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Profesora: Sullymar Morales Marrero
Biotecnología Molecular
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Brranquitas
Departamento de Ciencias y Tecnología
Objetivos (Todos estos fueron cumplidos en el laboratorio)
Definir que son los plásmidos.
Diferenciar entre un plásmido y un vector.
Mencionar los tipos de plásmidos naturales
existentes.
Mencionar mecanismos de transformaciónnaturales y compararlos con los realizados en el
laboratorio.
Mencionar las partes importantes de los
plásmidos sintetizados.
Objetivos
Vectores de clonación
Plásmidos (plasmidios)
Conformaciones
High and low copy number
Narrow and broad host-range
Orígenes de replicación (bacterias, células
mamíferas)
Genes de selección (bacterias, células mamíferas)
Genes reporteros (bacterias, células eucariotas)
Multiple cloning site
Shuttle vector
Vectores
DNA extracromosomal
Autorepicable
Primer vector sintetizado - Cohen y Boyer
sintetizaron el primer plásmido cortando dos
plásmidos naturales con la enzima EcoRI y
ligando los mismos este fue llamado pSC101. En el
1980 le concedieron las patentes.
Plásmido pBR322
Construida en 1974, fue uno de los primeros plásmidos modificados genéticamente para ser usado en técnicas de ADN recombinante.
Estos principios fueron a menudo los vectores de bajo número de copias, lo que significa que se replican para producir sólo una o dos copias en cada célula.
Derivado pUC18 de pBR322 tiene un "alto número de copias" plásmido (> 500 copias por célula bacteriana).
Plasmid must have:
Plásmido pUC
1982, de desarrollar nuevas series de
plásmidos
Identificación de ADN extraño que
contiene células
**Tienen tres característica importante:
Alto número de copias
Azul - blanco selección
Polilinker
pUC19 Restriction Map
pUC19 Multiple Cloning Site
An
aly
sis
Re
co
mb
ina
nt
DN
A
Conformaciones de los vectores
a)Lineal b)circular abierto c) super enrollado
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Tamaño – deberían ser lo suficientemente
pequeños como para que se puedan separar
fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria hospedera.
Sitio de clonación – MCS posee secuencias de
reconocimiento para varias enzimas de
restricción. Este lugar se genera para que no se
pierda un gen sino que el plásmido circular se
vuelve lineal cuando digiere permitiendo la
inserción de un fragmento de interés.
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Genes marcadores – permiten la selección e
identificación de las células transformadas
mediante un plásmido recombinante de aquellas que no lo están. Ejemplos amp, tet, lacZ.
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Origen de replicación (ori) – lugar de replicación
de forma separada a los cromosomas.
Se conoce al número de plásmidos que hay en una
célula .
El número normal es pequeño (menor de 12
plásmidos). Plásmido de baja copias.
Alto número de copias (cientos de miles de copias de
plásmidos por células).
Origen de replicación Bacteriana (ori)
Necesidad de garantizar su amplificación en
bacterias.
Muchos vector llevar un origen que se deriva del
plásmido en E. coli (ColE1)
Esto garantiza una alta tasa de amplificación,
debido a que su replicación no depende en el cromosoma bacteriano.
Vector con un origen p15A también puede
replicar de forma independiente, pero su rango
de copia es inferior a los ColE1.
Si se utilizan dos vectores
Si el vector comparten un origen de replicación, es
incompatibles porque una bacteria sólo puede
replicar un origen.
Por lo tanto, si se desean replicar dos vectores, deben
tener dos orígenes de replicación diferentes.
Origen de replicación de vectores (levaduras)
• Estos plásmidos carecen de un ORI y deben integrarse directamente en el cromosoma huésped mediante recombinación homóloga.
Yeast Integrating plasmids (YIp)
Plásmidos de integración de levadura (YIp):
• Estos vectores contienen una secuencia de replicación autónoma (ARS) derivado del cromosoma de la levadura. Como su nombre indica, estos vectores pueden replicarse independientemente del cromosoma de la levadura; Sin embargo, tienden a ser inestables y pueden perderse durante la gemación.
Yeast Replicating plasmids(YRp):
Replicación de los plásmidos de levadura (YRp):
• Estos son considerados vectores de baja copia e incorporan parte de una ARS, junto con parte de una secuencia de centrómero (CEN). Estos vectores se replican como si fueran pequeños cromosomas independientes y están por lo tanto se encuentran típicamente en una sola copia.
Yeast Centromere plasmids (YCp):
Plásmidos de centrómero de levadura (YCp):
• Estos son más similares a los plásmidos bacterianos y son considerados de "alto copia". Un fragmento de la 2 micras (un plásmido de levadura natural) permite más de 50 copias a propagar de manera estable por célula.
Yeast Episomal plasmids(YEp):
Plásmidos episomales de levadura
Origen de replicación células animales
Dado que no existen ORIs mamíferos "natural", los
científicos han usurpado ORIs basada en virus para que
ejerza una función parecida.
Estos ORIs, sin embargo, requieren componentes
adicionales expresadas dentro de la célula para la
replicación eficaz.
Las líneas celulares que expresan el virus de Epstein-Barr (EBV)
El antígeno nuclear 1 (EBNA1)
El antígeno de SV40 (293E o células 293T)
permiten la amplificación episomal de los plásmidos que
contienen el EBV o SV40 viral ORIs, respectivamente.
La presencia de estos componentes virales ayuda a la replicación, pero no garantiza 100% de eficiencia de
transfección.
Shuttle vector
Construida de manera que se puede propagar
en dos especies hospedadoras diferentes.
Poseen dos orígenes de secuenciación para
diversos hospedadores.
Plasmid must have:
Gen
reportero
Genes de selección: Genes de resistencia
Genes de selección
Bacterias Mamíferos
Genes de selección (resistencia
células animales)
Genes de selección levaduras
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Secuencias del promotor de RNA – permite la transcripción in
vivo e in vitro por la RNA polimerasa.
Secuencias de cebadores – estos permite la secuenciación
de nucleótidos de fragmentos de DNA clonado que hayan sido insertados al plásmidos.
Tipos de vectores
Clonación Expresión
Vectores Lambda
Vectores bacteriófagos
• Cromosoma ƛ (lineal, 49pb)
• Fragmento se introduce en el centro del cromosoma
• Se empaquetan las partículas virales in vitro
• Se utilizan los fagos para infectar E. coli(crecimiento en capa)
• Contiene varios extremos con COS, pero en los extremos del cromosoma extremos cohesivos COS (recircula y se replica)
• Luego produce ciclo lítico
Síntesis de fragmento
Ciclo lisogénico y lítico
Proceso
Vectores cósmidos
Cósmidos
•Contienen extremos COS, origen de replicación y genes de resistencia antibiótica, pero la mayoría de los genes virales se han eliminado.
Similtud
•La clonación es en un sitio de restricción y luego se empaqueta
Diferencias
•Se replica por el origen de replicación con bajos números de copias.
•Se forman colonias que la recombinación es seleccionada por antibióticos
Fósmidos
Un fosmido, fagémido o fagómido es un tipo de
Vector de clonación empleado en
biotecnología, compuesto por un plásmido al
que se le ha incorporado el origen de replicación
de un fago filamentoso (fagos de ácido
desoxirribonucleico (ADN) monocatenario), tales como el fago M13.
La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la
punta de los pili del hospedador E. coli.
M13
http://materiais.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Vectores/vectores.html#_Toc436393285
http://slideplayer.es/slide/1399373/
Cromosomas artificiales
bacterianos (BAC)
Grandes plásmidos de bajo número de copias
Contienen genes que codifican al factor F
(conjunto de genes que controla la replicación bacteriana)
No esta muy claro como los BAC aceptan y
replican los genes.
Vector expresión
Estos permiten la síntesis de proteínas eucariotas
en células procariotas porque tienen la
secuencia promotora adyacente al sitio en donde se inserta el DNA.
La RNA polimerasa bacteriana se une al promotor
y sintetiza grades cantidades de RNA (inserto)
que luego se traduce a proteínas.
Luego la proteína puede ser aislada.
Vector de expresión
Sin embargo, no siempre es posible expresar una
proteína funcional.
A veces no se puede doblar adecuadamente o modificaciones de arreglo post traduccional
indispensables para el funcionamiento de la
proteína.
Se prefiere utilizar otro tipo de bacteria si se desea
realizar dicho acto como Bacillus subtilis
(secreción de proteínas).
Puede haber reconocimiento como foráneo o la proteína sintetizada puede ser letal.
Vectores de expresión
mamíferos
En mamíferos se utiliza en muchos casos virus
como el SV40 porque puede ser utilizado para
transportar los vectores de expresión.
Características
Fuerte secuencia promotora (viral)
Una señal de poliadenilación (cola al extremo 3’)
Cromosomas artificiales
de levaduras (YAC)
Pequeños plásmidos que han crecido en E. coli y
han sido introducidos en levaduras.
Es una versión en miniatura de un cromosoma eucariota
Origen de replicación
Marcadores de selección
Dos Telomeros
Centrómeros
Sitio de restricción
Vector Ti
Son plásmidos que se originan normalmente (200kb)
aislado de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Forma un tumor de agalla.
El ADN-T es parte de la (Ti) plásmido "inductor de
tumores" que se realiza por la mayoría de las cepas
de A. tumefaciens se inserta en el cromosoma.
Dependiendo del plásmido Ti, la longitud de la región
de ADN-T puede variar de aproximadamente 10 a 30
pares de kilobases (kb).
Vectores Ti
¿Qué
significan las
flechas dentro
del mapa de
los plásmidos?
Elementos específicos que debe tener
vectores eucariotas
Promotor eucarionte
Señal de poliadenilación
Secuencias Kozak y codón AUG
Intrón
Tags-proteínas de fusión
ori de replicación eucarionte como el de SV40 (mamíferos)
Marcador de selección para células eucariontes (paratransfecciones estables)
Segmentos de DNA para recombinación homóloga
Control de expresión en
eucariotas
Tipos de promotores en eucariotas
1. Promotor constitutivo
Un promotor no regulada que permite la
transcripción continua de su gen asociado.
2. Promotor regulado
La actividad de estos promotores es inducida
por la presencia o ausencia de factores bióticos
o abióticos. Los promotores inducibles son una
herramienta muy poderosa en la ingeniería
genética debido a la expresión de genes unidos
operativamente a ellos se puede activar o desactivar en ciertas etapas del desarrollo de un organismo o en un tejido particular.
Promotores eucariontes
Genes constitutivos y genes regulados. No todos los genes se expresan simultáneamente ni al mismo nivel.
Genes constitutivos: los que se expresan al mismo nivel independientemente de las condiciones ambientales
Genes regulados: aquellos que se expresan a distintos niveles (o no se expresan) dependiendo de las condiciones ambientales.
Constitutivos:
- SV40
- RSV (Respiratory syncytial virus)
- CMV (citomegalovirus)
- hEF-1(promotor humano)
- Ubc (promotor de un lentivirus)
Inducibles o regulados:
- Tet o T-Rex inducible por tetraciclina
- Olac inducible por IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido isómero de lactosa dispara el operon de expresión de lac)
- Metalotioneína inducible por metales pesados
- GAL4-E1b inducible por mifepristona (bloque el receptor)
Elementos de control de la expresión en eucariotas
5’ leader 3’ trailer1 2 3 5gen de interés4
Ejemplo de un mRNA producido por el plásmido
Para la producción de una proteína
1 AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG)
2 Secuencia señal de secreción
3 Tag para su purificación
4 Sitio de clivaje proteolítico
5 Señal de poliadenilación
Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazarproductos génicos difíciles de medir y determinar actividadpromotora.
PROMOTOR exón 1 exón 2intrón
5’ 3’
PROMOTOR GEN REPORTEROe.g. luciferasa
Estrategia de genes reporteros
CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracciónorgánica
GAL (-galactosidasa)Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo quese cuantifica
SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible
LUC (luciferasa)Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas disponibles
GFP (green fluorescent protein)Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia.
Genes reporteros comunes en células eucariotas
Control de expresión en bacterias
OPERONES INDUCIBLES
OPERONES REPRIMIBLES
operatorpromoter
Inducible operon: lactose
Digestive pathway model
GLUCOSE is food of choice
Don’t need lactose digesting enzymes
Gene is turned off
DNATATA
repressor ACTIVE repressor protein
repressor gene1 gene2 gene3 gene4
RNA
polymerase
Slide from Kim Foglia
mRNA
enzyme1 enzyme2 enzyme3 enzyme4
operatorpromoter
Inducible operon: lactose
Digestive pathway model
When lactose is present, binds to
lac repressor protein & triggers
repressor to release DNA
induces transcription
DNATATARNA
polymerase
repressor repressor protein
repressorlactose – repressor protein
complex
lactose
lac repressor gene1 gene2 gene3 gene4
1 2 3 4
lac lac
laclac
lac
lac
lac
conformational change in
repressor protein makes it
INACTIVE!
lac
lac
Slide from Kim Foglia
Lactose operon
What happens when lactose is present?
Need to make lactose-digesting enzymes
Lactose is allosteric regulator of repressor protein
Slide from Kim Foglia
Operones reprimibles:
Cuando un producto del metabolismo, el triptófano por
ejemplo, está en cantidades suficientes la bacteria puede
dejar de fabricar las enzimas que los sintetizan. En este
sistema, el producto funciona como correpresor uniéndose al
represor y de este modo detiene la síntesis proteica.
PROMOTORES
Tipos de Promotores
Procariotas
Tipos de Promotores
Eucariotas
Tipos de promotores
Eucariotas
Vectores de DNA y aplicaciones Tipo de vector Máximo tamaño de
inserción Aplicaciones Limitaciones
Vectores plásmidos
bacterianos (circulares)
6 - 12 Clonación de DNA, expresión
de proteínas, subclonación,
secuenciación directa del
inserto
Tamaño de inserción
restringido, expresión limitada
de proteínas, problema con
el numero de copias,
replicación restringida a las
bacterias
Vectores bacteriófagos
(lineales)
25 DNA complementario
(cDNA), bibliotecas
genómicas y bibliotecas de
expresión
Limitaciones al
empaquetamiento del DNA
por su tamaño de inserción,
problema de replicación del
hospedador
Cósmido (circular) 35 Bibliotecas genómicas y de
cDNA, clonación clonación
de grandes fragmentos
Restricciones de
empaquetamiento del fago;
no es ideal para la expresión
de proteínas; no se puede
replicar en células de
mamíferos.
Cromosoma artificial
bacteriano (BAC, circular)
300 Bibliotecas genómicas y
clonación de grandes
fragmentos
Replicación restringida a las
bacterias no se puede utilizar
para la expresión de las
proteínas.
Cromosoma artificial de
levadura (YAC, circular)
200 – 2,000 Bibliotecas genómicas y
clonación de grandes
fragmentos
Debe crecer en la levadura;
no se puede utilizar en
bacteria.
Vector Ti Varía dependiendo del tipo
de vector Ti utilizado
Transferencia de genes en
plantas
Limitado a su uso sólo en
células vegetales ; numero
de sitios de restricción
distribuido aleatoriamente; el
gran tamaño del vector
dificulta su manipulación.
Vector
Plasmid /Vectors
http://www.mfa.od.ua/
Plasmid database
Addgene – a better way to share plasmids
http://www.addgene.org/vector-database/
Requisitos para seleccionar el vector
Objetivo de la experimentación
Huésped a ser utilizado
insertar tamaño
número de copias
incompatibilidad (Incompatibilidad refiere al
hecho de que los diferentes plásmidos a veces no
pueden coexistir en la misma célula)
marcador seleccionable
sitios de clonación
funciones vectoriales especializados
Los plásmidos son conocidos por ser capaz de pasar de
una cepa bacteriana a otra.
Sin embargo, los plásmidos no pueden trasladarse y
replicar en todas las cepas.
Narrow and broad host-range
Estrecha gama de acogida en huésped
Narrow host range
Uno de los patrones que vemos más en la naturaleza plásmido (NHR) un "especialista".
Endosimbiontes como parásitos intracelulares tienden a especializarse a hosts específicos, es decir, se vuelven cada vez mejor a invadir y replicarse en ese huésped.
Del mismo modo, muchos elementos genéticos parecen haberse especializado a una estrecha gama de anfitriones.
Se cree que algunos plásmidos NHR han desarrollado en ciertos huésped para ser segundo cromosomas, probablemente debido a que eran muy estables en una cepa particular, aumentando con éxito su tamaño mediante la adquisición de genes del cromosoma del huésped.
Narrow and broad host-range
Amplia gama de acogida en huésped
Broad host range
En contraste, un plásmido (BHR), un "generalista", se ha adaptado para transferir y replicar en muchas especies bacterianas diferentes y frecuentemente alejadas.
Esta característica generalista de plásmidos BHR puede causar problemas en la sociedad humana, como la propagación de la resistencia a múltiples antibióticos entre las bacterias patógenas.
Comparativa
Por tanto, parece que los plásmidos NHR
funcionan como reservorios genéticos para un
grupo estrechamente relacionado de bacterias.
Mientras que los plásmidos BHR funcionan como
especialmente activos los transportadores de
genes a través de una amplia gama de especies.
Incluso con todo el conocimiento sobre
plásmidos que hemos ganado en los últimos 50
años, y la utilidad que han demostrado en el
laboratorio, se sabe relativamente poco acerca de su origen.
References
Glick, B. R. & Pasternack, J.J (2010). Molecular biotechnology: Principles and application of recombinant DNA. 4th ed. USA: American Society for Microbiology.
Lodge, J., Lund, P.A. & Minchin,S. (c2007). Gene cloning (electronic resource): principles and applications.New York ; Abingdon [England] : Taylor & Francis Group, c2007. Retrieved from http://www.netLibrary.com/urlapi.asp?action=summary&v=1&bookid=184298
Reece, R.J. (2004). Analysis of Genes and Genomes. España; John Wiley & Sons