universidade de sÃo paulo escola de engenharia...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

AMANDA MONTEIRO ELIAS

Ação das enzimas de Ceriporiopsis subvermispora no biobranqueamento de polpas kraft de Eucalyptus grandis

Lorena 2007

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AMANDA MONTEIRO ELIAS

Ação das enzimas de Ceriporiopsis subvermispora no biobranqueamento de polpas kraft de Eucalyptus grandis

Dissertação apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de mestre em Biotecnologia Industrial. Área de concentração: Bioquímica e Microbiologia Orientadora: Profa Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres

Lorena 2007

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária

Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Elias, Amanda Monteiro

Ação das enzimas de Ceriporiopsis subvermispora no biobranqueamento de polpas kraft de Eucalyptus grandis / Amanda Monteiro Elias; orientadora Adriane Maria Ferreira Milagres - 2007

106 f: fig.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Bioquímica e Microbiologia) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, 2007

1. Biotecnologia 2. Xilanase 3. Ceriporiopsis subvermispora 4. Polpas kraft. I. Título.

574.6 - CDU

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DEDICATÓRIA

Em primeiro lugar a Deus que escreve nossos caminhos. Aos meus pais, César e Fátima, com amor, admiração e gratidão por sua compreensão, carinho, incentivo e incansável apoio ao longo do período de elaboração deste trabalho.

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AGRADECIMENTOS

À profa

Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres que muito me ensinou, pela paciência e ensinamentos, contribuindo para meu crescimento intelectual e científico. Aos professores, funcionários e técnicos do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ). Aos membros da banca. À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho. Aos meus irmãos, Luciane e Vinicius que mesmo distantes me incentivaram e trocaram idéias, enriquecendo este trabalho. Ao Luiz Homero e à Dona Dora pelo apoio, carinho e suporte durante a elaboração e conclusão deste trabalho. Às meninas companheiras, aos amigos que já tinha, e aos que ganhei neste caminho. Aos companheiros de trabalho, principalmente ao Valdeir, Joseana, Luís Ricardo e Michel, que me ensinaram muitas coisas importantes e sobretudo colaboraram no meu aprendizado.

Obrigada!

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“Já percorri esse longo caminho da liberdade. Procurei não vacilar e dei

muitos passos em falso no percurso. No entanto, descobri que depois de subir um

monte bem alto a gente apenas verifica que há muitos outros montes a escalar. Tirei

um instante para descansar, para dar uma olhadela no panorama glorioso que me

cerca, para olhar para trás e ver a distância que percorri. Porém só posso descansar

um instante, pois com a liberdade vêm as responsabilidades e eu não ouso demorar-

me, minha longa caminhada ainda não terminou.”

Nelson Mandela

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RESUMO

ELIAS, A. M. Ação das enzimas de Ceriporiopsis subvermispora no biobranqueamento de polpas kraft de Eucalyptus grandis. 2007. 106 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Lorena, 2007.

Enzimas extraídas de madeiras biotratadas por Ceriporiopsis subvermispora foram utilizadas no processo de biobranqueamento de polpas kraft de Eucalyptus grandis, seguida da seqüência de branqueamento químico EQP (extração alcalina, quelação e peroxidação). A caracterização dos extratos foi feita através da determinação das atividades enzimáticas do complexo xilanolítico: β-xilanase (346 UI/kg), β-xilosidase (62,6 UI/kg), β-glicosidase (87 UI/kg), β-mananase (231 UI/kg), endoglucanase (133 UI/kg) e da enzima manganês peroxidase (765 UI/kg). Xilanas de bétula, de fibra de trigo, de carvalho e de bagaço de cana-de-açúcar foram tratadas com xilanases de C. subvermispora e analisada a liberação de açúcares redutores que foi crescente por até 96 h. As xilanas de bétula, de fibra de trigo e de carvalho liberaram principalmente xilotetraose (0,63, 0,76, 0 g/L), xilotriose (0,24, 0,38, 0,19 g/L), xilobiose (0,52, 0,70, 0,39 g/L) e xilose (0, 0, 0,37 g/L), respectivamente. Ensaios com o extrato bruto de C. subvermispora e um extrato comercial sobre as polpas kraft de Eucalyptus grandis mostraram uma atuação semelhante quanto à liberação de açúcares redutores dos dois extratos nas polpas. Às polpas lavadas contendo 78% de celulose, 12,8% de polioses e 5,3% de lignina em sua constituição química e kappa e viscosidade iniciais de 12,9 e 24,8 cP, respectivamente, foram aplicados os extratos enzimáticos em função da atividade de xilanase nas concentrações de 0,5, 1, 1,5 e 2 UI/g, em diferentes tempos de tratamento (0,5, 1, 2, 3 e 5 h) a 40ºC e 10% de consistência. Foram feitas as medidas de absorbância a 237, 254, 280 e 465 nm e a quantificação dos açúcares redutores. Houve liberação de cromóforos a 254, 280 e 465 nm apenas para as cargas de 1,5 e 2 UI/g, enquanto que a 237 nm houve liberação de quantidades crescentes de cromóforos com o aumento da carga enzimática. A concentração máxima de açúcares redutores (23,6 g/L) foi obtida após 3 h de tratamento com 2 UI/g. O número kappa e a viscosidade das polpas foram medidos após o tratamento enzimático e após o branqueamento químico e o cálculo da eficiência da deslignificação e a seletividade foram medidos após a etapa de branqueamento químico. A diminuição do número kappa foi de 7,8% no tratamento enzimático, enquanto que no químico foi de 11,4%, ambos com a carga de 2 UI/g com 3 h de reação. As viscosidades de todas as amostras tratadas enzimaticamente foram maiores do que os controles. Após o branqueamento químico a carga de 2 UI/g foi a que apresentou os maiores valores de seletividade. A carga que propiciou a máxima redução no número kappa, aliados à maior redução de cromóforos a 237 e 465 nm e à maior liberação de açúcares redutores foi a de 2 UI/g, com tempos variando de 2 a 3 h de tratamento.

Palavras-chave: Biotecnologia Xilanase Ceriporiopsis subvermispora Polpa kraft

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ABSTRACT

ELIAS, A. M. Action of enzymes from Ceriporiopsis subvermispora in the biobleaching of Eucalyptus grandis kraft pulps. 2007. 106 f. Dissertation (Master of Science in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007.

Enzymes obtained from biopulping of wood by Ceriporiopsis subvermispora were used in the biobleaching process of Eucalyptus grandis kraft pulps, followed by an EQP bleaching sequence (alkaline extraction, chelating and peroxidation). Characterization of crude extracts were performed by determination of enzymatic activities of xylanolitic complex: β-xylanase (346 UI/kg), β-xylosidase (62,6 UI/kg), β-glucosidase (87 UI/kg), β-mannanase (231 UI/kg), endoglucanase (133 UI/kg) and for manganese peroxidase (765 UI/kg). Xylans from birchwood, oat spelt, beechwood and sugarcane bagasse were treated with xylanases from C. subvermispora and reducing sugars arose until 96 h. Birchwood xylan, oat-spelt xylan, beechwood xylan and sugarcane bagasse xylan released different quantities of xylotetraose (0,63, 0,76, 0 g/L), xylotriose (0,24, 0,38, 0,19 g/L), xylobiose (0,52, 0,70, 0,39 g/L) and xylose (0, 0, 0,37 g/L), respectively. Comparisons of kraft pulps assayed with a commercial extract or enzymatic extract of C. subvermispora showed similar results with respect to reducing sugars released. Pulps containing 78% of cellulose, 12,8% of hemicelluloses and 5,3% of lignin in its chemical composition, kappa number of 12,9 and viscosity of 24,8 cP, were submitted to the enzymatic treatment based on xylanase activity, at the concentrations of 0,5, 1, 1,5 and 2 UI/g for 0,5, 1, 2, 3 and 5 h at 40ºC and 10% consistency. It were measured the release of chromophores at 237, 254, 208 and 465 nm and reducing sugars. The chomophores were released at 254, 280 and 465 nm with xylanase dose of 1,5 and 2 UI/g, while the absorbance at 237 nm arose out of the xylanase dose increased. The maximum reducing sugars (23,6 g/L) was achieved after 3 h of treatment with 2 UI/g. Kappa number and viscosity of pulps were measured after enzymatic step and after chemical bleaching sequence and delignification efficiency and selectivity were determined after chemical bleaching sequence. The kappa number reduction was 7,8% after enzymatic pretreatment and 11,4% after the chemical bleaching sequence, both with xylanase dose of 2 UI/g for 3 h. Viscosity of all pulps enzymatically treated was higher than those without enzymatic treatment. The highest value of selectivity was achieved with 2 UI/g of xylanase. The highest kappa number reduction joined with the highest release of chomophores at 237 and 465 nm and reducing sugars were achieved with 2 UI/g of xylanase for 2 to 3 h of treatment.

Key-words: Biotechnology Xylanase Ceriporiopsis subvermispora kraft pulp

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LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Estrutura da celulose, parte central da cadeia molecular ......................................21

Figura 2.2 - Estrutura proposta para a macromolécula de lignina de Eucalyptus grandis .......22

Figura 2.3 - Estrutura dos monossacarídeos que formam as polioses ......................................23

Figura 2.4 - (A) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. Ac: grupo acetil;

α-Araf: α-arabinofuranose. (B) hidrólise de xilooligossacarídeos pela β-xilosidade...............26

Figura 2.5 - Cromóforos incorporados na lignina ....................................................................32

Figura 2.6 - Grupos cromógenos da lignina .............................................................................32

Figura 5.1 - Porcentagem de hidrólise da xilana de polpas kraft pelo extrato enzimático de C.

subvermispora e pelo extrato comercial. A carga enzimática aplicada foi de 2 UI/g nos dois

ensaios realizados .....................................................................................................................66

Figura 5.2 - Perfil da liberação de açúcares das xilanas por enzimas de C. subvermispora ....68

Figura 5.3 - Liberação de cromóforos a 237 nm em função do tempo de tratamento..............71

Figura 5.4 - Liberação de cromóforos a 254 nm em função do tempo de tratamento.............72



Figura 5.7 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 2 UI/g de xilanase nos

diferentes tempos de tratamento ...............................................................................................74

Figura 5.8 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 1,5 UI/g de xilanase

nos diferentes tempos de tratamento ........................................................................................74

Figura 5.9 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 1 (a) e 0,5 (b) UI/g de

xilanase nos diferentes tempos de tratamento ..........................................................................75

Figura 5.10 - Açúcares redutores liberados pelo tratamento enzimático nas polpas kraft em

função da carga enzimática referente à xilanase aplicada ........................................................76

Figura 5.11 - Hidrólise das polioses da polpa em diferentes cargas enzimáticas.....................77

Figura 5.12 - Viscosidade da polpa resultante do tratamento enzimático utilizando a carga

enzimática de 2 UI/g.................................................................................................................80


enzimática de 1,5 UI/g..............................................................................................................81


enzimática de 1 UI/g.................................................................................................................81


enzimática de 0,5 UI/g..............................................................................................................82

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Figura 5.16 - Viscosidade da polpa tratada com 2 UI/g de xilanase após o branqueamento

químico .....................................................................................................................................83

Figura 5.17 - Viscosidade da polpa tratada com 1,5 UI/g de xilanase após o branqueamento

químico .....................................................................................................................................83

Figura 5.18 - Viscosidade da polpa tratada com 1 UI/g de xilanase após o branqueamento

químico .....................................................................................................................................84

Figura 5.19 - Viscosidade da polpa tratada com 0,5 UI/g de xilanase após o branqueamento

químico .....................................................................................................................................84

Figura 5.20 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando a

carga de xilanase de 2 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico ...................86


carga de xilanase de 1,5 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico ................87


carga de xilanase de 1 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico ...................88

Figura 5.23 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando 0,5

UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico .......................................................89

Figura 5.24 - Viscosidade e número kappa em função da concentração de xilanase para os

tempos de tratamento enzimático de 1, 2 e 3 horas ..................................................................90

Figura 5.25 - Viscosidade e número kappa em função da concentração de xilanase para os

tempo de tratamento de 1, 2 e 3 horas para o branqueamento químico ...................................91

Figura 5.26 - Cromóforos (237 e 465 nm) e açúcares redutores liberados e número kappa em

função do tempo de tratamento (2 UI/g de xilanase)................................................................93

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LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Composição química das madeiras macias e duras..............................................21

Tabela 2.2 - Quadro resumido dos diferentes processos de separação dos componentes

lignocelulósicos ........................................................................................................................28

Tabela 2.3 - Características da celulose industrial obtida em diferentes processos de polpação

e seus usos ................................................................................................................................29

Tabela 2.4 - Notação dos Estágios de Branqueamento ............................................................33

Tabela 4.1 - Caracterização da polpa kraft de eucalipto...........................................................52

Tabela 4.2 - Constituição química do E. grandis utilizado neste trabalho ...............................52

Tabela 4.3 - Condições gerais de branqueamento ....................................................................60

Tabela 5.1 -.Produção enzimática de C. subvermispora em cavacos de E. grandis .................63

Tabela 5.2 - Concentração de açúcares redutores liberados dos tratamentos com os extratos

enzimáticos sobre polpas kraft. A carga enzimática aplicada foi de 2 UI/g nos dois ensaios

realizados ..................................................................................................................................65

Tabela 5.3 - Quantificação dos oligômeros detectados por CLAE ..........................................67

Tabela 5.4 - Quadro comparativo do grau de hidrólise entre as diferentes xilanas..................68

Tabela 5.5 - Condições utilizadas no branqueamento enzimático............................................69

Tabela 5.6 - Atividades aplicadas sobre a polpa referente às demais enzimas contidas no

extrato bruto de C. subvermispora............................................................................................70

Tabela 5.7 - Dados obtidos dos filtrados das polpas kraft após o tratamento com o extrato

bruto de C. subvermispora em diferente concentrações (0,5, 1, 1,5, e 2 UI/g) pela

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .....................................................................79

Tabela 5.8 - Resultados quanto à redução da viscosidade (%) e seletividade após o

branqueamento químico ...........................................................................................................91

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LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 4.1 - Relação entre massa seca, massa úmida, volume de enzima e volume de água a

ser acrescentada à mistura de reação para ajuste da consistência da polpa ..............................53

Equação 4.2 - Cálculo da lignina Klason .................................................................................54

Equação 4.3 - Cálculo da lignina solúvel .................................................................................55

Equação 4.4 - Cálculo da lignina solúvel .................................................................................55

Equação 4.5 - Cálculo do número kappa das polpas kraft........................................................57



Equação 4.8 - Cálculo da constante do viscosímetro ...............................................................58

Equação 4.9 - Cálculo da viscosidade ......................................................................................58

Equação 4.10 - Cálculo da redução da viscosidade (%)...........................................................59

Equação 4.11 - Cálculo da eficiência de deslignificação e seletividade ..................................59

Equação 4.12 - Cálculo da eficiência de deslignificação e seletividade ..................................59

Equação 4.13 - Taxa de hidrólise da xilana..............................................................................60

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AOX – Adsorbable Organic Halogen (‘Compostos Halogenados Absorvíveis’);

BRACELPA – Associação Brasileira de Papel e Celulose;

CMCase – Carboximetilcelulase ou Endo-1-4-β-glicanase;

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;

DNS – Ácido 3,5-dinitrosalicílico;

DP – Degree of Polymerization (‘Grau de Polimerização’);

DTPA – Diethylene Triamine Penta Acetate (‘Dietileno-Triamino-Penta-Acetato’);

EC – Enzyme Comission (‘Comissão que delibera sobre a nomenclatura das enzimas’);

ECF – Elemental Chlorine Free (‘Totalmente Livre de Cloro Elementar’);

EDTA – Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (‘Ácido Etileno-Diamino-Tetra-Acético’);

HexA’s – Hexenuronic Acids (‘Ácidos Hexenurônicos’);

HPLC – High Performance Liquid Chromatography (‘Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência’);

IPT – Instituto de Pesquisas Tecnológicas;

LCC – Lignin Carbohydrate Complex (‘Complexo Lignina-carboidrato’);

LiP – Lignina Peroxidase;

MnP – Manganês Peroxidase;

P&D – Pesquisa e Desenvolvimento;

PIB – Produto Interno Bruto;

pNP – P-nitrofenol;

pNPG – P-nitro-fenil-β-D-glicopiranosídeo;

pNPX – P-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo;

RI – Refraction Index (‘Índice de Refração’);

TAPPI - Technical Association of Pulp and Paper Industry (‘Associação Técnica da Indústria

do Papel e da Celulose’);

TCDF – 2,3,7,8-tetracloro-dibenzeno-furano;

TCF – Totally Chlorine Free (‘Totalmente Livre de Cloro’);

TCDD – 2,3,7,8-tetracloro-dibenzeno-p-dioxina.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................20

2.1. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA MADEIRA.................................................................20

2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DA MADEIRA .............................25

2.3. PROCESSOS DE POLPAÇÃO .....................................................................................28

2.4. PROCESSO KRAFT......................................................................................................29

2.5. PROCESSOS DE BRANQUEAMENTO......................................................................30

2.6. BRANQUEAMENTO ENZIMÁTICO..........................................................................37

2.7. HISTÓRICO DO USO DE XILANASES NA INDÚSTRIA DE PAPEL E CELULOSE

..................................................................................................................................................38

2.8. UTILIZAÇÃO DA ENZIMA MANGANÊS PEROXIDASE .......................................41

2.9. Ceriporiopsis subvermispora .........................................................................................42

3. OBJETIVOS.........................................................................................................................44

4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................45

4.1. PREPARO DOS EXTRATOS ENZIMÁTICOS ...........................................................45

4.1.1. Extrato de Ceriporiopsis subvermispora ..................................................................45

4.1.2. Extrato comercial......................................................................................................46

4.1.3. Caracterização dos extratos ......................................................................................46

4.1.3.1. β-Xilanase...........................................................................................................46

4.1.3.2. β-Xilosidase........................................................................................................47

4.1.3.3. β-Glicosidase ......................................................................................................48

4.1.3.4. β-Mananase ........................................................................................................49

4.1.3.5. Endoglucanase ....................................................................................................50

4.1.3.6. Manganês Peroxidase (MnP)..............................................................................51

4.2. PREPARO DAS XILANAS...........................................................................................51

4.3. POLPA............................................................................................................................52

4.3.1. Consistência das polpas (%) .....................................................................................53

4.3.2. Tratamento Enzimático das Polpas...........................................................................53

4.4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS POLPAS ..........................................54

4.4.1. Determinação da lignina insolúvel (Lignina Klason)...............................................54

4.4.2. Determinação da lignina solúvel ..............................................................................55

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4.4.3. Determinação da Lignina Total ................................................................................56

4.4.4. Determinação dos carboidratos ................................................................................56

4.4.5. Determinação do número kappa ...............................................................................56

4.4.6. Determinação da Viscosidade ..................................................................................58

4.4.7. Redução da Viscosidade...........................................................................................59

4.4.8. Cálculo da Eficiência de Deslignificação e Seletividade .........................................59

4.5. TAXA DE HIDRÓLISE DA XILANA..........................................................................60

4.6. BRANQUEAMENTO DAS POLPAS...........................................................................60

4.6.1. Determinação do pH das polpas ...............................................................................61

4.6.2. Extração alcalina (E) ................................................................................................61

4.6.3. Quelação (Q).............................................................................................................61

4.6.4. Peroxidação (P).........................................................................................................62

4.7. REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS...........................................................62

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................................63

5.1. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS NOS EXTRATOS DE C.

SUBVERMISPORA...................................................................................................................63

5.2. EFEITO DAS ENZIMAS DE C. SUBVERMISPORA E DO EXTRATO COMERCIAL

NA HIDRÓLISE DAS POLPAS .............................................................................................64

5.3. ANÁLISE DOS PRODUTOS DAS XILANAS DE DIFERENTES ORIGENS APÓS

AÇÃO DA XILANASE ...........................................................................................................66

5.4. BRANQUEAMENTO DAS POLPAS...........................................................................69

5.4.1. Análise dos produtos das polpas kraft após a ação do complexo enzimático de C.

subvermispora ..........................................................................................................................70

5.4.2. Características da polpa tratada com diferentes concentrações de enzimas e

branqueada................................................................................................................................79

5.5. CORRELAÇÃO ENTRE CROMÓFOROS, NÚMERO KAPPA E LIBERAÇÃO DE

AÇÚCARES REDUTORES ....................................................................................................92

6. CONCLUSÕES....................................................................................................................94

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................96

APÊNDICES ..........................................................................................................................105

16

1. INTRODUÇÃO

A indústria de papel e celulose representa um dos mais expressivos setores industriais do

mundo. O mercado mundial de celulose atingiu cerca de 28 milhões de toneladas em 1995,

movimentando US$ 25 bilhões, resultado do aumento de preços ocorrido a partir de 1994. No

período de 1995/2005 as taxas anuais médias ficaram ao redor de 3,3%, percentual elevado a 4,6%

quando se trata das fibras curtas de eucalipto, a especialidade brasileira. Entre 1993 e 2003, foram

investidos US$ 12 bilhões e para o período de 2003 até 2012, a meta é ultrapassar os US$ 14

bilhões. Nos últimos dez anos, o crescimento do Produto Interno Bruto (PIB) do país foi de 25%,

mas a indústria de celulose e papel registrou, no mesmo período, crescimento na produção de

celulose de 70% e de 50% na produção de papel. Segundo estimativas da Bracelpa, a produção de

celulose em 2006 alcançou 10,5 milhões de toneladas, 5% a mais em relação a 2005. Desse total, 6

milhões de toneladas foram destinadas à exportação, volume 16% superior ao ano anterior. A

produção nacional de celulose de eucalipto (celulose de fibra curta) responde pela metade da

produção mundial desse tipo de fibra, com uma produção ao redor de 6 milhões de toneladas de

polpa por ano, dos quais 98% são branqueadas.

A indústria de papel e celulose é importante na economia da América do Sul devido à

grande disponibilidade de recursos florestais, sendo o Brasil e o Chile os maiores produtores de

celulose da região. Os grandes avanços nos campos da silvicultura e da biotecnologia permitiram

que o Brasil se tornasse o 7º maior produtor mundial de celulose (incluindo fibras curtas e longas),

o maior produtor mundial de celulose branqueada de eucalipto, líder nas exportações de celulose

de fibra curta e 11º na produção de papel. Na década de 90 havia no Brasil mais de 90 empresas

papeleiras, como por exemplo as grandes Aracruz, Suzano, Champion e Rio Cell que obtiveram

um faturamento líquido em torno de R$ 940 milhões em 2005 (CABALLERO, 2005). Hoje, são

220 empresas de papel e celulose, que empregam cerca de 100 mil pessoas em 255 unidades

industriais. O setor exporta 90% da sua celulose de mercado (a não integrada com a produção do

papel). Com capacidade atual instalada de 7,8 milhões de toneladas/ano de celulose de fibra curta,

das quais 5,5 milhões de toneladas destinadas ao mercado externo, notadamente Europa (48%),

Ásia (27%), América do Norte (22%) e demais países (3%), o Brasil assumiu a liderança mundial

na exportação de celulose de fibra curta branqueada e deverá notabilizar-se cada vez mais nesse

segmento como provedor do mercado internacional (FURTADO, 2006).

17

A principal vantagem comparativa do Brasil para o aumento de suas exportações foi o

desenvolvimento da celulose de fibra curta de eucalipto e a sua aceitação no mercado

internacional. Esse tipo de celulose significou uma redução do tempo de corte da madeira, o que

representa em torno de 25% do custo da celulose. Em 2000, a produção de papel atingiu 7,2

milhões de toneladas e a de celulose 7,6 milhões. E a previsão é de que o consumo de celulose

aumente nessa década sendo previsto um incremento na produção de 4 milhões de toneladas de

celulose por volta de 2017-2018. O superávit da balança comercial em 2000 foi de US$ 1,8 bilhão,

enquanto o faturamento total do setor alcançou em torno de R$ 13,7 bilhões.

O potencial de crescimento do setor de papel no mercado brasileiro é infinitamente superior

em relação aos níveis atuais, apesar do consumo per capita ser considerado um dos menores do

mundo, havendo, portanto, grande necessidade de se reduzir a carga tributária sobre os

investimentos, como forma de contribuir para a instalação de novas fábricas de papel.

Enquanto no Brasil são consumidos apenas 40 quilos de papel por habitante ao ano, em países

desenvolvidos são encontrados níveis de consumo bem mais elevados, como é o caso dos Estados

Unidos (312 kg per capita/ano), Japão (247 kg per capita/ano), Alemanha (236 kg per capita/ano),

Canadá (223 kg per capita/ano), Reino Unido (210 kg per capita/ano) e Itália (195 kg per

capita/ano), ou mesmo nos demais países latino-americanos como Chile (67 kg per capita/ano),

México (58 kg per capita/ano) e Argentina (50 kg per capita/ano). Isso porque o consumo está

vinculado a dois fatores muito importantes: renda e escolaridade.

Como a produção de celulose e a produção de papel estão integradas, os investimentos se

direcionam para a integração da cadeia produtiva, ou seja, desde o plantio das árvores até o

acabamento do produto final, por exemplo, papel de impressão, tornando as empresas auto-

suficientes em matérias primas. Isso faz com que os investimentos dessa indústria tenham um

longo prazo de retorno, dado que os investimentos são da ordem de US$ 1.400 por tonelada de

papel; as escalas mínimas de investimentos atualmente estão acima de 100 mil toneladas. Além

disso, há a necessidade de investimentos contínuos em torno de US$ 100 milhões por parte dos

grandes produtores para a manutenção da capacidade produtiva. Outros investimentos são

direcionados para a atividade de reflorestamento, principal fonte de matéria-prima, e para o

desenvolvimento tecnológico. Os investimentos em pesquisa e desenvolvimento da indústria

brasileira representam apenas 1% do seu faturamento. Há também o impacto sócio-ambiental do

setor. O segmento de celulose e papel planeja investir no Brasil US$ 14,4 bilhões, no período de

2003 a 2012, para ampliar a capacidade produtiva e abrir 60 mil novos empregos. Nos últimos dez

anos, foram aplicados US$ 12 bilhões na ampliação da capacidade (BRACELPA, 2006).

18

A competição nesta indústria se dá por preço e qualidade. Nesse setor é necessário conjugar

qualidade, baixo custo e, principalmente, escala de produção. A diferenciação dos produtos torna-

se cada vez mais relevante, havendo a valorização do produto final. Nos últimos anos, acelerou-se

o processo de criação de produtos, ocorrendo algumas inovações na tecnologia de processos,

possibilitando ganhos expressivos de produtividade, e conseqüentemente, incentivando os gastos

com P&D. Pressões ambientalistas têm levado as empresas a investir no desenvolvimento e

implantação de novas tecnologias de processos, com destaque para a área de branqueamento, além

de pesados gastos com controle ambiental. Essa pressão é exercida, principalmente, em três

vetores: a exigência de produtos que não agridam o meio ambiente, o uso de tecnologias limpas e

o deslocamento de matéria-prima de origem florestal por papel reciclado. O principal objetivo das

indústrias tem sido o desenvolvimento de novas tecnologias que possam reduzir ou suprimir a

presença de poluentes, principalmente compostos organoclorados, nos efluentes das plantas de

branqueamento. Uma das escolhas para esse objetivo é a tecnologia baseada no tratamento

enzimático. Uma classe de enzimas já utilizada em escala industrial são as xilanases,

principalmente devido ao seu baixo custo de produção. Em 1995 o custo da enzima foi de US$

3,50 por tonelada de polpa (FARREL et al., 1996) e há relatos de que esse preço atualmente é mais

baixo. O tratamento com xilanase é muito versátil, associando as vantagens do pré-tratamento

enzimático, como redução de reagentes químicos, com modificações mínimas nos processos e

conseqüentemente um capital de investimento mínimo. É realizado em plantas que tratam tanto

madeiras macias, quanto madeiras duras que produzem polpas de mercado, plantas integradas,

plantas com deslignificação e plantas com 3-, 4- e 5- seqüências de branqueamento. Sabe-se que a

enzima não branqueia ou deslignifica a polpa, mas torna a polpa mais fácil para branquear nas

fases subseqüentes do branqueamento químico. Muitas xilanases têm sido isoladas e

caracterizadas, contudo pouco se sabe da atuação do complexo em substratos insolúveis, como em

polpas kraft. Para se tirar o máximo proveito do uso das enzimas, há necessidade de conhecer seus

mecanismos de reação com a lignina residual. A partir desse conhecimento, é possível combinar

de maneira mais efetiva os vários reagentes de branqueamento numa seqüência que seja de alta

eficiência e baixo impacto ambiental. O tratamento com xilanase também diminui o conteúdo de

ácidos hexenurônicos (HexA’s) das polpas, diminuindo o consumo de agentes branqueadores.

Existem 20 fábricas de celulose na América do Norte utilizando xilanase, sendo 7 no

Canadá e 13 nos Estados Unidos. Acima de 3,9 milhões de toneladas de polpa kraft foi tratada em

2001 e 6 milhões de toneladas em 2002. No Canadá, 4,2 toneladas de polpa são tratadas

diariamente, enquanto nos Estados Unidos são 6,9 toneladas. A utilização da xilanase em fábricas

19

americanas tem sido de aproximadamente 67% em madeiras duras e 37% em madeiras macias.

Uma razão para o aumento na utilização de xilanase é que o desempenho da xilanase tem

melhorado significativamente desde sua primeira implementação em fábricas anos atrás (VAN

DER BURGT et al., 2002). A efetividade do tratamento enzimático depende das propriedades da

enzima utilizada e da procedência desta, do tipo da madeira, do processo de cozimento e da

seqüência branqueadora que será utilizada em conjunto com a incubação com xilanase. Por estas

razões, estudos preliminares são requeridos havendo a necessidade de uma caracterização

detalhada da polpa e do papel resultantes através da utilização de xilanases de diferentes origens,

para um melhor entendimento dos efeitos enzimáticos nas fibras, primeiramente em escala

laboratorial para que seja possível então a subseqüente utilização desta tecnologia em escala

industrial.

Estudos feitos em laboratório mostram que não são caros os investimentos necessários para

adaptar o tratamento enzimático às plantas industriais existentes e o tratamento enzimático tem se

mostrado completamente compatível com os equipamentos instalados. Além disso, linhagens de

microrganismos que apresentam maior eficiência na produção de xilanase aliada à tecnologia,

oferecem baixos investimentos em xilanases branqueadoras de polpa, que são ambientalmente e

economicamente vantajosas. Indústrias de papel e celulose iniciaram pesquisas que relacionam a

produção de xilanases livres de celulase por microrganismos.

Neste estudo foi utilizado o extrato enzimático produzido pelo fungo de decomposição

branca Ceriporiopsis subvermispora para a avaliação do efeito biobranqueador de polpas kraft de

Eucaliptus grandis. Em seguida a polpa tratada enzimaticamente foi submetida a uma seqüência de

branqueamento químico. Ceriporiopsis subvermispora tem sido um dos fungos mais estudados nos

últimos anos devido ao complexo enzimático produzido e pelo seu potencial de deslignificar

seletivamente materiais lignocelulósicos, sendo por essa razão escolhido para este estudo.

20

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A biodegradação da madeira é um processo natural de reciclagem da matéria orgânica e

ocorre em todos os ambientes naturais (terrestres e aquáticos) quando as condições ambientais são

favoráveis. Do ponto de vista tecnológico, a biodegradação ou biopolpação, da madeira pode ser

utilizada em diversos processos industriais de transformação destinados à produção de celulose e

papel, além de outros.

Durante o processo de biopolpação um grande volume de enzimas pode ser recuperado.

Manganês-peroxidase é a principal enzima oxidativa produzida por Ceriporiopsis subvermispora,

enquanto xilanase e mananase são as principais enzimas hidrolíticas. Tais enzimas são

potencialmente importantes no biobranqueamento de polpas celulósicas, em que a lignina é

removida quase completamente após o processo de polpação. Porém uma parte dessa lignina

permanece na polpa interferindo na qualidade do produto final (CHRISTOV e PRIOR, 1997).

Estudos têm mostrado que a aplicação de enzimas hemicelulolíticas como a xilanase e a mananase

nesse processo, é capaz de solubilizar as polioses facilitando indiretamente a retirada de lignina.

Porém, tem-se descrito que a extensão da hidrólise das polioses residuais na polpa é dependente

entre outros fatores, das propriedades das enzimas, a massa molar, as cargas líquidas, o ponto

isoelétrico, a estabilidade térmica, a estabilidade ao pH e a interferência de inibidores da sua

atividade (MAGALHÃES, 2005).

2.1. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA MADEIRA

Sob o ponto de vista químico, a madeira é constituída principalmente de celulose, lignina e

polioses, em diferentes proporções. Extrativos, minerais, amido e pectina também estão presentes

na madeira num baixo teor (Tabela 2.1).

21

Tabela 2.1 - Composição química das madeiras macias e duras

Componentes Madeira dura (%) Madeira macia (%)

Celulose 40-50 45-50

Galactoglucomanana 2-5 20-25

Xilana 15-30 5-10

Lignina 18-25 25-35

Extrativos 1-5 3-8

(BIERMANN, 1996)

- Celulose

É o componente mais abundante nos lignocelulósicos, sendo um polímero linear (parte

amorfo e parte cristalino) formado exclusivamente por moléculas de anidro-glicose unidas por

meio de ligações β-(1-4)-glicosídicas. Estritamente a celulose é composta por unidades

monoméricas de celobiose (Figura 2.1) que se repetem sempre pela junção de duas moléculas de

glicose seguida da eliminação de água através das hidroxilas ligadas ao carbono 1 e 4 (FENGEL e

WEGENER, 1989). As pontes de hidrogênio inter e intramolecular são responsáveis pela

manutenção das regiões cristalinas, e tornam a celulose altamente resistente à hidrólise ácida,

alcalina ou enzimática (WOOD e SADDLER, 1988; CONVERSE e WARE, 1994). O tamanho da

cadeia de celulose é normalmente especificado pelo grau de polimerização (GP), que corresponde

ao número médio de unidades de glicose presentes na molécula de celulose.

Figura 2.1 - Estrutura da celulose, parte central da cadeia molecular (FENGEL e WEGENER, 1989)

22

- Lignina

A lignina tem um papel significante na proteção natural da madeira (DANIEL, 2003). É

composta basicamente de unidades fenilpropano formando uma macromolécula tridimensional e

amorfa, representando de 20 a 30% do total de lignocelulósicos (Figura 2.2). O acoplamento das

unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é atribuído ao mecanismo de

biossíntese da lignina, que se processa por via radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois

cinamílicos precursores (sinapílico, coniferílico e para-cumarílico).

Os diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos de

ligação entre as unidades fenilpropano. As mais abundantes são: β-O-4 e α-O-4 (50 a 65%), β-5 (6

a 15%), β-1 (9 a 15%), 5-5 (2 a 9%) e β-β (2 a 5%). Esses vários tipos de ligações formadas

originam uma estrutura tridimensional complexa (KANTELINEN, 1992).

Figura 2.2 - Estrutura proposta para a macromolécula de lignina de Eucalyptus grandis (BRASILEIRO et al., 2001)

23

- Polioses

As hemiceluloses ou polioses são oligômeros de baixa massa molar formadas por xilana,

galactana e glucomanana como componentes principais, podendo ainda apresentar quantidades

variáveis de ácidos urônicos e desoxi-hexoses em alguns tipos de madeira. As polioses estão

intimamente associadas à celulose na parede da célula vegetal e são compostas por diferentes

unidades de açúcares formando cadeias ramificadas (FENGEL e WEGENER, 1989). A estrutura

dos monossacarídeos que formam as polioses está mostrada na Figura 2.3.

Figura 2.3 - Estrutura dos monossacarídeos que formam as polioses (FENGEL e WEGENER, 1989)

A classificação é feita geralmente de acordo com o resíduo de açúcar presente na cadeia

principal. A cadeia principal pode conter quantidades variadas de diversas ramificações como

acetil, metil-glucuronil e arabinofuranosil. Os grupamentos arabinofuranosil podem ser

esterificados por ácidos aromáticos tais como ácido ferúlico e p-cumárico, que podem participar na

ligação lignina-hemicelulose (JEFFRIES, 1990; COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993). O teor de

polioses em diferentes tipos de lignocelulósicos é bastante variável, mas pode-se admitir um valor

médio de cerca de 20% (FERRAZ et al., 2002). Nas madeiras duras, tipo eucalipto, cerca de 25 a

40% da massa é constituída por polioses do tipo xilana, O-acetil-4-O-metil glucoronoxilana (20 a

24

35%) e glucomanana (3 a 5%) (TIMELL, 1965; JANES, 1969; COWLING e KIRK, 1976;

FENGEL e WEGENER, 1989; HON e SHIRAISHI, 2001).

Em seu estado natural as polioses não são cristalinas em razão da heterogeneidade de seus

constituintes, da presença de pequenos grupos laterais e em alguns casos ramificações,

diferentemente da estrutura altamente linear das moléculas de celulose (JANES, 1969).

- Extrativos

Os denominados extrativos da madeira são terpenos, resinas e polifenóis localizados

principalmente no cerne, e são responsáveis pela cor, cheiro e resistência da madeira (HARTLEY

e CLIVE, 1989; DESCHAMPS, 1989). As leucoantocianinas são os polifenóis mais abundantes

nas plantas depois da lignina, e são os precursores dos flavonóides e taninos presentes na madeira

(BARISKA e PIZZI, 1986). Os extrativos na madeira podem representar até 10% de sua

composição (FENGEL e WEGENER, 1989).

- Elementos inorgânicos

Na madeira os elementos inorgânicos encontram-se em baixas concentrações e

representam de 0,2 a 0,3% de seu peso seco (KOLLMAN e COTÊ, 1984). Os elementos

inorgânicos mais comuns são Ca (500-800 ppm), K (60-100 ppm) e Mg (50-80 ppm) (ELLIS,

1965). Também tem sido detectado P (20 ppm), Mn (4-100 ppm), B (2-15 ppm), Ba (2-15 ppm),

Fe (1-3 ppm), Sr (1-6 ppm), Al (0,5-6 ppm), Cu (0,5-1 ppm) e Zn (0,3-0,8 ppm) (GUYETTE et al.,

1992). Os íons metálicos na madeira podem existir na forma de compostos inorgânicos insolúveis

ou unidos à lignina e pectinas (CUTTER e GUYETTE, 1993). A presença dos elementos Mn, Fe,

Ca, Cr e Zn em maiores concentrações tem sido detectadas nas células do parênquima e na lamela

média (GUYETTE et al., 1992; HEIJNESSON et al., 1995).

25

2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DA MADEIRA

A biodegradação da celulose ocorre pela ação de três grupos de enzimas que atuam

sinergicamente. Esses grupos de enzimas compreendem as endo-1,4-β-glicanases, as exo-1,4-β-

glicanases e as 1,4-β-glicosidases. As endoglucanases rompem a molécula de celulose ao acaso e

liberam fragmentos menores que servem de substrato para as exo-glucanases. As exo-glucanases

hidrolisam, pelas pontas, os fragmentos de menor massa molecular, liberando moléculas de

celobiose. As β-glicosidases hidrolisam a celobiose até glicose (BHAT e BHAT, 1997).

A biodegradação da lignina ocorre através de pelo menos duas classes distintas de

enzimas: as fenoloxidases e as enzimas que produzem peróxido de hidrogênio. Entre as

fenoloxidases, ainda se podem descrever dois grupos: um contém as enzimas dependentes de

peróxido ou peroxidases. As peroxidases que estão envolvidas na biodegradação da lignina são

lignina peroxidase (LiP, EC 1.11.1.14) e peroxidase dependente de manganês (MnP, EC

1.11.1.13). As lacases (EC 1.10.3.2, benzenodiol oxigênio oxidoredutase), o outro subgrupo, são

cuproproteínas que não dependem de peróxido para atuar (FERRAZ, 2001; HAKALA et al.,

2005). As enzimas que produzem peróxido de hidrogênio são acessórias às peroxidases, gerando

peróxido de hidrogênio ‘in situ’ possibilitando que as peroxidases atuem.

A biodegradação das polioses ocorre de forma semelhante à da celulose, porém requer

um conjunto de enzimas extracelulares mais complexo. Isso ocorre devido a sua estrutura de

heteropolissacarídeo ramificado. São classificadas de acordo com o substrato em que atuam, sendo

também agrupadas sob o nome genérico de glicano-hidrolases (SUNNA e ANTRANIKIAN,

1997).

Por exemplo, a degradação completa de xilana requer a ação combinada de diferentes

enzimas (Figura 2.4). Assim, as endo-β-1,4-D xilanases rompem ligações glicosídicas ao acaso

produzindo grandes quantidades de xilo-oligossacarídeos substituídos e não-substituídos de

diversos tamanhos. As exo-β-1,4-D-xilanases removem somente unidades de xilose a partir das

extremidades da cadeia de xilana. As β-xilosidases hidrolisam sacarídeos como xilobiose e xilo-

oligossacarídeos maiores até xilose. Entre as enzimas que participam da quebra das cadeias laterais

destacam-se as α-L-arabinofuranosidases e as α-D-glucuronidases, além das esterases que

participam na liberação dos substituintes acetil, cumaril e feruloil, que atuam sinergicamente com

as endo-xilanases e as β-xilosidases (ERIKSSON, 1990; COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).

26

As mananases atuam sobre ligações glicosídicas entre moléculas de manose e as glucuronidases

sobre ligações de ácidos urônicos com moléculas de açúcares.

Figura 2.4 - (A) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. Ac: grupo acetil; α-Araf: α-arabinofuranose. (B) hidrólise de xilooligossacarídeos pela β-xilosidade (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997)

A disponibilidade de informações sobre as propriedades das diferentes xilanases vem do

estudo das enzimas de fungos e bactérias. Uma maneira de classificar as xilanases as dividem em

quatro grupos. Dois capazes de hidrolisar pontos de ramificação, diferindo nos produtos finais

formados. Assim, o primeiro produz xilobiose e xilose e o segundo produz xilo-oligossacarídeos

de tamanho intermediário. Os outros grupos não são capazes de hidrolisar ramificações. Um deles

produz xilo-oligossacarídeos maiores que a xilobiose e o outro produz principalmente xilobiose e

xilose (KULKARNI et al., 1999).

Xilanases de diferentes organismos são geralmente estáveis em uma ampla faixa de pH

(3-10) e apresentam uma faixa ótima que pode variar de 4-7. As xilanases produzidas pelo fungo

Aspergillus kawachii, por exemplo, e Penicillium herque exibem pH ótimo na faixa ácida (pH 2-

6). Endo-xilanases de fungos têm massas molares na faixa de 7 a 60 kDa e são geralmente mais

ativas a pH 3,5-6,0 e 40-60ºC (TAN et al., 1987; BISWAS et al., 1990; BAILEY et al., 1992).

27

Xilanases microbianas são formadas por proteínas de apenas uma cadeia com massas moleculares

por volta de 8 a 145 kDa (KULKARNI et al., 1999).

As β-xilosidases purificadas de fungos, bactérias e leveduras hidrolisam pequenos xilo-

oligossacarídeos a partir do terminal não redutor liberando xilopiranoses. Além da atividade

hidrolítica muitas β-xilosidases tem uma alta atividade de transferase, o que provoca a formação de

oligossacarídeos de massa molar maior que o substrato original (REILLY, 1981). Em comparação

às endo-xilanases, β-xilosidases apresentam uma massa molar mais elevada. Elas são mais ativas

na faixa de pH de 4,0-7,0 e a temperaturas entre 40-80ºC (KITPREECHAVANICH et al, 1986;

JOHN e SCHMIDT, 1988). A afinidade de β-xilosidases em degradar xilana e xilo-

oligossacarídeos é fundamental na conversão total da biomassa a monossacarídeos. Pequenos xilo-

oligossacarídeos lineares podem ser convertidos completamente a xilose por β-xilosidases,

contudo a afinidade em relação aos xilo-oligossacarídeos diminui com o aumento da cadeia

(TAKENISHI e TSUJISAKA, 1973; REILLY, 1981).

As α-L-arabinofuranosidases são enzimas que atuam em L-arabinosídeos de baixa massa

molar e seus oligossacarídeos. Este grupo de enzimas atua juntamente com as endo-xilanases e β-

xilosidases para hidrólise de arabino(glucorono)xilanas. As α-L-arabinofuranosidases tem sido

purificadas de fungos, bactérias e leveduras. Em comparação às endo-xilanases, apresentam massa

molar relativamente alta (400 kDa) e pH ótimo entre 2,5-7,0 (BRILLOUET et al., 1985;

POUTANEN, 1988). A utilização desta enzima para hidrólise de arabinoxilanas reduz a

solubilidade do substrato devido à agregação intermolecular. Um pré-tratamento de arabinoxilana

com endo-xilanases que não apresentem atividade desramificadora, seguido de um tratamento com

arabinofuranosidase, seria a melhor alternativa para prevenir a agregação de longas cadeias e a

obtenção de um rendimento máximo em monossacarídeos (ANDREWARTHA et al., 1979).

Um grupo de enzimas de grande importância na hidrólise da xilana proveniente de

madeiras duras são as acetil esterases. Estas enzimas hidrolisam ligações éster de cadeias alifáticas

e aromáticas e removem grupos O-acetil de xilanas ou oligossacarídeos. As esterases apresentam

pesos moleculares na faixa de 30-70 kDa, com poucas exceções. Elas são mais ativas na faixa de

pH de 5,0-8,0 e a temperaturas variando de 40-80ºC (POUTANEN e SUNDBERG, 1988;

SUNDBERG et al., 1990). Acetil esterases são importantes na degradação de xilanas acetiladas

porque em geral os substituintes acetil impedem a ação de endo-xilanases. Tem sido demonstrado

que a acetil esterase e endo-xilanase atuam cooperativamente na hidrólise de acetil xilana (BIELY,

1985). Dependendo do substrato e da especificidade da acetil esterase, uma distinção pode ser feita

entre acetil xilana esterase e acetil esterase. Acetil xilana esterase é capaz de liberar ácido acético

28

de xilana acetilada sem a cooperação de endo-xilanases, enquanto acetil esterase necessita da

cooperação de uma endo-xilanase para liberar ácido acético (POUTANEN e SUNDBERG, 1988;

POUTANEN et al., 1990; SUNDBERG e POUTANEN, 1991).

As α-glucuronidases são enzimas que hidrolisam resíduos (4-O-metil)glucurônico, e que

auxiliam na conversão total de (arabino)glucuronoxilanas a monossacarídeos. As análises

estruturais da parede celular mostraram que grupos carboxílicos do ácido metilglucurônico estão

ligados a grupos hidroxilas da lignina (SMITH e FORSBERG, 1991). Possuem massas molares

elevadas e são mais ativas a altas temperaturas e condições ácidas.

2.3. PROCESSOS DE POLPAÇÃO

O termo polpação se refere a diferentes processos de separação das fibras de materiais

lignocelulósicos, principalmente da madeira. Assim, de acordo com o processo, a pasta resultante

pode ser química, semiquímica, quimimecânica, quimiotermomêcanica e mecânica.

(CARVALHO, 2003).

Os processos de polpação em geral se dividem em dois grandes grupos, polpação de alto

rendimento (mecânico) e polpação química. Mais recentemente processos biotecnológicos vêm

sendo desenvolvidos (Tabela 2.2).

A polpação química apresenta rendimento médio de 50%, já que a maior parte da lignina

e das polioses são removidas durante o processo de cozimento. Entre os processos químicos de

polpação, o mais utilizado é o sulfato ou kraft, correspondendo a mais de 80% da produção anual

mundial de polpas celulósicas.

Tabela 2.2 - Quadro resumido dos diferentes processos de separação dos componentes lignocelulósicos Tipo de processo Descrição sucinta do processo Observações

Físico Utilizam apenas energia mecânica, não envolvendo emprego de reagente químicos. a) Irradiação de raios gama; b) Tratamento a vapor (tratamento térmico) c) Steam-explosion (aquecimento e rápida descompressão do material).

Elevado custo de energia, tanto elétrica, quanto mecânica. a)Pouco eficaz. b)Pouco eficaz, podendo provocar reações entre os produtos secundários oriundos da fração hemicelulósica e o complexo lignina-celulose. c)Efetivo, promove a separação integral dos três componentes poliméricos.

Continua

29

Conclusão

Tabela 2.2 - Quadro resumido dos diferentes processos de separação dos componentes lignocelulósicos Químico Utiliza agentes químicos

específicos para cozinhar o material sob pressão. Os processos podem ser: ácidos (sulfito) ou alcalinos (sulfato e soda).

Efetivo. Amplamente empregado na indústria de celulose e papel, tendo como desvantagem a formação de resíduos altamente poluentes.

Biotecnológico a)Utiliza a ação de microrganismos selecionados capazes de promover a deslignificação dos materiais lignocelulósicos. b)Utilização de enzimas provenientes de microrganismos.

Parcialmente efetivo. Necessita de processos complementares de deslignificação, devido à baixa velocidade de degradação do material (período de meses). Processo ainda em fase experimental. Efetivo no pré-tratamento complementar aos processos industriais convencionais. Necessita aprimoramento.

(CASTRO, 2001)

Assim, as propriedades do papel e da celulose dependem do processo industrial utilizado

(Tabela 2.3).

Tabela 2.3 - Características da celulose industrial obtida em diferentes processos de polpação e seus usos

Tipos Características Usos

Pasta mecânica Resistência física reduzida,

baixo custo, boa capacidade de impressão, alta opacidade.

Papel de jornal, catálogos, revistas, papéis de parede, papéis absorventes e papelão.

Celulose semiquímica

Características bem variáveis de processo para processo.

Papelão corrugado, papel de jornal, papel de impressão, escrita e desenho.

Celulose sulfato/

kraft

Escura, opaca e bastante resistente.

Não-branqueada: papéis, papelões e cartões para embalagem e revestimentos.

Branqueada: papéis de para embalagens, impressão (livros).

(CASTRO, 2001)

2.4. PROCESSO KRAFT

Entre os processos químicos de polpação, o mais bem estabelecido e utilizado

mundialmente em larga escala é o kraft. Na polpação kraft, os cavacos de madeira são submetidos

à reação com solução de hidróxido de sódio (NaOH) e sulfato de sódio (Na2SO4): o “licor

30

branco”, formando então sulfeto de sódio (Na2S). Isso ocorre dentro do digestor, mantido a altas

pressões e temperaturas. Os produtos químicos fragmentam a lignina, quebrando-a em substâncias

de baixa massa molar, solúveis na solução alcalina, podendo então ser removidas das fibras por

inúmeras etapas de lavagem. A polpa ou pasta celulósica resultante da polpação (polpa marrom)

ainda não é adequada para a produção de determinados tipos de papel, exatamente pela sua

coloração escura. Essa coloração é devida, principalmente, a pequenas quantidades de lignina que

não foram removidas das fibras, chamada agora de lignina residual. A transformação tecnológica

da madeira em polpa celulósica, pelos processos químicos convencionais resulta na degradação e

perda de 50% do peso da madeira. Além da clivagem e solubilização da lignina, parte dos

produtos químicos é utilizada para neutralização de compostos ácidos provenientes da degradação

dos carboidratos (ácido acético e ácidos urônicos removidos das polioses) e pelos produtos de

degradação da lignina (FENGEL e WEGENER, 1989; DYER, 2004). A presença de sulfeto de

sódio (Na2S) produz íons hidrossulfito (HS-) que aceleram a remoção da lignina, resultando em

uma polpa de melhores propriedades mecânicas. O cozimento é controlado até atingir-se um

número kappa pré-estabelecido o que indica a quantidade de lignina residual na polpa (MIMMS et

al., 1993). A reação é realizada a temperaturas entre 160-180°C, com tempo de cozimento entre

0,5-6 horas, dependendo das propriedades desejadas para a polpa (FENGEL e WEGENER, 1989;

BIERMANN, 1993).

Em madeiras duras, como o eucalipto, o principal constituinte das polioses é uma O-

acetil-2-O-(4-O-metil-α-D-glucurono)-β-(1,4)-D-xilana. Durante a polpação kraft, a estrutura desta

poliose é extensivamente modificada.

2.5. PROCESSOS DE BRANQUEAMENTO

No branqueamento das pastas químicas, em que a maior parte da lignina foi removida

previamente pelo processo de polpação, devem ser removidos derivados de lignina ainda

remanescentes na pasta. O branqueamento reduz a quantidade de certas impurezas na polpa, tais

como feixes de fibras contendo um teor de lignina mais alto do que a média da polpa (shives) e

fragmentos de casca (flecks). O valor comercial de certos tipos de polpa é altamente dependente da

quantidade dessas impurezas. O branqueamento também ajuda a reduzir o conteúdo de extrativos

resinosos (pitch) na polpa, que pode gerar pintas e depósitos de resina durante o processo de

fabricação de papel, além do conteúdo de "pitch" influenciar as propriedades de envelhecimento

31

do papel. Essas são as mudanças das características da polpa mais importantes que ocorrem

durante o branqueamento. Outras incluem um aumento da capacidade de absorção de água,

redução do grau de polimerização, retenção de corante e resinas e a alteração da composição dos

carboidratos (SINGH, 1979). Para obter uma polpa com elevada alvura e estabilidade de alvura, a

lignina tem que ser removida. Isto não pode ser feito no digestor porque se o cozimento for muito

prolongado ocorrerá degradação e dissolução dos carboidratos.

Os grupos funcionais que conferem cor às substâncias são conhecidos como cromóforos.

A maioria deles possui ligações insaturadas como C =O, C = C ou N = N, em sistemas conjugados.

Alguns grupos funcionais como as hidroxilas (-OH), as aminas (-NH) e os halogêneos (Cl, Br),

não conferem cor às substâncias, porém conseguem aumentar a absorção de um cromóforo e

deslocar seu comprimento máximo de absorção, sendo denominados ‘auxôcromos’. Denomina-se

cromógena uma estrutura básica, capaz de absorver radiação ultravioleta ou visível e que tem essa

absorção deslocada em comprimento de onda pela ação de um grupo funcional. Inicialmente,

assumiu-se que a fonte primária de cor na madeira era a estrutura da lignina. Mais tarde, por meio

de análises espectrais, constatou-se que outras estruturas possuindo propriedades cromóforas

específicas precisam também estar presentes para justificar a cor apresentada pelas pastas, já que

nenhuma das estruturas básicas da lignina, ou seja, guaiacil propano e siringil propano, absorve

radiação de comprimento de onda na região visível. A madeira possui vários cromóforos

incorporados em sua estrutura, indicadas na Figura 2.5 (NAVARRO, 2004).

32

Figura 2.5 - Cromóforos incorporados na lignina (RAPSON, 1969)

Os mais importantes grupos cromógenos entre os radicais das moléculas da lignina são

as carbonilas conjugadas, as duplas ligações e combinações de ambas (Figura 2.6) (SILVA, 1986).

Figura 2.6 - Grupos cromógenos da lignina (RAPSON, 1969)

33

Embora os polissacarídeos, celulose e polioses não absorvam na região visível, quando

são formados grupos carbonila nos carboidratos de uma pasta branqueada, é observado um

amarelamento, pois o envelhecimento pela luz do dia, temperatura ou um ataque mais acentuado

do álcali durante o cozimento resultam na degradação, especialmente das polioses, associada à

reversão de alvura (PERISSOTO, 2000).

Tendo observado a natureza da cor na pasta celulósica, verifica-se que para torná-la mais

clara, ou seja, branqueá-la, é necessário remover ou alterar quimicamente as substâncias coloridas,

interrompendo as conjugações de duplas ligações por oxidação, redução ou hidrólise dos grupos

saturados (REDKO, 1978; SJÖSTRÖM, 1993).

A remoção da lignina residual de polpas normalmente é conduzida em uma seqüência

multiestágios (Tabela 2.4), variando de acordo com o grau de alvura desejado, para melhor

preservação das propriedades mecânicas das fibras de celulose (FENGEL e WEGENER, 1989). A

seleção de um processo de branqueamento depende da matéria-prima tratada (madeira, gramíneas,

resíduos agrícolas e outros), do tipo de polpação (mecânico, sulfato, semiquímica e outras) e da

finalidade a qual se destina o produto (impressão, embalagem, uso industrial, higiênico, dissolução

ou outras).

Tabela 2.4 - Notação dos Estágios de Branqueamento Estágio Notação Reagente Cloração C Cloro gasoso ou água de cloro Dioxidação D Dióxido de cloro (ClO2) Dióxido de cloro / Cloro DC Dióxido de cloro (ClO2) seguido de Cloro (Cl2) sem

lavagem intermediária Extração alcalina E Hidróxido de sódio (NaOH) Extração oxidativa (E+H) Inclusão do hipoclorito no estágio de extração Extração oxidativa (E+P) Inclusão do peróxido no estágio de extração Hipocloração H Hipoclorito de sódio (NaClO) ou de Cálcio (Ca(ClO)2) Peroxidação P Peróxido de hidrogênio (H2O2) Quelação Q Tratamento da polpa com quelante (EDTA, DTPA, etc) Oxigenação (Pré- branqueamento) O Oxigênio (O2) e Hidróxido de sódio (NaOH) Branqueamento enzimático X Xilanase, lacase e/ou outras

(SENAI CETCEP, 2001)

Modificações no processo kraft de polpação tem permitido obter polpas com menor teor

de lignina residual, possibilitando o desenvolvimento de técnicas de branqueamento livre de cloro

elementar (ECF) e totalmente livre de cloro (TCF). No processo ECF o dióxido de cloro (ClO2) e o

hipoclorito de sódio (NaClO) são usados nas seqüências de branqueamento e no processo TCF

34

usam-se oxidantes não clorados como o oxigênio, ozônio e peróxido de hidrogênio. No entanto,

esses reagentes são menos seletivos e eficientes quando comparados ao cloro elementar e ao

dióxido de cloro (ERIKSSON, 1997; WONG et al., 1997a).

Um dos maiores inconvenientes do uso da cloração, processo convencional e mais

utilizado no branqueamento de polpas, é a geração de produtos organoclorados (mais de 200), cuja

toxicologia de mistura é muito complexa. Uma das maneiras de se quantificar esses compostos é

através da medida do conteúdo em organoclorados que podem ser adsorvidos em carvão ativado

(AOX). Desses AOX, de 1-3% são solúveis em solventes orgânicos não polares e são os de maior

significância ambiental, já que são bioacumulativos. Os compostos de maior toxicidade são as

dioxinas e os compostos dibenzeno furanos, dentre os quais o 2,3,7,8-tetracloro-dibenzeno-p-

dioxina (TCDD) e o 2,3,7,8-tetracloro-dibenzeno-furano (TCDF) que são os mais tóxicos (CPRH,

1998).

As operações de polpação e branqueamento têm forte efeito na química dos carboidratos

de polpas kraft. Essencialmente, a estrutura química das xilanas é modificada devido à conversão

dos grupos de ácidos 4-O-metilglucurônicos em grupos de ácidos hexenurônicos (HexA’s).

Durante esta conversão ácidos 4-O-metilglucorônicos são primeiro isomerizados para ácidos 4-O-

metilidurônicos e, posteriormente, convertidos via β-eliminação em ácidos hexenurônicos. Estes

contêm uma dupla ligação, que pode reagir com vários agentes químicos de branqueamento, como

ozônio, dióxido de cloro ou perácidos. A eficiência do branqueamento pode ser melhorada

removendo-se os ácidos hexenurônicos da polpa através de uma hidrólise ácida, resultando na

economia de reagentes de branqueamento. Os ácidos hexenurônicos também reagem com

permanganato e contribuem para o aumento do número kappa das polpas kraft.

Durante a hidrólise ácida, os ácidos hexenurônicos são convertidos principalmente em

ácido 2-furanocarboxílico, ácido fórmico e 5-carboxi-2-furaldeído. Sob condições ácidas brandas,

os HexAs são hidrolisados muito mais rapidamente do que outras estruturas de carboidratos.

Simultaneamente, o número kappa da polpa é decrescido. Os ácidos urônicos presentes na polpa

participam da reversão de alvura de polpas kraft, então parece que os ácidos hexenurônicos,

devido ao fato de conterem na sua estrutura uma dupla ligação, têm maior significância no papel

de reversão de alvura do que os ácidos metilglucurônicos (JEFFRIES, 2001).

A remoção seletiva de ácidos hexenurônicos tem aplicação no branqueamento ECF e

TCF de polpas kraft. As principais vantagens são um menor consumo de reagentes de

branqueamento, maior estabilidade na alvura da polpa branqueada e decréscimo na formação de

depósitos nos equipamentos de branqueamento, que é devido à redução na formação de ácido

35

oxálico. Adicionalmente, o controle de metais no branqueamento TCF é mais fácil porque a

hidrólise seletiva dos hexenurônicos remove, parcialmente, os sítios quelantes das polioses.

- Extração alcalina

A extração alcalina da polpa, também conhecida como pré-deslignificação, pode ser

considerada uma parte integrante de uma seqüência de branqueamento de múltiplos estágios. Seu

objetivo é remover os componentes coloridos da polpa, parcialmente branqueada, que se tornam

solúveis em soluções alcalinas diluídas mornas, pela ação de reagentes químicos usados no pré-

branqueamento (SENAI CETCEP, 2001). No estágio de extração alcalina ocorre uma remoção

extensiva de lignina clorada e oxidada e, conseqüentemente, o grau de alvura da polpa no

branqueamento subseqüente aumenta, sendo necessário menores quantidades de reagente de

branqueamento para atingir o grau de alvura desejado. Portanto, a economia do branqueamento e a

manutenção das propriedades de resistência da polpa são favorecidas. Nesse sentido, a extração

alcalina pode ser considerada um estágio de branqueamento sem significativa degradação

oxidativa das fibras. Entretanto, pode ocorrer a solubilização das polioses, sendo necessário um

controle de temperatura e concentração da soda cáustica, de forma a limitar o problema. Outros

benefícios provenientes dos processos de extração alcalina são relacionados à estabilidade da

alvura, opacidade, maciez e algumas propriedades mecânicas da polpa. Os principais objetivos nos

estágios que precedem a extração são a remoção da maioria da lignina e a solubilização da lignina

residual em meio alcalino. O uso de hidróxido de sódio para lavar a polpa após a cloração tem se

tornado uma etapa vital em plantas de branqueamento (NAVARRO, 2004).

- Peroxidação

Os peróxidos usados no branqueamento são o peróxido de hidrogênio e o peróxido de

sódio. O branqueamento com H2O2 remove pouca lignina em comparação com os processos

convencionais que utilizam oxigênio e compostos clorados. Esta característica é extremamente

importante quando se trata de pastas de alto rendimento. Para estes tipos de pasta, o estágio de

36

branqueamento visa apenas a modificação da estrutura das substâncias que estão presentes na

massa, sem solubilizá-las. Entretanto, sua utilização no branqueamento de polpas químicas vem se

destacando em função de fortes pressões ambientais contra os compostos clorados, responsáveis

pelos elevados níveis de AOX (compostos organoclorados) presentes nos efluentes do processo de

branqueamento. O íon hidroperóxido (OOH-) é a espécie ativa do branqueamento com peróxido.

Por esta razão, o branqueamento ocorre em meio alcalino, o que favorece o aparecimento do

hidroperóxido. A decomposição do peróxido é controlada pela adição de materiais tais como,

silicato de sódio e sulfato de magnésio, que além de formar um complexo com as formas oxidadas

das glucopiranoses, estabilizam as ligações glicosídicas da molécula de celulose, evitando sua

despolimerização (HORTAL e LLUCIÁ, 1984); agentes quelantes, tais como: EDTA (ácido

etileno-diamino-tetra-acético), DTPA (dietileno-triamino-penta-acetato) e tratamento ácido com

HCl, H2SO4, SO2-. O efeito benéfico de agentes quelantes é geralmente creditado às suas

habilidades em desativar metais de transição que catalisam a decomposição do peróxido. É muito

importante uma lavagem perfeita da pasta após o pré-tratamento com ácido ou agentes quelantes

para remoção dos metais seqüestrados (SENAI CETCEP, 2001).

O peróxido de hidrogênio é um ácido fraco, com constante de ionização 1,72 a 20ºC e,

em solução, forma o íon hidroperóxido ao qual se atribui a ação branqueadora. Embora a formação

de íons hidroperóxido e a razão do branqueamento aumentem com a alcalinidade, a decomposição

do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é acelerada em meio fortemente alcalino. A

decomposição do peróxido é catalisada ainda por um grande número de impurezas metálicas,

como prata, platina, cobre, cromo, manganês, cobalto, molibdênio e tungstênio, que estão

presentes no licor alcalino na forma de hidróxidos. A eficiência dos branqueadores à base de

peróxido depende da inativação desses catalisadores de decomposição. Durante a peroxidação, a

adição de sais de magnésio tem comprovado ser eficiente na diminuição da degradação dos

carboidratos. Diversas teorias explicam essa função de proteção dos carboidratos (SINGH e

DILLNER, 1979; NUNN e LINDE, 1980), mas de acordo com COLLODETE et al. (1990), a

função do magnésio seria a de prevenir a propagação das reações em cadeia dos radicais livres

gerados no processo. Esses radicais livres, e em particular, o radical hidroxil (HO*) podem causar

a clivagem das cadeias de celulose. A perda de viscosidade resultante do uso de peróxido de

hidrogênio na extração não traduz em resistências inferiores da polpa branqueada, e que de fato

seu uso facilita o refino da polpa, além de reduzir a reversão da alvura (NAVARRO, 2004).

37

2.6. BRANQUEAMENTO ENZIMÁTICO

O uso de enzima como auxiliar no branqueamento passou de escala laboratorial no final

dos anos 80 (VIIKARI et al., 1987) para aplicações industriais atualmente, com a vantagem de não

requerer grandes modificações no processo tradicional (SUURNAKKI, 1997; FERRAZ, 1999;

DUARTE et al., 2003).

Na indústria de papel e celulose, as enzimas de maior interesse e aplicabilidade são as

hemicelulases, poligalacturonases, pectinases, lacases, celulases, lignina peroxidases, manganês

peroxidase e glicose oxidases (MONTEIRO, 1997). Os compostos convencionais de

branqueamento com reagentes à base de cloro vêm sendo substituídos alternativamente por

oxigênio, peróxido de hidrogênio, ozônio e perácidos, com boa aceitação comercial. Mais

recentemente, o tratamento enzimático da polpa com hemicelulases, principalmente xilanases,

resultou na diminuição dos branqueadores químicos utilizados no processo, diminuindo a poluição

ambiental (SUBRAMANIYAN e PREMA, 2002).

Nos processos de branqueamento enzimático das polpas a dose ótima de enzima está entre

2 e 5 UI/g de polpa seca e a consistência da polpa entre 5 a 10% (BEG et al., 2001). Muitos dos

efeitos benéficos do pré-branqueamento da xilanase pode ser obtido de 1 a 2 h de tratamento (BEG

et al., 2000; GUPTA et al., 2000).

O objetivo principal do branqueamento químico é remover a lignina residual das polpas,

retendo os carboidratos. Há várias hipóteses propostas para explicar o efeito que o pré-tratamento

com hemicelulases tem no branqueamento das polpas. A primeira é a remoção de cromóforos

derivados de xilana, já que no cozimento alcalino as moléculas de xilose e xilana podem sofrer

modificações, formando estruturas parcialmente aromáticas e coloridas. Esses cromóforos

derivados da degradação de xilana podem ser removidos mais facilmente pelo uso de xilanase do

que por reagentes químicos (WONG et al., 1997a). Outra hipótese seria a de que há uma ligação

entre lignina e polioses na polpa que restringe a remoção da lignina residual. O rompimento das

cadeias de xilana pela xilanase separa as ligações de lignina-carboidrato, que ocorrem após o

período de cozimento, melhorando o acesso dos reagentes de branqueamento e facilitando a

remoção da lignina em subseqüentes seqüências químicas de branqueamento (BAJPAI e BAJPAI,

1996; YOUNG e AKHTAR, 1998; ERIKSSON, 1997; WONG et al., 1997a). As interações entre

a celulose e a xilana podem contribuir para a integridade das fibras da polpa dificultando a

remoção da lignina presente no interior dessa estrutura. O uso de xilanase pode romper essa

estrutura facilitando a subseqüente remoção da lignina residual. Ocorre também o inchamento das

38

fibras que gera poros maiores do que as macromoléculas de xilanas removidas (WONG et al.,

1997a). Dentre os mecanismos citados, os mais aceitos são a clivagem da porção de carboidrato do

complexo lignina-carboidrato e a remoção das xilanas redepositadas sobre as fibras. Também há

evidências de que a presença de ácidos hexenurônicos derivados de xilana que escurecem as

polpas e levam a um maior consumo de reagentes químicos de branqueamento (BUCHERT et al.,

1996; SUURNÄKKI et al., 1996; DYER, 2004).

2.7. HISTÓRICO DO USO DE XILANASES NA INDÚSTRIA DE PAPEL E CELULOSE

O primeiro registro sobre a possibilidade da xilanase aumentar o branqueamento de

polpa kraft foi apresentado em Estocolmo em 1986, durante a Terceira Conferência Internacional

sobre Biotecnologia na Indústria de Polpa e Papel (VIIKARI et al., 1986). O pré-tratamento da

polpa com hemicelulases brutas, preparadas a partir de um fungo Ascomycete, melhorou a

deslignificação por peróxido de polpas de bétula e pinus, reduzindo a quantidade de lignina

remanescente na polpa, medida pelo número kappa. A deslignificação por uso de dióxido de cloro

e cloro com subseqüente extração alcalina também aumentou, permitindo uma redução na

quantidade de cloro usado no estágio de branqueamento. Trabalhos subseqüentes usando enzimas

parcialmente purificadas sugeriram que xilanases, e não outras enzimas hemicelulolíticas ou

desramificantes, são responsáveis pelo aumento na deslignificação da polpa bem como pelo

branqueamento (KANTELINEN et al., 1988). Embora alguns trabalhos tenham mostrado que

mananase também contribui para o branqueamento de polpas de madeira macia, a habilidade de

xilanases para aumentar o branqueamento de polpa kraft tem sido verificado usando xilanases

clonadas geneticamente, que não apresentam outra atividade enzimática conhecida (WONG et al.,

1997b).

PAICE et al. (1992) encontraram que os efeitos de xilanases no branqueamento da polpa

estão associados a uma marcante redução no grau de polimerização (DP) da xilana. Essas

observações foram consistentes com a hipótese de que os efeitos do pré-branqueamento resultam

primariamente da despolimerização, mas não necessariamente na solubilização das polioses

derivadas da xilana.

Os fungos são excelentes produtores de xilanase, mas freqüentemente secretam

celulases, que pode afetar negativamente a qualidade das polpas. Muitos trabalhos tem estudado a

produção de xilanases livres de celulases utilizando diversas fontes de carbono, principalmente

39

resíduos, como palha de cana-de-açúcar, palha de milho e outros. Alternativamente, organismos

geneticamente modificados tem sido utilizados para produzir exclusivamente xilanases.

Entretanto, aplicando-se métodos e meios de crescimento apropriados é possível isolar e

selecionar microrganismos que produzem xilanases totalmente livres de celulases ou que

contenham quantidades negligenciáveis. Aspergillus foetidus (ATCC 14916); Aspergillus oryzae

(NRRL 1808); Aspergillus niger (ATCC 10864); Aspergillus niger (NRRL 3536); Aspergillus

phoenicis (ATCC 15555); Gliocladium viride (CBS 658.70) e Aureobasidium pullulans (NRRL

Y-2311) são excelentes produtores de xilanase apresentando menos de 0,1 UI/mL de atividade de

enzimas celulolíticas (CHRISTOV at al., 1999).

Características desejáveis das xilanases para o branqueamento de polpas kraft incluem:

baixo peso molecular (assegurando o acesso à matriz da polpa), atividade em pH alcalino (para

funcionar bem nas polpas kraft), especificidade para xilana (para evitar a degradação da celulose)

(BARAZNENOK et al., 1999).

Preparações de xilanases de Trichoderma spp. foram usadas em branqueamento. Tais

pré-tratamentos foram realizados utilizando-se de 1 a 5 kg de enzima comercial para cada tonelada

de polpa seca, com tempos de incubação de 0,5 a 3 horas. A comparação de duas xilanases de T.

reesei Rut C30, sugeriu que a enzima que mais solubilizou a xilana de polpa de pinus também

forneceu um melhor efeito no aumento do branqueamento (TENKANEN et al., 1992).

As modificações nas propriedades do papel após pré-tratamento da polpa com xilanase

do actinomicete termofílico, Saccharomonospora viridis, também foram estudadas. Este

microrganismo produz xilanase extracelular sem apresentar atividade para celulose. As

propriedades foram exploradas pela aplicação da enzima bruta em polpa de bétula e resultou na

remoção seletiva de aproximadamente 20% do total de xilana presente. Os resultados, juntamente

com aqueles do pré-tratamento da polpa de algodão com a xilanase de S. viridis e uma celulose

comercial, sugeriram que a remoção específica de xilana reduz o grau de ligação entre as fibras

mas não as rompe (BARAZNENOK et al., 1999).

Dentre as preparações comerciais de xilanases indicadas para tratamento da polpa de

madeira, três são produzidas a partir de: Trichoderma ssp.: Pulpzyme HA (Novo Laboratórios

Ltda), de T. reesei: Albazyme (Cultor Ltd.) e de T. longibrachiatum: Ecopulp (Alko Ltd.)

(WONG e SADDLER, 1992). As faixas de pH e temperatura usuais de algumas enzimas

comerciais são 5-7 e 40-55ºC para Cartazyme, pH 7-8 e 50-60ºC para Irgazyme, pH 7-8 e 50ºC

para Ecopulp e pH 7 e 45-50ºC para Resinase, respectivamente. Bleachzyme, Amano 90 e

40

Xilanase GS35 são outras enzimas comerciais com temperatura de aplicação de 30-40ºC e pH 4,5-

7 (TECHAPUM et al., 2003).

Em um estudo comparativo realizado com duas xilanases comerciais e um extrato bruto

de xilanase isolado de Streptomyces thermoviolaceus para aplicação em seqüência de

branqueamento CEDED de polpas de bétula, foi obtida uma redução no consumo de ClO2 de cerca

de 30 a 35%. Como decorrência da redução na quantidade de cloro utilizado no branqueamento a

carga de compostos organoclorados produzidos e descartados nos efluentes também é reduzida.

Por exemplo, a quantidade de matéria orgânica clorada (AOX) produzida no branqueamento de

uma polpa kraft de 91% de alvura, é reduzido de 4,3 para 3,5 kg de AOX/tonelada métrica de

polpa (cerca de 19%), quando xilanases são aplicadas antes do branqueamento com Cl2 e ClO2

(FERRAZ et al., 2001). Os estudos de aplicação de novas xilanases em seqüências de

branqueamento são necessários porque cada tipo de polpa e processo pode ter uma resposta frente

a um tratamento enzimático específico, ou seja, os preparados comerciais não atuam com a mesma

eficiência sobre qualquer tipo de polpa.

O desenvolvimento de seqüências de branqueamento ECF que utilizam agentes

oxidantes não clorados em substituição a um dos estágios com dióxido de cloro também tem se

mostrado promissor se aplicado em conjunto com xilanases. No estudo de uma seqüência de

branqueamento (XDEP) foi obtida uma polpa final com maior índice de alvura e viscosidade, com

redução de 26 a 42% no consumo de dióxido de cloro em relação à polpa controle. As

características do efluente também foram melhores para a seqüência com utilização de xilanases,

com redução na cor e no conteúdo de compostos AOX (ELEGIR et al., 1995).

Estudos detalhados feitos em laboratório mostram que não são caros os investimentos

necessários para adaptar o tratamento enzimático às plantas industriais, exceto em relação ao pH.

O tratamento enzimático tem se mostrado completamente compatível com os equipamentos

industriais existentes. Desde 1991, o biobranqueamento, juntamente com os processos ECF e TCF,

tem sido continuamente usado em escala industrial na Finlândia. A quantidade de cloro requerida

no branqueamento é reduzida de 20-30% e como resultado tem-se a redução da carga de AOX nos

efluentes de branqueamento de 15-20%. Maior número de testes industriais tem sido feitos na

Europa, principalmente na Escandinávia, onde a maioria da polpa kraft é produzida (KULKARNI

et al., 1999).

41

2.8. UTILIZAÇÃO DA ENZIMA MANGANÊS PEROXIDASE

A enzima manganês peroxidase é secretada por muitos fungos degradadores de lignina,

incluindo Phanerochaete chrysosporium, T. versicolor, P. sordida, e outros (HARAZONO et al.,

1994).

O íon Mn(II) presente nos cavacos de madeira pode ser oxidado durante o cozimento

kraft (sob condições alcalinas) (HIRAI et al., 2002). Embora o Mn(II) necessário para o sistema

catalítico da MnP esteja presente nas polpas kraft, a polpa não é substancialmente branqueada a

menos que MnSO4 seja adicionado durante o branqueamento ‘in vitro’ contendo tampão malonato

50 nM (pH 4,5) (HARAZONO et al., 1994). A presença de surfactantes também é um fator

importante no branqueamento de polpas com MnP. O surfactante pode dispersar a lignina

hidrofóbica degradada em soluções aquosas impedindo a repolimerização da lignina degradada.

Foi mostrado que MnP exerce um importante papel no branqueamento de polpas kraft de

madeiras não branqueadas por fungos de decomposição branca e a enzima tem se mostrado

eficiente no pré-tratamento de polpas kraft de madeiras duras. Harazono et al. (1994) reportaram a

deslignificação da lignina residual em polpas kraft com MnP isolada. MnP proporcionou um

aumento na alvura de cerca de 10 pontos e reduziu o número kappa em cerca de 6 pontos na

presença de MnSO4 e H2O2. Quando os tratamentos com MnP foram repetidos seis vezes em

combinação com a extração alcalina, a alvura da polpa aumentou 43 pontos. Com polpas kraft de

eucalipto foi obtida uma redução de 14% do valor kappa (MILAGRES et al., 1992; DURÁN et al.,

1995). Resultados similares foram obtidos com polpa organosolv (ácido fórmico). Reduções do

valor kappa e aumentos da alvura em solventes orgânicos também foram observados (DURÁN,

1996). A enzima MnP do fungo Phanerochaete sordida foi isolada e testada ‘in vitro’ com polpas

kraft de eucalipto deslignificadas com oxigênio, e a redução no número kappa foi utilizada como

uma indicação da oxidação da lignina. A preparação enzimática contendo MnP aplicada na dose de

60 UI/g de polpa por 6 horas (com agitação de 150 rpm a 27°C) causou um significante

decréscimo de 13% no número kappa na polpa em relação aos controles. O tratamento foi iniciado

com a adição de peróxido de hidrogênio (H2O2) em pulsos a cada 30 min, dando uma concentração

final de 0,5 mM a cada adição. Esta redução é comparável àquelas obtidas para várias polpas

utilizando MnP de outras fontes fúngicas, que obtiveram uma redução variando de 9 a 32%. Neste

estudo foi observado que doses maiores do que as utilizadas não trouxeram benefícios adicionais

às polpas. Esta observação pode sugerir limitações quanto à acessibilidade ou a susceptibilidade à

42

oxidação da lignina residual nas polpas (HIRAI et al., 2002). Foi observado uma correlação

positiva entre os níveis da enzima MnP produzida pelo fungo Bjerkandera sp. linhagem BOS55 e

o branqueamento de polpas quando a atividade de MnP variou entre 0 a 40 UI/ml, entretanto não

houve um grande aumento no branqueamento quando foram adicionados atividades maiores. É

possível que a solubilização da lignina e dos cromóforos da polpa seja limitante ao processo de

branqueamento. Esse processo é bem regulado na presença do microrganismo, gerando um bom

branqueamento, o que não acontece quando a enzima é isolada (MOREIRA et al., 2001).

2.9. Ceriporiopsis subvermispora

O gênero Ceriporiopsis Dom. é um gênero poróide que pertence à família Polyporaceae

(HAROLD, 1998). C. subvermispora vem sendo utilizado há alguns anos em pesquisas realizadas

por um consórcio formado por indústrias papeleiras e a Universidade de Wisconsin, em Madison,

EUA. Resultados bastante animadores já foram reportados envolvendo a utilização de C.

subvermispora no pré-tratamento de madeira anterior a processos mecânicos e termomecânicos

(SETLIFF et al., 1992; AKHTAR et al., 1992, 1993).

Muitas publicações têm mostrado que o crescimento fúngico em substrato sólido e líquido,

apresentou baixa atividade celulolítica, mas uma alta atividade hemicelulolítica e ligninolítica

(SETHURAMAN et al., 1998, SOUZA-CRUZ et al, 2004; HEIDORNE et al., 2006).

Considerando a atividade celulolítica, detectou-se baixa atividade para as endo-celulases e

quantidades não significantes de atividade para exo-celulases. Em cultivos em cavacos de

eucalipto e pinus, em condições de biopolpação, a xilanase foi a principal enzima hidrolítica

produzida. O perfil eletroforético do extrato foi obtido em gel desnaturante de poliacrilamida

revelando cinco bandas protéicas com massa molecular de 85,7 kDa, 60,2 kDa, 56 kDa, 52,1 kDa

e 50,9 kDa. A temperatura ótima das enzimas dos extratos enzimáticos foi 60oC e o valor de pH

ótimo para as enzimas foi 4,0 para a β-glicosidase, 4,5 para a β-xilosidase, 5,0 para a xilanase, 4,5

para a mananase e 3,5 para a CMCase (Carboximetilcelulase). A estabilidade ao pH foi

determinada em pH 3,5, 5,0 e 6,5 em tampão fosfato-citrato 50 mM e incubadas a 50oC por

períodos de até 6 horas, separadamente dos substratos. Verificou-se que as enzimas apresentaram

maior estabilidade em pH 5,0 (HEIDORNE et al, 2006). A estabilidade térmica das enzimas foi

determinada a 40, 50 e 60oC e incubadas nas respectivas temperaturas por períodos de 3 a 8 horas,

43

separadamente dos substratos. Observou-se que as enzimas apresentaram maior estabilidade à

30oC, porém a 50oC a estabilidade foi alta por 2 horas.

C. subvermispora degrada lignina de um material lignocelulósico através da ação da

manganês peroxidase e lacase. (RUTTIMANN-JOHNSON et al., 1993). Entretanto, lacases não

foram detectadas em condições de cultivo onde o único substrato orgânico é o próprio composto

lignocelulósico (FERRAZ et al., 2002; SOUZA-CRUZ, 2002). Com isso, a degradação de lignina

por esse fungo deveria, a princípio, ser atribuída principalmente a ação da MnP.

44

3. OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a ação do extrato enzimático extraído de

madeiras biodegradadas por Ceriporiopsis subvermispora no biobranqueamento de polpas kraft de

Eucalyptus grandis.

Para alcançar este objetivo foram realizadas as seguintes etapas:

- Análise dos produtos de xilanas de bétula, carvalho, fibra de trigo e bagaço de cana-de-

açúcar após ação das xilanases;

- Aplicações do extrato enzimático de C. subvermispora e de um extrato comercial em

polpas kraft para avaliação da taxa de hidrólise das polpas;

- Aplicações do extrato enzimático em polpas kraft em diferentes concentrações e diferentes

tempos de tratamento;

- Identificação dos monômeros e oligômeros liberados das polpas;

- Branqueamento químico das polpas pré-tratadas enzimaticamente pela seqüência EQP;

- Avaliação da ação enzimática nas polpas kraft por viscosidade, número kappa e liberação

de cromóforos.

45

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. PREPARO DOS EXTRATOS ENZIMÁTICOS

4.1.1. Extrato de Ceriporiopsis subvermispora

Os extratos enzimáticos produzidos pelo fungo Ceriporiopsis subvermispora foram

produzidos no laboratório de Microbiologia e Bioquímica do Departamento de Biotecnologia da

EEL-USP. C. subvermispora SS-3, mantido em agar extrato de malte (2%) a 4 ºC, foi repicado (20

discos com diâmetro de 8 mm) em frascos Erlenmeyer de 2 L contendo 200 mL de meio à base de

extrato de batata-dextrose (2,4%) e de extrato de levedura (0,7%). Após 12 dias de incubação

estática a 27ºC, o micélio obtido foi filtrado, lavado e macerado com água esterilizada.

Biorreatores de polietileno com capacidade de 20 L foram preenchidos com 2 kg de cavacos de E.

grandis (base seca) e mantidos imersos em água por um período de 12 h. Após drenagem e

esterilização a 121ºC por 15 min, os biorreatores foram inoculados com uma alíquota da suspensão

de micélio, de forma a se obter uma concentração inicial de micélio igual a 500 mg/kg de madeira

(base seca). Os biorreatores inoculados foram então agitados para homogeneização de seu

conteúdo e incubados a 27ºC, utilizando-se fluxo de ar igual a 23 L/h. Foram inoculados três

biorreatores e cada um deles forneceu os cavacos biodegradados para o preparo dos extratos

enzimáticos no tempo de 28 dias.

Para a obtenção dos extratos enzimáticos, o conteúdo do biorreator (micélio e cavacos)

foi transferido, em frações de 200 g, para frascos Erlenmeyer de 2 L contendo 500 mL do tampão

de extração (acetato de sódio 50 mM, pH 5,5, adicionado de 0,01% de Tween 60) e mantido sob

agitação de 120 rpm a 10ºC por um período de 4 h. Os extratos enzimáticos assim obtidos foram

centrifugados a 3400 g por 15 min, para a remoção de materiais particulados, e armazenados à

temperatura de - 80°C.

As atividades enzimáticas relacionadas à degradação da lignina, celulose e polioses

foram determinadas no momento do uso, utilizando-se o Espectrofotômetro U-2001 (Hitachi) e

expressas como unidades internacionais (UI/ml).

46

4.1.2. Extrato comercial

O extrato comercial cedido para este trabalho continha 107 UI/mL de atividade de

xilanase e 7 UI/mL de atividade de endoglucanase. As atividades enzimáticas relacionadas à

degradação da lignina, celulose e polioses foram determinadas no momento do uso, utilizando-se o

Espectrofotômetro U-2001 (Hitachi) e expressas como unidades internacionais (UI/ml).

4.1.3. Caracterização dos extratos

A caracterização dos extratos foi realizada através da determinação das atividades

enzimáticas das enzimas β-xilanase, β-xilosidase, β-glicosidase, β-mananase,

Carboximetilcelulase e Manganês peroxidase, além da quantificação de açúcares redutores. Os

procedimentos estão descritos abaixo.

4.1.3.1. β-Xilanase

O método baseia-se na liberação de açúcares redutores a partir da xilana 1% como

substrato (BAILEY et al., 1992), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados pelo

método de DNS (MILLER, 1959).

Uma alíquota de 0,9 mL de xilana foi colocada em tubos de ensaio e incubada em banho

termostatizado à temperatura de 50oC durante 2 minutos. Após incubação, foram adicionados

100 μL da enzima diluída apropriadamente no tampão, e a amostra incubada por 5, 15 e 30

minutos. A reação foi interrompida pela adição de 1,5 mL do reagente do DNS, sendo a mistura

fervida durante 5 minutos. Os tubos foram resfriados em banho de gelo, e a absorbância lida a 540

nm em espectrofotômetro. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o

volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente DNS antes do

extrato enzimático. Nessas condições é possível dosar compostos redutores que não são

provenientes da reação enzimática.

47

A curva padrão foi construída com solução de xilose (Merck), nas concentrações entre 2

e 20 μmol/mL. Uma unidade de atividade enzimática corresponde à quantidade desta capaz de

catalisar a liberação de 1 μmol de açúcar redutor por minuto.

- Preparo da solução de xilana 1%

A 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 adicionou-se 1 g de xilana

(Bichwood-Sigma-St. Louis, USA). A solução foi aquecida até ebulição em forno de microondas,

e após retornar à temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.

A solução permaneceu em agitação mecânica até completa solubilização da xilana na solução.

- Preparo do reagente DNS

O reagente foi preparado dissolvendo-se 10,6 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 19,8 g de

hidróxido de sódio, 306 g de tartarato de sódio e potássio e 8,3 g de bissulfito de sódio em 1 L de

água destilada. Após agitação para total dissolução dos reagentes, foram adicionados 7,6 mL de

fenol, e o volume completado para 1,4 L com água destilada (MILLER, 1959).

4.1.3.2. β-Xilosidase

A atividade de β-Xilosidase foi determinada segundo TAN et al., (1987), através da

estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo (pNPX).

Uma alíquota de 0,2 mL de extrato enzimático foi adicionada a 0,8 mL de solução 0,1%

de pNPX em tampão acetato de sódio 50 mM e pH 4,8. A reação foi conduzida incubando os tubos

durante 15, 30 e 60 minutos a 50oC. Após incubação, a reação foi interrompida pela adição de 2

mL de solução de bicarbonato de sódio 10% e a absorbância lida a 410 nm. Foram feitos controles

para cada amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de sódio 10% antes do extrato

48

enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu o volume da

enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8.

O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com padrão de p-

nitrofenol nas concentrações entre 50 e 350 μmol/mL. Uma unidade de atividade enzimática é

definida como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de pNP por minuto

a 50oC.

- Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-xilopiranosídeo (pNPX)

A solução de pNPX foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPX (Sigma-St. Louis,

USA) em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8, sob agitação mecânica e o volume

ajustado para 100 mL com o referido tampão.

- Preparo do bicarbonato de sódio 10%

A solução de bicarbonato de sódio 10% foi preparada dissolvendo-se 10 g de bicarbonato

de sódio em 100 mL de água destilada, sob agitação e aquecimento em agitador mecânico.

4.1.3.3. β-Glicosidase

A atividade de β-Glicosidase foi determinada segundo TAN et al., (1987), através da

estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG).

Uma alíquota de 0,2 mL de extrato enzimático foi adicionada a 0,8 mL de solução 0,1%

de pNPG em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8. A reação foi conduzida durante 15, 30 e 60

minutos a 50oC. Após incubação, a reação foi interrompida pela adição de 2 mL de solução de

bicarbonato de sódio 10% e a absorbância lida a 410 nm. Foram feitos controles para cada

amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de sódio 10% antes da adição do extrato

49

enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle em que se substituiu o volume da

enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8.

O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com padrão nas

concentrações entre 50 e 350 μmol/mL. Uma unidade de atividade enzimática é definida como a

quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de pNP por minuto a 50oC.

- Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG)

A solução de pNPG foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPG (Sigma-St. Louis,

USA) em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,8, sob agitação mecânica e o volume

ajustado para 100 mL com o referido tampão.

4.1.3.4. β-Mananase

O método baseia-se na liberação de açúcares redutores a partir de galactoglucomanana,

0,5%, seguido da quantificação de açúcares redutores liberados pelo método de DNS (RATTO e

POUTANEN, 1988).

Uma alíquota de 0,1 mL de extrato enzimático foi adicionada a 0,9 mL do substrato em

tubos de ensaio durante 5, 15 e 30 minutos à temperatura de 50oC. Após incubação, a reação foi

interrompida pela adição de 1,5 mL do reagente de DNS. Para calibração do aparelho foi feito um

controle em que se substituiu o volume da enzima por tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente DNS antes do

extrato enzimático para a determinação de compostos redutores que não são provenientes da

reação enzimática.

A curva padrão foi construída com solução de manose (Merck), nas concentrações entre

1 e 15 μmol/mL. Uma unidade de atividade enzimática é definida como sendo a quantidade de

enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de manose por minuto a 50oC.

50

- Preparo da solução de manana

A solução de manana foi preparada dissolvendo-se 0,5 g de galactoglucomanana

("locust bean gum"-Sigma-St. Louis, USA) em 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

A solução foi submetida a aquecimento até aproximadamente 80ºC, em forno de microondas, e

após retornar a temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.

A solução permaneceu em agitação mecânica até completa dissolução da manana em solução.

4.1.3.5. Endoglucanase

A atividade de endo-1-4-β-glucanase ou carboximetilcelulase (CMCase) foi

determinada através da hidrólise de uma solução de carboximetilcelulose a 0,44% em tampão

acetato de sódio 50 mM e pH 5,0 (TANAKA et al., 1981). A quantidade de açúcares redutores foi

determinada pelo método do DNS (MILLER, 1959). Os valores de absorbância lidos a 540 nm

foram transformados em μmol de glicose pela comparação da curva padrão de glicose.

Uma alíquota de 0,1 mL de extrato enzimático, devidamente diluído em tampão acetato

de sódio, foi adicionada a 0,9 mL do substrato durante 30, 60 e 90 minutos à temperatura de

50oC. Após incubação, a reação foi interrompida pela adição de 1,5 mL do reagente DNS, e os

tubos fervidos por 5 minutos. Foram feitos controles para cada amostra adicionando-se o reagente

DNS antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle em que se

substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

A curva padrão foi construída com solução de glicose (Merck), nas concentrações entre

1 e 12 μmol/mL. Uma unidade de atividade enzimática é definida como sendo a quantidade de

enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de glicose por minuto a 50oC.

- Preparo da solução de carboximetilcelulose

A 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 adicionou-se 0,44 g de

carboximetilcelulose média viscosidade (Sigma-St. Louis, USA). A solução foi fervida em forno

51

de microondas, e após retornar a temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o

referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa dissolução da

carboximetilcelulose na solução.

4.1.3.6. Manganês Peroxidase (MnP)

A atividade de manganês peroxidase foi determinada acompanhando-se a oxidação do

vermelho de fenol (ε610 = 22.000 M-1.cm-1) (LUNDELL et al., 1990). A mistura reacional foi

constituída por 1,75 mL de tampão succinato de sódio 50 mM (pH 3,2), 1,5 mL de lactato de sódio

50 mM, 0,5 mL de vermelho de fenol 0,1%, 0,5 mL de sulfato de manganês 1 mM, 0,25 mL de

albumina bovina 1,8%, 0,25 mL de peróxido de hidrogênio 2 mM e 0,25 mL de extrato

enzimático.

Após o início da reação, frações de 1 mL foram retiradas do tubo contendo a mistura

reacional a cada 1 min e transferidas para cubetas contendo 65 μL de hidróxido de sódio 6,5 M,

previamente à leitura da absorbância. Uma unidade de atividade enzimática foi considerada como

a quantidade de enzima capaz de catalisar a formação de 1 μmol de vermelho de fenol oxidado por

minuto.

4.2. PREPARO DAS XILANAS

Xilanas de bétula, fibra de trigo e carvalho foram obtidas da Sigma Chemical Co., St.

Louis, USA. As xilanas (1%) preparadas em água deionizada, foram mantida a 4ºC por 24 h e

então centrifugadas a 5000 g por 20 min. O sobrenadante foi filtrado em papel de filtro Watman nº

1 (LI et al., 2000). A solução foi concentrada com uma membrana Millipore (de corte molecular

5000) de 100 para 10 mL. Água deionizada foi utilizada para restaurar o volume do ultrafiltrado. A

xilana de bagaço-de-cana foi preparada através de hidrólise com NaOH (FENGEL e WEGENER,

1989). Em seguida foi seca em estufa e lavada com água deionizada em abundância. Alíquotas das

soluções das xilanas (10 mL) foram secas em estufa a 102ºC por 24 h e então determinadas as

massas secas. As massas obtidas foram convertidas para mg/mL. Cada ensaio foi realizado em

52

duplicata. As massas secas obtidas foram: xilana de bétula- 8,78 mg/mL; xilana de carvalho- 4,78

mg/mL; xilana de fibra de trigo- 8,77 mg/mL e xilana de bagaço-de-cana- 4,63 mg/mL.

Para a hidrólise enzimática das xilanas, a mistura de reação consistia de 19 mL de cada

xilana em 0,8 mL de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 6,0) e 2 UI/g de xilanase. Essa mistura

foi incubada a 40ºC por até 96 h. Alíquotas de 3,5 mL foram retiradas nos tempos 0, 24, 48, 72 e

96 h durante a hidrólise. Cada alíquota foi fervida durante 5 min a 100ºC para inativação das

enzimas. As amostras foram concentradas em liofilizador e então filtradas em filtro Sep-Pak

Cartridges C18 (Waters), para remoção de impurezas e compostos fenólicos. As liberações de

xilose e oligômeros nos filtrados foram analisadas em cromatógrafo líquido WATERS, modelo

515 HPLC, coluna Aminex HPX 42A de troca iônica (300 x 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories Ltd),

sendo o eluente água, fluxo de 0,6 mL/min e temperatura de 45°C. Os compostos foram

monitorados em um detector de índice de refração (RI).

4.3. POLPA

Foi utilizada uma polpa kraft industrial de eucalipto. A amostra de polpa foi

exaustivamente lavada com água deionizada e o pH foi ajustado para 5,0 pela adição de H2SO4

4M. A polpa foi deixada em contato com o ácido durante uma noite, o pH foi verificado pelo

contato com uma fita de pH e posteriormente caracterizada em termos de número kappa e

viscosidade (Tabela 4.1) e composição química (Tabela 4.2).

Tabela 4.1 - Caracterização da polpa kraft de eucalipto

Parâmetros ResultadosNúmero kappa 12,9

Viscosidade (cP) 24,8

Tabela 4.2 - Constituição química do E. grandis utilizado neste trabalho

Componentes Componentes na madeira (%) Componentes na polpa kraft (%)Celulose 47,8±0,9 78,1±0,3 Polioses 23,1±0,9 12,8±0,8 Lignina 28,6±0,4 5,3±0,5 Extrativos 1,5±0,4/0,9±0,8 ND

53

4.3.1. Consistência das polpas (%)

A consistência foi determinada pela relação massa seca/massa úmida, sendo expressa em

porcentagem. A polpa foi pesada determinando-se a massa úmida (m.u.). Aproximadamente 1,0 g

de polpa úmida foi colocada em uma balança Mettler Toledo moisture analyser, com aquecimento

por infra-vermelho. Quando a massa da polpa estabilizou, foi determinada a massa seca (m.s.) e a

consistência foi calculada.

4.3.2. Tratamento Enzimático das Polpas

Foi utilizado 25 g de polpa seca para as seqüências de branqueamento. Foi adicionado o

extrato enzimático às polpa em diferentes concentrações (0,5, 1, 1,5 e 2 UI/g de xilanase) e

acrescentada água até a consistência de 10%. Este ajuste foi realizado segundo a Equação 4.1. A

mistura de enzima e polpa foi colocada em sacos de polietileno, vedados com seladora e

devidamente incubados em banho com temperatura de 40ºC.

Equação 4.1 - Relação entre massa seca, massa úmida, volume de enzima e volume de água a ser acrescentada à mistura de reação para ajuste da consistência da polpa

massa seca (g) – massa úmida (g) – vol. enzima (mL) = volume de água a ser (4.1) consistência adicionado

O tratamento foi avaliado durante 0,5, 1, 2, 3 e 5 horas. Após os tratamentos as polpas

foram filtradas em funil de Buchner e lavadas com 500 ml de água destilada. A polpa foi usada

para determinação dos parâmetros número kappa e viscosidade. O filtrado foi tratado

termicamente (100ºC/5 min) e armazenado para a determinação da absorbância a 237, 254, 280 e

465 nm relativas à liberação de compostos fenólicos, produtos de degradação das polioses e

hidrofóbicos da polpa, respectivamente (PATEL e PAVITT, 1993; GARG et al., 1996; WONG et

al., 1997b; GUPTA et al, 2000; LI et al., 2005; SALLES et al., 2005). As liberações de xilose,

xilobiose e xilotriose foram avaliadas nos filtrados das polpas após os períodos de incubação e

então identificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em um cromatógrafo

54

líquido WATERS, modelo 515 HPLC. As soluções foram filtradas em filtro Sep-Pak C18 (Waters)

e injetadas diretamente em uma coluna Aminex HPX 42A (300 x 7,8 mm, Bio-Rad Laboratories

Ltd), sendo o eluente água deionizada, fluxo de 0,6 mL/min e temperatura de 45ºC. Os compostos

foram monitorados em um detector de índice de refração (RI).

A identificação dos oligômeros de xilose presentes nos filtrados foram determinadas a

partir de curvas de calibração externas obtidas com padrões analíticos de xilose, xilobiose,

xilotriose e xilotetraose (Megazyme-Ireland).

4.4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS POLPAS

4.4.1. Determinação da lignina insolúvel (Lignina Klason)

A quantidade de lignina Klason insolúvel em meio ácido foi determinada de acordo com

o método ASTM (ASTM Methods, 1966). Uma amostra de 1,2 g de polpa, previamente seca a

80°C durante uma noite, foi transferida para um becher de 100 ml e tratada com 10 mL de ácido

sulfúrico 72% (66,5% v/v) durante 1 h a 30°C e misturada continuamente com o auxílio de um

bastão de vidro. A reação foi interrompida com a adição de 50 ml de água destilada e a mistura foi

transferida quantitativamente para Erlenmeyer de 500 mL usando 270 mL de água e a seguir

autoclavada a 125°C por 1 h. Após esfriar a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada em funil

de vidro sinterizado (previamente seco e pesado) sendo então adicionada água destilada até que

fosse completado um volume de 500 mL. A mistura assim obtida foi filtrada e o material retido no

funil foi lavado com aproximadamente 1,8 L de água destilada e seco em estufa a 110°C até massa

constante e a massa de lignina determinada por diferença.

O percentual de lignina insolúvel foi determinado no material insolúvel retido no

cadinho sendo calculado em relação à massa seca das amostras, conforme Equação 4.2.

Equação 4.2 - Cálculo da lignina Klason

% Lignina Klason = massa de lignina Klason . 100 (4.2) massa de polpa seca

55

Sendo:

% Lignina Klason = lignina insolúvel (% em relação à polpa);

Massa de lignina Klason = massa de lignina Klason seca (g);

Massa de polpa seca = massa de polpa base seca (g).

4.4.2. Determinação da lignina solúvel

A quantidade de lignina solúvel em meio ácido foi determinada pela medida da

absorbância a 205 nm de uma diluição 1:2 do hidrolisado obtido no item anterior. Para o cálculo

da concentração de lignina solúvel foi utilizada uma absortividade de 105 g-1cm-1L no

comprimento de onda de 205 nm através das Equações 4.3 e 4.4 (FERRAZ et al., 2000).

Equações 4.3 e 4.4 - Cálculo da lignina solúvel

[Lig] = (Abs 205 nm / A . B) . D (4.3)

% Lignina solúvel = [Lig] . V (4.4)

massa de polpa seca

Sendo:

[Lig] = concentração de lignina no hidrolisado (g.L-1);

Abs 205 nm = absorbância do hidrolisado a 205 nm;

A = absortividade (105 L/g.cm);

B = caminho óptico (1 cm);

D = fator de diluição;

% Lignina solúvel = lignina solúvel (% em relação à polpa);

V = volume da amostra no hidrolisado;

Massa de polpa seca = massa de polpa base seca (g).

56

4.4.3. Determinação da Lignina Total

A lignina total foi determinada pela soma da lignina insolúvel (lignina Klason) com a

lignina solúvel.

4.4.4. Determinação dos carboidratos

Os carboidratos presentes no hidrolisado foram identificados em cromatógrafo líquido

WATERS, modelo 515 HPLC. O hidrolisado foi extraído em cartuchos Sep-Pak C18 (waters) para

remoção de compostos aromáticos, e então injetado em uma coluna Aminex BIORAD HPX 87H

(Bio-Rad Laboratories Ltd), acoplada a uma pré-coluna trocadora de cátions (Bio-Rad

Laboratories Ltd) usando-se ácido sulfúrico 0,005 M como fase móvel a um fluxo de 0,6 mL/min a

45°C. Os compostos foram monitorados por um detector de índice de refração. Nestas condições a

glicose e celobiose é separada dos demais açúcares provenientes da hemicelulose (xilose, manose,

galactose e arabinose). O teor de celulose foi calculado como o teor de glicose x 0,9 e teor de

celobiose x 0,95 (fator de hidrólise). De maneira similar, xilose x 0,88 foi convertida em xilana

(ROCHA, 2000).

As concentrações de celobiose, glicose, xilose, arabinose e ácido acético foram

determinadas a partir de curvas de calibração externas obtidas com padrões analíticos.

4.4.5. Determinação do Número Kappa

O número kappa é a medida indireta da lignina residual na pasta tratada. Determina

também o grau de deslignificação ou a branqueabilidade da celulose e corresponde aos mililitros

de uma solução padrão de permanganato de potássio 0,1 N consumida por 1,0 g de celulose, nas

condições especificadas nas normas TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industry,

1985).

57

Para avaliação do número kappa foram utilizados entre 0,5 a 1,0 g de polpa seca. A

amostra foi desintegrada com a mão em 10 mL de água destilada até ficar livre dos grumos e dos

feixes de fibras não dispersas. Este procedimento teve por objetivo separar as fibras evitando seu

corte excessivo. Depois de desintegradas, as polpas foram transferidas para um Erlenmeyer de 300

mL, seguidas de sucessivas lavagens com 140 mL de água destilada e colocadas em banho de

temperatura constante (25 ± 0,1°C). Separadamente em um Erlenmeyer de 125 mL foram

pipetados 25 mL de KMnO4 0,1 N + 0,0005 e 25 mL de H2SO4 4 M. O Erlenmeyer contendo a

solução foi colocado em um banho de temperatura constante (25 ± 0,1°C). Esta solução foi

transferida para o Erlenmeyer com a polpa. O Erlenmeyer de 125 ml foi lavado utilizando–se 50

ml de água destilada, que foi adicionada à polpa. A solução contendo a polpa foi deixada reagir

por 10 min. Para interromper a reação foram adicionados 5 mL de solução de KI 1,0 M. O iodo

livre na suspensão foi titulado com tiossulfato de sódio 0,1 N + 0,0005 até a solução (com agitação

constante) ficar com uma coloração amarelo claro. Foi então acrescentado 0,5 ml de solução de

amido 1%, continuando-se a titulação até a viragem da cor azul para o branco.

Foi realizada uma determinação do branco sem a polpa, utilizando 150 ml de água

destilada (ao invés de 140 ml), adotando-se o mesmo procedimento descrito anteriormente. O

permanganato oxida a lignina residual, e assim, a titulação foi realizada para se determinar quanto

de permanganato foi consumido. Quanto maior o conteúdo de lignina da polpa, maior o volume de

permanganato de potássio consumido por esta e conseqüentemente menor o volume de tiossulfato

de sódio utilizado para titular o iodo formado. Para o cálculo do número kappa foram utilizadas as

Equações 4.5, 4.6 e 4.7.

Equações 4.5, 4.6 e 4.7 - Cálculo do número kappa das polpas kraft

Sendo:

P = volume de KMnO4 que reagiu (mL);

a = volume de Na2SO4 gasto na titulação da amostra (mL);

b = volume de Na2SO4 gasto na titulação do branco (mL);

f = fator de correção para um consumo de 50% de permanganato de potássio,

determinado para cada P;

P = {(b – a) x N}/ 0,1 (4.5) f = 0,0084 P + 0,895 (4.6)

Nº kappa = (P x f)/w x [1 + 0,013 (25 – T)] (4.7)

58

N = normalidade da solução de Na2SO4;

T = temperatura de análise (ºC);

w = massa da polpa seca (g).

4.4.6. Determinação da Viscosidade

Exatamente 0,125 g de polpa seca foi colocada em um frasco com tampa sendo em

seguida adicionados 25 mL de etilenodiamina cúprica, solução 0,5 M em cobre. A mistura foi

agitada por 10 minutos com auxílio de uma barra magnética. Após esse tempo, a mistura foi

filtrada em cadinho de vidro sinterizado (nº 3) e transferida para a pipeta de viscosidade Fenske-

Otswald imersa em banho termostatizado a 25,0±0,1°C, previamente aferida com H2SO4

concentrado e utilizada dentro dos limites de viscosidade apropriados. Após equilíbrio térmico, a

solução foi aspirada e o tempo de escoamento, cronometrado. O tempo necessário para o menisco

do líquido passar entre as 2 marcas foi determinado em triplicata (TAPPI, 1985). Assim, com os

valores de densidade e viscosidade do H2SO4 concentrado na temperatura de medida, é feito o

cálculo da constante do viscosímetro pela Equação 4.8. E conhecida a constante do viscosímetro é

possível calcular o valor da viscosidade pela Equação 4.9.

Equação 4.8 - Cálculo da constante do viscosímetro

Sendo:

kv = constante do viscosímetro (cP.s-1.g-1.cm3);

V = viscosidade do H2SO4 a 25°C - 19,25 cP (TAPPI, 1982);

d = densidade do H2SO4 a 25°C - 1,84 g.cm-3 (WEAST, 1984);

t = tempo de escoamento (s).

Equação 4.9 - Cálculo da viscosidade

(4.8)

(4.9)

59

Sendo:

V = viscosidade da solução (cP);

kv = constante do viscosímetro (cP.s-1.g-1.cm3);

t = tempo de escoamento (s);

d = densidade da solução de celulose a 25ºC - 1,052 g.cm-3 (TAPPI, 1982).

4.4.7. Redução da Viscosidade

O percentual de redução da viscosidade, dado pelo grau de polimerização da celulose,

durante os tratamentos foi calculado conforme a Equação 4.10.

Equação 4.10 - Cálculo da redução da viscosidade (%)

5.3.4. Determinação da Alvura

4.4.8. Cálculo da Eficiência de Deslignificação e Seletividade

Para a análise dos resultados obtidos no branqueamento da polpa outros cálculos foram

realizados, conforme as Equações 4.11 e 4.12.

Equações 4.11 e 4.12 - Cálculo da eficiência de deslignificação e seletividade

Redução da Viscosidade (%) = (viscosidade inicial – viscosidade final) x 100 (4.10) viscosidade inicial

% Eficiência de deslignificação = Nº kappa inicial - Nº kappa final . 100 (4.11) Nº kappa inicial Seletividade = Eficiência de deslignificação (4.12) % de redução da viscosidade da polpa

60

4.5. TAXA DE HIDRÓLISE DA XILANA

Para a determinação da taxa de hidrólise das polpas com relação à xilana foi utilizada a

Equação 4.13.

Equação 4.13 - Taxa de hidrólise da xilana

Sendo:

[ALX] = Açúcares redutores liberados pela ação da xilanase;

[ALC] = Açúcares redutores liberados pelos controles;

Fator de hidrólise da xilana = 0,88.

4.6. BRANQUEAMENTO DAS POLPAS

O branqueamento foi realizado utilizando-se uma seqüência curta de branqueamento,

constituída de três estágios: extração alcalina com hidróxido de sódio (E), etapa de quelação com

EDTA (Q) e tratamento com peróxido de hidrogênio (P) para posterior avaliação das polpas. As

condições utilizadas estão mostradas na Tabela 4.3.

Tabela 4.3 - Condições gerais de branqueamento

Condições E Q P Consistência (%) 10 10 10

NaOH (%) 3 - - EDTA (%) - 0,4 -

H2O2 (%)/MgSO4* - - 3/0,05 pHfinal 10-11 5,5-7,0 10

Tempo (min) 60 30 60 Temperatura (ºC) 60±3 60±3 60±3

*0,05 g de MgSO4/100 g de polpa.

% Hidrólise = ([ALX] – [ALC]) x fator de hidrólise x 100 (4.13) Massa seca da amostra

61

4.6.1. Determinação do pH das polpas

Após lavagem com água, o pH das polpas obtidas medido de forma aproximada pelo

contato de uma tira de papel indicador universal com a polpa úmida.

O pH inicial foi determinado antes do branqueamento, ou seja, após a mistura da polpa

com o reagente de branqueamento (enzimático ou químico) e o pH final foi determinado após o

branqueamento das amostras para controle do processo.

4.6.2. Extração alcalina (E)

A seqüência de branqueamento químico foi iniciada pelo tratamento das polpas com

hidróxido de sódio. Os ensaios foram realizados em sacos de polietileno com quantidade suficiente

de polpa para as análises posteriores e conforme as condições da Tabela 4.3. Após mistura da

polpa nos sacos de polietileno e pré-aquecimento em forno de microondas, as polpas foram

mantidas na temperatura desejada em banho termostatizado. Após equilíbrio térmico foi

adicionado hidróxido de sódio (3% base polpa seca), sendo mantidas sob agitação por 60 min.

Após esse tempo, as polpas tratadas foram filtradas em funil de Buchner, lavadas com água

destilada até pH próximo ao neutro, secas à temperatura ambiente e guardadas adequadamente

para a etapa seguinte.

4.6.3. Quelação (Q)

A etapa de quelação foi usada visando a remoção de possíveis metais presentes nas

polpas, pois a presença desses metais pode consumir o peróxido de hidrogênio usado na posterior

etapa de branqueamento. Após a adição da dosagem adequada de EDTA (0,4% base polpa seca),

adicionou-se água à polpa, para ajuste de consistência, e suficiente quantidade de H2SO4 4 N, para

ajuste de pH (Tabela 4.3). A temperatura de reação foi ajustada pelo aquecimento da suspensão em

banho termostatizado. Terminada a reação, após 30 min, as polpas tratadas foram filtradas em funil

62

de Buchner, lavadas com água destilada até pH próximo ao neutro, secas à temperatura ambiente e

guardadas adequadamente para a etapa seguinte.

4.6.4. Peroxidação (P)

Após mistura da polpa com água e sulfato de magnésio (0,05 g MgSO4/100 g de polpa)

em sacos de polietileno, a temperatura do material foi ajustada pelo seu aquecimento em forno de

microondas e mantida no valor em banho termostatizado. O sulfato de magnésio aqui adicionado

teve a função de proteger a celulose da degradação, pois o peróxido, além de reagir com a lignina,

pode também reagir com a celulose o que ocasionaria uma possível despolimerização, causando

danos à polpa (HORTAL e LLUCIÁ, 1984).

Após equilíbrio térmico foi adicionado H2O2 (3% base polpa seca), corrigindo o pH para

10 com adição de hidróxido de sódio e os frascos mantidos sob agitação por 60 min (Tabela 4.3).

Após esse tempo, as polpas tratadas foram filtradas em funil de Buchner, lavadas com água

destilada até pH próximo ao neutro, secas à temperatura ambiente e guardadas adequadamente

para as análises seguintes.

4.7. REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS

Todos os experimentos foram realizados em triplicata para a confirmação dos resultados.

63

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS NOS EXTRATOS DE C. subvermispora

C. subvermispora foi utilizado para a biopolpação de cavacos de E. grandis e os extratos

obtidos a partir desses cavacos biodegradados foram avaliados quanto à atividade de algumas

enzimas oxidativas e hidrolíticas (Tabela 5.1). As atividades totais foram relacionadas com a

quantidade de cavacos de madeira utilizados durante o processo de biopolpação e expressas como

UI/kg (μmol/min x kg de cavaco).

Tabela 5.1 -.Produção enzimática de C. subvermispora em cavacos de E. grandis

Característica Xilanase Mananase Endoglucanase Β-glicosidase Β-xilosidase Mn- peroxidase

Atividade (UI/kg) 376 213 133 87 62,6 765

Ph ótimo 5,0 4,0 3,5 4,5 4,0 3,2

Temperatura ótima 60 60 70 60 60 40

C. subvermispora produziu baixas atividades de celulases, mas altas atividades de

hemicelulases e Mn-peroxidases, as quais são de interesse em aplicações tecnológicas, por

exemplo em processos de biobranqueamento em fábricas de celulose e papel. A produção de

xilanases e Mn-peroxidases livres de celulases pode ser realizada em grande escala durante a

biopolpação de cavacos e empregadas na remoção da lignina residual de polpas celulósicas. As

enzimas produzidas dessa maneira podem ser recuperadas e utilizadas como produtos finais sendo

úteis em seqüências de branqueamento nas próprias plantas que utilizam esse processo. Por

exemplo, se pelo menos 5% das enzimas produzidas puderem ser recuperadas da madeira

biopolpada através de algum procedimento de lavagem, mesmo em uma pequena planta de

polpação termo-mecânica, que produza 200 toneladas de polpa por dia, poderão ser produzidas 3,7

x 106 UI de xilanase e 7,6 x 106 UI de Mn-peroxidase por dia. Isto é mais do que a produção usual

de culturas líquidas submersas ou agitadas de Bacillus spp., Trichoderma spp., Phanerochaete

chrysosporium ou outros microrganismos (HARAZONO et al., 1996; SUBRAMANIYAN et al.,

2002; HEIDORNE et al., 2006).

A ação de MnP com o intuito de oxidar estruturas fenólicas da lignina ocorre na presença

64

de MnSO4, porém o conteúdo Mn na polpa kraft é muito baixo (4,8 ppm) (SILVA, 1997). Assim,

as polpas não são branqueadas sem a adição externa de MnSO4 (KONDO et al., 1994). Para uma

ação eficiente de MnP é necessário ainda que H2O2 e ácidos orgânicos, como o málico ou oxálico,

sejam adicionados continuamente durante a etapa de branqueamento, o que torna o processo mais

dispendioso e de difícil controle. Portanto, mesmo a MnP estando em maior proporção no extrato

de C. subvermispora do que outras enzimas, ela não é considerada um eficiente agente de redução

da lignina em polpas nas condições utilizadas. Além disso, elevadas concentrações de H2O2 podem

inativar irreversivelmente a enzima através da formação de um intermediário da enzima,

denominado composto III (WARIISHI et al., 1988).

As hemicelulases produzidas por C. subvermispora apresentam uma faixa de pH e

temperatura ótima de acordo com as comumente observadas, variando entre 4,0–6,0 e 60–70ºC,

respectivamente. As xilanases são estáveis em pH entre 5,0–6,0 e são mais ativas a 40–50ºC. As

atividades enzimáticas decaem durante longos períodos de incubação e em temperaturas maiores

que 50ºC. As enzimas são, geralmente, inativadas acima de 80ºC. Com relação às MnPs, verificou-

se que as atividades foram mais altas com o uso de tampão com menor pH (3,2) e em temperatura

de 40oC.

As enzimas produzidas por C. subvermispora apresentam algumas propriedades atípicas

quando comparadas a outras enzimas produzidas por fungos e podem ser úteis na indústria devido

a essas características. Talvez, a propriedade mais notável seja a alta especificidade (HEIDORNE

et al, 2006).

5.2. EFEITO DAS ENZIMAS DE C. subvermispora E DO EXTRATO COMERCIAL NA HIDRÓLISE DAS POLPAS

Foram realizados alguns ensaios para a comparação da ação do extrato bruto de C.

subvermispora e do extrato comercial em relação à extensão da liberação de açúcares redutores

(Tabela 5.2).

Observou-se uma atuação muito semelhante dos dois extratos na polpa. Os açúcares

redutores foram detectados somente a partir de 2 horas de incubação. Com o prosseguimento da

reação foram detectadas quantidades crescentes de açúcares redutores nos extratos até 12 horas de

tratamento. Após este tempo, a ação hidrolítica de ambos os extratos se estabiliza. A análise dos

dados mostra que tempos de tratamento muito longos (acima de 8 horas) não aumentam a extensão

65

de hidrólise significativamente nas polpas, confirmando alguns resultados encontrados na literatura

(LI et al., 2002). Esse fato poderia ser atribuído à inativação ou perda de função das enzimas em

tempos mais prolongados de tratamento. Entretanto, resultados anteriores mostraram que as

hemicelulases de C. subvermispora são estáveis durante mais de 6 h a 40oC, descartando a

possibilidade de redução da hidrólise da polpa por inativação térmica da enzima.

Tabela 5.2 - Concentração de açúcares redutores liberados dos tratamentos com os extratos enzimáticos sobre polpas kraft. A carga enzimática aplicada foi de 2 UI/g nos dois ensaios realizados

Açúcares redutores (g/L) Tempo de tratamento (h) Extrato de C. subvermispora Extrato comercial

0 2,21 2,21 2 6,64 7,74 4 12,17 12,21 8 16,59 17,53 12 24,53 22,32 24 24,62 21,16

Outros fatores a serem considerados quanto à diminuição da velocidade de hidrólise das

polioses é a redução da concentração e da disponibilidade dos substratos na polpa. Em tempos

mais prolongados de ação da enzima ocorrem alterações na estrutura das polioses. Para uma

hidrólise total, as enzimas têm que agir liberando substratos para que outras enzimas completem a

hidrólise. Esse processo na presença do fungo é bem regulado, no entanto quando se trabalha com

extrato livre de células, as enzimas podem sofrer inibição pelos produtos, o que restringiria a sua

ação (TECHAPUN et al., 2003).

A Figura 5.1 relaciona os resultados obtidos quanto à porcentagem de hidrólise de xilana

da polpa. Até 5 horas de tratamento, as enzimas de C. subvermispora e a comercial hidrolisaram

cerca de 45% das xilanas existentes na polpa. Acompanhando o perfil de liberação de açúcares

redutores, até 12 horas de reação a taxa de hidrólise de ambos os extratos é alta sendo que acima

desse tempo de tratamento a ação hidrolítica de ambos os extratos diminui. Em tempos mais

prolongados as enzimas de C. subvermispora tiveram uma ação mais eficiente na hidrólise das

xilanas em comparação ao extrato comercial. As diferenças percentuais obtidas foram de 14%

para 2 horas de tratamento, 0,33% para 4 horas, 5,4% para 8 horas, 9% para 12 horas e finalmente,

14% para 24 horas de tratamento com relação à enzima comercial.. As enzimas, principalmente as

xilanases, agem com sucesso na polpa sem perda de sua estabilidade, que permanecem adequadas

66

ao processo durante 6 horas em temperaturas de 40ºC e pH 5,0 (HEIDORNE et al., 2006). Dessa

maneira foi possível estabelecer um tempo de tratamento das polpas de até 5 horas, o que é um

tempo apropriado aos processos industriais.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tempo de tratamento (h)

Hid

rólis

e (%

)

C. subvermisporaExt. comercial

Figura 5.1 - Porcentagem de hidrólise da xilana de polpas kraft pelos extratos enzimáticos de C. subvermispora e pelo extrato comercial. A carga enzimática aplicada foi de 2 UI/g nos dois ensaios realizados

5.3. ANÁLISE DOS PRODUTOS DE XILANAS DE DIFERENTES ORIGENS APÓS AÇÃO DA XILANASE

Para o estudo dos produtos de hidrólise das xilanases de C. subvermispora utilizou-se

xilanas de bétula, de fibra de trigo, de carvalho e de bagaço de cana-de-açúcar. Cerca de 94% da

estrutura da xilana de bétula corresponde a xilose, o que a torna um substrato ideal para

padronizar as atividades de várias xilanases. Além da xilose, há pequenas quantidades de glicose e

galactose. A xilana de fibra de trigo contém pequenas quantidade de ácidos glucurônicos,

enquanto que na xilana de carvalho, o carboidrato mais abundante é a xilose (52%), seguida da

arabinose (22%) (LI et al., 2000). A xilana de cana de açúcar contém principalmente açúcares

facilmente hidrolisados por enzimas (ADSUL et al, 2005), principalmente xilose (75-80%),

manose, arabinose e galactose (GOMES et al., 2005).

Amostras de xilana de fibra de trigo liberaram xilopentaose, xilotetraose, xilotriose e

uma pequena quantidade de xilobiose. Em tempos de tratamento mais longos (96 horas), toda a

67

xilopentaose desapareceu, sendo convertida a xilobiose. A xilose, embora tenha sido detectada,

não foi quantificada, pois sua concentração ficou abaixo da curva de calibração. Nas xilanas de

bétula, a enzima liberou xilobiose, xilotriose e xilotetraose. Após 72 horas também foi detectada

xilose, permanecendo o mesmo perfil até 96 horas. A xilana de carvalho liberou principalmente

xilotriose e xilobiose a partir de 48 horas de reação. Xilose foi liberada com 72 horas, sendo

verificada redução na quantidade dos xilooligômeros liberados. Além desse tempo de reação

houve pouca redução na quantidade dos produtos liberados. A Tabela 5.3 traz os valores das

concentrações dos xilooligômeros detectados por CLAE.

Tabela 5.3 - Quantificação dos oligômeros detectados por CLAE

Xilanas Xilooligômeros Fibra de trigo xilopentaose Xilotetraose xilotriose xilobiose xilose

72 h 0,590 0,760 0,387 0,157 - 96 h - 0,680 0,235 0,697 -

Bétula 24h - 0,672 0,244 0,515 - 48h - 0,672 0,244 0,334 - 72h - 0,672 0,244 0,334 0,221 96h - 0,419 0,129 0,105 0,221

Carvalho 48h - - 0,192 0,390 - 72h - - 0,182 0,232 0,366 96h - - 0,182 0,220 0,366

Unidades em g/L; O símbolo (-) indica níveis abaixo do limite de detecção.

Por tratarem-se de substratos que se degradam com mais facilidade, os controles (sem

adição de enzima) apresentaram glicose e xilose em pequenas quantidades. Os produtos obtidos da

hidrólise da xilana mostraram que as enzimas de C. subvermispora apresentaram um padrão de

endo-xilanase, atacando a cadeia de xilana de uma maneira aleatória. Esses resultados estão em

acordo com os dados da literatura (LI et al., 2005). Endo-1,4-β-xilanases (EC 3.2.1.8) produzem

oligossacarídeos derivados da quebra aleatória da xilana enquanto que as 1,4-β-xilosidases (EC

3.2.1.37) atuam principalmente nos oligossacarídeos de xilana produzindo xilose. Algumas endo-

xilanases parecem ter grande especificidade por substratos de cadeia linear, e outras, por cadeias

mais ramificadas. A presença de ramificações em alguns desses substratos na cadeia de xilana

parece prevenir sua hidrólise completa pela xilanase. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações α-

1,3 e α-1,2 podem ser necessárias para a hidrólise completa da xilana (ANAND et al., 1996).

68

A ação da xilanase nas xilanas foi analisada pelo teor de açúcares redutores e os

resultados mostraram que para as xilanas de bétula, fibra de trigo e carvalho já existia produto

suficiente para detecção antes de 24 horas de hidrólise. A hidrólise da xilana de bagaço de cana foi

lenta, mas com 48 horas de hidrólise havia produtos (Figura 5.2). No final da reação, a xilana de

bagaço de cana foi a que apresentou maior grau de hidrólise seguida da xilana de fibra de trigo,

em relação ao tempo total de hidrólise.

0

5

10

15

20

25

0 24 48 72 96

Tempo (horas)

Açú

care

s re

duto

res

(g/L

)

Bagaço de cana Carvalho Bétula Fibra de trigo

Figura 5.2 - Perfil da liberação de açúcares redutores das xilanas de diferentes origens

Calculando-se a relação entre a concentração de açúcares redutores e a massa seca de

cada xilana solúvel, foi possível obter o grau máximo de hidrólise com o tratamento enzimático

(Tabela 5.4). Esses valores são relativos ao tempo de 96 horas de tratamento para as xilanas de

bétula, carvalho, bagaço de cana e 72 horas para a xilana de fibra de trigo.

Tabela 5.4 - Quadro comparativo do grau de hidrólise entre as diferentes xilanas

Xilanas Grau de hidrólise das xilanas (%)

Bétula 22,9

Carvalho 18,3

Fibra de trigo 34,0

Bagaço de Cana 61,6

69

A xilana de carvalho foi a que apresentou o menor grau de hidrólise entre as xilanas

estudadas. Aparentemente isto se deve ao fato desta xilana apresentar mais ramificações com

resíduos arabinosil.

5.4. BRANQUEAMENTO DAS POLPAS

As amostras de polpa kraft foram submetidas a um tratamento enzimático seguido de

uma seqüência de branqueamento químico. Foram adicionadas diferentes concentrações de

enzima, tendo como base os valores normalmente empregados no branqueamento de polpas com

xilanases.

A carga enzimática e as condições dos ensaios estão mostrados na Tabela 5.5. Para

estimar o potencial branqueador do extrato enzimático nas polpas, as seguintes análises foram

realizadas: medidas de absorbância a 237, 254, 280 e 465 nm, número kappa, viscosidade e

liberação de açúcares redutores.

Tabela 5.5 - Condições utilizadas no branqueamento enzimático

Condições Xilanase

Enzima (UI/g) 0,5 1 1,5 2

Tempo de reação (horas) 0,5 1 2 3 5

Temperatura/Consistência/pH 40ºC/10%/5,0

Quando a polpa kraft é pré-tratada com xilanase, a xilose e outros açúcares redutores

liberados resultam em um aumento no conteúdo de açúcar livre em meio à polpa. A xilana, como

uma parte das polioses, que está entre a barreira de lignina e celulose, quando hidrolisada pela

xilanase, em adição à xilose, também libera lignina e outros compostos fenólicos presentes nas

fibras da polpa. São esses compostos fenólicos que causam um aumento na absorbância a 237, 254

e 280 nm das amostras tratadas com xilanase comparadas ao controle. Assim, a correlação entre a

liberação dos cromóforos (principalmente a 237 nm), a liberação de compostos hidrofóbicos (465

nm) e a redução no número kappa associados com a liberação de açúcares redutores sugerem a

dissociação do complexo lignina-carboidrato das fibras da polpa (BEG et al., 2000). Esses

fenômenos propiciam uma redução na quantidade de reagentes de branqueamento, pois as fibras

70

mais livres desses complexos facilitam a penetração desses reagentes, branqueando melhor a polpa

em relação aos controles.

De acordo com as cargas de xilanase aplicadas e conhecendo-se as atividades das outras

enzimas estudadas (Tabela 5.1) foi possível calcular as cargas enzimáticas de cada enzima

presente no extrato utilizado. A Tabela 5.6 relaciona os resultados obtidos.

Tabela 5.6 - Atividades aplicadas sobre a polpa referente às demais enzimas contidas no extrato bruto de C. subvermispora

Enzima Atividade (UI/g)

B-xilanase 2,0 1,5 1,0 0,5

B-mananase 1,0 0,75 0,5 0,25

Endoglucanase 0,06 0,05 0,03 0,01

B-glicosidase 0,04 0,03 0,02 0,007

B-xilosidase 0,04 0,03 0,02 0,007

Mn-peroxidase 4,0 3,0 2,0 1,0

5.4.1. Análise dos produtos das polpas kraft após a ação do complexo enzimático de C. subvermispora

Foi analisada a ação do extrato enzimático de C. subvermispora nas polpas kraft. O

processo kraft remove a maior parte da lignina e dos carboidratos. Durante o período inicial de

aquecimento, a xilana é parcialmente despolimerizada e são removidos seus grupos acetil e

arabinosil. Após a polpação, parte dessa xilana pode estar recristalizada na superfície da fibra,

constituindo uma barreira física ao fluxo dos reagentes nas posteriores etapas de tratamento das

fibras. É nessa polpa rica em celulose (78%), com baixo teor de lignina (5,3%) e parcialmente

recoberta por xilana (12,8%) que as enzimas de C. subvermispora vão agir.

- Cromóforos liberados da polpa em função da concentração de enzima

Os cromóforos são estruturas insaturadas atribuídas principalmente a produtos derivados

da degradação da lignina e das polioses, por exemplo, grupos carbonila e ácidos urônicos

71

formados durante a polpação kraft. Foram feitas as determinações das absorbâncias a 237, 254 e

280 nm relativos à liberação de compostos fenólicos e produtos de degradação das polioses e 465

nm relativo à liberação de compostos hidrofóbicos da polpa.

Pode-se observar pela Figura 5.3 que para o comprimento de onda de 237 nm, as retas

correspondentes a todas as cargas enzimáticas apresentaram um aumento na inclinação até o

ponto correspondente a 3 horas de reação. Em seguida houve uma diminuição na liberação de

substâncias que absorvem nesse comprimento de onda, à exceção da reta correspondente a 0,5

UI/g, que apresentou um aumento da taxa a partir do ponto correspondente a 3 horas de reação.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abs

2 UI/g

1,5 UI/g

1 UI/g

0,5 UI/g

Figura 5.3 - Liberação de cromóforos a 237 nm em função do tempo de tratamento

As Figuras 5.4, 5.5 e 5.6 mostram a liberação de cromóforos nos comprimentos de onda

de 254, 280 e 465 nm. As cargas enzimáticas de 0,5 e 1 UI/g não apresentaram liberação de

quantidades significantes de compostos que absorvem em nenhum desses comprimentos de onda.

Para o comprimento de onda de 254 nm é possível observar que as retas correspondentes

às cargas enzimáticas de 1,5 e 2 UI/g apresentaram uma inclinação constante e gradual, embora

pequena, até o ponto correspondente a 2 horas de reação, apresentando em seguida uma inclinação

maior e mais acentuada entre 2 e 3 horas de reação e um pouco menor entre 3 e 5 horas de reação.

72

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 1 2 3 4 5Tempo (h)

Abs

2 UI/g

1,5 UI/g

1UI/g

0,5 UI/g


Para o comprimento de onda de 280 nm é possível observar que as retas correspondentes

às cargas enzimáticas de 1,5 e 2 UI/g apresentaram comportamentos diferenciados. Enquanto a

reta correspondente a 1,5 UI/g apresentou uma inclinação acentuada e constante para os tempos de

reação de 2 a 5 horas, a reta correspondente a 2 UI/g apresentou inclinações diferentes a cada

intervalo de tempo.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abs

2 UI/g

1,5 UI/g

1 UI/g

0,5 UI/g


73

Para o comprimento de onda de 465 nm é possível observar que a reta correspondente à

carga enzimática de 1,5 UI/g apresentou uma inclinação muito pequena até 2 horas de reação,

apresentando um aumento acentuado até o ponto correspondente a 5 horas de reação. A reta

correspondente à carga enzimática de 2 UI/g apresentou uma inclinação constante e acentuada nos

pontos de 1 a 3 horas de reação, apresentando uma inclinação menor até o ponto de 5 horas de

reação. Nesse comprimento de onda foi observado uma diminuição na quantidade de substâncias

liberadas com relação aos outros comprimentos de onda analisados.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abs

2 UI/g

1,5 UI/g

1 UI/g

0,5 UI/g


É possível observar que o aumento da carga enzimática e do tempo de tratamento

aumentam a absorção, já que há um aumento gradual na liberação de compostos cromóforos,

principalmente nos comprimentos de onda de 254 e 280 nm, correspondentes principalmente aos

compostos oriundos da degradação das polioses. Com as menores cargas enzimáticas a liberação

de compostos cromóforos não foi muito significativa, entretanto com as cargas enzimáticas de 1,5

e 2 UI/g, principalmente a partir de 1 hora de tratamento, há uma gradual elevação da absorção

nesses comprimentos de onda. Assim, é possível concluir que as cargas de 1,5 e 2 UI/g utilizadas

são as que possibilitam um melhor efeito biobranqueador.

Uma das interpretações possíveis dessas figuras é de que a inclinação entre cada ponto

nas retas demonstra a eficiência na liberação dos cromóforos. Esse fato pode ainda dar uma

indicação do ponto ótimo para o tempo de incubação. Quanto maior a inclinação, melhor é a

eficiência da enzima como agente de branqueamento das polpas. Então, segundo esse critério, com

74

a aplicação da carga enzimática de 0,5 UI/g, o melhor tempo de tratamento seria de 5 horas e para

cargas maiores, o tempo ótimo de tratamento poderia ser reduzido a 3 horas.

As Figuras 5.7, 5.8 e 5.9 apresentam os resultados referentes às liberações de cromóforos

nos comprimentos de onda estudados (237, 254, 280 e 465 nm) em função do tempo de tratamento

para cada carga enzimática aplicada.

2 UI/g

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abso

rção

237 nm

254 nm

280 nm

465 nm

Figura 5.7 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 2 UI/g de xilanase nos diferentes tempos de tratamento

1,5 UI/g

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abso

rção

237 nm

254 nm

280 nm

465 nm

Figura 5.8 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 1,5 UI/g de xilanase nos diferentes tempos de tratamento

75

1 UI/g 0,5 UI/g

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 1 2 3 4 5

Tempo (h)

Abso

rção

237 nm a

237 nm b

Figura 5.9 - Liberação de cromóforos pelo tratamento enzimático com 1 (a) e 0,5 (b) UI/g de xilanase nos diferentes tempos de tratamento

Os materiais cromóforos liberados a 237, 254 e 280 nm mostram que houve decréscimo

na aromaticidade da lignina residual quando foram aplicadas as cargas de 1,5 e 2 UI/g. Além de

compostos fenólicos, esses comprimentos de onda referem-se também a produtos de degradação

das polioses que contribuem em grande parte na coloração dessas polpas kraft. Entretanto, mesmo

havendo um aumento na absorbância dos filtrados não ocorreu uma concomitante diminuição na

cor das polpas.

- Açúcares redutores liberados da polpa em função da concentração de enzima

O extrato enzimático de C. subvermispora não teve efeito significante na polpa quando

utilizado em baixas atividades. Com a carga enzimática de 0,5 UI/g de xilanase houve pequena

liberação de açúcares redutores. O controle e o ensaio apresentaram concentrações muito

próximas, em torno de 0,30 g/L. Com a aplicação de 1 UI/g de xilanase a concentração de açúcares

aumentou discretamente, e a partir de 2 horas de tratamento a liberação ficou mais ou menos

estável, em 0,96 g/L. A aplicação de 1,5 UI/g de xilanase aumentou consideravelmente a

concentração de açúcares redutores liberados, chegando a 2,7 g/L em 30 minutos de reação. A

maior liberação de açúcares redutores foi observada quando foi aplicada a carga enzimática de 2

76

UI/g. Em 30 minutos foram produzidos 17 g/L de açúcares redutores e a máxima concentração

observada foi de 23,6 g/L no tempo de 3 horas de tratamento (Figura 5.10).

0

5

10

15

20

25

0,5 1 1,5 2

Carga enzimática (UI/g)

Açú

care

s re

duto

res

(g/L

) 0,5 hora1 hora2 horas3 horas5 horas

Figura 5.10 - Açúcares redutores liberados pelo tratamento enzimático nas polpas kraft em função da carga enzimática referente à xilanase aplicada

A Figura 5.11 mostra a taxa de hidrólise das polioses nas diferentes cargas enzimáticas. A

retirada das polioses é uma condição necessária para alterar a interface entre a celulose e a lignina,

facilitando a remoção da fração associada à lignina com o mínimo de dano à polpa (TECHAPUN

et al., 2003). O pré-tratamento com xilanase pode liberar uma maior superfície das fibras, expondo

a lignina e facilitando assim a posterior etapa de branqueamento da polpa, possibilitando também

uma economia de reagentes, além de preservar e até melhorar algumas propriedades da polpa

resultante, já que não retira carboidratos excessivamente.

77

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5Tempo de tratamento (h)

Hid

rólis

e (%

)2 UI/g1,5 UI/g1 UI/g0,5 UI/g

Figura 5.11 - Hidrólise das polioses da polpa em diferentes cargas enzimáticas

O tempo de tratamento, juntamente com a carga enzimática aplicada, é um dos principais

fatores que influenciam a quantidade de açúcares redutores liberados. Durante o tratamento

enzimático é necessário levar em consideração também a consistência da polpa e a agitação do

meio reacional, que além de diluir, permite a difusão dos produtos finais dispersando os produtos

que poderiam inibir a ação das enzimas.

A liberação de açúcares pela aplicação de cargas enzimáticas entre 0,5 e 1,5 UI/g de

xilanase às polpas é praticamente idêntica em todos os tempos estudados. Quando foi aplicado 2

UI/g é possível notar um aumento progressivo na liberação de açúcares redutores que se torna mais

acentuado a partir de 3 horas e depois se estabiliza.

É importante ressaltar que no extrato estavam presentes outras enzimas que também

atuaram nas polioses presentes na polpa, portanto também responsáveis por essa ação hidrolítica.

Vários mecanismos podem estar envolvidos na dissolução e hidrólise dessas polioses facilitando o

passo subseqüente de extração da lignina. As xilanas recristalizadas sobre as fibras de celulose e

aquelas associadas à lignina (LCC) podem ser parcialmente ou totalmente removidas e

quantificadas como açúcares redutores. Essa liberação de açúcares redutores é uma indicação de

que o uso de enzimas do complexo xilanolítico facilita o posterior branqueamento com reagentes

químicos.

A liberação de açúcares redutores e a liberação de lignina e compostos fenólicos são

fenômenos inter-relacionados. Quando a polpa kraft é pré-tratada com xilanase, a xilose e outros

açúcares redutores são liberados das polioses, resultando em um aumento na quantidade de

78

açúcares redutores da amostra. A xilana é uma parte das polioses que está localizada entre a

lignina e a celulose. Quando a xilana é degradada pela xilanase, não só xilose é liberada das fibras,

mas também pequenas quantidades de lignina e compostos fenólicos (KHANDEPARKAR et al.,

2006).

- Identificação dos produtos da hidrólise dos carboidratos da polpa

Para estudo dos monossacarídeos e oligossacarídeos obtidos da hidrólise das polpas kraft

pelas enzimas de C. subvermispora foi utilizada cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

As liberações de celobiose, glicose, arabinose, xilose, xilobiose, xilotriose e outros oligômeros

foram avaliadas nos filtrados das polpas após os períodos de incubação.

Os ensaios com xilanase não liberaram xilooligômeros em quantidades detectáveis em

nenhuma carga enzimática utilizada (Tabela 5.7). Os ensaios com xilanase na concentração de 1

UI/g liberaram apenas celobiose em quantidades detectáveis pela CLAE nos tempos de tratamento

utilizados. Na concentração de 1,5 UI/g foram detectados xilose e celobiose. Pelos resultados

obtidos é possível verificar que o tempo de 2 e 3 horas de tratamento foram os que liberaram as

maiores quantidades de xilose. Os ensaios com xilanase na concentração de 2 UI/g liberaram as

maiores quantidades de açúcares redutores. Arabinose foi detectada com apenas 0,5 hora de

tratamento, o que não ocorreu com a aplicação das menores cargas enzimáticas. Isso pode ter

ocorrido devido à presença de outras enzimas no extrato, como por exemplo a enzima

arabinofuranosidase. O aumento na concentração de xilanase aumenta, conseqüentemente, a

concentração dessas outras enzimas.

79

Tabela 5.7 - Dados obtidos dos filtrados das polpas kraft após o tratamento com o extrato bruto de C. subvermispora em diferentes concentrações (0,5, 1, 1,5 e 2 UI/g) pela cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

0,5 UI/g Tempo de tratamento (h) 0,5 1 2 3 5

Celobiose, Glicose, Xilose, Arabinose, Xilooligômeros*

-

1 UI/g Tempo de tratamento (h) 0,5 1 2 3 5

Celobiose - - - - - Glicose - - 0,211 0,212 0,197 Xilose - - - - -

Arabinose - - - - - Xilooligômeros* - - - - -

1,5 UI/g Tempos de tratamento (h) 0,5 1 2 3 5

Celobiose - 0,569 0,870 0,922 0,685 Glicose - - - - - Xilose - 0,180 0,260 0,277 0,237

Arabinose - - - - - Xilooligômeros* - - - - -

2 UI/g Tempos de tratamento (h) 0,5 1 2 3 5

Celobiose 0,224 0,406 0,804 1,032 0,560 Glicose - 0,206 0,254 0,272 0,242 Xilose - - 0,224 0,260 0,242

Arabinose 0,330 0,333 0,346 0,866 0,351 Xilooligômeros* - - - - -

Valores de açúcares redutores (g/L); * Foram usados como padrões xilobiose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose; O símbolo (-) indica níveis abaixo do limite de detecção.

5.4.2. Características da polpa tratada com diferentes concentrações de enzimas e branqueada

As polpas tratadas com diferentes concentrações de enzima foram branqueadas com a

seqüência X/E/Q/P e foram realizadas as análises de número kappa e viscosidade. Analisando os

valores da viscosidade após a etapa de tratamento enzimático (Apêndice A) é possível verificar

que houve um pequeno aumento da viscosidade das polpas branqueadas em relação ao controle.

As concentrações de enzima empregadas resultaram em viscosidades muito próximas, ou seja, a

faixa escolhida não afetou essa propriedade da polpa (Figuras 5.12, 5.13, 5.14 e 5.15). Tal fato

pode estar relacionado à ação da xilanase, que promove mudanças morfológicas na superfície das

80

fibras facilitando a difusão das macromoléculas de lignina e a remoção de xilanas, protegendo a

celulose de uma maior degradação (WONG et al., 1997a; TORRES et al., 2000). No entanto, os

dados anteriores referentes à hidrólise dos carboidratos da polpa mostraram que as enzimas de C.

subvermispora atuaram na celulose, liberando glicose e celobiose (Tabela 5.7). As enzimas

extracelulares produzidas por esse fungo compreendem as lacases, as MnPs, o complexo

xilanolítico completo e, do complexo celulolítico, endo-celulases e beta-glicosidases e pequenas

quantidades de exo-celulases (SETHURAMAN et al., 1998). Uma possível explicação seria que as

exo-celulases presentes no extrato de C. subvermispora removem fragmentos curtos de celulose,

aderidos a xilana, representando um efeito de limpeza dos polímeros de celulose. A ação dessa

enzima ocorre preferencialmente nas extremidades da celulose, promovendo pequenas

modificações na estrutura do polímero, sem afetar a viscosidade. Outra explicação para a

manutenção da viscosidade pode estar associada com a remoção das polioses, que tem um menor

grau de polimerização, enriquecendo a polpa em celulose. Desta forma, o grau de polimerização

final da polpa é aumentado.

Tratamento enzimático

20

21

22

23

0,5 1,5 2,5 3,5 4,5Tempo de tratamento (h)

Visc

osid

ade

(cP)

Controle Ensaio

Figura 5.12 - Viscosidade da polpa resultante do tratamento enzimático utilizando a carga enzimática de 2 UI/g

81


20

21

22

23


Visc

osid

ade

(cP)

Controle Ensaio

Figura 5.13 - Viscosidade da polpa resultante do tratamento enzimático utilizando a carga enzimática de 1,5 UI/g


20

21

22

23

0,5 1,5 2,5 3,5 4,5


Vis

cosi

dade

(cP)

Controle Ensaio

Figura 5.14 - Viscosidade da polpa resultante do tratamento enzimático utilizando a carga enzimática de 1 UI/g

82


20

21

22

23


Vis

cosi

dade

(cP

) Controle Ensaio

Figura 5.15 - Viscosidade da polpa resultante do tratamento enzimático utilizando a carga enzimática de 0,5 UI/g

A viscosidade das polpas após o branqueamento químico (Apêndice B) foi reduzida

consideravelmente. A polpa controle branqueada apenas quimicamente apresentou viscosidade

final de 16,6 ou seja, uma redução de 33,0% em relação à viscosidade inicial de 24,8. As polpas

que haviam sido previamente tratadas com enzimas mantiveram a viscosidade um pouco mais alta

que o controle, indicando a ação positiva da enzima.

O tempo de residência das polpas foi uma variável importante para a redução da

viscosidade das polpas. Com as cargas enzimáticas de 2 e 1,5 UI/g a menor redução da viscosidade

ocorreu com 0,5 hora de tratamento. Nos tempos de tratamento acima de 3 horas de reação não foi

observada variação da viscosidade (Figuras 5.16 e 5.17). A aplicação das cargas enzimáticas de 1

UI/g e 0,5 UI/g resultaram em pequenas reduções da viscosidade, em torno de 2% para ambas as

cargas utilizadas (Figuras 5.18 e 5.19).

83

Branqueamento químico

10

15

20

25

0 0,5 1 2 3 5


Visc

osid

ade

(cP

)

0

2

4

6

8

Redu

ção

(%)

Controle Ensaio % de Redução

Figura 5.16 - Viscosidade da polpa tratada com 2 UI/g de xilanase após o branqueamento químico


10

15

20

25

0 0,5 1 2 3 5


Visc

osid

ade

(cP

)

0

2

4

6

8

Red

ução

(%)


Figura 5.17 - Viscosidade da polpa tratada com 1,5 UI/g de xilanase após o branqueamento químico

84


10

15

20

25

0 0,5 1 2 3 5


Visc

osid

ade

(cP)

0

2

4

6

8

Redu

ção

(%)


Figura 5.18 - Viscosidade da polpa tratada com 1 UI/g de xilanase após o branqueamento químico


10

15

20

25

0 0,5 1 2 3 5


Visc

osid

ade

(cP)

0

2

4

6

8

Redu

ção

(%)


Figura 5.19 - Viscosidade da polpa tratada com 0,5 UI/g de xilanase após o branqueamento químico

A redução da viscosidade é indesejável, pois esta propriedade se relaciona com o grau de

polimerização da celulose e, indiretamente, com a resistência do papel. A redução após o

branqueamento químico pode ter ocorrido pela ação do peróxido de hidrogênio na polpa, apesar

da adição do sulfato de magnésio. O peróxido, além de reagir com a lignina, pode também reagir

com a celulose o que pode ocasionar uma possível despolimerização e conseqüente redução da

viscosidade, interferindo na qualidade final da polpa produzida. A adição do sulfato de magnésio à

85

etapa de branqueamento com peróxido de hidrogênio teve a função de proteger a celulose,

minimizando a sua degradação.

Após a etapa de tratamento enzimático observa-se que o número kappa (Apêndice C) das

polpas ficou menor do que na polpa controle, sendo a redução máxima atingida em 3 horas de

tratamento. Essa redução ocorre provavelmente pela retirada de parte da lignina durante a lavagem

da polpa, realizada antes da análise do número kappa (Figuras 5.20, 5.21, 5.22 e 5.23).

O efeito da redução do número kappa em função da concentração de enzima e do tempo

de reação fica mais evidente depois do branqueamento químico (Apêndice D). A maior carga de

xilanase utilizada (2 UI/g) foi eficaz na redução do número kappa em tempos curtos de reação. O

número kappa das polpas foi reduzido em 7,7% após o tratamento com 2 UI/g de xilanase e em

10,9% após o branqueamento químico, com 3 horas de reação (Figura 5.20). Nos ensaios em que

se utilizou uma menor carga de enzima verificou-se uma menor redução do kappa após o

tratamento enzimático e conseqüentemente o kappa final foi maior (Figura 5.21). O tratamento das

polpas com 1 UI/g e 0,5 UI/g não proporcionou uma ação eficiente nas fibras, quando se avalia o

efeito de redução no número kappa. Este resultado foi comprovado após o tratamento químico das

polpas, em que o kappa praticamente não foi alterado (Figuras 5.22 e 5.23).

A redução do número kappa tem sido atribuída à remoção da lignina, porém há

evidências de que a remoção de ácidos hexenurônicos (HexAs) formados durante a polpação kraft,

derivados dos ácidos 4-O-metil-D-glucurônico das xilanas, também são responsáveis pelo

mecanismo básico de redução do número kappa. Esses HexAs formados possuem ligações C4-C5

insaturadas, resultando em um aumento de absorbância na região de 230-265 nm. Foi

demonstrado também que esses HexAs interferem positivamente na determinação do número

kappa de madeiras duras da ordem de 30-40%. Outro dado importante é que a liberação de

material que absorve nesses comprimentos de onda, principalmente a 237 nm, fornece uma boa

correlação com o aumento na alvura nas polpas branqueadas (JEFFRIES, 2001).

86


11,5

12

12,5

13

0 0,5 1 2 3 5Tempo de tratamento (h)

Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

Redu

ção

(%)



7

8

9

10

11

12

13


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

12

Redu

ção

(%)


Figura 5.20 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando a carga de xilanase de 2 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico

87


11,5

12,0

12,5

13,0


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

Redu

ção

(%)


7

8

9

10

11

12

13


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

12

Redu

ção

(%)


Figura 5.21 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando a carga de xilanase de 1,5 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico

88


11,5

12,0

12,5

13,0


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

Red

ução

(%)


7

8

9

10

11

12

13


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

12

Redu

ção

(%)


Figura 5.22 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando a carga de xilanase de 1 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico

89


11,5

12,0

12,5

13,0


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

Redu

ção

(%)


7

8

9

10

11

12

13


Nº k

appa

0

2

4

6

8

10

12

Redu

ção

(%)


Figura 5.23 - Número kappa das polpas resultantes do tratamento enzimático utilizando 0,5 UI/g e das polpas resultantes do branqueamento químico

A perda da lignina após o tratamento enzimático, tem sido atribuída a redução dos

complexos lignina-carboidrato. As xilanases, catalisando a despolimerização das xilanas na polpa,

permitem que a lignina que estava ligada às polioses se difunda mais facilmente para fora da fibra.

Ocorrem também mudanças morfológicas na superfície das fibras como fendas, filamentos e

desfibramento devido ao tratamento enzimático. Estas fendas facilitam a difusão das

macromoléculas de lignina degradada da parede das fibras, além da remoção das xilanas,

proporcionando uma diminuição mais acentuada do número kappa das polpas branqueadas

quimicamente (WONG et al., 1997a; TORRES et al., 2000).

90

Comparando-se os resultados da viscosidade e do número kappa em função da

concentração de xilanase para os tempos de 1, 2 e 3 horas é possível verificar que a viscosidade é

melhor preservada com as maiores cargas enzimáticas embora, com maiores tempos de tratamento

ela seja reduzida. Em relação ao número kappa, os maiores tempos de tratamento permitem uma

maior redução, o que é desejável (Figura 5.24).


21,4

21,8

22,2

22,6

0,5 1 1,5 2Carga enzimática (UI/g)

Vis

cosi

dade

(cP

)

11,5

12

12,5

13

Nº k

appa

1 h viscosidade 2 h viscosidade 3 h viscosidade1 h kappa 2 h kappa 3 h kappa

Figura 5.24 - Viscosidade e número kappa em função da concentração de xilanase para os tempos de tratamento enzimático de 1, 2 e 3 horas

Após o branqueamento químico verifica-se que a viscosidade das polpas tratadas com

xilanase nos diferentes tempos foi pouco alterada. Quanto ao número kappa, o tempo de 3 horas

foi o que proporcionou os menores valores, em todas as cargas enzimáticas utilizadas (Figura

5.25).

91


15,5

16

16,5

17

17,5

0,5 1 1,5 2Carga enzimática (UI/g)

Vis

cosi

dade

(cP)

7,5

8

8,5

9

9,5

10

Nº k

appa

1 h viscosidade 2 h viscosidade 3 h viscosidade1 h kappa 2 h kappa 3 h kappa

Figura 5.25 - Viscosidade e número kappa em função da concentração de xilanase para os tempo de tratamento de 1, 2 e 3 horas para o branqueamento químico

Os resultados quanto à redução da viscosidade e seletividade após o branqueamento

químico nas diferentes cargas enzimáticas utilizadas estão apresentados na Tabela 5.8.

Tabela 5.8 - Resultados quanto à redução da viscosidade (%) e seletividade após o branqueamento químico

Redução da viscosidade (%)*

Tempo de reação (h) 2 UI/g 1,5 UI/g 1 UI/g 0,5 UI/g 0 4,15 3,32 2,83 1,84

0,5 2,96 3,57 2,31 2,38 1 4,88 4,59 2,04 2,28 2 5,48 5,86 2,35 2,48 3 6,79 6,73 3,00 3,02 5 6,46 6,58 3,83 3,67

Seletividade Tempo de reação (h) 2 UI/g 1,5 UI/g 1 UI/g 0,5 UI/g

0 0,40 0,37 0,12 0,06 0,5 1,35 1,17 1,06 1,03 1 1,50 1,34 1,10 1,02 2 1,61 1,32 1,13 1,08 3 1,74 1,53 1,12 1,06 5 1,43 1,30 1,09 1,05

*Valores referentes à diferença entre os ensaios e os controles.

92

Pelos resultados obtidos é possível observar que a seletividade foi maior quando foram

utilizadas as maiores cargas enzimáticas antes do branqueamento químico. Isso porque a xilanase

branqueia a polpa de uma forma indireta, agindo apenas sobre as polioses, embora tenha sido

observada uma pequena diminuição na viscosidade das polpas. Esses valores indicam que o pré-

tratamento com xilanase aumenta a deslignificação com uma melhor proteção dos carboidratos

(RONCERO et al., 2000). Assim ela apenas provoca um efeito indireto que auxilia o posterior

branqueamento com reagentes químicos. Esses resultados confirmam dados da literatura sobre a

xilanase (RONCERO et al., 2003; SALLES et al., 2005) e mostram que o extrato enzimático de C.

subvermispora apresenta um efeito biobranqueador significativo.

5.5. CORRELAÇÃO ENTRE CROMÓFOROS, NÚMERO KAPPA E LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES

A correlação entre a liberação de cromóforos, principalmente a 237 nm, e compostos

hidrofóbicos (465 nm) e a redução no número kappa aliados a liberação de açúcares redutores

sugerem a dissociação do complexo lignina-carboidrato (LCC) das fibras da polpa (Figura 5.26).

93

Figura 5.26 - Cromóforos (237 e 465 nm) e açúcares redutores liberados e número kappa em função do tempo de tratamento (2 UI/g de xilanase)

Priorizando a redução do número kappa e a máxima liberação de compostos coloridos da

polpa e açúcares redutores é possível verificar que com a carga de xilanase de 2 UI/g, o tempo de

tratamento de 3 horas foi o que melhor aliou essas características, portanto, sendo o tempo de

tratamento mais eficiente. Maiores períodos de incubação não melhoram as propriedades da polpa.

0 1 2 3 4 50,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

18

19

20

21

22

23

24

11,6

11,8

12,0

12,2

12,4

12,6 465 nm 237 nm Açúcares redutores Nº kappa

237

nm, 4

65 n

m


Açú

care

s re

duto

res

(g/L

)

Nº k

appa

94

6. CONCLUSÕES

Através dos resultados obtidos neste trabalho foi possível concluir que:

- Houve ação efetiva das hemicelulases presentes no extrato de C. subvermispora. Esse

fato pode ser evidenciado pelos dados referentes à liberação de açúcares redutores, à liberação de

substâncias cromóforas nos comprimentos de onda estudados e à diminuição do número kappa nas

polpas tratadas enzimaticamente, principalmente nas maiores cargas utilizadas.

- Acima de 12 horas de tratamento o extrato enzimático de C. subvermispora sofre uma

diminuição na sua ação hidrolítica sobre as polpas devido a uma possível inibição das enzimas

pelos produtos formados. Além disso, a redução da concentração e da disponibilidade das polioses

diminui a velocidade de hidrólise das polpas, portanto tempos de tratamento acima de 8 horas não

aumentam a extensão da hidrólise dos carboidratos da polpa.

- Os produtos obtidos da hidrólise das xilanas mostraram que as xilanases de C.

subvermispora apresentaram um padrão de endo-xilanase, estando esses resultados de acordo com

os dados encontrados na literatura.

- O fato das polioses presentes nas polpas kraft estarem mais condensadas e ligadas

quimicamente à lignina e à celulose proporcionou uma boa atuação tanto das xilanases, quanto das

enzimas acessórias presentes no extrato, permitindo altos graus de hidrólise quando utilizada a

carga de 2 UI/g.

- Comparando-se os resultados da viscosidade em função da concentração de xilanase é

possível verificar que a viscosidade é melhor preservada com as maiores cargas enzimáticas

utilizadas, ou seja, 1,5 e 2 UI/g.

- A carga enzimática que proporcionou as maiores reduções do número kappa foi a de 2

UI/g, sendo a diminuição máxima de 7,7% após o tratamento enzimático e de 10,9% após o

branqueamento químico, ambos com 3 h de tratamento. Após o branqueamento químico o efeito

na redução do número kappa em função da carga enzimática utilizada fica mais evidente,

confirmando as hipóteses do mecanismo de biobranqueamento da xilanase.

- Pelos resultados obtidos é possível observar que a seletividade foi maior quando foram

utilizadas as maiores cargas enzimáticas antes do branqueamento químico.

- A carga enzimática que permitiu uma melhor combinação entre a máxima redução no

número kappa, uma maior redução de cromóforos a 237 e 465 nm e uma maior liberação de

95

açúcares redutores foi a de 2 UI/g de xilanase com um tempo variando de 2 a 3 horas de

tratamento.

- A ação da enzima manganês peroxidase sobre polpas kraft não foi eficiente, mesmo

havendo uma alta atividade dessa enzima no extrato de C. subvermipora. Para que a enzima possa

atuar seria necessário o acréscimo de MnSO4 e pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio, o

que poderia inativar outras enzimas presentes no extrato.

96

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APÊNDICES

Tabela A - Viscosidade das polpas após o tratamento enzimático com as diferentes cargas enzimáticas utilizadas

Tempo de reação (h) Controle 2 UI/g 1,5 UI/g 1 UI/g 0,5 UI/g

0 24,8±0,20 24,8±0,80 24,8±0,80 24,8±0,80 24,8±0,80

0,5 21,8±0,10 22,6±0,04 22,6±0,02 22,4±0,04 22,3±0,02

1 21,7±0,03 22,4±0,04 22,4±0,01 22,2±0,03 22,1±0,01

2 21,1±0,01 22,2±0,01 22,0±0,01 21,8±0,02 21,6±0,01

3 21,0±0,01 22,1±0,02 21,9±0,01 21,8±0,03 21,5±0,02

5 20,9±0,07 21,9±0,05 21,7±0,02 21,6±0,04 21,4±0,02

Tabela B - Viscosidade das polpas após o branqueamento químico com as diferentes cargas enzimáticas utilizadas


0 20,9±0,07 21,9±0,05 21,7±0,02 21,6±0,04 21,4±0,02

0,5 15,3±0,05 16,7±0,02 16,7±0,03 16,3±0,01 16,1±0,02

1 15,2±0,03 17,0±0,01 16,8±0,01 16,2±0,01 16,0±0,02

2 15,1±0,02 17,1±0,06 17,0±0,02 16,1±0,01 16,0±0,01

3 14,9±0,03 17,1±0,04 17,0±0,01 16,1±0,01 15,9±0,02

5 14,7±0,07 16,8±0,03 16,7±0,01 16,0±0,03 15,8±0,01

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Tabela C - Número kappa das polpas após o tratamento enzimático com as diferentes cargas enzimáticas utilizadas


0 12,9±0,01 12,9±0,20 12,9±0,20 12,9±0,10 12,9±0,20

0,5 12,9±0,05 12,5±0,30 12,6±0,40 12,8±0,50 12,9±0,25

1 12,8±0,30 12,3±0,20 12,5±0,10 12,8±0,01 12,8±0,50

2 12,8±0,10 11,9±0,20 12,2±0,50 12,7±0,40 12,6±0,25

3 12,8±0,20 11,8±0,20 12,0±0,40 12,5±0,30 12,5±0,40

5 12,8±0,20 12,1±0,30 12,3±0,20 12,6±0,40 12,8±0,20

Tabela D - Número kappa das polpas após o branqueamento químico com as diferentes cargas enzimáticas utilizadas


0 12,8±0,20 12,3±0,20 12,5±0,20 12,5±0,05 12,7±0,20

0,5 9,6±0,30 8,8±0,05 9,4±0,03 9,5±0,20 9,6±0,20

1 9,5±0,10 8,6±0,10 9,0±0,10 9,3±0,10 9,6±0,08

2 9,6±0,10 8,3±0,10 9,2±0,10 9,2±0,10 9,4±0,09

3 9,4±0,05 8,0±0,10 8,6±0,10 9,2±0,05 9,4±0,20

5 9,4±0,10 8,6±0,10 9,0±0,10 9,2±0,20 9,4±0,10

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