universidade de aveiro departamento de química ano 2020

Universidade de Aveiro Ano 2020

Departamento de Química

BEATRIZ

SOUSA MELO

MACHADO

OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DOS

METABOLITOS PRESENTES NA FOLHA DE OLIVEIRA

(Olea europaea L.)

Universidade de Aveiro Ano 2020

Departamento de Química

BEATRIZ

SOUSA MELO

MACHADO

OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DOS

METABOLITOS PRESENTES NA FOLHA DE OLIVEIRA

(Olea europaea L.)

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos

necessários à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia, realizada sob a

orientação científ ica da Professora Diana Pinto, professora auxiliar do Departamento

de Química da Universidade de Aveiro, e da Doutora Maria Celeste Pereira Dias,

investigadora do Centro de Ecologia Funcional, Departamento de Ciências da Vida da

Universidade de Coimbra.

o júri

Presidente Professora Doutora Luísa Alexandra Seuanes Seraf im Leal Professora Auxiliar, Universidade de Aveiro

Arguente Doutor Romeu António Videira Investigador, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto

Orientador Professora Doutora Diana Cláudia Gouveia Alves Pinto Professora Auxiliar, Universidade de Aveiro

Quero agradecer a todos os que contribuíram para a realização do presente

trabalho.

Às minhas orientadoras, Professora Diana Pinto e Doutora Celeste Dias, por todos

os conhecimentos trasmitidos, pelo apoio e sobretudo por toda a disponibilidade.

Aos amigos que f iz em Aveiro e que me f izeram sentir em casa.

E, por último, à minha família, pais, irmão e madrinha, pela dedicação, esforço,

paciência, conf iança e encorajamento ao longo de todo este percurso, e um

especial agradecimento ao meu avô por todas as palavras de conforto e de

sabedoria.

agradecimentos

palavras-chave

cromatograf ia gasosa acoplada a espetrometria de massa (GC-MS),

cromatograf ia líquida acoplada a espetrometria de massa (LC-MS), extração

assistida por micro-ondas (MAE), extração assistida por ultrassons (UAE),

f itocompostos, Olea europaea L.

resumo

Há vários séculos que a oliveira, Olea europaea L., é conhecida pelo seu

elevado valor económico na região do mediterrâneo, a qual é responsável pela

produção de 98% das azeitonas e 78% do azeite, a nível mundial. Após a

extração do azeite, são geradas, aproximadamente, um milhão de folhas de

oliveira, ricas em compostos bioativos, como polifenóis, que apresentam

propriedades benéf icas, nomeadamente cardio - e neuroprotetora, com elevada

aplicabilidade nas indústrias alimentar e farmacêutica. Assim, tendo em conta a

elevada disponibilidade e baixo custo deste subproduto, é imperativa a

otimização da extração dos metabolitos secundários presentes nas folhas de

oliveira, e a valorização deste subproduto agroindustrial como uma fonte

essencial de compostos bioativos. Deste modo, os metabolitos lipof ílicos e

fenólicos presentes nas folhas de oliveira foram extraídos pelas metodologias

não convencionais, extração assistida por micro-ondas (MAE) e extração

assistida por ultrassons (UAE), e foram utilizados n-hexano e etanol como

solventes. Posteriomente, os metabolitos, extraídos das folhas de oliveira

f rescas ou secas e inteiras ou maceradas, foram identif icados recorrendo a

técnicas de cromatograf ia (gasosa e líquida) acoplada à espetrometria de massa

(GC-MS e UHPLC-MS, respetivamente). Foram identif icados e quantif icados 26

e 37 compostos lipofílicos extraídos pelas técnicas MAE e UAE, respetivamente,

tendo-se obtido um maior teor de compostos lipofílicos pela técnica UAE na folha

de oliveira seca macerada, e 22 compostos fenólicos extraídos por ambas as

técnicas não convencionais, em maior quantidade na folha de oliveira f resca

macerada, a partir da técnica MAE. Em suma, estes métodos emergentes

provaram ser ef icientes na extração de metabolitos secundários presentes nas

folhas de oliveira, quando comparados com os métodos convencionais,

essencialmente extração sólido - líquido (com hexano, metanol, etanol e água,

com agitação) e extração por Soxhlet (com etanol), uma vez que foram utilizados

tempos de extração signif icamente inferiores (30 min) e menores quantidades

de solvente, evitando ainda gastos de tempo e energia, mantendo bons

rendimentos de extração e tendo, por conseguinte, um impacto positivo no

ambiente.

keywords

GC-MS, UHPLC-DAD ESI/MSn, MAE, Olea europaea L., phytocompounds,

Soxhlet, UAE

abstract

The olive tree, Olea europaea L., has been known for centuries in the

Mediterranean region for its economic value. About 98% of the world ’s olive and

78% of world olive oil are produced in this region. Af ter the olive oil extraction,

around one million tons of olive leaves remain f rom this process. Olive leaves

are rich in bioactive compounds, such as polyphenols, and present several

health properties, mainly cardio- and neuroprotective, with a wide application in

the food and pharmaceutical industries. So, considering the high availability and

low cost of this sub- product, it is very important to optimize metabolite extraction

f rom leaves and increase its value as a source of important bioactive

compounds. Olive leaves metabolites, lipophilic and phenolic, were extracted by

nonconventional methods, such as microwave-assisted extraction (MAE) and

ultrasound-assisted extraction (UAE), with n-hexane and ethanol. The

metabolites extracted f rom f resh or dry and intact or macerated olive leaves were

identif ied and quantif ied by chromatography (gas and liquid) coupled with mass

spectrometry (GC-MS and UHPLC-DAD ESI/MSn). Overall, 26 and 37 lipophilic

compounds were extracted by MAE and UAE, respectively, and the highest

content of these compounds was detected in the macerated dry olive leaf by

UAE, and 22 phenolic compounds extracted by both nonconventional methods,

where the highest content was verif ied in the macerated f resh olive leaf by MAE.

Thereby, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction

proved to be ef f icient in extracting metabolites present in olive leaves when

compared with conventional methods such as solid -liquid extraction (with

hexane, methanol, ethanol, and water, with magnetic stirring) and Soxhlet

extraction (with ethanol), since signif icantly lower extraction times (30 min) and

amounts of solvent have been used, avoiding time and energy consumption,

maintaining good extraction yields and, therefore, having a positive impact on

the environment.

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................................. i

ÍNDICE DE TABELAS ............................................................................................................................... iii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................................................................. v

INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................................................... 1

1. Olea europaea L...................................................................................................................................... 2

2. Folhas de oliveira ................................................................................................................................... 3

3. Metabolitos presentes nas folhas de oliveira e sua aplicabilidade ......................................................... 4

3.1. Compostos fenólicos........................................................................................................................... 4

3.2. Ácidos gordos ..................................................................................................................................... 8

3.3. Terpenóides e esteróis......................................................................................................................... 9

3.4. Álcoois .............................................................................................................................................. 10

3.5. Hidrocarbonetos................................................................................................................................ 10

3.6. Açúcares ........................................................................................................................................... 11

4. Métodos de extração de compostos presentes em plantas .................................................................... 11

4.1. Métodos de extração convencionais ................................................................................................. 12

4.2. Métodos de extração não convencionais .......................................................................................... 15

4.2.1. Extração assistida por ultrassons (UAE) .................................................................................... 16

4.2.2. Extração assistida por micro-ondas (MAE) ............................................................................... 17

4.2.3. Extração por fluidos supercríticos (SFE) ................................................................................... 19

4.2.4. Extração por campo elétrico pulsado (PEF) ............................................................................... 21

4.2.5. Extração por líquido pressurizado (PLE) ................................................................................... 21

4.2.6. Extração assistida por enzimas (EAE) ....................................................................................... 22

5. Métodos de identificação e quantificação de compostos em extratos de folhas de oliveira ................ 23

OBJETIVOS ................................................................................................................................................ 25

MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................................... 27

1. Amostras de folhas de oliveira ............................................................................................................. 27

2. Extração de metabolitos das folhas de oliveira .................................................................................... 27

3. Análise de metabolitos presentes nos extratos de folhas de oliveira ....................................................... 28

3.1. Análise por GC-MS .......................................................................................................................... 28

3.2. Análise por UHPLC-DAD ESI/MSn ................................................................................................ 29

4. Análise de dados ................................................................................................................................... 30

RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................................. 31

1. Perfil lipofílico dos extratos de folhas de oliveira ................................................................................ 31

1.1. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira após MAE ........................................... 31

1.2. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira após UAE ............................................ 35

1.3. Comparação do perfil lipofílico dos extratos obtidos por MAE e UAE ....................................... 39

1.3.1. Comparação do perfil lipofílico dos extratos FI vs SI e FM vs SM extraídos por MAE e

UAE……………….. ............................................................................................................................ 40

1.3.2. Comparação do perfil lipofílico dos extratos obtidos pelos métodos não convencionais

(MAE e UAE) vs métodos convencionais ............................................................................................ 43

2. Perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira ................................................................................. 46

2.1. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira após MAE............................................. 46

2.2. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira após UAE ............................................. 50

2.3. Comparação do perfil fenólico dos extratos obtidos por MAE e UAE ........................................ 54

2.3.1. Comparação do perfil fenólico dos extratos FI vs SI e FM vs SM extraídos por MAE e UAE

............................................................................................................................................... 55

2.3.2. Comparação do perfil fenólico dos extratos obtidos pelos métodos não convencionais vs

métodos convencionais......................................................................................................................... 59

CONCLUSÃO ............................................................................................................................................. 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................ 67

ANEXOS ..................................................................................................................................................... 77

Anexo1. Padrões utilizados na quantificação de compostos lipofílicos .................................................. 77

Anexo 2. Padrões utilizados na quantificação de compostos fenólicos................................................... 80

i

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Olea europaea L............................................................................................................................. 2

Figura 2. Folhas de oliveira. .......................................................................................................................... 3

Figura 3. Estrutura da oleuropeína................................................................................................................. 5

Figura 4. Estruturas dos fenóis simples encontrados nas folhas de oliveira: hidroxitirosol (A) e tirosol (B).

....................................................................................................................................................................... 5

Figura 5. Estrutura dos flavonoides presentes nos extratos das folhas de oliveira: apigenina-7-O-glicósido

(A), luteolina-7-O-glicósido (B), luteolina-4'-O-glicósido (C) e quercetina (D). ......................................... 6

Figura 6. Estrutura do ácido cafeico. ............................................................................................................. 6

Figura 7. Estrutura do verbascosídeo............................................................................................................. 7

Figura 8. Estrutura dos ácidos gordos encontrados nas folhas de oliveira: ácido α - linolénico (C18:3) (A)

e ácido palmítico (C16:0) (B). ....................................................................................................................... 8

Figura 9. Estruturas dos compostos terpénicos encontrados nos extratos de folha de oliveira: ácido

oleanólico (A), ácido ursólico (B) e ácido maslínico (C). ............................................................................. 9

Figura 10. Estrutura do β-sitosterol, esterol predominante nas folhas de oliveira. ..................................... 10

Figura 11. Estrutura do álcool Hexacosan-1-ol (C26H54O). ...................................................................... 10

Figura 12. Estruturas dos açúcares presentes nas folhas de oliveira: Glucose (A), Frutose (B) e Manitol (C).

..................................................................................................................................................................... 11

Figura 13. Aparelho de Soxhlet convencional. ............................................................................................ 13

Figura 14. Exemplo de extração assistida por ultrassons (UAE) em folhas de oliveira secas (A) e frescas

(B). ............................................................................................................................................................... 16

Figura 15. Aparelho de micro-ondas utilizado em laboratório. ................................................................... 18

Figura 16. Transformação da fase gasosa e líquida do CO2 no estado supercrítico. ................................... 19

Figura 17. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por GC-MS dos extratos de hexano, após extração

assistida por micro-ondas. Os picos identificados com números correspondem aos compostos identificados

na tabela 1. ................................................................................................................................................... 31

Figura 18. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por GC-MS dos extratos de hexano, após extração

assistida por ultrassons. Os picos identificados com números correspondem aos compostos identificados na

tabela 2. ........................................................................................................................................................ 35

Figura 19. Comparação do perfil lipofílico dos extratos das folhas de oliveira inteiras, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/g PF ou PS). ……………………………………………………………...41

Figura 20. Comparação do perfil lipofílico dos extratos das folhas de oliveira maceradas, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/g PF ou PS)............................................................................................... 42

ii

Figura 21. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por LC-MS dos extratos de etanol, após extração

assistida por micro-ondas. Os picos identificados com números correspondem aos compostos identificados

na tabela 3. ................................................................................................................................................... 46

Figura 22. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por LC-MS dos extratos de etanol, após extração

assistida por ultrassons. Os picos identificados com números correspondem aos compostos identificados na

tabela 4. ........................................................................................................................................................ 50

Figura 23. Comparação do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira inteiras, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/Kg PF ou PS). ........................................................................................... 57

Figura 24. Comparação do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira maceradas, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/Kg PF ou PS). ........................................................................................... 58

Figura A1. Reta de calibração do octadecano. ............................................................................................ 77

Figura A2. Reta de calibração do ácido palmítico. ...................................................................................... 77

Figura A3. Reta de calibração do colesterol. ............................................................................................... 78

Figura A4. Reta de calibração do octadecanol. ........................................................................................... 78

Figura A5. Reta de calibração da maltose. .................................................................................................. 79

Figura A6. Reta de calibração do ácido cafeico. ......................................................................................... 80

Figura A7. Reta de calibração da oleuropeína a 280 nm. ............................................................................ 80

Figura A8. Reta de calibração da oleuropeína a 240 nm. ............................................................................ 81

Figura A9. Reta de calibração da luteolina. ................................................................................................. 81

Figura A10. Reta de calibração da quercetina. ............................................................................................ 82

Figura A11. Reta de calibração da rutina. ................................................................................................... 82

iii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira (mg/g PS) de cada grupo – folha fresca

inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI), e seca macerada (SM), após extração assistida por

micro-ondas (MAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3). ........................................... 32

Tabela 2. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira (mg/g PS) de cada grupo – folha fresca

inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI), e seca macerada (SM), após extração assistida por

ultrassons (UAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3)................................................. 36

Tabela 3. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira (mg/Kg PF) de cada grupo – folha fresca

inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM), após extração assistida por

micro-ondas (MAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3). ........................................... 47

Tabela 4. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira (mg/Kg PF) de cada grupo – folha fresca

inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM), após extração assistida por

ultrassons (UAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3)................................................. 51

v

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

A/Api – razão área do pico/ área do pico do padrão interno

Api – área do pico correspondente ao padrão interno

ABTS - 2,29-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)

ASE – extração por fluído acelerado, do inglês Accelerated Fluid Extraction

BHA – 2-t-butil-4-hidroxianisol

BHT – 3,5-di-t-butil-4-hidroxitolueno

BSTFA – bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida

EAE – extração assistida por enzimas, do inglês Enzyme-assisted Extraction

ESE – extração aumentada por solvente, do inglês Enhanced Solvent Extraction

FI – fresca inteira

FM – fresca macerada

FRAP - poder antioxidante por redução do ião férrico, do inglês Fluorescence Recovery

After Photobleaching

GC – cromatografia gasosa, do inglês Gas Cromatography

HPLC – cromatografia líquida de elevada eficiência, do inglês High Performance Liquid

Chromatography

HPSE – extração por solvente de alta pressão, do inglês High Pressure Solvent Extraction

m/z – razão massa/carga

MAE – extração assistida por micro-ondas, do inglês Microwave-assisted Extraction

MS – espectrometria de massa, do inglês Mass Spectrometry

PEF – extração por um campo elétrico pulsado, do inglês Pulsed-electric Field Extraction

PFE – extração por um fluído pressurizado, do inglês Pressurized Fluid Extraction

PF – peso fresco

PLE – extração por líquido pressurizado, do inglês Pressurized Liquid Extraction

PS – peso seco

R2 – coeficiente de correlação

SFE – extração por fluidos supercríticos, do inglês Supercritical Fluid Extraction

SFMAE – extração assistida por micro-ondas sem a utilização de solvente, do inglês

Solvent Free Microwave Assisted Extraction

SI – seca inteira

vi

SM – seca macerada

TBHQ – t-butil-hidroquinona

TMSCl – cloreto de trimetilsililo

UAE – extração assistida por ultrassons, do inglês Ultrasound-assisted Extraction

UHPLC-DAD ESI/MSn – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detetor de foto-díodos acoplada a espetrometria de massa com ionização por electrospay

1

INTRODUÇÃO GERAL

A utilização de plantas, tanto na alimentação como para fins medicinais e

terapêuticos, data as origens da humanidade.

Atualmente, o conhecimento científico das diversas propriedades biológicas dos

fitocompostos e o seu papel, nomeadamente na promoção da saúde humana, tem

contribuído para um aumento significativo da procura por alimentos saudáveis, bem como

por alternativas contendo antioxidantes naturais com o intuito de substituir os

antioxidantes sintéticos (Benavente-García et al., 2000; Ferreira & Abreu, 2007).

Na indústria alimentar, são frequentemente utilizados antioxidantes sintéticos, tais

como BHA (2-t-butil-4-hidroxianisol), BHT (3,5-di-t-butil-4-hidroxitolueno) e TBHQ (t-

butil-hidroquinona), como aditivos alimentares, devido à sua elevada estabilidade térmica

e baixo custo. Contudo, a segurança dos mesmos tem sido questionada ao longo dos anos

por apresentarem atividade carcinogénica (Ito et al., 1985).

Os fitoquímicos são compostos produzidos pelas plantas e são classificados como

compostos bioativos. Estes incluem antioxidantes, como polifenóis, vitaminas,

carotenoides, ácidos gordos insaturados e açúcares redutores (Ramarathnam et al., 1995;

Škerget et al., 2005).

Deste modo, estes antioxidantes naturais presentes na dieta alimentar,

nomeadamente em frutos e vegetais, assumem uma grande importância como possíveis

agentes seguros e eficazes na proteção do corpo humano contra danos oxidativos, estando

associados à redução do risco de ocorrência de várias doenças crónicas causadas,

essencialmente, pelo stress oxidativo, como certos tipos de cancro e doenças

cardiovasculares (Ferreira & Abreu, 2007; Halliwell, 1996; Valko et al., 2007).

Alguns sectores agroalimentares, como por exemplo a olivicultura, a

vitivinicultura e os lacticínios, geram grandes quantidades de subprodutos, que

apresentam propriedades biológicas importantes, mas que são subaproveitados, causando

um grande impacto ambiental. Por conseguinte, a valorização destes subprodutos

agroalimentares apresenta-se não só como uma necessidade, mas também como uma

oportunidade na obtenção de produtos novos com valor acrescentado, o que pode

provocar um impacto positivo na economia destas indústrias.

2

Assim, os subprodutos agroalimentares têm suscitado, cada vez mais interesse,

tanto pela sua composição em fitoquímicos, como pelo seu baixo custo e elevado impacto

ambiental (Pintado & Teixeira, 2015).

Na cultura da oliveira e, consequentemente, na produção do azeite, uma das fontes

mais promissoras de compostos bioativos, com inúmeras aplicabilidades, são as folhas de

oliveira obtidas como biomassa após a poda das árvores e a apanha da azeitona (Erbay &

Icier, 2010). A importância deste subproduto é enfatizada tanto pela elevada

disponibilidade como também pelos efeitos nutricionais e terapêuticos das folhas de

oliveira, contribuindo, ainda, para uma economia circular (Balasundram et al., 2006;

Guinda et al., 2015).

1. Olea europaea L.

A oliveira, Olea europaea L., (Figura 1) é uma árvore de fruto com elevado valor

económico e é frequentemente associada à região mediterrânica, na qual se situam mais

de 80% dos olivais de todo o mundo (Rashid & Rashid, 2019).

A oliveira é uma árvore de porte médio, pertencente à família das oleáceas, e é a

espécie mais popular pertencente ao género Olea. Trata-se de uma árvore com grande

longevidade e distribuição geográfica, uma vez que consegue resistir a condições de

stress, como variações de temperatura, seca e exposição a radiação UV (Dias et al., 2020;

Martinelli et al., 2013). Das variedades de oliveira existentes, a Cobrançosa, Galega,

Figura 1. Olea europaea L.

3

Azeiteira, Cordovil e Blanqueta, são variedades típicas de Portugal e as principais

responsáveis pela produção de azeite (Cardoso, 2006).

Apesar de ser conhecida principalmente pelo seu óleo, o azeite, a oliveira é

também conhecida pelo seu fruto, a azeitona. A região do Mediterrâneo é responsável

pela produção de 98% das azeitonas e 78% do azeite a nível mundial (Ryan & Robards,

1998). Nos últimos anos o consumo de azeite tem vindo a aumentar devido ao

conhecimento dos efeitos benéficos do azeite na saúde, nomeadamente ao nível da

proteção contra doenças, como doenças cardiovasculares, e das suas propriedades

antioxidantes, anti-inflamatórias e anticancerígenas (Ghanbari et al., 2012; Talhaoui,

Gómez-Caravaca, et al., 2015).

Contudo, tanto o cultivo de oliveiras como a extração do azeite originam,

anualmente, quantidades significativas de produtos designados por “subprodutos da

oliveira”, como por exemplo as suas folhas. Após a extração do azeite são geradas,

aproximadamente, 1 milhão de folhas como subproduto, ricas em compostos bioativos e

com elevada aplicabilidade nas indústrias alimentar e farmacêutica (Abdellaoui et al.,

2018).

2. Folhas de oliveira

As folhas de oliveira (Figura 2) são uma fonte renovável, barata e abundante em

ácidos gordos e polifenóis, representando aproximadamente 10% do peso total da oliveira

(Abdellaoui et al., 2018; Balasundram et al., 2006).

Para além do azeite e da azeitona, as folhas têm também elevada aplicabilidade,

como infusões ou extratos na medicina tradicional, e nas indústrias farmacêutica,

Figura 2. Folhas de oliveira.

4

cosmética e alimentar. Na medicina tradicional, as folhas de oliveira são, há muitos anos,

utilizadas no tratamento de várias doenças, como malária, diabetes, doenças

cardiovasculares e no combate a infeções (Ben Salem et al., 2015; Benavente-García et

al., 2000), por apresentarem propriedades bioativas, tais como antioxidante, anti-

hipertensiva, anti-inflamatória, hipoglicémica e hipocolesterolémica (Boss et al., 2016).

3. Metabolitos presentes nas folhas de oliveira e sua aplicabilidade

As folhas de oliveira têm despertado elevado interesse devido aos metabolitos

presentes na sua composição, como compostos fenólicos, ácidos gordos, terpenóides,

álcoois e esteróis, hidrocarbonetos e hidratos de carbono, conferindo-lhes inúmeras

aplicabilidades nas diferentes indústrias (Peragon, 2013).

A presença e o teor destes metabolitos nas folhas de oliveira dependem sobretudo

da variedade, do estado de desenvolvimento, das condições ambientais de crescimento, e

ainda da região em que se encontra a oliveira. Já a composição dos extratos de folhas de

oliveira depende dos métodos e condições de extração utilizados (Taamalli, Arráez-

Román, Barrajón-Catalán, et al., 2012; Talhaoui, Taamalli, et al., 2015).

3.1. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são metabolitos secundários que apresentam um anel

aromático na sua estrutura química, ao qual se liga um ou mais grupos hidroxilo. Estes

compostos ocorrem naturalmente em plantas e estão, frequentemente, associados às

qualidades sensoriais e nutricionais dos seus produtos, conferindo-lhes proteção contra

danos oxidativos, devido às suas atividades antimicrobiana e antioxidante (Talhaoui,

Gómez-Caravaca, et al., 2015).

Nas folhas de oliveira estão presentes diversos grupos de compostos fenólicos,

como secoiridoides, sendo esta a principal família de compostos presente nas folhas de

oliveira, e restrita à família oleaceae; flavonoides, lenhanos, fenóis simples e derivados

do ácido cinâmico, na sua maioria contendo grupos hidroxilo (Leouifoudi et al., 2014;

Talhaoui, Taamalli, et al., 2015).

A oleuropeína, representada na Figura 3, pertencente ao grupo dos secoiridoides,

é um dos compostos fenólicos mais abundantes nos extratos de folhas de oliveira (Irakli

5

et al., 2018; Talhaoui et al., 2014), podendo constituir até 9% da folha seca (Romani et

al., 2016). Além da oleuropeína, e ainda do grupo dos secoiridoides, também é possível

detetar nas folhas de oliveira o composto ligstrosido (Ben Salem et al., 2015; Irakli et al.,

2018).

O hidroxitirosol e o tirosol, cujas estruturas se encontram representadas na Figura

4, são os fenóis simples presentes nas folhas de oliveira e são percursores da oleuropeína

e seus derivados ( Silva et al., 2006).

Para além destes, já foram identificados flavonoides nos extratos de folhas de

oliveira, como a rutina, apigenina, apigenina-7-O-glucósido, glucósidos de luteolina,

nomeadamente luteolina-7-O-glucósido e luteolina-4'-O-glucósido, e quercetina,

representados na Figura 5 (Fu et al., 2010; Pereira et al., 2007; Talhaoui, Taamalli, et al.,

2015).

Figura 3. Estrutura da oleuropeína .

Figura 4. Estruturas dos fenóis simples encontrados nas folhas de oliveira: hidroxitirosol (A) e

tirosol (B).

A B

6

Relativamente aos derivados do ácido cinâmico, é possível detetar nas folhas de

oliveira a presença de ácido cafeico, representado na Figura 6 (Kiritsakis et al., 2010;

Pereira et al., 2007).

Por último, é possível ainda detetar a presença de um derivado do ácido cafeico

nas folhas de oliveira, o verbascosídeo, representado na Figura 7 (Ryan & Robards, 1998;

Taamalli, Arráez-Román, Ibañez, et al., 2012).

Figura 5. Estrutura dos flavonoides presentes nos extratos das folhas de oliveira: apigenina-7-O-

glicósido (A), luteolina -7-O-glicósido (B), luteolina -4'-O-glicósido (C) e quercetina (D).

A) R1 = H; R2 = H; R3 = H; R4 = glucose

B) R1 = H; R2 = OH; R3 = H; R4 = glucose

C) R1 = glucose; R2 = OH; R3 = H; R4 = H

D) R1 = H; R2 = OH; R3 = OH; R4 = H

Figura 6. Estrutura do ácido cafeico.

7

A família dos compostos fenólicos é a principal responsável pela capacidade

antioxidante detetada nas folhas de oliveira, essencialmente devido ao seu elevado poder

redutor.

A nível alimentar, as folhas podem estar presentes na extração do azeite,

conferindo-lhe um maior teor destes compostos antioxidantes, aumentando

consequentemente a estabilidade oxidativa do produto, uma vez que retarda a principal

causa de deterioração dos alimentos, a peroxidação lipídica, mantendo a sua qualidade e

propriedades sensoriais (Bouaziz et al., 2008; Ecker, 2003; Maisuthisakul et al., 2007).

Os extratos obtidos a partir das folhas de oliveira também podem ser usados na prevenção

da oxidação de outros óleos e carnes, apresentando-se como uma fonte promissora de

antioxidantes a ser incorporada em embalagens de alimentos perecíveis (Bouaziz et al.,

2008; Marcos et al., 2014).

A adição de extratos de folhas de oliveira também já provou ser eficaz no fabrico

de salsichas, carnes, saladas e sopas, melhorando a qualidade microbiológica, estabilidade

da cor, sabor e, assim, o tempo de prateleira (Ložiene et al., 2007; Novak et al., 2000).

Além disso, a adição de folhas de oliveira à ração de animais tem, também, um

impacto positivo na qualidade microbiológica da carne obtida, sendo adicionadas para

impedir o crescimento de bactérias indesejáveis, devido às propriedades antibióticas

Figura 7. Estrutura do verbascosídeo.

8

apresentadas pela oleuropeína e hidroxitirosol presentes nos extratos de folhas de oliveira

(Marangoni et al., 2015).

Existem, ainda, estudos que demonstram a eficácia do extrato das folhas de

oliveira rico em oleuropeína, ácido oleico e hidroxitirosol na inibição da infeção e

transmissão do vírus HIV-1, em parte devido à indução da apoptose celular, mas também

pela reversão dos danos causados pelo vírus a nível da expressão de genes envolvidos nas

vias sinalizadoras de sobrevivência, morte, diferenciação e proliferação celular (Boss et

al., 2016; Lee-Huang et al., 2008; Malik & Bradford, 2006).

3.2. Ácidos gordos

Nas folhas de oliveira já foram identificados diversos ácidos gordos

polinsaturados, como por exemplo, o ácido α - linolénico (C18:3), um ácido gordo ómega

3, o ácido linoleico (C18:2), um ácido gordo ómega 6 e o ácido oleico (C18:1), um ácido

gordo monoinsaturado, em quantidades significativas.

Os ácidos gordos polinsaturados apresentam inúmeros benefícios na saúde

humana, principalmente na prevenção de doenças cardiovasculares e obesidade. Por

exemplo, o ácido linolénico é um ácido ómega 3, que está presente nas folhas de oliveira.

A sua ingestão permite a regulação dos níveis de triglicéridos e ácidos gordos no plasma,

bem como o controlo da pressão arterial (Şahin et al., 2018).

Além destes, também já foram detetadas elevadas quantidades de ácidos gordos

saturados, nomeadamente, o ácido palmítico (C16:0), e em menores quantidades, o ácido

esteárico (C18:0) (Dias et al., 2018). Na Figura 8 encontram-se representadas as estruturas

dos ácidos α – linolénico e palmítico.

Figura 8. Estrutura dos ácidos gordos encontrados nas folhas de oliveira: ácido α - linolénico (C18:3) (A)

e ácido palmítico (C16:0) (B).

A

B

9

3.3. Terpenóides e esteróis

As folhas de oliveira também são ricas em terpenóides, os quais apresentam

elevada atividade antioxidante, conferindo-lhes propriedades benéficas, como

propriedades anticancerígenas e antiproliferativas, pelo que têm uma potencial aplicação

no combate a certos tipos de cancro, tais como cancro do cólon e da mama (Allouche et

al., 2011).

Nas folhas de oliveira, é de salientar a presença do ácido oleanólico, por ser o

mais abundante, e os ácidos maslínico e ursólico, evidenciados na Figura 9, e em menores

concentrações, uvaol e eritrodiol (Dias et al., 2019; Guinda et al., 2015; Peragon, 2013).

Para além destes, podem encontrar-se também o α-tocoferol, que é a forma mais

ativa da vitamina E, e o β-caroteno, precursor da vitamina A (Issaoui et al., 2017; Tabera

et al., 2004).

Relativamente aos esteróis presentes nas folhas de oliveira, o β-sitosterol é o

composto que se encontra em maiores concentrações, cuja estrutura se encontra

evidenciada na Figura 10, seguido do campesterol e estigmasterol. Contudo, também já

foram identificados outros compostos pertencentes a esta família como o colesterol e Δ5-

e Δ7-avenasterol, em menores quantidades (Mara Orozco-Solano et al., 2010; Tabera et

al., 2004).

A B C

Figura 9. Estruturas dos compostos terpénicos encontrados nos extratos de folha de oliveira: ácido

oleanólico (A), ácido ursólico (B) e ácido maslínico (C).

10

3.4. Álcoois

Geralmente, os álcoois encontram-se em maior abundância no fruto da oliveira do

que nas folhas. No entanto, verifica-se a presença de álcoois de cadeia longa como o

hexacosanol (C26H54O), representado na Figura 11, sendo este o mais relevante. De

salientar, ainda, a presença do álcool octacosanol (C28H58O), pelas suas propriedades

bioativas, e os álcoois tetracosanol (C24H50O) e docosanol (C22H46O), em quantidades

inferiores nas folhas de oliveira (Mara Orozco-Solano et al., 2010).

3.5. Hidrocarbonetos

Nas folhas de oliveira predominam os hidrocarbonetos alifáticos, ou seja, alcanos

de cadeia longa, que varia entre 24 e 35 átomos de carbono. Assim, verifica-se uma

predominância dos hidrocarbonetos nonacosano (C29H60), untriacontano (C31H64) e

tritriacontano (C33H68) (Issaoui et al., 2017).

Para além destes, também se encontram presentes hidrocarbonetos aromáticos,

tais como o tolueno, em quantidades superiores, e ainda orto- e para-xileno (Malheiro et

al., 2016; Ryan & Robards, 1998).

Figura 10. Estrutura do β-sitosterol, esterol predominante nas folhas de oliveira.

Figura 11. Estrutura do álcool Hexacosan-1-ol (C26H54O).

11

3.6. Açúcares

Os açúcares presentes nas folhas de oliveira resultam da fotossíntese realizada nas

mesmas, sendo uma fonte de energia e um constituinte fundamental da parede celular.

Nas folhas de oliveira predominam os açúcares glucose e frutose, e um derivado da

manose, o manitol, representados na Figura 12. O manitol também confere alguma

vantagem às folhas de oliveira, uma vez que pode ter aplicabilidade como adoçante na

indústria alimentar (Guinda et al., 2015).

Para além destes, também já foram descritos outros componentes importantes

como a celulose e açúcares hemicelulósicos, nomeadamente arabinose, galactose e xilose

(Gómez-González et al., 2010).

4. Métodos de extração de compostos presentes em plantas

Como resultados das suas propriedades, há um crescente interesse em isolar estes

compostos presentes nas folhas de oliveira, com o intuito de os utilizar como

antioxidantes naturais, a partir de diferentes métodos de extração (Jeong et al., 2004).

O processo de extração é uma das etapas mais importantes para a obtenção dos

compostos químicos presentes nas plantas. A seleção de uma técnica de extração

adequada é determinante para separar, identificar e caracterizar os compostos químicos,

bem como para evitar a sua degradação ou perda durante todo o processo de extração

(Tradit et al., 2007).

A B C

Figura 12. Estruturas dos açúcares presentes nas folhas de oliveira: Glucose (A), Frutose (B) e Manitol

(C).

12

A extração utilizando um solvente, orgânico ou inorgânico, também designada por

extração sólido-líquido, é uma das técnicas mais comuns na preparação de extratos a

partir de plantas, devido à simplicidade do método, à elevada eficiência e à vasta gama

de aplicações.

Por conseguinte, a eficiência da extração depende, essencialmente, da escolha dos

solventes que deve ter por base a polaridade dos compostos alvo. Além disso, a afinidade

molecular entre o soluto e o solvente, a transferência de massa, uso de co-solvente,

segurança ambiental, toxicidade humana e viabilidade económica também devem ser

tidos em conta aquando a seleção do solvente para a extração de compostos bioativos

(Murphy, 1999).

4.1. Métodos de extração convencionais

Os métodos de extração clássicos baseiam-se, sobretudo, na escolha e utilização

de um solvente, ou mistura de solventes, apropriado, bem como na utilização de elevadas

temperaturas e/ou agitação. Deste modo, o rendimento do processo de extração depende,

fortemente, do solvente líquido e da sua polaridade, do tempo e temperatura usados e, por

último, da quantidade e das propriedades físicas e químicas da amostra (Mircea Vinatoru,

2001).

O hexano, o metanol e o etanol são exemplos de solventes habitualmente

utilizados. No entanto, é de salientar que, por ser um solvente apolar, o hexano dissolve

preferencialmente compostos apolares. Já o metanol e o etanol dissolvem

preferencialmente compostos polares (Şahin et al., 2011).

Relativamente aos métodos de extração sólido-líquido convencionais, as técnicas

mais utilizadas são a maceração, a destilação por arrastamento de vapor e a extração por

Soxhlet, podendo ser aplicadas de forma individual ou combinada.

A maceração é um processo de extração que se apoia em dois efeitos

fundamentais, difusão e osmose. Nesta técnica, a amostra é inicialmente macerada com o

intuito de quebrar as paredes e membranas celulares e, assim, aumentar a área de

superfície em contacto com o solvente, podendo ser utilizadas elevadas temperaturas.

Após a maceração, é então adicionado o solvente apropriado e por último, procede-se à

filtração da mistura.

13

A agitação ocasional neste processo facilita a extração uma vez que aumenta a

difusão dos compostos presentes na matriz da amostra para o solvente, permit indo um

maior rendimento de extração (Naviglio et al., 2007).

A destilação por arrastamento de vapor consiste na adição de água à amostra e

posterior fervura da mesma. Alternativamente, é injetado vapor diretamente na amostra.

Assim, tanto a água como o vapor têm um papel fundamental na libertação dos compostos

bioativos a partir dos tecidos vegetais. A refrigeração indireta pela água condensa a

mistura de água e óleos essenciais, a qual flui até um separador, que diferencia,

automaticamente, os óleos e os compostos bioativos da água (L. V. Silva et al., 2005).

Por último, a extração por Soxhlet é, também, um método convencional

comumente utilizado na extração de metabolitos a partir de plantas. Nesta técnica usa-se

o aparelho de Soxhlet, representado na Figura 13, que é constituído por uma câmara de

extração ou extrator, uma câmara de vaporização (balão) e um condensador. Ambas as

câmaras comunicam por um intermediário de dois tubos laterais, um funciona como sifão

e o outro como passagem do vapor do solvente. A matriz sólida, inteira ou previamente

macerada, a ser extraída é colocada num cartucho de papel de filtro na câmara de extração

(Luque de Castro & Priego-Capote, 2010).

Deste modo, por aquecimento, o solvente presente no balão evapora até ao

condensador, através do tubo lateral, no qual condensa e enche a câmara de extração,

onde se encontra o cartucho de Soxhlet. Por conseguinte, o analito dissolvido é

Figura 13. Aparelho de Soxhlet convencional.

14

encaminhado para o sifão de recolha, no qual é descarregado, de volta, para o balão após

terminado o ciclo de extração. De seguida, inicia-se um novo ciclo de extração pela

evaporação do solvente livre do soluto, repetindo-se o processo descrito, até à extração

completa da amostra (Luque de Castro & Priego-Capote, 2010; Rodríguez-Bernaldo de

Quirós et al., 2010).

A extração convencional por Soxhlet apresenta diversas vantagens visto ser uma

metodologia simples e por extrair elevadas quantidades de amostra. Como resultado do

contacto permanente da amostra sólida com o solvente, a solubilização do analito ocorre

mais facilmente, e a quantidade de solvente é a mesma em todos os ciclos, até que a matriz

sólida se encontre livre de soluto, possibilitando o uso económico do solvente, e não

sendo necessário haver filtração após a extração (Mircea Vinatoru, 2001).

Porém, tanto a extração por Soxhlet como os restantes métodos convencionais

requerem, geralmente, tempos de extração significativamente longos (geralmente 72h, o

equivalente a 3 ciclos de extração), elevadas quantidades de amostra e,

consequentemente, de solvente, o que torna o processo consideravelmente dispendioso,

tendo um impacto negativo no ambiente e na saúde humana. Além disso, nas técnicas de

destilação por arrastamento de vapor e extração por Soxhlet, as amostras são, geralmente,

extraídas ao ponto de ebulição do solvente, podendo resultar na perda de componentes

voláteis, desvantagem que limita a utilização destes métodos convencionais na extração

de compostos termolábeis (Rodríguez-Bernaldo de Quirós et al., 2010).

Por último, o aparelho de Soxhlet convencional não apresenta agitação, o que

poderia ter um impacto no rendimento de extração, as elevadas quantidades de solvente

utilizado necessitam de ser evaporadas, após a extração, e esta técnica é limitada, ainda,

pela dificuldade em automatizar (Luque de Castro & Priego-Capote, 2010).

Apesar das suas desvantagens, a extração por Soxhlet tem sido usada como ponto

de partida para o desenvolvimento e otimização do processo de extração sólido - líquido,

pelo que a maior parte das modificações feitas tem como objetivo tornar o método

semelhante às técnicas de extração mais recentes, através da redução dos tempos de

extração, e da utilização de formas auxiliares de energia e automação do sistema de

extração (Luque de Castro & Priego-Capote, 2010; Zhang et al., 2005).

Na maior parte dos estudos realizados com folhas de oliveira, a extração de

compostos é feita através de métodos convencionais, nomeadamente através da utilização

de etanol ou metanol a frio, e de água ou etanol a quente (através do método de Soxhlet)

para a extração de compostos fenólicos (Fu et al., 2010; Meirinhos et al., 2005; Pereira et

15

al., 2007). Já para a extração dos compostos lipofílicos, o hexano e o diclorometano a frio

são os principais solventes usados (Cavalheiro et al., 2015; Dias et al., 2018, 2019; M.

Orozco-Solano et al., 2010).

4.2. Métodos de extração não convencionais

Alguns compostos bioativos, como os polifenóis, são termolábeis, pelo que a

elevadas temperaturas há alteração das suas estruturas químicas e consequente

decomposição (Vo et al., 2018). Assim, como referido anteriormente, as técnicas de

extração clássicas podem, por vezes, não ser adequadas. Ainda assim, é extremamente

difícil escolher a técnica de extração ideal para todos os compostos fenólicos presentes

em algumas espécies de plantas, uma vez que apresentam diferentes estruturas químicas

(Garcia-Salas et al., 2010). Além disso, a interação de compostos fenólicos com outras

moléculas, como proteínas e hidratos de carbono, é bastante comum e pode resultar na

formação de complexos insolúveis em solventes orgânicos (Khoddami et al., 2013).

O uso de compostos bioativos em diferentes setores comerciais como

farmacêutico, alimentar e químico, implica a utilização de técnicas mais apropriadas para

a extração desses compostos a partir das plantas, pelo que têm sido estudados novos

métodos de extração, nomeadamente extração assistida por ultrassons (“Ultrasound-

assisted extraction” – UAE), extração assistida por micro-ondas (“Microwave-assisted

extraction” – MAE), extração por fluidos supercríticos (“Supercritical fluid extraction”

– SFE), extração por um campo elétrico pulsado (“Pulsed-electric field extraction” –

PEF), extração por líquido pressurizado (“Pressurized liquid extraction” – PLE) e, por

último, extração assistida por enzimas (“Enzyme-assisted extraction” – EAE) (Garcia-

Salas et al., 2010; Huang et al., 2010; Shao et al., 2014).

Deste modo, estas técnicas de extração não convencionais surgem com o intuito

de ultrapassar as limitações apresentadas pelas técnicas clássicas, nomeadamente com o

intuito de encontrar métodos economicamente mais baratos, amigos do ambiente, sendo

algumas técnicas consideradas “verdes”, e evitar gastos de energia, tempo e solvente

(Chuyen et al., 2018).

Também já foram utilizadas diferentes técnicas de extração não convencionais,

como UAE (Cárcel et al., 2010; Irakli et al., 2018; M. Orozco-Solano et al., 2010), MAE

(Taamalli, Arráez-Román, Barrajón-Catalán, et al., 2012; Taamalli, Arráez-Román,

16

Ibañez, et al., 2012) e SFE (Taamalli, Arráez-Román, Barrajón-Catalán, et al., 2012), para

a extração de compostos fenólicos e lipofílicos presentes nos produtos da oliveira,

essencialmente da folha e do seu fruto.

4.2.1. Extração assistida por ultrassons (UAE)

A extração assistida por ultrassons, exemplo representado na Figura 14, é uma

tecnologia emergente que é cada vez mais utilizada em laboratórios para recuperar

compostos bioativos e de elevado valor, a partir de diferentes matrizes biológicas (Luque

de Castro & Priego-Capote, 2010; Rostagno et al., 2003).

O ultrassom é um tipo especial de onda sonora, normalmente entre 20 kHz e 100

MHz, para além da perceção da audição humana. Assim como as outras ondas, passa

através de um meio criando compressão e expansão, produzindo um fenómeno designado

por cativação, isto é, produção, crescimento e colapso de bolhas (Azmir et al., 2013). Dos

solventes mais utilizados, destacam-se o metanol, o etanol e a acetona (Lee & Lin, 2007).

Deste modo, o efeito mecânico de ultrassons, mais eficaz a baixas frequências

(entre 18 e 40 kHz), promove a libertação de compostos solúveis pela disrupção das

paredes celulares da planta, aumentando a transferência de massa e facilitando o acesso

ao conteúdo celular. Se a matriz tiver sofrido desidratação ou secagem, os ultrassons

promovem a sua reidratação, que ocorre em simultâneo com a fragmentação da matriz,

Figura 14. Exemplo de extração assistida por ultrassons (UAE) em folhas de oliveira secas (A) e frescas

(B).

A B

17

sem causar degradação química significativa (Cravotto et al., 2008; Mircea Vinatoru,

2001).

O mecanismo de extração por ultrassons envolve dois fenómenos físicos

principais: difusão através da parede celular e lavagem dos conteúdos da célula após a

quebra das paredes (Mason et al., 1996). O conteúdo de água na amostra, o grau de

tritura/moagem, tamanho das partículas e solvente são fatores cruciais na obtenção de

uma extração eficaz e eficiente. Além destes, a temperatura, pressão, frequência e tempo

de sonicação são os principais fatores para a ação de ultrassons.

As vantagens deste método incluem a redução do tempo de extração, energia e

uso de solvente, bem como o tamanho do equipamento. A utilização de energia ultrassons

também facilita o processo de mistura, permitindo uma transferência de energia mais

rápida, temperatura de extração e gradientes térmicos reduzidos, permitindo, ainda, uma

extração seletiva dos constituintes da planta (Khoddami et al., 2013).

Assim, a UAE tem sido incorporada em várias técnicas clássicas, uma vez que

aumenta o rendimento de extração de um sistema convencional (M. Vinatoru et al., 1997;

Mircea Vinatoru, 2001).

4.2.2. Extração assistida por micro-ondas (MAE)

A extração assistida por micro-ondas também é considerada como um novo

método para a extração de produtos solúveis, a partir de uma vasta gama de materiais,

usando energia micro-ondas (Punt et al., 1999).

A energia de micro-ondas é uma radiação não ionizante, com frequências entre

300 MHz e 300 GHz. Esta energia eletromagnética é convertida em calor segundo os

mecanismos de condução iónica e rotação dos dipolos (Hadkar et al., 2013). Por um lado,

durante o mecanismo de condução iónica, é gerado calor pela resistência do meio ao fluxo

de iões. Por outro lado, os iões mantêm a sua direção de acordo com os sinais do campo,

que podem mudar frequentemente. Esta alteração frequente de direções resulta na colisão

de moléculas gerando, por conseguinte, calor (Hadkar et al., 2013; Hemwimon et al.,

2007). O aparelho utilizado em laboratório encontra-se representado na Figura 15.

18

O mecanismo de MAE envolve três passos sequenciais: em primeiro lugar há a

separação dos solutos a partir dos locais ativos da matriz da amostra sob elevadas

condições de pressão e temperatura; em segundo lugar ocorre a difusão do solvente ao

longo da matriz da amostra; e em terceiro lugar, há a libertação dos solutos da matriz da

amostra para o solvente (ALUPULUI et al., 2012). Nesta técnica, os solventes mais

utilizados são o metanol, etanol, propanol, acetona, acetonitrilo e água (Eskilsson &

Bjorklund, 2000).

Neste método de extração, o aquecimento por micro-ondas requer a presença de

um composto dielétrico. Quanto maior a constante dielétrica, ou seja, a capacidade de

absorção de energia micro-ondas pela amostra, maior é a quantidade de energia térmica

libertada e, por conseguinte, mais rápido é o aquecimento a uma dada frequência

(Letellier & Budzinski, 1999).

Deste modo, o rendimento de extração depende, fortemente, da natureza da matriz

e do solvente, que deve ter uma elevada constante dielétrica. No entanto, em alguns casos

apenas a matriz da amostra pode ser aquecida para que os solutos sejam libertados num

determinado solvente, particularmente útil para compostos termolábeis, de forma a evitar

a sua degradação (Paris-grignon et al., 2000).

Figura 15. Aparelho de micro-ondas utilizado em laboratório.

19

Este método não convencional, conhecido como uma tecnologia verde, apresenta

várias vantagens, destacando-se o rápido aquecimento na extração de compostos

bioativos a partir de plantas, redução da degradação térmica de compostos termolábeis,

bem como a extração de compostos bioativos em tempos mais curtos, com uma maior

recuperação em relação aos processos de extração convencionais. A extração assistida

por micro-ondas é uma técnica seletiva capaz de extrair compostos orgânicos e

organometálicos mais difíceis (Cravotto et al., 2008). Além disso, uma das principais

vantagens deste método é a possibilidade de isolar compostos bioativos sem a utilização

de um solvente orgânico – “solvent free microwave assisted extraction” (SFMAE), ou

através da utilização de água (Mihiretu et al., 2017; Sahin et al., 2017).

4.2.3. Extração por fluidos supercríticos (SFE)

A extração por fluidos supercríticos foi, inicialmente, desenvolvida para a

extração da cafeína dos grãos de café no processo de descafeinação. Desde então é

utilizada tanto na indústria de preparação de café como na indústria alimentar, na análise

de alimentos, farmacêutica, na síntese de fármacos livres de resíduos, e ambiental

(Ndiomu & Simpson, 1988; Zougagh et al., 2004).

O estado supercrítico distingue-se dos três estados físicos da matéria, sólido,

líquido e gasoso, uma vez que só pode ser atingido se a substância for submetida a

condições de temperatura e pressão superiores às do seu ponto crítico, situação física

observada pela indistinção entre as suas fases gasosa e líquida, representada na Figura 16

(Brunner, 2005).

Figura 16. Transformação da fase gasosa e líquida do CO2 no estado supercrítico.

20

O dióxido de carbono é considerado um solvente ideal para a SFE, sendo o mais

utilizado por apresentar bom poder de solvatação, alta difusidade, custo acessível e não

constituir um problema ambiental. A temperatura crítica do CO2 é bastante próxima da

temperatura ambiente (31 ºC), e a baixa pressão crítica (74 bar) permite operar a pressões

moderadas, geralmente entre 100 e 450 bar. A única desvantagem apresentada pelo

dióxido de carbono é a sua baixa polaridade, o que o torna ideal para lípidos, gorduras e

substâncias não polares, mas impróprio para a maior parte das amostras farmacêuticas

(Brunner, 2005; Mendiola et al., 2007).

Na região supercrítica de um composto, este apresenta densidades semelhantes à

fase líquida, viscosidades semelhantes às dos gases e difusidades significativamente

superiores às dos líquidos. Estas propriedades tornam possível a extração de compostos

em tempos mais curtos com maior rendimento de extração (Sihvonen et al., 1999). Deste

modo, o processo de extração supercrítica (SFE) consiste, basicamente, em dois passos:

extração e separação. No extrator, o fluido em estado supercrítico (SCF) (solvente) passa

pela matriz sólida e dissolve os compostos (solutos). Na zona de separação, a mistura

soluto-solvente expande e o soluto precipita (Sihvonen et al., 1999).

O rendimento de extração de compostos bioativos a partir de materiais das plantas

depende de alguns parâmetros cruciais na SFE, como a temperatura, pressão, o tamanho

das partículas, teor de água no material, tempo de extração e taxa de fluxo do CO2 (Hayes,

2015; Mendiola et al., 2007).

Este método não convencional apresenta inúmeras vantagens na extração de

compostos bioativos, como: o fluido supercrítico tem um maior coeficiente de difusão,

menor viscosidade e tensão de superfície do que um solvente líquido, levando a uma

maior penetração na matriz da amostra, e favorecendo, consequentemente, a transferência

de massa; o tempo de extração é significativamente menor, em comparação com os

métodos convencionais; o refluxo constante do fluido supercrítico na amostra permite

uma extração completa; a seletividade do fluido supercrítico é maior que o solvente

líquido e o seu poder de solvatação pode ser regulado pela alteração da temperatura e/ou

pressão; a separação do soluto a partir do solvente no processo de extração convencional

pode ser contornado pela despressurização do fluido supercrítico.

Por ser realizada à temperatura ambiente, a SFE é um método ideal para a extração

de compostos termolábeis, e na qual é extraída uma pequena quantidade de amostra e de

solvente, pelo que o tempo de extração é reduzido, sendo considerada uma técnica verde.

Por último é possível reutilizar o fluido supercrítico após a extração (Lang & Wai, 2001).

21

4.2.4. Extração por campo elétrico pulsado (PEF)

O tratamento com campo elétrico pulsado (PEF) tem vindo a ser reconhecido nos

processos de secagem, extração e difusão durante as últimas décadas (Angersbach et al.,

2000). Esta técnica consiste, sobretudo, em destruir a estrutura da membrana celular, de

forma a aumentar a extração, através da aplicação de um potencial elétrico na célula,

durante a suspensão da célula num campo elétrico. Assim, há separação das moléculas,

tendo por base a natureza dos dipolos das moléculas da membrana, de acordo com as suas

cargas na membrana celular (Heinz et al., 2003). Após exceder 1 V do potencial

transmembranar, ocorre repulsão entre as moléculas com carga, formando poros nas

zonas mais fracas da membrana e, por conseguinte, aumentando significativamente a sua

permeabilidade (Bryant & Wolfe, 1987).

A eficácia deste método depende estritamente de parâmetros como a força do

campo, a energia específica aplicada, o número de pulsos, a temperatura e as propriedades

da amostra (Heinz et al., 2003).

O método de PEF pode aumentar a transferência de massa durante a extração, pela

destruição da estrutura da membrana dos materiais da planta, com o intuito de aumentar

o rendimento de extração e reduzir o tempo de extração. Além disso, um tratamento PEF

a um campo elétrico moderado (500 e 1000 V/cm, durante 10-4 a 10-2 s) já demonstrou

provocar danos na membrana celular do tecido vegetal com um aumento de temperatura

mínimo. Assim, a extração por campo elétrico pulsado consegue minimizar a degradação

dos compostos sensíveis a elevadas temperaturas (Ade-Omowaye et al., 2001).

4.2.5. Extração por líquido pressurizado (PLE)

A extração por líquido pressurizado, também conhecida por extração por fluido

pressurizado (“Pressurized Fluid Extraction” – PFE), extração por fluido acelerado

(“Accelerated Fluid Extraction” – ASE), extração aumentada por solvente (“Enhanced

Solvent Extraction” – ESE) e extração por solvente de alta pressão (“High Pressure

Solvent Extraction” – HPSE), baseia-se na aplicação de alta pressão no solvente líquido

remanescente, para além do seu ponto de ebulição, com o intuito de facilitar o processo

de extração (Nieto et al., 2007). A elevada temperatura de extração pode promover maior

solubilidade do analito, uma vez que diminui a viscosidade e a tensão de superfície dos

solventes, obtendo-se uma maior taxa de extração (Hayes, 2015). Em comparação com a

22

extração por Soxhlet tradicional, PLE demonstrou reduzir drasticamente o consumo de

tempo e a quantidade de solvente (Richter et al., 1996).

Atualmente, este método não convencional é considerado como uma potencial

alternativa à técnica de extração por fluidos supercríticos, aquando a extração de

compostos polares (Christen & Kaufmann, 2002). Além disso, esta técnica também tem

sido utilizada na extração de poluentes orgânicos a partir de matrizes ambientais, estáveis

a elevadas temperaturas (L. Wang & Weller, 2006), e na extração de compostos bioativos

a partir de esponjas marinhas (Hayes, 2015). Ademais, devido às pequenas quantidades

de solvente orgânico utilizadas, PLE é reconhecido como uma técnica de extração verde

(Hayes, 2015).

4.2.6. Extração assistida por enzimas (EAE)

Alguns fitoquímicos nas matrizes das plantas encontram-se dispersos no

citoplasma da célula, podendo até encontrarem-se retidos numa rede de polissacarídeos-

lignina, via ligações hidrofóbicas, pelo que os processos de extração convencionais não

são eficazes na extração destes compostos. Deste modo, o pré-tratamento enzimático tem

sido considerado útil na libertação destes compostos a partir das matrizes vegetais,

aumentando o rendimento da extração (Rosenthal et al., 1996). A adição de enzimas

específicas como celulase, α-amílase e pectinase durante a extração demonstrou aumentar

a recuperação (extrato), uma vez que quebra a parede celular e hidrolisa as estruturas dos

polissacarídeos e lípidos (Rosenthal et al., 1996; Sharma et al., 2002).

Por conseguinte, a extração assistida por enzimas tornou-se uma metodologia

ecológica relevante na extração de compostos a partir de material vegetal, por utilizar

quantidades de solventes inferiores e consumir menos energia que os métodos não-

enzimáticos (Puri et al., 2012).

23

5. Métodos de identificação e quantificação de compostos em extratos de folhas de oliveira

A identificação e quantificação dos compostos presentes no extrato de folhas pode

ser realizada, por exemplo, recorrendo a duas técnicas de cromatografia, gasosa e líquida,

acopladas à espetrometria de massa, GC-MS e LC-MS, respetivamente (Pessoa, 1993).

A cromatografia é uma técnica quantitativa usada na separação e purificação de

misturas, tendo por base a solubilidade, tamanho e massa dos componentes. Estes são

distribuídos por duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária, sendo separados

de acordo com a sua retenção no sistema. A cromatografia gasosa é utilizada para separar

os analitos voláteis presentes em solução, enquanto que a cromatografia líquida é usada

para separar os analitos polares, pouco voláteis e termolábeis. Deste modo, a análise dos

extratos de hexano pode ser feita por GC-MS e a análise dos extratos de etanol pode ser

feita recorrendo a LC-MS (Primer, 2001).

Também podem ser realizadas, previamente, reações de sililação com o intuito de

aumentar a volatilidade de alguns compostos e, consequentemente, obter melhores

resultados (Gómez-González et al., 2010).

Assim, a cromatografia separa os componentes presentes em solução com base

nos seus tempos de retenção que são, posteriormente, detetados e identificados através da

espetrometria de massa, permitindo obter o espetro de cada componente. No espetrómetro

de massa, os analitos são ionizados e separados por interação com compostos elétricos,

com base na razão massa/carga (m/z), são detetados e é feito o registo de iões para cada

m/z. No fim do processo, obtém-se um espetro cujos picos relacionam a abundância com

m/z de cada componente da amostra, pelo que é possível quantificar cada composto a

partir da área de cada pico do cromatograma (Pessoa, 1993; Primer, 2001).

Para além destes métodos, são também recorrentes a cromatografia líquida de

elevada eficiência (HPLC) (S. Silva et al., 2006), HPLC acoplada a espectrometria de

massa com ionização por electrospray e TOF (ESI-TOF-MS) (Taamalli, Arráez-Román,

Barrajón-Catalán, et al., 2012) e HPLC com detetor de foto - díodos (HPLC-DAD)

(Pereira et al., 2007), na quantificação de compostos fenólicos presentes nos extratos de

folhas de oliveira. Relativamente ao perfil lipofílico dos extratos de folhas de oliveira, a

cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa (GC-MS) é o método mais

utilizado. Contudo, existem trabalhos que descrevem a análise de ácidos gordos e

24

terpenóides das folhas de oliveira recorrendo à cromatografia gasosa com detetor por

ionização de chama (GC-FID) (Guinda et al., 2010).

25

OBJETIVOS

A oliveira é uma das principais culturas na região mediterrânica, com elevado

valor económico, sendo valorizada principalmente pelo azeite extraído do seu fruto.

Contudo, para além do azeite e da azeitona, as folhas também são ricas em compostos

bioativos, com diversas aplicabilidades nas indústrias medicinal, farmacêutica e

alimentar.

Neste contexto, tendo em conta a elevada disponibilidade e baixo custo deste

desperdício agroindustrial, os objetivos deste trabalho consistem em:

• Otimizar a extração de metabolitos (compostos fenólicos e lipofílicos) a

partir das folhas de oliveira utilizando métodos não convencionais de

extração, como por exemplo os ultrassons e as micro-ondas, e vários tipos

de solventes de extração;

• Avaliar e comparar o tipo e quantidade de metabolitos extraidos pelos

métodos convencionais (ex. Soxhlet) e pelas técnicas emergentes

(métodos não convencionais: UAE e MAE), e os perfis de metabolitos

obtidos através da análise por várias técnicas de cromatografia (GC-MS e

UHPLC-DAD ESI/MSn).

27

MATERIAL E MÉTODOS

1. Amostras de folhas de oliveira

Foram colhidas folhas de oliveiras (Olea europaea L.) de árvores adultas, no

campus da Universidade de Aveiro. As folhas foram pesadas (aproximadamente, 1,5 g

para cada réplica), lavadas com água destilada (3 vezes) e organizadas em quatro grupos:

folhas frescas inteiras (FI), frescas maceradas (FM), secas inteiras (SI) e secas maceradas

(SM). As folhas usadas no grupo SI e SM (folha seca) tiveram de passar pelo processo de

secagem numa estufa durante sete dias a 40 ºC, e as folhas dos grupos FM e SM (folhas

maceradas) foram trituradas num moinho de café.

Foram preparadas 3 réplicas para cada amostra (grupo).

2. Extração de metabolitos das folhas de oliveira

As extrações dos metabolitos presentes nas folhas de oliveira foram realizadas

com solventes como n-hexano e etanol. Numa primeira fase, foram adicionados 25 mL

de n-hexano, às amostras previamente pesadas, para serem submetidas a processos de

extração não convencionais, nomeadamente extração assistida por micro-ondas (MAE)

usando o equipamento Discover® SP CEM, e extração assistida por ultrassons (UAE)

usando um aparelho de ultrassons bandelin Sanorex Digitec (Berlin, Germany). Ambos

os processos de extração para todas as amostras dos quatro grupos (FI, FM, SI e SM)

tiveram a duração de 30 min e os aparelhos foram ajustados para uma temperatura de 30

ºC. Após cada extração, o extrato foi filtrado, o solvente evaporado num evaporador

rotativo e, depois de se encontrar completamente seco, o resíduo total obtido foi pesado.

Numa segunda fase, foi realizado o mesmo processo utilizando etanol como solvente. Os

extratos obtidos foram, posteriormente, preparados e injetos no equipamento de

cromatografia gasosa e líquida.

28

3. Análise de metabolitos presentes nos extratos de folhas de oliveira

3.1. Análise por GC-MS

Os metabolitos presentes nos extratos de n-hexano foram identificados por análise

GC-MS. Primeiramente, os extratos foram dissolvidos em diclorometano, obtendo-se

soluções de concentração conhecida (aproximadamente 5 mg/mL). Foram realizadas

reações de sililação, nas quais foram utilizados tubos de sililação, com um volume de

solução correspondente a 15 mg de extrato, 50 µL de padrão interno (tetracosano 1,2

mmol/L), 250 µL de piridina, 250 µL de N,O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida

(BSTFA) e 50 µL de trimetilsilil cloro (TMSCl). A reação decorreu durante uma hora a

70 ºC.

A análise cromatográfica dos extratos sililados foi realizada usando o

equipamento GC-MS QP2010 Ultra Shimadzu equipado com uma coluna capilar DB-5-

J&W (30 m x 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25μm de espessura do filme). A fase

móvel utilizada foi hélio, com um fluxo de 1,13 mL/min e a amostra foi injetada no modo

split numa razão de 1:50. A temperatura inicial da coluna foi mantida a 70 ºC por 5 min,

depois foi aumentada, primeiro 4 ºC/min até aos 250 ºC, e posteriormente 2 ºC/min até

aos 300 ºC, onde se manteve por 5 min. A temperatura do injetor foi de 320 ºC e a da

linha de transferência foi de 200 ºC. A ionização foi realizada por impacto eletrónico,

com 70 eV de energia. A recolha dos dados foi feita numa taxa de 1 scan/s numa gr de

m/z 50 – 1000. A análise de GC-MS decorreu durante 87 min.

A identificação dos compostos presentes nos extratos de n-hexano foi feita através

da comparação direta com uma base de dados de espectroscopia de massa (NIST14 Mass

spectral e WILEY RegistryTM of Mass Spectra Data).

Os compostos lipofílicos identificados foram quantificados utilizando retas de

calibração obtidas para compostos padrão. Quando o composto padrão não estava

disponível, a quantificação do composto fenólico foi efetuada com um padrão com uma

estrutura semelhante. Assim, foram utilizadas retas de calibração de soluções padrão,

previamente preparadas, representativas de cada família de compostos presentes nas

amostras: ácido palmítico (100 mg/mL) para os ácidos gordos; octadecanol (2 mg/mL)

para álcoois; colesterol (2 mg/mL) para terpenóides e esteróis; octadecano (2,4 mg/mL)

para alcanos e maltose para açúcares e polióis. A maltose foi pesada diretamente para os

tudos de sililação nas várias concentrações representadas na curva de calibração. Os

29

padrões sililados foram injetados no GC-MS sob as mesmas condições que os extratos e

foram construídas curvas de calibração com um coeficiente de correlação (R2) superior a

0,98, para cada padrão. As referidas retas de calibração encontram-se no anexo 1.

3.2. Análise por UHPLC-DAD ESI/MSn

Os metabolitos presentes nos extratos de etanol foram analisados através de

UHPLC-DAD ESI/MSn (Cromatogradia Líquida de Alta Eficiência com detetor de foto-

díodos acoplada a espetrometria de massa com ionização por electrospay).

Primeiramente, os extratos secos foram dissolvidos em metanol, obtendo-se soluções de

concentração conhecida (15 mg/mL). As amostras foram filtradas através de uma

membrana de 0,2 mm de Nylon (Whatman). Para cada amostra foram realizadas três

réplicas.

A análise cromatográfica dos extratos foi realizada usando um Thermo Scientific

Ultimate 3000RSLC (Dionex) equipado com um detetor de matriz de diodo

DionexUltiMate 3000 RS acoplado a um espectrómetro de massa. A coluna utilizada foi

a “thermo scientific hypersil gold” (1000 mm x 20 mm) com 1,9 μm, tendo-se mantido a

sua temperatura a 30 ºC. A fase móvel utilizada foi acetonitrilo (solvente A) e ácido

fórmico 0,1% (v/v) (solvente B) previamente desgaseificados e filtrados, com um fluxo

de 0,2 mL/min. O gradiente de solvente foi iniciado com 5% de solvente B por 14 min,

de seguida, 40% de solvente B durante 2 min, posteriormente, 100% por mais de 7 min

e, por fim, 5% por mais de 10 min. Foi injetado 1 μL de amostra. Obtiveram-se dados

espetrais UV-vis na gama de 250 a 500 nm e os perfis cromatográficos foram registados

a 280 nm. Foi utilizado um espectrómetro de massa LTQ XL “linear ion trap 2D” com

uma fonte de ionização de eletrospray ortogonal (ESI) de temperatura capilar de 275 ºC.

A ionização foi realizada por uma fonte de eletrospray de 5,00 kV, tendo sido utilizado

no modo de ião negativo. A recolha dos dados foi feita numa gama de m/z 50,00 –

2000,00. Foram também obtidos, em simultâneo, dissociações de iões precursores

induzidas por colisão MS/MS e MSn.

Os compostos fenólicos analisados e identificados a 280 ou 240 nm foram

quantificados utilizando retas de calibração obtidas para compostos padrão. Quando o

composto padrão não estava disponível, a quantificação do composto fenólico foi

efetuada com um padrão com uma estrutura semelhante. Assim, foram utilizadas retas de

calibração de soluções padrão, previamente preparadas, representativas de cada família

30

de compostos presentes nas amostras, nomeadamente ácido cafeico (20 mg/ml) para os

derivados do ácido cinâmico, oleuropeína (5 mg/ml) para os secoiridoides, quercetina (20

mg/ml) para quercetina-O-hexósido, rutina (20 mg/ml) para a rutina e luteolina (5 mg/ml)

para os isómeros de glucósido e rutinósido de luteolina, luteolina, apigenina, apigenina-

7-glucósido e 7-O-(glucopiranosil-D)-crisoerio. Os padrões foram injetados no UHPLC-

DAD ESI/MSn sob as mesmas condições que os extratos e foram construídas curvas de

calibração com um coeficiente de correlação (R2) superior a 0,98, para cada padrão. As

referidas retas encontram-se no anexo 2.

4. Análise de dados

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão e são o resultado da

leitura de três replicas.

31

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Perfil lipofílico dos extratos de folhas de oliveira

1.1.Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira após MAE

Na Figura 17 encontra-se representado um exemplo de um dos cromatogramas

obtidos por GC-MS, do perfil lipofílico dos extratos de folhas de oliveira, após extração

assistida por micro-ondas (MAE), nomeadamente o cromatograma obtido para o extrato

da folha seca macerada (SM), encontrando-se na Tabela 1 a identificação e composição

lipofílica do extrato correspondente a cada amostra – folha fresca inteira (FI), fresca

macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM).

3 8 7 9 10 11

Figura 17. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por GC-MS dos extratos de hexano, após extração assistida por micro-ondas. Os

picos identificados com números correspondem aos compostos identificados na tabela 1.

12

2

1 4 5

6

13

20

21

19

17 18 16 15

14

32

Tabela 1. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira (mg/g PF ou PS) de cada grupo – folha

fresca inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI), e seca macerada (SM), após extração assistida

por micro-ondas (MAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3).

Pico TR

(min) Composto FI FM SI SM

Hidrocarbonetos

12 67,45 Nanocosano ND 0,616 ± 0,011 0,429 ± 0,005 0,787 ± 0,024

- - Triacontano ND ND ND 0,112 ± 0,013

9 64,83 Dotriacontano ND ND ND 0,185 ± 0,003

2 57,34 Tetratriacontano ND 0,370 ± 0,002 0,334 ± 0,001 0,378 ± 0,002

6 62,29 Hexatriacontano 0,764 ± 0,030 0,668 ± 0,006 0,552 ± 0,003 0,728 ± 0,006

3 59,76 Tetracontano 0,446 ± 0,001 0,181 ± 0,001 0,118 ± 0,002 0,152 ± 0,004

16 69,35 Tetrapentacontano 0,665 ± 0,017 ND ND 0,103 ± 0,003

Total 1,875 1,835 1,433 2,445

Ácidos gordos

- - Ácido palmítico 0,248 ± 0,008 ND 0,281 ± 0,008 ND

7 63,08 Ácido octacosanóico ND ND ND 0,332 ± 0,002

10 65,68 Ácido nonacosanóico ND ND ND 0,329 ± 0,001

17 71,24 Ácido hentriacontanóico ND ND ND 0,340 ± 0,003

Total 0,248 0,000 0,281 1,001

Terpenóides

13 67,74 β-Amirina 0,235 ± 0,004 0,300 ± 0,007 0,237 ± 0,003 0,256 ± 0,005

14 68,77 α-Amirina 0,151 ± 0,003 0,180 ± 0,006 0,142 ± 0,02 0,196 ± 0,001

19 71,58 Olean-12-en-3-ol 0,152 ± 0,002 0,176 ± 0,001 ND 1,346 ± 0,026

18 71,24 Lup-20(29)-en-3-ol 0,155 ± 0,003 0,149 ± 0,016 0,145 ± 0,007 0,116 ± 0,006

15 68,9655 Lupeol ND 0,097 ± 0,005 ND 0,079 ± 0,000

- - Olean-12-ene-3,28-diol 1,041 ± 0,011 1,153 ± 0,014 0,890 ± 0,014 ND

20 72,541 Derivado de

lup-20(29)-en-28-al 0,598 ± 0,008 0,478 ± 0,040 0,753 ± 0,018 0,819 ± 0,016

21 73,084 Ácido ursólico 0,520 ± 0,019 0,295 ± 0,016 2,475 ± 0,060 0,233 ± 0,014

- - Derivado de ácido

ursólico ND ND 0,151 ± 0,026 ND

- -

Aldeído ursólico ND 0,124 ± 0,007 0,112 ± 0,018 ND

Total 2,852 2,952 4,905 3,045

33

Pico TR

(min) Composto FI FM SI SM

Esteróis

4 60,68 Cholesta-4,6-dien-3-ol ND ND ND 0,062 ± 0,001

11 66,97 Estigmast-5-en-3-ol ND ND ND 0,072 ± 0,005

5 61,21 β-Sitosterol ND ND ND 0,078 ± 0,002

Total 0,000 0,000 0,000 0,212

Álcoois

1 54,56 Glicerol ND 0,093 ± 0,000 ND 0,060 ± 0,001

8 63,32 Octacosan-1-ol ND ND ND 0,060 ± 0,001

Total 0,000 0,093 0,000 0,120

ND – Não detetado

No total, a extração assistida por micro-ondas permitiu a identificação e

quantificação de 26 compostos distintos divididos em cinco famílias: alcanos (7), ácidos

gordos (4), terpenóides (10), esteróis (3) e álcoois (2).

A família predominante é a dos terpenóides, como β - amirina, α - amirina, olean-

12-en-3-ol, lup-20(29)-en-3-ol, lupeol, olean-12-ene-3,28-diol, derivado de lup-20(29)-

en-28-al, ácido ursólico, derivado de ácido ursólico e aldeído ursólico, principalmente

nos extratos de folha seca inteira (4,905 mg/g PS) e seca macerada (3,045 mg/g PS), e em

menores quantidades nos extratos de folha fresca inteira (2,852 mg/g PF) e fresca

macerada (2,952 mg/g PF).

De seguida, também foi possível detetar, em quantidades significativas, a família

dos alcanos, tais como nanocosano, triacontano, dotriacontano, tetratriacontano,

hexatriacontano, tetracontano e tetrapentacontano, essencialmente no extrato de folha

seca macerada (2,445 mg/g PS), no extrato de folha fresca inteira (1,875 mg/g PF) e no

extrato de folha fresca macerada (1,835 mg/g PF) e, em menores quantidades, no extrato

de folha seca inteira (1,433 mg/g PS).

Relativamente à família dos ácidos gordos, foram identificados os ácidos

octacosanóico, nonacosanóico e hentriacontanóico no extrato de folha seca macerada

(1,001 mg/g PS), e o ácido palmítico nos extratos de folha seca inteira (0,281 mg/g PS) e

de folha fresca inteira (0,248 mg/g PF). Além disso, não foi detetada a presença destes

compostos no extrato de folha fresca macerada.

34

Só foi possível detetar a presença de esteróis, tais como cholesta-4,6-dien-3-ol,

estigmast-5-en-3-ol e β-sitosterol no extrato de folha seca macerada (0,212 mg/g PS).

Por último, foram identificados álcoois em apenas dois dos extratos de folha de

oliveira, o glicerol e o octacosan-1-ol, nomeadamente no extrato de folha seca macerada

(0,120 mg/g PS) e, em menor abundância, no extrato de folha fresca macerada (0,093

mg/g PF), tendo sido o glicerol o único composto identificado.

35

1.2.Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira após UAE


obtidos por GC-MS, do perfil lipofílico dos extratos de folhas de oliveira, após extração

assistida por ultrassons (UAE), nomeadamente o cromatograma obtido para o extrato da

folha seca macerada (SM), encontrando-se na Tabela 2 a identificação e composição

lipofílica do extrato correspondente a cada grupo – folha fresca inteira (FI), fresca

macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM).

4

6

16 18

11 2

3 5 7

8

9 12 10 11 13

14 15

17

19

Figure 18. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por GC-MS dos extratos de hexano, após extração assistida por ultrassons. Os

picos identificados com números correspondem aos compostos identificados na tabela 2.

36

Tabela 2. Composição lipofílica dos extratos de folhas de oliveira (mg/g PF ou PS) de cada grupo – folha

fresca inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI), e seca macerada (SM), após extração assistida

por ultrassons (UAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3).

Pico TR (min) Composto FI FM SI SM

Hidrocarbonetos

8 67,45 Nanocosano ND 0,838 ± 0,020 0,066 ± 0,007 1,037 ± 0,202

6 64,83 Dotriacontano 0,592 ± 0,031 0,195 ± 0,013 0,133 ± 0,018 0,227 ± 0,028

2 59,75 Tetratriacontano ND 0,478 ± 0,081 0,094 ± 0,009 0,171 ± 0,007

4 62,29 Hexatriacontano 0,512 ± 0,188 0,840 ± 0,117 0,699 ± 0,021 0,830 ± 0,158

1 57,35 Tetracontano 0,225 ± 0,146 0,153 ± 0,020 0,356 ± 0,005 0,436 ± 0,069

- - Tetrapentacontano ND ND 0,680 ± 0,121 ND

Total 1,329 2,504 2,028 2,701

Ácidos gordos

- - Ácido palmítico ND ND 0,262 ± 0,003 ND

- - Ácido α-linolénico ND ND 0,221 ± 0,002 ND

- - Ácido octacosanóico ND 0,484 ± 0,010 0.218 ± 0,004 ND

- - Ácido nonacosanóico ND ND 0,240 ± 0,009 0,491 ± 0,012

13 69,55 Ácido hentriacontanóico ND ND 0,257 ± 0,017 0,546 ± 0,017

- - Ácido dodecanóico ND ND 0,231 ± 0,009 ND

15 70,92 Ácido hexacosanóico ND ND 0,249 ± 0,008 4,393 ± 0,846

Total 0,000 0,484 1,678 5,430

Terpenóides

9 67,74 β-Amirina 0,338 ± 0,022 0,360 ± 0,047 0,254 ± 0,055 0,346 ± 0,045

11 68,46 α-Amirina 0,207 ± 0,038 0,227 ± 0,053 ND 0,271 ± 0,035

16 71,64 Olean-12-en-3-ol 0,135 ± 0,024 0,180 ± 0,023 ND 1,957 ± 0,528

14 70,01 Lup-20(29)-en-3-ol ND 0,199 ± 0,035 0,116 ± 0,022 0,182 ± 0,014

12 68,78 Lupeol 0,139 ± 0,019 0,096 ± 0,011 ND 0,110 ± 0,006

- - Olean-12-ene-3,28-diol 1,633 ± 0,470 2,205 ± 0,382 1,940 ± 0,040 ND

- - Lup-20(29)-en-28-al 0,995 ± 0,267 1,386 ± 0,423 1,288 ± 0,038 ND

18 73,24 Ácido ursólico 1,140 ± 0,392 1,508 ± 0,364 1,667 ± 0,102 0,124 ± 0,025

17 72,62 Derivado de ácido

ursólico ND ND ND 2,430 ± 0,529

- - Aldeído ursólico 0,156 ± 0,024 0,210 ± 0,054 0,075 ± 0,010 ND

37

Pico TR (min) Composto FI FM SI SM

- - Derivado de aldeído

ursólico ND ND 0,053 ± 0,008 ND

Total 4,743 7,433 5,393 5,420

Esteróis

3 61,22 β-Sitosterol ND ND ND 0,094 ± 0,001

Total 0,000 0,000 0,000 0,094

Álcoois

- - Glicerol ND 0,100 ± 0,009 ND 0,119 ± 0,022

5 63,32 Octacosan-1-ol ND 0,088 ± 0,007 0,054 ± 0,008 0,084 ± 0,008

10 68,31 Triacontan-1-ol ND ND 0,062 ± 0,006 0,102 ± 0,005

7 65,89 Hexatriacontan-1-ol ND ND 0,035 ± 0,003 0,079 ± 0,007

19 73,38 Heptatriacontan-1-ol ND ND ND 0,118 ± 0,025

Total 0,000 0,188 0,151 0,502

Açúcares e Polióis

- - D-Sorbitol 0,395 ± 0,099 0,403 ± 0,150 ND ND

- - Mio-Inositol 0,051 ± 0,008 0,054 ± 0,005 ND ND

- - D-Manopiranose 0,187 ± 0,052 0,296 ± 0,068 ND ND

- - D-Glucopiranose 0,321 ± 0,115 0,402 ± 0,085 ND ND

- - D-Fructofuranose ND 0,100 ± 0,026 ND ND

- - D-Psicofuranose ND 0,050 ± 0,013 ND ND

- - D-Lactose ND 0,064 ± 0,005 ND ND

Total 0,954 1,369 0,000 0,000

ND – Não detetado

No total, foram identificados e quantificados 37 compostos distintos, após a

extração assistida por ultrassons, divididos em seis famílias: alcanos (5), ácidos gordos

(7), terpenóides (11), esteróis (1), álcoois (5) e açúcares e polióis (7).

A família em maior predominância foi igualmente a família dos terpenóides,

tendo-se identificado compostos como β-amirina, α-amirina, olean-12-en-3-ol, lup-

20(29)-en-3-ol, lupeol, olean-12-ene-3,28-diol, lup-20(29)-en-28-al, ácido ursólico,

aldeído ursólicos e seus derivados, essencialmente no extrato de folha fresca macerada

38

(7,433 mg/g PF), e em menor quantidade nos extratos de folha seca inteira (5,393 mg/g

PS), seca macerada (5,420 mg/g PS) e fresca inteira (4,743 mg/g PF).

Também foi possível detetar a presença de alcanos tais como nanocosano,

dotriacontano, tetratriacontano, hexatriacontano, tetracontano e tetrapentacontano nos

extratos de folha de oliveira, em maior quantidade nos extratos de folha seca macerada

(2,701 mg/g PS), fresca macerada (2,504 mg/g PF) e seca inteira (2,028 mg/g PS), e em

menor quantidade no extrato de folha fresca inteira (1,329 mg/g PF).

Para além destes compostos, verificou-se um elevado teor de ácidos gordos, como

por exemplo o ácido palmítico, ácido α-linolénico e ácidos octacosanóico,

nonacosanóico, hentriacontanóico, docecanóico e hexacosanóico, essencialmente no

extrato de folha seca macerada (5,430 mg/g PS), tendo sido o ácido hexacosanóico o

composto predominante neste extrato (4,393 mg/g PS). Apesar de não se ter detetado a

presença de ácidos gordos no extrato de folha fresca inteira, foi possível verificar a

presença destes compostos no extrato de folha seca inteira (1,678 mg/g PS) e, em menor

abundância, no extrato de folha fresca macerada (0,484 mg/g PF).

Relativamente à família dos esteróis, só foi possível detetar e quantificar a

presença do composto β-sitosterol no extrato de folha seca macerada (0,094 mg/g PS).

Foram ainda identificados álcoois como o glicerol, octacosan-1-ol, triacontan-1-

ol, hexatriacontan-1-ol e heptatriacontan-1-ol, especialmente no extrato de folha seca

macerada (0,502 mg/g PS), e nos extratos de folha fresca macerada (0,188 mg/g PF) e de

folha seca inteira (0,151 mg/g PS).

Por fim, esta técnica de extração não convencional permitiu a extração de açúcares

e polióis como D-Sorbitol, Mio-inositol, D-Manopiranose, D-Glucopiranose, D-

Fructofuranose, D-Psicofuranose e D-Lactose, a partir dos dois extratos de folha fresca de

oliveira, macerada (1,369 mg/g PF) e inteira (0,954 mg/ PF).

39

1.3. Comparação do perfil lipofílico dos extratos obtidos por MAE e UAE

Foi possível obter um perfil lipofílico distinto em ambos os métodos não

convencionais estudados. Pelo que na técnica UAE, foram identificados e quantificados

37 compostos lipofílicos que pertenciam a seis famílias (alcanos, ácidos gordos,

terpenóides, esteróis, álcoois e açúcares e polióis), enquanto que na MAE foram

identificados e quantificados apenas 26 compostos que pertenciam a cinco famílias

(alcanos, ácidos gordos, terpenóides, esteróis e álcoois). De salientar que só foi possível

extrair açúcares e polióis a partir da técnica UAE. Também o número de ácidos gordos,

terpenóides e álcoois extraídos e identificados foi superior por UAE. Contudo, a técnica

de MAE permitiu identificar um maior número de alcanos (7) e esteróis (3). Deste modo,

a técnica MAE não demonstra ser muito apropriada, principalmente, para a extração de

açúcares e polióis em folhas de oliveiras.

Seria de esperar que a energia gerada pelas micro-ondas, na técnica MAE,

facilitasse a extração de mais metabolitos (Kaufmann et al., 2001), contudo tal não se

observou neste trabalho. Isto pode estar relacionado com a natureza da matriz e/ou do

solvente utilizado, neste caso o hexano, um solvente apolar, uma vez que este método

depende fortemente da suscetibilidade dielétrica do solvente. Assim, podem ser obtidos

melhores resultados se se utilizar solventes polares como o etanol, metanol ou a água

devido às suas elevadas constantes dielétricas (Brachet et al., 2002).

Os trabalhos publicados sobre este método de extração estão mais direcionados

para a extração de compostos como óleos essenciais a partir de matrizes vegetais como

por exemplo azeitonas (García-Ayuso & Luque de Castro, 2001; García-Ayuso & Luque

De Castro, 1999), folhas de hortelã (Sigouin & Lapointe, 1991) e a partir de sementes de

Cuminum cyminum e Zanthoxylum bungeanum (Wang et al., 2006).

Já a extração assistida por ultrassons demonstrou ser eficaz na extração de óleos

essenciais e lípidos, em trabalhos anteriormente publicados, nomeadamente na extração

de terpenóides a partir de sementes de Carum carvi (Chemat et al., 2004), de álcoois a

partir de farelo (resíduo da fabricação da farinha de gramíneas) (Cravotto et al., 2004), e

de óleos essenciais a partir de sementes oleaginosas (Luque-García & Luque De Castro,

2004).

40

1.3.1. Comparação do perfil lipofílico dos extratos FI vs SI e FM vs SM

extraídos por MAE e UAE

Nas Figuras 19 e 20 encontra-se graficamente representado o total de alcanos,

ácidos gordos, terpenóides, esteróis, álcoois, açúcares e polióis, presentes nos extratos de

folhas de oliveira inteira e macerada, respetivamente, extraídos por ambos os métodos

não convencionais, MAE e UAE.

Assim, quando se compara o perfil de metabolitos de FI vs SI extraídos por MAE

e UAE (Figura 19), verifica-se que a secagem da folha (SI) e a utilização do método UAE

permitiu extrair e identificar em maior quantidade alcanos, ácidos gordos e terpenóides.

Contudo, também foi possível verificar quantidades significativas de terpenóides no

extrato da folha SI pela extração assistida por micro-ondas. De salientar ainda que só

foram detetados álcoois nos extratos de folha seca inteira (SI), e açúcares e polióis no

extrato de folha fresca inteira (FI), ambos extraídos por UAE. Por último, através da

análise da Figura 19, é possível ainda verificar que não foram extraídos esteróis nas folhas

inteiras, a partir de ambos os métodos MAE e UAE.

Relativamente ao perfil de metabolitos das folhas de oliveira maceradas extraídos

por MAE e UAE (Figura 20), verifica-se que a utilização da folha seca (SM) e da técnica

UAE permitiram extrair em maior quantidade alcanos, ácidos gordos e álcoois. No

entanto, foi no extrato da folha SM, pela técnica MAE, que se verificou o maior teor de

esteróis. Além disso, foi possível obter o maior teor de terpenóides no extrato da folha

fresca macerada (FM) por UAE, tendo-se detetado ainda açúcares e polióis apenas neste

extrato de folha de oliveira, com a utilização do mesmo método.

De um modo geral, estes resultados indicam que o facto de se usar folhas de

oliveira frescas ou secas e inteiras ou maceradas, influencia a extração tanto em número

como em quantidade de metabolitos lipofílicos, tendo-se obtido melhores resultados para

a folha de oliveira seca macerada (SM) pela extração assistida por ultrassons (UAE). Em

suma, estes resultados estão de acordo com o expectável, uma vez que ambos os processos

de secagem e de maceração provocam a quebra das paredes e membranas celulares da

matriz vegetal, aumentando a área de superfície em contacto com o solvente, permitindo,

por conseguinte, uma extração mais eficiciente dos compostos presentes na mesma

(Saifullah et al., 2019).

41

Figura 19. Comparação do perfil lipofílico dos extratos das folhas de oliveira inteiras, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/g PF ou PS).

42

Figura 20. Comparação do perfil lipofílico dos extratos das folhas de oliveira maceradas, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/g PF ou PS).

43

1.3.2. Comparação do perfil lipofílico dos extratos obtidos pelos métodos

não convencionais (MAE e UAE) vs métodos convencionais

De acordo com a literatura disponível relativamente à extração de compostos para

a obtenção do perfil lipofílico de folhas de oliveiras, os métodos convencionais, tais como

extração sólido-líquido em hexano com agitação à temperatura ambiente, são os mais

usados [Dias et al. 2018, Dias et al. 2019, Figueiredo 2017]. Nestes trabalhos foram

usadas sempre folhas de oliveira secas e maceradas. Deste modo, será comparado o perfil

lipofílico dos extratos de oliveira seca macerada (SM) obtido no presente trabalho, a partir

dos métodos não convencionais (MAE e UAE), com os métodos convencionais já

estudados.

Assim, as técnicas não convencionais utilizadas neste trabalho, MAE e UAE,

demonstraram ser eficazes na extração de metabolitos lipofílicos a partir de folhas de

oliveira, tendo-se identificado e quantificado um total de 22 compostos nos extratos de

folha seca macerada (SM) através de ambos os métodos.

Relativamente à família dos terpenóides, as técnicas MAE e UAE conseguiram

extrair 7 compostos da folha SM, nomeadamente α-amirina (0,196 e 0,271 mg/g PS,

repetivamente), β-amirina (0,256 e 0,346 mg/g PS, repetivamente), olean-12-en-3-ol

(1,346 e 1,957 mg/g PS, respetivamente), lup-20(29)-en-3-ol (0,116 e 0,182 mg/g PS,

respetivamente), lupeol (0,079 e 0,110 mg/g PS, respetivamente), ácido ursólico (0,233 e

2,430 mg/g PS, respetivamente) e, no caso da extração assistida por micro-ondas o

derivado de lup-20(29)-en-28-al (0,819 mg/g PS) e na extração assistida por ultrassons,

o derivado de ácido ursólico (0,124 mg/g PS). Já em outros trabalhos desenvolvidos por

Dias et al. (2018) e Figueiredo (2017) foram identificados a α-amirina (0,102 - 0,200

mg/g PS), a β-amirina (0,094-0,250 mg/g PS), o lupeol (0,144 – 0,266 mg/g PS), lup-

20(29)-en-3-al (0,171 - 0,271 mg/g PS) e o ácido ursólico (0,054 – 0,087 mg/g PS) em

folhas de oliveira secas e maceradas, a partir de métodos convencionais (extração sólido-

líquido em hexano com agitação). Por conseguinte, estes valores obtidos por estes autores

para os compostos descritos são inferiores aos resultados obtidos no presente trabalho

pelos métodos de extração não convencionais, UAE e MAE.

Ambos os métodos, MAE e UAE, também permitiram a extração de alcanos de

cadeia longa com um teor variável entre 0,103 e 0,787 mg/g PS (MAE - SM), e 0,171 e

1,037 mg/g PS (UAE - SM). Estes compostos também foram identificados por outros

autores em folhas de oliveira e o seu conteúdo variou entre 0,3 – 0,75 mg/g PS (Dias et

44

al., 2018) e entre 1,7 – 2,6 mg/g PS (Figueiredo 2017), a partir de técnicas de extração

convencionais (folha macerada seca e extração sólido-líquido em hexano com agitação).

Assim, neste trabalho, nenhuma das técnicas de UAE e MAE com folhas de oliveira SI,

FI, SM e FM permitiram alcançar os valores atingidos pelos métodos convencionais

descritos por Figueiredo et al. (2018) de 2,6 mg/g PS. As folhas de oliveiras são, em geral,

muito ricas em ceras, e os alcanos de cadeia longa são um dos principais componentes

das ceras depositadas na superfície das folhas (Lv et al., 2016).

O perfil de ácidos gordos reportado em outros trabalhos ( Dias et al., 2018; Dias

et al., 2019), no qual foram usadas folhas de oliveira secas maceradas e uma extração

sólido-líquido em hexano com agitação, é um pouco diferente do obtido no presente

trabalho. Os ácidos oleico e palmítico são descritos por estes autores como os mais

abundantes, e os únicos identificados nestas folhas, tendo o seu conteúdo variado entre

0,4-2,6 mg/g PS. As extrações assistidas por micro-ondas e ultrassons permitiram uma

maior extração de ácidos gordos em folhas secas maceradas, tanto em número como em

quantidade, tendo-se detetado a presença de 3 ácidos gordos, nomeadamente ácido

nonacosanóico (0,332 e 0,491 mg/g PS, respetivamente), ácido hentriacontanóico (0,340

e 0,546 mg/g PS, respetivamente) e, no caso de MAE, o ácido hentriacontanóico (0,340

mg/g PS) e, no caso de UAE, o ácido hexacosanóico (4,393 mg/g PS). Contudo o acido

pálmitico não foi identificado nas folhas secas maceradas e extraidas por MAE e UAE.

Assim, os métodos não-convencionais usados no presente trabalho permitem extrair outro

tipo de ácidos gordos das folhas de oliveira.

Para além destes compostos, também foram identificados 3 esteróis nos extratos

de folhas de oliveira, e o seu conteúdo variou entre 0,062 e 0,094 mg/g PS na folha SM -

MAE e UAE. Dias et al. (2018), apenas identificou o β-sitosterol, no entanto o conteúdo

deste esterol extraído pelos métodos convencionais foi superior (0,2 a 0,4 mg/g PS) ao

obtido no presente trabalho. Já em outro trabalho, Figueiredo (2017), apenas identificou

o β-sitosterol e o estigmast-5-en-3-ol utilizando métodos convencionais, mas obteve

quantidades superiores às resultantes da extração por MAE e UAE (0,213-0,310 mg/g

PS).

Neste trabalho também foi possível extrair por MAE e UAE alguns álcoois (como

o álcool triacontan-1-ol) e ácidos gordos (como os ácidos nanocosanóico,

hentriacontanóico, dodecanóico e hexacosanóico) que não estão descritos na literatura

para folhas de oliveira.

45

É importante salientar ainda que as diferenças obtidas, principalmente na

quantidade de esteróis e alcanos, podem estar relacionadas com vários factores, como por

exemplo, a variedade da oliveira, apresença de stresses abióticos e biótico, a idade da

árvore e da estação do ano em que as folhas foram colhidas (Dias et al., 2018; Dias et al.

2019).

De um modo geral, os métodos não convencionais utilizados neste trabalho (MAE

e UAE), permitiram uma extração eficicente de compostos lipofílicos, quando

comparados com os métodos convencionais, nomeadamente extração sólido-líquido em

hexano com agitação, tendo-se verificado uma elevada quantidade de compostos

lipofílicos extraídos, essencialmente terpenóides e ácidos gordos, em apenas 30 min (um

ciclo de extração a 30 ºC). Além disso, foram utilizadas quantidades de solvente

significativamente inferiores às utilizadas nos métodos convencionais, reduzindo assim o

consumo de energia, solvente e tempo e, tornando, por conseguinte, estes métodos

emergentes (MAE e UAE) vantajosos na extração destes compostos benéficos para a

saúde humana, com diversas aplicabilidades nas indústrias medicinal, farmacêutica e

alimentar.

46

2. Perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira

2.1.Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira após MAE


obtidos por UHPLC-DAD ESI/MSn, do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira,

após extração assistida por micro-ondas (MAE), nomeadamente o cromatograma obtido

para o extrato da folha fresca macerada (FM). Na Tabela 3 encontra-se a identificação e

composição fenólica do extrato correspondente a cada amostra – folha fresca inteira (FI),

fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM).

Figura 21. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por UHPLC-DAD ESI/MSn dos extratos de

etanol, após extração assistida por micro-ondas. Os picos identificados com números correspondem aos

compostos identificados na tabela 3.

2 3

4 5

1 6

7

8

9

14

13 12

10

11

47

Tabela 3. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira (mg/Kg PF ou PS) de cada grupo – folha fresca inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca

macerada (SM), após extração assistida por micro-ondas (MAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3).

Pico TR (min) Composto [M-H]-

(m/z) MS2 (m/z) FI FM SI SM

Derivados do Ácido Cinâmico

- - Verbascósido 623 461 30,23 ± 0,442 ND ND ND

8 12,79 Isómero de verbascósido 623 461 35,48 ± 0,212 37,94 ± 5,640 28,69 ± 1,627 ND

12 13,79 Derivado do ácido cumárico 491 161; 175; 337 ND 33,84 ± 4,119 ND 29,14 ± 1,205

- - Calceolariosido 477 315 ND ND 30,78 ± 2,439 ND

- - Derivado do ácido ferúlico 519 193; 325 ND ND ND 24,29 ± 0,696

1 7,83 Ácido Cafeoil-Quínico 353 191 ND 24,79 ± 0,770 ND ND

2 9,80 Derivado do Ácido Sinápico 431 385 ND 25,03 ± 0,735 ND 24,62 ± 0,601

Total 65,71 121,6 59,47 78,05

Secoiridoides

- - Isómero de hidroxitirosol 1 315 153 161,9 ± 11,51 128,9 ± 30,89 ND 163,4 ± 31,40

- - Isómero de hidroxitirosol 2 315 153 583,9 ± 42,73 538,7 ± 204,1 ND 91,95 ± 12,16

3 10,22 Derivado da aglicona de

oleuropeína 377 197 18,94 ± 0,581 27,36 ± 7,564 ND 16,43 ± 2,341

48

Pico TR (min) Composto m/z MS2 FI FM SI SM

9 12,95 Dimetiloleuropeína 525 389; 345 42,89 ± 2,146 84,94 ± 29,73 ND 26,30 ± 6,432

- - Oleuropeína 539 377; 307; 275 7,841 ± 0,047 116,1 ± 42,04 30,27 ± 9,677 289,3 ± 42,64

Total 815,5 896,0 30,27 587,4

Flavonoides

- - Isómero de rutinósido de

luteolina 1 593 473; 503 ND ND ND 17,99 ± 0,148

4 11,53 Rutina 609 301 13,68 ± 1,307 39,67 ± 16,26 18,91 ± 9,246 8,851 ± 3,894

5 11,76 Isómero de rutinósido de

luteolina 2 593 285 27,54 ± 0,375 34,18 ± 7,303 19,37 ± 2,614 20,41 ± 1,168

6 11,91 Quercetina -O-hexósido 463 301; 300 69,78 ± 1,947 74,18 ± 4,337 72,28 ± 2,429 70,78 ± 0,762

7 12,07 Isómero de glucósido de luteolina

1 447 285 81,22 ± 4,563 146,5 ± 50,36 ND ND

10 13,25 Apigenina-7-glucósido 431 269 31,80 ± 0,750 43,85 ± 10,88 28,26 ± 1,307 53,75 ± 11,04

11 13,34 Isómero de glucósido de luteolina

2 447 285 44,94 ± 1,499 91,63 ± 29,19 52,20 ± 14,50 53,51 ± 11,24

- - 7-O-(D-Glucopiranosil)-crisoeriol 461 299; 446 27,63 ± 0,366 ND ND 21,90 ± 1,757

13 15,75 Luteolina 285 285 24,60 ± 0,256 28,79 ± 5,215 72,27 ± 31,30 23,66 ± 2,190

14 17,48 Apigenina 269 269 ND 17,77 ± 0,881 19,29 ± 0,523 ND

Total 321,2 476,6 282,6 270,9

49

No total, a extração assistida por micro-ondas permitiu a identificação e

quantificação de 22 compostos fenólicos divididos em três famílias: derivados do ácido

cinâmico (7), secoiridoides (5) e flavonoides (10).

Assim, a família predominante, em número de compostos, foi a dos flavonoides,

tendo sido identificados compostos como rutina, isómeros de rutinósido de luteolina,

quercetina -O-hexósido, isómeros de glucósido de luteolina, apigenina-7-glucósido, 7-O-

(D-glucopiranosil)-crisoeriol, luteolina e apigenina, principalmente nos extratos de folha

fresca macerada (476,6 mg/Kg PF) e de folha fresca inteira (321,2 mg/Kg PF), seguindo-

se os extratos de folha seca inteira (282,6 mg/Kg PS) e macerada (270,9 mg/Kg PS).

No entanto, foi na família dos secoiridoides que se detetou as maiores

quantidades, nomeadamente nos isómeros de hidroxitirosol, derivado da aglicona de

oleuropeína, dimetiloleuropeína e oleuropeína. Estes compostos foram identificados,

essencialmente nos extratos de folha fresca macerada (896,0 mg/Kg PF), de folha fresca

inteira (815,5 mg/Kg PF), e de folha seca macerada (587,4 mg/Kg PS), e em menores

quantidades na folha seca inteira (20,27 mg/Kg PS) uma vez que a oleuropeína foi o único

secoiridoide identificado neste extrato.

De seguida, também foi possível detetar, em quantidades significativas, derivados

do ácido cinâmico, tais como verbascósido, isómero de verbascósido, derivado do ácido

cumárico, calceolariosido, derivado do ácido ferúlico, ácido cafeoil - quínico e um

derivado do ácido sinápico, principalmente nos extratos de folha fresca macerada (121,6

mg/Kg PF), seca macerada (78,05 mg/Kg PS) e fresca inteira (65,71 mg/Kg PF), e em

menor abundância no extrato de folha seca inteira (59,47 mg/Kg PS).

Por último, a extração assistida por micro-ondas permitiu a extração de compostos

como isómero de delfinidina e galocatequina. No entanto não foi possível a sua

quantificação devido à inexistência de padrões apropriados no laboratório.

50

2.2. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira após UAE


obtidos por UHPLC-DAD ESI/MSn, do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira,

após extração assistida por ultrassons (UAE), nomeadamente o cromatograma obtido para

o extrato da folha seca macerada (SM). Na Tabela 4 encontra-se a identificação e

composição fenólica do extrato correspondente a cada amostra – folha fresca inteira (FI),

fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca macerada (SM).

Figura 22. Exemplo de um dos cromatogramas obtidos por UHPLC-DAD ESI/MSn dos extratos de

etanol, após extração assistida por ultrassons. Os picos identificados com números correspondem aos

compostos identificados na tabela 4.

1 2 3

4

6

5

7

8

9

15

14 13

12

11

10

51

Tabela 4. Composição fenólica dos extratos de folhas de oliveira (mg/Kg PF ou PS) de cada grupo – folha fresca inteira (FI), fresca macerada (FM), seca inteira (SI) e seca

macerada (SM), após extração assistida por ultrassons (UAE). Os valores representam média ± desvio padrão (n = 3).

Pico TR (min) Composto [M-H]-

(m/z) MS2 (m/z) FI FM SI SM

Derivados do Ácido Cinâmico

- - Verbascósido 623 461 32,09 ± 0,563 42,72 ± 9,894 ND ND

8 12,82 Isómero de Verbascósido 623 461 39,23 ± 1,283 43,96 ± 10,56 43,42 ± 2,553 41,67 ± 1,437

13 13,72 Derivado do Ácido Cumárico 491 161; 175; 337 26,30 ± 0,335 30,01 ± 2,964 24,66 ± 0,359 30,66 ± 3,711

- - Calceolariosido 477 315 27,90 ± 0,346 27,48 ± 1,595 27,28 ± 0,651 ND

- - Ácido Cafeoil-Quínico 353 191 25,75 ± 0,347 ND ND ND

2 9,82 Derivado do Ácido Sinápico 431 385 ND ND ND 26,66 ± 0,930

Total 151,3 144,2 95,36 98,99

Secoiridoides

- - Isómero de Oleósido 389 315 ND ND 88,61 ± 9,275 51,47 ± 15,94

- - Isómero de Hidroxitirosol 1 315 153 187,0 ± 36,48 181,9 ± 19,97 ND ND

- - Isómero de Hidroxitirosol 2 315 153 567,5 ± 57,09 361,5 ± 157,1 ND 533,3 ± 47,28

3 10,25 Derivado da Aglicona de

Oleuropeína 377 197 14,51 ± 0,818 18,68 ± 5,708 13,99 ± 0,798 25,26 ± 1,278

52

Pico TR (min) Composto m/z MS2 FI FM SI SM

9 12,99 Dimetiloleuropeína 525 389; 345 ND 39,82 ± 18,36 31,88 ± 3,125 58,76 ± 4,658

- - Oleuropeína 539 377; 307; 275 63,70 ± 5,685 111,3 ± 59,88 247,0 ± 27,34 17,83 ± 7,087

Total 832,7 713,2 381,5 686,6

Flavonoides

1 9,71 Isómero de Rutinósido de

Luteolina 1 593 473; 503 ND ND ND 18,78 ± 0,582

4 11,56 Rutina 609 301 16,99 ± 2,127 14,83 ± 10,26 14,42 ± 2,248 10,88 ± 1,376

5 11,78 Isómero de Rutinósido de

Luteolina 2 593 285 24,60 ± 3,378 27,66 ± 6,832 27,64 ± 3,193 34,02 ± 1,855

6 11,94 Quercetina -O-hexósido 463 301; 300 73,21 ± 1,803 73,83 ± 3,339 71,73 ± 3,492 74,63 ± 2,486

7 12,10 Isómero de Glucósido de

Luteolina 1 447 285 68,26 ± 5,219 92,83 ± 42,34 94,24 ± 9,469 130,9 ± 9,899

10 13,29 Apigenina-7-glucósido 431 269 42,95 ± 2,686 56,67 ± 22,10 48,99 ± 3,854 48,19 ± 2,738

11 13,38 Isómero de Glucósido de

Luteolina 2 447 285 67,57 ± 4,927 63,27 ± 26,00 59,23 ± 5,425 63,64 ± 3,842

12 13,54 7-O-(Glucopiranosil-D)-crisoeriol 461 299; 446 23,07 ± 0,614 27,61 ± 6,311 24,38 ± 1,247 36,38 ± 1,822

14 15,80 Luteolina 285 285 34,42 ± 2,163 29,34 ± 7,109 30,32 ± 1,804 32,90 ± 1,361

15 17,53 Apigenina 269 269 19,58 ± 0,307 18,55 ± 1,210 17,42 ± 0,385 19,55 ± 0,612

Total 370,7 404,6 388,4 469,9

53

Deste modo, o método de extração não convencional UAE permitiu a

identificação e quantificação de 22 compostos fenólicos divididos em quatro famílias:

derivados do ácido cinâmico (6), secoiridoides (6) e flavonoides (10).

Assim como a técnica de MAE, também a técnica de UAE permitiu a extração de

um maior número de flavonoides como rutina, isómeros de rutinósido de luteolina,

quercetina -O-hexósido, isómeros de glucósido de luteolina, apigenina-7-glucósido, 7-O-

(D-glucopiranosil)-crisoeriol, luteolina e apigenina, mas em maior quantidade no extrato

de folha seca macerada (469,9 mg/Kg PS), seguindo-se os extratos de folha fresca

macerada (404,6 mg/Kg PF), seca inteira (388,4 mg/Kg PS) e fresca inteira (370,7 mg/Kg

PF).

Contudo, a família detetada em maior abundância foi a família dos secoiridoides,

como isómeros de hidroxitirosol, derivado da aglicona de oleuropeína,

dimetiloleuropeína e oleuropeína, principalmente nos extratos de folha fresca inteira

(832,7 mg/Kg PF), fresca macerada (713,2 mg/Kg PF), seca macerada (686,6 mg/Kg PS)

e, em menor teor, no extrato de folha seca inteira (381,5 mg/Kg PS).

Também foram identificados e quantificados derivados do ácido cinâmico nos

extratos de folhas de oliveira, nomeadamente os compostos verbascósido, isómero de

verbascósido, calceolariosido, derivado do ácido cumárico, ácido cafeoil - quínico e

derivado do ácido sinápico. Estes compostos foram identificados essencialmente nos

extratos de folha fresca inteira (151,3 mg/Kg PF) e fresca macerada (144,2 mg/Kg PF), e

em menores quantidades, nos extratos de folha seca macerada (98,99 mg/Kg PS) e seca

inteira (95,36 mg/Kg PS).

Por fim, a extração assistida por ultrassons permitiu a extração de compostos

como isómero de delfinidina, galocatequina e derivado do ácido elenólico. Contudo, não

foi possível a sua quantificação devido à inexistência de padrões adequados no

laboratório.

54

2.3. Comparação do perfil fenólico dos extratos obtidos por MAE e UAE

Foi possível obter um perfil fenólico semelhante entre os métodos de extração não

convencionais, MAE e UAE, tendo-se identificado e quantificado 22 compostos

fenólicos, a partir de ambas as técnicas, pertencentes a três famílias: derivados do ácido

cinâmico, secoiridoides e flavonoides. Contudo a técnica de extração assistida por micro-

ondas permitiu identificar um maior número de derivados do ácido cinâmico (7) e a

técnica de extração assistida por ultrassons um maior número de secoiridoides (6).

Relativamente ao conteúdo de compostos presentes nos extratos de folhas de

oliveira, a técnica de extração assistida por micro-ondas permitiu uma maior extração de

secoiridoides e de flavonoides, e a técnica de extração assistida por ultrassons de

derivados do ácido cinâmico.

Deste modo, a energia gerada tanto em MAE como em UAE, permitiu uma

extração eficaz, como esperado. Isto também pode estar relacionado com a escolha do

solvente, o etanol, uma vez que a sua elevada constante dielétrica é um fator determinante

na extração de metabolitos, essencialmente na técnica de extração assistida por micro-

ondas (MAE).

55

2.3.1. Comparação do perfil fenólico dos extratos FI vs SI e FM vs SM extraídos

por MAE e UAE

Nas Figuras 23 e 24 encontra-se graficamente representado o total de compostos

fenólicos, tais como derivados do ácido cinâmico, secoiridoides e flavonoides, presentes

nos extratos de folhas de oliveira inteira e macerada, respetivamente, extraídos pelos

métodos não convencionais, MAE e UAE.

Deste modo, é possível verificar a partir da Figura 23, que ambos os perfis

fenólicos dos extratos de folha de oliveira fresca inteira, FI vs SI, obtidos pelas técnicas

de MAE e UAE foram muito similares.

No entanto, verifica-se que a folha fresca inteira (FI) aliada ao processo de

extração assistido por ultrassons (UAE) permitiu extrair e identificar um maior teor de

derivados do ácido cinâmico e secoiridoides.

Além disso, foi possível verificar uma diferença quantitativa significativa no

perfil de metabolitos fenólicos presentes nos extratos de folha de oliveira seca inteira (SI),

obtidos por MAE e UAE, tendo-se obtido um maior conteúdo de derivados do ácido

cinâmico, secoiridoides e flavonoides no extrato de folha SI, obtido por UAE.

Relativamente ao perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira maceradas, FM

vs SM extraídas por MAE e UAE (Figura 24), verifica-se que a folha fresca (FM) e a

utilização da técnica MAE permitiram extrair em maior quantidade secoiridoides e

flavonoides. O maior teor de derivados do ácido cinâmico foi detetado no extrato de folha

fresca macerada, obtido por UAE. Quando se compara o perfil fenólico dos extratos de

folha de oliveira seca macerada, verifica-se uma maior quantidade de compostos no

extrato de folha seca macerada obtido por UAE.

De um modo geral, estes resultados indicam que o facto de se usar folhas de

oliveira frescas ou secas e inteiras ou maceradas, influencia a extração tanto em número

como em quantidade de metabolitos fenólicos, tendo-se obtido melhores resultados na

extração de secoiridoides e flavonoides no extrato de folha de oliveira fresca macerada

pela técnica de MAE e, por último, derivados do ácido cinâmico no extrato de folha fresca

inteira pela técnica de UAE.

Em suma, verificou-se que o processo de maceração tornou o processo de extração

dos compostos fenólicos presentes nas folhas de oliveira mais eficaz, como era de esperar,

uma vez que este processo aumenta a área de superfície da amostra em contacto com o

solvente, através da quebra das paredes e membranas celulares das folhas de oliveira. Já

56

o processo de secagem das folhas, apesar de possibilitar um maior rendimento de extração

devido às modificões da estrutura física dos tecidos celulares, pode também induzir

efeitos adversos em alguns compostos, especialmente aqueles que são mais sensíveis ao

calor (Saifullah et al., 2019). Estudos conduzidos em folhas de Moringa oleifera

revelaram que alguns métodos de secagem (por exemplo, em estufa a 40 ºC e ao sol)

diminuem o conteúdo em alguns compostos fenólicos (tais como, rutina, campferol,

epicatequina, e ácidos cafeico e clorogénico) e a sua capacidade antioxidante (ex. ABTS

e FRAP), tendo-se obtido resultados inferiores aos resultados obtidos para folhas

congeladas (Ademiluyi et al., 2018). Nas folhas de oliveira, apesar de só ter sido usada

uma temperatura de 40ºC no processo de secagem, esta pode ter influenciado

negativamente alguns compostos fenólicos, possivelmente induzindo alterações na sua

estrutura. Assim, o presente trabalho indica que a utilização de material fresco parece ser

mais aconselhada para uma maior obtenção de compostos fenólicos presentes nas folhas

de oliveira.

57

Figura 23. Comparação do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira inteiras, frescas e secas, extraídos

por MAE e UAE (mg/Kg PF ou PS).

58

Figura 24. Comparação do perfil fenólico dos extratos de folhas de oliveira maceradas, frescas e secas,

extraídos por MAE e UAE (mg/Kg PF ou PS).

59

2.3.2. Comparação do perfil fenólico dos extratos obtidos pelos métodos não

convencionais vs métodos convencionais

Os métodos de extração não convencionais aplicados neste trabalho, MAE e UAE,

possibilitaram uma extração eficaz de compostos fenólicos presentes nos extratos de

folhas de oliveira, tanto em número como em quantidade, tendo-se obtido resultados

similares a partir de ambos os processos de extração.

Assim, relativamente à folha seca macerada (SM), as técnicas não convencionais

utilizadas neste trabalho, MAE e UAE, permitiram a extração de um elevado número de

compostos pertencentes à família dos flavonoides, nomeadamente isómero de rutinósido

de luteolina 1 (17,99 e 18,78 mg/Kg PS, respetivemente), isómero de rutinósido de

luteolina 2 (20,41 e 34,01 mg/Kg PS, respetivamente), rutina (8,851 e 10,88 mg/Kg PS,

respetivamente), quercetina-O-hexósido (70,78 e 74,63 mg/Kg PS, respetivamente),

apigenina-7-glucósido (53,75 e 48,19 mg/Kg PS, respetivamente), isómero de glucósido

de luteolina 2 (53,51 e 63,64 mg/Kg PS, respetivamente), 7-O-(D-glucopiranosil)-

crisoeriol (21,90 e 36,38 mg/Kg PS, respetivamente) e luteolina (23,66 e 32,90 mg/Kg

PS). Para além destes, o método de extração assistida por ultrassons permitiu ainda a

extração da apigenina (19,55 mg/Kg PS) e do isómero de glucósido de luteolina 1 (130,9

mg/Kg PS). Dias et al. (2018) e Figueiredo (2017) conseguiram extrair apenas 5 destes

compostos, como rutina (517 – 930 mg/Kg PS), isómero de rutinósido de luteolina 1 e 2

(780 – 1348 mg/Kg PS e 2054 – 3475 mg/Kg PS, respetivamente), quercetina-O-hexósido

(20 – 122 mg/Kg PS), isómero de glucósido de luteolina (613 – 903 mg/Kg PS), através

da extração sólido - líquido em metanol com agitação à temperatura ambiente (Dias et al

2020) e por Soxhlet (Figueiredo 2017), mas em quantidades superiores. Também

Meirinhos et al. (2005), reportou a extração de 5 dos compostos identificados neste

trabalho em folha seca macerada, em quantidades superiores, nomeadamente dois

isómeros de glucósido de luteolina (85 – 1955 mg/Kg PS e 253 – 2674 mg/Kg PS), a

apigenina-7-glucósido (123 – 1261 mg/Kg PS), a luteolina (45 – 690 mg/Kg PS) e a

apigenina (5 – 340 mg/Kg PS), a partir da extração sólido - líquido em metanol com

agitação a uma temperatura de 45 ºC. Já Ahmad – Qasem et al. (2014) e Talhaoui et al.

(2014) reportaram a extração de vários compostos pertencentes à família dos flavonóides,

tais como isómero de rutinósido de luteolina (1860 e 199 – 491 mg/Kg PS,

respetivamente), isómero de glucósido de luteolina (1100 e 1072 – 5724 mg/Kg PS,

respetivamente), luteolina (280 e 367 – 497 mg/Kg PS, respetivamente), apigenina-7-

glucósido (698 mg/Kg PS, apenas em Ahmad – Qasem et al. 2014), e 7-O-(D-

60

glucopiranosil)-crisoeriol (581 – 845 mg/Kg PS, apenas em Talhaoui et al. 2014), a partir

de extração assistida por ultrassons (UAE), em folhas de oliveira secas maceradas,

utilizando etanol e metanol como solventes. Estes resultados de extração obtidos por UAE

demonstraram ser superiores aos resultados obtidos no presente trabalho, também por

extração assistida por ultrassons.

As técnicas de MAE e UAE (para a folha SM) também permitiram a extração de

quantidades significativas de secoiridoides, tais como isómero de hidroxitirosol 2 (91,95

e 533,3 mg/Kg PS, respetivamente), derivado da aglicona de oleuropeína (16,43 e 25,26

mg/Kg PS, respetivamente), dimetiloleuropeína (26,30 e 58,76 mg/Kg PS,

respetivamente), oleuropeína (289,3 e 17,83 mg/Kg PS, respetivamente). Para além

destes, a técnica de extração assistida por micro-ondas (para a folha SM) permitiu ainda

a extração de isómero de hidroxitirosol 1 (163,4 mg/Kg PS), e a técnica de extração

assistida por ultrassons a extração de um isómero de oleósido (51,47 mg/Kg PS). Os

valores resportados por Dias et al. (2018) e Figueiredo (2017), a partir de extração por

métodos convencionais em folhas secas maceradas foram superiores, mas apenas

conseguiram extrair três dos compostos mencionados, nomeadamente isómero de

oleósido (665 – 1087 mg/Kg PS), derivado da aglicona de oleuropeína (15 – 28 mg/Kg

PS) e oleuropeína (1300 – 2347 mg/Kg PS). Talhaoui et al. (2014) também reportou a

extração de 4 dos secoiridoides identificados no presente trabalho, utilizando métodos de

extração não convencionais (UAE) e metanol como solvente, em folhas secas maceradas,

nomeadamente dois isómeros de hidroxitirosol (341 – 438 mg/Kg PS e 469 – 793 mg/Kg

PS, respetivamente), a dimetiloleuropeína (1338 – 6382 mg/Kg PS) e a oleuropeína (2100

– 2337 mg/Kg PS). O conteúdo destes compostos reportado por Talhaoui et al. (2014) foi

em geral superior ao obtido no presente trabalho.

Relativamente à família dos derivados do ácido cinâmico, foram identificados três

compostos, extraídos por MAE e UAE, na folha SM, tais como derivado do ácido

cumárico (29,14 e 30,66 mg/Kg PS, respetivamente) e, no caso da técnica de MAE, um

derivado do ácido ferúlico (24,29 mg/Kg PS), e no caso de UAE, um isómero de

verbascósido (41,67 mg/Kg PS) e um derivado do ácido sinápico (98,99 mg/Kg PS). Já

Dias et al. (2019) conseguiu extrair apenas um destes compostos, mas em quantidades

superiores (74 – 288 mg/Kg PS), pelo método convencional, extração por Soxhlet (onde

o solvente usado foi o etanol).

Relativamente à folha fresca, os métodos de extração não convencionais aplicados

neste trabalho (MAE e UAE) demonstraram ser eficazes na extração de compostos

61

pertencentes às várias famílias, tendo-se obtido, de uma forma geral, um perfil qualitativo

similar na folha fresca inteira (FI) e macerada (FM), mas em termos quantitativos foi

superior na folha fresca macerada (FM). Assim, das famílias de compostos presentes nas

folhas de oliveira, é de salientar a família dos flavonóides, tendo-se extraído e

quantificado 8 destes compostos, a partir de MAE e UAE: rutina (39,67 e 14,83 mg/Kg

PF, respetivamente), isómero de rutinósido de luteolina (34,18 e 27,66 mg/Kg PF,

respetivamente), quercetina-O-hexósido (74,18 e 73,83 mg/Kg PF, respetivamente),

apigenina-7-glucósido (43,85 e 56,67 mg/Kg PF, respetivamente), isómeros de glucósido

de luteolina 1 e 2 (146,5 e 92,83 mg/Kg PF, e 91,63 e 63,27 mg/Kg PF, respetivamente),

luteolina (28,79 e 29,34 mg/Kg PF, respetivamente) e apigenina (17,77 e 18,55 mg/Kg

PF, respetivamente). A técnica de extração assistida por ultrassons também possibilitou

a extração do composto 7-O-(D-glucopiranosil)-crisoeriol em quantidade 27,61 mg/Kg

PF. Romani et al. (2017) reportou a extração de apenas dois compostos pertencentes a

esta família em folhas de oliveira frescas, a partir da extração sólido – líquido em

etanol/água (30:70, v/v), sob agitação, nomeadamente apigenina-7-glucósido (40 - 320

mg/Kg PF) e 7-O-(D-glucopiranosil)-crisoeriol (120 mg/Kg PF), mas em quantidades

superiores.

As técnicas não convencionais de MAE e UAE também permitiram a extração de

quantidades significativas de secoiridoides presentes na folha fresca macerada (FM),

nomeadamente isómeros de hidroxitirosol 1 e 2 (128,9 e 181,9 mg/Kg PF, e 538,7 e 361,5

mg/Kg PF, respetivamente), derivado da aglicona de oleuropeína (27,36 e 18,68 mg/Kg

PF, respetivamente), dimetiloleuropeína (84,94 e 39,82 mg/Kg PF, respetivamente) e, por

último, a oleuropeína (116,1 e 111,3 mg/Kg PF, respetivamente). Também Mert et al.

(2013) reportou a extração de oleuropeína a partir de métodos não convencionais,

nomeadamente extração assistida por ultrassons (UAE) em folhas frescas em quantidades

superiores, 730 – 7050 mg/Kg PF. Já Romani et al. (2016) reportou a extração de dois

destes compostos, a dimetiloleuropeína (450 – 1060 mg/Kg PF) e a oleuropeína (2790 –

13640 mg/Kg PF) a partir de técnicas de extração convencionais (extração sólido –

líquido em etanol/água (30:70, v/v), com agitação) em folhas frescas; e Ranalli et al.

(2006) apenas a extração de oleuropeína (780 – 8610 mg/Kg PF), em folhas frescas de

oliveira, utilizando o método convencional, extração sólido – líquido e a mistura de

solventes metanol/água (2:3:1, v/v) com agitação.

Por fim, a técnica UAE permitiu a extração de 4 compostos pertencentes à família

dos derivados do ácido cinâmico, presentes na folha FM, tais como o verbascósido (42,72

62

mg/Kg PF), um isómero de verbascósido (43,96 mg/Kg PF), um derivado do ácido

cumárico (30,01 mg/Kg PF) e o calceolariosido (27,48 mg/Kg PF). A técnica de extração

assistida por micro-ondas (MAE) permitiu apenas a extração de dois destes compostos,

nomeadamente o isómero de verbascósido (37,94 mg/Kg PF) e um derivado do ácido

cumárico (30,01 mg/Kg PF). No entanto, esta técnina também permitiu a extração do

ácido cafeoíl-quínico (24,79 mg/Kg PF) e de um derivado do ácido sinápico (25,03

mg/Kg PF), presentes na folha fresca macerada (FM). Também Romani et al. (2016)

reportou a extração de apenas um composto derivado do ácido cinâmico, o verbascósido,

a partir do método convencional extração sólido – líquido utilizando uma mistura de

solventes etanol/água (30:70, v/v), mas em quantidades superiores (160 – 730 mg/Kg PF).

É de salientar também que, apesar das diferenças nos conteúdos de vários

metabolitos obtidos neste trabalho por MAE e UAE e os reportados na literatura, os

valores obtidos tanto para o hidroxitirosol (128,9 – 538,7 mg/Kg PF e 91,95 – 533,3

mg/Kg PS), como para a luteolina, apigenina e ácido ferrúlico (23,66 – 32,90 mg/Kg PS;

19,55 mg/Kg PS e 24,29 mg/Kg PS, respetivamente) encontram-se dentro dos intervalos

descritos para os mesmos compostos nas folhas de oliveira descitos por Talhaoui et al.

(2015) (11,94 – 479,3 mg/Kg PF e 2,2 – 1120 mg/Kg PS; 10,1 – 5600 mg/Kg PS; 4,6 –

339,5 mg/Kg PS e 7 – 91,4 mg/Kg PS, respetivamente).

De um modo geral, quando comparados os resultados obtidos a partir de ambas

as extrações (MAE e UAE) em folhas de oliveira, verificou-se que a técnica MAE

possibilitou uma maior extração dos compostos fenólicos (derivados do ácido cinâmico,

secoiridoides e flavonoides) presentes na folha macerada (FM). O mesmo não se verificou

a partir da técnica UAE, tendo-se obtido uma maior quantidade de derivados do ácido

cinâmico e secoiridoides na folha FM, e uma maior quantidade de flavonoides na folha

seca macerada (SM).

Em suma, os métodos de extração não convencionais utilizados no presente

trabalho (MAE e UAE) permitiram uma extração eficiente de compostos fenólicos

presentes nas folhas de oliveira, tanto frescas como secas, quando comparados com os

métodos convencionais utilizados noutros trabalhos (extração sólido – líquido em

metanol, etanol e água, com agitação). Ambas as técnicas de extração assistidas por

micro-ondas e ultrassons demonstraram ser benéficas aquando a utilização da folha de

oliveira fresca, evitando processos de secagem e, por conseguinte, consumo de tempo e

energia. Além disso, também o tempo de extração de apenas 30 minutos e o menor uso

de solvente apresentam-se como vantagens da utilização destas técnicas de extração não

63

convencionais, quando comparadas com os métodos convencionais que, geralmente, são

mais longos e requerem elevadas quantidades de solvente (por exemplo, 72h –

equivalente a três ciclos de extração, (Dias et al., 2019, 2020)).

65

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que as folhas de oliveira são

uma fonte essencial de compostos bioativos, pelo que é imperativa a valorização deste

subproduto alimentar de elevada disponibilidade com inúmeras aplicabilidades nas

indústrias alimentar, farmacêutica e medicinal.

Neste trabalho, a utilização de métodos emergentes não convencionais, MAE e

UAE, mostrou ser eficiente na extração dos compostos lipofílicos bem como dos

compostos fenólicos presentes nas folhas de oliveira, quando comparados com os

métodos convencionais, nomeadamente extração sólido – líquido (com hexano e folha

macerada) e extração por Soxhlet (com etanol e folha macerada). Alguns compostos

extraídos por estes métodos não convencionais permitiram a identificação de vários

compostos não reportados na literatura, até ao presente momento, nomeadamente, o

álcool triacontan-1-ol e os ácidos nanocosanóico e dodecanóico.

As diferenças obtidas na quantidade de alguns compostos lipofílicos e fenólicos

quando comparados com a literatura podem estar relacionadas com vários factores,

nomeadamente com a variedade da oliveira e a idade da árvore, as condições ambientais

de crescimento e tipo de solo, a estação do ano em que as folhas foram colhidas, o estado

fenológico da planta e, ainda, com as condições de processamento das amostras, do tipo

de solvente de extração, e do tempo e temperatura de extração.

Os resultados obtidos no presente trabalho indicam também que o facto de se usar

folhas de oliveiras frescas ou secas e inteiras ou maceradas, influencia tanto em número

como em quantidade de metabolitos (lipofílicos e fenólicos) extraídos, tendo-se obtido

um maior teor de compostos lipofílicos a partir da técnica de extração assistida por

ultrassons (UAE) na folha de oliveira seca macerada (SM), e um maior teor de compostos

fenólicos a partir da técnica de extração assistida por micro-ondas (MAE) na folha de

oliveira fresca macerada (FM), o que torna este método não convencional (MAE)

benéfico na extração de compostos fenólicos presentes nas folhas de oliveira, sem recorrer

a processos de secagem e, evitando, consequentemente, consumo de tempo e energia.

Além disso, os métodos utilizados no presente trabalho, MAE e UAE, utilizam menores

quantidades de solvente e tempos de extração reduzidos, geralmente 30 minutos,

mantendo bons rendimentos de extração e tendo, por conseguinte, um impacto positivo

no ambiente.

67

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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77

ANEXOS

Anexo1. Padrões utilizados na quantificação de compostos lipofílicos

y = 0,097x + 0,2123

R² = 0,992

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 20 40 60 80 100

[Ácid

o P

alm

ític

o]

(mg

/mL

)

A/Api

Figura A2. Reta de calibração do ácido palmítico.

y = 0,0952x + 0,0466

R² = 0,9921

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

[Octa

decan

o]

(mg

/mL

)

A/Api

Figura A1. Reta de calibração do octadecano.

78

y = 0,0611x + 0,032

R² = 0,9914

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12

[Cole

ste

rol]

(m

g/m

L)

A/Api

Figura A3. Reta de calibração do colesterol.

y = 0,0872x + 0,0243

R² = 0,996

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

[Octa

decan

ol]

(m

g/m

L)

A/Api

Figura A4. Reta de calibração do octadecanol.

79

y = 0,0414x + 0,0115

R² = 0,9909

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

[Malt

ose]

(mg

/mL

)

A/Api

Figura A5. Reta de calibração da maltose.

80

Anexo 2. Padrões utilizados na quantificação de compostos fenólicos

y = 9E-08x + 0,0358

R² = 0,9992

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000

[Ácid

o C

afe

ico]

(mg

/mL

)

Área

Figura A6. Reta de calibração do ácido cafeico.

y = 8E-07x + 0,0116

R² = 0,9841

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000

[Ole

uropeín

a]

(mg

/mL

)

Área

Figura A7. Reta de calibração da oleuropeína a 280 nm.

81

y = 2E-07x + 0,0084

R² = 0,9882

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000

[Ole

uropeín

a]

(mg

/mL

)

Área

y = 2E-07x + 0,0236

R² = 0,9817

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000

[Lu

teoli

na]

(mg

/mL

)

Área

Figura A8. Reta de calibração da oleuropeína a 240 nm.

Figura A9. Reta de calibração da luteolina.

82

y = 3E-07x + 0,0991

R² = 0,9989

0

1

2

3

4

5

6

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000

[Qu

erceti

na]

(mg

/mL

)

Área

.

Figura A10. Reta de calibração da quercetina.

y = 5E-07x - 0,0045

R² = 0,9986

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000

[Ru

tin

a]

(mg

/mL

)

Área

Figura A11. Reta de calibração da rutina.

universidade de aveiro departamento de química ano 2020

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