 1 % em formulações creme e gel

por espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta (UVD) foi

estatisticamente comparado à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) quanto

à exatidão por meio do teste t e quanto à precisão por meio do teste F3.

4.2.8. Estudo de estabilidade acelerado

As formulações selecionadas no estudo preliminar de estabilidade (16, 30, 42

e 46) foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerado, com duração de 90

dias, tendo como base o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA

3 Quando se pretende avaliar se 2 métodos (A e B) tem diferenças significativas entre si , em termos de precisão, pode-se recorrer ao teste F. Este baseia-se no cálculo da razão entre as variâncias dos 2 métodos (F cale = SA2/SS\ colocando-se a maior no numerador, de modo que a razão seja maior ou igual a 1. Em seguida, compara-se esse valor obtido com o valor tabelado de F. Se F cale::; F tab, os 2 métodos não apresentam diferenças significativas entre si , relativamente às suas precisões (INMETRO, 2003) . O teste t é utilizado para se comparar médias, portanto para se detectar erros sistemáticos, ou seja , aqueles relacionados à exatidão (MILLER; MILLER, 1993).

71

(BRASIL, 2004a), os instrumentos 01A (R2) (ICH, 2003) e 01 B (ICH, 1996a) e a

Resolução RE n° 398 da ANVISA (BRASIL, 2004b).

4.2.8.1. Preparo das formulações

Cada formulação selecionada para o estudo de estabilidade acelerado foi

preparada em lote de 1300g.

a) Amostra ácido kójico 1 % associada a ácido glicólico 5% creme










o excipiente creme polawax® com 0,2% HEC foi preparado usando-se um

agitador mecânico, pelo método de inversão de fases. O ácido glicólico (sol.

comercial 70%) foi neutralizado com ° NaOH, e acrescentado do tampão citrato,

edta (na forma de solução aquosa a 10%) e do metabissulfito de sódio, originando

uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado em gral e incorporado

geometricamente da formulação creme polawax® anteriormente preparada. A

solução do ácido glicólico neutralizado foi vertida aos poucos sobre o gral e todo o

conteúdo homogeneizado.

72

b) Amostra ácido kójico 1 % associada a ácido glicólico 5% gel









o excipiente gel de natrosol® foi preparado usando-se um agitador mecânico,

a 60°C. O ácido glicólico (sol. comercial 70%) foi neutralizado com o NaOH, e

acrescentado do tampão citrato, edta (na forma de solução aquosa a 10%) e do

metabissulfito de sódio, originando uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado

em gral e incorporado geometricamente da formulação gel de natrosol®

anteriormente preparada. A solução do ácido glicólico neutral izado foi vertida aos

poucos sobre o gral e todo o conteúdo homogeneizado.

c) Amostra ácido kójico 1 % creme








O excipiente creme polawax® com 0,2% HEC foi preparado usando-se um

agitador mecânico, pelo método de inversão de fases. Os adjuvantes tampão citrato,

73

edta (na forma de solução aquosa a 10%) e metabissulfito de sódio foram

misturados previamente, originando uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado

em gral e incorporado geometricamente da formulação creme polawax®

anteriormente preparada. A solução dos adjuvantes foi vertida aos poucos sobre o

gral e todo o conteúdo homogeneizado.

d) Amostra ácido kójico 1 % gel







O excipiente gel de natrosol® foi preparado usando-se um agitador mecânico,

a 60°C. Os adjuvantes tampão citrato, edta (na forma de solução aquosa a 10%) e

metabissulfito de sódio foram misturados previamente, originando uma solução

límpida. O ácido kójico foi triturado em gral e incorporado geometricamente da

formulação creme polawax® anteriormente preparada. A solução dos adjuvantes foi

vertida aos poucos sobre o gral e todo o conteúdo homogeneizado.

Após o preparo, cada formulação foi distribuída em potes plásticos de

poliestireno branco com capacidade para 30 9 devidamente identificados. De cada

uma das quatro formulações foram produzidos potes em número suficiente para 3

condições de armazenagem e 6 tempos de leitura, em duplicatas denominadas "a" e

"b". Também foram produzidos o creme e o gel base das formulações (isentos dos

princípios ativos e do NaOH), os quais foram também expostos às 3 condições de

armazenamento. Todos os potes foram fechados com batoque e tampa e selados

•owpcoid eialovkamn op oçfflai e epueadwoo anb epedwei ewn woo (lanisvk op oçA6a0 euj eoueiq epedum ewn ap oçõeposse ep claw iod onoadsa owsew o ABuRe wa als!suoo anb `z oeódo e eu òpealaw ou JR.111109U0 ap spolip a (Asno ojie ap Qçs sepedwei sie} anb zan ewn "elaiovkawn a lanisin duoadsa o eumwoo anb (LL601 osi e woo opooe ep è!P op zol leuopewaiu! offed) 59(31/59(3 ePeclwm ewn ap osn o ?naid H01 op 1 ocódo V g

"(VOOZ `1\13S-IIN) seroo sep oeõeuene ap oeó!puo0 Jouiaw e epmuuad ienb e ,e!p_opw oe 001.1.1? ieiod oinatio ou emitia zni ç apuodsoiioo m000çg ap (.soo ap ainieJadwai) op zni e oçóelai wa epu,apuodsauoo e a Jo!ew %001 ap owvoid spw ojuenb èlas no lainieu zni ep onoadsa o a epedwm elad opeie6 cupadsa o aflua epu?puodsauoo e znpaii (Joo ap oçõnpaidai ap ao!pul) odi

(ocr sep 0£ odwal -

(sLi) sep g. odwal -

(9t7±) saia] gi7 odwal -

( oi) 0.19Z odwal -

:sodwal salup6as sou sepesueue seAsowe sV

asffue ap epuanbaid rgwv

"ewpe webeuezeulle ap segôipuoo sep ewn

epeo e seTsodxe waio4 1"2""j7 ww ou sepeuopuew seo5einauo4 .t7 se sapo'

.olueweuezeiwe

ap spiwou sao5!puoo we seo5eintewoi. sep apepffiqelse e Jequedwooe

ap a44 e `(00enj) aluamwe ainTaladwal ç opeqoa4 opçwN (o

.(e966 `HOI) HOI op epepumelsamod ap se sal

wed ein op SZ oOdo — (Moa e!u?AIÁS „AN 10e18„ ePedw?i) aleGU

zni e epeposse 17)i.0099 O_UT096 3 I `996/M 81, Cn1 sd!INd (AN

Áep„) ello op zni sawaosaiong sepedwa1 opualuoo 1003---Fg3 eInTs3 (q

"zni ap epuasne woo ÒcZi 0i7 ens (e

olueweuazewie ap sao5!puo0

"eog.joadse 041.19W8UeZeWJC ap

oe5puoo ens eu epeooloo Jas ap saiue epesed !ol weBeieqwe epeo "adaio woo

iL

seei? sep iwed V "sin-An iopeiep woo onzpewms op!nbli oieJ69Tewon ou `c.g.z.17

wa;i ou seppaiaqeisa spluawpadxa segôipuoo se opunhas 3vi3 Jod èleoudnp

we isepeu!wJapp a .L.g.3.17 Wel! o ~aluo° seplaiixe àlue!qwe emileJedwal

? sepeia6uoasep weJol sealsowe se (opnlse op oeõezneu4 e s9dv •aluewele!pew!

opeia6uoo a ond ap awg woo (magoo !ol Janinci o ..soai op °papo ou o?5a_uoo

Jopalsod eJed sopepue WeJOI sopesad samen so -opeowluap! aluewepnap

oo!is?id Janb9q es-opuesn 'com reue eõueieq we eAsowe ap 6 0002'0 ap caie° as

-nosad `(„e„ eleondnp) waBeieqwe ep opriewoo op oeõez!eue6owou sodv

oweweasop (o

•aluemwe einTeiedwal e Lopexineo oAaw9puelod

We opipew io4 Hd o a opeffie ioJ opr,-ialuoo o 19661, `VISIdd) epepsep enfie

ap 1w 6 ap opeuoppe aluaw.iopeisod àpn ap 00SeJj. wn we eJTSOW8 ep 61, es

-nosed („e„ eleondnp) wa6eleqwe ep opr,lawoo op oe5ez!eua6owou s9dv

Hd (q

.apepaueBowou e epu?Ts!suoo `Jopo `.100 eu seoõeJalle

e oiuenb leu!No wa6eieqwe ens eu sepenene weJol seAsowe sv

soo!Td9ioue6Jo saJapeleo (e

soloadse salupbas so opunhas

sepenene WCJOJ. SCASOWC se `011JeWeUeZeWJe ap opoped epeo ap ieu4 ov

sepez!leai saslieuy .v.g.z.v

eJed eJ!apeie6 we opeuazewie e aTuawenou °peias !q. eTod epeo 'esq?ue

eJed eleloo sodv •opeloue Joien o e epesed !ol weBeieqwe epeo einieJedwal ep

oe5ezumelse sodv .soppaieqese-9id sodwal sou („q„ e „e„ eleondnp) waBeuezewJe

ap oe5!puoo epeo ap sopainai WeJOI seTod so '01 oied oleox3

(061) se!p 06 odwal-

(o9i) sep 09 odwal -

SL

76

obtidas pela integração dos picos calculou-se o teor das amostras submetidas ao

estudo de estabilidade. Para cada amostra e condição de armazenagem foi

calculada a média do teor remanescente em relação ao T Q. OS resultados foram

submetidos à estatística descritiva e aval iados por ANOVA e teste de comparações

múltiplas de Bonferroni. O nível de significância pré-estabelecido foi de 5%.

d) Comportamento reológico

As amostras (duplicata "b") retiradas de cada condição de armazenagem

nos tempos pré-estabelecidos, foram colocadas em sala climatizada a 23±2°C e

deixadas estabilizar, ao abrigo da luz, por 24 horas. Após esse período as

embalagens foram abertas e, sem que fossem homogeneizadas, aproximadamente

13 g foram retirados e transferidos para um adaptador de pequena amostra ("small

adapter" SC4-45Y Brookfield®). As análises foram realizadas, em duplicata, no

viscosímetro rotacional Brookfield® RVT, utilizando-se a haste SC-2 29/13R Os

valores de torque foram registrados na faixa de velocidade de 0,5 a 100 rpm (curva

ascendente) e de 100 a 0,5 rpm (curva descendente), correspondendo a 0,125 - 25

(1/s) e 25 - 0,125 (1/s) de gradiente de velocidade ("shear rate"). Foi observado o

intervalo de 2 minutos entre cada faixa de velocidade. Usando-se o fator de

conversão especificado pelo fabricante para o "spindle" SC-4 29/13R, os valores de

torque foram convertidos em viscosidade expressada em cPs. Uma vez que a

amostra ácido kójico 1 % gel apresentou valores de viscosidade fora da faixa prevista

para a haste selecionada na faixa de 20 a 100 rpm (estouro de escala), foi analisada

apenas na faixa de 0,5 a 10 rpm (0,125 a 2,5 1/s) de gradiente de velocidade.

77

5. RESU L T ADOS

5.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima

5.1.1. Espectroscopia no infravermelho

As figuras a seguir apresentam os espectros na região do infravermelho das

natérias-primas ácido kójico e ácido glicólico e seus respectivos padrões

substâncias de referência).

a) Ácido Kójico

BOMEM MB-100 25/11/00 11 ;05 Arquivo= 1 0784 Descricão: H

100 I __

BO

60

40

T ransmittance rWaverunber (em"

'" o 'O m

'"

3000 2000

~

~~ 1 ~ .. ~ o-- ~

N .. '"

'" '" ""

~

Scens =20 ReS? 4 cm-1 Mode .; 2 (Mid-IR) Ap.od =-Cosine

~ r ~ -< - N

0-U>

1000

Figura 1: Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do infravermelho

(pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda cm-1) : 1579 (

C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922 (-CH

aromático); 3172 (-OH).

BOMEM MB-l00 25/11/0010:54 Arq!Jivo,," 10783 Descri~o:G

ao

1>0

40

3000 . 2000

N ~

Si N .... ... '"

~ ~

1000

Scans = 20 Res = 4cm-l Mode =2 (MicHR)' Ap..od = Cosine '

Figura 2: Espectro do ácido kójico substância de referência na regiâo do

infravermelho (pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda

cm-1): 1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922

(-CH aromático); 3175 (-OH).

78

b) Ácido Glicólico

8om~m. MB100 Arquivo:= 11850 IAmostra: R Scans = 20

100

98

96

94

92 g; ~

3000 2000

fd ~

02i03i05 15: 19 , Apod = Cosine

Mpdo = 2 (Mid-IR) Res = 4" cm-1 22 scanslmin

'" 1'; kl

Figura 3: Espectro do ácido glicólico matéria-prima na região do infravermelho (filme

líquido). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1732 (-C=O de

ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH).

79

BOMEM MB-flfO 25/11 /00 10:01 Arquivo· 10776 Descrição: A

98

96-

94

92

1T.~:»-----.. }' •. '.~. __ . -L..o..I~""

3000 2000 1000

Scans = 20 Res = '4 em-1 tylode = 2 (Mid-IR) t'eod = Cosine

Figura 4: Espectro do ácido glicólico substância de referência do infravermelho

(pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1721 (

C=O de ácido carboxílico) , 3200-3600 (-OH).

5.1.2. Espectrofotometria no UV

80

Os espectros de absorção no UV dos padrões (substância de referência) e

matéria-prima do ácido kójico encontram-se ilustrados nas figuras 5,6 e 7.

a) ácido K6jico

1.000\-, --~---.--~---r---~---'---~---'---~-----,

A b 0,5

~~ ~ 200,0 260,0

Wavelength (nrn.) 320,0

Figura 5: Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do UV, concentração

de 10 IJg/ mL, tendo como solvente água destilada. Picos em 216,4 e

268,6 nm.

81

A b

1.000'rl --~----"r---~---'---~-----.--~---r---~---'

0,5001

0,0001 ~ 200.0 260.0

Wavelenglh [nm.] 320.0

Figura 6: Espectro do ácido kójico substância de referência na região do UV,

concentração de 10 1-191 mL, tendo como solvente água destilada. Picos

em 216,2 e 268,6 nm.

82

A b

c) Ácido Glicólico

1,000;r, --~-----'---~--"---~----r---~---;r----~-----,

0,5001

O .OO~ 200,0 260,0

Wavelength (nm.) 320,0

Figura 7: Espectro do ácido glicólico substância de referência na região do UV, na

concentração de 100 jJg/mL, tendo como solvente água destilada,

83

84

5.1.3. Análise térmica (curvas TG/DTG e DSC) do ácido kójico e do ácido

glicólico

As figuras a seguir caracterizam o comportamento térmico dos ácidos kójico e

glicólico nas condições estudadas.

0.20 0.00 DSC

-c L ~ ·E 0.00 -o, ...... _- ............. - ... -'"' ........ .

til E -2.00 ' . ,"~"._ .................... _-.. -... .. _ ............. _ ............ _.-# ..... _ ..... I ....

E ~ . "'\ ~ DTG ~ .ê- \\ l ·ãi o E

. . ~ ~ .

m . Q) .:g -0.20 -o . ro , E . ro

'f: Q)

o

o ~ -4.00

,

u::: , , ,

: -- -l O · TG -0.40 ~

-6.00 ~ · · · , ,

H . , , , . , ',1 .1

-0.60l ti I I

o 100 200 300 400 500 Temp [Cl

Figura 8: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico substância

de referência, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura

ambiente a 550°C.

~l::

'E Cl .s ~

'Qi E 'C C. 10

U 10 >

' C Q)

o

0.00

-0.10

-0.20

-0.30

-0.40

-0.50

0.00

b! -2.00 E

~ ... o

~ ~ -4.00 o ~ ü:

-6.00

o

.~ .. ... _.--- .. _- ...... - ... _~

100 200

.. ,

DSC :-.- ••••• •••••• _. o.' • • •• _._ •••• ~~~G ....

300 Temp ICI

400 500

"

H

Figura 9: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria

prima, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a

550°C.

85

100

~ 50~

E

o

~l::::

'e

0.00

r -D.10

~ 'Cji E

' 1:: a.

~ ~ .;:: (J)

o -D.20

0.00

~bl-2 .00 E

~ ..... o

ri (J)

"O

~ -4.00 ::J Li:

-6.00

.

. .

I

. , \ , °I

I , 1 , r

O 100 ---LUU

I

" I .... ~ .. .

;;UU Temp [Cl

• I

'.1

DSC

DTG

~l TG

I

400 500

Figura 10: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido glicólico

substância de referência, razão de aquecimento SOC/min,

temperatura ambiente a SSO°C.

100

;g e.... 50 ~

(\l

E

j O

86

DSC 0.00 100

".~ ........ ~ -'.",'" .. .... , ............ DTG

~C: ~ ·E ~b> j ~ '\J ~ Ó E

SOl .s -0.10 ~ -1 ~ !!! .s . , , . " .ijj o , , , , E .",

a. li! -c li! > . ",

~

(ii , o ,

, , CIl , -c , , o , , , ~ , , Li: -2 ...

',' -0.20

-3

100

, , ,

, , ,

200 Temp [Cl

H TG

300 400

Figura 11: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido

glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de referência, razão de

aquecimento SOC/min, temperatura ambiente a 400°C.

O

87

~

c: 'E C> .s e! 'Qj E .~

m

" m .~ Q; O

1.00

-0.50

O> E

~ .s

1-11 \ ~t\ t 0.50

~l -1 .50

0.00 o -2.00t: I ! I I I

o 100 200 300 400 Temp [C)

Figura 12: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido

glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência (razão de

aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C).

88

~ U! f/l m E

C:: "E ti> .s « C!)

t o

100 200 Temp [C]

300

H

400

Figura 13: Sobreposição das curvas DTG do ácido glicólico substância de

referência (-), ácido kójico substância de referência (- ), da

mistura do ácido glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de referência

(- ) e da mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5: 1 substâncias de

referência (- ), aproximadamente 5 mg de amostra, razão de

aquecimento 5°e/min. (temperatura ambiente a 400°C), obtidas sob

atmosfera dinâmica de ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.

89

~

-" 'E ci> .s ~ Cl

o 100 200 Temp [C]

300

~ 1 400

Figura 14: Sobreposição das curvas DSC do ácido glicólico substância de

referência (-), ácido kójico substância de referência (- ), da

mistura do ácido glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de

referência (- ) e da mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5: 1

substâncias de referência (- ), aproximadamente 2 mg de

amostra, razão de aquecimento 5°C/min. (temperatura ambiente a

400°C) , obtidas sob atmosfera dinâmica de N2 de 100 mUmin, em

cadinho de alumínio.

90

91

As curvas isotermas obtidas com a mistura ácido glicólico : ácido kójico 5: 1

são mostradas na figura 15.

A partir dos tlO% observados (descontado o tempo necessário para atingir a

Tiso) foi construído o gráfico de Arrhenius, apresentado na figura 16.

TG.A %

10

9

9

o

27 ,26 min 68,14 min 108,49

-10.022% -10.002% -10.012% 165,14 min -10.014%

249,84 min -10.000% ~W ___ ~_··· ___ • __ •• • •• _ _ · ···1 ___ __ _______ ___ ~ ________ ____ ____ __ ___ __ ~

, ,

50 100 150 Time [min]

65' C

70' C

75' C

80'C

90' C

200 250

Figura 15: Sobreposição das curvas TG isotérmicas da mistura ácido glicólico/ácido

kójico 5:1 substâncias de referência, razão de aquecimento 5°C/min.

(temperatura ambiente a T iso·1 O°C) seguida de 2°C/min. até ocorrência de

10% de perda de massa, obtidas sob atmosfera dinâmica de ar de 50

mUmin, em cadinho de platina.

92

5,5 In t = 10910,6 (1fT) - 26,7

5,0 r2= 0,9978

ê 4,5

E ........ -c 4,0

3,5

3,0 2 ,8x10-3 2,8x10-3 2,9x10-3 2,9x10-3 3,OX10-3

1fT (K1)

Figura 16: Gráfico de Arrhenius (y = a + bx) da mistura ácido glicólico/ácido kójico 5: 1

substâncias de referência.

93

A energia de ativação E, calculada pelo produto da inclinação da reta

(10910,6) pela constante molar dos gases (8,314 J. moI. K1) foi de 90,7 KJ. mor1.

A equação obtida foi usada a fim de se estimar o tempo necessário para se

verificar uma degradação de 10% à temperatura de 25°C. A extrapolação resultou

num tempo de vida útil a 25°C de 14,7 dias.

5.2. Estudo preliminar de estabilidade das formulações

5.2.1. Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico

Os resultados da avaliação das formulações creme e gel contendo ácido

kójico associado a ácido glicólico (1 a 35), após o estudo preliminar de estabilidade

encontram-se representados nas tabelas a seguir.

A avaliação foi feita considerando-se como referências as embalagens

armazenadas em geladeira e o creme e gel base de cada formulação.

94

a) armazenagem em estufa a 45±2°C

Tabela 1: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido

glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,



F COTo CO T30 pH To pH T30

1 branco +++ 3,77 3,72

2 branco +++ 3,73 3,69

3 branco +++ 3,85 3,66

4 branco ++ 3,83 3,70

5 branco ++ (s) 3,46 3,54

6 branco + (s) 3,23 3,45

7 branco +++ 3,79 3,84

8 branco ++ (s) 3,62 3,41

9 branco +++ 3,65 3,78

10 branco ++ 3,56 3,56

11 branco (c) (b) ++++ 4,27 4,02

12 bege claro (c) (b) ++++ (sp) 4,32 4,16

13 bege claro (c) +++ (sp) 3,65 3,61

14 branco ++ 3,65 3,59

15 branco ++ (b) 3,63 3,52

16 branco + 3,65 3,58

Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade

da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.

95


glicólico associados, usando como excipiente creme aniônico,




17 branco ++ 3,75 3,79

18 branco +++ 3,84 3,67

19 branco ++ 3,42 3,57

20 branco ++ (s) 3,16 3,23

21 branco ++ (b) 3,60 3,57

22 branco (c) + (b) 3,63 3,68


da degradação (amarelo claro ao marrom escuro) ; c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.

96


glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,



F COTo CO T30 pH To pH T3Q

23 incolor +++ 3,65 3,89

24 incolor +++ 3,72 3,68

25 incolor ++ 3,61 3,62

26 incolor (s) ++ 3,23 3,35

27 Incolor (b) ++++ 3,65 3,77

28 incolor (b) +++ 3,58 3,65

29 incolor (b) +++ 3,60 3,69

30 incolor + 3,66 3,76


da degradação (laranja claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; s = odor de

sulfeto.

97


glicólico associados, usando como excipiente gel de amigel®,



F COTo COT30 pH To pH T30

31 incolor +++ 3,69 3,72

32 incolor +++ 3,70 3,68

33 incolor ++ (g) 3,49 3,60

34 incolor (s) +++ 3,21 3,35

35 incolor (c) ++++ 3,59 3,68


da degradação (laranja claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; c = perda de

consistência; s = odor de sulfeto; g = aspecto gelatinoso.

b) exposto à luz em embalagem de vidro incolor


glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico, expostas

à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.

F COTo CO T30

10 branco +

13 bege claro (c) + (b)

14 branco +

15 branco sd (b)

16 branco sd


da degradação (bege claro ao marrom claro) ; c = perda de consistência; b = formação de

bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação.

98


glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®, expostas

à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.

F COTo CO T30

30 incolor sd


da degradação (amarelo claro a marrom claro) ; c = perda de consistência; b = formação

de bolhas; s = odor de sulfeto; sd = sem degradação.

5.2.2. Formulações contendo ácido kójico

As tabelas a seguir apresentam os resultados da avaliação das formulações

creme e gel contendo ácido kójico (36 a 48), após o estudo preliminar de

estabilidade.

A avaliação foi feita considerando-se como referências as embalagens

armazenadas em geladeira e o creme e gel base de cada formulação.

99

a) armazenagem em estufa a 45±2°C

Tabela 7: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico, usando

como excipiente creme não iônico, armazenadas à temperatura de

45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).


36 branco ++ 3,80 3,54

37 branco ++ 3,96 4,27

38 branco (s) + 3,79 3,80

39 branco ++ 3,91 3,84

40 bege claro (c) ++ (sp) 3,92 3,84

41 bege claro (s) ++ (b) 3,10 3,00

42 branco sd 3,91 3,80


da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b =

formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação

evidente.

./ BiB~I :~il ~C A

Faculdade de Ciências Farrnacêuticas , Universidade de São Paulo

100


como excipiente creme aniônico, armazenadas à temperatura de

45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).

F COTo COT3Q pHTo pH T30

43 branco ++ 4,66 4,02

44 branco + (b) 3,85 4,09


da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.


como excipiente gel de natrosol®, armazenadas à temperatura de

45±2°C em estufa em embalagem plástica (polipropileno).

F COTo COT3Q pH To pH T3Q

45 incolor +++ 5,18 4,30

46 incolor + 4,17 4,20


da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; s = odor de

sulfeto.

101

Tabela 10: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,

usando como excipiente gel de amigel®, armazenadas à temperatura



47 incolor +++ 4,55 4,09

48 incolor ++ (c) (g) 4,05 4,07


da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; c = perda da

consistência; s = odor de sulfeto; g = aspecto gelatinoso.

b) exposto à luz em embalagem de vidro incolor

Tabela 11: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico usando

como excipiente creme não iônico, expostas à luz (temperatura


F COTo CO T30

39 branco +

40 bege claro (c) sd

41 bege claro (s) + (b)

42 branco sd


da degradação (bege claro ao marrom claro); c = perda de consistência; b = formação de

bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação.

102

Tabela 12: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico usando

como excipiente gel de natrosol®, expostas à luz (temperatura


F COTo CO T30

46 incolor sd


da degradação (amarelo claro a marrom claro); c = perda de consistência; b = formação

de bolhas; s = odor de sulfeto; sd = sem degradação.

103

5.3. Validação do método de determinação do ác. kójico por

espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVD)

5.3.1. Espectro de absorção do ácido kójico

A figura 17 mostra o espectro de absorção direto e o de primeira derivada do

ácido kójico, obtidos conforme as condições experimentais estabelecidas no item

4.2.4.3.

A b

1,OOOrl ------,..-------,---------,,..-------r---------,

-0,100IL1 ___ ~ __ ....L... __ ~ ___ .l_ __ ~ __ ---.JL_ __ ~ __ __L ___ ~ __ ....J

200,0 260,0 Wavelength (nm.)

320,0

Figura 17: Espectro de absorção direto (--) e de primeira derivada (- ) do ácido kójico

substância de referência (10 IJg/mL) em metanol.

104

5.3.2. Curva de calibração do ácido k6jico por espectrofotometria

derivada de 1a ordem

o espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico, obtido

nas condições experimentais padronizadas no item 4.2.4.3 pode ser encontrado na

figura 18. A figura 19 mostra o mesmo espectro de absorção em 1 a derivada.

A b s

1.800..-, --~----'---------'---~--'----~---r---~--""

0.0001 --- ?:'? 200.0 260.0

Wavelength (nm.) 320.0

Figura 18: Espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico

em metanol , intervalo de concentração de 2 a 18 j.Jg/mL.

A b

.0.0801 I\\V/U

200.0 260.0 \\Iavelength (nm.)

320.0

105

Figura 19: Espectro de absorção em derivada de primeira ordem da curva de calibração

do ácido kójico em metanol, intervalo de concentração de 2 a 18 I-Ig/mL.

Os valores experimentais obtidos na construção da curva de calibração do

ácido kójico por espectrofotometria derivada estão descritos na tabela 13.

A regressão linear da curva, obtida pelo método dos mínimos quadrados, e os

dados estatísticos da regressão são mostrados nas figuras 20 e 21 ,

respectivamente.

106

Tabela 13: Absorbâncias e Mbs/I1À obtidas na construção da curva de calibração

do ácido kójico em metanol, nas concentrações de 2 a 18 I-Ig/mL.

Concentração Absorbância* DPR(%) I1Abs/ I1À * DPR(%) j..Jg/mL (270 nm) (270 nm) (256,8 nm) (256,8 nm)

2 0,1181 3,57 0,0030 3,81

4 0,2272 1,01 0,0066 1,74

6 0,3402 0,19 0,0100 0,58

8 0,4515 1,05 0,0131 1,16

10 0,5698 0,81 0,0170 0,90

12 0,6817 0,49 0,0205 0,75

14 0,7918 0,76 0,0234 0,74

16 0,9003 0,15 0,0267 0,22

18 1,0161 0,23 0,0305 0,50

* média de três determinações

107

0,035

y = -2,86.10.4 + 0,0017 x 0,030

0,025

c< 0,020 <l --Cf)

III 0,015 ~

0,010

0,005

0,000 O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

concentração ~g/mL

Figura 20: Curva de calibração do ácido kójico (2 - 18 IJg/mL) em metanol, obtida por

espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta a 256,8 nm.

Regressão linear: y = a + bx

Parâmetro

a b

r

0,9997

Valor

-2,86.10-4

0,0017

DP

2,32.10-4

Erro

1,69.10-4 1,50.10-5

N

9

(t., = 1,69)

P

<0.0001

Figura 21 : Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração do ácido

kójico em metanol a 256,8 nm, obtida pelo método dos mínimos quadrados,

onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de

correlação e t., = t calculado (teste de significância de a).

110


A figura 24 mostra os espectros diretos da amostra ácido kójico 1 % gel, gel

base e solução padrão, obtidos conforme o item 4.2.4.5.1, em metano/.

A b

tODO, I

0,500

/ :/ r v ~\

0,000' 2'=- ~

200,0 260,0 Wavelength (nm.)

320.0

Figura 24: Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 f..Lg/mL (- ),

da amostra ácido kójico gel 10 f..Lg/mL (- ) e do gel base (- ), em

metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.

A análise dos espectros de absorção diretos apresentados permite concluir

que o uso do método direto não é aplicável, uma vez que ocorre sobreposição do

espectro do gel base com os espectros do padrão e da amostra. Tal sobreposição

evidencia que os excipientes usados na formulação absorvem na mesma região de

comprimento de onda que o analíto.

111

A figura 25, por sua vez, mostra os resultados obtidos a partir da derivação

dos espectros diretos, usando-se o método "zero crossing", no qual utiliza-se o

comprimento de onda onde o espectro derivado do gel base se anula.

A b

0,065" --~---.---~---.---~---r---~---r---~----'

0,0001 ' o \( l ' ? c::: l ? c=:==:: :=::...... \.. )( :::;;= ::::;:::::n

-0,065' ,~(

200,0

256,8 nm

260,0 Wavelength (nm,)

320,0

Figura 25: Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão

de ácido kójico a 10 Ilg/mL (- ), da amostra ácido kójico gel 10

Ilg/mL (-) e do gel base (- ), em metanol, com intervalo de leitura

de 200 a 320 nm. Ponto de anulação do gel base a 256,8 nm

(método quantitativo "zero crossing").

A obtenção dos espectros em derivada de primeira ordem permite identificar o

ponto de anulação onde é possível a quantificação do ácido kójico sem interferência

dos excipientes do gel base, o que ocorre a 256,8 nm.

112


o espectro direto e em derivada de primeira ordem da amostra ácido kójico

1 % creme submetido a envelhecimento acelerado a 45°C em estufa por 30 dias,

conforme o item 4.2.4.5.2., são mostrados nas figuras 26 e 27.

A b

0.0001 ~ 200.0 260.0

Wavelength (nm.) 320.0

Figura 26: Espectro direto, em metanol, da amostra ácido kójico creme a 10 fJ.g/mL (- ),

da amostra ácido kójico creme a 10 fJ.g/mL submetido a envelhecimento

acelerado (- ) e da solução padrão de ácido kójico a 10 fJ.g/mL (- ).

A b

0,065" --.....,....--__._--~--__._--~--__._--~--_,_--~-___,

.0,065' v 200,0 260,0

Wavelength (nm.) 320,0

113

Figura 27: Espectro de absorção em primeira derivada, em metanol, da amostra ácido

kójico creme a 10 ~g/mL (- ), da amostra ácido kójico creme a 10 ~g/mL

submetido a envelhecimento acelerado (- ) e da solução padrão a 10

~g/mL (- ).


Os valores experimentais obtidos na recuperação de concentrações

conhecidas de padrão adicionadas à amostra, conforme especificado no item

4.2.4.6, são apresentados a seguir.

A porcentagem de recuperação foi calculada conforme segue:

[amostra adicionada de padrão] - [amostra não adicionada de padrão] %R= x 100

[padrão adicionado]

114


Os resultados obtidos na recuperação de alíquotas de padrão adicionados à

amostra, conforme as condições experimentais estabelecidas no item 4.2.4.6,

usando o método espectrofotométrico derivado de primeira ordem a 256,8 nm,

podem ser observados na tabela 14.

Tabela 14: Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico

1 % creme, por espectrofotometria derivada de primeira ordem no


metanol.

Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)

2,00 2,06 103,00 0,00

4,00 4,12 103,00 0,00

6,00 6,18 103,00 0,57


a) Amostra ácido kójico 1 % gel

Os resultados obtidos na recuperação de alíquotas de padrão adicionados à

amostra, conforme as condições experimentais estabelecidas no item 4.2.4.6,

usando o método espectrofotométrico derivado de primeira ordem a 256,8 nm,

podem ser observados na tabela 15.

„BUISSOJO cuaz„

onevluenb opolaw `eiaio!negin ou wapio emewpd ap epenpap eplawolojapedse

iod 81110.10 00g9)1 oppe eAsowe eu oo![91 opp? ap _1091 op oebeugualep

eu sopgqo sopefinsai so agsuowep Anões e epeluesaide 91, v

OW0-13 %I, 03!!9 Opp? ensowv (e

oespaid 'T£'9

sao5eu!twaTep saJT ap ellnw

LZ`O 00'66 176'S 00'9

ZEL O 09'66 86`8 00'17

00'0 00'1,0 I- ZO`Z 00`Z

(%) HdCI

(%) oeõeJadnoau

1w1611 .opeiednow oeiped

lw/611 opeuoioipe oaped

111.1U g`99z e „6UISS010 0.1eZ„ onRepluenb opolaw celaio!naiiin

ou wapio ei!awpd ap epenpap eplawoloi.apadsa Jod %1,

0301 oppe eAsowe wed oeõeJadnoai ap alsal ou sopgio sopeinsau elege].

566

116

Tabela 16: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra

ácido kójico 1 % creme por espectrofotometria derivada de primeira

ordem, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente

metano!.

Valor rotulado valor encontrado* teor DPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança

(%) (%) (%) (p=95%)

1,0 0,9838 98,38 0,41 98,4 ± 0,3

* média de 10 determinações


A tabela 17 apresentada a seguir ilustra os resultados obtidos na

determinação do teor de ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % gel por

espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta, método quantitativo

"zero crossing".

.opolaw op oluaumnionuasep eied lanow ase'.

ep oeõeies eu somo sopelinsai so ansow An6as e epeluesakle g 6 elegei V

saieugullaid sooggiBoiewon sowsu3 • I 9

3V13

iod sopeposse soppe sop oe5eugua;ap ap opovaw op oeSepHeA 'p•9

seo5eug.tualap 01, ap e!P9w .

E`O -T- Ç'L6 617'0 ES'L6 ESL6'0 0'1.

(cY0S6=d) (%) (%)

(%) eõue!juop (%)

oo!!.91 opp?

ap oielualui UdCI soe]. .opaquooua JOICA °perlai JoleA

"iouelaw aluemos `wu g'gg e „611ISS0.10 aleZ„ onnelnuenb opolaw

`wapio wiet.upd ap epenpap epiewolojapedse Jod 1a6 % I, 0301 oppe

ailsowe eu oogol opp? ap Joal op oeõeu!auelap eu sopicio sopefinsed :, eiaclei

L1.1.

118

Tabela 18: Sistemas cromatográficos testados no desenvolvimento do método.

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex,

vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm;


FM A B A:B pH tR G tR K

01 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50 3,21 5,14


03 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00 3,89 6,63


05 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30 4,01 8,79


07 Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30 3,73 6,17

08 Tampão KH2POJH3P04 10 mM ACN 95:05 2,00 3,82


10 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00 3,69 6,29

11 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM 3,00 3,82

12 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 3,87 6,88

13 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM 2,20 4,35 11,3

14 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 2,20 4,42 8,86





Legenda: FM= fase móvel; A = conteúdo aquoso; B = fase orgânica; ACN= acetonitrila;

MET= metanol; TBA = brometo de tetrabutilamônio; TEA = trietilamina; tR G = tempo de

retenção do ácido glicólico; ÍR K = tempo de retenção do ácido kójico.

119

A tabela a seguir mostra os valores de k (fator de retenção) calculados para o

ácido glicólico nos diversos sistemas cromatográficos testados, considerando que o

tempo morto da coluna (to) é de 3,69 minutos, calculado como segue:

tr - to k=

to t = o

Vo

fluxo

tr = tempo de retenção do analíto, to = tempo morto da coluna

Sendo Vo o volume morto da coluna, calculado de Vo = 0, 487.d2. L como

sendo 2,58 mL, e considerado o fluxo de 0,7 mUmin., o valor de to corresponde a

3,69 mino

120

Tabela 19: Valores do fator de retenção (k) nos diferentes sistemas cromatográficos

testados no desenvolvimento do método. Condições cromatográficas:

coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 J.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

FM

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10

11

12

13

14

15

16

17

18

A B A:B pH tR G k<;

Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50 3,21 < 0,0

Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 90:10 3,00 3,59 < 0,0

Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00 3,89 0,05

Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,30 3,74 0,01

Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30 4,01 0,09


Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30 3,73 0,01



Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00 3,69 0,00

Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM 3,00 3,82 0,04

Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 3,87 0,05

Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM 2,20 4,35 0,19

Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 2,20 4,42 0,20



Tampão NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 4 mM ACN 95:05 3,00 4,66 0,26


Legenda: FM= fase móvel; A =conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;

MET= metanol; TBA= brometo de tetrabutilamônio; TEA= trietilamina; tR G = tempo de

retenção do ácido glicólico; KG = fator de retenção para o ácido glicólico.

121

5.4.2. Perfil cromatográfico do ác. kójico e do ác. glicólico na fase móvel

selecionada

Após a realização dos ensaios cromatográficos preliminares a fase móvel 18

foi selecionada para validação do método. As figuras a seguir mostram o perfil

cromatográfico do ácido kójico e do ácido glicólico (matéria-prima e substâncias de

referência) no sistema mencionado, segundo as condições experimentais

estabelecidas no item 4.2.5.3.

~

50 ,

j 40

30.

20

10

t :w ........ - ...... _ .

. RetentIonTme

..... 10 ~

I O +-------------~~ /

2 3 4 ..... _ ..

122

150

[ 40 .

30

~ 20

10

O ·

I ' ~ 5 6 7 8

Figura 28: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 J.1g/mL).

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel

18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

'aluemwe einleJadwal

t_uu czE e owboaleP OZ opelefu! awnion !u!wriw L'o o?zen '(90:96)

NOV 00'E Hd nal Z VE11 + Vslw OE 'Oc1c1-1/t'Ocizi-PHN o?dweT ianow

ase4 `exeuewduelld d2i 0-11)!H !WauÁs eunioo :seowi6olewon segóipuoO

*(1w1611 zg) epuaJajaa ap epualsons op!rol oppe op oow5olewoap wed :oc ein6!3

talflypi

091 -OS

001 -001

Oçt 091

00Z

rn ewil uoguelett

00I

~11 RM -

GSZ •• giz :1

09Z

125

250 I t :.JIRlo. •. Nn ..... f2Sl 1 . - "- ;; : .. ~. ; .. RtmOnIiOn Torne . .a6

~~ 200 1 1\

I \ t

150 j ['M ~10J I \

100.

i. i \ .

50 1 /. \ [ , " ! ,b, 01 . I , , , ,

o 1 2 3 4 S 8 . 7 " --

Figura 31 : Perfil cromatográfico do ácido kójico matéria-prima (32!-1g/mL). Condições

cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18:

tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão

0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura

ambiente.

126

250 '2S0 1:121 ...... II1II_ -.- . ~ -'-· $Wenlion Tme tri . .

200 t 200

\ . '

.. '

i 150 "

\

150'

:J .~ ~

1 \ 100 100· · .

I \ 50 ' \ 50 .·

~ JI ~ I O

/'...... \. O I

O 2 3 4 5 .8 7 8 9 10 11 12 • .MInUta • •

------ - -

Figura 32: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 Ilg/mL)

com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de referência (32 Ilg/mL) - tR

a 5,99 mino Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP

Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a


sao5eu!itualep senp ap e!paw

89'0 80980179 817

£6`0 L9631.1• 0173

09'0 09/170917 017

00' I- 1731796 003

1,8'0 OCOP89£ 3£

03'3 £9L9L 091-

36'0 L Lett 9Z .17

63'1- 99699 031-

03'0 99033L 6 91- 63'1- 1-86LE 08

E9'1. VLL1799 80 68'0 917E03 017

(Mui) lw/eid (%) (flVw)

(%) tida .ealY E l tidC1 .BeJv [ ]

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-aluamwe ainlaiedwe

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NOV 00`£ Hd 1/51w 3 VELL + IAM 0£ i7OcicH7OdH17HN oçdwel lanow

asei. '1V13 Jdd (1w/6r1 0173 e 0t7 ap o?,5e.queouoo ap otemew!) 001190116

oppe e opeioosse (iw/Bri 817 e go ap oe5aqueouoo ap olemalu!)

oo!frm oppe op oeàexplea ap mana ep oe5rulsuoo eu sepgqo seaN Maciel

.9E e E£ sain64 seu sopeAsow oes oesseJ6eJ ep sooFisileise sopep so

e Lsopeapenb sowiuiw sop opolaw oied epgio `semno sep mau!' oesseJ6w v

-oj elege). eu solposep oelse wel! ou olposap atinoluoo `(3v-10)

epualo!la etle ap epploji e4e.i6oTewan JOd 001190116 oppe e opeposse oo!frm oppe

op oe5emeo ap mano ep oOnAsuoo eu sopgio s!eluewpadxe saJoien so

3410 iod

03!193!16 opine e opeposse oo!rox opine op oeSeicilie3 ap emno "rvg

LZ

128

6000000 y = -85776,4 + 114486,8 x

5000000

4000000

::> 'ª 3000000 CU Q) .....

,« 2000000

1000000

O O 10 20 30 40 50

concentração f-lg/mL

Figura 33: Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48

I-Ig/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2

mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 JlL, detecção a



Parâmetro

a b

r

0,9999

Valor

-85776,4 114486,8

DP

20200,68916

Erro

18805,82 603,61

N

6

(te = 4,56)

p

<0.0001

Figura 34: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração do

ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48 j..Ig/mL) obtida por

CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH

3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção

a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método dos mínimos

quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de significância de a) .

129

130

120000 y = 889,4 + 468,01 x

100000

80000 ::J « E

60000 CU Q) '--,«

40000

20000

O O 50 100 150 200 250

concentração J.Lg/mL

Figura 35: Curva de calibração do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240

I-Ig/mL) obtida por CLAE, fase móvel : tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2

mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção

a 220 nm; temperatura ambiente.


Parâmetro

a b

r

0,9998

Valor

889,4 468,01

OP

825,46

Erro

768,47 4,93

N

6

(te = 1,16)

P

<0.0001

Figura 36: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração

do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 IJg/mL)

obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado

20 f.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método

dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado


5.4.4. Especificidade

5.4.4.1. Interferência dos excipientes


131

As figuras 37 e 38 mostradas a seguir ilustram os cromatogramas da amostra

ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e do creme base, obtidos

conforme o item 4.2.5.5.1.

132

250j ~ ~:_ [ 250

R~ 11 l

2001 Ii -200 -

:J

150

1 I \ t ". o

~ 100 \ l,001

501 I \ , 50

.I . t !~ ~ . o 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 ---

Figura 37: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 f.lg/mL) associado a ácido

glicólico (160 f.lg/mL) creme. Condições cromatográficas: coluna Synergi

Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20

f.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

133

1

.250

200

250] .----:- ::=:l. -. -RetenIIon. TIme

200

150 '· 150 ··

~ ~ 100 100 ·· ·

50 - 50

01 -;:;':: -.=- lO O 2 4 8 11 10 12 14

. ~ .Mftwta.

Figura 38: Perfil cromatográfico do creme base. Condições cromatográficas: coluna

Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04

30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 !J.L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

134


As figuras 39 e 40 mostradas a seguir correspondem aos cromatogramas da

amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel e do gel base, obtidos

conforme o item 4.2.5.5.1.

250..- 1: 22a, .......... , 250

~-- 8 ...-.-. Retention Tune -,.;

200~ 1\ ~ 200

'~l 1I

150

\ ~ I, ~

100 \ 100 .

\ 50 1

~.. i \ ~ 50

, ~,jo o ' :';' ~,\ :;=::=; , , , .. o 2 3 " 5 8 7 8 9 10 11 12

Figura 39: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 f.!g/mL) associado a ácido

glicólico (160 f.!g/mL) gel. Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP

Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 f.!L, detecção a


135

250 I ,,:..,2JJl-. ........ 1250 ~ __ .T _T

.:-Retention· TIme

200 _200

150 150

~ 1 100 100

] :;::;::::::::: ~

[ D 2 4 8 8 .. 10 12 14 -

Figura 40: Perfil cromatográfico do gel base. Condições cromatográficas: coluna Synergi

Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 flL,


136


Os cromatogramas apresentados nas figuras 41 e 42 mostram o perfil

cromatográfico da amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme

submetido a envelhecimento acelerado a 45°C em estufa por 30 dias, e dos

respectivos padrões, conforme o item 4.2.5.5.2.

250 1 1; ::ta -. I ,r- ('oi -= . ~ ·.·RoIentíon Time o() •

200 \ I I

\

1001 ' \

, .. 1\

50~ ,I .. !. I \ o ~ ~

i i . i i i i

150

~

o · - M~ .·

-----~ 10 """" 12

137

·250

I . ~ 200

l,. I

100 ·

l J~

14

Figura 41: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 Ilg/mL) associado a ácido glicólico

(160 Ilg/mL) creme, submetida a envelhecimento acelerado em estufa a 45°C por 30

dias. Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel

18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

250 1 ', .... _ ..... - [.250 ~.- . i .....-.~ . ·_r""" . . , .. . D

200 - 1\ ~ 200 1\ \

1501 II ' 150-

=> I \ l => ~ . . . ~

100 ; I 100·· .

501 I I ~ 5Q (1; ... I \ "l . . ~

Oj , ~, ,\ , , to o 1 2 4 . e 9 10 11 12

.... IaUIN. .

Figura 42: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 Ilg/mL) com tR a

4,56 min - e do ácido kójico substância de referência (32 Ilg/mL) - tR a 5,99 mino

Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18:

tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.

138

A análise de pureza dos picos no detector PDA apresentou índices de pureza

de 99,9999% e 99,9997% para o ácido kójico e glicólico, respectivamente.

5.4.5. Exatidão (recuperação)


A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.5.6, as tabelas

abaixo demonstram a recuperação obtida para os ácidos kójico e glicólico na

amostra creme.

Tabela 21: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na


móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN

(95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.lL, detecção a 220 nm;


Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR J.lg/mL J.lg/mL (%) (%)

40,00 39,77 99,43 1,46

80,00 80,05 100,06 0,99

120,00 120,26 100,22 2,26


seo5euguialap 59.4 ap e!p9w „

88'0 61:001- EZ`01-

1-9' 9£'86 89`8L 00'08

6£`0 817'86 6£'6£ 00'017

(%) ddC1

(%) oe5wednoa1

1w/611 opaiadnow owped opeuoppe owped

.aluamwe wrilwadwal

033 e o,e5384013 `111 OZ opeie[u! awnion L'o o?zen '(g0:96)

NOV 00`e Hd Ww Z VELL + IAM 0£ 170c121A/170dHt7HN 00wel len9w

ase'. Jod 106 001190116 oppe e opeposse 4001Í91 oPPe wlsowe

eu 001193116 oppe op oe5wadnow ap aisa4 ou sopgio sopefinsad :£1 einei

'3V10 Jod epeuplualap w4sowe eu

ooi1930 e 0301 soppe so wed epgqo oe5wadnow e weAsuowep ox!eqe seiaqe

se `9.9z-17 way ou seppaieqe;sa s!e4uawpadxa sao5!puoo sep Jped v

ia6 %g 031193116 opp? e opeposse %L. o31fom opp? ensowv (q

seo5eu!analap s9.11 ap e!p9w „

61:0 1-L'301- 99'17 00`17Z

8Z`0 176' Z01- 2:17`91-

1-1:0 8£'301- 61:8 00'8

(%) ida

(%) oe5wadnoad

lw/bri opeJadnow owped

lw/Bri opeuopipe owped

.aluamwe ainTwadwal

wu 0j3 e oeõoalep cz opeleíu! awnioA !u!wnw L'o OCZCA

`(90:96) NOV 00`£ Hd 1Alw Z V81 + lAlw 0£ 170d£H7OdHl7HN o?,dwel

leA91.11 asei JOd eweJO oo!i930 oppe e opeposse 030.91 opp?

wlsowe eu op!f9)1 oppe op oeõelednow ap alsal ou sopNo sopefinsed :zz eioqn

6£6

140

Tabela 24: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra


tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05),

vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm;


Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação OPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)

8,00 8,52 106,50 0,57

16,00 16,85 105,31 0,64

24,00 25,47 106,13 0,39


5.4.6. Precisão


As tabelas 25 e 26 apresentadas a seguir ilustram os resultados obtidos na

determinação dos teores de ácido kójico e de ácido glicólico na amostra ácido kójico

1 % associado a ácido glicólico a 5% creme por CLAE.

141

Tabela 25: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Jlg/mL)

na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE,

fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :

ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 JlL, detecção a 220


Valor rotulado valor teor DPR Intervalo de ácido kójico encontrado* confiança

(%) (%) (%) (%) (p=95%)

1,00 0,9869 98,69 0,77 98,69.± 0,54


Tabela 26: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160

Jlg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por

CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH

3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 JlL, detecção

a 220 nm; temperatura ambiente.

Valor rotulado valor teor DPR Intervalo de ácido glicólico encontrado * confiança

(%) (%) (%) (%) (p=95%)

5,00 5,3425 106,85 1,81 106,85.± 1,38



As tabelas 27 e 28 ilustram os resultados obtidos na determinação dos

teores de ácido kójico e de ácido glicólico na amostra ácido kójico 1 % associado a

ácido glicólico a 5% gel por CLAE.

142

Tabela 27: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 J.1g/mL)

na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase

móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN

(95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm;



(%) (%) (%) (p=95%)

1,00 0,9860 98,60 1,30 98,60 ± 0,92


Tabela 28: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160

J.1g/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE,

fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :

ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220



(%) (%) (%) (p=95%)

5,00 5,28 105,57 1,82 105,57 ± 1,38


143

5.4.7. Robustez

A robustez do método foi avaliada por meio da utilização de um outro

cromatógrafo líquido, especificado no item 4.2.5.8, equipado com detector UV-VIS.

a) Linearidade

As figuras 43 e 44, mostradas a seguir, apresentam os dados estatísticos da

regressão linear do ácido kójico associado a ácido glicólico, obtida pelo método dos

mínimos quadrados.


Parâmetro

a b

r

0,9999

Valor

-8903,5 126023,4

DP

14431 ,2

Erro

13434,7 431 ,2

N

6

te = 0,66

P

<0.0001

Figura 43: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de

calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48

I-lg/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30

mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente, obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de

correlação e te = t calculado (teste de significância de a).


Parâmetro

a b

r

0,9997

Valor

2449,7 476,6

DP

934,3

Erro

869,7 5,6

N

6

te= 2,8

P

<0.0001


do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 I-Ig/mL) obtida

por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 /-lL,

detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente, obtida

pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b

= coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado


144

Os tempos de retenção do ácido glicólico e do ácido kójico, substâncias de

referência, foram de 5,02 e 6,79 min, respectivamente.

145

b) Exatidão

As tabelas 29 a 31 mostram os resultados obtidos na determinação da

exatidão (recuperação) do método aplicado às amostras ácido kójico 1 % associado

a ácido glicólico 5% nas formas creme e gel.

Tabela 29: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na amostra ácido

kój ico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2PO.JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);


Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR !lg/mL !lg/mL (%) (%)

40,00 41,20 102,99 1,00

80,00 79,66 99,58 0,71

120,00 120,71 100,59 0,72


Tabela 30: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra ácido

kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2PO.JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);


Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR !lg/mL !lg/mL (%) (%)

8,00 8,24 102,95 0,17

16,00 16,58 103,64 0,32

24,00 25,1 4 104,75 0,25


146

Tabela 31 : Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra ácido

kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 j..lL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);



8,00 8,03 100,32 0,99

16,00 16,44 102,76 1, 11

24,00 24,50 102,08 0,99


c) Precisão

Os resultados obtidos na determinação da precisão do método cromatográfico

nas amostras ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e gel são

demonstrados na tabela 32.

147

Tabela 32: Resultados obtidos no teste de precisão na determinação do ácido kójico (K) e

do ácido glicólico (G) na amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico

5% creme e gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO.JH3P04 30 mM +

TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 I-lL,

detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.

KAmostra

Teor* (%) DPR(%) Teor* (%)

G

DPR (%)

creme

gel

95,0

97,3

0,45

0,43

110,0

107,26

1,34

1,14


148

5.5. Validação do método de determinação do ácido kójico por


Os resultados obtidos na validação do método de determinação do ácido

kójico isolado por CLAE em formulações na forma creme e gel, usando-se

cromatógrafo líquido acoplado de detector UV-VIS são apresentados a seguir.

5.5.1 Curva de calibração do ácido kójico por CLAE

Os valores experimentais obtidos na construção da curva de calibração do

ácido kójico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), conforme descrito no

item 4.2.6.1, estão descritos na tabela 33.

A regressão linear das curvas, obtida pelo método dos mínimos quadrados, e

os dados estatísticos da regressão são mostrados nas figuras 45 e 46.

Tabela 33: Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico

(intervalo de concentração de 8 a 48 1-1gImL), fase móvel: tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN (95:05), vazão 0,7

mUmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);


Ácido kójico

] I-Ig/mL

08

16

24

32

40

48

Área* (mAU)

1014291

2019069

3052006

4071265

5063699

6111792

DPR (%)

0,15

0,41

1,11

0,29

0,38

0,39

* média de duas determinações

149

7000000

6000000 y = -8712 + 127288 x

5000000

~ 4000000 « E m 3000000 .... ,«

2000000

1000000

O O 10 20 30 40 50

concentração I!g/mL

Figura 45: Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL)

obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH

3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 ,....L, detecção a 220

nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.

Regressão linear:

y = a + bx

Parâmetro

a b

r

0,9999

DP

Valor

-8711,7 127288,1

N

12831 ,9

Erro

11945,9 383,4

P

6

te= 0,73

<0.0001


do ácido kój ico (intervalo de concentração de 8 a 48 \Jg/mL) obtida

por CLAE, fase móvel : tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM

pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,

detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente, obtida

pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta,

b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado


150

151

5.5.2. Exatidão (recuperação)

c) Amostra ácido kójico 1% creme

A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.6.2, a tabela

abaixo demonstra a recuperação obtida para o ácido kójico na amostra creme.


ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04

30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 JlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente.

Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Jlg/mL Jlg/mL (%) (%)

8,00 8,2 102,5 0,11

16,00 16,33 102,1 0,23

24,00 24,85 103,5 0,63


d) Amostra ácido kójico 1 % gel

A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.6.2, a tabela

abaixo demonstra a recuperação obtida para o ácido kójico na amostra gel ,

determinada por CLAE.

152


ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30

mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume

injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura

ambiente.


8,00 8,15 101,8 0,52

16,00 16,48 102,9 0,43

24,00 40,30 102,0 0,42


5.5.3. Precisão


A tabela 36 apresentada a seguir ilustra o resultado obtido na determinação

do teor de ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % creme por CLAE.

153

Tabela 36: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 IlglmL)

na amostra ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);


Valor rotulado valor teor OPR Intervalo de ácido kójico encontrado* confiança

(%) (%) (%) (%) (p=95%)

1,00 0,9740 97,40 0,56 97,4 ± 0,39



A tabela 37 ilustra o resultado obtido na determinação do teor de ácido kójico

na amostra ácido kójico 1 % gel por CLAE.

Tabela 37: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Ilg/mL)

na amostra ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão

NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7

mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);


Valor rotulado valor encontrado* teor OPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança

(%) (%) (%) (p=95%)

1,00 0,9943 99,43 0,75 99,43 ± 0,54


154

5.6. Comparação dos métodos de determinação do ác. kójico por UVO e

CLAE

Na tabela 38 são mostrados os resultados da aplicação dos testes F e t para

comparação dos métodos cromatográfico (item 5.5.3) e espectrofotométrico (item

5.3.5) na determinação de ácido kójico a 1 % em formulações na forma creme e gel,

quanto aos parâmetros de precisão e exatidão, respectivamente.

Tabela 38: Resultados obtidos na comparação da precisão e exatidão dos

métodos propostos (EDUV e CLAE) para determinação de ácido kójico nas amostras

creme e gel.

Precisão

Amostra UVO (A) CLAE (8) Fcalc

Ácido kójico 1 % creme SA 2 = 0,1640 SB 2 = 0,3015 1,84

Ácido kójico 1 % gel SA 2 = 0,2240 SB 2 = 0,5588 2,50

Exatidão

Amostra )("d Sd tcalc

Ácido kójico 1 % creme 0,3 0,72 0,72

Ácido kójico 1 % gel -2,4 1,4 2,97

Uma vez que o valor de Fg,g na tabela de Snedecor (distribuição bilateral) de

4,026 (p=95%) é maior que os valores calculados de F para ambas as amostras,

pode se dizer que não há diferença entre os métodos quanto à precisão. Igualmente,

pode se dizer que não há diferença estatisticamente significante entre os métodos

quanto à sua exatidão uma vez que o valor crítico de t (p=95%) de 4,30 na tabela

também é maior que os valores calculados de t para ambas as amostras.

155

5.7. Estudo de estabilidade acelerado

5.7.1. Caracteres organolépticos

o resultado da avaliação macroscópica das formulações contendo ácido

kójico associado ou não a ácido glicólico, submetidas ao estudo de estabilidade

acelerado, encontram-se representados nas tabelas a seguir.

A avaliação foi feita considerando-se como referência as embalagens

correspondentes ao To, armazenadas em geladeira.

Tabela 39: Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo

ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de

armazenamento.

Tempo Estufa Luz Armário

40±2°C 25±2°C (t.a)

To branco branco branco

T48 branco branco branco



T60 bege claro branco branco

T90 bege branco branco

Legenda: t.a = temperatura ambiente

156


ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de

natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de

armazenamento.


4D±2°C 25±2°C (t.a)

To incolor incolor incolor

T48 incolor incolor incolor


T30 amarelo claro incolor incolor

T6D amarelo claro incolor incolor-

Too amarelo incolor incolor

Legenda: t.a =temperatura ambiente


ácido kójico 1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote



4D±2°C 25±2°C (t.a)--

To branco branco branco




T60 Bege claro branco branco

Tgo bege branco branco


157


ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote



40±2°C 25±2°C (t.a)

To incolor incolor incolor



T30 amarelo claro incolor incolor

T60 amarelo incolor incolor

T90 amarelo incolor incolor


Todas as formulações avaliadas não apresentaram sinais visíveis de perda de

homogeneidade, instabilidade física ou a presença de odores significativos.

5.7.2. Análise de pH

As tabelas a seguir ilustram os resultados obtidos da análise de pH das

formulações submetidas ao estudo acelerado de estabilidade, realizada de acordo

com o estabelecido no item 4.2.4.4.

158

Tabela 43: Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido

kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,

embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de

armazenamento.


40±2°C 25±2°C (t.a)

To 3,54 3,54 3,54

T48 3,51 3,55 3,56

T15 3,61 3,60 3,62

T30 3,58 3,58 3,59

T60 3,65 3,64 3,65

T90 3,59 3,61 3,62



kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de

armazenamento.


40±2°C 25±2°C (t.a)

To 3,64 3,64 3,64

T48 3,65 3,66 3,65

T15 3,73 3,72 3,72

T30 3,73 3,71 3,71

T60 3,78 3,76 3,77

T90 3,77 3,75 3,75


159


kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico



40±2°C 25±2°C (t.a)

To 3,61 3,61 3,61

T48 3,57 3,57 3,58

T15 3,56 3,59 3,65

T30 3,37 3,53 3,50

T60 3,46 3,41 3,48

T90 3,21 3,34 3,46



kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico



40±2°C 25±2°C (t.a)

To 4,56 4,56 4,56

T48 4,54 4,54 4,54

T15 4,59 4,61 4,65

T30 4,48 4,57 4,58

T60 4,46 4,47 4,64

T90 4,24 4,46 4,58


160

5.7.3. Doseamento

Os resultados da análise por CLAE do teor das formulações submetidas ao

estudo acelerado de estabilidade, realizada segundo as condições padronizadas no

item 4.2.8.4 (item c), são ilustrados nas tabelas a seguir.

Os teores apresentados foram corrigidos com a perda de umidade calculada

para cada embalagem. Para cada amostra e condição de armazenagem calculou-se

a média do teor remanescente de ácido kójico em relação ao To. Para o conjunto de

dados apresentados nas tabelas de 47 a 50 médias acompanhadas de letras iguais

não diferem entre si ao nível de 0,05 de significância.

Tabela 47: Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações

contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente

creme não iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes


Estufa Luz Armário

40±2°C 25±2°C (t.a)

Tempo Kteor% * G teor% * Kteor% * G teor"h * Kteor% * G teor% *

To 101,0 108,4 101,0 108,4 101,0 108,4

T48 100,5 115,9 101,4 115,0 101,5 115,4

T15 95,9 122,4 97,5 121 ,0 98,7 120,2

T30 93,8 124,3 97,9 126,3 97,8 125,1

T60 90,6 125,1 94,2 124,6 96,7 128,5

T90 87,2 124,1 92,1 125,0 93,2 127,3

média** 93,9aA 96,4bA 97,2bA

Legenda: t.a = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.

*média de 2 determinações. **média do teor remanescente em relação ao To (médias

seguidas por letras iguais em minúsculo não diferem entre si para uma mesma amostra

em relação à condição de armazenamento; médias seguidas por letras maiúsculas não

diferem entre si quando as quatro amostras são comparadas dentro de uma mesma

condição de armazenamento; a = 0,05.)

161


contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente

gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes


Estufa Luz Armário

40±2°C 25±2°C (t.a)

Tempo Kteor% * G teor% * Kteor% * Gteor"Á> * Kteor% * G teor%*

To 99,4 103,4 99,4 103,4 99,4 103,4

T48 99,4 107,6 99,1 104,4 99,9 108,2

T15 97,3 112,8 98,1 110,5 98,2 111 ,7

T30 95,1 110,1 98,0 115,3 97;9 115,1

T60 92,8 109,6 95,1 114,3 97,0 114,6

T90 89,8 112,1 95,4 120,3 96,3 120,2

média** 96,2aAB 98,1abAB 98,7bAB







162


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em

pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.

Estufa Luz Armário

40±2°C 25±2°C (t.a)

Tempo Kteor% * Kteor% * Kteor% *

To 105,3 105,3 105,3

T48 103,1 104,3 106,9

T15 101,4 101 ,9 103,7

T30 98,0 103,9 103,3

T60 98,3 99,2 101,4

T90 86,6 92,7 96,0

média** 93,8aA 96,1abA 97,6bA







163


contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em

pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.

Estufa Luz Armário

40±2°C 25±2°C (t.a)

Tempo Kteor% * Kteor% * Kteor% *

To 100,3 100,3 100,3

T48 101 ,0 101,4 101,3

T15 99,1 100,3 100,8

T30 98,2 101,5 101 ,0

T60 98,1 98,5 101,5

T90 93,9 97,6 101 ,3

média** 98,1aB 99,6abB 100,7bB

Legenda: La = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.






164

5.7.4. Comportamento reológico

As tabelas e figuras apresentadas a seguir demonstram os resultados da

análise reológica das formulações submetidas ao estudo de estabilidade acelerado,

conforme as condições experimentais indicadas no item 4.2.4.4.

Tabela 51 : Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico

1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,

embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos


Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade

(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90

0,125 120000 150000 150000 155000 165000 150000

0,25 82500 102500 105000 105000 112500 100000

0,625 49000 59000 63000 62000 69000 64000

1,25 32500 37000 39500 39500 41500 40500

2,5 21250 22500 24000 25750 26500 26250

5 14125 14250 15875 17125 18875 19125

12,5 7650 8250 8750 9650 10800 10900

25 4675 4975 5675 6375 7375 7650

25 4825 5075 5900 6625 7425 7550

12,5 7650 7900 9100 9900 10300 10950

5 12750 13375 14875 15625 15875 16875

2,5 19000 20500 21250 23500 24000 24250

1,25 28000 30000 31500 34500 35000 35000

0,625 41000 43000 47000 50000 50000 50000

0,25 67500 72500 77500 82500 82500 80000

0,125 105000 105000 115000 115000 120000 115000

*média de 2 determinações

165

- - To

200000 -- T

48 -- T

15 180000 -- T3Q

-- Too -- T

90

r0 E 160000 --Z ........ 140000 a -c:: 120000 Q)

E ro 100000 .s= (ij IJ) 80000

·13 Q) 60000 "O ro C» 40000 .... a u. 20000

O O 5 10 15 20 25

Gradiente de velocidade (1/5)

--To 200000 --T

gO

180000 ",-

E 160000 --Z ......, 140000 a -c:: 120000 Q)

E ro

.s= 100000

tu IJ)

·13 80000

Q) 60000 "O ro c» 40000 .... a

U. 20000

O

O 5 10 15 20 25


Figura 47: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido

kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a

40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas

os To e Tgo.

166

Tabela 52: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico


embaladas em potes plásticos (poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes

tempos de leitura.


(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90

0,125 120000 170000 165000 160000 150000 160000 0,25 82500 107500 107500 107500 100000 105000

0,625 49000 60000 62000 62000 59000 63000 1,25 32500 37000 37000 37000 35500 37500 2,5 21250 23250 24000 23750 23000 25000 5 14125 15375 15625 16000 16000 17250

12,5 7650 7800 8450 8600 9000 9950 25 4675 4825 5325 5525 5750 6425 25 4825 4750 5375 5675 5950 6650

12,5 7650 7750 8650 9100 9200 10550 5 12750 13500 15000 15375 15625 17000

2,5 19000 20500 21750 22500 22750 25000 1,25 28000 29500 31500 32000 32500 35500 0,625 41000 45000 46000 48000 48000 50000 0,25 67500 72500 80000 80000 75000 80000 0,125 105000 110000 110000 120000 110000 110000


--T 180000 -, o

--T48

160000 -l --T15

~ 140000j

--T30

--Tso --TgO 120000

O ....... C Q) 100000 E co .r: 80000

CO UJ '(3 60000 Q) "O CO 40000 e-O

LL 20000

O O 5 10 15 20 25

Gradiente de velocidade (1/s) 180000..., - - T o

160000 ...J --TgO

-. N 140000 E --z -- 120000 O ....... C Q) 100000 E co .r: 80000 co UJ '(3 60000 Q) "O co u. 40000 ..... O

LL 20000

O O 5 10 15 20 25

Gradiente de velocidade (1/s)

Figura 48: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo

ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente

creme não iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à

luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque


167

168



embaladas em potes plásticos (poliestireno ), armazenadas em armário à

temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.


(1/s) To T48 T15 T30 T60 Tso

0,125 120000 170000 160000 160000 160000 160000 0,25 82500 107500 105000 107500 102500 102500

0,625 49000 59000 60000 60000 59000 59000 1,25 32500 35500 36000 36500 36500 35000 2,5 21250 23000 23750 24500 24250 24000 5 14125 15250 15500 16250 16250 15500

12,5 7650 7750 8000 8450 8950 8650 25 4675 4825 5000 5400 5800 5700 25 4825 4775 5150 5525 5875 5875

12,5 7650 7500 8350 9050 9750 9500 5 12750 13250 14250 16000 16125 15750

2,5 19000 20000 21500 23000 24500 23750 1,25 28000 29000 32500 33000 36000 34000

0,625 41000 43000 49000 48000 51000 49000 0,25 67500 70000 80000 77500 85000 80000

0,125 105000 110000 115000 115000 125000 120000


--T 160000 -, o

--T48

140000~ --T

15

1120000

- - T30

- - T60

--T90

o 100000 ..... C Q)

E 80000 tU ~

tU (/) 60000 ·0 Q)

"O 40000 tU O-.... O 20000 u..

O O 5 10 15 20 25


160000 -, --T o --T

90

140000

.--.. '" E 120000 -.. Z .......-o 100000 ..... c Q)

E 80000 tU ~

tU (/) 60000 ·0 Q)

"O 40000 tU O-.... O 20000 u..

o o 5 10 15 20 25



kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não

iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em armário

fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e

em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.

169

170


1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,

embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos


Gradiente de velocidade

Viscosidade (cPs)*

(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90

0,125 290000 270000 210000 190000 125000 75000 0,25 202500 195000 175000 147500 102500 70000

0,625 113000 108000 100000 89000 67000 50000 1,25 69500 68000 64000 58000 46500 37000 2,5 49250 50000 42250 37000 30750 25750 5 28750 29000 28750 26750 20250 17500

12,5 14000 13800 13750 13300 10700 9700 25 7975 7900 8100 7750 6400 5900 25 7900 7725 7950 7675 6350 5850

12,5 13550 13250 13500 12850 10300 9250 5 27250 27125 27000 25375 19125 16500

2,5 45250 44750 44750 41250 29500 24250 1,25 74000 73000 70000 63500 43000 33500

0,625 116000 113000 107000 93000 60000 44000 0,25 197500 192500 172500 145000 87500 57500

0,125 285000 275000 240000 185000 110000 70000


--To

2roooo~ --T

48

200000 --T

15 --T

30

180000 --T60 rr

..§ 160000 --TgO

Z -;; 140000 -c:: 120000 Q)

E ctI 100000 .r:. (ij

80000 (J)

"u Q) 60000

"O ctI 40000 <> ..... O 20000 u..

O

O 5 10 15 20 25


220000 -, --To

2000001 --T

gO

____ 180000 N

E 160000 --Z '-"""

o 140000 -c::: Q) 120000 E ctI

100000 .r:. (ij li)

80000 "u Q)

60000 "O ctI o.. 40000 ..... o u..

20000

o o 5 10 15 20 25



kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de

natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em

estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque

(abaixo) apenas os To e Tgo"

171

172



embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes

tempos de leitura.


(1/5) To T48 T15 T30 T60 T90

0,125 290000 280000 270000 275000 240000 205000 0,25 202500 200000 202500 197500 180000 160000

0,625 113000 110000 112000 109000 103000 92000 1,25 69500 69000 70000 68500 65000 60000 2,5 49250 51250 50500 52250 47000 42000 5 28750 29000 29500 29375 27500 27875

12,5 14000 13900 14250 14300 13700 13250 25 7975 7900 7875 8125 7750 7775 25 7900 7825 8125 7925 7700 7925

12,5 13550 13450 13500 13650 13200 13100 5 27250 27250 28000 27500 26250 25875

2,5 45250 45500 47250 45750 42500 42000 1,25 74000 73500 73500 73000 67000 65000

0,625 116000 115000 117000 114000 103000 96000 0,25 197500 195000 192500 187500 167500 147500 0,125 285000 280000 265000 265000 225000 195000


--To 220000 -, -- T 48

200000 -i -- T15

-- T3Q _ 180000 ~ -- T

N 60

..ê 160000 -- T 90 Z '-"

O 140000 .-c Q) 120000 E C1l ..c 100000 (ij Cf)

80000 "u Q)

60000 "O C1l U< 40000 ... O U.

20000

O O 5 10 15 20 25


220000 ..., --To

2000001 --T

gO

_ 180000 N

E 160000 ""-

Z '-' o 140000 -c:: Q) 120000 E C1l

100000 ..c (ij Cf)

80000 "u Q)

60000 "O C1l t)o 40000 ... o U.

20000

o o 5 10 15 20 25



kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de

natrosol®, embaladas · em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a

25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo)

apenas os To e T 90"

173

174



embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à

temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.


(cm-1) To T48 T15 T30 T60 T90

--0,125 290000 280000 295000 295000 285000 295000 0,25 202500 205000 207500 212500 202500 212500 0,625 113000 112000 114000 115000 111000 114000 1,25 69500 70000 71500 72500 68000 70500 2,5 49250 50500 51250 53500 50500 53500 5 28750 29500 29750 30750 29000 31000

12,5 14000 14100 14000 14550 13650 14650 25 7975 8050 8100 8175 8025 8600

25 7900 8000 7800 8225 7875 8350 12,5 13550 13600 13250 14050 13600 14400

5 27250 27750 27375 28250 26875 28750

2,5 45250 47000 46250 47500 45500 48250

1,25 74000 75000 73000 77000 73000 77000

0,625 116000 116000 118000 121000 113000 121000

0,25 197500 195000 197500 205000 185000 197500

0,125 285000 280000 280000 290000 260000 290000


--To --T

48

220000~ --T

15

200000 --T

30

~ 180000 --T

60

--TgO

~ 160000 O - 140000 c: Q)

E C'II

120000 .c ro 100000 Cf)

"ü 80000 Q)

"O 60000 C'II O>

40000 ..... O LL

20000

O O 5 10 15 20 25


2200001 --To --T

gO 200000

~ 180000

--Z 160000 .......,. o

140000 -c: Q)

E 120000 C'II .c 100000 (ij Cf)

"ü 80000 Q) "O 60000 C'II o- 40000 L-

o LL

20000

o o 5 10 15 20 25



ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente

gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno) ,

armazenadas em armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes

tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e T 90"

175

176


1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos

(poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.


(1Is) To T48 T15 T3Q T60 T90

0,125 180000 180000 165000 180000 175000 160000 0,25 120000 117500 115000 122500 122500 115000

0,625 71000 68000 69000 76000 78000 80000 1,25 43000 43500 44500 47000 48000 51000 2,5 25750 26250 27750 29250 31000 34000 5 18000 18625 19875 21000 22125 26125

12,5 9000 9950 10800 11850 12800 14700 25 5075 5725 6625 7600 8400 9775 25 5150 5800 6850 7825 8600 9950

12,5 8900 10100 11300 12300 13100 14300 5 16375 16875 17375 17875 19500 20125

2,5 23500 24250 23750 24750 27000 28250 1,25 34500 34500 34500 35500 39000 39500

0,625 47000 50000 48000 49000 56000 56000 0,25 77500 77500 77500 82500 92500 87500

0,125 105000 115000 120000 130000 125000 125000


260000 - - To --T

48 240000 --T

15 ---. 220000 --T

30 N

E 200000 --TSO --z

......... 180000 --TgO O

C 160000 Q)

E 140000 CIl ,f; 120000 CIl ,!!! 100000 u Q) 80000

"O

~ 60000 L-

O 40000 LL

20000

O O 5 10 15 20 25


260000~ - -T o 240000 --T

gO

---. 220000 N

..§ 200000 Z ......... 180000 O - 160000 c: Q)

E 140000 CIl ,f; 120000 CIl til 100000 '13 Q)

"O 80000

CIl u. 60000 L-o 40000

LL 20000

O O 5 10 15 20 25



ácido kójico 1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em

potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos

diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e

Tgo,

177

178


1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos

(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.


(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90

0,125 180000 180000 180000 170000 170000 160000 0,25 120000 115000 115000 117500 112500 110000

0,625 71000 68000 68000 70000 71000 72000 1,25 43000 41500 42000 43500 44000 44500 2,5 25750 25500 27250 27000 27750 · 28250 5 18000 18375 19500 19750 20125 20625

12,5 9000 9100 10000 10550 11150 11850 25 5075 5350 6075 6575 7000 7500 25 5150 5325 6275 6750 7250 7775

12,5 8900 9550 10600 11300 11900 12250 5 16375 17000 16625 19000 18375 19125

2,5 23500 22250 23750 25000 25250 26500 1,25 34500 32000 35000 36500 36000 37000

0,625 47000 45000 50000 52000 51000 53000 0,25 77500 75000 82500 82500 82500 85000

0,125 105000 110000 120000 120000 125000 130000


200000 -I --TO --T

48

1~OOO~ --T15

«' --T30 ~ 160000

--TOO

'-'" 140000 --T90 O -c: 120000 Q)

E co :5

100000

CO fi) 80000 ·ü Q) 60000 "C CO e' 40000 O

U. 20000

O O 5 10 15 20 25


200000 -I --To

180000 ' --TgO

",-

E 160000 --Z '-'" 140000 o ... c: 120000 Q)

E ca 100000

.I::. (ij fi) 80000 ·ü Q) 60000 "C

CO o- 40000 .... o

u.. 20000

O O 5 10 15 20 25



ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em

potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes

tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.

179

180


1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos

(poliestireno), armazenadas em armário à temperatura ambiente, nos diferentes

tempos de leitura.

--Gradiente de Viscosidade (cPs)*velocidade

(1/s) To T48 T15 T30 T60 Too--0,125 180000 190000 170000 165000 165000 1600000,25 120000 120000 112500 112500 112500 110000

0,625 71000 69000 68000 69000 70000 700001,25 43000 43000 42000 43500 43000 425002,5 25750 26250 26000 27000 27250 277505 18000 18500 18875 19500 19500 19875

12,5 9000 9350 9750 10300 10700 1100025 5075 5475 5900 6350 6600 695025 5150 5275 5925 6575 6850 7125

12,5 8900 9600 10400 10950 11500 118505 16375 17125 17500 17625 18500 19250

2,5 23500 23250 23500 24250 25000 255001,25 34500 35000 33000 34000 36500 36000

0,625 47000 50000 46000 48000 52000 510000,25 77500 80000 75000 80000 85000 80000

0,125 105000 120000 115000 120000 125000 120000


200000 --, --TO

180000 -l --T

48 --T

15

160000 ~ --T30

O 140000

--T60 -C --TgO Q)

E 120000 CU .c CU U)

100000 ' (3 Q) 80000 'O

~ 60000 lo....

O lL.. 40000

20000

O O 5 10 15 20 25

200000.., Gradiente de velocidade (1/s) --T

1800001 o

--TgO ","'-'" 160000 E --Z 140000

'--'"

O - 120000 C Q)

E 100000 CU .c CU 80000 U)

'(3

Q) 60000 'O

~ 40000 lo.... O

lL.. 20000

o o 5 10 15 20 25



kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes

plásticos (poliestireno), armazenadas em armário fechado à temperatura

ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo)

apenas os To e T 90.

181

182


1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos

(poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.


(cm-1) To T48 T15 T30 T60 T90

--0,125 610000 625000 580000 555000 495000 295000 0,25 412500 425000 405000 400000 360000 227500

0,625 220000 226000 217000 215000 197000 140000

1,25 138000 159000 160000 160000 149000 93000 2,5 89000 91000 89000 93000 86000 63000 2,5 85000 90250 86250 87000 82500 65500 1,25 141000 154000 146500 150000 139000 106000

0,625 227000 252000 238000 238000 214000. 154000

0,25 437500 462500 432500 415000 385000 245000

0,125 660000 710000 645000 630000 565000 335000


- - To 240000 --T

48 220000 -- T

15

N- 200000 --T30

E T60 --- 180000 Z --T90

....... O 160000 -r= Cl> 140000 E co 120000 ~

ro 100000 CIl '(3

80000 Cl>

"O CO 60000 C» .... 40000 O

U. 20000

O 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5


240000

2200001 -- To --T

90 200000

~ 180000 Z ....... 160000

~~~ O -r= 140000 Cl> E 120000 CO ~

ro 100000 CIl

~ '(3

80000 Cl>

"O 60000 CO C» .... 40000 O U.

20000

O 0,0 0,5 1,0 1,5 2 ,0 2,5



ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em

potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos

diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To

e T90 ,

183

184


1%, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos

(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.

Gradiente de Viscosidade (cPs)*velocidade

(cm-1) To T48 T15 T3Q T60 Too

--0,125 610000 630000 580000 575000 580000 5700000,25 412500 435000 395000 412500 425000 397500

0,625 220000 229000 209000 223000 225000 2100001,25 138000 156000 152000 156500 166000 1405002,5 89000 89500 85500 87750 89250 887502,5 85000 87000 83750 87750 89750 875001,25 141000 149500 138000 146000 148000 146500

0,625 227000 248000 223000 241000 245000 2370000,25 437500 452500 400000 445000 445000 4125000,125 660000 700000 610000 670000 675000 625000


240000 --T

O

220000 --T

48 --T

15 200000 --T

30 ..--.. N

E 180000 - - T60 -Z --T90 '-" 180000

O .-c Q)

140000

E 120000 tU ..c tU 100000 (/) .(3

80000 Q)

""O 60000 ~ L.. 40000 O

I..L 20000

O

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5


240000

220000 1 --To

200000 --Too

..--.. N

E 180000 -Z '-" 160000 o .-c Q)

140000

E 120000 tU ..c cu 100000 (/) .(3

80000 Q)

""O tU

60000 t» ... 40000 o

I..L 20000

o 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5



ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em

potes plásticos (poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes

tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.

185

186


1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos

(poliestireno) , armazenadas em armário à temperatura ambiente, nos diferentes

tempos de leitura.


(1/s) To T48 T15 T30 Tao T90

0,125 610000 650000 580000 685000 695000 625000 0,25 412500 435000 400000 465000 477500 452500 0,625 220000 229000 212000 242000 248000 237000 1,25 138000 157000 149000 164000 168000 160000 2,5 89000 92000 83000 93000 93750 93500 2,5 85000 87500 84500 90500 95000 92000 1,25 141000 143000 142000 155000 159500 155000

0,625 227000 246000 231000 256000 258000 254000 0,25 437500 447500 420000 477500 482500 467500 0,125 660000 710000 630000 735000 770000 710000


240000

220000

N"' 200000 E -- 180000 Z -O 160000 ..... I::

140000 ai E ('tl 120000

..r:: (ii 100000 cn '(3

80000 -1 P ai

" ('tl 60000 (.)o> .... 40000 O ~

20000

O 0,0 0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Gradiente de velocidade (lIs)

240000 ~ 220000

--To --T

gO N- 200000 E -- 180000 ~ O 160000 ..... I:: ai 140000 E ('tl 120000

..r:: (ii 100000 cn ' (3

80000 ai

" ('tl 60000 (.)o> .... 40000 O ~

20000

o 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5



ácido kójico 1 % , usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em

potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em armário fechado à

temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em

destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.

187

6. DISCUSSÃO

BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

188

o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um método de

análise e estudo de estabilidade de ácido kójico associado ou não a ácido glicólico

em formulações tópicas.

o ácido kójico é um agente despigmentante usado em formulações tópicas no

tratamento de hiperpigmentações cutâneas (STULBERG et aI., 2003; VICTOR et aI.,

2004; CAYCE et aI., 2004). Vários métodos analíticos para dosagem do ácido kójico

foram relatados na revisão da literatura (MAJMUDAR et al.,1998; KIMURA et aI.,

2000; SOTIOFATIORI; ANZOLDI, 2000; SATO et aI., 2000; MASSE et aI., 2001;

SHIH, 2001; SHIH; ZEN, 1999; MANABE et aI., 1988; YAMAMOTO et aI., 1997)

entretanto, até o presente momento, nenhum se utilizou da espectrofotometria no

ultravioleta, método mais simples e acessível, para a sua determinação.

O ácido glicólico é um agente esfoliante (VAN SCOTI; YU, 1989;

MANALOTO; ALSTER, 1999; USUKI et aI., 2003; STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004)

empregado em associação ao ácido kójico com o objetivo de potencializar sua ação,

sendo ele também inibidor direto da síntese de melanina.

Não há na literatura, até o presente momento relato de método analítico para

determinação dos ácidos kójico e glicólico associados.

O trabalho experimental foi iniciado pela caracterização físico-química das

substâncias de referência e matérias-primas, mediante o emprego de métodos

espectrométricos e de análise térmica.

Os espectros na região do infravermelho das matérias-primas e das

substâncias de referência (fig.1-4) apresentaram as bandas de absorção na região

de 4000 a 625 cm-1 (usada para identificação de estruturas) nos comprimentos de

onda característicos dos espectros relatados na literatura (POURCHET, 1975). O

ácido glicólico matéria-prima, por se apresentar comercialmente na forma de solução

aquosa 70%, mostrou um alargamento da banda na região de deformação de 3200-

3600, característica da função -OH, em razão da influência das moléculas de H20

presentes na matéria-prima, que apresentam deformação (banda) na mesma região.

189

Ao ser analisado por espectrofotometria no ultravioleta, o espectro do ácido

kójico substância de referência apresentou picos em 216,4 e 268,6 nm (fig.6). O

espectro do ácido kójico usado como matéria-prima (fig.5) revelou o mesmo perfil,

quando comparado ao da substância de referência.

O espectro do ácido glicólico não produziu um pico característico de

absorção, mesmo à concentração de 100 1-1 gIm L, revelando sua baixa absortividade

na região do ultravioleta (fig.7). Tal resultado frustrou a expectativa de

desenvolvimento de um método de análise das duas substâncias em conjunto por

espectrofotometria UV.

A partir das condições experimentais utilizadas, as curvas de análise térmica

do ácido glicólico substância de referência (fig.10) demonstraram que a espécie foi

termoestável até a temperatura de 80°C (curva TG/DTG), seguindo-se depois a

ocorrência de um evento de perda de massa, caracterizado na curva DSC como um

evento de decomposição endotérmica, com pico em 160,5°C. A existência de um

pico fino a 77,34°C na curva DSC, sem evento de perda de massa correspondente,

caracteriza a fusão da substância, valor este de acordo com o relatado na literatura

para o ácido glicólico (77-79°C). Não foram obtidas as curvas da matéria-prima em

solução a 70% em função da interferência da perda de massa da água a

temperatura inferior a 100°C.

Para o ácido kójico substância de referência (fig.8), observou-se que a

espécie é termoestável até aproximadamente 160°C, seguido de um evento de

decomposição endotérmica com pico a aproximadamente 240°C. A observação da

curva DSC também evidencia a fusão da substância a 152,62°C (pico fino

endotérmico sem evento de perda de massa correspondente na curva TG/DTG),

muito próximo à faixa encontrada para a substância na literatura (153-154°C). A

observação das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria-prima (fig.9) revelou

similaridade quando comparadas às curvas da substância de referência, tendo a

fusão ocorrido a 152,75°C.

Com o objetivo de avaliar possíveis interações entre os ácidos kójico e

glicólico, foram obtidas curvas TG/DTG e DSC da mistura física de ambos, nas

proporções 1: 1 e também 5: 1, mesma proporção utilizada nas formulações (fig.11 e

190

12). Quando observadas em conjunto (fig.13 e 14) o perfil das curvas não mostrou

mudanças significativas, que pudessem indicar a presença de alguma interação

entre as espécies.

A cinética de degradação dos ácidos foi avaliada mediante a realização de

curvas isotermas por termogravimetria. A mistura física dos ácidos glicólico e kójico

na proporção de 5: 1 foi submetida a aquecimento à temperatura constante (65, 70,

75, 80 e 90°C) por período de tempo suficiente para ocorrência de perda de massa

de 10% (fig.15). Os dados de In t (min) e 1fT (OK1) obtidos foram usados para

construção do gráfico de Arrhenius (~ = 0,9978) ilustrado na fig.16. A partir do valor

de inclinação obtido (coeficiente b) a energia de ativação E foi calculada como sendo

de 90,7 KJ.mor1. O tempo de vida útil extrapolado a 25°C foi de 14,7 dias, sugerindo

a instabilidade da mistura nas condições experimentais utilizadas (temperatura

constante). Tais resultados confirmam a relatada instabilidade do ácido kójico e

podem explicar a dificuldade de obtenção de formulações estáveis contendo o ativo,

embora a cinética de degradação de substâncias puras pode diferir em muito do que

ocorre na matriz de uma formulação cosmética. A contribuição do ácido glicólico na

cinética de degradação da mistura merece ser objeto de futuras investigações.

A partir da caracterização das matérias-primas, diversas formulações

contendo ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico foram preparadas e

avaliadas com a finalidade de selecionar as mais estáveis para o estudo de

estabilidade acelerada. Foram testadas formulações à base de creme não iônico e

aniônico e também na forma gel (gel de hidroxietilcelulose e gel de amigel®). A

literatura relata vasta mente a instabilidade do ácido kójico à temperatura, luz e pH.

Foram testados diferentes tipos de antioxidantes (ácido ascórbico, metabissulfito de

sódio, sulfito de sódio e BHT), em diferentes concentrações, alcalinizantes (hidróxido

de amônia e hidróxido de sódio), bem como substâncias fotoprotetoras (dióxido de

titânio, filtros solares UVA e UVB). Foram empregados ainda EDTA (agente

sequestrante), usando-se tampão citrato pH 3,5 com o objetivo de manter as

formulações dentro da faixa de pH na qual o ácido kójico se manteria mais estável

(3,0-5,0).

A análise dos caracteres organolépticos das formulações (tabelas 1-12)

mostrou que o creme não iônico e gel de hidroxietilcelulose são os excipientes mais

191

apropriados para a incorporação tanto do ácido kójico isolado como também

associado ao ácido glicólico, consideradas as duas formas de armazenagem usadas

no estudo preliminar (estufa a 45°C e exposto à luz à temperatura ambiente). EDTA,

metabissulfito de sódio e tampão citrato pH 3,5 foram os adjuvantes que

apresentaram os melhores resultados para ambas as formulações, creme e gel.

Ainda assim, as formulações selecionadas apresentaram algum grau de alteração na

cor, especialmente as submetidas à estufa a 45°C. A formulação contendo ácido

kójico a 1 % veiculado em gel de hidroxietilcelulose apresentou valores de pH mais

elevados, e em função da impossibilidade de mudança na concentração do tampão

para as demais formulações na forma creme (emulsões apresentam instabilidade

frente a altas concentrações de eletrólitos), foi mantida no estudo por ainda se

encontrar na faixa de pH de estabilidade do ácido kójico.

Os experimentos também demonstraram uma possível interação do hidróxido

de amônia com os demais constituintes da formulação, o que resultou na seleção do

hidróxido de sódio como agente alcalinizante.

A partir da seleção das formulações ácido kójico 1 % associado a ácido

glicólico 5% creme não iônico, ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel de

natrosol®, ácido kójico 1 % creme não iônico e ácido kójico 1 % gel de natrosol®,

passou-se ao desenvolvimento do método de análise.

A caracterização do ácido glicólico revelou que o mesmo não possui

absortividade significativa na região do ultravioleta, o que restringiu o

desenvolvimento de método analítico por espectrofotometria UV ao ácido kójico, cuja

varredura resultou no aparecimento de dois picos, a 216,2 e 268,6 nm.

O uso de espectrofotometria direta no UV para dosagem de ácido kójico nas

formulações propostas não foi possível em função dos excipientes usados

absorverem na mesma região do espectro que o analito (fig.22 e 24).

A obtenção dos espectros em derivada de primeira ordem, usando-se metanol

como solvente, permitiu escolher o ponto de anulação das formulações creme e gel

base (método "zero crossing") a 256,8 nm (fig.23 e 25). Posteriormente a

interferência foi identificada como sendo relativa aos parabenos presentes na

formulação. A observação do espectro produzido para a amostra submetida a 45°C

192

por 30 dias a fim de verificar a interferência de possíveis produtos de degradação,

não mostrou alteração na característica e formato do espectro obtido por derivada de

1 a ordem (fig.27). Embora não muito sensível, a análise do espectro derivado pode

ser usada como método indicativo da presença de produtos de degradação

(BAKSHI; SINGH, 2002).

A curva de calibração do ácido kójico obtida por espectrofotometria derivada

de primeira ordem (fig.18-21), na faixa de concentração de 2 a 18 1-1 gIm L,

apresentou coeficiente de correlação linear (r) de 0,9997.

o percentual de recuperação médio do ácido kójico na amostra creme a 1 %

por espectrofotometria derivada de primeira ordem foi de 103,00% com desvio

padrão relativo (DPR) médio de 0,19% (tabela 14). O teor de ácido kójico no creme

foi de 98,38 % com DPR médio de 0,41 % (tabela 16), revelando boa precisão do

método.

Para a amostra ácido kójico gel 1 % o percentual de recuperação variou de

99,00 a 101,00%, apresentando DPR médio de 0,20% (tabela 15). A precisão do

método para a amostra gel, com teor de 97,53%, foi de 0,49% de DPR (tabela 17).

A cromatografia líquida de alta eficiência foi proposta para quantificação dos

ácidos kójico e glicólico associados nas formulações descritas anteriormente.

Sendo o ácido glicólico substância altamente polar, o modo reverso foi o

adotado. Além disso, uma coluna C18 com capeamento polar foi selecionada em

função de proporcionar maior retentividade de compostos extremamente hidrofílicos.

O capeamento polar também permite a utilização de fases móveis com pouco ou

nenhum solvente orgânico, sem que haja risco para a integridade da coluna.

O ácido glicólico foi determinante na seleção do comprimento de onda de

detecção. Foi utilizado o comprimento de onda de 220 nm em função da região de

absorção do ácido glicólico compreender a faixa de 210 a 220 nm, coincidindo com o

primeiro dos dois picos de absorção do ácido kójico (216,2 nm) na região do

ultravioleta.

Muitos solventes e tampões absorvem na faixa de 205-230 nm, produzindo

interferência na detecção, traduzida pela eluição de picos espúrios na frente da fase

193

móvel (SNYDER et aI., 1997). Uma vez que a interferência é menor à medida que o

comprimento de onda aumenta, foi selecionado o valor de 220 nm. Em função da

acetonitrila apresentar um valor de "cutoff' (comprimento de onda abaixo do qual o

solvente absorve mais de 1,0 unidade de absorbância numa célula de 1 cm de

caminho óptico) maior que o do metanol, ela foi preferida como solvente orgânico.

Em função do caráter ácido dos analítos, a fase móvel foi preparada com

adição de tampão, a fim de manter estável o pH do sistema. Segundo SNYDER et

aI. (1997), a escolha do tampão deve considerar: capacidade tampão, valor de

"cutoff', solubilidade, estabilidade, interação com a amostra e com a coluna,

volatibilidade e corrosão do sistema entre outros.

o tampão fosfato (pKa1 = 2,1; pKa2= 7,2 e pKa3= 12,3) foi preferido em

relação aos tampões acetato e citrato também em função de apresentar um menor

valor de "cutoff' (fosfato < 200 nm; acetato 210 nm; citrato 230 nm). O tampão citrato

(pKa1 = 3,13; pKa2= 4,76 e pKa3= 6,40), apesar de não ser inorgânico e portanto

mais solúvel na presença de solventes orgânicos, e de possuir uma ampla faixa de

utilização em função de suas 3 faixas de pKa, foi evitado também pela possibilidade

de atacar as superfícies de aço inox do equipamento. Dos sais de fosfato, o de sódio

não é geralmente utilizado, em função de sua menor solubilidade (SNYDER et aI.,

1997; SCHELLlNGER; CARR, 2004). Uma vez que o tampão fosfato de potássio

apresentou sinais de precipitação durante o desenvolvimento do método, foi

substituído pelo sal de amônio.

A variação do pH da fase móvel foi usada para promover a seletividade e a

retenção, a partir do conhecimento dos valores de pKa dos compostos: 3,83 para o

ácido glicólico e 7,9 e 8,03 para o ácido kójico.

A elevada polaridade do ácido glicólico restringiu o método ao uso de fases

móveis com baixo pH (abaixo do pka de 3,83). Isso porque a forma não dissociada

do mesmo apresenta caráter mais apoiar, favorecendo a retenção na coluna de fase

reversa. O pH foi variado dentro da faixa de ± 1,0-1,5 unidades do valor do pKa do

tampão, faixa na qual os tampões são mais eficazes em manter o pH.

A baixa retentividade do ácido glicólico também implicou na adição de pouco

solvente orgânico na fase móvel. Entretanto, não foi possível o uso de um sistema

194

totalmente aquoso em função da característica menos polar do ácido kójico e sua

maior retentividade na coluna.

Os sistemas de 1 a 12 (tabela 18 e 19) não foram capazes de promover a

retenção satisfatória do ácido glicólico. O fator de retenção (k) foi menor que 0,1

nesses sistemas, mesmo a pH tão baixo quanto 2,00 e usando baixa concentração

de solvente orgânico. A eluição do ácido glicólico ocorreu próximo do tempo morto

da coluna, sofrendo interferência dos constituintes da fase móvel.

Apenas com o uso do reagente de pareamento iônico brometo de

tetrabutilamônio (TBA) foi possível aumentar o fator de retenção para valores da

ordem de 0,2.

Quando o pareador iônico foi usado a 2 mM em tampão fosfato de amônia 30

mM pH 2,20, fases móveis 13 e 14, os valores de k para o ácido glicólico foram de

0,19 e 0,20, respectivamente.

Na fase móvel 13, desprovida de solvente orgânico, o tempo de retenção do

ácido kójico foi muito elevado, da ordem de 11 ,3 minutos. Além disso, interferentes

das formulações como EDTA e ácido cítrico eluíram próximos do pico do ácido

kójico, em 11 ,76 e 11,92 minutos, respectivamente.

Na fase móvel 14, já com a adição de 2% de acetonitrila, a retenção do ácido

kójico baixou para 8,86 minutos, mas o pico ainda sofreu interferência do ácido

cítrico que eluiu em 8,97 minutos, tendo o EDTA eluído tardiamente (10,58 min.).

Com a finalidade de aumentar a retenção do ácido glicólico o pH do tampão

foi aumentado para 3,00 (fase móvel 15), pois quanto maior o grau de ionização do

analíto maior sua interação com o pareador iônico e conseqüentemente com a fase

estacionária. A estratégia teve como efeito positivo a elevação do fator de retenção

do ácido glicólico para 0,33 e a diminuição do tempo de retenção do ácido kójico

para 8,86 minutos.

Entretanto, a retenção dos interferentes foi aumentada em função do pH

escolhido se situar próximo ao valor do primeiro pKa do ácido cítrico (pKa1 = 3,1) e

do segundo pKa do EDTA (pKa1 = 2,07, PKa2 = 2,75, PKa3 = 6,24, PKa4 = 10,34).

195

Mais ionizados, apresentaram aumento do tempo de retenção para 12,32 minutos

(EDTA) e 13,79 minutos (ácido cítrico).

o aumento da concentração de acetonitrila de 2% para 5% levou o tempo de

retenção do ácido kójico a níveis mais adequados (6,0 minutos), mantendo o fator de

retenção do ácido glicólico em níveis aceitáveis (0,24) . EDTA e ácido cítrico tiveram

seus tempos de retenção diminuídos para 9,2 e 11,4 minutos, respectivamente,

resultando num tempo de corrida final para as amostras de 12 minutos.

o aumento da concentração de tetrabutilamônio de 2 mM para 4 mM (fase

móvel 17) não produziu melhora significativa na retenção do ácido glicólico.

Dessa maneira, a fase móvel 18 (tampão fosfato de amônio 30 mM

adicionado de TBA 2mM pH 3,OO/acetonitrila 95:5), foi selecionada para a validação

do método.

o tempo de corrida estabelecido de 12 minutos permitiu a eluição dos ácidos

glicólico (tR = 4,58 min) e kójico (tR = 6,00 min) e dos interferentes da matriz,

tornando viável sua aplicação em análises de rotina (fig.28-32).

As curvas de calibração obtidas por CLAE para o ácido glicólico (40 a 240

\-I9/mL) e para o ácido kójico (8 a 48 \-Ig/mL) a 220 nm apresentaram coeficientes de

correlação (r) de 0,9998 e 0,9999, respectivamente, demonstrando a boa linearidade

do método (tabela 20, fig.33-36). A revisão da literatura mostrou resultados de

0,9990 (9,375-150 \-Ig/mL a 270 nm) e 0,999 (0,05-100 \-Ig/mL a 270 nm) para os

trabalhos realizados por Masse et aI. (2001) e Shi (2001), respectivamente, na

determinação do ácido kójico por CLAE. Huang et aI. (2002) obtiveram para o ácido

glicólico "r" igual 0,9997 na faixa de 25-200 \-Ig/mL, Couch; Howard (2002) 0,998

entre 23,1-462 \-I gIm L, Scallia et aI. (1998) 0,998 entre 15-500 \-Ig/mL e Nicoletti et aI.

(1999a) 0,99996 para a faixa de 92-736 \-I gIm L, todos realizados com detecção a

210 nm, e Chang; Chang (2003) o valor de 0,9974 para concentrações de 8-36

\-Ig/mL a 220 nm. Trabalhando a 214 nm, De Villiers et aI. (1998) e De Villiers et aI.

(1997) encontraram valores de "r" para o ácido glicólico de 0,9998 na faixa de 50-

100 \-Ig/mL e 0,9999 na faixa de 200-1000 \-Ig/mL.

196

A análise do perfil cromatográfico das amostras ácido kójico 1 % associado a

ácido glicólico 5% creme e gel mostrou a especificidade do método, quando

comparados aos cromatogramas das formulações creme e gel base (fig.37 -40). O

cromatograma obtido da análise da amostra submetida a envelhecimento a 45°C por

30 dias não revelou a existência de outros picos (fig. 41 e 42). A pureza dos picos

analisada no detector PDA ("photo diode array detector") foi de 99,9999% para o

pico do ácido kójico e 99,9997% para o do ácido glicólico.

Para a amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme os

percentuais de recuperação médios foram de 99,9 % (DPR médio = 1,57%) para o

ácido glicólico (tabela 21) e de 102,7% (DPR médio = 0,19%) para o ácido kójico

(tabela 22).

Os percentuais médios de recuperação para a amostra ácido kójico 1 %

associado a ácido glicólico 5% gel foram de 99% (DPR médio = 0,96%) para o ácido

glicólico (tabela 23) e de 106,0% (DPR médio = 0,53%) para o ácido kójico (tabela

24).

As taxas de recuperação obtidas por CLAE apresentadas na revisão de

literatura para o ácido kójico foram de 73-96% e de 78,5-90,4% nos estudos

realizados por Kimura et aI. (2000) e Sato et aI. (2000), respectivamente. Em ambos

os estudos os pesquisadores trabalharam com matriz de alimentos.

Usando matriz cosmética, Shih (2001) relatou taxas de recuperação da ordem

de 95,2±O,99 a 101,8±2,10% e de 97,65±O,52 a 103,8±1,59% para amostras

contendo ácido kójico na forma creme e loção, respectivamente.

Diversos estudos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência foram

realizados com o objetivo de testar a recuperação de ácido glicólico em amostras

cosméticas. Os autores encontraram taxas de recuperação de 92,4-96,2% (SCALLlA

et aI., 1998), 99,6% (DE VILLlERS et aI. 1998),93% (YATES; HAVERY, 1999),98,2-

101,5% (N ICOLETTI et aI., 1999a), 98,2-100% (HUANG et aI., 2002), 100,1-109,8%

(COUCH; HOWARD, 2002) e 99,6-100,1 (CHANG; CHANG, 2003).

Para o teste de precisão realizado por CLAE foram obtidos 0,77% de desvio

padrão relativo para a determinação do teor do ácido kójico (98,69%) e de 1,81%

197

para a determinação do teor (106,85%) do ácido glicólico na amostra ácido kójico

1 % associado a ácido glicólico 5% creme (tabelas 25 e 26).

Na amostra contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% na

forma gel a determinação do ácido kójico mostrou precisão (OPR) de 1,30% (teor =

98,6%), enquanto a do ácido glicólico foi de 1,82% (teor = 105,57%), conforme

mostrado nas tabelas 27 e 28. O teor de 105,57% de ácido glicólico pode ser

explicado pelo fato da matéria-prima utilizada no preparo das amostras apresentar

se comercialmente na forma de solução a 70%, com possível concentração do teor

de ácido glicólico por evaporação da água, durante o armazenamento no laboratório.

Masse et aI. (2001) obtiveram precisão de 0,4% e 6,77% de OPR quando

testaram formulações contendo ácido kójico na forma creme por CLAE. Shih (2001)

encontrou OPR igual a 2,19%,0,38% e 0,31% para concentrações de 1, 10 e 100

ppm de ácido kójico, respectivamente, e de 0,62% em amostra comercial.

Analisando amostras comerciais Scallia et aI. (1998) e Chang; Chang (2003)

obtiveram OPR de 1,5-5,4% e de 2,2%, respectivamente, na determinação da

precisão do ácido glicólico por CLAE.

A robustez do método de cromatografia líquida de alta eficiência na

determinação dos ácidos kójico e glicólico foi também avaliada. Segundo o

instrumento Q2A do ICH (ICH, 1994) robustez de um procedimento analítico é a

capacidade de não ser afetado por pequenas, mas deliberativas, variações em

parâmetros do método, fornecendo uma indicação de sua confiabilidade durante o

seu uso rotineiro. Para tanto, em se tratando de métodos cromatográficos,

normalmente são usadas variações na temperatura, pH, tipo de coluna, parâmetros

do instrumento, etc. No presente estudo a robustez do método foi avaliada variando

se o detector POA ("photo diode array detector") para UV-VIS, em outro

equipamento.

Usando cromatógrafo líquido acoplado a detector UV-VIS, a linearidade

(coeficiente de correlação) do método foi de 0,9999 para o ácido kójico e de 0,9997

para o ácido glicólico (fig. 43 e 44). Os tempos de retenção dos analítos foram

ligeiramente maiores (tR ácido glicólico = 5,02; tR ácido kójico = 6,79), o que não

comprometeu a resolução do cromatograma.

198

As taxas de recuperação média foram de 101,05% (DPR de 0,71-1,0%) para

o ácido glicólico e de 103,78% (DPR= 0,17-0,32%) para o ácido kójico, na amostra

ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme (tabelas 29 e 30). A taxa de

recuperação média do ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % associado a ácido

glicólico 5% gel foi de 101,72% (DPR = 0,99-1,11%), conforme mostra a tabela 31.

Para o teste de precisão foram encontrados valores de DPR de 0,45% e

0,43% na determinação do ácido kójico e de 1,34% e 1,14% para o ácido glicólico

nas amostras ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e gel,

respectivamente (tabela 32).

Os resultados demonstram a robustez do método frente à variação do

detector PDA para UV-VIS.

Para a determinação de ácido kójico isolado em formulações tópicas também

foi desenvolvido um método por cromatografia líquida de alta eficiência,

empregando-se as mesmas condições experimentais utilizadas na determinação dos

ácidos associados.

O valor do coeficiente de correlação para o teste de lineàridade do ácido

kójico foi de 0,9999 (tabela 33, figo 45 e 46), demonstrando a boa linearidade do

método na faixa de concentração estudada.

A taxa de recuperação média de padrão de ácido kójico adicionado à amostra

foi de 102,7% (DPR= 0,11-0,63%) para a amostra ácido kójico 1% creme e de

102,2% (DPR= 0,42-0,52%) para a amostra ácido kójico 1 % gel (tabelas 34 e 35).

O desvio padrão relativo nas amostras creme e gel foi de 0,56% e 0,75%,

respectivamente, demonstrando a precisão do método (tabelas 36 e 37).

A comparação estatística entre os métodos desenvolvidos para a

determinação do ácido kójico isolado em formulações cosméticas foi feita quanto aos

parâmetros de precisão e exatidão, aplicando-se os testes F e t emparelhado,

respectivamente. Ao nível de 95% de confiança não houve diferença

estatisticamente significante entre a cromatografia líquida de alta eficiência e a

espectrofotometria derivada de primeira ordem quanto aos parâmetros avaliados

(tabela 38).

199

Com a finalidade de avaliar a estabilidade das formulações desenvolvidas

contendo ácido kójico associado ou não a ácido glicólico na forma creme e gel, um

estudo de estabilidade acelerado foi conduzido, sendo as formulações armazenadas

em estufa a 40±2°C e expostas à luz a 25±2°C. Uma vez que as formulações

testadas são formas semi-sólidas de base aquosa, acondicionadas em embalagem

semi-permeável, não foram submetidas à condição de 75% de umidade relativa

(UR). O controle de perda de umidade foi feito através da pesagem das embalagens

antes e depois do experimento, tendo sido considerada na correção dos cálculos de

teor das formulações.

O estudo foi conduzido por 90 dias, de acordo com as recomendações do

Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA (BRASIL, 2004a). As

análises de avaliação dos caracteres organolépticos, pH, doseamento e

comportamento reológico foram realizadas nos To, T 48, T15, T30, T 60 e Tgo.

Simultaneamente ao estudo acelerado, as amostras também foram

armazenadas em armário fechado, à temperatura ambiente, para avaliar o

comportamento das mesmas em condições normais de armazenamento.

Diferentemente do estudo preliminar de estabilidade que visa selecionar as

formulações, orientando desta maneira o pré-desenvolvimento da formulação, o

estudo de estabilidade acelerado pode ser usado de forma auxiliar na determinação

do prazo de validade da formulação, ou determiná-lo de forma provisória, até que o

estudo de longa duração (teste de prateleira) seja realizado. Segundo o Guia para

Realização de Estudo de Estabilidade da ANVISA (BRASIL, 2004b) o estudo é

projetado para acelerar a degradação química ou mudanças físicas de um produto

farmacêutico em condições forçadas de armazenamento. Os dados assim obtidos,

juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa duração, podem ser

usados para avaliar efeitos químicos prolongados em condições não aceleradas e

para avaliar o impacto de curtas exposições a condições fora daquelas

estabelecidas no rótulo do produto, que podem ocorrer durante o transporte.

O mesmo guia estabelece um prazo de validade provisório de 24 meses

quando o estudo de estabilidade acelerado foi realizado e nenhuma mudança

significativa foi observada, condicionado à apresentação imediata dos resultados do

200

estudo de prateleira quando o mesmo for finalizado. Quando mudanças significativas

ocorrem no estudo de estabilidade acelerado, este deverá ser desconsiderado,

devendo prevalecer os dados do estudo de longa duração. Por mudança significativa

são definidos, entre outros, a perda de 5% em relação ao teor inicial do lote, pH do

produto fora do limite especificado, não atendimento às especificações para

aparência e propriedades físicas como cor, separação de fase, dureza, etc.

o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA (BRASIL, 2004a)

menciona ainda que devido à natureza particular das formulações dos produtos

cosméticos, se aceita como regra geral, a impossibilidade da eleição de um

ingrediente isolado do restante da formulação, tornando difícil a aplicação da relação

entre constante cinética, temperatura e uma correlação direta dessas variáveis com

o prazo de validade estimado.

No caso de produtos manipulados, a RDC 33 da ANVISA (BRASIL, 2001)

estabelece que as farmácias de manipulação estimem o prazo de validade das

formulações a partir da realização de estudos de estabilidade ou com base em

estudos técnicos científicos já realizados.

Em função de razões econômicas, de disponibilidade do produto ou de

natureza técnico-científica, muitas vezes os médicos prescrevem formulações para

serem manipuladas extemporâneamente (VERMEULEN et aI., 1999). Os ácidos

kójico e glicólico são ativos freqüentemente encontrados em prescrições médicas

aviadas em farmácias de manipulação no Brasil. Em geral, os excipientes utilizados

para incorporá-los são os mesmos utilizados no presente estudo.

Quatro formulações foram selecionadas no estudo preliminar e submetidas

ao estudo acelerado de estabilidade: ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%

e ácido kójico 1 %, nas formas creme não iônico e gel de natrosol®.

Ao final dos 90 dias do estudo, a avaliação dos caracteres organolépticos

revelou que apenas as formulações armazenadas a 40±2°C apresentaram sinais

visíveis de degradação, com desenvolvimento de coloração bege a levemente

amarelada. As formulações expostas à luz a 25±2°C ou armazenadas em armário

fechado à temperatura ambiente mantiveram a coloração apresentada no início do

estudo (tabelas 39 a 42).

201

A análise de pH (tabelas 43 a 46) não mostrou mudanças significativas para a

maioria das formulações, nas 3 condições de armazenagem, quando se compara o

pH no To e ao final do estudo (T 90) . Em todos os casos as alterações não foram

maiores que ±0,4 unidades de pH. A formulação ácido kójico 1 % creme apresentou

valor de pH menor 3,5 pH quando armazenada em estufa a 40±2°C, o que ocorreu

também quando exposta à luz a 25±2°C (tabela 45). As formulações contendo ácido

glicólico mantiveram o pH acima de 3,5, em conformidade com as recomendações

internacionais. Os resultados também sugerem uma tendência de aumento do pH,

com o decorrer do tempo de armazenagem, para as formulações contendo os dois

ácidos associados e uma tendência de queda para aquelas contendo apenas o

ácido kójico (exceto para o gel armazenado em armário a temperatura ambiente).

A queda de pH em níveis menores que 3,5 na formulação ácido kójico 1 %

creme não iônico após 90 dias nas condições de envelhecimento acelerado

evidencia que o tampão citrato 1 M pH 3,5 usado a 10% na formulação, não foi

suficiente para impedir variações do pH de tal ordem.

A análise do teor das formulações usando o método de cromatografia líquida

de alta eficiência mostrou declínio no teor de ácido kójico em quase todas as

situações.

Os dados obtidos (tabelas 47 a 50) indicam que a degradação média do

ácido kójico armazenado em estufa a 40±2°C não foi estatisticamente diferente ao

nível de significância de 0,05 da que ocorreu em luz a 25°C, exceto para a amostra

creme contendo os 2 ácidos associados, que revelou queda importante do teor de

ácido kójico já no T15, sugerindo para essa amostra uma condição muito drástica de

armazenamento. Embora a diferença entre a média do teor remanescente de ácido

kójico entre duas condições aceleradas não tenha sido estatisticamente significante,

os resultados sugerem uma diferenciação, em termos de uma maior degradação das

amostras armazenadas em estufa, mais ao fim do experimento.

A média de teor remanescente do ácido kójico nas amostras não foi

estatisticamente diferente (o = 0,05) quando a condição exposição à luz é

comparada com armário à temperatura ambiente, o que sugere que a embalagem

202

utilizada para acondicionamento das formulações exerceu efeito protetor contra a

ação da luz.

Quando comparada à condição armário, a degradação do ácido kójico em

estufa resultou em médias de teores remanescentes estatisticamente menores,

evidenciando que a temperatura exerceu efeito importante sobre a degradação das

amostras.

Quando as quatro amostras foram comparadas entre si, não houve diferença

entre a média de teor remanescente de ácido kójico (o = 0,05) apresentada,

independente da condição de armazenagem, para as amostras contendo ácido

kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% na forma creme e gel e ácido kójico 1 %

creme. A amostra ácido kójico 1 % gel (tabela 50) apresentou teor remanescente

médio acima das demais em todas as condições de armazenagem, mas não foi

estatisticamente diferente da amostra gel contendo os dois ácidos associados

(tabela 48) Tais resultados sugerem uma tendência de menor degradação média

para as formulações na forma gel.

Esse resultado talvez possa estar correlacionado ao pH das formulações uma

vez que as amostras na forma gel mantiveram uma faixa de pH ligeiramente superior

durante o estudo, especialmente a formulação ácido kójico 1 % gel, sugerindo que

um valor de pH mais elevado possa ser mais favorável quanto à manutenção da

estabilidade do ácido kójico.

Considerados os resultados apresentados ao final do T90 e o que dispõe a

legislação (BRASIL, 2004b), as formulações armazenadas a 40±2°C apresentaram

queda de teor acima dos 5% de tolerância em relação ao teor original, sendo 18,7%

para ácido kójico 1 % creme não iônico, 13,8 % para ácido kójico 1 % associado a

ácido glicólico 5% creme não iônico, 9,6% para ácido kójico 1 % associado a ácido

glicólico 5% gel de natrosol® e 6,4 % para ácido kójico 1 % gel de natrosol®. Ambas

as formulações na forma creme também mostraram redução de teor acima de 5%

quando expostas à luz a 25±2°C, sendo de 12,6% para o creme contendo apenas o

ácido kójico e de 8,9% para o creme contendo os dois ácidos associados. Nessa

condição de armazenagem, as duas formulações na forma gel mantiveram-se na

faixa de até 5% de perda de teor.

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COZ

204

pudesse ter sido originado por um produto de degradação do ácido kójico não

detectado pela análise de pureza do pico realizada com o detector POA. A literatura

aponta que o detector POA não é muito sensível e pode ser incapaz de detectar

interferentes em concentração < 1 % (BAKSHI; SINGH, 2002). A temperatura de

45°C usada para o envelhecimento da formulação por 30 dias, submetida depois ao

teste de especificidade, pode também não ter sido suficiente para provocar o

surgimento dos produtos de degradação em concentrações detectáveis pelo

método. Entretanto, não parece serem essas as respostas para o aumento do teor

do ácido glicólico verificado no estudo de estabilidade. Isso porque, se observados

os resultados das tabelas 47 e 48, o aumento do teor do ácido glicólico ocorreu de

maneira expressiva mesmo nas condições de armazenagem onde a degradação do

ácido kójico foi mínima.

Uma outra questão pode estar relacionada com a forma como o ácido

glicólico é disponibilizado comercialmente. O laudo fornecido pela empresa que

cedeu a matéria-prima menciona teor de 70%-72% de ácidos totais e 64,1-66,7% de

ácidos livres. Segundo um dos fabricantes da matéria-prima (OUPONT, 2005) o

ácido glicólico pode reagir com ele mesmo para formar glicolídios diméricos,

poliglicolídeos e carboximetil-hidroxiacetatos, os quais podem hidrolisar

gradualmente em meio aquoso. Se a diferença entre o teor de ácidos totais e livres

se refere à forma polimerizada, isso talvez ajudasse a explicar o aumento do teor,

pois a hidrólise da forma cíclica poderia estar, com o tempo, levando à "liberação"

da forma livre.

A ocorrência desses fatos e a real implicância dos mesmos na elevação do

teor do ácido glicólico devem ser objeto de investigação futura.

A estabilidade física das formulações foi avaliada no estudo acelerado através

do comportamento reológico (tabelas 51 a 62) .

Reologia é a ciência que estuda o comportamento de fluxo, o qual pode ser

classificado em newtoniano, no qual a viscosidade é constante, e não newtoniano,

no qual a viscosidade se altera em função da força de cisalhamento aplicada (LABA,

1993).

205

Quando observadas no To, as quatro formulações avaliadas apresentaram

comportamento não newtoniano caracterizado como pseudoplástico, ou seja, aquele

no qual a viscosidade, que é a resistência ao fluxo, diminui à medida que a força de

cisalhamento aumenta.

A observação das curvas descendentes nos gráficos permite afirmar que as

quatro formulações mostraram-se tixotrópicas, ou seja, têm a recuperação de sua

estrutura dependente do tempo.

As formulações na forma gel apresentaram-se mais viscosas ou consistentes

no To quando comparadas às formulações na forma creme. Os valores iniciais de

"yield value" (força de cisalhamento mínima necessária para induzir o fluxo) também

foram aparentemente maiores para as formulações na forma gel quando

comparados aos cremes.

As formulações contendo ácido kójico associado ao ácido glicólico

apresentaram viscosidade ligeiramente menor no To, quando comparadas às

formulações contendo apenas o ácido kójico, provavelmente em função da maior

proporção de líquidos incorporados (o próprio ácido glicólico e a solução de NaOH

usada na sua neutralização).

Analisando-se nos gráficos ilustrados nas figuras de 47 a 58 as alterações

apresentadas no T 90, percebe-se que as formulações na forma creme tiveram um

aumento da viscosidade.

Embora emulsões possam ser consideradas sistemas termodinamicamente

instáveis, tais resultados podem ser explicados pelo fato de que sua estrutura sofre

alterações após o processo de fabricação, relacionados à maturação da formulação.

De maneira geral, a viscosidade das emulsões aumenta com o envelhecimento,

sendo que um aumento significativo da consistência pode ocorrer após 2 ou 3

meses de fabricação (LACHMAN et aI., 2001). Além disso, segundo Laba (1993)

tensoativos não iônicos a altas temperaturas podem sofrer mudanças moleculares,

tornando-se menos hidratados, com alteração do valor de EHL. Uma vez que o

tensoativo é fator determinante da viscosidade, emulsões expostas a essas

condições podem ser mais estáveis que à temperatura ambiente. Em adição, o

álcool cetoestearílico, presente na cera polawax® usada no creme não iônico,

206

possui uma tendência a aumentar de viscosidade com o envelhecimento da

formulação (DI MAMBRO et aI., 2003). O fato do aumento da viscosidade ter sido

maior para as formulações armazenadas a 40±2°C pode ser explicado pela maior

perda de água das mesmas nessa condição.

As formulações gel não apresentaram alterações significativas da viscosidade

ao final do estudo, quando armazenadas à temperatura ambiente ou expostas à luz

25±2°C, demonstrando boa estabilidade nessas condições. Entretanto, a 40±2°C a

viscosidade diminuiu. A hidroxietilcelulose (natrosol®) pode sofrer despolimerização

através da clivagem oxidativa das ligações glicosídeo, influenciada pela ação da luz

e temperatura (CARLOTTI et aI., 2004), o que pode explicar a diminuição da

consistência. Embora esse fato possa representar uma possível instabilidade dos

géis à temperatura, a diminuição das bolhas (presentes no gel devido ao processo

de fabricação) provocada pelo aumento da temperatura, pode ter contribuído para a

redução da viscosidade. Observadas visualmente ao final do estudo, as formulações

apresentavam ainda boa consistência (não se liquefizeram).

207

7. CONCLUSÕES

A partir dos resultados experimentais pode-se concluir que:

- as metodologias desenvolvidas para a determinação do ácido kójico isolado

por espectrofotometria derivada no ultravioleta e cromatografia líquida de alta

eficiência demonstraram boa precisão, exatidão, linearidade e especificidade,

podendo ambas ser utilizadas na análise de formulações tópicas na forma creme e

gel contendo o ativo;

- a metodologia desenvolvida para a determinação dos ácidos kójico e

glicólico associados demonstrou boa exatidão, linearidade, especificidade e

precisão, podendo ser usada na análise de formulações tópicas na forma creme e

gel contendo o ativo;

- o ácido kójico é uma substância instável e mesmo formulado na presença de

adjuvantes habitualmente relatados como estabilizadores para o ativo não suportou,

de forma geral, as condições aceleradas de armazenamento empregadas nesse

estudo. Além disso, quando associado em mistura física ao ácido glicólico, na

mesma proporção usada nas formulações, demonstrou tempo extrapolado de vida

útil a 25°C de apenas 14, 7 dias, e

- as formulações estudadas mantiveram suas características organolépticas,

estabilidade física e no mínimo 90% do teor de ácido kójico no estudo de

estabilidade quando armazenadas em condições normais, indicando que o prazo de

validade de 90 dias pode ser considerado para formulações semelhantes, em

composição e embalagem, desde que guardadas à temperatura ambiente e ao

abrigo da luz.

8. REFERÊNCIAS BIBLlOGRÁFICAS6

ACCORSI, C.A.; BlO, G. Determination of volatile and non-volatile

organic acids in technical sugar solutions by ion-exclusion

chromatography. J. Chromatogr., Amsterdam, v.555, n.1/2, p.65-

71,1991.

AGAR, N.; YOUNG, A. R. Melanogenesis: a photoprotective response

to DNA damage? Mutat. Res., Amsterdam, v.571, n.1/2, p.121-132,

2005.

AHN, K.S.; MOON, K.Y.; lEE, J.; KIM, Y.S. Downregulation of NF

kappaB activation in human keratinocytes by melanogenic inhibitors.

J. Dermatol. Sci., Amsterdam, v.31, n.3, p.193-201, 2003.

ANSEl, H.C.; POPOVICH, N.G. ; AllEN JR, L.V. Formas

farmacêuticas & sistemas de liberação de fármacos. 6.ed. São

Paulo: Editorial Premier, 2000. cap.4, p.113-173.

ARNAUD-SEBlllOTTE, L. ; SEGOT, E. Cosmetic and/or

dermatological composition containing a cationic polymeric gelling

agent and its uses for skin depigmentation. Fr. Pat. 680748, 8 novo

1995.

ARNDT, K. Manual de terapêutica dermatológica. 4.ed. Rio de

Janeiro: Medsi Editora Médica e Científica, 1990.

208

6 De acordo com a nonna NBR6023/2000, preconizada pela Associação Brasileira de Nonnas Técnicas (ABNT). As abreviaturas dos títulos dos periódicos seguem o Chemícal Abstracts Service Source Index (CASSI) 2002.

BAKSHI, M.; SINGH, S. Oevelopment of validates stability-indicating

assay methods: criticai review. J. Pharm. Biomed. Anal.,

Amsterdam, v. 28, n.28, p. 1011-1040, 2002.

BASTIAENS, M.; WESTENOORP, R; VERMEER, B.; BAVINCK, J.N.8.

Ephelides are more related to pigmentary constitutional host factors

than solar lentigines. Pigment Cell Res., Copenhagen, v.12, n.5,

p.316-322,1999.

BASTIAENS, M.; HOEFNAGEL, J.; WESTENOORP, R; VERMEER, 8.;

BAVINCK, J.N.B. Solar lentigines are strongly related to sun

exposure in contrast to ephelides. Pigment Cell Res., Copenhagen,

v.17, n.3, p.225-229, 2004.

BATTAINI, G.; MONZANI, E. ; CASELLA, L. ; SANTAGOSTINI, L.;

PAGLlARIN, R Inhibition of the catecholase activity of biomimetic

copper complexes by kojic acid. J. Biol. Inorg. Chem., Herlin, v.5,

n.2, p.262-268, 2000.

BAUMANN, L. Cosmetic dermatology: principies and practice. 1.

ed. Hong Kong: MacGraw-Hill, 2002. 226p.

BERGFELO, W.F. ; BELSITO, OV.; CARLTON, W.W.; KLAASSEN,

C.O.; SCHROETER, AL. ; SHANK, RC.; SLAGA, T.J . Final report

on the safety assessment of glycolic acid, ammonium, calcium,

potassium, and sodium glycolates, methyl, ethyl, propyl , and butyl

glycolates, and lactic acid, ammonium, calcium, potassium, sodium,

and TEA-Iactates, methyl, ethyl, isopropyl, and butyl lactates, and

lauryl, myristyl, and cetyl lactates. Int. J. Toxicol., Philadelphia,

v.17, n.1, suppl. 1, p.1-3, abstr. , 1998. (Cosmetic Ingredient Review

Expert Panel). [Review].

209

BERZEAS, J.J.; RODRIGUÉZ, J.; CASTANEDA, G. Simultaneous

determination of ethinylestradiol and levonorgestrel in oral

contraceptives by derivative spectrophotometry. Analyst,

Cambridge, v. 122, n.1, p. 41-44, 1997.

BESSOU, S.; PAIN, C.; TAiEB, A. Use of human skin reconstructs in

the study of pigment modifiers. Arch. Dermatol., Chicago, v.133,

n.3, p.331-6, 1997.

BRASIL. Ministério da Saúde. Resolução RDC nO 33, de 19 de abril de

2000 (versão republicada - 08.01.2001). A Agência Nacional de

Vigilância Sanitária aprova o Regulamento Técnico sobre Boas

Práticas de Manipulação de Medicamentos em farmácias. D.O.U. -

Diário Oficial da União, Brasília, 08 de janeiro de 2001.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

Guia de estabilidade de produtos cosméticos. Brasília: Ministério

da Saúde, 2004a. 47p. (Séries temáticas).

BRASIL. Ministério da Saúde. Resolução RDC nO 398, de 12 de

novembro de 2004. Determina a publicação do Guia para a

Realização de Estudos de Estabilidade - ANVISA. D.O.U. - Diário

Oficial da União, Brasília, 16 de novembro de 2004b.

BRAVO, G.; PABLO, J. Acido kójico: un nuevo despigmentante. Rev.

Chil. Dermatol. , Santiago, v.13, n.3, p.186-9, 1997.

BRIGANTI, S.; CAMERA, E.; PICARDO, M. Chemical and instrumental

approaches to treat hyperpigmentation. Pigment Cell Res.,

Copenhagen, v.16, n.2, p.101-110, 2003.

210

BUDAVARI, S., ed. The Merek Index - An Encyclopedia of Chemicals,

Drugs, and Biologicals. 12. ed., NJ: Merck & Co, 1996.

BUENO, G. ; REDONDO, D.; DELGADO, G.; ZAYAS, O. ; LOPEZ, M.S. ;

PEREZ, K.; GARRIGA, Y.; AGUILAR, L. Characterization and

separation of organic acids of sugarcane juice. Rev. Deriv. Cana

Azuear, Havana, v.31, n.3, p.27-31 , 1997.

CABANES, J.; CHAZARRA, S. ; CARMONA, F.G. Kojic acid, a

cosmetic skin whitening agent is a slow-binding inhibitor of

catecholase activity of tyrosinase. J. Pharm. Pharmaeol.,

Wall ingford , v.46, n.12, p.982-985, 1994.

CARLOTTI, M.E. ; ROSSATTO, V. ; GALLARATE, M.; TROTTA, M. ;

DEBERNARDI, F. Vitamin A palmitate photostability and stability

over time. J. Cosmet. Sei., New York, v.55, n.3, p.233-525, 2004.

CASS, Q.B.; DEGANI, AL.G. Desenvolvimento de métodos por

HPLC: fundamentos, estratégias e validação. São Carlos:

EdUFSCar, 2001. 77p.

CAYCE, K.A; MCMICHAEL, AJ.; FELDMAN, S.R. Hyperpigmentation:

an overview of common afflictions. Dermatol Nurs., Pitman, v.16,

n.5, p.401-416, 2004.

CHANG, M.L.; CHANG, C.M. Simultaneous HPLC determination of

hydrophilic whitening agents in cosmetics products. J. Pharm.

Biomed. Anal. , Amsterdam, v. 33, n.4, p. 617-626, 2003.

CIOLA, R. Fundamentos de eromatografia a líquido de alto

desempenho: HPLC. São Paulo: Edgard Blücher, 1998. 179p.

211

COLEMAN, W.P.; BRODY, H.J. Efficacy of low-strength glycolic acid

application in the treatment of melasma: in reply. Areh. Dermatol.,

Chicago, v.139, n.6, p.811-812, 2003. [Letter].

COTELLESSA, C.; PERIS, K; ONORATI, M.1.; FARGNOLl, M.C.;

CHIMENT, S. The use of chemical peelings in the treatment of

different cutaneous hyperpigmentations. Dermatol. Surg., New

York, v.25, n.6, p.450-4, 1999.

COUCH, L.H.; HOWARD, P.C. Quantification of glycolic acid in

cosmetics products using reversed phase high performance liquid

chromatography. Int. J. Cosmet. Sei., Oxford, v. 24, n.2, p. 89-95,

2002.

CURTO, E.V.; KWONG, C.; HERMERSDORFER, H.; GLATT, H.;

SANTIS, C.; VIRADOR, V.; HEARING, V.J .; DOOLEY, 1.P.

Inhibitors of mammalian melanocyte tyrosinase: in vitro comparisons

of alkyl esters of gentisic acid with other putative inhibitors.

Bioehem. Pharmaeol., Amsterdam, v.57, n.6, p.663-72, 1999.

DE VILLlERS, M.M.; WURSTER, D.E.; NARSAI, K Stability of lactic

acid and glycolic acid in aqueous systems subjected to acid

hydrolysis and thermal decomposition. J. Soe. Cosmet. Chem.,

Pontiac, v.48, n.4, p.165-174, 1997.

DE VILLlERS, M. M.; WURSTER, D.E. ; BERGH, 1.; NARSAI, K

Stability indicating HPLC assay of a-hydroxy acids lactic acid and

glycolic acid in non-ionic creams. Pharmazie, Eschborn, n.53, n.3,

p.204-205, 1998.

DEL NOZAL, M.J.; BERNAL, J.L.; MARINERO, P.; DI EGO, J.C.;

FRECHILLA, J.I.; HIGES, M.; LLORENTE,J. High performance

212

liquid chromatographic determination of organic acids in honeys

from different botanical origino J. Liq. Chromatogr. Relat.

Technol. , Philadelphia, v.21, n.20, p.3197-3214, 1998.

DI MAMBRO, V.M.; BORIN, M.F.; FONSECA, M.JV. Topical

formulations with superoxide dismutase: influence of formulation

composition on physical stability and enzimatic activity. High

performance liquid chromatographic determination of organic acids

in honeys from different botanical origino J. Pharm. Biomed. Anal. ,

Amsterdam, v. 32, n.1, p. 97-105, 2003.

DUPONT DuPont glycolic acid - Technical information. Disponível em:

http://www.dupont.com/glycolicacid/techinfo/index.html . Acesso em

18/10/2005.

EL-SHARKAWY, S.H. Kojic acid production from cocoa juice by

Aspergillus flavus entrapped in calcium alginate. BolI. Chim. Farm.,

Milan, v.134, n.6, p.316-9, 1995.

FUJIMOTO, N. ; WATANABE, H.; NAKATANI, T; ROY, G.; ITO, A.

Induction of thyroid tumours in (C57BL/6N x C3H/N)F1 mice by oral

administration of kojic acid. Food. Chem. Toxicol., Amsterdam,

v.36, n.8, p.697-703, 1998.

FUJIMOTO, N.; ONODERA, H.; MITSUMORI, K. ; TAMURA, T;

MARUYAMA, S. ; ITO, A. Changes in thyroid function during

development of thyroid hyperplasia induced by kojic acid in F344

rats. Carcinogenesis, Oxford, v.20, n.8, p.1567-1571, 1999.

FURUYA, T Makeup cosmetics containing kojic acid. Jpn. Pat.

01275515,6 novo 1989.

213

GARCIA, A; FUL TON JR, J.E. The combination of glycolic acid and

hydroquinone or kojic acid for the treatment of melasma and related

conditions. Dermatol. Surg., New York, v.22, n.5, pA43-7, 1996.

GERNY, H. Formulations containing esters of glycolic acid for topical

treatment of skin. Ger. Pat. 19818849, 29 oct. 1998.

GLAOSTONE, H.S.; NGUYEN, S.L. ; WILLlAMS, R; OTTOMEYER, T. ;

WORTZMAN, M.; JEFFERS, M.; MOY, RL. Efficacy of

hydroquinone cream (USP 4%) used alone or in combination with

salicylic acid peels in improving photodamage on the neck and

upper chest. Dermatol. Surg., New York, v.26, nA, p.333-337,

2000.

GLOOR, R; JOHNSON, E.L. Praticai aspects of reversed phase ion

pair chromatography. J Chromatogr Sei., Niles, v.15, n.9, pA13-

423, 1977.

GRIMES, P.E. Melasma: etiologic and therapeutic considerations.

Areh. Dermatol., Chicago, v.131, n.12, p.1453-7, 1995.

GUEVARA, LL.; PANOYA, AG. Safety and efficacy of 4 %

hydroquinone combined with 10% glycolic acid, antioxidants, and

sunscreen in the treatment of melasma. Int. J. Dermatol., Oxford,

vA2, n.12, p.966-972, 2003.

HA, Y. H.; YU, S.U.; KIM, O.S.; LlM, S.J.; CHOI, Y.W. Hydrolysis, skin

permeation and in vivo whitening effect of kojic acid monostearate

as an antimelanogenic agent. Yakhak Hoeehi, Seoul, vA2, n.1,

p.39-45, 1998.

214

HALDER, RM.; RICHARDS, G.M. Management of dyscrhomias in

ethnic skin. Dermatol. Ther., Copenhagen, v.17, n.2, p. 151-157,

2004.

HAYASHI, H.; TAKEI, M. Cosmetics containing kojic acids and

isomerized sugars. Jpn. Pat. 11335226, 7 dec. 1999a.

HAYASHI, H.; TAKEI, M. Nonirritant cosmetics containing kojic acids

and tyrosinase inhibitors. Jpn. Pat. 11335225, 7 dec. 1999b.

HEINISCH, S. ; ROCCA, J.L. Effect of mobile phase composition, pH

and buffer type on the retention of ionizable compounds in reversed

phase liquid chromatography: application to method development. J.

Chromatogr. A, Amsterdam, v.1048, n.2, p.183-193, 2004.

HEMPEL, G. Determination of alpha-hydroxycarboxylic acids in

cosmetics. Dtsch. Lebensmitt. Rundsch., Stuttgart, v.94, nA, p.

118-119, 1998.

HIKIMA, T. Skin-lightening cosmetics containing Pyracantha

fortuneana extracts and hydroquinone derivatives, pyrones and/or

placenta extracts. Jpn. Pat. 09071519,18 mar. 1997.

HONDA, S. Stable cosmetics containing kojic acids and triazine

derivative. Jpn. Pat. 09241141, 16 sep. 1997.

HONDA, S. Topical cosmetics containing kojic acid derivatives. Jpn.

Pat. 2000016912, 18 jan. 2000a.

HONDA, S. Antiperspirants containing kojic acids. Jpn. Pat.

2000016928, 18jan.2000b.

215

HUANG, W.; LlN, C.C.; HUANG, M.C.; WEN, KC. Determination of Q

hydroxyacids in cosmetics. Yaowu Shipin Fenxi , Taipei, v. 10, n.2,

p. 95-100, 2002.

HURLEY, M.E. ; GUEVARA, I.L; GONZALES, RM. ; PANDYA, AG.

Efficacy of glycolic acid peels in the treatment of melasma.

Comment in: Arch. Dermatol., Chicago, v.138, n.12, p.1578-1582,

2002.

INOUE, H.; ITO, K; NAKAJIMA, H.; TOKUE, W.; NISHAMA, S. Skin

cosmetics. Jpn. Pal. 09263513, 7ocl. 1997.

INOUE, Y.; IZUMIDA, H.; TAKADERA, T. Skin-lightening face

cleansers containing kojic acid. Jpn. Pal. 02042016, 13 feb. 1990.

INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E

QUALIDADE INDUSTRIAL Acreditação (Credenciamento).

Documentos Necessários para Acreditação (Credenciamento).

Laboratórios de Calibração de ensaios segundo requisitos da NBR

ISOIIEC/17025. Orientações sobre validação de métodos de

ensaios químicos: DOQ-CGCRE-008, revisão 01, 2003. 35p.

Disponível em:

http://www.inmetro.gov.br/credenciamento/laboratorios/calibEnsaios.

asp. Acesso em: 10 sei. 2005.

INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION - ICH. Text

on validation of analytical procedures Q2A. International

Conference on Harmonization of T echnical Requirements for

registration of pharmaceuticals for human use, 1994. Disponível em:

http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1.html. Acesso em: 01

mar. 2003.

216

INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION - ICH.

Guidanee for industry Q1 B Photostability testing of new drug

substanees and produets. International Conference on

Harmonization, 1996a. Disponível em:

htlp://www.ich.org/cache/compo/276-254-1 .html. Acesso em: 01

mar. 2003.


Validation of analytieal proeedures: methodology Q2B.

International Conference on Harmonization of T echnical

Requirements for registration of pharmaceuticals for human use,

1996b. Disponível em: http://www.ich.org/cache/compo/276-254-

1.html. Acesso em: 01 mar. 2003.


Guidanee for industry Q1A (R2) Stability testing of new drug

substanees and produets. International Conference on

Harmonization, 2003. Disponível em:

http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1 .html. Acesso em: 01

mar. 2003.

IZUMIDA, H.; liDA, K.; TAKADERA, T.; INOE, H. White cosmetics

containing kojic acid and chelating agents. Jpn. Pat. 02015017, 18

jan. 1990.

JOHNSON, AW.; STOUDEMAYER, T. ; KLlGMAN, AM. Application of

4% and 8% glycolic acid to human skin in commercial skin creams

formulated to CIR guidelines does not thin the stratum corneum or

increase sensitivity to UVR. J. Cosmet. Sei., New York, v.51, n.6,

p.343-349, 2000.

217

KAHN, V. Effect of kojic acid on the oxidation of DL-DOPA,

norepinephrine, and dopamine by mushroom tyrosinase. Pigment

Cell. Res., Oxford, v.8, n.5, p.234-40, 1995.

KAKITA, L.S.; LOWE, N.J. Azelaic acid and glycolic acid combinatíon

therapy for facial hyperpigmentation in darker -skinned patients: a

clínical comparíson with hydroquínone. Clin. Ther., Hillsborough,

v.20, n.5, p.960-970, 1998.

KAMEYAMA, H., HAYASHI, K., NAITO, N. Stabílízers in líposome or

phospholípid dispersions. Jpn. Pat. 03197408,28 aug. 1991.

KARPINSKA, J. Derivative spectrophotometry: recent applications and

directions of developments. Talanta, London, v.64, nA, p.801-822,

2004.

KAUH, Y.C.; ZACHIAN. T.F. Melasma. Adv. Exp. Med.Biol., New

York, vA55, pA91-499, 1999.

KIMURA, K.; HIROKADO, M.; YASUDA, K.; NISHIJIMA, M.

Determination of kojic acid in various commercial foods by HPLC.

Shokuhin Eiseigaku Zasshi, Tokyo, vA1 , n.1, p.70-73, 2000.

LABA, D. Rheological properties of cosmetics and toiletries. New

York: Mareei Dekker, 1993A25p.

LACHMAN, L.; LlEBERMAN, H.A. ; KANIG, J.L. , eds. Teoria e prática

na indústria farmacêutica. Lisboa: Fundação Calouste

Gulbenkian, 2001 .

LAN, X. Method for preventing oxidation of skin-lightening cosmetics

218

containing kojic acid. Chin. Pat. 1184812, 17 jun. 1998.

LAWRENCE, N.; COX, S.E. ; BRODY, H.J. Treatment of melasma with

Jessner's solution versus glycolic acid: a comparison of clinicai

efficacy and evaluation of the predictive ability of wood's light

examination. J. Am. Aead. Dermatol., St. Louis, v.36, n.4, p.589-

93,1997.

LlM, J.T Treatment of melasma using kojic acid in a gel containing

hydroquinone and glycolic acid. Dermatol. Surg., New York, v.25,

n.4, p.282-4, 1999.

LlM, J.T; THAM, S.N. Glycolic acid peels in the treatment of melasma

among Asian women. Dermatol. Surg. , New York, v.23, n.3, p.177-

179,1997.

MAEDA, N. ; NAGANUMA, M. Skin-whitening cosmetics. Jpn. Pat.

2000016917, 18jan.2000.

MAJMUDAR, G.; JACOB, G.; LABOY, Y. ; FISHER, L. An in vitro

method for screening skin-whitening products. J. Cosmet. Sei.,

New York, v.49, n.6, p. 361-367, 1998.

MANABE, M.; SHINSHI, E.; GOTO, T; TANAKA, K. ; MISAWA, Y.

Fluorescent constituents in fermented foods. VIII. Gas-liquid

chromatographic analytical system for kojic acid. Nippon Shoyu

KenkyushoZasshi, Tokyo, v.14, n.6, p.183-186, 1988.

MANALOTO, RM.P. ; ALSTER, TS. Periorbital Rejuvenation: A review

of dermatological treatments. Dermatol. Surg., New York, v.25,

n.1, p.1-9, 1999.

219

MASSE, M.O.; DUVALLET, V.; BORREMANS, M.; GOEYENS, L.

Identification and quantitative analysis of kojic acid and arbutine in

skin-whitening cosmetics. Int. J. Cosmet. Sei., Oxford, v.23, nA,

p.219-232, 2001 .

MILLER, J.C.; MILLER, J.N. Estadística para química analítica. 2.ed.

Delaware: Addison-Wesley Iberoamerican, 1993. 211 p.

MITSUMORI, K; ONODERA, H; TAKAHASHI, M.; FUNAKOSHI, T.;

TAMURA, T.; YASUHARA, K.; TAKEGAWA, K.; TAKAHASHI, M.

Promoting effects of kojic acid due to serum TSH elevation resulting

from reduced serum thyroid hormone leveis on development of

thyroid proliferative lesions in rats initiated with N-bis (2-

hydroxypropyl) nitrosamine. Carcinogenesis, Oxford, v.20, n.1,

p.173-176,1999.

MOON, KY; AHN, KS.; LEE, J.; KIM, Y.S. kojic acid, a potencial

inhibitor of NF-kappaB activation in transfectant human HaCaT and

SCC-13 cells. Arch. Pharm. Res., Seoul, v.24, nA, p.307-311,

2001.

NAKAJIMA, M.; SHINODA, 1.; FUKUWATARI, Y; H AYASAWA, H.

Arbutin increases the pigmentation of cultured human melanocytes

through mechanisms other than the induction of tyrosinase activity.

PigmentCell. Res., Oxford, v.11, n.1, p.12-7, 1998.

NARAYANAN, L.; MOGHADDAM, AP.; TAYLOR, AG.; SUDBERRY,

G.L. ; FISHER, J.W. Sensitive high-performance liquid

chromatography method for the simultaneous determination of low

leveis of dichloroacetic acid and its metabolites in blood and urine.

J. Chromatogr., B: Biomed. Sei. Appl., Amsterdam, v.729, n (1-2),

220

p.271-277,1999.

NG, L.K.; LAFONTAINE, P.; HARNOIS, J. Gas chromatographic-mass

spectrometric analysis of acids and phenols in distilled alcohol

beverages. Application of anion-exchange disk extraction combined

with in-vial elution and silylation. J. Chromatogr. A., Amsterdam,

v.873, n.1, p.29-38, 2000.

NICOLETTI, 1.; CORRADINI, C.; COGLlANDRO, E.; CAVAZZA, A.

Determination of alpha-hydroxy acids in cosmetic products by high

performance liquid chromatography with a narrow-bore column. Int.

J. Cosmet. Sei., Oxford, v.21, n.4, p. 265-274, 1999a.

NICOLETTI, 1.; CORRADINI, C.; GOGLlANDRO, E. a-Hydroxy acids in

. cosmetic formulations. Lab. 2000, Milan, v.12, n.2, p.50-52, 1999b.

NILSEN, C. Let there be light. Taking the mystery of photostability.

Pharmaeeutieal Formulation & Quality. AugustlSeptember, 2004.

Disponível em: http://www.pharmaguality.com/PFQundercon.htm.

Acesso em 16/03/2005.

NOHYNEK, G.J.; KIRKLAND, D.; MARZIN, D.; TOUTAIN, H.;

LECLERC-RIBAUD, C.; JINNAI, H. An assessment of the

genotoxicity and human health risk of topical use of kojic acid [5-

hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4-one]. Food. Chem.

Toxieol., Amsterdam, v.42, n.1, p.93-105, jan 2004.

ONIZUKA, K Multilayered emulsions containing kojic acid. Jpn. Pat.

07101849,18 apr. 1995.

PARASKEVAS, L.R. ; HALPERN A.C.; MARGHOOB, A.A. Utility of the

Wood's light: five cases from a pigmented lesion clinic. Br. J.

221

Dermatol., Oxford, v.152, n.5, p.1 039-1 044, 2005.

PÉREZ-BERNAL, A; MUNOZ-PÉREZ, M.A.; CAMACHO, F.

Management of facial hyperpigmentation. Am. J. Clin. Dermatol.,

Auckland, v.1 , n.5, p.261-268, 2000.

PERKAMPUS, H.H. UV-VIS spectroscopy and its applications.

Berlin: Springer-Verlag, 1992. 244p.

PORTER, W.H.; RUTTER, P.W.; YAO, H.H. Simultaneous

determination of ethylene glycol and glycolic acid in serum by

chromatography-mass spectrometry. J. Anal. Toxicol., Niles, v.23,

n.7, p.591-597, 1999.

POUCHERT, C.J. The Aldrich library of infrared spectra. 2.ed.

Milwaukee: Aldrich Chemical, 1975. 1576p.

PRISTA, L. N. Tecnologia farmacêutica. 4a ed. Lisboa: Fundação

Calouste Gulbenkian, 1996.

RANGEL, V. L. B. 1.; UEMA, M. K. Determinação do prazo de validade

do ácido glicólico incorporado em uma emulsão não iônica. IJPC,

Edição Brasileira, v.6, n.3, p.140-145, 2004.

RODENAS, V.; GARCíA, M.S.; SÁNCHES-PEDRENO, C.; ALBERO,

M.I. Simultaneous determination of propacetamol and paracetamol

by derivative spectrophotometry. Talanta, London, v.52, n.3, p.517-

523, 2000.

SAKODA, T.; TOYAMA, K. Aqueous topical comprising kojic acid,

salicilyc acid and a water soluble glycol ether. Jpn. Pat. 9817247,

222

30 apr. 1998.

SANO, H.; WATANABE, T Dentifrices containing kojic acid. Jpn. Pat.

11021222, 26jan. 1999.

SARKAR, R; KAUR, C.; BHALLA, M. ; KANWAR, A.J. The combination

of glycolic acid peels with a topical regimen in the treatment of

melasma in dark-skinned patients: a comparative study. Dermatol.

Surg. , New York, v.28, n.9, p.828-832, 2002.

SATO, K.; SAKAMOTO, S. ; MAITANI, T; YAMAOA, T Effect of

cooking and other treatments on residual kojic acid in shrimps.

Shokuhin Eiseigaku Zasshi , Tokyo, v.41 , n.2, p.122-125, 2000.

SCALlA, S.; CALLEGARI, R; VILLANI, S. Oetermination of glycolic

acid in cosmetic products by solid-phase extraction and reversed

phase ion-pair high-performance liquid chromatography. J.

Chromatogr A., Amsterdam, v.795, n.2, p.219-225, 1998:

SCHELLlNGER, A.P.; CARR, P.W. Solubility of buffers in aqueous

organic eluents for reversed-phase liquid chromatography. LCGC

North Am., Ouluth, v.22, n.6, p.545-548, 2004.

SCHMITT, W.H. Skin care products. In: WILLlAMS, O.F.; SCHMITT,

W.H., eds. Chemistry and technology of the cosmetics and

toiletries industry. London: Blackie Academic & Professional,

Chapman & Hall , 1992. cap.3, p.99-141.

SEO, B.; YUN, J.; LEE, S.; KIM, M.; HWANG, J.; KIM, J. ; MIN, K.R;

KIM, Y.; MOON, o. Barbarin as a new tyrosinase inhibitor from

Barbarea orthocerus. Planta Med., Stuttgart, v.65, n.8, p.683-86,

1999.

223

SHAO, G.; GIESE, RW. Trace detection of glycolic acid by

electrophore labeling gas chromatography-electron capture mass

spectrometry. Anal. Chem., Columbus, v.76, n.11, p.3049-3054,

2004.

SHIH, Y. Simultaneous determination of magnesium L-ascorbyl-2-

phosphate and kojic acid in cosmetics bleaching products by using a

microbore column and ion-pair liquid chromatography. J. AOAC.

Int., Gaithersburg, v.84, nA, 2001.

SHIH, Y.; ZEN, J.M. Voltammetric determination of kojic acid in

cosmetic bleaching products using a disposable screen-printed

carbon electrode. Electroanalysis, Weinheim, v.11, nA, p.229-233,

1999.

SHINSHI, E.; MANABE, G.; GOTO, T.; MISAWA, Y.; TANAKA, K.;

MATSUURA, S. Studies on the fluorescent compound in fermented

foods. VII. Degradation of added kojic acid during soy sauce

fermentation. Shokuryo Kenkyusho Kenkyu Hokoku, Tokyo,

nA6, p.342-347, 1984.

SILVA, C.R; JARDIM, I.C.S.F.; COLLlNS, C.H.; AIROLDI, C. Novas

fases estacionárias à base de sílica para cromatografia líquida de

alta eficiência. Quim. Nova, São Paulo, v.27, n.2, p.270-276, 2004.

SKOOG, D.A; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A Princípios de análise

instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. 836p.

SLOMINSKI, A; TOBIN, D.J.; SHIBAHARA, S.; WORTSMAN, J.

Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal

regulation. Physiol. Rev., Bethesda, v.84, nA, p.1155-1228, 2004.

224

SNYDER, L. R. ; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. Praetieal HPLC

method development. 2.ed. New York : Wiley Interscience, 1997.

765p.

SOTTOFATTORI, E.; ANZOLDI, M. The use of a cyanopropyl stationary

phase in the HPLC determination of commercial cosmetics creams.

Int. Lab., Shelton, v.30, n.3, p.8-9, 2000.

STRATIGOS, AJ. ; KATSAMBAS, AD. Optimal management of

recalcitrant disorders of hyperpigmentation in dark-skinned patients.

Am. J. Clin. Dermatol., Auckland, v.5, n.3, p.161-168, 2004.

STULBERG, D.L.; CLARK, N.; TOVEY, D. Common hyperpigmentation

disorders in adults: part li. Am Fam Physieian., Kansas, v.68, n.10,

p.1963-1968, 2003.

SU, Z.; LI, B. ; L1U, H. Study on stability of kojic acid and its effects on

skin discoloration. Riyong Huaxue Gongye, Beijing, n.2, p.56-57,

1999.

SUZUKI , K; ONO, F. Tooth-lightening patch. Jpn. Pat. 10017448,20

jan. 1998.

TAMURA, T. ; MITSUMORI, K; ONODERA, H.; TAKAHASHI, M.;

FUNAKOSHI, T. ; YASUHARA, K; TAKEGAWA, K; TAKAGI, H.;

HIROSE, M. Time course observation of thyroid proliferative lesions

and serum leveis of related hormones in rats treated with kojic acid

after DHPN initiation. J. Toxieol. Sei., Tokyo, v.24, n.3, p.145-55,

1999.

THIBAUL T, P.K; WLODARCZYK, J.; WENCK, A A double-blind

randomized clinicai trial on the effectiveness of a daily glycolic acid

225

5% formulation in the treatment of photoaging. Dermatol. Surg.,

New York, v.24, n.5, p.573-578, 1998.

THOMAS, M. Ultraviolet and visible spectroscopy. 2.ed. West

Sussex: Wiley, 1996. 229p.

TSIAFOULlS, C.G.; PRODOMIDIS, M.I.; KARAYANNIS, M.I.

Development of amperometric biosensors for the determination of

glycolic acid in real samples. Anal. Chem., Columbus, v. 74, n.1,

p.132-139,2002.

UNITED States Pharmacopeia. 28.ed. Rockville: The United States

Pharmacopeial Convetion, 2005.

USUKI, A.; OHASHI, A.; SATO, H.; OCHIAI, Y.; ICHIHASHI, M.;

FUNASAKA, Y. The inhibitory effect of glycolic acid on melanin

synthesis in melanoma cells. Exp. Dermatol., Oxford, v.12, suppl.2,

p.43-50,2003.

VADAS, E. B. Estabilidad de los productos farmacéuticos. In:

Remington farmacia. 19.ed. Buenos Aires: Editorial Medica

Panamericana, 1998. tomo I, cap.38, p.933-946.

VAN HEEL, P.; NEELS, H.; DE DONCKER, M.; VRYDAGS, N.;

SCHATTEMAN, K.; UYTTENBROECK, W.; HAMERS, N.; HIMPE,

D.; LAMBERT W. Analysis of gamma-hydroxybutyric acid, DL-Iactic

acid, glycolic acid, ethylene glycol and other glycols in body fluids by

a direct injection gas chromatography-mass spectrometry assay for

wide use. Clin. Chem. Lab. Med., Berlin, v.42, n.11, p.1341-1345,

2004.

VAN SCOTT, E.J.; YU, RJ. Alpha hydroxy acids: procedures for use in

226

clinicai practice. Cutis, New York, v.43, n.3, p.222-228, 1989.

VERMEULEN, B.; REMON, J.P.; NELlS, H. The formulation and

stability of erythromycin-benzoyl peroxide in a topical gel. Int. J.

Pharm., Amsterdan, v.178, n.1, p.137-141, 1999.

VICTOR, F.C. ; GELBER, J.; RAO, B. Melasma: a review. J. Cutan.

Med. Surg., New York, v.8, n.2, p.97-102, 2004.

VIRADOR, V.M.; KOBAYASHI, N.; MATSUNAGA, J.; HEARING, V. A

standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.

Anal. Bioehem., New York, v.270, n.2, p.207 -219, 1999.

VORARAT, S.; AROMDEE, C.; PODOKMAI, Y. Determination of alpha

hydroxy acids in fruits by capillary electrophoresis. Anal. Sei.,

Tokyo, v.18, n.8, p.893-896, 2002.

YAMAMOTO, S. Purification of kojic acid by sublimation, for drugs

used externally. Eur. Pat. 289027, 2 novo 1988.

YAMAMOTO, S. ; NAKANISHI, K. ; ALlHASSAN, M. Chromatographic

separation of galactosylkojic acid. J. Ferment. Bioeng., Osaka,

v.84, n.1, p.82-85, 1997.

YATES, RL.; HAVERY, D.C. Determination of phenol, resorcinol ,

salicylic acid and a-hydroxy acids in cosmetics products and salon

preparations. J. Cosmet. Sei., New York, v.50, n.5, p.315-325,

1999.

YOKOGAWA, Y.; OTA, M. ; YAGI, E.; TANAKA, N. Skin preparations

containing melanin formation inhibitors. Jpn. Pat. 09227355, 2 sep.

227

1997.

WADE, A; WELLER, P.J., eds. Handbook of pharmaceutical

excipients. 2.ed. Washington: American Pharmaceutical

Association; London: Pharmaceutical Society of Great Britain, 1994.

651p.

WAKSMUND-HAJNOS, M. Chromatographic separations of aromatic

carboxylics acids. J Chromatogr B., Amsterdan, v.717, n.1-2, p.93-

118, 1998.

WATANABE, T.; OHSATO, F. Oral compositions for tooth whitening.

Jpn. Pat. 11343220, 14 dec. 1999.

WESTON, A; BROWN, P.R. HPLC and CG: principies and practice.

San Diego: Academic Press, 1997. 280p.

228

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