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Universidade de São PauloInstituto de Física
Grupo de Fluídos Complexos
Relatório de Atividades referentes ao período de Dezembro de 2016 à Dezembro de 2017.
Dr. Wagner Wlysses Araújo
São Paulo, Dezembro de 2017.
1
Parte I.1Introdução.
Os fenômenos de óptica nãolinear, são assim denomindados, porque ocorrem quando a
resposta de um material na presença de um campo eléctrico aplicado, se dá de uma forma nãolinear
em relação á magnitude do campo. Os ferrofluidos pertencem a uma classe de materiais que
apresentam propriedades ópticas nãolineares. Os ferrofluidos (FF) são suspensões coloidais de
nanopartículas magnéticas de domínio único (dimensões típicas da ordem de 10 nm). Essas
nanopartículas são mantidas dispersas em um líquido portador. Para evitar a aglomeração as
nanopartículas de ferrofluidos são revestidas ou com moleculas ou com grupos carregados
eletricamente de materiais apropriados [1].
Os ferrofluidos são materiais importantes tanto do ponto de vista acadêmico quanto
tecnológico. Um ramo de conhecimento em que as propriedades estão sendo empregadas é
optofluídica. A optofluídica combina em um microdispositivo características de microfluidica
aliadas às propriedades ópticas do fluído a ser empregado [27]. Alguns exemplos de dispositivos
optoflu dicos com ferrofluidos já foram propostos e implementados. Por exemplo, fibras ópticası ı
com núcleo preenchido com ferrofluido são empregadas na construção de moduladores magneto
ópticos, que controlam, com um campo magnético, a intensidade da luz transmitida [710]. Além
disso, os ferrofluidos são utilizados na biomedicina como contraste para imagem por ressonância
magnética (MRI) [1113]. Existem ainda, estudos no tratamento do câncer por termoterapia
utilizando ferrofluidos, bem como no revestimento das part culas por moléculas biológicas para oı ı
carregamento de fármacos para uma região espec fica do corpo ı ı [11].
2 Materiais e Métodos.
2.1 Materias.
Os materiais estudados foram ferrofluídos cedidos em colaboração pela Drª Kinnari Parehk
do Charotar University of Science & Technology (CHARUSAT). As amostras são ferrofluídos
monodispersas obtidas pelo método de substituição (Re = Ho3+ Mn0.5Zn0.5Fe22xRe2xO4) que ao longo
do texto será adota a nomenclatura MZH. Foi adotado como referência a amostra sem a dopagem
com (Re = Ho3+) Mn0.5Zn0.5Fe2O4 . Ao longo do texto será adota a nomenclatura MZ para a amostra
de referência. Essas amostras Foram analisadas por Microscopia Elêtronica de Transmissão.
2
Foram estudados também dois ferrofluidos que apresentam nanopartículas de magnetitas
(Fe3O4) obtidas comercialmente da empresa ChemiCell. Os ferrofluidos obtidos são fluidMAG
UC/A e fluidMAGUC/C ambos estão dispersos em água. As nanopartículas fluidMAGUC/A
apresentam cargas aniônica, enquanto que e as nanopartículas fluidMAGUC/C apresentam cargas
catiônicas. Esses materiais foram estudados por espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).
Neste trabalho foram sintetizados 3 amostras de ferrofluidos pelo método de co
precipitação. Amostra de magnetita (Fe3O4), amostra de magnetita dopada com 3% de Neodímio
(Nd) e uma amostra de magnetita sintetitazada na presença de campo magnético para se gerar
nanobastões. Estas amostras foram caracterizadas quanto a sua morfologia e a sua estrutura.
2.2 Sínteze de nanopartículas de magnetita.
As nanoparticulas foram preparadas pelo método de coprecipitação. 25 mL de solução
aquosa de FeCl3:6H2O (4 mmol), FeCl2:4H2O (2 mmol), 8 ml de cis-9-octadecenóico e 2,5 mL de
HCl foram rapidamente adicionados a 150 mmol de NaOH a 80 ºC com agitação vigorosa. O
precipitado de cor marrom escura foi lavado 10 vezes em água deionizada para se ter o pH 8. O
mesmo procedimento foi adotado para ser obter a amosra de magnetita de nanobastõe. A diferença é
que neste caso o béquer estava imerso numa região de um campo uniforme de 2kG.
A amostra de magnetita dopada com 3% de Nd foi obtida pelo mesmo processo acima
descrito, mas neste caso, a solução aquosa é composta de FeCl3:6H2O (3,88 mmol), NdCl3:6H2O
(0,12 mmol), FeCl2:4H2O (2 mmol), 8 ml de cis-9-octadecenóico e 2,5 mL de HCl. Esta solução
aquosa foi rapidamente adicionada a 150 mmol de NaOH a 80 ºC com agitação vigorosa formando
o precipitado de cor marrom escura. Este precipitado foi lavado 10 vezes em água deionizada para
se ter o pH 8.
2.3 Microscopia eletrônica de Transmissão.
As micrografias de TEM, HRTEM e padrão de difração de elétrons de área selecionada
(SAED) das nanopartículas de nanocubos foram obtidos usando um elétron de transmissão de alta
resolução num microscópio (TEM Tecnai G2 F20) operando numa tensão de 200 kV. Amostras
foram
A morfologia, o tamanho e a distribuição de tamanho foram investigados utilizando
microscopia eletrônica de transmissão. O ferrofluido foi diluído 1000 vezes em Hexano e depois
mantido num banho de ultrassônico durante o período de 30 min. Uma gota da dispersão obtida foi
depositada em uma grade de cobre revestida de carbono e o excesso de fluido foi seco com papel
filtro antes de examinar a amostra no microscópio.
3
2.4 O Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).
Os experimentos de espalhamento a baixos ângulos podemse iniciar com uma partícula fixa
no espaço. Conforme ilustrado na Figura 1 onde uma onda incidente com vetor de onda k0 incide
nos pontos O e P separados por um vetor r [14].
Figura 1 – Esquema ilustrativo do processo de espalhamento por uma partícula fixa.
O espalhamento ocorrido é assumido como elástico (primeira aproximação de Born), dessa
forma a onda espalhada com vetor de onda k possui o mesmo módulo da onda incidente e então a
diferença entre os feixes incidentes e espalhados é dado por [14]:
(1)
sendo q o vetor transferência de momento do espaço recíproco. A amplitude do espalhamento ƒ(q) é
dada pela transformada de Fourier da densidade de comprimento de espalhamento do centro
espalhador, ρ r( )[14].
(2)
A grandeza mensurável no espalhamento de raios X a baixos ângulos é a intensidade de
espalhamento, I(q) que é dada pelo modulo quadrático da amplitude de espalhamento, [14]
(3)
4
Para um sistema de partículas em solução, a intensidade espalhada pode ser representada
pela seguinte expressão,
(4)
onde NS o número de partículas iluminadas pelo feixe incidente, ƒ2(q) é o fator de forma da particula
espalhadora, com ƒ(q) sendo a amplitude de espalhamento e S(q) é o fator de estrutura do sistema
[14].
Para uma análise quantitativa, a intensidade espalhada de raios X a baixos ângulos I(q) foi
modelada. A intensidade de espalhamento pode depender do formato das nanopart culas, daı ı
interação entre elas e da possível formação de agregados. O formato das part culas geralmente éı ı
modelado como um fator de forma no cálculo de I(q), enquanto a contribuição dos agregados e da
interação entre as part culas é modelado como fatores de estrutura no cálculo de ı ı I(q) [15].
Utilizando um modelo de part culas esfericas homogeneas de raio ı ı R, a amplitude do fator
de forma, F (q, R), e dada pela equacao [1416]:
(6)
Outro fator importante que deve ser levado em consideração é que dependendo da
concentracao de nanopart culas do sistema espalhador, as intensidades espalhadas pelas diferentesı ı
part culas podem sofrer interferencia entre si. Esse comportamento, pode ser descrito por um fatorı ı
de estrutura, que contem tambem informacoes sobre a interacao entre as part culas. Foi utilizado oı ı
modelo de esferas r gidas interagentes [17] dados por:ı ı
(7)
onde RHS é o raio de esferas r gidas interagentes e ı ı φHS é a fracao volumetrica das esferas. O subscrito
HS é utilizado para se referir a esfera r gida (ı ı HardSphere) ao longo do texto. O modelo final,
portanto, foi o do espalhamento por um sistema de esferas r gidas interagentes de raio ı ı R, com
polidispersidade σ. Esse modelo e descrito pela equacao:
5
(8)
onde as constantes IF e Sc representam a intensidade de fundo e o fator de escala, respectivamente.
D(R) e a distribuicao numerica dos raios das esferas dada por uma distribuição Lognormal.
As medidas experimentais de SAXS das amostras de LDL foram realizadas em um
equipamento NanoStar da Bruker, que está localizado no Laboratório de Cristalografia do IFUSP.
O arranjo é formado por uma fonte de raios X com radiação CUk (1,54 Å). Os portaamostras
utilizados foram capilares de quartzo de 1 mm de diâmetro. O intervalo de q medidos na faixa de 9
e 3,5 1 Å1.
2.5 A distribuição LogNormal.
As nanopartículas magnéticas exibem uma geometria quase esférica, com uma distribuição
de forma não uniforme. A distribuição P(D) de diâmetros D, geralmente é dado por uma função
lognormal, conforme a equação:
(9)
onde D e σ são o diâmetro médio e desvio padrão de ln D, respectivamente.
3 Resultados.
3.1 Resultados para as micrografias de eletrônica transmissão.
Na Figura 2 são apresentados as micrografias para as amostras de Ferrofluídos MZ e MZH.
Para a amostra MZ, as partículas são de natureza esférica, com o diâmetro dado por D0 = 11,4 nm e
σ = 0,096. Para a amostra de MZH, as partículas são de forma cúbica/quadrada, de modo que a
largura dos cubos foi medida. O valor esperado para o comprimento do lado do nanocubo é de 10,9
nm e σ = 0,07.
6
Figura 2: Micrografias TEM e a distribuição do número de partículas encontrado para as nanopartículas as MZ (Esferas)
e MZH (Cubos).
Na figura 3 são apresentados a micrografia MET de alta resolução para a amostra MZH (ver
Figura 3a) (nanocubos) e o correspondente padrão da análise de difração de elétrons de área
selecionada (SAED)(ver Figura 3b). A partir da microscopia de alta resolução foi possível calcular
o valor de 0,829 nm para o parâmetro de rede. Este valor é comparável ao valor de 0,836 nm obtido
por difração de raios X fornecido pelo fabricante. Na Figura 3b, a difração de elétrons de área
selecionada (SAED) mostra que indexação do aneis de difração está de acordo com o resultado
obtido pela difração de raios X.
a b
7
Figura 3: aMicrografia MET de alta resolução obtida para a amostra MZH, barra de 2 nm. b Padrão de difração de
elétrons de área selecionada (SAED) obtido para amostra MZH.
3.2 Resultados para as análises de SAXS das amostras fluidMAGUC/A e fluidMAGUC/C.
Nas figuras 4a e 4b, são apresentados as curvas de intensidade espalhada I(q) das amostras
fluidMAGUC/A e fluidMAGUC/C, respectivamente. O ajuste foi realizado de acordo com a
equação 8 e é apresentado nas Figuras 4a e 4b com a linha vermelha. A partir do ajuste as
distribuições de raios foram obtidas, conforme é apresentado nas Figuras 4c e 4d para as amostras
fluidMAGUC/A e fluidMAGUC/C, respectivamente. As distribuições de raios obtidas são do tipo
Lognormal. A partir das distruições Lognormal determinouse o valor dos raios esperados para as
amostras fluidMAGUC/A e fluidMAGUC/C. Para a amostra fluidMAGUC/A obtivemos um
valor de raio esperado de 17,28 ± 7,13 Å. Enquanto que para a amostra fluidMAGUC/C obtivemos
um valor de raio esperado de 18,84 ± 7,56 Å, este valor é ligeiramente maior quando comparado
com a amostra fluidMAGUC/A mas dada a incerteza de ambos, podese concluir que essa
diferança não é significativa.
8
ab
cd
Figura 4: a Curvas de intensidade espalhada I(q) e o ajuste teórico realizado. b Curvas de intensidade espalhada I(q) eo ajuste teórico realizado. c Distribuições de raios obtido a partir do ajuste teórico para a amostra fluidMAGUC/A. d
Distribuições de raios obtido a partir do ajuste teórico para a amostra fluidMAGUC/C.
3.3 Resultados para as análises de MET das amostras sintetizadas.Na figura 5 é apresentado as micrografias MET para as amostras de magnetita (Fe3O4),
amostra de magnetita dopada com 3% de Neodímio (Nd) e uma amostra de magnetita sintetitazadana presença de campo magnético para se gerar nanobastões. Estas amostras foram caracterizadaspor MET quanto a sua morfologia. A amostra de magnetita apresenta predominantemente ageometria esferica enquanto que a amostra de magnetita dopada com Nd apresenta poliedros. Apresença do dopante induz o facetamento das nanopartículas. As amostras de Nanobastões demagnetita apresentam uma geometria de elipsoides. As distruições de tamanhos mostram que asnanopartículas de magnetita apresentam tamanho modal de <Dm> =7,73 nm e desvio padrão de σ=5,58 nm. As nanopartículas de magnetita dopada co Nd apresentam distribuição de tamanhos demodal de <Dm> =5,54 nm e desvio padrão de =6,58 nm, enquanto que as amostras de nanobastõesσde magnetita apresentam distribuição de tamanhos de modal de <Dm> =7,54 nm e desvio padrão de
=6,58 nm.σ
9
A
B
C
D
E
FFigura 5: A, C e E micrografias de MET das amostras de Magnetita, Magnetita dopada com Nd e Nanobastões de
magnetita. As figuras B, D e F são as respectivas distribuições de tamanhos.
10
3.4 Resultados para as análises de DRX das amostras sintetizadas.Na figura 6 é apresentado o difratograma para as amostras de magnetita que foram
sintetizadas. Para todas as amostras é possível verificar que há uma boa correspondência entre ospicos da referencia JCPDF 880315 em vermelho e os picos experimentais em preto.
A
B
CFigura 6: A Difratograma para a amostra de magntetita. B Difratograma para a amostra de magnetita dopada com 3%
de Nd. C Difratograma para a amostra de nanobastões de magnetita.
11
3.5 Resultados para as análises de SAXS das amostras sintetizadas.
Na figura 7 é apresentado as curvas de intensidade espalhada I(q) e o ajuste teóricorealizado. As Distribuições de raios foram obtidas a partir do ajuste teórico. As curvas foram ajustascom modelo de esferas rígidas não interagentes de acordo com a equação 8. As distribuições detamanhos corroboram os valores para os diâmetros obtidos por MET.
Figura 7: Curvas de intensidade espalhada I(q) e o ajuste teórico realizado. b Distribuições de raios obtido a partir doajuste teórico. REF corresponde a amostra de magnetita, RC corresponde a amostra de nanobastões de magnetita e ND
corresponde a amostra de magnetita dopada com 3% de Nd.
4 Conclusões.
Através da microsocopia MET foi possível determinar a morfologia da nanopartículas paras
as amostras MZH e MZ. Obtevese também o padrão de difração de elétrons de área selecionada da
amostra MZH.
Através do espalhamento de raios X a baixos ângulos obtivemos a intensidade de raios X
espalhada para as amostras de ferrofluido fluidMAGUC/A e fluidMAGUC/C. A partir do ajuste
teórico realizado nas curvas de intensidade espalhados determinouse a distribuição de raios das
nanopartículas presentes nas amostras.
Amostras de magnetita foram sintetizadas e caracterizadas por MET, difração de raios X e
SAXS. Os resultados de difração de raios X mostram que o material sintetizado é realmente de
magnetita. Através de SAXS obtevese a distribuição de tamanhos e a morfologia das
nanopartículas.
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12
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[17] Kinning, D. J.; Thomas, E. L. Macromolecules, ACS Publications 17(9), 1712–1718 (1984).
13
Parte II.1 – Introdução
A área de processamento de imagens vem sendo objeto de crescente interesse por permitir
viabilizar grande número de aplicações em duas categorias bem distintas: (1) o aprimoramento de
informações extraídas de uma figura para posteriormente ser interpretada por um ser humano; e (2)
a análise automática por computador de informações extraídas de uma figura. Ao longo deste texto,
reservaremos a expressão 'processamento de imagens' para designar a primeira categoria. Já para a
segunda categoria os termos 'análise de imagens', 'visão por computador' (ou 'visão computacional')
e 'reconhecimento de padrões' seriam igualmente válidos. Ao longo deste texto não faremos uso de
visão computacional [13].
O uso de técnicas computacionais de aprimoramento de imagens teve início no Jet
Propulsion Laboratory (Pasadena, CaliforniaEUA) em 1964, quando imagens da lua transmitidas
por uma sonda Ranger eram processadas por computador para corrigir vários tipos de distorções
inerentes à câmera de TV acoplada à sonda [13].
De 1964 aos dias atuais, a área de processamento de imagens vem apresentando crescimento
expressivo e suas aplicações permeiam quase todos os ramos da atividade humana. Em Medicina, o
uso de imagens no diagnóstico médico tornouse rotineiro e os avanços em processamento de
imagens vêm permitindo tanto o desenvolvimento de novos equipamentos quanto a maior facilidade
de interpretação de imagens produzidas por equipamentos, como por exemplo o de raio X. Em
Biologia, a capacidade de processar automaticamente imagens obtidas de microscópios, por
exemplo contando o número de células de um certo tipo presente em uma imagem, facilita
sobremaneira a execução de tarefas laboratoriais com alto grau de precisão e repetibilidade [].
Neste relatório será descrito os procedimentos utilizados para a caracterização de
micrografias de MET de Lipoproteínas de baixa densidade por processamento de imagens. Para o
processamento de imagens foi utilizado o software ImageJ 1.51J8 [36]. O ImageJ é distribuído
livremente [7] e apresenta diversas ferramentas de operações morfológicas [8] em imagens que
apresentam escala de cinza, tal como as micrografias registradas no MET.
2 – Materiais e Métodos
2.1.1 Amostras de LDL Nativas e Oxidadas com Cobre e Ferro.
O plasma é composto por várias substâncias, dentre elas podemos citar as lipoproteínas
VLDL, IDL, LDL e HDL. A separação de cada tipo de lipoproteína do plasma é feita por diferença
14
de densidade, em sucessivos processos de ultracentrifugação [9]. A oxidação in vitro das
lipoproteínas tem o objetivo de mimetizar aquela que ocorre in vivo [9]. As oxidações in vitro da
LDL com Cobre e Ferro foram realizadas pelas Drªs Andreia M. Monteiro (PósDoutorado, 2010)
[910] e Priscila Ribeiro dos Santos (Doutorado, 20092013) [10,11]. Para obterse as partículas de
LDL oxidadas por íons de cobre (LDLCu). As partículas de LDL foram dialisadas durante a noite
com PBS sem EDTA. Após a diálise as LDL foram incubadas na concentração de 1mg de
proteína/mL com CuSO4 20 μM por 18 h a 37°C. Já as partículas de LDL oxidado por íons de ferro
(FeLDL) foram produzidas pela diálise da LDL na concentração de 1 mg de proteína/mL
adicionados a 2 μm de FeSO4∙7H2O adicionados em PBS a pH 7,2, durante 48 h a temperatura
ambiente. As oxidações foi interrompida pela adição de EDTA (1 mM) [913]. Mais informações
sobre os processos de oxidação com Cobre e Ferro podem serem encontradas em [913]. As
micrografias foram realizadas pela Drª Sylvia M. Carneiro do Instituto Butantã. Neste relatório será
apresentado apenas o processamento de imagens realizado nestas micrografias.
2.1.2Amostras de LDL Nativas, Oxidadas e Glicadas e Oxidadas.
As análises de MET foram realizadas para as amostras de LDL nativa, LDL oxidada e LDL
glicada e oxidada in vitro.
A partir do sangue de doadores, foi separado o plasma, e por meio da ultracentrifugação
sequencial a LDL foi isolada [1416]. Em adição, por meio da cromatrografia de troca iônica foi
isolada as subfrações de LDL nativa e eletronegativa. E posteriormente, a LDL nativa foi
subdividade em alíquotas para serem glicadas e glicadas e oxidadas. Nesta etapa, foi feita a
incubação da LDL nativa em 2 soluções diferentes: i) Solução 1 PBS, na presença de
antioxidantes (hidroxitoluenobutilado BHT e ácido etilenodiamino tetraacético EDTA), que irá
funcionar como controle. ii) Solução 2 8mM de glicolaldeído (Glycolaldehyde dimer®; Sigma
Aldrich, FlukaBuchs, Alemanha) em PBS por mg de proteína da solução de LDL, com
antioxidantes, para favorecer a glicação isolada, à 37oC, por 4 dias [17]
O processo de separação, glicação e oxidação das lipoproteínas é realizado pela Drª Ana P.
Q Mello, PósDoutoranda (2017) do Gruplo de fluidos complexos. A preparação das lipoproteínas
para Microcospia Eletrônica de Transmissão, a visualização no microscopio e posteriormente o
processamento das micrografias são realizados pelo candidato/proponente.
15
2.1.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão.
Para a análise da microscopia eletrônica de transmissão foi realizado o procedimento de
constratação negativa das partículas de LDL nativas, e LDL modificadas. Um volume de 15 µL da
suspenção de LDL, com uma concentração de proteína de 0,1 mg/mL, foi aplicados sobre uma
grade de microscopia. Utilizaremos uma grade de cobre com 200 campos e a mesma estará
revestida com filme fino de formvar® (6070 nm). A suspenção de LDL permanecerá por 1 min
sobre a grade de cobre e depois, o excesso de líquido será retirado com papel filtro deixando uma
pequena quantidade de fluído residual da supensão de LDL. A constratação negativa será realizada
com ácido fosfotúngstico 2% (m/v pH 7,2) durante o tempo de 1 min e em seguida secase o
excesso de líquido residual. As grades serão analisadas num microscópio eletrônico de transmissão
FEITECNAI G2 Twin (Fei, Holanda) ou JEOL 1010 (Jeol, Japão) com uma tensão de aceleração
de 80 kV. As micrografias serão adquiridas por uma câmera CDD Gatan Bioscan 782 de 1K x 1K
pixels. Serão registradas de 10 a 15 micrografias em magnificiações de 150.000 ou 300.000 vezes
para posterior análise da morfologia das partículas e de suas distribuições de tamanhos [9].
2.2 Descrição geral do processo de binarização de Imagens.
O princípio da limiarização consiste em separar as regiões de uma imagem quando esta
apresenta duas classes (o fundo e o objeto). Devido ao fato da limiarização produzir uma imagem
binária à saída, o processo também é denominado, muitas vezes, binarização. A forma mais simples
de limiarização consiste na bipartição do histograma, convertendo os pixels cujo tom de cinza é
maior ou igual a um certo valor de limiar (T) em brancos e os demais em pretos, como ilustra a
Figura 1. No caso de níveis de cinza divididos basicamente em duas classes, onde o histograma
apresenta dois picos e um vale, a limiarização é trivial [13].
16
Figura 1:
Matematicamente, a operação de limiarização pode ser descrita como uma técnica de
processamento de imagens na qual uma imagem de entrada I=f(x,y) de N níveis de cinza produz à
saída uma imagem g(x,y), chamada de imagem limiarizada, cujo número de níveis de cinza é menor
que N [13]. Normalmente, g(x,y) apresenta 2 níveis de cinza, sendo:
onde os pixels rotulados com 1 correspondem aos objetos e os pixels etiquetados com 0
correspondem ao fundo (background) e T é um valor de tom de cinza prédefinido, ao qual
denominamos limiar [13].
Pelo exposto até aqui, assumiuse que a escolha do valor de limiar é arbitrária e subjetiva.
Sabendo que o histograma é um representador gráfico da distribuição de probabilidade de
ocorrência do nível de cinza em uma imagem, é lícito imaginar a possibilidade de uso de técnicas de
cálculo do valor ótimo de limiar com base nas propriedades estatísticas da imagem. Uma destas
técnicas, denominada limiarização ótima, parte de uma imagem da qual se conhecem as principais
propriedades estatísticas (supondo que sua distribuição de probabilidade é normal ou gaussiana), a
saber:
17
μ1 : média dos tons de cinza da região de interesse
μ2 : média dos tons de cinza da região de fundo (background)
σ1, σ2: desvios padrão
P1, P2 : probabilidade de ocorrência dos pixels pertencentes às regiões 1 e 2, respectivamente.
Podese mostrar [13] que existe um valor ótimo de limiar, T, dado
por uma das raízes da equação:
onde:
Duas raízes reais e positivas indicam que a imagem pode requerer dois valores de limiarpara obter uma solução ótima. Se as variâncias forem iguais ( =σ σ1=σ2), um único valor T énecessário:
Se, além disso, as duas classes forem equiprováveis:
o que está em acordo com o conceito intuitivo de que o valor ótimo de limiar quando as classes
apresentam a mesma distribuição de probabilidade (os lóbulos são exatamente iguais) é o ponto
médio entre as médias das classes.
2.3 Processamento imagens aplicados às Micrografias de MET
Uma micrografia típica de MET de LDL Nativa (ver Figura 2) foi carregada no software
ImageJ e o programa foi calibrado para trabalhar na escala da barra da micrografia, neste caso de
100 nm. Para tal, utilizase a ferramenta de linhas e traçase uma linha reta sobre a barra para
18
sabermos o seu tamanho em pixel, conforme a Figura 3. Em seguida, no menu de Analyze>Set
Scale abrirá uma janela em que será utilizada para indicar ao software que a distância medida
(Know distance) corresponde ao tamanho da barra, neste caso de 100 nm. Deste modo, o software
ImageJ passa a trabalhar nas dimensões da micrografia (nm) ao invés de pixel.
Figura 2: Micrografia Caracteristica de LDL Nativa.
Figura 3: Ilustração do procedimento utilizado para calibrar o software ImageJ para que o mesmo passe a trabalhar nasdimensões da micrografia ao invés de pixel.
Uma vez que o software esteja calibrado, podese realizar operações para melhorar o
contraste nas micrografias. Estas operações são necessárias para que quando for realizado o
processo de binarização da micrografia as partículas de LDL sejam resolvidas individualmente sem
que haja perda de informação. Neste caso, o préprocessamento de imagem necessário foi a
subtração do fundo (Process> Subtract Background>Rolling ball 150) e a equalização do
19
histograma da distribuição de frequência de pixel (Process> Enhance Contraste> Saturated
Pixels=0,5%>Equalize Histogram). Em seguida, no menu image>adjust>threshold, o
algoritmo/método de limiar (threshold) utilizado foi o método Huang [18] numa faixa de 30 a 50 do
histograma de pixels. Após estas etapas, as micrografias foram binarizadas [13]. A binarização é
um processo de conversão de uma imagem com níveis de cinza para uma imagem com
representação binária (dois tons) e é importante para uma série de objetivos, tais como: (i)
identificar objetos e separálos do fundo da imagem; (ii) quando analisar a forma da imagem é mais
importante que a intensidade dos pixels. Para realizar a binarização no ImageJ, vamos ao
menu>Process>Binary>Make Binary. Uma que vez que a micrografia esteja binarizada iremos
separar as LDL que possam ter permanecido conectadas, para tanto, vamos utilizar a função
watershed (menu>Process>Binary>Watershed). Através destes passos, obtêmse uma
micrografia/imagem binária em que a partícula apresenta valor 1 e o fundo valor 0, conforme
ilustrado na Figura 3. Para a caracterização das partículas de LDL com relação à forma/geometria,
no ImageJ devemos selecionar no menu>Analyze>Set Measurements>Shape descriptors.
Finalmente, a caracterização das partículas de LDL será realizada no menu>Analyze>Analyze
Particles>Size(150800)>Circularity(0.01.0)>Show(Outilines)>ok. Uma tabela com diversos
parâmetros para cada partícula encontrada será gerada. Nesta tabela estaremos interessados nas
grandezas: Feret (Diâmetros), Circ. (Circularidade) e AR (Aspect Ratio ou Razão de Aspecto) [8].
Figura 4: Micrografia binarizada da LDL Nativa.
2.4 A distribuição LogNormal.
As partículas de LDL exibem uma geometria quase esférica, com uma distribuição de forma
não uniforme [15]. A distribuição P(D) de diâmetros D, geralmente é dado por uma função log
normal, conforme a equação:
20
onde D0 e σ são o diâmetro médio e desvio padrão de ln D, respectivamente.
3 Resultados.
3.1-Resultados para Micrografias de LDL Nativas e Oxidadas com Cobre e Ferro.
A partir dos dados obtidos no ImageJ; os Diâmetros (Feret), a Circularidade [Circ =
4πArea/(Perimetro2)] e a AR (Aspect Ratio ou Razão de Aspecto = Eixo Maior/Eixo Menor) deram
origem aos histogramas com as distribuições de frequências, conforme apresentado nas Figuras 5, 6
e 7. Estes histogramas foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada
uma das 5 micrografias/imagens/regiões de cada amostra. As amostras analisadas foram partículas
de LDL Nativas (LDLNat), partículas de LDL oxidadas in vitro com Cobre (Cu; LDLCu) e Ferro
(Fe; LDLFe).
Figura 5: Histogramas das distribuições de Feret (Diâmetros) de cada partícula de LDL nativa.
21
Figura 6: Histogramas das distribuições de Razão de Aspecto de cada partícula de LDL nativa.
Figura 7: Histogramas das distribuições de Razão de Circularidade de cada partícula de LDL nativa.
Nas Figuras 8, 9 e 10, são apresentados os histogramas das distruibuições de frequências em
função dos diâmetros para as partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe. Estas distribuições
apresentam valores esperados de 23,16 ± 2,53 nm; 25,30 ± 2,73 nm e 27,14 ± 3,20 nm para as
partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe, respectivamente. Nas Figuras 11, 12 e 13 são
apresentados os histogramas das distribuições de frequências em função da circularidade para as
partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe. Estas distribuições apresentam valores esperados de
0,83 ± 0,01; 0,70 ± 0,02 e 0,60 ± 0,05 para as partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe,
respectivamente. Nas Figuras 14, 15 e 16 são apresentados os histogramas das distribuições de
frequências em função da AR para as partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe. Estas
22
distribuições apresentam valores esperados de 1,23 ± 0,02; 1,44 ± 0,01 e 1,40 ± 0,02 para as
partículas de LDLNat, LDLCu e LDLFe, respectivamente.
Figura 8: Histogramas das distruibuições de frequências de diâmetros para as particulas de LDL-Nat.
Figura 9: Histogramas das distribuições de frequências de diâmetros para as partículas de LDL-Cu.
Figura 10: Histogramas das distribuições de frequências de diâmetros para as partículas de LDL-Fe.
23
Figura 11: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDLNat.
Figura 12: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDL-Cu.
Figura 13: Histogramas das distribuições de frequências de circularidade para as partículas de LDL-Fe.
24
Figura 14: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Nat.
Figura 15: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Cu.
Figura 16: Histogramas das distribuições de frequências de AR para as partículas de LDL-Fe.
25
Nas Figuras 17, 18 e 19 são apresentados os gráficos de caixa (boxplot) para as grandezas
Diâmetro, Circularidade e Razão de Aspecto para o conjunto de amostra de LDLNat, LDLCu e
LDLFe. Nestes gráficos foram realizados o teste estatístico ANOVA com intervalo de confiança
(CI= 95%) e o resultado para a probabilidade p é apresentado nos gráficos de caixa. Estes gráficos
foram gerados para um número de partículas de LDL N= 275 em cada uma das amostras LDLNat,
LDLCu e LDLFe.
Figura 17: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Diâmetro do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu e LDL-Fe.
Figura 18: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Circularidade do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu eLDL-Fe.
26
Figura 19: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza Razão de Aspecto do conjunto de amostra de LDL-Nat, LDL-Cu e LDL-Fe.
3.2- Resultados para Micrografias de LDL Nativas, Oxidadas e Glicadas e Oxidadas.
3.2.1 Resultados para Micrografias de LDL Nativas.
Na Figura 20a é apresentado uma micrografia característica da LDL Nativa. A micrografia
foi binarizada e a partir da imagem binarizada foi possível obter as distribuições de diâmetro, razão
de aspecto (AR) e circularidade. Essas distribuições para as grandezas diâmetro, razão de aspecto
(AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras 20b, 20c e 20d, respectivamente.
27
cd
Figura 20 a- Micrografia característica da amostra de LDL Nativa. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).
Nas Figuras 21, 22 e 23 são apresentados os gráficos de caixa (boxplot) para as grandezas
diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Nativa. Estes Gráficos de
caixa (boxplot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada uma das
15 micrografias/imagens/regiões micrografadas nesta amostra.
Figura 21: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLNativa. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3
desvio padrão).
29
Figura 22: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLNativa. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Figura 23: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostraLDL Nativa. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Nas Figuras 21 e 22 foi possível observar que os diâmetros e as razões de aspectos
apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha
horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 25 nm e 1,25, respectivamente. Note que para os
valores de circularidades existe uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região com os
valores médios oscilando entre 0,65 e 0,75, conforme pode ser observado na Figura 22.
30
3.2.2 Resultados para Micrografias de LDL Oxidadas.
Na Figura 24a é apresentado uma micrografia característica da LDL Oxidada. Esta
micrografia também foi binarizada e a partir da imagem binarizada foi possível obter as
distribuições de diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade. Essas distribuições para as
grandezas diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras
24b, 24c e 24d, respectivamente.
31
cd
Figura 24 a- Micrografia característica da amostra de LDL Oxidada. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).
Nas Figuras 25, 26 e 27 são apresentados os gráficos de caixa (boxplot) para as grandezas
diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Oxidada. Estes Gráficos
de caixa (boxplot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para cada uma
das 15 micrografias/imagens/regiões de micrografadas nesta amostra.
Figura 25: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLOxidada. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que
3 desvio padrão).
33
Figura 26: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLOxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Figura 27: Gráficos de caixa (boxplot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra
LDL Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Nas Figuras 25 e 26 foi possível observar que os diâmetros e as razões de aspectos
apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha
horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 22,5 nm e 1,25, respectivamente. No entanto,
para os valores de circularidades existe uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região
com os valores médios oscilando entre 0,65 e 0,70, conforme pode ser observado na Figura 27.
34
Neste caso os diâmetros e as circularidades apresentam variações ligeiramente menores quando
comparados com as amostras de LDL Nativas.
3.2.1 Resultados para Micrografias de LDL Glicadas e Oxidadas.
Na Figura 28a é apresentado uma micrografia característica da LDL Glicada e Oxidada.
Esta micrografia também foi binarizada e a partir da imagem binarizada foi possível obter as
distribuições de diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade. Essas distribuições para as
grandezas diâmetro, razão de aspecto (AR) e circularidade podem serem visualizadas nas Figuras
28b, 28c e 28d, respectivamente.
35
cd
Figura 28 a- Micrografia característica da amostra de LDL Nativa. b- Distribuição de diâmetros (azul) ajustados comuma distribuição log-normal (vermelho). c- Distribuição de razões de aspecto (azul) ajustados com uma distribuiçãolog-normal (vermelho). d- Distribuição de circularidades (azul) ajustados com uma distribuição log-normal (vermelho).
Nas Figuras 29, 30 e 31 são apresentados os gráficos de caixa (boxplot) para as grandezas
diâmetro, circularidade e AR (Razão de Aspecto) para a amostra de LDL Glicada e Oxidada. Estes
Gráficos de caixa (boxplot) foram gerados a partir do total de partículas de LDL encontradas para
cada uma das 9 micrografias/imagens/regiões de micrografadas nesta amostra.
Figura 29: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza diâmetro do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLGlicada e Oxidada. Os diâmetros apresentam unidade de nm e os circulos representam os outliers (dados com valores
maiores que 3 desvio padrão).
37
Figura 30: Gráficos de caixa (box-plot) para a grandeza AR do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra LDLGlicada e Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Figura 31: Gráficos de caixa (boxplot) para a grandeza cicurlaridade do conjunto de 15 regiões diferentes da amostra
LDL Glicada e Oxidada. Os circulos representam os outliers (dados com valores maiores que 3 desvio padrão).
Nas Figuras 29 e 30 foi possível observar que os diâmetros e as razões de aspectos
apresentam distribuições uniformes para cada região com seus valores médios (indicado pela linha
horizontal dentro da caixa) oscilando em torno de 24,5 nm e 1,3, respectivamente. Note que para os
valores de circularidades existem uma mais alta variabilidade nas distribuições de cada região com
os valores médios oscilando entre 0,65 e 0,70, conforme pode ser observado na Figura 31. Neste
38
caso os diâmetros e as circularidades apresentam variações ligeiramente menores quando
comparados com as amostras de LDL Nativas.
Nas Figuras 32, 33 e 34 são apresentados os gráficos de caixa (boxplot) para as grandezas
Diâmetro, Circularidade e Razão de Aspecto para o conjunto de amostra de LDLNativa, LDL
Oxidada e LDLGlicada e Oxidada. Estes gráficos foram gerados para um número de partículas de
LDL N= 150 em cada uma das amostras LDLNativa, LDLOxidada e LDLGlicada e Oxidada.
Nestes gráficos foram realizados o teste estatístico ANOVA com intervalo de confiança (CI= 95%)
e o resultado para a probabilidade p > 0,15 foi obtido. Este valor de p indica que não há diferença
estatistica significativa entre os valores obtidos para diâmetro, razão de aspecto e circularidade.
Figura 32: Gráfico de caixa (boxplot) para a grandeza Diâmetro do conjunto de amostra de LDLNativa (NAT), LDL
Oxidada (OX) e LDLGlicada e Oxidada (GLD).
39
Figura 33: Gráfico de caixa (boxplot) para a grandeza AR do conjunto de amostra de LDLNativa (NAT), LDL
Oxidada (OX) e LDLGlicada e Oxidada (GLD).
Figura 34: Gráfico de caixa (boxplot) para a grandeza Circularidade do conjunto de amostra de LDLNativa (NAT),
LDLOxidada (OX) e LDLGlicada e Oxidada (GLD).
4- Conclusões.
Através da microscopia MET foi possível determinar variações ocorridas na morfologia da
lipoproteínas. As maiores variações na morfologia obtidas foram devido ao processo de oxidação da
lipoproteínas com Cobre e Ferro.
5- Artigo aceito para publicação.
40
O artigo com o título "On the influence of PDMS (polydimethylsiloxane) substrate surface
energy in wrinkling of DLC (diamondlike carbon) thin films" Manuscript [JR172595R1]
005739JAP foi aceito para publicação na revista “Journal of Applied Physics”. Esta revista
apresenta fator de impacto de 2.103 e classificação qualis B1 pela CAPES. DOI:
10.1063/1.5006609.
6-Participação em congressos, eventos e reuniões cientificas.
O candidato participou da 1st SPSLNX (São Paulo School on Scattering: Difraction and
Imaging using Light, Neutrons and Xrays) ocorrido entre os dias 17 e 21 de julho de 2017.
O candidato participou do 1º Encontro de Pósdoutorandos da Universidade de São Paulo. O
evento foi promovido pela Próreitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo e ocorreu nos dias
29 e 30 de Junho de 2017 na Comissão de Cooperação International (CCInt).
7 - Referências Bibliográficas
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