universidade ceuma prÓ-reitoria de pÓs-graduaÇÃo, … mrcia melo... · prÓ-reitoria de...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO
Identificação e diferenciação molecular pela Análise de
Restrição de DNA Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR)
das espécies de Acinetobacter isoladas de pacientes de
hospitais de São Luis-MA
SÃO LUIS
2014
MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO
Identificação e diferenciação molecular pela Análise de Restrição de DNA
Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR) das espécies de Acinetobacter isoladas
de pacientes de hospitais de São Luis-MA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre
em Biologia Parasitária.
Orientadora: Drª Maria Rosa Quaresma
Bomfim
Coorientador: Dr. Valério Monteiro-Neto.
SÃO LUIS 2014
MARTINA MÁRCIA MELO COQUEIRO
Identificação e diferenciação molecular pela Análise de Restrição de DNA
Ribosomal Amplificado (ARDRA-PCR) das espécies de Acinetobacter isoladas
de pacientes de hospitais de São Luis-MA
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado
em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / ,
considerou o(a) candidato(a)
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
4) Presidente (Orientador)_____________________________
A DEUS por sempre guiar e iluminar o meu caminho.
Aos meus pais, Edvaldo e Socorro, pelo exemplo, dedicação e amor.
À minha irmã e sobrinha pelo amor e carinho.
Agradecimentos
À minha querida orientadora, Prof. Drª. Maria Rosa Quaresma Bomfim, por
todo o apoio, incentivo e disposição, serei sempre grata.
Ao meu noivo, Fabrício da Ascensão Lima Pinheiro, por todo carinho,
dedicação, amor e por sempre estar ao meu lado.
À amiga Patrícia Cristina Saldanha Ribeiro pela fundamental ajuda na
realização deste trabalho.
A Margareth Penha que sempre está disposta a nos ajudar no Laboratório de
Pesquisa.
Ao Laboratório Cedro por ceder as amostras clínicas utilizadas neste estudo.
À Universidade Ceuma por fornecer a infraestrutura necessária para a
execução da parte experimental desta pesquisa.
RESUMO
Acinetobacter é um patógeno oportunista que tem causado sérias infecções em
pacientes hospitalizados, principalmente àqueles lotados em Unidades de Terapia
Intensiva. A espécie Acinetobacter baumannii se destaca como um dos mais
importantes patógenos clínicos no ambiente hospitalar, caracterizado por apresentar
resistência à maioria dos antimicrobianos utilizados na prática clínica. Estudos têm
demonstrado que Acinetobacter apresenta resistência a diferentes antimicrobianos
devido à presença de genes intrínsecos e adquiridos que lhes confere a capacidade
de produzir a enzima β-lactamase, o mais prevalente mecanismo de resistência aos
fármacos β-lactâmicos. Algumas espécies de Acinetobacter têm emergido como
importantes patógenos hospitalares, dentre elas àquelas conhecidas por formarem o
complexo A. calcoaceticus-A.baumanii. O grande problema na atualidade com
relação à identificação das espécies envolvidas nestes processos infecciosos é que
os métodos fenotípicos não diferenciam as espécies infectantes. Neste aspecto, no
presente estudo foi avaliada a técnica de ARDRA-PCR (Análise de Restrição de
DNA Ribosomal Amplificado) para identificar as espécies de Acinetobacter em 142
isolados oriundos de 119 pacientes internados em 12 hospitais de São Luis-MA. Os
resultados obtidos mostraram que o método automatizado Vitek®2 (Biomerieux,
França) identificou 138 (97.2%) isolados como sendo A. baumannii, 2 (1.4%) como
A. ursingii e 2 (1.4%) como A. lwoffii. A investigação da presença de quatro
subgrupos de carbapenemases pela técnica de PCR multiplex mostrou um maior
número de isolados apresentando simultaneamente os genes blaOXA-51 e blaOXA-23. O
gene blaOXA-51, foi o segundo mais observado. Além disso, os genes blaOXA-24 e
blaOXA-58 foram também detectados. A reação de PCR específica detectou o gene
blaOXA-51 em 140 (98.6%) isolados. A técnica de ARDRA-PCR detectou diferenças
intraespecíficas entre os 142 isolados, demonstrando ser uma ferramenta molecular
útil para o estudo da diversidade genética das espécies de Acinetobacter spp.
Palavras chave: Identificação/diferenciação; ARDRA-PCR; Acinetobacter spp.
ABSTRACT
Acinetobacter is an opportunistic pathogen that has caused serious infections in
hospitalized patients, especially those admitted to intensive care units. The
Acinetobacter baumannii species stands out as one of the most important clinical
pathogens in the hospital environment, characterized by presenting resistance to
most antimicrobial agents used in clinical practice. Studies have shown that
Acinetobacter is resistant to different antimicrobial due to the presence of intrinsic
and acquired gene that confers them the ability to produce the enzyme β-lactamase
the most common mechanism of resistance to β-lactam drugs. Some Acinetobacter
species have emerged as important nosocomial pathogens, among them those
known to form A. calcoaceticus-A.baumani complex. The major problem today with
identification of the species involved in these infectious processes is that the
phenotypic methods do not differentiate the infecting species. In this respect, the
present study evaluated the technique ARDRA-PCR (Restriction Analysis of
Amplified Ribosomal DNA) to identify 142 species of Acinetobacter isolates from 119
patients admitted to 12 hospitals in São Luis-MA. The results obtained using the
automated method Vitek®2 (Biomerieux, France) revealed that 138 (97.2%) isolates
were A. baumannii, 2 (1.4%) as A. ursingii and 2 (1.4%) and A. lwoffii. Investigating
the presence of four subgroups of carbapenemase by multiplex PCR technique found
a higher number of isolates with both the blaOXA-51 and blaOXA-23 genes. The blaOXA-51
gene was the second most prevalent. Furthermore, blaOXA-24 and blaOXA-58 genes
were also detected. The specific PCR detected the blaOXA-51 gene in 140 (98.6%)
isolates. The technique of PCR-ARDRA intraspecific differences detected between
the 142 isolates demonstrated to be a useful tool for studying the molecular genetic
diversity of the species Acinetobacter spp.
Keywords: Differentiation/identification; ARDRA-PCR; Acinetobacter spp.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Lista de espécies do gênero Acinetobacter com nomes válidos...
19
Tabela 2 -
Perfis ARDRA-PCR das 32 espécies de Acinetobacter constantes do Genbank utilizadas na digestão in silico e construção da matriz fenotípica para a geração do dendrograma.................................................................................
39
Tabela 3 - Sequência de iniciadores usados para detecção por Multiplex-PCR dos genes blaOXA nos isolados de Acinetobacter spp.................................................................................................
41
Tabela 4 - Características gerais dos 142 pacientes provenientes de hospitais públicos e privados de São Luís-MA..............................
44
Tabela 5 - Distribuição por hospital dos espécimes clínicos de onde os isolados foram recuperados..........................................................
45
Tabela 6 - Distribuição setorial dos 142 isolados recuperados de espécimes clínicos de pacientes atendidos em doze hospitais de São Luis-MA.............................................................................
45
Tabela 7 - Perfil fenotípico de susceptibilidade dos isolados microbianos avaliados pelo Vitek2.....................................................................
46
Tabela 8 - Frequência de detecção dos genes para oxacilinase (OXA) por mPCR nos isolados avaliados......................................................
48
Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de susceptibilidade aos antibióticos e presença de genes para oxacilinases...................................................................................
49
Tabela 10 - Perfis obtidos no ARDRA-PCR para os 142 isolados de Acinetobacter avaliados no presente estudo.................................
53
Tabela 11 - Resultado da análise de similaridade genética entre as sequências obtidas dos isolados quando submetida ao Blastn do Genbank...................................................................................
57
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Perfis representativos dos resultados obtidos pela mPCR para a detecção simultânea dos genes tipo blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 em alguns isolados do estudo...........................................
47
Figura 2 - Gel de agarose 2% mostrando o produto de amplificação por PCR específica do gene blaOXA-51 de alguns isolados do estudo..............................................................................................
51
Figura 3 - Gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação por PCR específica para o gene da região 16S ribossomal de alguns isolados do estudo...........................................................................
52
Figura 4 - Gel de poliacrilamida 6% representando os produtos da digestão enzimática de alguns isolados identificados do estudo...................
53
Figura 5 - Dendrograma de similaridade genética derivado do coeficiente de similaridade DICE implementado pelo programa NTSYS mostrando as relações filogenéticas entre os 142 isolados do estudo e as 32 espécies de referência de Acinetobacter do Genbank..........................................................................................
55
Figura 6 - Árvore filogenética construída pelo programa Mega versão 5.2 usando o algoritmo de neighbor joining com valor de bootstrap de 1000 replicatas. A árvore foi baseada na sequência nucleotídica do fragmento de 1.432bp de 28 isolados que foram sequenciados e 32 sequências de diferentes espécies de Acinetobacter provenientes do Genbank........................................
57
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACB Complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
AFLP Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados (do
inglês, Amplified fragment length polymorphism)
AMI Amicacina
AMP Ampicilina
AmpC Enzima cefalosporinase cromossomal β-lactamase de classe C
ARDRA Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (do inglês,
Amplified ribosomal DNA restriction analysis
ARI-1 Acinetobacter resistente ao imipenem (do inglês, Acinetobacter
resistant imipenem)
ASB Ampicilina/sulbactam
Bap Proteína associada ao biofilme (do inglês, biofilm associated
protein)
BHI Brain Heart Infusion
CAZ Ceftazidima
CIM Concentração inibotória mínima
CIP Ciprofloxacina
CHDL β-lactamases da classe D que hidrolisam carbapenêmicos (do
inglês, Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase)
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CPM Cefepime
CT Cefoxitina
dATP Desoxiadenosina trifosfatado
dCTP Desoxicitidina trifosfatado
dGTP Desoxiguanosina trifosfatado
DNA Ácido desoxiribonucléico (do inglês, DeoxyriboNucleic Acid)
dNTP Desoxiribonuleotídeo trifosfatado
dTTP Desoxitimidina trifosfatado
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês,
Ethylenediaminetetraacetic acid)
ESBL β-lactamase de amplo espectro (do inglês, Expended-Spectrum β-
lactamases)
FDA Food and Drug Administration
GEN Gentamicina
IMI Imipenem
Kb Kilobase
KPC Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase
MBLs Metalo-β-lactamases
MER Meropenem
Mpcr Reação em cadeia pela polimerase multiplex
OMP Proteína de membrana externa (do inglês, outer membrane protein)
OXA Oxacilinase
Pb Pares de base
PBP Proteína ligadora de penicilina (do inglês, penicillin binding protein)
PBS Solução salina tamponada com fosfato (do inglês, phosphate-
buffered saline)
PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês, Polymerase Chain
Reaction)
RFLP Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição
PFGE Eletroforese em gel de agarose em campo pulsado (do inglês,
Pulsed Field Gel Electrophoresis)
POL Polimixina B
RAPD Amplificação randômica do DNA polimórfico
REP-PCR PCR das sequências palindrômicas extragênicas repetidas (do
inglês, Repetitive Extragenic Palindromic elements)
Rpm Rotação por minuto
TBE Tris-Borato-EDTA
TE Tris-EDTA
TGC Tigeciclina
TSA Ágar de soja tríptica (do inglês,Tryptic Soy Agar)
TSB Caldo de soja tríptica (do inglês, Tryptic Soy Broth)
TZP Piperacilina/tazobactam
UTI Unidade de terapia intensiva
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC Grau Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
HCl Ácido Clorídrico
L Litro
MG Miligrama
MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitros
mM Milimolar
mV Milivolt
nº Número
Ng Nanograma
pH Potencial hidrogeniônico
Pmol Picomol
V Volts
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 14 2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 18
2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO GÊNERO Acinetobacter............ 19 2.2 PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA......................... 22 2.2.1 Mecanismos de resistência a antimicrobianos............................ 24 2.2.2 Produção de β-Lactamases............................................................ 27
2.2.2.1 β-Lactamases do tipo OXA............................................................... 27 2.3 MÉTODOS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO E
CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DO GÊNERO Acinetobacter....... 30
3 JUSTIFICATIVA................................................................................ 33 4 OBJETIVOS DA PESQUISA............................................................ 34 4.1 OBJETIVO GERAL............................................................................ 34 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................. 34 5 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................. 35
5.1 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA............................................... 35 5.2 ISOLADOS BACTERIANOS....................................................................... 35
5.3 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS.................................... 35 5.4 ANÁLISE MOLECULAR.................................................................... 36 5.4.1 Extração do DNA Genômico Para Amplificação........................... 36 5.4.2 Ensaios de PCR Para a Detecção do Gene blaOXA-51.................... 37 5.4.3 Desenho dos Iniciadores e Ensaios de PCR................................. 37 5.4.4 Escolha da Enzima de Restrição e Ensaio de ARDRA-PCR........ 38 5.4.5 Aferição do Tamanho Molecular dos Fragmentos Gerados
pelo ARDRA-PCR e Confecção do Dendrograma........................ 40
5.4.6 Ensaios de Multiplex-PCR (mPCR) Para a Detecção de Genes blaOXA................................................................................................
41
5.5 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR DE ALGUNS ISOLADOS..........................................................
41
5.6 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS PARA INFERÊNCIAS FILOGENÉTICAS........................................................................................
42
5.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS............................................................... 43 6 RESULTADOS.................................................................................. 44 7 DISCUSSÃO..................................................................................... 59 8 CONCLUSÃO..................................................................................... 68
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 69
14
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas tem sido observado um aumento significativo no número
de casos de infecções hospitalares causadas por Acinetobacter spp., e vários surtos
têm sido registrados em todo o mundo. As espécies envolvidas nessas infecções
são difíceis de serem erradicadas porque frequentemente apresentam
multirresistência à maioria dos antimicrobianos disponíveis (YABUMOTO;
OLIVEIRA, 2011).
As bactérias pertencentes ao gênero Acinetobacter spp., têm se tornado
patógenos predominantes no ambiente hospitalar, sendo isolado principalmente de
pacientes imunodeprimidos e lotados em Unidades de Terapia Intensiva (UTI’s), e
provavelmente, essas infecções estão relacionadas a procedimentos invasivos
utilizados em pacientes nestas unidades (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996;
TOWNER, 1997).
Algumas espécies do gênero Acinetobacter têm emergido como importantes
patógenos hospitalares, dentre elas aquelas conhecidas por formarem o complexo
A. calcoaceticus-A. baumannii constituído pelas espécies A. calcoaceticus, A.
baumannii, A. nosocomialis (conhecido como Acinetobacter genoespécie 13TU), e
A. pittii (conhecido como Acinetobacter genoespécie 3) (YABUMOTO; OLIVEIRA,
2011). Estudos têm apontado as três últimas espécies como as mais comumente
associadas com infecções humanas. Destas, A. baumannii tem sido a mais isolada
em diferentes tipos de infecções oportunistas, incluindo septicemia, pneumonia,
endocardite, meningite, peritonite em pacientes submetidos à diálise peritoneal,
infecção de pele e tecidos, e infecção do trato urinário (YABUMOTO; OLIVEIRA,
2011).
Assim, o controle das infecções causadas por A. baumannii se tornou um
problema de saúde pública em muitos países devido à capacidade que esse micro-
organismo apresenta de adquirir genes de resistência de forma muito rápida levando
à multirresistência (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996; LANDMAN et al.,
2002).
Além das espécies que formam o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii,
outras espécies como A. junii, A. johnsonii, A. ursingii e A. schindleri podem estar,
acidentalmente, associadas a infecções (DIJKSHOORN et al., 2007; Di NOCERA et
al., 2011).
15
Por outro lado, ressalta-se a importância do conhecimento das espécies que
estão emergindo e acometendo os pacientes, principalmente aqueles em estado
crítico com alto risco de vida (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Atualmente, a
identificação em laboratório de microbiologia clínica das espécies de Acinetobacter é
difícil de ser realizada porque estas bactérias apresentam características fenotípicas
semelhantes e também devido ao seu metabolismo pouco ativo (LA ESCOLA et al.,
2006). Além disso, um clone da mesma linhagem pode expressar características
diferentes (LUPSKI, 1987). Neste aspecto, a diferenciação entre as espécies deste
complexo é feita apenas por métodos genotípicos, metodologia esta ainda restrita
aos laboratórios de referência.
Diferentes técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para o estudo da
epidemiologia dos surtos das infecções causadas por Acinetobacter, tais como:
fagotipagem, eletroforese de proteínas, análise do conteúdo total plasmidial,
Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (PCR-RFLP), Ribotipagem,
Eletroforese em gel de agarose em campo pulsátil (PFGE), amplificação randômica
do DNA polimórfico (RAPD), PCR das sequências palindrômicas extragênicas
repetidas (REP-PCR), entre outras. Por outro lado, algumas destas técnicas têm
baixo poder discriminatório, enquanto outras são demoradas e complexas
necessitando de equipamentos sofisticados e profissionais qualificados para
executar (VILA et al., 1996; WOODFORD; FAGAN; ELLINGTON, 2006; PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008).
A diferenciação entre os isolados do complexo A. calcoaceticus-A. baumannii
é clinicamente importante uma vez que as espécies pertencentes a este complexo
apresentam características biológicas e patogênicas distintas, o que pode ser
relevante na eficácia do tratamento. Há uma necessidade de realização de estudos
moleculares epidemiológicos para que se possa entender melhor a relação
filogenética entre as genoespécies. Os resultados serão úteis para um melhor
tratamento clínico e controle da infecção (SEIFERT et al., 1993; DIEZ et al., 2004;
IDZENGA et al., 2006).
A compreensão dos mecanismos fundamentais das infecções causadas por
Acinetobacter, incluindo as fontes originais dos organismos infecciosos, sua
clonalidade e distribuição geográfica, é importante para o desenvolvimento de
medidas apropriadas de controle da infecção. A identificação genotípica permite a
16
investigação da expansão clonal podendo ser utilizada também para identificar a
fonte da infecção (ECKER et al., 2006).
Nos últimos anos inúmeras técnicas moleculares têm sido utilizadas para
detectar genes específicos em algumas espécies de Acinetobacter, como por
exemplo, a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), que geralmente é aplicada
para a detecção de genes de resistência à antimicrobianos que expressam β-
lactamases de amplo espectro (ESBL-Extended-spectrum β-lactamase), as metalo-
β-lactamases (MBLs) e também as carbapenemases (KPCs) (TENOVER et al.,
1995; NEELEMAN et al., 2004; WALSH et al., 2010).
Variações na técnica tradicional de PCR têm sido implementadas por
pesquisadores em todo o mundo para o diagnóstico de doenças infecciosas
causadas por diferentes patógenos. Entre essas variações destaca-se a Multiplex-
PCR (mPCR). Esta permite a amplificação de vários alvos em um único ensaio de
PCR. Neste caso, mais de uma sequência alvo é amplificada pela utilização de
múltiplos pares de iniciadores em um único tubo de reação. Esta metodologia tem o
potencial de promover economia de tempo e de trabalho laboratorial sem
comprometer o desempenho do experimento (ELNIFRO et al., 2000). A mPCR tem
sido utilizada com sucesso para a detecção e diferenciação de clones de diferentes
espécies bacterianas, inclusive para Acinetobacter, com perfil de resistência aos
antimicrobianos β-lactâmicos (WOODFORD; FAGAN; ELLINGTON, 2006;
WOODFORD et al., 2006).
Além das aplicações na área de diagnóstico, técnicas moleculares baseadas
na PCR têm sido aplicadas também para fins taxonômicos, tais como o ARDRA-
PCR (Polymerase chain reaction - Amplified ribosomal DNA restriction analysis).
Este método consiste da amplificação por PCR do DNA ribossomal, em seguida o
produto amplificado é digerido com uma enzima de restrição e o resultado é
observado em gel. Até o momento, cinco enzimas (CFOI, AluI, Mbol, RsaI e MspI)
têm sido as mais utilizadas em análises por ARDRA-PCR para a diferenciação das
linhagens de Acinetobacter spp. Padrões de restrição são examinados visualmente e
comparados com uma biblioteca de perfis de estirpes de referência das espécies
descritas (NEMEC et al., 2009). Ressalta-se que, a análise de restrição da região do
DNA ribossomal amplificado tem sido muito utilizada para estudos da diversidade
genética intraespécie para diferentes micro-organismos.
17
O valor do método ARDRA-PCR está na sua rapidez e capacidade para
avaliar diferenças entre grupos filogenéticos, efetuando análises em vários níveis de
classificação, inclusive em estudos de evolução, gerando novos marcadores para
estudos de genética de populações (JORGENSEN; CLUSTER, 1989). Além disso,
os resultados obtidos por ARDRA-PCR com um grande número de linhagens
bacterianas de diferentes espécies têm demonstrado uma boa correlação com
aqueles obtidos pela técnica de hibridização, considerada padrão ouro para a
classificação taxonômica de vários micro-organismos, incluindo os pertencentes ao
gênero Acinetobacter (DIJKSHOORN et al., 1998; JAWAD et al., 1998a).
Neste cenário, e devido ao aumento no número de infecções hospitalares
causadas por diferentes espécies de Acinetobacter, é de suma importância a
identificação rápida e correta da espécie infectante, bem como o conhecimento do
perfil de resistência dos isolados frente aos antimicrobianos β-lactâmicos,
especialmente os carbapenêmicos, considerados as drogas de escolha para o
tratamento de infecções causadas por bactérias que expressam β-lactamases de
amplo espectro.
A identificação das espécies de Acinetobacter é fundamental a fim de se
averiguar se as linhagens epidemiologicamente relacionadas são também
geneticamente relacionadas. Além disso, o conhecimento do perfil de resistência das
linhagens deste micro-organismo que estão circulando no ambiente hospitalar
poderá ajudar os profissionais de saúde na escolha de antimicrobianos mais efetivos
na prática clínica.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
A história do gênero Acinetobacter teve início em 1911 quando Beijerinck, um
microbiologista holandês, utilizando meio mínimo enriquecido com acetato de cálcio,
isolou este micro-organismo a partir do solo, denominando-o de Micrococcus
calcoaceticus. Nas décadas seguintes vários micro-organismos similares foram
descritos. Em 1954, Brisou e Prevot, propuseram a formação do gênero
Acinetobacter (oriundo do grego akinetos, não móveis) para separar as bactérias
imóveis daquelas que apresentam motilidade e pertencentes ao gênero
“Achromobacter”. Baumann et al. (1968), propôs que diversas bactérias oxidase-
negativas classificadas no grupo Moraxella na verdade pertenciam ao gênero
Acinetobacter e que a subclassificação em espécies baseada em características
fenotípicas era impossível.
No ano de 1971, o gênero Acinetobacter foi oficialmente reconhecido pelo
Subcomitê em Taxonomia de Moraxella e outras bactérias afins (PELEG; SEIFERT;
PATERSON, 2008). Em 1974, este gênero foi listado pela primeira vez no Manual
Bergey de Bacteriologia Sistemática e a linhagem A. calcoaceticus foi considerada a
cepa padrão para o gênero e espécie. Posteriormente, Bouvet e Grimont (1986),
baseados em estudos de hibridização DNA-DNA, descreveram 12 genoespécies de
Acinetobacter, que podiam ser diferenciadas por vinte e oito testes fenotípicos,
algumas destas receberam denominação: Acinetobacter calcoaceticus, A. lwofii, A.
haemolyticus, A. baumannii, A. johnsonii e A. junii. Posteriormente foram incluídas
mais espécies genômicas a este esquema, pois apesar dos diversos estudos de
hibridização já realizados, sempre surgem novas variedades não classificadas
sugerindo que a variedade deste gênero vai além dos grupos já descritos (NEMEC
et al., 2001).
Atualmente, o gênero Acinetobacter compreende 34 espécies com
denominações formalmente definidas (Tabela 1) (KIM et al., 2014). O gênero
Acinetobacter apresenta uma grande diversidade que pode ser observada pela
variedade de grupos fenotípicos e de grupos de DNA homólogos que têm sido
definidos (LUIZ, 2006; POIREL et al., 2010).
19
Tabela 1 – Lista de espécies do gênero Acinetobacter com nomes válidos
A. baumannii A. brisouii A. junii A. schindleri
A. nosocomialis A. gerneri A. kookii A. soli
A. pittii A. grimontii A. lwoffii A. tandoii
A. calcoaceticus A. guillouiae A. nectaris A. tjernbergiae
A. baylyi A. gyllenbergii A. parvus A. towneri
A. beijerinckii A. haemolyticus A. puyangensis A. ursingii
A. bereziniae A. harbinensis A. qingfengensis A. venetianus
A. boissieri A. indicus A. radioresistens
A. bouvetii A. johnsonii A. rudis
Fonte: Adaptada de Kim et al. (2014)
As espécies A. calcoaceticus, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A.
genoespécie 13TU são intimamente relacionadas sendo difícil diferenciá-las através
das suas características fenotípicas. Assim, em 1992, foi proposto o agrupamento
dessas espécies no complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
(ACB) (GERNER-SMIDT; TJERNBERG; URSING, 1991; GERNER-SMIDT, 1992).
Ou seja, o conhecimento da biologia e ecologia das espécies deste gênero
bacteriano ainda é limitado, isso porque a identificação em nível de espécie também
é limitada (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Por outro lado, o sistema de
identificação fenotípica, composto por diferentes testes bioquímicos (biotipagem),
padrões de susceptibilidade a antimicrobianos, reações sorologias, tipagem de fagos
e de perfis de proteínas tem sido amplamente utilizados, mas alguns estudos têm
mostrado que este esquema não cobre a variabilidade genômica de todas as
espécies do gênero Acinetobacter (GERNER-SMIDT; TJERNBERG; URSING, 1991;
VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Estes métodos têm sido gradativamente
substituídos por métodos moleculares (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008).
2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO GÊNERO Acinetobacter
As espécies do gênero Acinetobacter são morfologicamente do tipo coco
bacilos, gram-negativos, pleomórficos, aeróbios estritos, não fermentadores de
açúcares, imóveis, oxidase-negativos e catalase positivos que pertencem à família
Moraxellaceae. Podem ser cultivadas in vitro em meios comumente utilizados na
20
rotina dos laboratórios onde formam colônias planas, por vezes mucóides de
coloração branco-acinzentada com diâmetro de 1,5 a 3mm em temperatura de 37ºC
e que apresentam um conteúdo de G + C em seu DNA de 39% a 47% (PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008).
O número de genes, nas espécies já sequenciadas de Acinetobacter, varia de
3690 em A. baumannii a 2874 em A. radioresistens. As espécies que formam o
complexo A. calcoaceticus-A.baumannii possuem os maiores genomas (3.94Mb) e
estão mais intimamente relacionadas, já A. radioresistens possui o menor genoma
(3.16Mb) (PELEG et al., 2012; SAHL et al., 2013). A filogenia do sequenciamento do
gene 16S rRNA demonstrou que A. radioresistens é o clado mais basal entre
Acinetobacter spp., previamente sequenciadas (SAHL et al., 2013).
As espécies pertencentes a este gênero apresentam uma elevada
versatilidade nutricional e metabólica adaptando-se facilmente a diferentes
ambientes, assim, são amplamente distribuídas na natureza e encontradas em água,
solo, lama, vegetais, fezes animais e colonizando a pele humana sendo geralmente
consideradas não patogênicas em indivíduos saudáveis (BERLAU et al., 1999;
DIJKSHOORN et al., 2005). Algumas linhagens são isoladas de alimentos e outras
são capazes de sobreviver em diversos equipamentos médicos e até mesmo na pele
humana saudável (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011). Além disso, este agente pode
sobreviver em condições ambientais adversas tais como a dessecação, soluções
desinfetantes e variações de temperatura, podendo ser encontrado no ambiente
hospitalar em equipamentos de diálise, ventiladores mecânicos, no sistema de
ventilação, nas fontes de água, nas preparações medicamentosas e em
desinfetantes (McDONALD et al., 1998; GUSTEN et al., 2002; LANDMAN et al.,
2002; BERNARDS et al., 2004). Devido a sua capacidade de sobreviver em diversas
superfícies (úmidas e secas) tornaram-se importantes fontes de infecção no
ambiente hospitalar para pacientes debilitados (YABUMOTO; OLIVEIRA, 2011).
Algumas espécies do gênero Acinetobacter são clinicamente mais
importantes do que outras, talvez isso seja explicado pela presença de determinados
genes apenas em espécies patogênicas e ausentes nas demais. Peleg et al. (2012)
identificaram 51 genes, incluindo 12 supostos operons, presentes apenas em
linhagens patogênicas de A. baumannii, A. pittii e A. nosocomiallis. Um desses
operons é o csu que inclui os genes CsuA/BABCDE e codifica proteínas envolvidas
21
em uma chaperona que parece ser importante na montagem do pilli, aderência a
superfícies abióticas e formação de biofilme (PELEG et al., 2012).
A espécie A. baumannii é considerada clinicamente a mais importante e com
o maior número de surtos e relatos de multirresistência aos antimicrobianos. Esta
espécie é o segundo bacilo Gram-negativo não fermentador mais prevalente em
infecções hospitalares, sendo superado apenas pelo gênero Pseudomonas
(DIJKSHOORN et al., 2007; PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Na grande
maioria das infecções causadas por este patógeno, o tratamento é difícil de ser
realizado devido à expressão do fenótipo de resistência às várias classes de
antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos, o que se torna uma grande
preocupação pela falta de terapias eficazes e assim uma urgência clínica e
epidemiológica global (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Recentemente, como
consequência do desenvolvimento das técnicas de identificação laboratoriais, A. pittii
e A. nosocomialis também emergiram como espécies clinicamente importantes, com
cada vez mais relatos de surtos e resistência aos antibióticos (PELEG et al., 2012).
As genoespécies do complexo ACB diferem nas suas características
biológicas e patogênicas, por exemplo, A. calcoaceticus é considerado um patógeno
ambiental sendo raramente apontado como causa de doenças graves, foi observada
também diferenças entre as genoespécies na sua capacidade de colonizar a pele
humana, susceptibilidade a antimicrobianos e mecanismos de resistência
(TJERNBERG, 1990; GERNER-SMIDT, 1992; SEIFERT et al., 1997; BERLAU et al.,
1999; RIBERA et al., 2004; LIM; SHIN; KIM, 2007; KO et al., 2008; PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008; SHENG et al., 2009).
As espécies A. lwoffii, A. ursingii e A. parvus são regularmente encontradas
em isolados clínicos e estão associadas a infecções mais graves, sendo
considerados patógenos emergentes. Outras espécies como A. johnsonii e A.
radioresistens foram identificadas apenas como colonizadoras da pele humana ou
raramente causando doenças em humanos. Até o momento, segundo a literatura, a
espécie A. calcoaceticus ainda não foi identificada como causador de doenças
humanas graves (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; TURTON et al., 2010).
Alguns fatores de virulência que permitem a sobrevivência e adaptação de
Acinetobacter spp., no ambiente hospitalar são a sua habilidade em captar o ferro do
meio ambiente, resistência à dessecação, produção de uma cápsula polissacarídica
em algumas linhagens e a capacidade de aderir a diferentes superfícies pela
22
formação de biofilmes e aderência às células do epitélio respiratório através de pili
(FOURNIER; RICHET, 2006; LEE et al., 2006).
2.2 PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA
As bactérias pertencentes ao gênero Acinetobacter causam, principalmente,
infecções oportunistas em pacientes críticos internados em UTI (DIJKSHOORN;
NEMEC; SEIFERT, 2007). No passado estas espécies eram consideradas
organismos de baixa virulência (JOLY-GUILLOU, 2005). Apesar da grande
quantidade de estudos envolvendo as espécies do gênero Acinetobacter, pouco se
sabe sobre o seu verdadeiro potencial patogênico e fatores de virulência (HOWARD
et al., 2012).
O maior número de isolados obtidos de secreção respiratória e urina
demonstra que a colonização é mais comum do que a infecção, isto enfatiza
também que a patogenicidade dessas espécies é baixa, no entanto, uma vez
desenvolvida a infecção esta pode ser grave. Tem sido observado que a maioria das
infecções envolve órgãos com elevada quantidade de fluido, como o trato
respiratório e urinário, mas também no peritônio. O acúmulo de fluido peritoneal
pode estar associado aos dispositivos de longa permanência (FOURNIER; RICHET,
2006; DIJKSHOORN; NEMEC; SEIFERT, 2007).
Ao contrário de muitas bactérias Gram-negativas que não resistem à
dessecação e não sobrevivem em ambiente seco, os membros do gênero
Acinetobacter, principalmente A. baumannii, podem sobreviver em ambiente
inanimado por longos períodos de tempo, o que contribui para a sua permanência e
transmissibilidade em ambiente hospitalar (BEGGS et al., 2006).
A capacidade que as espécies de Acinetobacter apresentam de sobreviver
em superfícies secas e na pele é uma característica importante na sua
epidemiologia. Essa resistência à dessecação pode explicar também o motivo de
espécies que apresentam uma baixa resistência como A. johnsonii, A. junii e A.
lwoffii não serem comumente relacionadas a surtos hospitalares, ao contrário do que
acontece com A. baumannii que, devido a sua patogenicidade e capacidade de
sobreviver em superfícies secas, é a espécie mais importante do gênero sendo
responsável por cerca de 80% dos surtos hospitalares (FORSTER et al., 1998;
AYGUN et al., 2002; BEGGS et al., 2006). Foi demonstrado por Jawad et al. (1998b)
23
que A. baumanni é capaz de sobreviver por uma média de 27 dias em ambiente com
umidade relativa de 31%. Um estudo realizado por Wendt et al. (1997) mostrou que
linhagens de A. baumannii isoladas de fontes secas (fronhas e bancada de trabalho)
apresentaram maiores taxas de sobrevivência do que as linhagens isoladas de
fontes molhadas (urina e esgoto). Alguns isolados de Acinetobacter podem
sobreviver por mais de quatro meses sob condições secas. Essa característica
parece estar mais relacionada com a linhagem do que com a espécie (WENDT et al.,
1997).
Outros fatores de virulência implicados no sucesso do estabelecimento de
infecções em algumas espécies de Acinetobacter, principalmente A. baumannii, são
a formação de biofilme e a capacidade de aderência às células epiteliais,
consideradas uma etapa essencial e o primeiro passo na colonização do hospedeiro
(BEACHEY, 1981).
O biofilme é constituído de comunidades microbianas caracterizadas por
células ligadas, irreversivelmente, a um substrato e incorporadas em uma matriz
polimérica extracelular produzida por elas próprias. A formação de biofilme parece
ser uma característica patogênica importante principalmente na pneumonia
associada à ventilação mecânica e infecções intravasculares (COSTERTON;
STEWART; GREENBERG, 1999). Um estudo realizado por Lee et al. (2008)
demonstrou uma alta capacidade de linhagens de A. baumannii em formar biofilme e
aderir a células epiteliais do trato respiratório. Essa característica juntamente com a
resistência a vários antimicrobianos podem contribuir para a sobrevivência e
disseminação desse micro-organismo no ambiente hospitalar. Gurung et al. (2013),
utilizando o método do teste em tubo, demonstraram que 50% dos isolados de A.
baumannii foram produtores de biofilme, além disso, a resistência a amicacina,
ceftazidima, ciprofloxacino, ceftriaxona e ofloxacino foi maior nos isolados
produtores do que nos isolados não produtores de biofilme. Assim, a formação de
biofilme é importante na patogênese de algumas infecções causadas por A.
baumannii (RODRÍGUEZ-BAÑO et al., 2008).
A proteína associada ao biofilme (Bap) é um componente essencial na
formação e maturação do biofilme em diversas superfícies, incluindo as encontradas
em ambiente hospitalar. Esta proteína, encontrada em A. baumannii, parece
contribuir para a aderência às células eucarióticas devido a sua propensão em
aumentar a hidrofobicidade da superfície da bactéria (BROSSARD; CAMPAGNARI,
24
2012). A formação de biofilme por A. baumannii permite o seu crescimento em
condições e ambientes desfavoráveis (HOWARD, 2012).
Outro importante fator de virulência de A. baumannii é a proteína de
membrana externa (OMP). Um estudo realizado por Choi et al. (2005) demonstrou
que a Omp38 é uma potente citotoxina que induz a apoptose em células epiteliais
nas infecções causadas por este micro-organismo. Esta apoptose pode romper a
mucosa e permitir o acesso das bactérias ou dos produtos bacterianos para os
tecidos profundos (CHOI et al., 2005).
Nos últimos anos, as fosfolipases C e D têm sido consideradas importantes
fatores de virulência em A. baumannii. A fosfolipase D permite que essa bactéria
sobreviva no soro humano e invada células epiteliais pulmonares, já a fosfolipase C
aumenta a toxicidade para células epiteliais (CARMARENA et al., 2010; JACOBS et
al., 2010).
2.2.1 Mecanismos de resistência a antimicrobianos
A resistência antimicrobiana é um problema crescente percebido desde o
início do uso dos primeiros antimicrobianos e reflete a seleção Darwiniana, uma vez
que essas drogas matam ou impedem o crescimento das bactérias suscetíveis, mas
permitem a sobrevivência e multiplicação das linhagens bacterianas resistentes
(LIVERMORE; DUDLEY, 2000; TENOVER, 2006).
Apesar da resistência a antimicrobianos não ser um fato novo, o número e a
amplitude de micro-organismos resistentes, juntamente com a grande quantidade de
localizações geográficas atingidas, é algo alarmante e sem precedentes (LEVY;
MARSHALL, 2004).
Nas últimas décadas, o uso indiscriminado de antimicrobianos e de
quimioterápicos tem exercido uma pressão seletiva sobre vários gêneros de micro-
organismos levando ao surgimento de espécies resistentes ou até mesmo
multirresistentes. Atualmente, observa-se que um grande número de espécies tem
desenvolvido resistência à maioria dos antimicrobianos convencionais (PERES-
BOTA et al., 2003; PITTET, 2005; DEPARDIEU et al., 2007).
Alguns micro-organismos podem utilizar várias formas para escapar da ação
letal de um determinado antimicrobiano, tais como: (i) diminuição do acúmulo
intracelular da droga, alteração da permeabilidade da membrana externa e ativação
25
da bomba de efluxo; (ii) alteração do sítio de ação da droga e (iii) degradação
enzimática da droga, este é o principal e mais frequente mecanismo de resistência.
A existência de vários destes mecanismos no mesmo micro-organismo pode explicar
a multirresistência (DEPARDIEU et al., 2007).
As bactérias podem apresentar mecanismos de resistência intrínsecos ou
extrínsecos (adquiridos). Os intrínsecos são naturais da espécie, como por exemplo,
sistemas de efluxo e β-lactamases do tipo AmpC. Os adquiridos estão relacionados
a mutações cromossomais ou aquisição de genes de resistência de outros micro-
organismos através da transferência horizontal. Essa transferência é o principal
mecanismo de disseminação de resistência bacteriana e pode ocorrer por
transformação, transdução ou conjugação. Os genes de resistência podem ainda,
ser incorporados ao cromossomo por recombinação (DZIDIC; SUSKOVIC; KOS,
2008).
A seleção e vantagens adquiridas pelas linhagens resistentes; a transferência
e disseminação de genes de resistência entre as bactérias através de plasmídeos,
transposons e integrons; e a propagação epidêmica dos isolados resistentes entre
pacientes, hospitais e países são fatores que contribuem para o aumento da
resistência. A relativa importância desses processos varia de acordo o patógeno e o
antimicrobiano (LIVERMORE; DUDLEY, 2000).
Nos últimos anos têm aumentado os relatos de casos de infecções
hospitalares causadas por linhagens multirresistentes de Acinetobacter. O termo
multirresistente não apresenta uma definição padrão, geralmente é utilizado na
caracterização de isolados resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos
usados em tratamentos (PEREZ et al., 2007).
Até o início da década de 70 as infecções causadas por A. baumannii eram
tratadas com sucesso com ampicilina, gentamicina, ácido nalidíxico ou minociclina. A
partir de 1975 vários surtos demonstraram o aumento da resistência em isolados
clínicos das espécies de Acinetobacter (BERGOGNE-BÉRÉZIN; TOWNER, 1996).
Atualmente uma elevada proporção de linhagens pertencentes a este gênero tornou-
se clinicamente resistente à maioria dos antibióticos utilizados na clínica. Uma das
características mais alarmantes desse patógeno é a sua capacidade de desenvolver
resistência a todos os antimicrobianos disponíveis, incluindo os carbapenêmicos que
são considerados agentes antimicrobianos de escolha no tratamento de infecções
graves causadas por este micro-organismo (POIREL; NORDMANN, 2006;
26
GARNACHO-MONTERO; AMAYA-VILLAR, 2010). O rápido surgimento de linhagens
de A. baumannii com esta característica demonstra a capacidade que esse micro-
organismo possui em responder rapidamente às pressões seletivas do ambiente
(PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008).
Os carbapenêmicos pertencem à classe dos antimicrobianos β-lactâmicos de
amplo espectro derivados da tienamicina, possuem estabilidade frente à maioria das
beta-lactamases de amplo espectro (ESBL), por isso são utilizados no tratamento de
infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes (RODLOFF;
GOLDSTEINM; TORRES, 2006). No entanto, a elevação dos índices de resistência
a estes antimicrobianos tem sido observada em todo o mundo, inclusive no Brasil,
isto representa um sério problema, uma vez que, os carbapenêmicos são
considerados um dos últimos recursos para o tratamento de infecções causadas por
isolados multirresistentes (WALSH et al., 2002). Assim, para o tratamento das
infecções causadas por Acinetobacter spp., resistentes aos carbapenêmicos restam
apenas antibióticos potencialmente mais tóxicos, como a polimixina ou ampicilina-
sulbactam para o qual muitos isolados já são resistentes (GALES et al., 2003).
A resistência aos β-lactâmicos está associada a uma variedade de
mecanismos que incluem β-lactamases, diminuição da permeabilidade de
membrana devido à perda ou redução na expressão de porinas, alteração nas
proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) e superexpressão de bombas de efluxo. A
combinação de vários destes mecanismos pode estar presente no mesmo micro-
organimo (CLARK, 1996; FERNÁNDEZ-CUENCA et al., 2003). No entanto, o
mecanismo mais comum de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, em A.
baumannii, é a presença de β-lactamases que são enzimas capazes de hidrolisar o
anel β-lactâmico, transformando os antibióticos correspondentes em produtos
inativos (ZARRILLI et al., 2009). Em especial, as β-lactamases da classe B de
Ambler (também denominadas de metalo-β-lactamases, MBLs) e da classe D de
Ambler (OXA-carbapenemases), têm sido identificadas mundialmente em isolados
de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. (AFZAL-SHAH; WOODFORD;
LIVERMORE, 2001; NAAS et al., 2005).
27
2.2.2 Produção de β-Lactamases
As β-Lactamases são enzimas que protegem as bactérias da ação letal dos
antibióticos β-lactâmicos (MEDEIROS, 1997). A sua produção é o principal e mais
comum mecanismo de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. Uma vez que,
as penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos são os antimicrobianos mais
utilizados no tratamento de várias infecções, a presença de tais enzimas
desempenha um papel fundamental na escolha do melhor tratamento (BUSH;
JACOBY, 2010). As β-lactamases são consideradas também o mais diverso grupo
de enzimas relacionadas à resistência em bactérias Gram-negativas. Mais de
cinquenta diferentes tipos já foram identificados em A. baumannii (DIJKSHOORN;
NEMEC; SEIFERT, 2007).
A classificação das β-lactamases pode ser feita de acordo com suas
propriedades funcionais (classificação de Bush) ou características moleculares
(classificação de Ambler). A classificação de Ambler foi feita de acordo com a
homologia de aminoácidos e resultou em quatro classes (A, B, C, D), as enzimas
pertencentes às classes moleculares A, C e D possuem serina no seu sítio ativo, já
as pertencentes à classe B são metalo-β-lactamases e possuem zinco no seu sítio
ativo. A classificação de Bush foi feita baseada no grupo específico de substrato e
perfil de inibição em uma tentativa de agrupar essas enzimas de acordo com o seu
fenótipo em isolados clínicos (AMBLER, 1980; BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995;
BUSH; JACOBY, 2010).
As carbapenemases são β-lactamases que possuem a peculiar capacidade
de hidrolisar os mais potentes β-lactâmicos, os carbapenêmicos, sendo
responsáveis pelo aumento da concentração inibitória mínima (CIM) detectada em
ensaios de susceptibilidade (QUEENAN; BUSH, 2007; POIREL; PITOUT;
NORDMANN, 2007).
2.2.2.1 β-Lactamases do tipo OXA
As OXA-carbapenemases são enzimas pertencentes à classe D de Ambler
(CHDLs) e têm sido consideradas mundialmente como as mais comuns, sendo o
principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos em espécies de
Acinetobacter (BROWN; AMYES, 2006; POIREL; NAAS; NORDMANN, 2010). Essas
28
enzimas são codificadas pelos genes blaOXA e podem ser classificadas em oito sub-
grupos dos quais OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58 e OXA-143 já foram
identificados em A. baumannii (HIGGINS et al., 2009; HIGGINS et al., 2010a). As
enzimas do tipo OXA que apresentam um elevado grau de similaridade genética são
agrupadas no mesmo subgrupo. Essa classificação foi feita de acordo com a
identidade entre as sequências de aminoácidos das variantes dessas enzimas
(BROWN; AMYES, 2006; FEIZABADI et al., 2008). A denominação dessas enzimas
se deve ao fato de hidrolisarem a oxacilina mais eficientemente do que as
benzilpenicilinas. As oxacilinases hidrolisam também a meticilina, amoxicilina,
cefaloridina e, até certo ponto, cefalotina. Apenas algumas destas enzimas
hidrolisam as cefalosporinas de amplo espectro, já a propriedade de hidrolisar os
carbapenêmicos parece ser intrínseca a elas (POIREL; NORDMANN, 2006).
A eficiência hidrolítica das oxacilinases contra os carbapenêmicos é menor do
que a capacidade das MBLs, porém foi demonstrado que as enzimas do tipo OXA
podem ser superexpressadas quando associadas com elementos móveis como o
ISAba1 resultando na diminuição da suscetibilidade a estes antimicrobianos
(POIREL; NORDMANN, 2006; TURTON et al., 2006a). Essas enzimas são
resistentes a inibição por clavulanato e tazobactam (POIREL; NORDMANN, 2006).
É elevada a incidência das linhagens bacterianas resistentes aos
carbapenêmicos associadas às oxacilinases, essas linhagens estão relacionadas a
surtos infecciosos e contribuem para o óbito dos pacientes (BROWN; AMYES,
2006). A grande maioria das oxacilinases tem sido descobertas em A. baumannii
(QUEENAN; BUSH, 2007).
O mecanismo de ação das oxacilinases se inicia pela ligação não covalente
da enzima ao antibiótico formando um complexo intermediário. Em seguida o anel β-
lactâmico é atacado pelo grupo hidroxila ligado ao resíduo de serina do sítio ativo da
enzima formando um grupo acil-éster. A hidrólise desse éster resulta na liberação da
droga inativa (LIVERMORE, 1995).
A primeira oxacilinase foi identificada em um isolado clínico de A. baumannii
em 1985 na Escócia. Esta enzima, que é codificada por plasmídeo, foi inicialmente
denominada ARI-1. Posteriormente, com o sequenciamento do seu gene, a enzima
recebeu o nome de OXA-23 (PATON et al., 1993; SCAIFE et al., 1995; DONALD et
al., 2000).
29
Outras enzimas fazem parte do sub-grupo da OXA-23, tais como: OXA-27 e
OXA-49, ambas identificadas em isolados de A. baumannii, a primeira em Singapura
e a segunda na China (AFZAL-SHAH; WOODFORD; LIVERMORE, 2001; POIREL;
NORDMANN, 2006). Entre as oxacilinases, as variantes que fazem parte do sub-
grupo da OXA-23 têm sido detectadas em todo o mundo e são apontadas como as
carbapenemases predominantes em espécies de Acinetobacter de muitas regiões
geográficas (CORRÊA et al., 2012). No Brasil, o primeiro relato de linhagens de A.
baumannii produtoras dessa enzima foi em um trabalho realizado por Dalla-Costa et
al. (2003) na cidade de Curitiba-PR. Depois, outros relatos de isolados clínicos de
espécies de Acinetobacter produtores de OXA-23 foram feitos em Porto Alegre-RS,
Rio de Janeiro-RJ, Niterói-RJ, São Paulo-SP, Belo Horizonte-MG, Blumenau-SC e
São Luís-MA (CARVALHO et al., 2009; FURTADO et al., 2011).
Poirel et al. (2008) identificaram o gene blaOXA-23 em cinco isolados de A.
radioresistens sensíveis aos carbapenêmicos, esta espécie apresenta uma baixa
virulência e é considerada comensal da pele de indivíduos saudáveis. Os autores
sugerem que esta espécie é a progenitora dos genes blaOXA-23 que estão surgindo
como fontes de resistência a estes antimicrobianos em A. baumannii de todo o
mundo. A disseminação deste gene pode estar associado com elementos de
inserção, como ISAba1 (POIREL et al., 2008).
O segundo grupo de oxacilinase é representado pelo sub-grupo OXA-24 que
apresenta cerca de 60% de similaridade com o sub-grupo OXA-23. Esta enzima foi
identificada em isolados multirresistentes de A. baumannii e tem sido descrita como
endêmica na Espanha onde é responsável por vários surtos (BOU et al., 2000;
ACOSTA et al., 2011; TENA et al., 2013).
Dados da literatura têm mostrado que a enzima OXA-51 é encontrada em
todos os isolados de A. baumannii e parece ser um componente intrínseco desta
espécie, sugerem também que a detecção do gene blaOXA-51 pode ser usado como
um método simples e confiável para a identificação dessa espécie (TURTON, 2006b;
MOROVAT et al., 2009; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012).
O sub-grupo da enzima OXA-58 apresenta 59% de similaridade com o sub-
grupo de OXA-51 e menos de 50% de identidade com as outras oxacilinases
(POIREL; NORDMANN, 2006). Esta enzima foi primeiramente identificada em um
isolado de A. baumannii resistente aos carbapenêmicos em Tolouse, França
(POIREL et al., 2005). Atualmente já foi demonstrado a sua ocorrência em vários
30
países como Argentina, Kuwait, Reino Unido e Grécia demonstrando a ampla
distribuição desse gene (COELHO et al., 2006; POURNARAS et al., 2006). No Brasil
o gene blaOXA-58 foi identificado no Rio de Janeiro, Niterói e São Paulo (ANTONIO et
al, 2011; FIGUEIREDO et al, 2011; GUSATTI et al., 2012).
A disseminação dos genes blaOXA em espécies de Acinetobacter é uma
preocupação crescente uma vez que, as linhagens que possuem estes genes,
apresentam resistência a quase todos os antibióticos com exceção das polimixinas e
tigeciclina (COELHO et al., 2006).
2.3 MÉTODOS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
TAXONÔMICA DO GÊNERO Acinetobacter
Devido às limitações apresentadas pelos métodos fenotípicos utizados na
rotina de identificação e diferenciação das espécies do gênero Acinetobacter, uma
variedade de métodos genotípicos têm sido explorados e aplicados para investigar a
diversidade ou filogenia deste micro-organismo (VANEECHOUTTE; DE BAERE,
2007). Entre estes métodos pode-se citar: (1) DNA “fingerprinting” como AFLP
(polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados) que se baseia na
amplificação seletiva por PCR de um subconjunto de fragmentos derivados da
digestão total do DNA genômico pelo uso de uma combinação de enzimas de corte
raro e de corte frequente que clivam a molécula em sítios específicos. A técnica
envolve três passos: (i) restrição do DNA genômico e ligação a iniciadores
adaptadores, (ii) amplificação seletiva de conjuntos de fragmentos da restrição
enzimática e, (iii) a análise em gel dos fragmentos amplificados (VOS et al.,1995). As
técnicas que utilizam a PCR seguida de hibridização apresentam algumas limitações
tais como: requerem o isolamento do agente; o perfil gerado depende da qualidade
do DNA isolado; a disponibilidade de sondas preparadas a partir do DNA de cada
espécie dificulta ou impossibilita a detecção de espécies mais distanciadas
filogeneticamente; a utilização de sondas marcadas radioativamente e a
necessidade de utilização de estrutura laboratorial mais complexa. Por isso, essas
técnicas são difíceis de ser padronizadas (MEYER et al., 1995); (2) Polimorfismo de
tamanho do fragmento de restrição (RFLP) é um método fácil de executar e tem sido
utilizado para fins filogenéticos e taxonômicos. Por esta abordagem, sequências
conservadas (DNA ribossomal 16-23s, gene recA e da região intergênica
31
espassadora 16S-23S e etc.) são amplificadas por PCR e os produtos amplificados
são digeridos com uma ou várias enzimas de restrição. Os fragmentos da digestão
enzimática são separados por eletroforese em géis de agarose ou de poliacrilamida
e os padrões de restrição podem ser utilizados para criar uma biblioteca de
identificação (DIJKSHOORN; NEMEC, 2008) e (3) o sequenciamento completo do
gene 16s rRNA (de aproximadamente 1500pb) tem sido utilizada para a
diferenciação de Acinetobacter, entretanto, o sucesso deste método depende da
padronização de um método de identificação das espécies, uma vez que o
sequenciamento poderá fornecer dados sobre a diversidade e relações filogenéticas
intraespécies (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007).
Ressalta-se que, apesar de diversos métodos já terem sido avaliados para a
identificação genotípica de Acinetobacter spp., apenas o sequenciamento da região
16S-23 ITS tem sido considerado o padrão ouro para a diferenciação entre as
espécies que formam o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii. Entretanto, o
sequenciamento é um método caro e ainda não disponível em laboratórios de rotina,
ficando ainda restrito aos laboratórios de pesquisa (PELEG; SEIFERT; PATERSON,
2008).
Por outro lado, a técnica de mPCR tem sido utilizada para detectar a
presença de diferentes genes de resistência a diferentes antimicrobianos, em
especial aos β-lactâmicos do tipo OXA. Tem sido preconizado na literatura que a
presença do gene blaOXA-51 pode ser usado como um método simples e confiável
para a identificação da espécie A. baumannii. Segundo Mostachio et al. (2009) a
mPCR apresenta resultados consistentes com os da PCR tradicional, sendo assim,
uma ferramenta útil para a detecção de genes que codificam as oxacilinases.
A proposta de utilizar o ARDRA-PCR se deve ao fato de ser uma técnica
simples, de fácil execução e que não necessita de equipamentos caros e
especializados. A grande vantagem da utilização deste método é o uso de DNA da
região que codifica o gene 16s rRNA, considerada conservada entre as bactérias,
mas que, ao mesmo tempo, apresenta variabilidade e quantidade de informações
suficientes que podem revelar, claramente, as relações filogenéticas entre as
espécies de Acinetobacter (VANEECHOUTTE; DE BAERE, 2007). Assim, o ARDRA-
PCR poderá se constituir em um método extremamente útil para a identificação e
diferenciação entre as espécies de Acinetobacter oriundas de amostras clínicas.
Pelas vantagens apresentadas acima, neste trabalho a eficiência da técnica de
32
ARDRA-PCR será avaliada em função da detecção e diferenciação de Acinetobacter
spp., em isolados clínicos de pacientes internados em diferentes hospitais públicos e
privados de São Luis-Maranhão.
33
3 JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos tem havido um aumento significativo no número de
infecções hospitalares causadas por diferentes espécies do gênero Acinetobacter
mostrando que este micro-organismo é um grave problema de saúde pública em
todo o mundo. Estudos epidemiológicos têm demonstrado a necessidade da
utilização de técnicas capazes de distinguir as espécies que fazem parte do
complexo A. calcoaceticus-A. baumannii, porque estas são as mais envolvidas em
infecções humanas.
A identificação das espécies circulantes de Acinetobacter é de fundamental
importância epidemiológica a fim de se averiguar se as linhagens
epidemiologicamente relacionadas são também geneticamente relacionadas. A
análise clonal deste patógeno poderá auxiliar na identificação da fonte (ambiental ou
pessoal) dos isolados e na distinção de linhagens com potencial infeccioso.
Por outro lado, a demonstração do perfil de resistência das linhagens
circulantes em pacientes hospitalizados poderá influenciar na tomada de decisões e
adoção de medidas terapêuticas mais eficazes no tratamento das infecções
hospitalares que envolvam as diferentes espécies do gênero Acinetobacter. Além
disso, a diferenciação molecular por ARDRA-PCR dessas espécies poderá contribuir
para o conhecimento da prevalência deste micro-organismo em hospitais públicos e
privados da cidade de São Luis-MA.
Neste contexto, no presente estudo foram utilizadas as técnicas de PCR
específica para a detecção do gene blaOXA-51, gene intrínseco à espécie A.
baumannii; o ensaio de mPCR para detectar a presença de diferentes genes de
resistência do tipo OXA e o ARDRA-PCR, com iniciadores especialmente
desenhados para este trabalho, para identificar e diferenciar as espécies de
Acinetobacter.
34
4 OBJETIVOS DA PESQUISA
4.1 OBJETIVO GERAL
Determinar e diferenciar, por ARDRA-PCR, as espécies de Acinetobacter em
isolados clínicos de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e privada de
São Luis-Maranhão.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o perfil de susceptibilidade dos isolados a diferentes antimicrobianos
usados na prática clínica.
Estudar a prevalência de espécies de Acinetobacter não baumannii nas
amostras clínicas dos pacientes.
Pesquisar pela técnica de Multiplex-PCR a presença de genes de resistência
às β-Lactamases do tipo oxacilinase (blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58) nos
isolados bacterianos.
Confirmar os resultados fenotípicos obtidos pela automação frente a Reação
em Cadeia pela Polimerase dos isolados pertencentes à espécie Acinetobacter
baumannii pela amplificação do gene blaOXA-51.
Avaliar a capacidade de um ensaio ARDRA-PCR em identificar e diferenciar
espécies de Acinetobacter envolvidas em infecções de pacientes procedentes de
hospitais da rede pública e privada de São Luis-Maranhão.
Averiguar pelo sequenciamento, de alguns isolados, se a técnica de ARDRA-
PCR é capaz de demonstrar se as linhagens são geneticamente relacionadas entre
si.
35
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
Em atendimento às exigências da Resolução 466/2013 do Conselho Nacional
de Saúde, que norteia a pesquisa envolvendo seres humanos, este projeto foi
submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do
CEUMA, parecer consubstanciado nº. 249.579 de 25/03/2013.
5.2 ISOLADOS BACTERIANOS
Neste estudo foram avaliados 142 isolados de Acinetobacter spp., oriundos
de 119 pacientes internados em 10 hospitais públicos (H1 a H10) e dois da rede
privada (H11 e H12) situados em São Luis – MA, no período de junho de 2012 a
junho de 2013.
Os isolados bacterianos foram provenientes dos seguintes espécimes
clínicos: secreção traqueal, swab nasal, sangue, swab anal, fragmento de ferida,
urina, líquido pleural e secreção ocular. Os setores de internação dos pacientes
foram a Unidade de Terapia Intensiva, unidade semi-intensiva, emergência, clínica
médica, unidade intermediária, centro cirúrgico, oncologia, UTI-Neo e ambulatório.
Os dados coletados dos pacientes foram idade, gênero, acomodação ou setor
de origem e sua unidade hospitalar de procedência (pública ou privada).
5.3 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS
As linhagens bacterianas foram previamente isoladas pela utilização de
Protocolos Operacionais Padrões e depois foram identificadas pelo método
automatizado Vitek® 2 (Biomerieux, França) com o cartão para identificação de
Gram negativo (GN TEST KIT VITEK II).
Todos os isolados foram submetidos ao teste de susceptibilidade aos
antimicrobianos segundo as recomendações do Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI 2014) pelo método de microdiluição em equipamento de automação
Vitek® 2 (Biomerieux, França) com o cartão AST N239. Os resultados de resistência
foram confirmados pelo método de dico difusão (Kirby-Bauer) e método
36
epsilométrico (E-test). Os antimicrobianos avaliados foram os seguintes: amicacina
(AMI), ampicilina (AMP), ampicilina/sulbactam (ASB), cefepime (CPM), cefoxitina
(CT), ceftazidima (CAZ), ciprofloxacina (CIP), gentamicina (GEN), imipenem (IMI),
meropenem (MER), piperacilina/tazobactam (TZP), polimixina B (POL) e tigeciclina
(TGC).
O Food and Drug Administration (FDA) e o CLSI ainda não estabeleceram
critérios interpretativos para Acinetobacter spp. à tigeciclina. Alguns autores
sugerem a CIM ≤ 2 μg/mL para susceptibilidade (JONES et al., 2007;
KARAGEORGOPOULOS et al., 2008).
Durante os estudos, os isolados bacterianos foram estocados em freezer a -
80ºC, no meio líquido Brain Heart Infusion BHI-DIFCO (OXOID®, Basingstoke,
ENGLAND) acrescido de 15% de glicerol. Alíquotas destes 142 isolados bacterianos
foram gentilmente cedidos pelo Laboratório Cedro, São Luis - MA. No Laboratório de
Biologia Molecular de Micro-organismos Patogênicos do UNICEUMA, os isolados
foram recuperados em placa contendo o meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar) e
incubados por um período aproximado de 16 horas a uma temperatura de 37°C em
estufa bacteriológica. Posteriormente uma colônia foi passada para o caldo TSB
(Tryptic Soy Broth) e incubada nas mesmas condições supracitadas. Uma alíquota
de 2 mL de cada cultivo foi utilizada para a extração do DNA a ser utilizado como
molde nos experimentos de biologia molecular.
5.4 ANÁLISE MOLECULAR
Os estudos de biologia molecular (extração do DNA, amplificações pela
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), digestão enzimática, detecção de genes
de resistência as oxicilinases por mPCR e análise por eletroforese dos produtos
amplificados para a identificação e diferenciação dos isolados) foram realizados no
Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos Patogênicos da Universidade
CEUMA.
5.4.1 Extração do DNA Genômico Para Amplificação
O DNA genômico dos isolados foi extraído utilizando-se o kit “Wizard®
Genomic DNA Purification Kit” (Promega®) seguindo-se o protocolo original do
37
fabricante. A concentração e a pureza do DNA extraído foram verificadas por
eletroforese em gel de agarose 0,8%, em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) [100
mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 85 mV
durante 1 hora (MANIATS; FRITCH; SAMBROOK, 1989). Após a corrida, os géis
foram corados em uma solução de brometo de etídio e água destilada (1:1000),
durante 20 minutos e observados em transiluminador ultravioleta comparando-se a
intensidade de banda com um padrão comercial de massa molecular (Mass DNA
Ladder, BioLabs New England).
5.4.2 Ensaios de PCR Para a Detecção do Gene blaOXA-51
Inicialmente, a fim de se confirmar quais isolados pertenciam a espécie A.
baumannii, o DNA de todas os isolados foi submetido à PCR específica para a
detecção do gene blaOXA-51, com o par de iniciadores previamente descritos por
Woodford et al. (2006) e mostrados na Tabela 2. Cada tubo de reação teve um
volume final de 25 µL, contendo 1 µL de cada iniciador específico (10 pmol/L),
acrescidos de 12,5 µL de PCR Master Mix - Promega® [Taq DNA polimerase
(dNTPs, MgCl2, tampão de PCR [pH 8,5]), 1,5 µL de água livre de nuclease e 3 µL
do molde DNA, correspondendo à aproximadamente 100 ng. A reação de
amplificação foi feita em termociclador Mycycler Bio rad modelo 580BR3578 sob as
seguintes condições: 94ºC por 5 minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos
de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de
extensão final a 72ºC por 7 minutos. Os produtos amplificados foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose 2%, segundo Maniats; Fritch; Sambrook (1989).
5.4.3 Desenho dos Iniciadores e Ensaios de PCR
Os ensaios de ARDRA-PCR para diferenciar as espécies de Acinetobacter
nos isolados clínicos de pacientes procedentes de hospitais da rede pública e
privada de São Luis-Maranhão foram conduzidos da seguinte forma: desenho de
iniciadores específicos e a escolha da enzima de restrição.
Para diferenciar os isolados de Acinetobacter spp., pelo método ARDRA-
PCR, inicialmente um par de iniciadores foi especialmente desenhado a partir da
região do DNA ribossomal 16S. Os iniciadores foram denominados como:
38
Acin01FW: 5’-CGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAG-3’ e Acin01RV: anti-senso:
5’-GATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACG-3’. Estes iniciadores amplificam um
fragmento de 1432 nucleotídeos que, após o processo de digestão enzimática, gera
fragmentos que permitem diferenciar as espécies de Acinetobacter. As amplificações
por PCR específica foram feitas em termociclador Mycycler Bio rad modelo
580BR3578, em um volume final de 25 µL, contendo 20 picomoles de cada iniciador
(senso e anti-senso), 12,5 μL do Master Mix PCR-kit, contendo 500 units/mL de Taq
DNA polimerase, 400 µM de dATP, dGTP, dCTP, dTTP e 3 mM de MgCl2,
(PROMEGA, MADISON - WI USA) acrescido de 2 µL de DNA molde (mais ou
menos 100 ng). A reação de amplificação seguiu as seguintes condições: 94ºC por 5
minutos (desnaturação inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por
1 minuto e 72ºC por 1 minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 7 minutos.
A fim de verificar a eficiência da PCR e determinar o tamanho do fragmento de
DNA amplificado foram aplicados em gel de agarose 1%, em torno de 5 µL do
produto da PCR acrescido de 2 µL de tampão de amostra (Blue/Orange 6X Loading
Dye, Promega, EUA). O marcador de tamanho molecular 1 Kb DNA ladder
(INVITROGEN, Life Technologies, EUA) foi usado como padrão comparativo na
interpretação dos resultados.
O gel foi submetido à eletroforese em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA)
[100 mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a
100 V durante 1 hora (MANIATIS; FRITCH; SAMBROOK, 1989). Após a
eletroforese, foi feita a coloração do gel com brometo de etídio durante 20 minutos e
em seguida foi observado em transiluminador de luz ultravioleta.
5.4.4 Escolha da Enzima de Restrição e Ensaio de ARDRA-PCR
A determinação da enzima de restrição que melhor diferenciasse os isolados
de Acinetobacter por ARDRA-PCR foi feita através de digestões in silico utilizando-
se o programa de informática NebCutter, http://tools.neb.com/NEBcutter2/. Foram
utilizadas 124 sequências da região 16S RNA ribossomal de 32 diferentes espécies
de Acinetobacter disponíveis no Genbank conforme descrito na Tabela 2.
39
Tabela 2 - Perfis ARDRA-PCR das 32 espécies de Acinetobacter constantes do Genbank utilizadas na digestão in silico e construção da matriz fenotípica para a geração do dendrograma
Espécie Bacteriana Número
Genbank
Perfil ARDRA-PCR in silico
A. baumannii NC-011595 39-94-95-146-173-175-182-222-306 A. calcoaceticus EU513394.1 74-81-95-146-175-182-222-438 A. genomosp. 13TU FJ860879.1 86-88-95-149-175-182-222-519 A. pittii HE651911.1 81-95-102-175-182-222-235-438 A. ursingii KB849719.1 81-146-175-189-404-437 A. junii HE651918.1 39-146-173-175-199-306-404 A. schindleri AJ275040.2 22-149-163-175-404-519 A. johnsonii KC904088.1 81-147-166-175-180-224-440 Acinetobacter sp. JF710649.1 76-149-151-175-404-518 Acinetobacter sp JQ039977.1 47-81-151-156-175-404-437 A. septicus EF611419.1 81-146-175-188-404-437 A. haemolyticus KC329832.1 66-81-149-169-175-181-222-438 A. lwoffii KC178575.1 146-169-175-404-519 A. bereziniae HE651922.1 81-149-175-189-404-437 A. towneri HQ180191.1 37-107-150-175-404-519 A. oleivorans NR_102814.1 81-94-95-146-175-182-222-438 A. guillouiae KC904086.1 81-148-173-175-404-437 A. gerneri HE651926.1 94-95-146-175-182-334-404 A. radioresistens GU145275.1 146-175-189-194-210-518 A. brisouii DQ832256.1 24-81-95-146-175-404-438 A. rudis
EF204258.3 13-39-81-89-151-163-173-175-181-210-225
A. antiviralis DQ314740.1 11-43-81-95-144-175-182-184-211-253 A. boissieri JQ771141.1 146-166-175-184-334-404 A. nectaris JQ771132.1 11-146-166-175-182-184-211-334 A. seohaensis AY633608.1 81-147-175-180-404-437 A. marinus AY633607.1 146-175-180-182-222-518 A. tjernbergiae HE651928.1 81-146-175-181-189-223-438 A. rhizosphaerae AY364536.1 81-146-175-187-405-438 A. kyonggiensis A. venetianus
FJ527818.1 81-111-148-175-404-438
KJ545603.1 34-39-81-112-148-173-175-195-209-228
Uncultured acinetobacter
KC011150.1 72-95-146-175-182-222-518
Uncultured acinetobacter
JQ885539.1 54-147-149-397-698
Experimentalmente, objetivando-se diferenciar entre si as espécies de
Acinetobacter que foram isoladas a partir dos espécimes clínicos, foram feitas
digestões enzimáticas do fragmento específico de 1432pb obtido por PCR para cada
um dos isolados. A enzima de restrição BfaI (INVITROGEN-BRL), previamente
40
selecionada pelo NebCutter foi usada em todas as digestões. Em cada tubo de
reação de digestão, contendo 25 μL do produto amplificado (com aproximadamente
1 μg de DNA) foi adicionado 1 Unidade da enzima BfaI, 5 μL do NEBuffer 10X, mais
1x de soro albumina bovina acetilada (INVITROGEN-BRL). Foi acrescentada água
Mili-Q estéril até completar o volume final de 50 μL. O tubo de reação foi colocado
em banho Maria a 37ºC por 1 hora e 20 minutos. Em seguida, foi colocado a 80ºC
por 20 minutos e armazenado a -20ºC até a análise eletroforética em gel de
poliacrilamida.
5.4.5 Aferição do Tamanho Molecular dos Fragmentos Gerados pelo
ARDRA-PCR e Confecção do Dendrograma
Para a análise do perfil de migração dos fragmentos gerados pela digestão
enzimática, o produto digerido foi aplicado em gel de agarose 2,5% da seguinte
forma: em uma das canaletas do gel foi aplicado o padrão de tamanho molecular,
100pb DNA Ladder (INVITROGEN-BRL). Para uma melhor interpretação dos perfis
obtidos, em uma das canaletas foi aplicado 10 μL da mesma amostra não digerida e
a seguir 10 μL do produto digerido. A eletroforese para a completa separação dos
fragmentos foi feita a 80 volts em TBE 1X por 2 horas. Após a corrida o gel foi
corado com brometo de etídio (10µg/mL) e a visualização do perfil eletroforético feita
sob luz ultravioleta e o gel fotografado. Para a confecção do dendrograma, os perfis
apresentados no gel de poliacrilamida foram medidos usando-se o programa
LabImage version 2.7.0 (Kapelan GmbH, 1999-2003). O tamanho dos fragmentos
em pares de base (pb) obtido para cada perfil apresentado no gel foram dispostos
em tabelas para a confecção da matriz fenotípica baseada na presença (1) ou
ausência (0) de cada fragmento. Para a análise do agrupamento dos fragmentos foi
utilizado o Software de taxonomia numérica e sistema de análise multivariada
(NTSYS versão 2.1, Exeter Software, New york, NY, EUA). As linhagens foram
correlacionadas entre si pela apresentação de um coeficiente de correlação de
Sorensen-Dice maior que 90 calculado pelo programa NTSYS (ROHLF, 2000).
41
5.4.6 Ensaios de Multiplex-PCR (mPCR) Para a Detecção de Genes blaOXA
A técnica de multiplex-PCR foi utilizada a fim de detectar a presença de genes
codificadores de resistência às oxacilinases (blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58)
mais frequentes em Acinetobacter spp. As reações de mPCR foram feitas em
termociclador Mycycler Bio rad modelo 580BR3578 em um volume final de 25 µL,
contendo 1 µL de cada iniciador específico (10 pmol/L) descritos na Tabela 3,
acrescidos de 12,5 µL de PCR Master Mix - Promega® [Taq DNA polimerase
(dNTPs, MgCl2, tampão de PCR [pH 8,5]), 1,5 µL de água livre de nuclease e 3 µL
do molde DNA, correspondendo à aproximadamente 100 ng de DNA. A reação de
amplificação seguiu as seguintes condições: 94ºC por 5 minutos (desnaturação
inicial) seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 62ºC por 1 minuto e 72ºC por 1
minuto e um passo de extensão final a 72ºC por 7 minutos. Os produtos da mPCR
foram mensurados em gel de agarose 2% e corado com brometo de etídio
(10µg/mL), como previamente descrito (MANIATIS; FRITCH; SAMBROOK, 1989).
Tabela 3 - Sequência de iniciadores usados para detecção por Multiplex-PCR dos genes blaOXA nos isolados de Acinetobacter spp.
Gene Tamanho
(pb)
Iniciadores
5’ -3’
Autores
Woodford et al.
(2006)
blaOXA-23 501 GATCGGATTGGAGAACCAGA
ATTTCTGACCGCATTTCCAT
blaOXA-24 246 GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA
AGTTGAGCGAAAAGGGGATT
blaOXA-51 353 TAATGCTTTGATCGGCCTTG
TGGATTGCACTTCATCTTGG
blaOXA-58 599 AAGTATTGGGGCTTGTGCTG
CCCCTCTGCGCTCTACATAC
5.5 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR DE
ALGUNS ISOLADOS
Os isolados bacterianos que deram perfis diferentes entre si, pela análise de
ARDRA-PCR, tiveram seu DNA novamente amplificado por PCR específica a fim de
se verificar por sequenciamento a eficiência da metodologia de ARDRA-PCR em
42
diferenciar os isolados de Acinetobacter spp. Além disso, foram escolhidos
aleatoriamente 24 isolados, entre aqueles que mostraram perfil ARDRA-PCR para A.
baumannii. Para tal, o fragmento específico de 1432pb, amplificado pela PCR com o
par de iniciadores desenhados para este estudo, foi purificado com o Kit comercial
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), seguindo-se as instruções
do fabricante. Após a purificação, a qualidade dos produtos foi verificada por
eletroforese em gel de agarose 1%, quantificando-se através de comparação com
um padrão de massa molecular (N3237S Mass DNA Ladder da New England
BioLabs).
O sequenciamento de cada produto purificado foi feito pelo método da
terminação da cadeia por dideoxinucleotídeos (SANGER; NICKELEN; COULSON,
1977), em ambas as direções da dupla fita (senso positivo e senso negativo) com o
“Kit ABI Prism BigDye” no sequenciador automático ABI 3130 Genétic Analyser
(Applied Biosystems). As amostras foram sequenciadas pelo menos três vezes em
cada sentido da fita perfazendo um total de seis sequências da mesma amostra.
Todos os sequenciamentos foram feitos pela empresa Myleus Biotecnologia Ltda,
sediada em Belo Horizonte-MG.
5.6 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS PARA INFERÊNCIAS
FILOGENÉTICAS
Para as análises computacionais das sequências, os eletroferogramas obtidos
durante o sequenciamento foram analisados no programa ChromasPro
(TechnelysiumPty. Ltd. http://www.technelysium.com.au/chromas.html). A
similaridade das sequências nucleotídicas obtidas foi verificada com o auxílio do
programa BLASTn do pacote BLAST 2.0 (Basic AlignmentSearch Tool –
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (ALTSCHUL et al., 1997). Para as análises
comparativas foram selecionadas aleatoriamente 32 sequências de isolados de
referências de diferentes espécies de Acinetobacter, constantes do Genbank. As
sequências foram alinhadas e analisadas pelo programa MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis, versão 5.2), http://www.megasoftware.net/. O nível
de reprodutibilidade da árvore filogenética foi garantido pela análise de bootstrap de
1000 repetições.
43
5.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS (v.18). O
desfecho representou o perfil de sensibilidade aos antibióticos testados. A variável
de exposição principal foi a detecção de genes para oxacilinases do tipo blaOXA-23,
blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58 nos isolados. As covariáveis englobaram o perfil do
paciente, origem do material coletado e espécie bacteriana.
Inicialmente foi realizada a estatística descritiva dos dados por meio de
frequência absoluta, percentual, médias e desvio padrão. As medidas de associação
diferença do risco (DR) e o teste Exato de Fisher foram utilizados para análise da
associação entre as prevalências dos genes nos isolados. A extensão de Freeman-
Halton para o teste Exato de Fisher foi utilizada para analisar a associação entre
detecção de oxacilinases nos micro-organismos isolados e o padrão de sensibilidade
aos antibióticos testados. O nível de significância adotado foi de 5% (p<0.05).
44
6 RESULTADOS
Com relação à identificação das espécies de Acinetobacter recuperados dos
espécimes clínicos, o método automatizado Vitek®2 (Biomerieux, França) identificou
138 (97.2%) isolados como sendo A. baumannii, 2 (1.4%) como A. ursingii (isolados
30 e 71) e 2 (1.4%) como A. lwoffii (isolados 126 e 142).
A média de idade dos pacientes variou de 50,03 ± 24,62 anos. A Tabela 4
mostra os dados gerais dos pacientes que foram agrupados em diferentes grupos
etários. Observou-se que a maioria tinha mais de 60 anos, representando esta faixa
etária 40,3% dos pacientes, seguidos pelos pacientes com idades entre 41 a 60
anos (26,1%). No que diz respeito ao gênero, homens e mulheres representaram,
respectivamente, 56,3% e 43,7% dos pacientes (Tabela 4). Os setores de origem do
material clínico que representaram as maiores frequências no estudo foram: UTI
(adulto e neonatal) (58%), Emergência (10,1%) e Clínica Médica (9,2%) (Tabelas 3 e
5). Além disso, observou-se que 95,8% dos exames eram provenientes de unidades
públicas de saúde (Tabela 4).
Tabela 4 - Características gerais dos 142 pacientes provenientes de hospitais
públicos e privados de São Luís-MA
Variáveis F (%)
Faixa etária (em anos) ≤10 9 (7,6) 11-20 10 (8,4) 21-40 21 (17,6) 41-60 31 (26,1) >60 48 (40,3)
Gênero Masculino 67 (56,3) Feminino 52 (43,7)
Acomodação (Setor de origem) UTI 64 (53,8) Emergência 12 (10,1) Clínica Médica 11 (9,2) Unidade Semi-intensiva 8 (6,7) Unidade Intermediária 7 (5,9) UTI Neonatal 5 (4,2) Centro Cirúrgico 3 (2,5) Oncologia 3 (2,5) Ambulatório 6 (5,0) Procedência dos pacientes Hospital Público 114 (95,8) Hospital privado 5 (4,2)
f = frequência absoluta. % = frequência relativa.
45
É possível observar a distribuição dos diferentes tipos de espécimes clínicos
obtidos em cada hospital, bem como o setor hospitalar de atendimento e ou
alocação dos pacientes (Tabelas 5 e 6). Ressalta-se que, em alguns casos foram
utilizados mais de um espécime clínico provenientes do mesmo paciente, obtidos de
diferentes sítios e coletados em diferentes períodos de tempo da infecção.
Observou-se que secreção traqueal, swab nasal e sangue representaram,
respectivamente, 54,9%, 16,9% e 11,2% do total da amostragem (Tabela 5).
Tabela 5 - Distribuição por hospital dos espécimes clínicos de onde os isolados
foram recuperados
Hospitais Nº de
isolados
Secreção Traqueal
%
Swab nasal
%
Sangue %
Swab anal %
Fragmento de ferida
%
Urina %
Liquido pleural
%
Secreção Ocular
%
H01 44 27(61,4) 12(27,2) 3(6,8) 1(2,3) 1(2,2 ) - - - H02 45 27(60,0) 1(2,2) 7(15,6) - 4(8,9) 5(11,1) 1(2,2) - H03 11 5(45,5) 2(18,1) - - 3(27,3) 1( 9,1) - - H04 3 1(33,3) 1(33,3) 1(33,3) - - - - - H05 7 1(14,3) 1(14,3) 2(28,6 ) 2(28,6) - 1(14,3) - - H06 5 1(20) 3(60) 1(20) - - - - - H07 17 8(47,0) 4(23,5) 1(5,9) 1(5,9) - 2(11,7) - - H08 2 - - 1(50) - - - - 1(50) H09 1 1(100) - - - - - - - H10 1 1(100) - - - - - - - H11 5 5(100) - - - - - - - H12 1 1(100) - - - - - - -
Total 142 78(54,9) 24(16,9) 16(11,2) 4(2,8) 8(5,6) 9(6,3) 1(0,7) 1(0,7)
Tabela 6 - Distribuição setorial dos 142 isolados recuperados de espécimes clínicos de pacientes atendidos em doze hospitais de São Luis-MA
Hospital Setor
UTI %
SI %
EM %
CM %
UI %
CC %
ON %
UTI N %
AM %
H01 30(75) 4(10) - 6(15) - - - - - H02 20(55,6) - 1(2,7) 3(8,3) 6(16,7) 3(8,3) 3(8,3) - - H03 3(42,9) - 4(57,1) - - - - - - H04 - - 3(100) - - - - - - H05 2(33,3) - - 2(33,3) - - - 1(16,7) 1(16,7) H06 1(20) - 1(20) - - - - 2(60) - H07 4(36,4) - 2(18,2) - - - - - 5(45,4) H08 - 1(33,3) - - 1(33,3) - - 1(33,3) - H09 - 1(50) 1(50) - - - - - - H10 - 2(66,6) - - - - - 1(33,3) - H11 3(100) - - - - - - - - H12 1(100) - - - - - - - -
Total 64(53,8) 8(6,7) 12(10,1) 11(9,2) 7(5,9) 3(2,5) 3(2,5) 5(4,2) 6(5,0)
UTI: Unidade de Terapia Intensiva; SI: Semi Intensiva; EM: Emergência; CM: Clínica Médica; UI:
Unidade Intermediária; CC: Centro Cirúrgico, ON: Oncologia; UTI N: Unidade de Terapia Intensiva
Neonatal; AM: Ambulatório
46
Com relação à identificação fenotípica do perfil de resistência dos isolados
frente a diferentes antimicrobianos, o método de microdiluição no Vitek® 2
(Biomerieux, França) mostrou que a maioria dos isolados apresentou resistência
simultânea a diferentes drogas testadas (Tabela 7). Nesse aspecto, adotou-se a
definição de multirresistência para o isolado que demonstrou resistência a pelo
menos três antimicrobianos de diferentes classes, como sugerido pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2010).
Tabela 7 - Perfil fenotípico de susceptibilidade dos isolados bacterianos avaliados pelo Vitek2
Agente antimicrobiano
Perfil de Sensibilidade
Sensível Intermediário Resistente
Amicacina 107 (75,4%) 5 (3,5%) 30 (21,1%)
Ampicilina - - 142 (100%)
Ampicilina/Sulbactam 18 (12,7%) 30 (21,1%) 94 (66,2%)
Cefepime 12 (8,5%) 3 (2,1%) 127 (89,4%)
Cefoxitina - 1 (0,7%) 141 (99,3%)
Ceftazidima 9 (6,3%) 2 (1,4%) 131 (92,3%)
Ciprofloxacina 12 (8,5%) 2 (1,4%) 128 (90,1%)
Polimixina B 142 (100%) - -
Gentamicina 66 (46,4%) 6 (4,2%) 70 (49,3%)
Imipenem 13 (9,3%) 1 (0,7%) 128 (90,1%)
Meropenem 13 (9,2%) 1 (0,7%) 128 (90,1%)
Piperacilina/Tazobactam 10 (7,0%) 1 (0,7%) 131 (92,3%)
Tigeciclina 133(93,7%) 9 (6,3%) -
Os resultados da triagem fenotípica para a detecção do perfil de
susceptibilidade a diferentes antimicrobianos foram também avaliados por métodos
moleculares. A investigação da presença de quatro subgrupos de carbapenemases
do tipo oxacilinase (OXA) foi feita pela técnica de PCR multiplex para a detecção
simultânea dos genes blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58, nos 142 isolados. A
Figura 1 mostra o perfil genético representativo obtido para essas oxacilinases com
alguns dos isolados bacterianos. Tamanho dos fragmentos para cada gene: blaOXA-
23=501pb; blaOXA-24=246pb, blaOXA-51=353pb, blaOXA-58=599pb.
Analisando-se a distribuição dos quatros genes do tipo OXA detectados nos
isolados, observou-se um maior número de isolados apresentando simultaneamente
os genes blaOXA-51 e blaOXA-23. O gene blaOXA-51, isoladamente, foi o segundo mais
47
observado. Além disso, os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 foram também detectados
(Tabela 8).
Analisando-se a Figura 1, que mostra representativamente os perfis de
resistência para essas oxacilinases, é importante notar que o isolado 30, identificado
pelo Vitek2, como A. ursingii apresentou perfil de resistência para três tipos de
oxacilinases (blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-51). Além disso, nesta amostra observou-se,
um fragmento adicional de aproximadamente 320pb, amplificado inespecificamente
durante a reação de mPCR. No isolado 71, identificado como A. ursingii foram
observados fragmentos de 501pb e 353pb, compatíveis com os genes blaOXA-23 e
blaOXA-51. E nos isolados 126 e 142, foram identificados perfis de blaOXA-24 e blaOXA-58,
com fragmentos de 246 e 599pb, respectivamente. Estes dois isolados haviam sido
identificados pelo Vitek2 como pertencentes à espécie A. lwoffii.
Figura 1 - Perfis representativos dos resultados obtidos pela mPCR para a
detecção simultânea dos genes tipo blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58 em
alguns isolados do estudo
Legenda: Canaleta 01: 100 pb DNA ladder (Promega); Can30 (blaOXA-23,24,51); Can34 (blaOXA-24,51);
Can37 (blaOXA-51) Can38 (blaOXA-51); Can51 (blaOXA-23,51); Can63 (blaOXA-24,51); Can71(blaOXA-23,51);
Can126 (blaOXA-24); Can142 (blaOXA-58); Can55 (blaOXA-51); Can56 (blaOXA-23,51); Can88 (blaOXA-23,51);
Can61 (blaOxa-51); CN : controle negativo dos reagentes usados na mPCR.
48
Tabela 8 - Frequência de detecção dos genes para oxacilinase (OXA) por
mPCR nos isolados avaliados
Genes Frequência
blaOXA-23, blaOXA-51 130 (91,6%)
blaOXA-51 7 (4,9%)
blaOXA-24, blaOXA-51 2 (1,4%)
blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 1 (0,7%) blaOXA-24 1 (0,7%)
blaOXA-58 1 (0,7%)
O perfil comparativo entre os resultados da análise fenotípica (Tabela 7) com
o perfil de amplificação por mPCR (Tabela 8) dos genes para as oxacilinases está
demonstrado na Tabela 8. Dos 128 isolados resistentes ao imipenem e meropenem,
127 apresentaram o gene bla-OXA23 (p<0,001). Enquanto que dos 13 isolados que
foram sensíveis a esses antimicrobianos apenas dois apresentaram este gene
(Tabela 9).
Todos os 94 isolados resistentes a ampicilina/sulbactam foram positivos para
a presença dos genes blaOXA-23 (p<0,001) e blaOXA-51 (p<0,015). Entre os 18 isolados
sensíveis a este antimicrobiano, 16 apresentaram o gene blaOXA-51 e em apenas 6
foram detectados o gene blaOXA-23 (Tabela 9).
Entre os 127 isolados resistentes ao cefepime, 126 foram positivos para o
gene blaOXA-23 (p<0,001). Dos 12 isolados sensíveis, 2 foram positivos para esse
gene. Todas os isolados resistentes apresentaram também o gene blaOXA-51
(p<0,003) (9).
Em relação à ceftazidima, 128 dos 131 isolados resistentes apresentaram o
gene blaOXA-23 (p<0,001) e 2 dos 9 isolados sensíveis também apresentaram esse
gene. 130 dos 131 isolados resistentes possuíam o gene blaOXA-23 (p<0,031) (Tabela
9).
Entre os 128 isolados resistentes a ciprofloxacina, 124 foram positivos para o
gene blaOXA-23 (p<0,001). Dos 12 isolados sensíveis a esse antibiótico, quatro
apresentaram esse gene (Tabela 9).
49
Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de susceptibilidade aos antibióticos e presença de genes para
oxacilinases (n=142)
Padrão de sensibilidade
OXA 23 OXA 24 OXA 51 OXA 58
Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência
F (%) f (%) f (%) f (%) f (%) F (%) f (%) f (%)
Amicacina Sensível 96 (73,8) 11 (91,7) 3 (75,0) 104 (75,4) 106 (75,7) 1 (50,0) 1 (100) 106 (75,2) Intermediário 5 (3,8) 0 (0) 0 (0) 5 (3,6) 5 (3,6) 0 (0) 0 (0) 5 (3,5) Resistente 29 (22,4) 1 (8,3) 1 (25,0) 29 (21,0) 29 (20,7) 1 (50,0) 0 (0) 30 (21,3)
P =0,657 P =1,000 P =0,433 P =1,000 Ampicilina
Sensível 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Intermediário 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Resistente 130 (100) 12 (100) 4 (100) 138 (100) 140 (100) 2 (100) 1 (100) 141 (100)
P =1,000 P =1,000 P =1,000 P =1,000 Ampicilina/ Sulbactam
Sensível 6 (4,6) 12 (100) 4 (100) 14 (10,1) 16 (11,4) 2 (100) 1 (100) 17 (12,1) Intermediário 30 (23,1) 0 (0) 0 (0) 30 (21,7) 30 (21,4) 0 (0) 0 (0) 30 (21,3) Resistente 94 (72,3) 0 (0) 0 (0) 94 (68,1) 94 (67,1) 0 (0) 0 (0) 94 (66,7)
P <0,001* P <0,001* P =0,015* P =0,126 Cefepime
Sensível 2 (1,5) 10 (83,4) 4 (100) 8 (5,8) 11 (7,9) 1 (50,0) 0 (0) 12 (8,5) Intermediário 2 (1,5) 1 (8,3) 0 (0) 3 (2,2) 2 (1,4) 1 (50,0) 1 (100) 2 (1,4) Resistente 126 (97,0) 1 (8,3) 0 (0) 127 (92,0) 127 (90,7) 0 (0) 0 (0) 127 (90,1)
P <0,001* P <0,001* P =0,003* P =0,021* Cefoxitina
Sensível 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Intermediário 0 (0) 1 (8,3) 1 (25,0) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) Resistente 130 (100) 11 (91,7) 3 (75,0) 138 (100) 139 (99,3) 2 (100) 1 (100) 140 99,3)
P =0,085 P =0,028* P =1,000 P =1,000 Ceftazidima
Sensível 2 (1,5) 7 (58,3) 3 (75,0) 6 (4,3) 9 (6,4) 0 (0) 0 (0) 9 (6,4) Intermediário 0 (0) 2 (16,7) 0 (0) 2 (1,4) 1 (0,7) 1 (50,0) 1 (100) 1 (0,7) Resistente 128 (98,5) 3 (25,0) 1 (25,0) 130 (94,2) 130 (92,9) 1 (50,0) 0 (0) 131 (92,9)
P <0,001* P =0,001* P =0,031* P =0,014*
50
Tabela 9 - Análise comparativa entre perfil fenotípico de sensibilidade aos antibióticos e presença de genes para oxacilinases (n=142) (continuação)
Padrão de sensibilidade
OXA 23 OXA 24 OXA 51 OXA 58
Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência
F (%) f (%) f (%) f (%) f (%) F (%) f (%) f (%)
Ciprofloxacina Sensível 4 (3,1) 8 (66,7) 3 (75,0) 9 (6,5) 12 (8,6) 0 (0) 0 (0) 12 (8,5) Intermediário 2 (1,5) 0 (0) 0 (0) 2 (1,4) 2 (1,4) 0 (0) 0 (0) 2 (1,4) Resistente 124 (95,4) 4 (33,3) 1 (25,0) 127 (92,0) 126 (90,0) 2 (100) 1 (100) 127 (90,1)
P <0,001* P =0,003* P =1,000 P =1,000 Gentamicina
Sensível 57 (43,8) 9 (75,0) 2 (50,0) 64 (46,4) 65 (46,4) 1 (50,0) 1 (100) 65 (46,1) Intermediário 6 (4,6) 0 (0) 0 (0) 6 (4,3) 6 (4,3) 0 (0) 0 (0) 6 (4,3) Resistente 67 (51,5) 3 (25,0) 2 (50,0) 68 (49,3) 69 (49,3) 1 (50,0) 0 (0) 70 (49,6)
P =0,163 P =1,000 P =1,000 P =0,507 Imipenem
Sensível 2 (1,5) 11 (91,7) 3 (75,0) 10 (7,3) 11 (7,9) 2 (100) 1 (100) 12 (8,5) Intermediário 1 (0,8) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) Resistente 127 (97,7) 1 (8,3) 1 (25,0) 127 (92,0) 128 (91,4) 0 (0) 0 (0) 128 (90,8)
P <0,001* P =0,002* P =0,009* P =0,098 Meropenem
Sensível 2 (1,5) 11 (91,7) 3 (75,0) 10 (7,2) 11 (7,9) 2 (100) 1 (100) 12 (8,5) Intermediário 1 (0,8) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) Resistente 127 (97,7) 1 (8,3) 1 (25,0) 127 (92,0) 128 (91,4) 0 (0) 0 (0) 128 (90,8)
P <0,001* P =0,002* P =0,009* P =0,098 Piper/tazob
Sensível 2 (1,5) 8 (66,7) 2 (50,0) 8 (5,8) 10 (7,1) 0 (0) 0 (0) 10 (7,1) Intermediário 0 (0) 1 (8,3) 1 (25,0) 0 (0) 0 (0) 1 (50,0) 0 (0) 1 (0,7) Resistente 128 (98,5) 3 (25,0) 1 (25,0) 130 (94,2) 130 (92,9) 1 (50,0) 1 (100) 130 (92,2)
P =0,505 P <0,001* P =0,018* P =1,000 Tigeciclina
Sensível 122 (93,1) 11 (100) 4 (100) 129 (93,5) 131 (93,6) 2 (100) 1 (100) 132 (93,6) Intermediário 9 (6,9) 0 (0) 0 (0) 9 (6,5) 9 (6,4) 0 (0) 0 (0) 9 (6,4) Resistente 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0,0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
P =0,630 P =1,000 P = 0,999 P =1,000
f = frequência absoluta. % = frequência relativa. *Diferenças estatisticamente significantes (P <0,05) através do teste de probabilidade de Exato de Fisher (Freeman-Halton extension).
51
A reação de PCR utilizada para confirmar a identificação fenotípica dos
isolados, pela amplificação do gene blaOXA-51, mostrou um fragmento especifico de
353pb em 140 (98.6%) isolados. Nesta investigação, somente dois isolados (126 e
142) não apresentaram o gene blaOXA-51, que é considerado intrínseco em A.
baumannii e serve para a identificação dessa espécie. O fragmento específico do
gene blaOXA-51 em alguns dos isolados é mostrado na Figura 2.
Figura 2 - Gel de agarose 2% mostrando o produto de amplificação por PCR específica do gene blaOXA-51 de alguns isolados do estudo
Legenda: CN (controle o reagentes utilizados no mPCR; 100 pb DNA ladder (Promega);
Isolados nºs: 61, 71, 88, 89, 105 e 122, respectivamente.
A técnica de ARDRA-PCR foi feita, não somente para confirmar os resultados
fenotípicos obtidos, mas também com o intuito de detectar diferenças
intraespecíficas entre os 142 isolados. Para tal, o DNA foi submetido a ensaios de
PCR com um par de iniciadores específicos, desenhados para esta finalidade. Este
par de iniciadores amplificou um fragmento de tamanho de1432pb, como esperado,
em todos os isolados. A Figura 3 mostra um perfil representativo para o DNA de
alguns desses isolados amplificados.
52
Figura 3 - Gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação por PCR específica para o gene da região 16S ribossomal de alguns isolados do estudo
Legenda: Isolados nºs: 30; 100 pb DNA ladder (Promega); Isolados nºs: 34, 37, 38, 56, 63, 71, 26,
142, 55, 51, 61 e 88, respectivamente.
A fim de se constatar se o método ARDRA-PCR teria capacidade de
diferenciar os isolados entre si, o produto amplificado de cada isolado foi submetido
à digestão enzimática com a endonuclease BfaI. Os perfis eletroforéticos mostrados
em gel foram medidos visualmente de forma comparativa, tendo-se um padrão
molecular de uso comercial amplamente utilizado para estes fins. Observaram-se
perfis homogêneos para 138 (97,1%) isolados com fragmentos de 31-39-95-146-
167-173-189-281-306, previamente identificados fenotipicamente e genotipicamente,
como sendo A. baumannii (Tabela 10). É importante notar que fragmentos muito
pequenos (entre 01 e 100 pares de base) frequentemente não aparecem no gel de
poliacrilamida.
É possível observar, em gel de poliacrilamida 6%, o resultado representativo
da digestão enzimática/ARDRA-PCR do perfil para alguns isolados, previamente
identificados pelos métodos automatizado e PCR específica para a detecção do
gene blaOXA-51 (Figura 4). No referido gel a espécie A. baumannii está representada
por dois isolados (14 e 72), uma A. ursingii (isolado 71) dois A. lwoffii (isolados 126 e
142). Os perfis de restrição obtidos para o isolado 71 foram fragmentos de 81-146-
175-189-404-437 pb, correspondendo ao perfil de uma amostra sob número de
acesso no Genbank KB849719.1 depositada como A. ursingii (Tabela 10).
Ressalta-se que os perfis de restrição ARDRA-PCR de três isolados
identificados pelo Vitek2 como sendo: A. ursingii (isolado 30) e dois como A. lwoffii
(isolados 126 e 142) não corresponderam ao perfil in silico obtido para estas
espécies com sequências do Genbank. Os perfis com fragmentos de 76-149-151-
53
175-404-518pb obtidos para os isolados 30 e 126 foram semelhantes àqueles
obtidos para um Acinetobacter sp., com o número de acesso no Genbank
JF710649.1. Enquanto o perfil obtido para o isolado 142, identificado como A. lwoffii
fenotipicamente, foi compatível com Acinetobacter sp., número de acesso no
Genbank JQ039977.1 e apresentando fragmentos de 47-81-151-156-175-404-
437pb (Figura 4 e Tabela 10). Ou seja, a identificação obtida pelo método
automatizado foi cordante da molecular no gênero, porém em relação à espécie
houve discordância.
Figura 4 - Gel de poliacrilamida 6% representando os produtos da digestão enzimática de alguns isolados identificados no estudo
Legenda: ND = Não digerido; Dig = Digerido; CN=Controle negativo dos reagentes amplificados e
digeridos.
Tabela 10 - Perfis obtidos no ARDRA-PCR para os 142 isolados de Acinetobacter avaliados no presente estudo Isolado nº. Sequencia de referência
do Genbank Perfil ARDRA-PCR
Genbank Perfil ARDRA-PCR
isolados
1 ao 29; 31 ao 70; 72 ao125; 127 ao 141
Acinetobacter baumannii gi|215481761:18347-19871
39-94-95-146-173-175-182-222-306
39-94-95-146-173-175-182-222-306
Total 138
30-126 Acinetobacter sp. JF710649.1
76-149-151-175-404-518 76-149-151-175-404-518
71 Acinetobacter ursingii KB849719.1
81-146-175-189-404-437 81-146-175-189-404-437
142 Acinetobacter sp. JQ039977.1
47-81-151-156-175-404-437
151-156-175-404-437
54
Para a construção de um dendrograma mostrando os perfis ARDRA-PCR dos
142 isolados, foram feitas digestões in silico com 124 diferentes sequências
pertencentes a 32 espécies Acinetobacter spp., constantes no Genbank. Entre os
resultados destas digestões encontrou-se o perfil obtido para 138 (97,1%) isolados
como pertencentes às espécies A. baumannii, de três isolados como pertencentes a
duas diferentes linhagens da espécie Acinetobacter sp., e uma como sendo da
espécie A. ursingii.
Utilizando-se os perfis mostrados dos produtos da PCR, em gel de agarose
após digestão com a enzima BfaI, foi construída uma matriz binária baseada na
presença (1) ou ausência (0) de cada fragmento digerido dos isolados. Com relação
às espécies de referência, utilizou-se àquelas que apresentaram o perfil semelhante
ao obtido para os isolados, bem como, 28 diferentes espécies escolhidas
aleatoriamente, utilizou-se o resultado da digestão in silico obtida pelo programa
NEBcutter 2.0, entre as 124 linhagens previamente analisadas (Tabela 2). A matriz
foi construída pelo programa NTSYS v. 2.1 (ROHLF, 2000) que gerou um
dendrograma onde foram mostrados os resultados do agrupamento dos perfis dos
isolados e de 32 diferentes espécies de referência com base na média aritmética
ponderada (Unweighted Pair Group Method algorithm-UPGMA). O grau de
similaridade genotípica entre ambos os perfis de ARDRA-PCR, para os
isolados/amostras de referência, foi estabelecido pelo coeficiente Sorensen-Dice
calculado pelo programa NTSYS (ROHLF, 2000).
Na análise dos agrupamentos formados no dendrograma foi possível
perceber o alto grau de similaridade entre os perfis ARDRA-PCR obtidos pela
digestão in silico das sequências das espécies de referência existentes no Genbank,
mostrando diferenciar as espécies entre si. Além disso, esta metodologia foi capaz
de agrupar os isolados, em conformidade com a espécie identificada pelo perfil
ARDRA (Figura 5).
55
Figura 5 - Dendrograma de similaridade genética derivado do coeficiente de similaridade DICE implementado pelo programa NTSYS mostrando as relações filogenéticas entre os 142 isolados do estudo e as 32 espécies de referência de Acinetobacter do Genbank
Legenda: Isolados nºs: 71 – A. ursingii; 30 e 126 – Acinetobacter sp.; 142 – Acinetobacter sp.; 1-29,
31-70, 72-125, 127-141 – A. baumannii
56
A fim de confirmar os resultados obtidos no ARDRA-PCR, bem como verificar
a eficiência dessa metodologia em diferenciar entre si os isolados de Acinetobacter
spp., o produto da PCR dos 04 isolados (30,71, 126 e 142), que mostraram um perfil
diferenciado no ARDRA-PCR, e de outros 24 isolados, descritos na Tabela 11 e que
foram escolhidos aleatoriamente, entre aqueles identificados por PCR como A.
baumannii, tiveram o seu produto amplificado purificado e sequenciado.
Obteve-se pelo sequenciamento do fragmento específico de 1432pb, com os
iniciadores especialmente desenhados para o presente estudo, sequências de
tamanhos variados, ou seja, de 922 a 1423pb (Tabela 11). A busca de similaridade
entre as sequências dos 28 isolados com as sequências existentes no Genbank foi
feita com o auxílio do programa BLASTn do pacote BLAST 2.0 (BASIC ALIGNMENT
SEARCH TOOL) desenvolvido pelo NCBI (ALTSCHUL et al., 1997) e mostrou um
grau de similaridade que variou de 98 a 100%.
Foi observado neste estudo que os 24 isolados, escolhidos aleatoriamente
entre aqueles identificados como A. baumannii, eram na maioria de secreção
traqueal de pacientes de UTI, mostrando assim a importância do envolvimento
desse patógeno nas infecções hospitalares (Tabela 11).
As sequências nucleotídicas obtidas foram editadas para a remoção de
ambiguidades e a qualidade de cada base foi avaliada utilizando o CLUSTALW
software package (EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) de modo que somente
as bases de alta confiabilidade, repetidas em série nos diferentes sequenciamentos
foram utilizadas para a montagem de uma fita consenso final, para cada isolado.
Estas sequências estão em processo de depósito no GenBank.
Análises filogenéticas foram feitas alinhando-se as sequências nucleotídicas
obtidas para os 28 isolados e mais as 32 sequências de diferentes espécies de
Acinetobacter existentes no Genbank, como mostrado na Tabela 11 e na Figura 6. O
resultado mostrou e confirmou a similaridade genética entre os isolados e as
amostras de referência do Genbank, confirmando também o perfil mostrado no
dendrograma.
Na árvore filogenética, resultante do alinhamento implementado pelo
programa de bioinformática Mega com o algorítmo Neighbor-Joining e 1000
replicatas de bootstrap, foi possível perceber que, mesmo não se fechando o
sequenciamento do fragmento todo (1432pb) para os 28 isolados analisados, o
resultado do alinhamento mostrou a diferenciação, não somente das espécies de
57
Acinetobacter de referência oriundas do Genbank, mas também os isolados foram
topograficamente alocados com as respectivas amostras de referência com as quais
elas foram identificadas no ARDRA-PCR (Figura 6).
Tabela 11 - Resultado da análise de similaridade genética entre as sequências obtidas dos isolados quando submetida ao Blastn do Genbank
Lege
nda:
UTI: Unidade de Terapia Intensiva; CM: Clínica Médica; SI: Semi Intensivo; EM: Emergência. ST:
Secreção traqueal; FO: Ferida operatória; SN: Swab Nasal; S: Sangue.
Isolado nº.
Hospital/Setor Espécime clínico
Tamanho sequenciado
(pb)
Identidade Similaridade %
01 H01/UTI/ST 922 A. baumannii 99% 02 H01/UTI/ST 1018 A. baumannii 99% 06 H03/UTI//ST 1020 A. baumannii 99% 08 H01/UTI//ST 996 A. baumannii 99% 11 H03/UTI//ST 1011 A. baumannii 99% 12 H02/CM/FO 1376 A. baumannii 99% 13 H05/UTI/ST 1001 A. baumannii 99% 14 H02/UTI/ST 998 A. baumannii 99% 16 H01/UTI/ST 1026 A. baumannii 99% 30 HO1/CM/SN 1376 Acinetobacter sp 99% 71 H06/UTI/ S 1357 A. ursingii 99% 84 HO7/ UTI/ST 1334 A. baumannii 99% 88 H12/UTI/ S 1353 A. baumannii 99% 91 H01/UTI/SN 1344 A. baumannii 99% 92 HO7/ UTI/ST 1374 A. baumannii 99% 93 HO7/ UTI/ST 1350 A. baumannii 99% 94 H01/UTI/ST 1000 A. baumannii 100% 95 H02/UTI/ST 1029 A. baumannii 99% 96 HO7/UTI/ST 1000 A. baumannii 100% 97 H01/SI/SN 1370 A. baumannii 99% 98 HO7/ SI/S 1005 A. baumannii 99% 100 HO7/ SI/ST 1372 A. baumannii 99% 101 H01/UTI/ST 1353 A. baumannii 99% 103 H04/EM/ST 1333 A. baumannii 99% 104 H08/UTI/S 1363 A. baumannii 99% 105 H09/SI/ST 1352 A. baumannii 99% 126 H10/UTI/ST 1415 Acinetobacter sp 98% 142 H11/UTI/ST 1423 Acinetobacter sp 99%
58
Figura 6 - Árvore filogenética construída pelo programa Mega versão 5.2 usando o algoritmo de neighbor joining com valor de bootstrap de 1000 replicatas. A árvore foi baseada na sequência nucleotídica do fragmento de 1.432bp de 28 isolados que foram sequenciados e 32 sequências de diferentes espécies de Acinetobacter provenientes do Genbank
‘’
59
7 DISCUSSÃO
As espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter são uma importante causa
de infecção no ambiente hospitalar e têm sido associadas a uma grande variedade
de enfermidades em pacientes internados, principalmente naqueles em Unidades de
Terapia Intensiva (SINHA; SRINIVASA; MACADEN, 2007; PELEG; SEIFERT;
PATERSON, 2008; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012).
No presente estudo os resultados dos métodos de identificação fenotípica e
molecular demonstraram que a espécie A. baumannii foi a mais detectada
corroborando dados da literatura recente que tem registrado o A. baumannii como a
principal espécie do gênero relacionada a infecções hospitalares (NOWAK;
PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012; ZHENG; YUAN; LI, 2013).
Dos 142 isolados utilizados no estudo, três foram identificados incorretamente
quanto à espécie, pelo sistema automatizado Vitek 2, um foi identificado como A.
ursingii e dois isolados como A. lwoffii. Os métodos moleculares identificaram estes
isolados como sendo Acinetobacter sp. Os sistemas automatizados têm sido
utilizados com grande frequência para a identificação e perfil de susceptibilidade de
bactérias, esses sistemas diminuem o trabalho e o tempo de realização desses
testes o que possibilita a liberação de resultados com mais rapidez (DONAY et al.,
2004), no entanto, prováveis erros desses sistemas podem implicar em sérios
problemas na evolução clínica dos pacientes (KULAH et al., 2009). Estudo realizado
por Higgins et al. (2010b) demonstrou erro na identificação por esse sistema, uma
amostra identificada como A. lwoffii era na verdade A. baumannii. Segundo Sung et
al. (2000) o A. lwoffii foi uma das espécies identificadas incorretamente com maior
frequência. Recentemente, Guo et al. (2014) efetuou um estudo comparativo entre
métodos de identificação de diferentes micro-organismos e constatou erros de
identificação no Vitek2.
Tem sido descrito que infecções causadas por isolados de Acinetobacter
multirresistentes apresentam taxas extremamente elevadas de mortalidade
ocorrendo frequentemente em pacientes graves internados em unidades de terapia
intensiva e em uso de ventilação mecânica (MARAGAKIS; PERL, 2008; JOSHI;
LITAKE, 2013). Os procedimentos invasivos, como a ventilação mecânica, são um
dos maiores fatores de risco para as infecções causadas por A. baumannii
(FOURNIER et al., 2006).
60
Em relação ao setor de internação, a UTI (adulto e neonatal) se confirmou
como o setor com o maior número de amostras 69 (58%), este resultado está de
acordo com os outros trabalhos. Em um estudo realizado no Brasil por CORRÊA et
al. (2012) a UTI também foi responsável pela maior parte dos isolados, 57,1%. Na
Arábia Saudita 56% das amostras foram isoladas de pacientes internados na
unidade de terapia intensiva (ABDALHAMID et al., 2014). Pacientes internados em
UTI geralmente apresentam quadro clínico mais grave por passarem longos
períodos de tempo internados. Biglari et al. (2013) sugerem que esses pacientes têm
uma maior chance de serem colonizados ou infectados por Acinetobacter spp.,
principalmente através de feridas de tecidos moles e trato respiratório.
Quanto ao tipo de espécime clínico, assim como em outros estudos, a
secreção traqueal foi o espécime clínico mais frequente neste estudo. Safari et al.
(2013) relataram que 74% dos seus isolados eram provenientes de aspirado
traqueal. Em outro estudo realizado por Abdalhamid et al. (2014) o trato respiratório
foi responsável por 52% das amostras. No Brasil, em trabalho realizado no Rio de
Janeiro, 47,3% dos isolados foram provenientes do trato respiratório (CARVALHO et
al., 2009).
A média de idade neste estudo foi de 50,03 anos sendo que a maior parte dos
pacientes (40,3%) apresentou mais de 60 anos. Em um estudo realizado em
Curitiba, os pesquisadores observaram que os pacientes que foram a óbito eram em
média 13,5 anos mais velhos e que a idade teve valor significativo para mortalidade.
Estes dados mostram que a equipe médica deve ter um cuidado redobrado com os
pacientes idosos a fim de minimizar possíveis colonizações ou infecções por A.
baumannii, bem como os índices de mortalidade causados por este patógeno
(MEDEIROS; YABUMOTO; MOTA, 2008).
As espécies do gênero Acinetobacter têm ganhado destaque devido a sua
resistência intrínseca a antibióticos e capacidade de adquirir novos genes de
resistência, o que as torna resistentes a várias classes de antibióticos (SHEHATA,
2012). A. baumannii é considerado um importante patógeno no ambiente hospitalar
principalmente devido a sua resistência contra múltiplas classes de antimicrobianos
(PEREZ et al., 2007), constatando-se nos últimos anos um aumento continuo da
prevalência de linhagens multirresistentes (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK,
2012; ZHENG; YUAN; LI, 2013).
61
Sobre o perfil de resistência dos isolados analisados no presente estudo os
resultados mostraram altas taxas de resistência aos antibióticos testados, não só
aos β-lactâmicos, mas também a outras classes de antimicrobianos. Para alguns
antibióticos não foi observada nenhuma linhagem sensível, como foi o caso da
ampicilina e da cefoxitina. A polimixina B e a tigeciclina foram os antimicrobianos
mais efetivos, apresentando 100% e 93,66% de sensibilidade, respectivamente.
A resistência aos antimicrobianos restringe as opções de tratamento,
principalmente quando os isolados são resistentes aos carbapenêmicos que são
considerados os fármacos de primeira escolha no tratamento das infecções
causadas por bactérias do gênero Acinetobacter (CORRÊA et al., 2012). No entanto,
nos últimos anos, tem sido observado em todo o mundo o aumento de isolados
resistentes ao carbapenêmicos, restando apenas a polimixina B e tigeciclina como
as últimas drogas com atividade in vitro (AL-AGAMY et al., 2014).
Os perfis de 90,14% de resistência aos carbapenêmicos observados nos
isolados aqui analisados concordam com os resultados de CORRÊA et al. (2012)
que encontraram altas taxas de resistência entre isolados brasileiros de
Acinetobacter spp. Neste mesmo estudo, as taxas de resistência ao imipenem e
meropenem foram de 71,4% e 69,7%, respectivamente. Em estudo realizado no
Maranhão, 86,6% dos isolados de A. baumannii foram resistentes ao imipenem
(FONSECA et al., 2013). Pequisadores do Iran encontraram elevados índices de
resistência ao imipenem (79,8%) e meropenem (75%) e baixa resistência a
tigeciclina (2,9%) (MOHAJERI et al., 2014). Altas taxas (63,6%) de resistência ao
imipenem foram também encontradas na Arábia Saudita (AL-AGAMY et al., 2014).
Assim, devido à falta de novas drogas, os médicos têm considerado a
tigeciclina como opção contra infecções causadas por Acinetobacter spp.,
multirresistentes (ROSSI, 2011). Com exceção da polimixina B e tigeciclina, as
maiores taxas de susceptibilidade no presente estudo foram da amicacina (75,4%) e
gentamicina (46,4%). No Teerã a polimixina B e tigeciclina apresentaram boa
atividade antimicrobiana, sendo 91,2% dos isolados de A. baumannii sensíveis a
estes antibióticos (MOROVAT et al., 2009). No Brasil, Corrêa et al (2012)
encontraram a maior taxa de susceptibilidade para amicacina (58,8%), tetraciclina
(55,4%) e gentamicina (42,9%), porém eles não utilizaram polimixina B e tigeciclina.
As oxacilinases são o principal mecanismo de resistência ao carbapenêmicos
entre linhagens de A. baumannii (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012). A
62
resistência a outras classes de antimicrobianos, diferentes dos carbapenêmicos,
pode estar relacionada a múltiplos mecanismos de resistência que também são
encontrados em Acinetobacter spp., mas que não foram pesquisados no presente
estudo. Entre esses mecanismos pode-se citar a perda ou alteração estrutural de
proteínas de membrana do tipo porinas, presença de bombas de efluxo que
reduzem a concentração do agente antimicrobiano no interior da bactéria,
diminuição da permeabilidade da membrana externa, expressão da cefalosporinase
do tipo AmpC (intrínseca em A. baumannii) e metalo-β-lactamases (MBLs) (PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008; FIGUEIREDO et al., 2012).
As enzimas carbapenemases do tipo OXA são as mais difundidas em A.
baumanii, elas são capazes de hidrolisar os carbapenêmicos conferindo a este
micro-organismo a capacidade de resistência aos antimicrobianos desta classe de
fármacos (FOUAD et al., 2013). A produção da enzima OXA-23, uma beta-lactamase
da classe D de Ambler, representa um importante mecanismo de resistência em
isolados de A. baumannii e tem sido detectada com frequência em diferentes países
(SUNG et al., 2008; CORRÊA et al., 2012; CIESLINSKI et al., 2013; FOUAD et al.,
2013; AL-AGAMY et al., 2014).
Neste estudo, a presença do gene blaOXA-51 foi confirmada em 140 (98,6%)
isolados, todos os 138 isolados de A. baumanni foram positivas para este gene.
Além disso, blaOXA-51 foi também detectado em dois isolados não-baumannii. Estes
resultados estão em concordância com a literatura, onde vários autores afirmam que
este gene é intrínseco à espécie A. baumannii (TURTON et al., 2006b; POIREL;
NORDMANN, 2006; ABDALHAMID et al. 2014). Por outro lado, o gene blaOXA-51 foi
também detectado em outras espécies não-baumannii (LEE, Y. T. et al., 2009;
2012). Estes resultados demonstram que a enzima OXA-51 é a mais prevalente em
isolados de A. baumannii não só do Brasil, mas em várias partes do todo o mundo.
A alta frequência dos genes blaOXA-51 e blaOXA-23 nos isolados resistentes e a
baixa frequência dos mesmos nos isolados sensíveis sugere que as enzimas
codificadas por estes genes podem estar relacionadas à resistência aos
carbapenêmicos. Estes resultados concordam com resultados obtidos na Korea
(LEE et al., 2009), Arábia Saudita (FOUAD et al., 2013) e em Taiwan (CHAN et al.,
2014) onde estes genes foram detectados na maioria dos isolados de A. baumanni
estudados e relacionados diretamente à resistência a estes dois carbapenêmicos.
No Maranhão o gene blaOXA-23 foi recentemente detectado em 86,6% dos isolados de
63
A. baumannii resistentes a carbapenêmicos e o blaOXA-51 em 100% (FONSECA et al.,
2013). Um estudo realizado em Niterói, Rio de Janeiro, também detectou uma alta
frequência do blaOXA-23 e blaOXA-51 em 95,4% e 100%, respectivamente dos isolados
de A. baumanni resistentes ao imipenem (CORRÊA et al., 2012). Em Belo Horizonte,
MARTINS et al. (2014) encontraram estes dois genes em 93,7% e 84,3% dos
isolados de A. baumanni multirresistentes.
Apesar da resistência aos carbapenêmicos não poder ser atribuída somente à
presença do gene blaOXA-51, a presença dos genes blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-58
foram consistentemente associados à resistência ou à diminuição da
susceptibilidade (WOODFORD et al., 2006). No presente estudo um isolado
apresentou os genes blaOXA-23, blaOXA-24 e blaOXA-51. Woodford et al. (2006), também
identificaram dois isolados, provavelmente oriundas do Paquistão e Tailândia, que
possuíam três genes blaOXA simultaneamente.
A investigação da presença de quatro subgrupos de carbapenemases do tipo
oxacilinase (OXA) foi feita com a finalidade de detectar os genes blaOXA-51, blaOXA-23,
blaOXA-24 e blaOXA-58 nos 142 isolados estudados. Foi observado que dos 138 isolados
identificados como A. baumannii, 130 (94.2%) apresentaram simultaneamente o
genes blaOXA-23 e o blaOXA-51, destas 127 (97,7%) foram resistentes ao imipenem e
meropenem. Além disso, isolados com perfil intermediário apresentaram também
estes genes.
O gene blaOXA-24 foi detectado em 4 (2,8%) isolados e o blaOXA-58 foi detectado
em apenas 1 (0,7%), estes resultados estão de acordo com outros estudos que
também apresentaram baixa frequência desses genes, Sohrabi et al. (2012) em um
estudo realizado no Irã detectaram o gene blaOXA-24 em 1,6% dos isolados e o gene
blaOXA-58 em 3,2% dos isolados de A. baumannii. Al-Agamy et al. (2014) encontraram
o gene blaOXA-24 em dois isolados enquanto o gene blaOXA-58 não foi encontrado em
nenhum isolado. O gene blaOXA-58 foi isolado pela primeira vez no Brasil na cidade de
São Paulo (ANTÔNIO et al., 2011).
A rápida detecção de isolados de Acinetobacter resistentes a carbapenêmicos
e seus mecanismos de resistência é de suma importância para evitar a sua
disseminação no ambiente hospitalar (CORRÊA et al., 2012). Neste aspecto, os
resultados desse estudo, juntamente com os de outros pesquisadores, mostram que
os elevados índices de resistência são um problema não só do Brasil, mas de todo o
64
mundo despertando maior atenção para o perigo da disseminação de linhagens
multirresistentes de Acinetobacter spp.
A espécie A. baumannii tem sido considerada a mais importante do gênero,
do ponto de vista clínico, constituindo-se atualmente, um dos principais problemas
enfrentados pelos profissionais de saúde devida sua resistência a múltiplas drogas
(BIGLARI et al., 2013). Por outro lado, infecções causadas por outras espécies de
não-baumannii Acinetobacter spp., têm aumentado na comunidade e em hospitais.
Tem sido descrito que as infecções causadas por estas outras espécies,
consideradas menos patogênicas, raramente são graves porque estes micro-
organismos ainda são suscetíveis a vários antimicrobianos (PELEG; SEIFERT;
PATERSON, 2008; FIGUEIREDO et al., 2011). Neste sentido, sua rápida
diferenciação das outras espécies que raramente causam infecções é de suma
importância (TURTON et al., 2006a).
O gênero Acinetobacter tem sofrido mudanças taxonômicas ao longo da
história e até o presente, 33 diferentes genoespécies foram definidas através de
métodos de hibridização de DNA-DNA genômico (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011).
Apesar de ser considerado o padrão ouro, essa metodologia é laboriosa e de difícil
aplicação na rotina clínica (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). Por isso, o sistema de
identificação fenotípico tem sido amplamente utilizado para identificar ou diferenciar
novos isolados, entretanto estes métodos são imprecisos, apresentam baixa
capacidade de discriminação entre espécies de Acinetobacter, são complexos de
executar e demorados (ESPINAL; ROCA; VILA, 2011). Alguns métodos de
identificação comerciais disponíveis são conseguem separar as espécies
pertencentes ao complexo A. calcoaceticus – A. baumannii, as três espécies
clinicamente relevantes desse complexo são identificadas como A. baumannii pela
maioria desses sistemas (PAUL; MARYAN; DANNIE, 2007; PELEG; SEIFERT;
PATERSON, 2008).
Entre os métodos recentemente desenvolvidos para identificar os isolados de
A. baumannii incluem-se a detecção por PCR do gene blaOXA-51, que codifica uma
carbapenemase intrínseca a esta espécie, Espectrometria de Massa com Ionização
por PCR-electrospray, e uma nova metodologia de PCR que analisa as diferenças
nos respectivos genes gyrB permitindo diferenciação entre A. baumannii e
Acinetobacter genoespecie 13TU (NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012).
65
No presente estudo o gene blaOXA-51 foi detectado em todos os isolados
identificados fenotipicamente como A. baumannii e em dois isolados não-baumannii,
sendo uma amostra de A. ursingii (71), e outra de Acinetobacter spp. (isolado 30),
sugerindo que a presença deste gene pode identificar até o nível de gênero, mas
não ao de espécie. Este resultado concorda com aqueles obtidos por Lee, Y. T. et al.
(2009, 2012) que identificaram pela primeira vez o gene blaOXA-51 em isolados
clínicos de Acinetobacter genoespécie 13TU e A. nosocomialis. Apesar de alguns
autores considerarem que a detecção do gene blaOXA-51 pode ser usada como a
forma mais simples e confiável para identificação de A. baumannii (TURTON et al.,
2006b; NOWAK; PALUCHOWSKA; BUDAK, 2012; ABDALHAMID et al., 2014) a
somatória dos resultados obtidos neste trabalho mais os obtidos por Lee Y. T. et al.
(2009; 2012) colocam em dúvida a utilização da identificação deste gene como
forma de identificação e diferenciação de A. baumannii de outras espécies de
Acinetobacter. Os resultados obtidos aqui são sugestivos de que, apesar de
intrínseco a A. baumannii. este gene não é exclusivo desta espécie.
Outra metodologia que tem sido muito utilizada é a análise de restrição de
DNA ribossomal amplificado (ARDRA-PCR) que apresenta muitas vantagens na
identificação de espécies de Acinetobacter em relação à identificação fenotípica,
uma vez que, esse método é confiável e valioso também nos estudos filogenéticos e
taxonômicos (VANEECHOUTE et al., 1995; GUNDI et al., 2009; SKLARZ et al.,
2009).
No presente estudo, a utilidade do ensaio de ARDRA-PCR foi avaliada para a
diferenciação das espécies genômicas de 142 isolados de Acinetobacter spp. Os
perfis obtidos experimentalmente através da digestão enzimática destes isolados
foram coincidentes com os perfis in silico obtidos com diferentes sequências do
Genbank e pertencentes a 32 espécies de Acinetobacter. Além disso, a obtenção
dos perfis ARDRA do fragmento de 1432pb da região 16S do RNA ribossomal, teve
um importante diferencial, em relação ao que existe na literatura, pela utilização de
apenas uma enzima de restrição para a execução do ARDRA-PCR. Neste método
comumente são utilizadas várias endonucleases de restrição, para identificar e ou
diferenciar entre si diferentes tipos de micro-organismos patogênicos, inclusive de
Acinetobacter spp.
Vaneechoutte et al. (1995) demonstraram que o ARDRA-PCR usando cinco
enzimas de restrição é uma eficiente técnica para diferenciar as espécies do
66
complexo A. calcoaceticus-A. baumannii. Tien et al. (2012) conseguiram identificar
as espécies de Acinetobacter utilizando a técnica de ARDRA-PCR com três
enzimas. Kong et al. (2011) também obteve sucesso ao utilizar o ARDRA-PCR na
identificação e diferenciação de linhagens de A. baumannii. O presente estudo
demonstrou que a identificação dessas espécies pode ser realizada com o uso de
apenas uma enzima de restrição, previamente selecionada in silico.
O ARDRA-PCR tem sido um dos métodos mais aceitos e validados para a
identificação de espécies de Acinetobacter com um grande acervo de perfis
disponíveis (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008). Esta técnica apresenta várias
vantagens, é um método econômico que fornece resultados de forma rápida, além
disso, os equipamentos necessários para a sua execução, como termocicladores e
equipamentos para eletroforese, são de fácil acesso na maioria dos laboratórios de
microbiologia clínica. Todas essas características fazem dessa técnica uma das
melhores alternativas na identificação de espécies do gênero Acinetobacter (CHANG
et al., 2005; KONG et al., 2011). Também foi demonstrado que o ARDRA-PCR é
uma importante ferramenta no estudo da diversidade genética o que pode contribuir
para o melhor entendimento da epidemiologia e importância clínica das espécies de
Acinetobacter principalmente às pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-A.
baumannii (VANEECHOUTTE et al., 1995; TIEN et al., 2012).
É importante ressaltar que o sequenciamento genômico do fragmento
específico correspondente a toda região 16S do RNA ribossômico tem sido utilizado
para a identificação parcial ou quase completa das espécies de Acinetobacter
(CHANG et al., 2005). No presente estudo, o sequenciamento do fragmento
específico de 1432pb de 24 isolados, escolhidos aleatoriamente entre os isolados
identificados fenotipicamente como A. baumannii mostrou similaridade genética de
98 a 100% com A. baumannii, confirmando a identificação molecular obtido no
ARDRA-PCR, e com isso, validando os resultados obtidos para os demais isolados.
Além disso, o sequenciamento do produto da PCR dos quatro isolados identificados
pelo Vitek 2 como sendo: A. ursingii (isolados 30 e 71) e dois como A. lwoffii
(isolados 126 e 142) mostrou que apenas o isolado 71 era realmente A. ursingii, os
demais foram identificados como Acinetobacter spp. Esses achados estão de acordo
com a literatura a respeito da identificação fenotípica das espécies do gênero
Acinetobacter, ou seja, que a mesma é insuficiente para identificar Acinetobacter em
nível de espécie (CHANG et al., 2005). Os resultados do presente estudo não
67
somente suportam a aplicação do ARDRA-PCR para a determinação das espécies
de Acinetobacter, mas também sugere que a maioria das espécies genômicas
podem ser identificadas para considerações clínicas usando-se apenas uma enzima,
nesse caso a enzima BfaI.
68
8 CONCLUSÃO
A exemplo do que está descrito na literatura, os resultados obtidos no
presente estudo mostraram que a espécie A. baumannii é a mais importante
do gênero, e que o número de infecções causadas por espécies não-
baumannii tem aumentado no ambiente hospitalar; demonstrando a sua
importância clínica, uma vez que estas podem apresentar resistência
antimicrobiana e características potenciais de virulência;
A resistência bacteriana a antimicrobianos avaliada pelo método
automatizado Vitek2 mostrou que são altos os índices de resistência em A.
baumannii, considerando quase todas as classes de antimicrobianos, com
exceção da polimixina B e Tigeciclina, que ainda são efetivas contra A.
baumannii;
Os genes codificadores de Oxacilinases (blaOXA-23 e blaOXA-51) foram
detectados em quase totalidade dos isolados de A. baumannii estudadas;
A presença do gene blaOXA-51 em isolados de Acinetobacter spp.,
apresentados neste estudo, demonstrou que este gene necessariamente não
os identifica como A. baumannii.
O sequenciamento do fragmento amplificado com os iniciadores
especialmente desenhado para o presente trabalho permitiu a identificação
dos 28 isolados sequenciados;
O ARDRA-PCR demonstrou ser uma ferramenta molecular útil para o estudo
da diversidade genética das espécies de Acinetobacter spp., pois permitiu
identificar e diferenciar todos os isolados entre si, pela utilização de apenas
uma enzima de restrição.
O dendrograma construído a partir dos perfis ARDRA-PCR, obtidos para os
isolados mostrou alto grau de similaridade com os perfis obtidos pela digestão
in silico das sequências de referência de Acinetobacter spp., existentes no
Genbank, suportando a aplicabilidade do ARDRA-PCR para a determinação
das espécies de Acinetobacter.
69
REFERÊNCIAS
ABDALHAMID, B.; HASSAN, H.; ITBAILEH, A.; SHORMAN, M. Characterization of
carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates in a tertiary care
hospital in Saudi Arabia. New Microbiologica, v. 37, p. 65-73, 2014.
ACOSTA, J.; MERINO, M.; VIEDMA, E.; POZA, M.; SANZ, F.; OTERO, J. R.; CHAVES, F.; BOU, G. Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Harboring OXA-24 Carbapenemase, Spain. Emerging Infectious Diseases, v. 17, n. 6, p. 1064-1067, 2011. AFZAL-SHAH, M.; WOODFORD, N.; LIVERMORE, D. M. Characterization of OXA-25, OXA-26, and OXA-27, molecular class D beta-lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 45, p. 583-588, 2001. AL-AGAMY, M. H.; SHIBL, A. M.; ALI, M. S.; KHUBNANI, H.; RADWAN, H. H.; LIVERMORE, D. M. Distribution of β-lactamases in carbapenem-non-susceptible Acinetobacter baumannii in Riyadh, Saudi Arabia. Journal of Global Antimicrobial Resistance, v. 2, n. 1, p. 17-21, 2014.
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 3389-3402, 1997.
AMBLER, R. P. The structure of β-lactamases. Philos Trans R Soc Lond B Bio Sci,
v. 289, p. 321-31, 1980. ANTONIO, C. S.; NEVES, P. R.; MEDEIROS, M.; MAMIZUKA, E. M. High Prevalence of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Carrying the blaOXA-
143 Gene in Brazilian Hospitals. Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 55, n. 3, p. 1322-1323, 2011. ANVISA/Agência Nacional de Vigilância Sanitária 2010. Nota técnica Nº 1/2010: Medidas para identificação, prevenção e controle de infecções relacionadas à assistência à saúde por micro-organismos multirresistentes. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/portal/anvisa/home/serviçosdesaude> Acessado em 05 de Abril de 2014. AYGUN, G.; DEMIRKIRAN, O.; UTKU, T.; METE, B.; URKMEZ, S.; YILMAZ, M.; YASAR, H.; DIKMEN, Y.; OZTÜRK, R. Environmental contamination during a carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit. Journal of Hospital Infection, v. 52, p. 259-262, 2002. BAUMANN, P.; DOUDOROFF, M.; STANIER, R. Y. A study of the Moraxella group. II. Oxidative-negative species (genus Acinetobacter). Journal of Bacteriology, v.
95, p. 1520–1541, 1968.
70
BEACHEY, E. H. Bacterial adherence: adhesion-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surface. The Journal of Infectious Disease, v. 143, p. 325-345, 1981. BEGGS, C. B.; KERR, K. G.; SNELLING, A. M.; SLEIGH, P. A. Acinetobacter spp. and the Clinical Environment. Indoor and Built Environment, v. 15, n. 1, p. 19-24, 2006. BEIJERINCK, M. Pigmenten als oxydatieproducten gevormd door bacterien.Versl.
Koninklijke Akad. Wetensch. Amsterdam, v. 19, p. 1092–1103, 1911. BERGOGNE-BÉRÉZIN E.; TOWNER, K. J. Acinetobacter spp. as Nosocomial Pathogens: Microbiological, Clinical, and Epidemiological Features. Clinical Microbiology Reviews, v. 9, n. 2, p. 148-165, 1996. BERLAU, J.; AUCKEN, H.; MALNICK, H.; PITT, T. Distribution of Acinetobacter species on skin of healthy humans. European Journal Clinical Microbiology & Infectious Diseases, v. 18, p. 179–183, 1999. BERNARDS, A. T.; HARINCK, H. I.; DIJKSHOORN, L.; van der REIJDEN, T. J.; van den BROEK, P. J. Persistent Acinetobacter baumannii? Look inside your medical equipment. Infection Control and Hospital Epidemiology, v. 25, n. 11, p. 1002-1004, 2004. BIGLARI, S.; HANAFIAH, A.; RAMLI, R.; RAHMAN, M.; KHAITHIR, T. M. N. Clinico-epidemiological nature and antibiotic susceptibility profile of Acinetobacter species. Pakistan Journal of Medical Sciences, v. 29, n. 2, p. 469-473, 2013.
BOU, G.; CERVERÓ, G.; DOMÍNGUEZ, M. A.; QUEREDA, C.; MARTÍNEZ-BELTRÁN, J. Characterization of a Nosocomial Outbreak Caused by a Multiresistant Acinetobacter baumannii Strain with a Carbapenem-Hydrolyzing Enzyme: High-Level Carbapenem Resistance in A. baumannii Is Not Due Solely to the Presence of β-Lactamases. Journal of Clinical Microbiology, v. 38, n. 9, p. 3299–3305, 2000.
BOUVET, P. J. M.; GRIMONT, P. A. D. Taxonomy of the genus Acinetobacter with the recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov., and Acinetobacter junii sp. nov. and emended descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii. International Journal of Systematic Bacteriology, v. 36, p. 228–240, 1986.
BROSSARD, K. A.; CAMPAGNARI, A. A. The Acinetobacter baumannii Biofilm-Associated Protein Plays a Role in Adherence to Human Epithelial Cells. Infection and Immunity, v. 80, n. 1, p. 228-233, 2012.
BRISOU, J.; PREVOT, A. R. Etudes de systematique bacterienne. X. Revision des especes réunies dans le genere Achromobacter. Annales de Institut Pasteur (Paris), v. 86, p. 722-728, 1954.
BROWN, S.; AMYES, S. OXA β-lactamases in Acinetobacter: the story so far. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 57, p. 1-3, 2006.
71
BUSH, K.; JACOBY, G. A.; MEDEIROS, A. A. Functional Classification Scheme for β –Lactamases and Its Correlation with Molecular Structure. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 39, p. 1211–1233, 1995. BUSH, K.; JACOBY, G. A. Updated Functional Classification of β-Lactamases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 3, p. 969–976, 2010.
CARMARENA, L.; BRUNO, V.; EUSKIRCHEN, G.; POGGIO, S.; SNYDER, M. Molecular mechanisms of ethanol-induced pathogenesis revealed by RNA-sequencing. PLOS Pathogens, v. 6, n. 4, e1000834, 2010.
CARVALHO, K. R.; CARVALHO-ASSEF, A. P. D.; PEIRANO, G.; SANTOS, L. C. G.; PEREIRA, M. J. F.; ASENSI, M. D. Dissemination of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii genotypes carrying blaOXA-23 collected from hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 34, p. 25–28, 2009. CHAN, M. C.; CHIU, S. K.; HSUEH P. R.; WANG, N. C.; WANG, C. C.; FANG, C. T.
Risk Factors for Healthcare-Associated Extensively Drug-Resistant Acinetobacter
baumannii Infections: A Case-Control Study. Plos One, v. 9, n. 1, p. 1-7, 2014.
CHANG, H. C.; WEI, Y. F.; DIJKSHOORN, L.; VANEECHOUTTE M.; TANG, C. T.; CHANG, T. C. Species-level identification of isolates of the Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex by sequence analysis of the 16S-23S rRNA gene spacer region. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 4, p. 1632-1639, 2005. CHOI, C. H.; LEE, E. Y.; LEE, Y. C.; PARK, T. I.; KIM, H. J.; HYUN, S. H.; KIM, S. A.; LEE, S. K.; LEE, J. C. Outer membrane protein 38 of Acinetobacter baumannii localizes to the mitochondria and induces apoptosis of epithelial cells. Cellular Microbiology, v. 7, n. 8, p. 1127-1138, 2005. CIESLINSKI, J. M.; AREND, L.; TUON, F. F.; SILVA, E. P.; EKERMANN, R. G. S.; DALLA-COSTA, L. M.; HIGGINS, P. G.; SEIFERT, H.; PILONETTO, M. Molecular epidemiology characterization of OXA-23 carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii isolated from 8 Brazilian using repetitive sequence-based PCR. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v. 77, p. 337-340, 2013. CLARK, R. B. Imipenem resistance among Acinetobacter baumannii: association with reduced expression of a 33-36 kDa outer membrane pro protein. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.38, p.245-251, 1996. COELHO, J.; WOODFORD, N.; AFZAL-SHAH, M.; LIVERMORE, D. Occurrence of OXA-58-Like carbapenemases in Acinetobacter spp. collected over 10 years in three continents. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 50, n. 2, p. 756–758, 2006. CORRÊA, L. L.; BOTELHO, L. A. B.; BARBOSA, L. C.; MATTOS, C. S.; CARBALLIDO, J. M.; de CASTRO, C. L. T.; MONDINO, P. J. J.; de PAULA, G. R.; de
72
MONDINO, S. S. B.; de MENDONÇA-SOUZA, C. R. V. Detection of blaOXA-23 in Acinetobacter spp. isolated from patients of a university hospital. Brazilian Journal of Infectious diseases, v. 16, n. 6, p. 521-526, 2012.
COSTERTON, J. W.; STEWART, P. S.; GREENBERG E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, v. 84, p. 1318-1322, 1999. DALLA-COSTA, L. M.; COELHO, J. M.; SOUZA, H. A.; CASTRO, M. E.; STIER, C. J.; BRAGAGNOLO, K. L.; REA-NETO, A.; PENTEADO-FILHO, S. R.; LIVERMORE, D. M.; WOODFORD, N. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil. Journal of Cinical Microbiology,
v. 41, n. 7, p. 3403-3406, 2003. DEPARDIEU, F.; PODGLAJEN, I.; LECLERCQ, R.; COLLATZ, E.; COURVALIN, P. Modes and Modulations of Antibiotic Resistance Gene Expression. Clinical Microbiology Reviews, v. 20, n. 1, p. 79-114, 2007. DÍEZ, A. I. D.; PÉREZ, M. A. B.; BOUZA, J. M. E.; GÓMEZ, A. A.; RODRÍGUEZ, P. G.; GÓMEZ, M. A. M.; DOMINGO, A. O.; RODRÍGUEZ-TORRES, A. Susceptibility of the Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii complex to imipenem, meropenem, sulbactam and colistin. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 23,
p.487–493, 2004. Di NOCERA, P. P.; ROCCO, F.; GIANNOULI, M.; TRIASSI, M.; ZARRILLI, F. Genome organization of epidemic Acinetobacter baumannii strains. Microbiology, v.
11, p. 224-240, 2011. DIJKSHOORN L.; van HARSSELAAR, B.; TJERNBERG I.; BOUVET P. J. M.; VANEECHOUTTE M. Evaluation of amplified ribosomal DNA restriction analysis for identification of Acinetobacter genomic species. Systematic and Applied Microbiology, v. 21, p. 33–39, 1998.
DIJKSHOORN, L.; VAN AKEN, E.; SHUNBURNE, L.; van der REIJDEN, T. J.; BERNARDS, A. T.; NEMEC, A.; TOWNER, K. J. Prevalence of Acinetobacter baumannii and other Acinetobacter spp. in faecal samples from non-hospitalised individuals. Clinical Microbiology and Infection, v. 11, p. 329–332, 2005. DIJKSHOORN, L.; NEMEC, A.; SEIFERT H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology, v. 5, p.
939–951, 2007. DIJKSHOORN, L.; NEMEC, A. The diversity of the genus Acinetobacter, p. 1-34. In U. Gerischer (ed.), Acinetobacter molecular microbiology. Caister Academic Press, Norfolk, United Kingdom, 2008. DONALD, H. M.; SCAIFE, W.; AMYES, S. G.; YOUNG, H. K. Sequence analysis of ARI-1, a novel OXA beta-lactamase, responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii 6B92. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.44, p.196–199, 2000.
73
DONAY, J. L.; MATHIEU, D.; FERNANDES, P.; PRÉGERMAIN, C.; BRUEL, P.; WARGNIER, A.; CASIN, I.; WEILL, F. X.; LAGRANGE, P. H.; HERRMANN, J. L. Evaluation of the automated Phoenix system for potential routine use in the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 4, p. 1542-1546, 2004. DZIDIC, S.; SUSKOVIC, J.; KOS, B. Antibiotic resistance mechanisms in bacteria: biochemical and genetic aspects. Food Technology Biotechnology, v. 46, n. 1, p. 11-21, 2008. ECKER, J. A.; MASSIRE, C.; HALL, T. A.; RANKEN, R.; PENNELLA, T. T.; AGASINO, I. C.; BLYN, L. B.; HOFSTADLER, S. A.; ENDY, T. P.; SCOTT, P. T.; LINDLER, L.; HAMILTON, T.; GADDY, C.; SNOW, K.; PE, M.; FISHBAIN J.; CRAFT, D.; DEYE, G.; RIDDELL, S.; MILSTREY, E.; PETRUCCELLI, B.; BRISSE, S.; HARPIN, V.; SCHINK, V.; ECKER, D. J.; SAMPATH, R.; ESHOO, M. W. Identification of Acinetobacter species and genotyping of Acinetobacter baumannii by multilocus PCR and mass spectrometry. Journal of Clinical Microbiology, v. 44, n.
8, p. 2921-2932, 2006. . ELNIFRO, E. M.; ASHSHI, A. M.; COOPER, R. J.; KLAPPER, E. PAUL. Multiplex PCR: Optimization and application in diagnostic virology. Clinical Microbiology Reviews. v. 13, p.559-570, 2000. ESPINAL, P.; ROCA, I.; VILA, J. Clinical impact and molecular basis of antimicrobial resistance in non-baumannii Acinetobacter. Future Microbiology, v. 6, n. 5, p. 495-
511, 2011. FEIZABADI, M. M.; FATHOLLAHZADEH, B.; TAHERI-KALANI, M.; RASOOLINEJAD, M.; SADEGHIFARD, N.; ALIGHOLI, M. Antimicrobial susceptibility patterns and distribiution of blaOXA genes among Acinetobacter spp. isolated from patients at Tehran hospital. Japanese Journal of Infectious Diseases, v. 61, p.
274-278, 2008. FERNÁNDEZ-CUENCA, F.; MARTÍNEZ-MARTÍNEZ, L.; CONEJO, M. C.; AYALA, J. A.; PEREA, E. J.; PASCUAL, A. Relationship between beta-lactamase production, outer membrane protein and penicillin-binding protein profiles on the activity of carbapenems against clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 51, p. 565-574, 2003. FIGUEIREDO, D. Q.; SANTOS, K. R. N dos; PEREIRA, E. M.; SCHUENCK, R. P.; MENDONÇA-SOUZA, C. R. V.; TEIXEIRA, L. M.; MONDINO, S. S. B. First Report of the blaOXA-58 gene in a clinical isolate of Acinetobacter baumannii in Rio de Janeiro, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 106, n. 3, p. 368-370, 2011.
FIGUEIREDO S.; BONNIN R. A.; POIREL L.; DURANTEAU J.; NORDMANN P. Identification of the naturally occurring genes encoding carbapenem-hydrolysing oxacillinases from Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter johnsonii, and Acinetobacter calcoaceticus. Clinical Microbiology and Infection, v. 18, p. 907–913, 2012.
74
FONSECA, E. L.; SCHEIDEGGER, E.; FREITAS, F. S.; CIPRIANO, R.; VICENTE, A.
C. P. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii from Brazil: role of carO alleles
expression and blaOXA23 gene. BMC Microbiology, v. 13, p. 1-7, 2013.
FORSTER, D. H.; DASCHNER, F. D. Acinetobacter species as nosocomial pathogens. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, v.
17, p. 73-77, 1998. FOUAD, M.; ATTIA, A. S.; TAWAKKOL, W. M.; HASHEM, A. M. Emergence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii harboring the OXA-23 carbapenemase in intensive care units of Egyptian hospitals. International Journal of Infectious Diseases, v. 17, n. 12, p. 1252-1254, 2013.
FOURNIER, P. E.; RICHET, H. The Epidemiology and Control of Acinetobacter baumannii in Health Care Facilities. Clinical Infectious Diseases, v. 42, n. 5, p. 692-699, 2006. FURTADO, G. H.; CAVALCANTE, A. C.; MEDEIROS, E. A.; GALES, A. C.; OLIVEIRA, V. G.; GIRARDELO, R. Bloodstream infections with OXA-23-producing Acinetobacter baumannii isolates in a university-affiliated hospital in Brazil: epidemiology and clinical outcomes. American Journal of Infection Control, v. 39, p. 706–708, 2011. GALES, A. C.; TOGNIM, M. C.; REIS, A. O.; JONES, R. N.; SADER, H. S. Emergence of an IMP-like metallo-enzyme in an Acinetobacter baumannii clinical strain from a Brazilian teaching hospital. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v. 45, p. 77-79, 2003. GARNACHO-MONTERO, J.; AMAYA-VILLAR, R. Multiresistant Acinetobacter baumannii infections: epidemiology and management. Current Opinion Infectious Disease, v. 23, p. 332-339, 2010.
GERNER-SMIDT, P.; TJERNBERG, I.; URSING, J. Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species. Journal of Clinical Microbiology, v. 29, p.
277–28, 1991. GERNER-SMIDT, P. Ribotyping of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. Journal of Clinical Microbiology, v. 30, n. 10, p. 2680-2685,
1992. GUNDI, V. A. K. B.; DIJKSHOORN, L.; BURIGNAT, S.; RAOULT, D.; LA SCOLA, B. Validation of partial rpoB gene sequence analysis for the identification of clinically important and emerging Acinetobacter species. Microbiology, v. 155, p. 2333-2341, 2009. GUO, L.; YE, L.; ZHAO, Q.; MA, Y.; YANG, J.; LUO, Y. Comparative study of MALDI-TOF MS and VITEK 2 in bacteria identification. Journal of Thoracic Disease, v. 6, n. 5, p. 534-538, 2014. GURUNG, J.; KHYRIEM, A. B.; BANIK, A.; LYNGDOH, W. V.; CHOUDHURY, B.; BHATTACHARYYA, P. Association of biofilm production with multidrug resistance
75
among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit. Indian Journal of Critical Care Medicine, v. 17, n. 4, p. 214-218, 2013. GUSATTI C. S.; BERTHOLDO, L. M.; OTTON, L. M.; MARCHETTI, D. P.; FERREIRA, A. E.; CORÇÃO, G. First occurrence of blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii isolated from a clinical sample in southern Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 43, n. 1, p. 243-246, 2012. GUSTEN, W. M.; HANSEN, E. A.; CUNHA, B. A. Acinetobacter baumannii pseudomeningitis. Heart Lung, v. 31, p. 76, 2002.
HIGGINS, P. G.; POIREL, L.; LEHMANN, M.; NORDMANN, P.; SEIFERT, H. OXA-143, a novel carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, n. 12, p. 5035-5038,
2009. HIGGINS, P. G.; DAMMHAYN, C.; HACKEL, M.; SEIFERT, H. Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 65, n. 2, p. 233-238, 2010a. HIGGINS, P. G.; SCHNEIDERS, T.; HAMPRECHT, A.; SEIFERT, H. In Vivo Selection of a Missense Mutation in adeR and Conversion of the Novel blaOXA-164 Gene into blaOXA-58 in Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates from a Hospitalized Patient. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, n. 12, p.
5021-5027, 2010b. HOWARD, A.; O’DONOGHUE, M.; FEENEY, A.; SLEATOR, R. D. Acinetobacter baumannii an emerging opportunistic pathogen. Virulence, v. 3, p. 243-250, 2012.
IDZENGA, D.; SCHOUTERN, M. A.; van ZANTEN, A. R. Outbreak of Acinetobacter genomic species 3 in a Dutch intensive care unit. The Journal of Hospital Infection, v.63, n. 4, p. 485-487, 2006. JACOBS, A. C.; HOOD, I.; BOYD, K. L.; OLSON, P. D.; MORRISON, J. M.; CARSON, S.; SAYOOD, K.; IWEN, P. C.; SKAAR, E. P.; DUNMAN, P. M. Inactivation of phospholipase D diminishes Acinetobacter baumannii Pathogenesis. Infection and Immunity, v. 78, n. 6, p. 1952-1962, 2010. JAWAD, A.; SNELLING, A. M.; HERITAGE J.; HAWKEY, P. M. Comparison of ARDRA and recA-RFLP analysis for genomic species identification of Acinetobacter spp. FEMS Microbiology Letters, v. 165, n. 2, p. 357–362, 1998a. JAWAD, A.; SEIFERT, H.; SNELLING, A. M.; HERITAGE, J.; HAWKEY, P. M. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces: comparison of outbreak and sporadic isolates. Journal of Clinical Microbiology, v. 36, n. 7, p. 1938-1941, 1998b. JOLY-GUILLOU, M. L. Clinical impact and pathogenicity of Acinetobacter. Clinical Microbiology and Infection, v. 11, p. 868-873, 2005.
76
JONES, R. N.; FERRARO, M. J.; RELLER, L. B.; SCHRECKENBERGER, P. C.; SWENSON, J. M.; SADER, H. S. Multicenter Studies of Tigecycline Disk Diffusion Susceptibility Results for Acinetobacter spp. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, n. 1, p. 227-230, 2007. JORGENSEN, R. A.; CLUSTER, P. D. Modes and temps in the evolution of nuclear ribossomal DNA: new characters for evolutionary studies and new markers for genetic and population studies. Annual Missouri Botanical Garden, v. 75, p. 1238-
1247, 1989. JOSHI, S. G.; LITAKE, G. M. Acinetobacter baumannii: An emerging pathogenic threat to public health. World Journal of Clinical Infectious Diseases, v. 3, n. 3, p.
25-36, 2013. KARAGEORGOPOULOS, D. E.; KELESIDIS, T.; KELESIDIS, I.; FALAGAS, M. E. Tigecycline for the treatment of multidrug-resistant (including carbapenen-resistant) Acinetobacter infections: a review of the scientific evidence. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 62, n. 1, p. 45-55, 2008.
KIM, U. J.; KIM, H. K.; AN, J. H.; CHO, S. K.; PARK, K-H.; JANG, H-C. Update on the epidemiology, treatment, and outcomes of carbapenem-resistant Acinetobacter infections. Chonnam Medical Journal, v. 50, p. 37-44, 2014.
KO, W. C.; LEE, N. Y.; SU, S. C.; DIJKSHOORN, L.; VANEECHOUTTE, M.; WANG, L. R.; YAN, J. J.; CHANG, T. C. Oligonucleotide array-based identification of species in the Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii complex in isolates from blood cultures and antimicrobial susceptibility testing of the isolates. Journal of Clinical Microbiology, v. 46, p. 2052-2059, 2008.
KONG, B. H.; HANIFAH, Y. A.; YUSOF, M. Y.; THONG, K. L. Application of amplified ribosomal DNA restriction analysis in the identification of Acinetobacter baumannii from a Tertiary Teaching Hospital, Malaysia. Tropical Biomedicine, v. 28, n. 3, p.
563-568, 2011. KULAH, C.; AKTAS, E.; COMERT, F.; OZLU, N.; AKYAR, I.; ANKARALI, H. Detecting imipenem resistance in Acinetobacter baumannii by automated systems (BD Phoenix, Microscan WalkAway, Vitek 2); high error rates with Microscan WalkAway. BMC Infectious Diseases, v. 9, n. 30, p. 1-7, 2009.
LA SCOLA, B.; GUNDI, V. A.; KHAMIS, A.; RAOULT, D. Sequencing of the rpoB gene and flanking spacers for molecular identification of Acinetobacter species. Journal of Clinical Microbiology, v. 44, p. 827-832, 2006.
LANDMAN, D.; QUALE, J. M. MAYORGA, D.; ADEDEJI, A.; VANGALA, K.; RAVISHANKAR, J.; FLORES, C.; BROOKS, S. Citywide clonal outbreak of multiresistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa in Brooklyn, NY: the preantibiotic era has returned. Archives of Internal Medicine, v. 162, p. 1515-1520, 2002. .
77
LEE, J. C.; KOERTEN, H.; van den BROEK, P.; BEEKHUIZEN, H.; WOLTERBEEK, R.; van den BARSELAAR, M.; van der REIJDEN, T.; van der MEER, J.; van de GEVEL, J.; DIJKSHOORN, L. Adherence of Acinetobacter baumannii strains to human bronchial epithelial cells. Research in Microbiology, v. 157, n. 4, p. 360-366, 2006. LEE, H. W.; KOH, Y. M.; KIM, J.; LEE, J. C.; LEE, Y. C.; SEOL, S. Y.; CHO, D. T.; KIM, J. Capacity of multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces. Clinical Microbiology and Infection, v. 14, n. 1, p. 49-54, 2008. LEE, K.; KIM, M. N.; CHOI, T. Y.; CHO, S. E.; LEE, S.; WHANG, D. H.; YOUNG, D.;
CHONG, Y.; WOODFORD, N.; LIVERMORE, D. M.; KONSAR GROUP. Wide
dissemination of OXA-type carbapenemases in clinical Acinetobacter spp. isolates
from South Korea. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 33, p. 520-
524, 2009.
LEE, Y. T.; TURTON, J. F.; CHEN, T. L.; WU, R. C.; CHANG, W. C.; FUNG, C. P.;
CHEN, C. P.; CHO, W. L.; HUANG, L. Y.; SIU, L. K. First identification of blaOXA-51-
like in non-baumannii Acinetobacter spp. Journal of Chemotherapy, v. 21, n. 5, p.
514-520, 2009.
LEE, Y. T.; KUO S. C.; CHIANG, M. C.; YANG, S. P.; CHEN, C. P.; CHEN T. L.; FUNG, C. P. Emergence of Carbapenem-Resistant Non-baumannii Species of Acinetobacter Harboring a blaOXA-51-Like Gene That Is Intrinsic to A. baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 56, n. 2, p. 1124-1127, 2012. LEVY, S. B.; MARSHALL, B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine Supplement, v. 10, n. 12, p. 122-129, 2004.
LIM, Y. M.; SHIN, K. S.; KIM, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, p. 902-905, 2007.
LIVERMORE, D. M. β-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology Reviews, v. 8, n. 4, p. 557–584, 1995. LIVERMORE, D. M.; DUDLEY, M. N. Antimicrobials: better use, better drugs, or both? Current opinion in Microbiology, v. 3, p. 487-488, 2000.
LUIZ, S. O. Caracterização da Resistência de amostras de Acinetobacter baumannii isoladas no Hospital de Clínicas de Curitiba. 2006. 79 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia, Parasitologia e Patologia)-Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Paraná, 2006. LUPSKI, J. R. Molecular mechanisms for transposition of drug-resistance genes and other movable genetic elements. Reviews of Infectious Diseases, v. 9, n. 2, p.
357-368, 1987.
78
McDONALD, L. C.; WALKER, M., CARSON, L.; ARDUINO, M.; AGUERO, S. M.; GOMEZ, P.; McNEIL, P.; JARVIS, W. R. Outbreak of Acinetobacter spp. bloodstream infections in a nursery associated with contaminated aerosols and air conditioners. Pediatric Infectious Disease Journal, v. 17, n. 8, p. 716, 1998. MANIATIS, T.; FRITCH, E. E. F.; SAMBROOK, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989, 2nd
ed. 3 volumes. MARAGAKIS, L. L.; PERL, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology,
Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases, v.
46, p. 1254-1263, 2008.
MARTINS, H. S. I.; BOMFIM, M. R. Q.; FRANÇA, R. O.; FARIAS, L. M.; CARVALHO,
M. A. R.; SERUFO, J. C.; SANTOS, S. G. Resistance Markers and Genetic Diversity
in Acinetobacter baumannii Strains Recovered from Nosocomial Bloodstream
Infectious. International Journal of Environmental Research and Public Health,
v. 11, n. 2, p. 1465-1478, 2014.
MEDEIROS, A. A. Evolution and dissemination of β-lactamases accelerated by generations of β-lactam antibiotics. Clinical Infectious Diseases, v. 24, p. 19-45, 1997. MEDEIROS, F. de; YABUMOTO, R.; MOTTA, F. A. Fatores de Mortalidade em Pacientes de UTI de Trauma de um Hospital Terciário de Referência Colonizados e/ou Infectados por Acinetobacter baumannii. Newslab, v. 86, p. 124-138, 2008. MEYER, R.; HÖFELEIN, C.; LÜTHY, J.; CANDRIAN, U. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food. Journal of AOAC International, v. 78, n. 6, p. 1542-1551, 1995. MOHAJERI, P.; FARAHANI, A.; FEIZABADI, M. M.; KETABI, H.; ABIRI, R.; NAJAFI,
F. Antimicrobial susceptibility profiling and genomic diversity of Acinetobacter
baumannii isolates: A study in western Iran. Iranian Journal of Microbiology, v. 5,
n. 3, p. 195-202, 2013.
MOSTACHIO, A. K.; van der HEIDJEN I.; ROSSI, F.; LEVIN, A. S.; COSTA, S. F. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding oxacillinases and metallo-β-lactamases in carbapenem-resistant Acinetobacter spp. Journal of Medical Microbiology, v. 58, n. 11, p. 1522-1524, 2009. MOROVAT T.; BAHRAM, F.; MOHAMMAD, E.; SETAREH, S.; MEHDI, F. M. Distribution of different carbapenem resistant clones of Acinetobacter baumannii in Tehran Hospitals. New Microbiologica, v. 32, n. 3, p. 265-271, 2009. NAAS, T.; LEVY, M.; HIRSCHAUER, C.; MARCHANDIN, H.; NORDMANN, P. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the
79
carbapenemase OXA-23 in a tertiary care hospital of Papeete, French Polynesia. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 9, p. 4826-4829, 2005. NEELEMAN, C.; KLAASSEN, C. H.; DE VALK, H. A.; DE RUITER, M. T.; MOUTON, J. W. Amplified fragment length polymorphism fingerprinting is an effective technique to distinguish Streptococcus pneumoniae from other Streptococci and an efficient alternative to pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of pneumococci. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 1, p. 369-371, 2004. NEMEC, A.; BAERE, T.; TJERNBERG, I.; VANEECHOUTTE, M.; van der REIJDEN, T. J. K.; DIJKSHOORN, L. Acinetobacter ursingii sp nov. and Acinetobacter schindleri sp nov., isolated from human clinical specimens. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 51, p. 1891–1899, 2001.
NEMEC, A.; MUSÍLEK, M.; MAIXNEROVÁ, M.; BAERE, T.; van der REIJDEN, T. J. K.; VANEECHOUTTE, M.; DIJKSHOORN, L. Acinetobacter beijerinckii sp. nov. and Acinetobacter gyllenbergii sp. nov., haemoytic organisms isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 59, p. 118–124, 2009. NOWAK, P.; PALUCHOWSKA, P.; BUDAK, A. Distribution of blaOXA genes among carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii nosocomial strains in Poland. New Microbiologica, v. 35, p. 317-325, 2012.
PATON, R.; MILES, R. S.; HOOD, J.; AMYES, S. G. B. ARI-1: β-lactamase mediated imipenem resistance in Acinetobacter baumannii. International Journal of Antimicrobial Agents, v.2, n. 2, p.81–88, 1993.
PAUL, C. S.; MARYAN, I. D.; DANNIE, G. H. Acinetobacter, Alcaligenes, Chryseobacterium, Moraxella, and other nonfermentative gram-negative rods, p. 770-802. In MURRAY, P. R.; BARON, E. J.; JORGENSEN, J. H.; LANDRY, M. L.; PFALLER, M. A. Manual of clinical microbiology, 9th ed. ASM Press, 2007, Washington, DC. PELEG, A. Y.; SEIFERT, H.; PATERSON, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clinical Microbiology Reviews, v. 21, n. 3, p. 538–82, 2008. PELEG, A.Y; BREIJ, A. de; ADAMS, M. D.; CERQUEIRA, G. M.; MOCALI, S.; GALARDINI, M.; NIBBERING, P. H.; EARL, A. M.; WARD, D. V.; PATERSON D. L.; SEIFERT, H.; DIJKSHOORN, L. The Success of Acinetobacter Species; Genetic, Metabolic and Virulence Attributes. PLOS One, v.7, n.10, e46984, 2012. PERES-BOTA D.; RODRIGUEZ H.; DIMOPOULOS G.; DAROS, A.; MÉLOT, C.; STRUELENS, M.; VINCENT, J. Are infections due to resistant pathogens associated with a worse outcome in critically ill patients? Journal of infection, v. 47, n. 4, p.307-316, 2003.
80
PEREZ, F.; HUJER, A. M.; HUJER, K. M.; DECKER, B. K.; RATHER, P.N.; BONOMO, R.A. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 51, n. 10, p. 3471-3484, 2007.
PITTET, D. Infection control and quality health care in the new millennium. American Journal of infection Control, v. 33, n. 5, p. 258-267, 2005. POIREL, L.; MARQUÉ, S.; HÉRITIER, C.; SEGONDS, C.; CHABANAN, G.; NORDMANN, P. OXA-58, a Novel Class D β-Lactamase Involved in Resistance to Carbapenems in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemoterapy, v. 49, n. 1, p. 202-208, 2005.
POIREL, L.; NORDMANN P. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clinical Microbiology and Infection, v. 12, n. 9, p. 826-36, 2006. POIREL, L.; PITOUT, J. D.; NORDMANN, P. Carbapenemases: molecular diversity and clinical consequences. Future Microbiololy, v. 2, n. 5, p. 501-512, 2007. POIREL, L.; FIGUEIREDO, S.; CATTOIR, V.; CARATTOLI, A.; NORDMANN, P. Acinetobacter radioresistens as a Silent Source of Carbapenem Resistance for Acinetobacter spp. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 52, n. 4, p. 1252-1256, 2008. POIREL, L.; NAAS, T.; NORDMANN, P. Class D β-lactamases: diversity, epidemiology and genetics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 54, p. 24-38, 2010. POURNARAS, S.; MARKOGIANNAKIS, A.; IKONOMIDIS, A.; KONDYLI, L.; BETHIMOUTI, K.; MANIATIS, A. N.; LEGAKIS, N. J.; TSAKRIS, A. Outbreak of multiple clones of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates expressing OXA-58 carbapenemase in an intensive care unit. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 57, n. 3, p. 557–561, 2006.
QUEENAN, A. M.; BUSH, K. Carbapenemases: the Versatile β-lactamases. Clinical Microbiology Reviews, v. 20, n. 3, p. 440-458, 2007. RIBERA, A.; FERNÁNDEZ-CUENCA, F.; BECEIRO, A.; BOU, G.; MARTÍNEZ-MARTÍNEZ, L.; PASCUAL, A.; CISNEROS, J. M.; RODRÍGUEZ-BAÑO, J.; PACHÓN, J.; VILA, J. Antimicrobial Susceptibility and Mechanisms of Resistance to Quinolones and β-Lactams in Acinetobacter Genospecies 3. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 4, p. 1430-1432, 2004. RODLOFF, A. C.; GOLDSTEINM, E. J.; TORRES, A. Two decades of imipenem therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.58, p. 916-929, 2006.
RODRÍGUEZ-BAÑO, J.; MARTÍ, S.; SOTO, S.; FERNÁNDEZ-CUENCA, F.; CISNEROS, J. M.; PACHÓN, J.; PASCUAL, A.; MARTÍNEZ-MARTÍNEZ, L.; McQUEARY, C.; ACTIS, L. A.; VILA, J. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii:
81
associated features and clinical implications. Clinical Microbiology and Infection,
v. 14, n. 3, p. 276-278, 2008.
ROHLF, F. J. NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1. Exeter Software, New York, 98p, 2000. ROSSI, F. The Challenges of Antimicrobial Resistance in Brazil. Antimicrobial
Resistance, v. 52, p. 1138-1143, 2011.
SAHL, J. W.; GILLECE, J. D.; SCHUPP, J. M.; WADDELL, V. G.; DRIEBE, E. M.;
ENGELTHALER, D. M., KEIM, P. Evolution of a Pathogen: A Comparative Genomics
Analysis Identifies a Genetic Pathway to Pathogenesis in Acinetobacter. Plos One,
v. 8, n. 1, e54287, 2013.
SAFARI, M.; SAIDIJAM, M.; BAHADOR, A.; JAFARI, R.; ALIKHANI, M. Y. High
Prevalence of Multidrug Resistance and Metallo-beta-lactamase (MβL) producing
Acinetobacter baumannii Isolated from Patients in ICU Wards, Hamadan, Iran.
Journal of Research in Health Sciences, v. 13, n. 2, p. 162-167, 2013.
SANGER, F.; NICKELEN, S; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v. 74, n. 12, p. 5463-5467, 1977. SCAIFE, W.; YOUNG, H. K.; PATON, R. H.; AMYES, S. G. Transferable imipenem-resistance in Acinetobacter species from a clinical source. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 36, n. 3, p.585–586, 1995. SEIFERT, H.; BAGINSKI, R.; SCHULZE, A.; PULVERER, G. Antimicrobial susceptibility of Acinetobacter species. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
v. 37, n. 4, p. 750-753, 1993. SEIFERT, H.; DIJKSHOORN, L.; GERNER-SMIDT, P.; PELZER, N.; TJERNBERG, I.; VANEECHOUTTE, M. Distribution of Acinetobacter species on human skin: comparison of phenotypic and genotypic identification methods. Journal of Clinical Microbiology, v. 35, n. 11, p. 2819-2825, 1997.
SHEHATA, A. I. Phenotypic and Genotypic Typing of Multidrug-resistant
Acinetobacter baumannii by Plasmid Profiles and Multiplex-PCR Typing. Science
Journal of Microbiology, v. 2012, p. 1-7, 2012.
SHENG, W. H.; LIN, Y. C.; WANG. J. T.; CHEN, Y. C.; CHANG, S. C.; HSIA, K. C.; WU, R. J.; LI, S. Y. Identification of distinct ciprofloxacin susceptibility in Acinetobacter spp. by detection of the gyrA gene mutation using real-time PCR. Molecular and Cellular Probes, v. 23, p. 154-156, 2009. SINHA, M.; SRINIVASA, H.; MACADEN, R. Antibiotic resistance profile and extended spectrum beta-lactamase (ESBL) production in Acinetobacter species. Indian Journal of Medical Research, v. 126, n. 1, p. 63-67, 2007.
82
SKLARZ, M. Y.; ANGEL, R.; GILLOR, O.; SOARES, M. I. M. Evaluating amplified rDNA restriction analysis assay for identification of bacterial communities. Antonie Van Leeuwenhoek, v. 96, n. 4, p. 659-664, 2009. SOHRABI, N.; FARAJNIA, S.; AKHI, M. T.; NAGHILI, B.; PEYMANI, A.; AMIRI, Z.; REZAEE, M. A.; SAEEDI, N. Prevalence of OXA-type β-lactamases among Acinetobacter baumannii isolates from Northwest of Iran. Microbial Drug Resistance, v. 18, n. 4, p. 385-389, 2012.
SUNG, L. L.; YANG, D. le; HUNG, C. C.; HO, H. T. Evaluation of autoSCAN-W/A and the Vitek GNI+ AutoMicrobic System for Identification of Non-Glucose-Fermenting Gram-Negative Bacilli. Journal of Clinical Microbiology, v. 38, n. 3, p. 1127-1130,
2000. SUNG, J. Y.; KWON, K. C.; PARK, J. W.; KIM, Y. S.; KIM, J. M.; SHIN, K. S.; KIM, J.
W.; KO, C. S.; SHIN, S. Y.; SONG, J. H.; KOO, S. H. Dissemination of IMP-1 and
OXA Type β-Lactamase in Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. Korean
Journal of Laboratory Medicine, v. 28, n. 1, p. 16-23, 2008.
TENA, D.; MARTÍNEZ, N. M.; OTEO, J.; SÁEZ, D.; VINDEL, A.; AZAÑEDO, M. L.; SÁNCHEZ, L.; ESPINOSA, A.; COBOS, J.; SÁNCHEZ, R.; OTERO, I.; BISQUERT, J. Outbreak of Multiresistant OXA-24 and OXA-51-Producing Acinetobacter baumannii in an Internal Medicine Ward. Japanese Journal of Infectious Diseases,
v. 66, n. 4, p. 323-326, 2013. TENOVER, F. C.; ARBEIT, R. D.; GOERING, R. V.; MICKELSEN, P. A.; MURRAY, B. E.; PERSING, D.H.; SWAMINATHAN, B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, n. 9, p. 2233-9, 1995.
TENOVER, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. American Journal of Infection Control, v. 34, p. 3-10, 2006. TIEN, N.; YOU, B. J.; CHANG, H. L.; LIN, H. S.; LEE, C. Y.; CHUNG, T. C.; LU, J. J.; CHANG, C. C. Comparison of Genospecies and Antimicrobial Resistance Profiles of Isolates in the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii Complex from Various Clinical Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 56, n.
12, p. 6267-6271, 2012. TJERNBERG, I. Antimicrobial susceptibility of Acinetobacter strains identified by DNA-DNA hybridization. APMIS, v. 98, p. 320-326, 1990.
TOWNER, K. J. Clinical importance and antibiotic resistance of Acinetobacter spp. Proceedings of a symposium held on 4-5 November 1996 at Eilat, Israel. Journal of Medical Microbiology, v. 46, n. 9, p. 721-746, 1997.
TURTON, J. F.; WARD, M. E., WOODFORD, N.; KAUFMANN, M. E.; PIKE, R.; LIVERMORE, D. M.; PITT, T. L. The role of ISAba1 in expression of OXA
83
carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii. FEMS Microbiology Letters, v.
258, p. 72-77, 2006a. TURTON, J. F.; WOODFORD, N.; GLOVER, J.; YARDE, S.; KAUFMANN, M. E.; PITT, T. Identification of Acinetobacter baumannii by Detection of the blaOXA-51-like Carbapenemase Gene Intrinsic to this Species. Journal of Clinical Microbiology, v. 44, n. 8, p. 2974-2976, 2006b. TURTON, J. F.; SHAH, J.; OZONGWU, C.; PIKE, R. Incidence of Acinetobacter species other than A. baumannii among clinical isolates of Acinetobacter: evidence for emerging species. Journal of Clinical Microbiology, v. 48, p.1445–1449, 2010.
YABUMOTO, F. M.; OLIVEIRA, J. C. C. Resistência Bacteriana de Isolados de Acinetobacter baumannii em UTI. NewsLab - edição 108, p. 128-135, 2011. VANEECHOUTTE, M.; DIJKSHOORN, L.; TJERNBERG, I.; ELAICHOUNI, A.; VOS, P. de; CLAEYS, G.; VERSCHRAEGEN, G. Identification of Acinetobacter Genomic Species by Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, n. 1, p. 11-15, 1995.
VANEECHOUTTE, M.; DE BAERE, T. Taxonomy of the genus Acinetobacter, based on 16S ribosomal RNA gene sequences. In Acinetobacter Molecular Biology. Edited by U. Gerischer. Wymondham, UK: Horizon Scientific Press/Caister Academic Pres, p. 35–60, 2007. VILA, J.; MARCOS, M. A.; JIMENEZ DE ANTA, M. T. A comparative study of different PCR-based DNA fingerprinting techniques for typing of the Acinetobacter calcoaceticus-A.baumannii complex. Journal of Medical Microbiology, v. 44, n. 6, p. 482-489, 1996. VOS, P.; HOGERS, R.; BLEEKER, M.; REIJANS, M.; van de LEE, T.; HORNES, M.; FRIJTERS, A.; POT, J.; PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU, M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, v. 23, p. 4407–4414,
1995. WALSH, T. R.; BOLMSTRÖM, A.; QWÄRNSTRÖM, A.; GALES, A. Evaluation of a New Etest for Detecting Metallo-β-Lactamases in Routine Clinical Testing. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, n. 8, p. 2755-2759, 2002. WALSH, T. R. Emerging carbapenemases: a global perspective. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 36, p. 8-14, 2010.
WENDT, C.; DIETZE, B.; DIETZ, E.; RÜDEN H. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces. Journal of Clinical Microbiology, v. 35, n. 6, p. 1394-1397, 1997. WOODFORD, N.; FAGAN, E. J.; ELLINGTON, M. J. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extended-spectrum (beta)-lactamases. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 57, n. 1, p.154-155. 2006.
84
WOODFORD, N.; ELLINGTON, M. J.; COELHO, J. M.; TURTON, J. F.; WARD, M. E.; BROWN, S.; AMYES, S. G. B.; LIVERMORE, D. M. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 27, n. 4, p. 351-353, 2006. ZARRILLI, R.; GIANNOULI, M.; TOMASONE, F.; TRIASSI, M.; TSAKRIS, A. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities. Journal of Infection in Developing Countries, v. 3, n. 5, p. 335-341, 2009.
ZHENG, W; YUAN, S; LI, L. Analysis of hospital departmental distribution and antibiotic susceptibility of Acinetobacter isolated from sputum samples. American Journal of Infection Control, v. 41, n. 8, p. 73-36, 2013.