ultrassonografia do tumor sÓlido de ehrlich …... · 2017. 5. 2. · dentre os tipos de exames, a...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ULTRASSONOGRAFIA DO TUMOR SÓLIDO DE EHRLICH
INOCULADO EM CAMUNDONGOS
Carla Martí Castelló
Orientadora: Profª. Drª. Naida C. Borges
GOIÂNIA
2017
ii
CARLA MARTÍ CASTELLÓ
ULTRASSONOGRAFIA DO TUMOR SÓLIDO DE EHRLICH
INOCULADO EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada para obtenção do grau
de Mestre em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal
de Goiás.
Área de concentração:
Patologia, clínica e cirurgia
Orientadora:
Profª. Drª. Naida Cristina Borges -EVZ/UFG
Comitê de orientação:
Prof. Dr. Andris Figueiroa Bakuzis –IF/UFG
Profª. Drª. Marina Pacheco Miguel-IPTSP/UFG
GOIÂNIA
2017
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.
CDU 639.09
Martí Castelló, Carla ULTRASSONOGRAFIA DO TUMOR SÓLIDO DE EHRLICHINOCULADO EM CAMUNDONGOS [manuscrito] / Carla Martí Castelló.- 2017. xiii, 46 f.
Orientador: Profa. Dra. Naida Cristina Borges; co-orientador Dr. Andris Bakuzis Figueiroa; co-orientadora Dra. Marina Pacheco Miguel. - Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ), Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Goiânia, 2017. Bibliografia. Anexos. Inclui lista de figuras, lista de tabelas.
1. Carcinoma Sólido de Ehrlich. 2. Modelos tumorais murinos. 3.Modo Doppler. 4. Ultrassonografia. I. Cristina Borges, Naida, orient. II.Título.
v
Dedico este trabalho ao Biel, por
fazer crescer em mim a maior força e
amor que jamais poderia imaginar.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço, em primeiro lugar, a meus pais e irmãos por compartilhar o grande amor
pelos animais que me fez escolher minha profissão e pelo apoio incondicional, estando perto
ou longe.
Agradeço a todos os meus amigos, da Catalunha e do Brasil, pois sempre foram
companheiros em todos os momentos. Em especial a Amanda, Leda, Glória, Gisana, Natércia,
Francy, Joelena, Rosa, Skarleth e Alejandro que sem a ajuda e apoio deles não teria conseguido
realizar este projeto.
À minha orientadora Profa. Dra. Naida Cristina Borges e meu comité e
coorientação Profa. Dra. Mariana Pacheco Miguel e Prof. Dr. Andris Figueiroa Bakuzis pela
dedicação, apoio, paciência e compreensão, inclusive nos momentos mais difíceis.
A todos os professores pelos ensinamentos compartilhados e aos funcionários da
Escola de Veterinária e Zootecnia e do Hospital Veterinário da UFG.
Ao programa de pós-graduação de Ciência Animal da escola de Veterinária e
Zootecnia da UFG por oferecer um curso de alta qualidade para auxiliar na minha formação e
à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
concedida que possibilitou me manter no país durante os estudos.
E, finalmente, agradeço ao doutorando em física Gustavo Capistrano, por ser um
ótimo companheiro, dividir conhecimentos e ser minha maior fonte de apoio e motivação tanto
na sala de ultrassonografia e laboratórios como fora da universidade.
vii
E a cura começava quando percebiam
que as adversidades
não são um impedimento para ser feliz
Rafael Santandreu
viii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ...................................................................................... 1
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................................... 2
2.1 Câncer ............................................................................................................................................... 2
2.1.1 Aspectos gerais ............................................................................................................................... 2
2.1.2 Fundamentos biológicos do crescimento tumoral .......................................................................... 3
2.1.3 Modelos tumorais ........................................................................................................................... 4
2.2 Ultrassonografia e outras técnicas de imagem no estudo de tumores ............................................... 6
2.2.1 Técnicas de imagem no estudo de tumores murinos ...................................................................... 6
2.2.2 Princípios físicos e generalidades da ultrassonografia ................................................................... 8
2.2.3 Estudo ultrassonográfico de tumores ........................................................................................... 12
3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .................................................................................................... 14
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 15
CAPÍTULO 2 – ARTIGO ..................................................................................................................... 22
B-MODE AND DOPPLER ULTRASONOGRAPHY OF SOLID EHRLICH CARCINOMA
INOCULATED IN MICE ..................................................................................................................... 22
INTRODUTION ................................................................................................................................... 23
MATERIAL AND METHODS ............................................................................................................ 24
RESULTS ............................................................................................................................................. 28
DISCUSSION ....................................................................................................................................... 33
REFERENCES ...................................................................................................................................... 36
CAPÍTULO 3 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 39
ANEXOS............................................................................................................................................... 40
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAS
FIGURA 1 – Imagem modo-B de carcinoma sólido de Ehrlich induzido no
subcutâneo. Evidenciando tecido hiperecoico correspondente a derme
(seta), tecido hipoecoico correspondente a tecido tumoral periférico
(a), tecido anecoico correspondente ao centro do tumor (b), limites para
as medidas do tumor (+). Camundongo Swiss albino. Transdutor linear,
18MHz secção transversal...................................................................... 8
FIGURA 2 – Esquema da variação das ondas sonoras transmitidas e recebidas pelo
transdutor. A) objeto imóvel reflete a onda com a mesma frequência
que foi emitida; B) objeto com movimentação em direção ao transdutor
reflete a onda com frequência maior que a emitida; C) objeto com
movimentação em direção contrária ao transdutor reflete a onda com
frequência menor do que a emitida......................................................... 10
FIGURA 3 – Imagem Doppler colorido de carcinoma sólido de Ehrlich induzido no
subcutâneo. Evidenciando fluxo em direção ao transdutor em cor
vermelha (a) e fluxo em direção contrária ao transdutor em cor azul
(b). Camundongo Swiss albino. Transdutor linear, 18MHz.................... 11
FIGURA 4 – Imagem tríplex Doppler de carcinoma sólido de Ehrlich induzido no
subcutâneo. Evidencia-se a amostra (traços horizontais em verde) e o
traçado espectral do fluxo sanguíneo em função do tempo (traçado
amarelo). Camundongo Swiss albino. Transdutor linear, frequência
18MHz.................................................................................................... 12
CAPÍTULO 2 - B-MODE AND DOPPLER ULTRASONOGRAPHY OF SOLID EHRLICH
CARCINOMA GROWTH IN SWISS ALBINO MICE
FIGURE 1 – A Swiss albino mouse in ventral recumbence in the foam be, with the
acoustic solid gelatin on him…………………………….. ……………. 26
FIGURE 2 – B-mode ultrasound images of ESC induced in the subcutaneous tissue
of Swiss albino mouse, showing in A) Longitudinal view showing the
measurements of length and height, B) Cross-sectional view showing
width and height measurements. 18MHz linear transducer ..………….. 26
FIGURE 3 – B-mode ultrasound images of ESC induced in the subcutaneous tissue
of Swiss albino mice; showing in A) complete capsule and
circumscribed margins; B) discontinuity in the capsule (marked by
arrow), giving rise to an image with partially undefined margins, C)
significant discontinuity in the capsule (marked by arrows), giving rise
x
to an image with indistinct margins, evidencing too, the heterogeneous
interior; D) homogeneous and hipoechogenic interior. 18MHz linear
transducer................................................................................................ 29
FIGURE 4 – Color Doppler mode ultrasound images of ESC induced in the
subcutaneous tissue of Swiss albino mice; showing in A) tumor without
vascular flow, the signals of flow in the skin marked with (*) are not
considered tumor flow; B) image with a single intratumoral vessel with
central distribution flow pattern; C) image with four intratumoral
vessels with peripheral distribution flow pattern; D) image with more
than five intratumoral vessels with mixed distribution flow pattern.
18MHz linear transducer ………………………………………….…… 31
FIGURE 5 – Triplex Doppler mode ultrasound images of ESC induced in the
subcutaneous tissue of Swiss albino mice; showing in A) intratumoral
vessel and their spectral trace showing the minimum of three
consecutive waves marking the peak of systolic velocity and the end of
diastolic velocity (+ cursors) to calculate the resistivity index, B)
extratumoral vessel and their spectral trace showing the delimitation of
the maximum speed average (green trace) for calculate the pulsatibility
index. 18MHz linear transducer ………...………………………...…… 32
FIGURE 6 – Graphic showing the statistical differences between the mean of
extratumoral and intratumoral RI and PI………………………………. 32
xi
LISTA DE TABELAS
TABLE 1 – Volume (mm3) of tumors in each exam................................................... 28
TABLE 2 – Percentages of tumors with each morphological characteristic
evaluated by ultrasonography………..................................................... 30
TABLE 3 – Percentages exams with each category of quantity of vessels and blood
flow distribution pattern evaluated by ultrasonography.......................... 31
xii
RESUMO
A pesquisa para o diagnóstico precoce, prevenção e novos tratamentos do câncer é um dos
principais desafios da medicina atual e os modelos tumorais in vivo são imprescindíveis para
esse fim. Técnicas de imagem, como a ultrassonografia, auxiliam a obter dados mais precisos
e diminuir o número de animais para obter resultados estatisticamente significativos. O
carcinoma de Ehrlich é um dos modelos mais usados, mas não existem descrições
ultrassonográficas dele. Nesse trabalho, foram realizados exames ultrassonográficos seriados,
em modo-B e Doppler, em carcinomas sólidos de Ehrlich (ESC) inoculados em camundongos.
A partir das medidas obtidas por ultrassom, foram analisados os padrões de crescimento e os
tumores foram separados em dois grupos dependendo da taxa específica de crescimento (SGR).
Foram comparadas as características ultrassonográficas da capsula, margens, ecotextura,
distribuição e quantidade de fluxo e os índices Doppler, Índice de Resistividade (IR) e Índice
de Pulsabilidade (IP), entre os grupos. Os ESCs apresentaram-se como tumores com padrões
de crescimento variáveis; uma capsula detectável por ultrassonografia, mas que pode apresentar
descontinuidade em alguns casos; fluxo detectável na maioria dos exames; e que podem
apresentam um foco de necrose central ou vários focos de necrose separados. Conclui-se que
os tumores que apresentam alta vascularização tendem a ter alta SGR enquanto os que
apresentam ausência de fluxo e ecotextura homogênea estão correlacionados com baixa SGR.
O estudo também demonstrou que as alterações e mudanças nos vasos tumorais se encontram
refletidas nos índices Doppler, apresentando IR e IP significativamente menores as dos vasos
extratumorais.
Palavras chave: Carcinoma Sólido de Ehrlich, Modelos tumorais murinos, Modo Doppler,
Ultrassonografia.
xiii
ABSTRACT
The research to prevent cancer, diagnose early, and find new therapies is one of the main
challenges of current medicine, and in vivo tumor models are essential for this aim. Imaging
techniques, such as ultrasound, assists the research by helping to obtain data that are more
accurate and to reduce the number of animals necessary to obtain statistically significant results.
Ehrlich carcinoma is one of the most widely used models but it has not an ultrasonographic
description. In this study, serial ultrasound examinations were performed, in B-mode and
Doppler, on Ehrlich solid carcinomas (ESC) inoculated in mice. From the measurements
obtained by ultrasound, the growth patterns were analyzed and the tumors were separated in
two groups depending on the specific growth rate (SGR). Ultrasonographic characteristics of
capsule, margins, echotexture, vascular flow, and Doppler indices of Resistivity Index (RI) and
Pulsability Index (PI) were compared between groups. ESC presents variable growth patterns;
a capsule detectable by ultrasound, which sometimes present discontinuity; detectable flow in
most of the exams; and the possibility of a central focus of necrosis or several necrosis focuses
separated by tissue. In conclusion, tumors with high vascularization tend to have high SGR,
while tumors that presented homogeneous echotexture and absence of blood flow tend to have
lower SGR. The study also showed that changes in tumor vessels are reflected in Doppler
indices, with significantly lower RI and PI, than normal vessels.
Key words: Ehrlich Solid Carcinoma, Murine tumor models, Doppler mode, Ultrasonography.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma das doenças mais comuns e graves da atualidade clínica, tanto na
medicina como na medicina veterinária. Por esse motivo, pesquisas relacionadas à prevenção,
detecção precoce e tratamentos que minimizem as consequências clínicas advindas da doença
são prioridade para área médica. Em países como o Brasil, as neoplasias conduzem a altas taxas
de mortalidade, devido ao fato de serem diagnosticadas em estágios avançados. Dentre os tipos
de câncer, o carcinoma e o adenocarcinoma mamários são os mais comumente diagnosticados
em mulheres e em fêmeas animais, principalmente, cadelas1,2,3.
Várias pesquisas na área da oncologia utilizam modelos experimentais com indução
de tumores. Atualmente, existem modelos in vitro e simulações virtuais que reduzem o número
de animais a serem utilizados. No entanto, os modelos in vivo ainda continuam sendo
imprescindíveis, haja vista serem os únicos que integram todos os fatores e complexos
processos do crescimento e invasão tumoral no organismo4. O carcinoma de Ehrlich, tanto em
sua forma ascítica como em sua forma sólida, é um dos modelos tumorais mais empregados,
tanto pela boa capacidade de manutenção e transplante das células tumorais como por ser um
bom modelo de tumor altamente invasivo, apresentando características similares aos
carcinomas mamários humanos5.
Diferentes modalidades de exames por imagem, auxiliam no estudo desses modelos
tumorais, permitindo a obtenção de dados sobre morfologia, fisiologia e vascularização da
lesão. Dentre os tipos de exames, a ultrassonografia possui vantagens por ser um método não
invasivo, por avaliar a lesão em tempo real, por ser completamente seguro e não interferir nos
tratamentos, além de gerar informação morfológica e vascular do local. Além disso, os achados
obtidos nos estudos ultrassonográficos experimentais, costumam fornecer informação
facilmente aplicável na clínica6,7.
Pretende-se nesse trabalho, descrever as características ultrassonográficas do
carcinoma sólido de Ehrlich, estudar a partir de medidas obtidas por ultrassom a sua cinética e
crescimento, comparando a ultrassonografia com os padrões de crescimento. Diante do exposto,
o objetivo desse trabalho é encontrar na ultrassonografia uma ferramenta que auxilie a prever o
comportamento do ESC para ajudar nos estudos pré-clínicos que usam esse modelo, assim
como também aportar informações sobre o diagnóstico ultrassonográfico de tumores que
possam ser aplicadas na clínica.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Câncer
2.1.1 Aspectos gerais
O câncer é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o
mundo, com aproximadamente 14 milhões de novos casos em 2012 e 8,8 milhões de mortes no
ano 2015, sendo a segunda causa de morte global8. Aproximadamente o 70% de casos de morte
por câncer ocorrem em países em vias de desenvolvimento, onde o diagnóstico tardio e
inacessibilidade aos tratamentos são comuns9. A Organização Mundial da Saúde (OMS) prevê
que o número de novos casos aumente em aproximadamente 70% nas próximas duas décadas8.
Devido a algumas das novas características da sociedade brasileira, como as
mudanças no perfil demográfico (envelhecimento da população, urbanização populacional e
industrialização) e a outros fatores de risco do mundo contemporâneo, aparecem as doenças
crônico-degenerativas como um novo centro de atenção para a saúde pública. Estima-se para o
biênio 2016-2017 a ocorrência de 600.000 casos novos de câncer no Brasil. Com relação ao
tipo de câncer, os que mais aumentam são os de pele não melanoma, seguidos dos de próstata
em homens e os mamários em mulheres e depois os de cólon e reto em ambos os sexos1.
Existem registros de dados sobre câncer em animais de estimação em diversos
países como Estados Unidos, Itália, Canadá, Reino Unido e Suécia. Os dados desses registros
mostram que nos últimos anos a tendência do número total de neoplasias em pequenos animais
é de aumento, provavelmente devido a maior longevidade desses animais, ligada às melhoras
em nutrição, prevenção de doenças infecciosas e dos métodos de diagnóstico e protocolos
terapêuticos. O único tipo de tumor que teve tendência a diminuir nesses registros é o mamário,
devido ao aumento de ovário-histerectomias preventivas10-16, essa diminuição não foi observada
em estudos realizados no Brasil2,3.
Estimar a incidência de câncer entre animais de estimação requer a enumeração de
todos os novos casos de câncer diagnosticados em uma determinada população em um
determinado intervalo de tempo, por isso, estimativas confiáveis requerem dados válidos sobre
a demografia da população e uma enumeração completa dos casos de câncer17, o que atualmente
é praticamente impossível no Brasil onde a maioria de animais de estimação não é registrada.
Porém, existem estudos sobre a prevalência de tipos de tumores atendidos em hospitais e
centros veterinários universitários como o realizado na Universidade Federal do Paraná, onde
foi sucedido um estudo retrospectivo em 333 cães. O tumor mais diagnosticado foi o mamário
3
seguido de mastocitoma, tumor venéreo transmissível e linfossarcoma. O mesmo trabalho
mostrou que quase 50% dos atendimentos na unidade de oncologia veterinária pesquisada
foram devidos a tumores mamários e se consideramos somente as cadelas esse cifra aumenta
para 70%2. Em outra pesquisa sobre prevalência de tumores mamários em cães realizada no
Brasil as neoplasias mamárias corresponderam a mais do 50% dos tumores das cadelas3. Nos
estudos em que avaliaram a prevalência dos diferentes tipos de tumores em cães o mais
frequente foi o adenocarcinoma mamário, seguido de adenoma mamário e carcinosarcoma
(tumor misto maligno de mama)2,18.
2.1.2 Fundamentos biológicos do crescimento tumoral
O câncer deriva de alterações genéticas (instabilidade genômica) e epigenéticas que
culminam com mudanças morfológicas e funcionais das células, principalmente, associadas à
proliferação descontrolada e perda da diferenciação celular. Estas alterações genéticas ocorrem
em oncogenes, genes supressores de tumor, genes do reparo do DNA, genes da apoptose e genes
da mobilidade, predominantemente. Desta forma, as células neoplásicas malignas apresentam
autonomia gênica, reprogramação do metabolismo energético, autosuficiência no crescimento,
a insensibilidade aos sinais de inibição de crescimento, evasão da apoptose, potencial
replicativo ilimitado, manutenção da angiogênese, invasão tecidual e metástase19-21.
Após as mutações gênicas, a característica inicial do câncer é o aumento da taxa
mitótica e, consequente aumento do número de células alteradas, vista na maioria dos casos
pela formação de tumores. Esta característica está associada à capacidade das células
neoplásicas não responderem à potente sinalização inibitória de proliferação celular conferida
aos genes supressores de tumores, os quais estão mutados ou inibidos no câncer. Desta forma,
quanto mais protoncogenes mutados e mais genes supressores de tumores estejam inibidos
maior será a taxa mitótica e maior o aumento de massa tumoral22,23.
Associado à ausência de resposta à inibição da proliferação celular, o crescimento
tumoral também está relacionado à inativação de genes indutores de apoptose, o que garante a
imortalidade das células24,25. Outra característica de malignidade é o potencial replicativo
ilimitado, o qual está relacionado com a ativação da enzima telomerase26. Quando células
tumorais adquirem capacidade replicativa ilimitada e conseguem evadir a apoptose, podem se
multiplicar indefinidamente sem controle e acumular danos genéticos adicionais que podem
aumentar a malignidade25. A replicação sem controle e o acúmulo de danos genéticos origina
células tumorais com características heterogêneas, com diferentes afinidades, com capacidade
de metastatização, sensibilidade a hormônios ou fatores de crescimento e resistência a fármacos.
4
Essa heterogeneidade tumoral é uma das principais limitações no diagnóstico, prognóstico e
eficácia do tratamento24.
Para poder crescer além de 2 mm de diâmetro, as células neoplásicas de tumores
sólidos precisam induzir a angiogênese intratumoral para o fornecimento de oxigênio,
nutrientes e outros fatores essenciais para manutenção do metabolismo celular27. A angiogênese
no ambiente tumoral é altamente estimulada por fatores pró-angiogênicos, tais como o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) e fatores fibroblásticos (FGF), produzidos tanto pelas
células tumorais quanto por macrófagos associados ao tumor23,27. Os vasos formados no tumor
apresentam-se imaturos, as vezes com lúmem colapsado, desorganizados, com aumento da
permeabilidade e sem organização hierárquica, ao contrário do observado no tecido normal que
possui vasos maduros com distribuição hierárquica de arteríolas, capilares e vênulas28-31. Estas
características dos vasos tumorais são responsáveis por uma ineficiência da função vascular no
tumor, que é compensada com um aumento da densidade vascular27.
Apesar de várias características serem associadas ao câncer, a única que realmente
é associada somente a este tipo de doença é a capacidade de invasão e metástase. A ativação da
metástase é um processo de múltiplas etapas em que somente algumas células tornam-se
capazes de realizar, e que pode acontecer em qualquer fase da evolução do câncer22. No entanto,
alguns aspectos acerca dos passos na cascata metastática permanecem pouco compreendidos32.
Vale ressaltar que as metástases são responsáveis por mais de 90% das mortes relacionadas ao
câncer, o que torna alvo de pesquisas o entendimento da sua evolução e o tratamento33,34.
2.1.3 Modelos tumorais
Os modelos tumorais são ferramentas de grande importância na pesquisa contra o
câncer, possibilitando a identificação de substâncias cancerígenas, o estudo dos mecanismos
moleculares e processos da tumorigênese e metástase e o desenvolvimento de terapias e seleção
de fármacos. Atualmente, existem diferentes tipos de modelos tumorais, como as simulações
virtuais e os modelos in vitro e in vivo4,35.
Os modelos in vivo capturam a complexidade da tumorigênese e do processo
metastático em um sistema vivo, mas a visualização dos passos individualmente e a extração
quantitativa de dados é geralmente difícil. Em contraste, os modelos in vitro têm uma relevância
fisiológica reduzida, preservando somente aspectos limitados do microambiente do tumor, mas
permitem o controle da maioria das variáveis experimentais possibilitando uma melhor análise
quantitativa4.
5
A análise in vitro de tecidos tumorais permitiu estudar as mudanças genômicas
apresentadas pelas células tumorais, mas apresenta limitações quanto ao estudo de fatores que
influenciam nos estágios iniciais do desenvolvimento35, já que o desenvolvimento do câncer
depende das mudanças intracelulares, mas também das interações entre essas células tumorais
e o seu microambiente36. Graças aos avanços na engenharia de tecidos, cultura 3D, biomateriais,
microfluidos e microfabricação essas limitações estão sendo reduzidas com a criação de
complexos cultivos com diferentes tipos celulares imitando o microambiente tumoral4,21.
Mesmo com grandes avanços nos modelos in vitro, os estudos dos processos de
metástase, de angiogênese e da resposta imune contra o câncer não mimetizam o que ocorre in
vivo. Por esta razão, os modelos animais experimentais de câncer ainda estão desempenhando
um papel vital na compreensão da tumorigênese e dos processos metastáticos e suas relações
com o ambiente in vivo, e na avaliação de novas terapias37.
Outra ferramenta inovadora paro o estudo de tumores e que pode chegar a reduzir
o número de animais usados na pesquisa é o uso de simulações tumorais virtuais. As simulações
podem ajudar a visualizar o tumor como um sistema biológico dinâmico auto-organizado,
conectando os dados já conhecidos sobre tumores e oncogênese. Mas para adquirir novos dados
e poder criar simulações precisa-se dos modelos in vitro e in vivo38.
Devido às limitações dos outros modelos tumorais, continua sendo imprescindível
o uso de modelos in vivo. Existem vários tipos de modelos tumorais in vivo, dependendo do
tipo de animal (íntegro, imunodeprimido ou geneticamente modificado) e dependendo do
mecanismo de produção do tumor (induzido com substâncias químicas ou implantado com
células tumorais). Os tumores implantados com células tumorais podem ser classificados
dependendo da origem dessas células e da forma e lugar de implantação. As células podem
proceder de qualquer tecido humano (xenoenxerto) ou de tecidos murinos (aloenxerto), e
podem ser implantadas no mesmo lugar de origem do tumor (implantação ortotópica) ou em
outras localizações (implantação ectotópica)39,40.
Um dos modelos experimentais mais estudados é o tumor de Ehrlich, por ser um
dos primeiros tumores transplantáveis conhecidos. Trata-se de uma neoplasia originária de
carcinoma mamário de camundongos fêmeas transplantado, inicialmente, na forma sólida e, a
partir de 1930, para a forma ascítica. A conversão do tumor de Ehrlich para a forma ascítica
permitiu padronizar o número de células inoculadas, quantificar a regressão e o crescimento
tumoral e estudar a célula tumoral propriamente dita5. As células tumorais são estabilizadas e
mantidas mediante transplantes intraperitoneais periódicos. Esse líquido ascítico pode ser
colhido, lavado e após contagem celular ser inoculado de forma subcutânea para obter um tumor
6
sólido mais estável comparado à aplicação diretamente no subcutâneo41,42. A indução do câncer
por meio da implantação subcutânea é um dos modelos mais usados, por ser tecnicamente fácil
de realizar e por apresentar excelente acessibilidade para monitorar a progressão tumoral e para
avaliar os efeitos dos tratamentos39.
2.2 Ultrassonografia e outras técnicas de imagem no estudo de tumores
2.2.1 Técnicas de imagem no estudo de tumores murinos
Os modelos tumorais podem servir para investigar novas abordagens do diagnóstico
por imagem do câncer, permitindo que as hipóteses sejam testadas rigorosamente no contexto
de um sistema biológico complexo. Nos últimos anos, foram desenvolvidas uma variedade de
técnicas e equipamentos para obter imagens de modelos tumorais de forma não invasiva, com
o objetivo de maximizar a utilidade de modelos de câncer in vivo. Técnicas não invasivas são
importantes para medir aspectos da biologia do tumor, anatômicos e funcionais em cada animal
de forma individual e dinâmica. A imageniologia permite medir aspectos da biologia do tumor
que não são evidentes e avaliar de forma não invasiva a resposta tumoral ao tratamento ao longo
do tempo6,7.
Algumas modalidades de imagem experimental são iguais às usadas na clínica,
como por exemplo, a ultrassonografia43,44, em outras modalidades os aparelhos são versões de
menor escala àquelas usadas na clínica, como no caso da ressonância magnética45. Já algumas
são somente experimentais, adaptadas para imagens pré-clínicas como, por exemplo, a
bioluminescência46.
No estudo de modelos tumorais murinos a ultrassonografia é útil para medir a carga
tumoral no tecido mole e os aspectos da vascularização e perfusão do tumor. Os aparelhos
ultrassonográficos para pesquisas pré-clínicas usam transdutores de frequências maiores (10-
75 MHz) dos usados na clínica (2-18 MHz)7,43,44. As principais vantagens desse método são
que não emite nenhum tipo de radiação prejudicial, baixo custo dos exames e fácil acesso e
aplicabilidade clínica. As desvantagens são a aplicabilidade somente a tecidos moles, campo de
visão limitado, inadequado para imagens de todo o animal e, contraste também limitado. Para
melhorar o contraste foram desenvolvidas microbolhas como agentes de contraste, aumentando
assim a utilidade do ultrassom para estudar à fisiologia vascular6,7.
A ressonância magnética pode produzir imagens com excelente detalhe anatômico
e ótimo contraste, mas é relativamente insensível, por isso sua principal aplicação é para
descrições anatômicas de tumores já bem estabelecidos, mas também é capaz de medir vários
7
aspectos da biologia45. Por outro lado a ressonância magnética hiperpolarizada é mais de 10.000
vezes mais sensível que a convencional e atualmente é a única técnica que permite visualizar o
metabolismo tumoral in vivo, em tempo real e de forma não invasiva, mas não é aplicável a
todas as reações metabólica47. A principal desvantagem da ressonância magnética é o alto custo
e elevado conhecimento técnico necessário, especialmente a hiperpolarizada6.
A tomografia computorizada cria uma imagem tridimensional a partir de muitas
imagens individuais de raios-X, a usada para modelos tumorais pré-clínicos é a micro
tomografia computorizada. Do mesmo modo que a ressonância magnética, a tomografia
computorizada oferece imagens de alta resolução anatómica, mas do mesmo modo que o raio-
X comum é relativamente pobre para imagens de tumores que surgem em tecido mole, nesses
casos podem ser usados iodo radio-opaco ou agentes de contraste para melhorar a imagem48,49.
A cintilografia é considerada uma das modalidades de imagem pré-clínica mais
sensível e altamente quantitativa permitindo medições precisas. A imagem mostra onde se
concentram os isótopos radioativos injetados e os detectores captam os raios gama emitidos por
esses isótopos radioativos depois de ter passado por um colimador50.
A imagem por bioluminescência é um método popular de imagem para modelos
murinos de câncer, devido a sua sensibilidade extremadamente alta e técnica relativamente
simples, segura e de baixo custo. Porém, devido à exigência de modificar geneticamente as
células alvo antes da imagem, atualmente não é aplicável na clínica. Na bioluminescência, as
células alvo tumorais expressam um transgene que faz expressar luciferase e gerar luz quando
é administrado um determinado substrato químico não endógeno46,51.
Para os modelos tumorais in vivo, a fluorescência é um método popular, acessível,
seguro, compatível com uma grande gama de outras análises e deferentemente da
bioluminescência o sinal pode ser detectado com hardware barato. A fluorescência pode ser
usada tanto em escala microscópica, que permite imagens com resolução de célula única, como
macroscópica de todo o animal, adequado para localizar populações de células52. A
fluorescência permite também a visualização de interações entre diferentes tipos de células
dentro do microambiente tumoral, em contrapartida, é uma técnica que só é capaz de penetrar
poucos centímetros no tecido53.
Em conjunto, a aplicação adequada de imagens não invasivas melhora a qualidade
dos dados experimentais e reduz o número de indivíduos necessários para produzir resultados
estatisticamente válidos. Cada modalidade de imagem tem vantagens diferentes e o uso de cada
uma vai depender do tipo de experimento e seus objetivos6.
8
2.2.2 Princípios físicos e generalidades da ultrassonografia
A ultrassonografia baseia-se na emissão de uma onda de ultrassom através de um
transdutor e a posterior recuperação desse ultrassom após atravessar as diferentes interfaces dos
tecidos com os que a onda colide. O mesmo transdutor que emitiu, recupera a onda de ultrassom
que é retornada e traduzida a voltagem gerando uma imagem no monitor54. Para representar as
imagens no monitor existem diferentes modos, entre os mais usados encontram-se o modo-B e
o modo Doppler.
a) Modo-B
Nesse modo, as ondas refletidas são traduzidas e expostas no monitor com
diferentes brilhos em uma escala de cinza. Os tecidos que absorvem os ultrassom sem refleti-
lo são chamados de anecogênicos e observa-se a geração de imagem preta; os que absorvem a
maior parte e só retornam uma pequena fração são chamados de hipoecogênicos e observa-se a
geração de imagens em diferentes tons de cinza escura; os tecidos que refletem grande parte ou
todo o feixe de ultrassom, são chamados de hiperecogênicos e observa-se a geração de imagens
de cinza claro a branco brilhante. A imagem gerada vai representar uma secção longitudinal ou
transversal dependendo da orientação do transdutor sobre a estrutura em estudo55 (Figura 1).
FIGURA 1 – Imagem modo-B de carcinoma sólido de Ehrlich induzido
no subcutâneo. Evidencia-se tecido hiperecoico
correspondente à derme (seta), tecido hipoecoico
correspondente ao tecido tumoral periférico (a), tecido
anecoico correspondente ao centro do tumor (b), limites
para as medidas do tumor (+). Camundongo Swiss albino.
Transdutor linear, 18MHz secção transversal.
9
Isso pode acontecer devido à propriedade dos tecidos em refletir as ondas sonoras.
Diferentes tecidos refletem as ondas de forma distinta, baseado nas variações intrínsecas da
estrutura do tecido como a densidade, quantidade de água, queratina, colágeno, etc. Essas
variações fazem com que o ultrassom seja uma ferramenta importante para distinguir as bordas
e interfaces entre regiões como, por exemplo, entre o subcutâneo que é hipoecogênica e a derme
que é mais ecogênica56.
Os parâmetros mais básicos a considerar quando se realiza um exame
ultrassonográfico são a frequência com que se emite o ultrassom e a profundidade em que esse
chega54. O ultrassom de baixa e alta frequência é usado para finalidades diferentes. O ultrassom
de baixa frequência é usado para visualizar estruturas grandes e profundas como os órgãos
internos56,57. Deve-se considerar que, a frequência de onda maior vai providenciar uma maior
resolução da imagem, mas vai diminuir a capacidade de penetração no tecido. Quanto maior a
frequência de onda que emite o transdutor, maior é a clareza e resolução da imagem dos tecidos
próximos ao transdutor.
Na avaliação de tumores subcutâneos e linfonodos regionais são usadas resoluções
dentre cinco e 18 MHz, o que permite uma maior penetração das ondas e visualização de
estruturas mais profundas58.
b) Modo Doppler
Os sistemas de ultrassonografia Doppler, detectam os tecidos em movimento,
permitindo observar e medir a velocidade e distribuição do fluxo sanguíneo59. A
ultrassonografia Doppler é baseada no princípio físico do efeito Doppler, o qual descreve a
mudança no comprimento de onda (frequência) de som que se produz quando existe movimento
relativo entre a fonte emissora e o receptor60.
Esta técnica ultrassonográfica usa a informação adicional nos ecos que retornam,
para avaliar o movimento de alvos móveis. Quando o som de alta frequência colide com uma
interface estacionária, o som refletido tem essencialmente a mesma frequência ou o mesmo
comprimento de onda do som transmitido (Figura 2A). Contudo, se a interface refletora estiver
em movimento com relação ao feixe sonoro emitido pelo transdutor, como no caso das células
sanguíneas, há uma mudança na frequência do som que se dispersa pelo objeto em movimento
(Figura 2B e 2C). Quando a interface refletora aproxima-se ao transdutor, as ondas são
percebidas com maior frequência (Figura 2B) e, por outro lado, quando a interface refletora
distancia-se são percebidas com menor frequência (Figura 2C)60-63.
10
FIGURA 2 – Esquema da variação das ondas sonoras transmitidas e recebidas pelo
transdutor. A) objeto imóvel reflete a onda com a mesma frequência que foi
emitida; B) objeto com movimentação em direção ao transdutor reflete a onda
com frequência maior que a emitida; C) objeto com movimentação em direção
contrária ao transdutor reflete a onda com frequência menor do que a emitida.
Fonte: Adaptado de Carvalho64.
Diferentes técnicas foram desenvolvidas para explorar todas essas informações de
mudança na frequência do ultrassom. Assim, atualmente existem vários modos de exibição
desta informação, sendo eles, Doppler contínuo, Doppler pulsado, Doppler colorido e Doppler
de amplitude56,63,65. Entre esses modos, os mais usados para o estudo de tumores são o Doppler
colorido, o Doppler de amplitude e o Doppler pulsado. Na ultrassonografia oncológica o
Doppler pulsado costuma a ser usado conjuntamente com o Doppler colorido, no nomeado
tríplex Doppler56.
O Doppler colorido fornece informações sobre a arquitetura vascular do órgão ou
mapeamento do leito vascular em estudo66. O sinal obtido é decodificado por cores em relação
ao sentido do movimento e por intensidade da cor em relação à velocidade do movimento das
células sanguíneas. Assim, sobre a imagem em modo-B é apresentada outra imagem, colorida,
que representa um mapeamento dos elementos móveis em relação à intensidade e ao sentido do
movimento64.
Convencionou-se que o fluxo em direção ao transdutor é vermelho e o fluxo em
direção contrária ao transdutor é azul. Os fluxos de maior velocidade são demonstrados por
tonalidades mais claras, como amarelo e laranja (dirigidos ao transdutor) e tons de azul claro
ou verde (contrários ao transdutor) (Figura 3)67.
11
FIGURA 3 – Imagem Doppler colorido de carcinoma sólido de
Ehrlich induzido no subcutâneo. Evidenciando fluxo
em direção ao transdutor em cor vermelha (a) e fluxo
em direção contrária ao transdutor em cor azul (b).
Camundongo Swiss albino. Transdutor linear, 18MHz.
Diferente do modo Doppler colorido, que mostra o ultrassom na imagem de
diferentes cores de acordo com a direção e a velocidade do fluxo, o modo Doppler de amplitude
permite que o fluxo seja visualizado somente numa cor homogênea, o laranja67. Teoricamente,
isso resulta em aumento da aplicação dinâmica do scanner, possibilitando ganho efetivo mais
alto sem artefatos e maior sensibilidade para detecção de fluxos lentos, lúmens de pequenos
vasos e avaliação qualitativa da perfusão parenquimal68.
No estudo de tumores, o Doppler pulsado é exibido junto com o Doppler colorido,
sendo denominado tríplex Doppler (Figura 4). Isso permite uma melhor identificação do vaso
alvo, disposta na tela em modo Doppler colorido63,69.
No Doppler pulsado, os dados sobre o desvio Doppler são representados na forma
de gráficos, como um espectro temporal do sinal que retorna. O tempo decorrido fica no eixo
horizontal ou linha de base e, a frequência de deslocamento Doppler, pode ser vista no eixo
vertical61,67. A detecção de desvio da frequência Doppler indica movimento do alvo, que na
maioria dos casos está relacionado com a presença de fluxo. O sinal de desvio da frequência,
positivo ou negativo, indica a direção do fluxo em relação ao transdutor62 (Figura 4).
12
FIGURA 4 – Imagem tríplex Doppler carcinoma sólido
de Ehrlich induzido no subcutâneo.
Evidencia-se a amostra (traços horizontais
em verde) e o traçado espectral do fluxo
sanguíneo em função do tempo (traçado
em amarelo). Camundongo Swiss albino.
Transdutor linear, frequência 18MHz.
2.2.3 Estudo ultrassonográfico de tumores
A ultrassonografia é uma ótima ferramenta para o diagnóstico de lesões de tecidos
moles, incluindo os tumores. Na pesquisa contra o câncer é usada tanto em estudos clínicos como
pré-clínicos para medir a carga tumoral e medir aspectos da vascularização e perfusão43,70.
A ultrassonografia em modo-B, é usada nas pesquisas com modelos tumorais in
vivo, principalmente para fazer um seguimento do crescimento e da evolução do volume
tumoral durante os tratamentos estudados. As medidas tomadas por ultrassonografia refletem
com maior precisão e reprodutibilidade o volume do tumor do que as tomadas com paquímetro
ou outros aparelhos métricos. Esses dados sugerem que os estudos que utilizam ultrassom
requerem menos animais para alcançar significância estatística43,71.
Em outros estudos, tanto clínicos como pré-clínicos, a ultrassonografia em modo-
B é usada para estudar as características morfológicas que podem ser visualizadas por ultrassom
e compará-las com as características histopatológicas e a malignidade72-74. As principais
características morfológicas a serem avaliadas no modo-B são o aspecto do tecido circundante,
localização do tumor, presença de cápsula, definição das margens, projeções papilares,
ecotextura e ecogenicidade73-75. A ecotextura pode ser classificada como homogênea ou
heterogênea73,74 e a ecogenicidade como cística quando é anecogênica ou sólida quando é
majoritariamente hiperecogênica ou hipoecogênica75.
13
Devido à importância do estudo da vascularização e perfusão sanguínea, a
ultrassonografia em modo Doppler vem sendo cada vez mais usada tanto nos estudos clínicos
como pré-clínicos de tumores. Empregando o modo Doppler, a vascularidade pode ser avaliada
in vivo, com a identificação de vasos tão pequenos como 0,1 mm de diâmetro76. Essa técnica é
proposta em estudos para auxiliar ao diagnóstico, como ferramenta para descobrir indícios de
malignidade ou ajudar na obtenção e biópsias72-74,77; para o estudo de neoangiogênese
funcional76,78 e também como técnica a ser usada na avaliação de tratamentos, especialmente
aqueles que interferem na angiogênese e vascularização do tumor79-81.
O mapeamento no modo Doppler colorido ou Doppler de amplitude é usado para
descrever a quantidade e o tipo de distribuição do fluxo. A forma de quantificar depende de
cada experimento e tipo de tumor. Os tumores com menos fluxo podem ser classificados com
fluxo ausente ou presente, marcando um tempo mínimo de escaneamento do tumor antes de ser
declarado ausente75. Também pode ser classificada como vascularização alta, média e baixa ou
por número de vasos presentes73,74. A distribuição do fluxo pode ser classificada como central
ou periférica75, mas dependendo do tipo de tumor tem que ser incluída a classificação de
distribuição mista, quando aparecem vasos centrais e periféricos ao mesmo tempo73,74.
Para o estudo de fluxo no tumor são analisados os índices Doppler, obtidos por
Doppler espectral. Os índices comparam o fluxo durante a sístole e a diástole73-75,82, ao contrário
da análise isolada da velocidade, têm como vantagem a independência da correção de ângulo,
sendo assim mais indicados para pequenos fluxos83. Entre os índices Doppler, no estudo da
vascularização tumoral, destacam-se o IR e IP, que fornecem informações acerca da resistência
arterial ao fluxo sanguíneo73-75,82. O IR relaciona o resultado da subtração entre as velocidades
de pico sistólico e diastólico final sobre a velocidade de pico sistólico e o IP relaciona o
resultado da subtração entre as velocidades de pico sistólico e diastólico final sobre a velocidade
média64. O aumento na velocidade diastólica leva a um correspondente aumento do fluxo
sanguíneo e redução dos índices IR e IP, portanto, baixa resistividade de fluxo sugere alto
metabolismo, e, altas resistências sugerem baixo metabolismo75,82. A vantagem do IR é sua alta
sensibilidade para diferenciar traçados anormais, porque o denominador nunca se torna zero,
permitindo sempre a obtenção de um valor para este índice. O IP tem como vantagem o fato de
levar em conta a velocidade média, que reflete o que ocorre durante todo o ciclo cardíaco, e não
em apenas um momento específico como o IR83.
Assim, o Doppler permite o estudo da vascularização local, a identificação de
alterações de calibre e trajeto de vasos, a determinação de parâmetros quantitativos de fluxo
sanguíneo e de resistência vascular64.
14
3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Os modelos tumorais murinos são de suma importância na pesquisa contra o câncer.
Os modelos in vivo são os únicos que capturam a complexidade do crescimento tumoral e dos
processos metastáticos, sendo necessários para poder criar modelos computacionais e confirmar
alguns dos resultados obtidos in vitro. Por ser um tumor facilmente transplantável, agressivo e
de rápido crescimento, o carcinoma de Ehrlich sólido é um dos modelos tumorais mais usados
na pesquisa contra o câncer.
As técnicas de diagnóstico por imagem ajudam a ter um melhor entendimento do
comportamento, tipo de crescimento e biologia do tumor. Esses conhecimentos contribuem na
precisão e melhora dos dados experimentais, podendo assim, reduzir o número de animais
utilizados em experimentos. A ultrassonografia é um método de imagem em tempo real, não
invasivo, seguro e compatível com praticamente todos os tipos de tratamentos e procedimentos
realizados nas pesquisas.
Na clínica, a ultrassonografia é uma importante ferramenta para o diagnóstico
precoce e prognóstico nos pacientes com câncer, enquanto se esperam os resultados
histopatológicos. O diagnóstico precoce é relevante em todos os contextos e na maioria dos
cânceres, quanto mais antecipado for o diagnóstico, mais probabilidade de responder a um
tratamento de forma eficaz, aumentando assim a sobrevivência e diminuído a morbidade.
Melhorias significativas podem ser feitas na vida de pacientes com câncer através da detecção
precoce e a ultrassonografia é uma importante ferramenta para esse fim. Os dados e achados
ultrassonográficos em estudos pré-clínicos, no geral, podem ser facilmente transferidos e
aplicados para a rotina clínica.
O objetivo desse trabalho foi descrever as características ultrassonográficas do
carcinoma sólido de Ehrlich, estudar a partir de medidas obtidas por ultrassom a sua cinética e
crescimento e comparar as características ultrassonográficas, tanto morfológicas como de
vascularização, com os padrões de crescimento, a fim de encontrar na ultrassonografia uma
ferramenta para prever o crescimento neoplásico. Essa informação pode contribuir tanto para
prever o comportamento em futuros estudos pré-clínicos que foram a usar esse modelo, como
na clínica, para efetuar um pré-diagnóstico e ter uma ideia do prognóstico enquanto não se têm
os resultados histopatológicos.
15
REFERÊNCIAS
1. Estimativa 2016/2017. Banco de dados do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes
da Silva (INCA) [acesso 10 fev 2017]. Disponível em: http://www.inca.gov.br.
2. De Nardi AB, Rodaski S, Sousa RS, Costa TA, Macedo TR, Rodigheri SM, Rios A, Piekarz
CH. Prevalência de neoplasias e modalidades de tratamento em cães atendidos no Hospital
Veterinário da Universidade Federal do Paraná. Arc Vet Sci. 2002;7(2):15-26.
3. Queiroga F, Lopes C. Tumores mamários caninos: pesquisa de novos fatores de prognóstico.
Rev Por Ciên Vet. 2002;97(543):119-27.
4. Katt ME, Placone AL, Wong AD, Xu ZS, Searson PC. In vitro tumor models: advantages,
disadvantages, variables and selecting the right platform. Front Bioengin Biotech.
2016;4(12):1-14.
5. Dunham LJ, Stewart HL. A Survery of transplantable and transmissible animal tumors. J
Natl Cancer I. 1953;13(5):1299-377.
6. Lyons SK. Imaging mouse models of cancer. Cancer J. 2015;21:152–64.
7. Wang Y, Tseng JC, Sun Y, Beck AH, Kung AL. Noninvasive imaging of tumor burden and
molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Laboratory Press [online]
2016:135-45 [acesso 12 set 2016]. Disponível em: http://cshprotocols.cshlp.org.
doi:10.1101/pdb.top069930.
8. Stewart BW, Wild CP, editores. World cancer report 2014. Lyon: International Agency for
Research on Cancer; 2014. 16-22p.
9. GBD 2015 Risk Factors Collaborators. Global, regional, and national comparative risk
assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters
of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet.
2016: 388 (10053):1659-724.
10. Dorn CR, Taylor DO, Schneider R, et al. Survey of animal neoplasms in Alameda and
Contra Costa Counties, California. II. Cancer morbidity in dogs and cats from Alameda County.
J Natl Cancer Inst 1968;40:307–318.
11. Priester WA, McKay FW. The occurrence of tumors in domestic animals. Natl Cancer Inst
Monogr 1980;1–210.
12. MacVean DW, Monlux AW, Anderson PS Jr. Frequency of canine and feline tumors in a
defined population. Vet Pathol 1978;15:700–15.
13. Merlo DF, Capurro C, Reggiardo G, et al. Cancer incidence rates in dogs: Preliminary
findings from the Animal Tumor Registry, Genova, Italy. In: Rossi L, Richardson R,
16
Harshbarger J, eds. Spontaneous Animal Tumors: A Survey. Proceedings of the First World
Conference on Spontaneous Animal Tumors 1995 Apr 28–30. Genoa (Italy); 2000:135–9.
14. Reid-Smith RJ, Bonnett BN, Martin SW, et al. The incidence of neoplasia in the canine and
feline patient populations of private veterinary practices in southern Ontario. Proceedings of
the 9th Symposium of the International Society for Veterinary Epidemiology and Economics,
Breckenridge, CO, August 6–11, 2000, 935–55.
15. Bonnett BN, Egenvall A, Olson P, Hedhammar A. Mortality in insured Swedish dogs: Rates
and causes of death in various breeds. Vet Rec 1997;141:40–4.
16. Dobson JM, Samuel S, Milstein H, et al. Canine neoplasia in the UK: Estimates of incidence
rates from a population of insured dogs. J Small Anim Pract 2002;43:240–46.
17. Merlo DF, Rossi L, Pellegrino C, Ceppi M, Cardellino U, Capurro C, Ratto A, Sambuco
PL, Sestito V, Tanara G, Bocchini V. Cancer incidence in pet dogs: finding of the Animal
Tumor Registry of Genoa, Italy. J Vet Intern Med. 2008;22:976–84.
18. Oliveira Filho JC, Kommers GD, Asuda EK, Marques, BMFPP, Fighera RA, Irigoyen LF,
Barros, CSL. Estudo retrospectivo de 1647 tumores mamários em cães. Pesq Vet Bras.
2010;30(2):177-85.
19. Brasileiro Filho G, Pereira FEL, Guimarães RC. Distúrbios do crescimento e da
diferenciação celulares. In: Brasileiro Filho G, editor. Bogliolo patologia geral. 5a ed. Belo
Horizonte: Guanabara Koogan; 2013. 243-253p.
20. Hanahan, D. and Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57–70.
21. Xu X, Farach-Carson MC, Jia X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer
research and drug evaluation. Biotechnol Adv. 2014;32:1256–68.
22. Cullen JM, Page R, Misorp W. An Overview of cancer pathogenesis, diagnosis and
management. In: Meuten DJ, editor. Tumors in domestic animals. 5th ed. North Carolina:
Wiley-Blackwell; 2016. 1-14p.
23. Balkwill F. Cancer and the chemokine network. Nat Rev Cancer. 2004;4:540-50.
24. Perez ML, Culver S, Owen JL, Dunbar M, Kow K, Breen M, Milner RJ. Partial cytogenetic
response with toceranib and prednisone treatment in young dog with chronic monocytic
leukemia. Anticancer Drug. 2013;24:1098-103.
25. Keller RL, Avery AC, Burnett RC, Walton JA, Olver CS. Detection of neoplastic
lymphocytes in peripheral blood of dogs with lymphoma by polymerase chain reaction for
antigen receptor gene rearrangement. Vet Clin Pathol. 2004;33:145-49.
17
26. Thalheim L, Williams LE, Borst LB, Fogle JE, Suter SE. Lymphoma immunophenotype of
dogs determined by immunohistochemistry, flow cytometry and polymerase chain reaction for
antigen receptor rearrangements. J Vet Intern Med. 2013;27:1509-16.
27. Qian CN, Tan M, Yang J, Cao Y. Revisiting tumor angiogenesis: vessel co‑option, vessel
remodeling, and cancer cell‑derived vasculature formation. Chin. J. Cancer. 2016;35(10):1-6.
28. McDonald DM, Baluk P. Imaging of angiogenesis in inflamed airways and tumors: newly
formed blood vessels are not alike and may be wildly abnormal: Parker B. Francis lecture.
Chest. 2005;128(6):602–8.
29. Yao X, Qian CN, Zhang ZF, Tan MH, Kort EJ, Yang XJ, et al. Two distinct types of blood
vessels in clear cell renal cell carcinoma have contrasting prognostic implications. Clin Cancer
Res. 2007;13(1):161–9.
30. Qian CN, Huang D, Wondergem B, Teh BT. Complexity of tumor vasculature in clear cell
renal cell carcinoma. Cancer. 2009;115(10):2282–9.
31. Qin L, Bromberg-White JL, Qian CN. Opportunities and challenges in tumor angiogenesis
research: back and forth between bench and bed. Adv Cancer Res. 2012;113:191–239.
32. Wirtz D, Konstantopoulos K, Searson PC. The physics of cancer: the role of physical
interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 2011;11:512–22.
33. Weigelt B, Peterse JL, Van’t Veer LJ. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat.
Rev. Cancer. 2005;5:591–602.
34. Mehlen P, Puisieux A. Metastasis: a question of life or death. Nat. Rev. Cancer. 2006;6:449–
58.
35. Conmy S, Nasheuer HP. The use of transgenic mice in câncer anf genome stability research.
In: Nasheure HP, editor. Genome Stability and Human Diseases. Galway: Springer Science
Business Media; 2010. 325-335p.
36. Cahill, D. P., Kinzler, K. W., Vogelstein, K. B., and Lengauer, C. Genetic instability and
Darwinian selection in tumours. Trends Cell Biol. 1999;9:57–90.
37. Pantaleão C, Luchs A. Câncer e modelos experimentais de tumores murinos. Rev Inst
Adolfo Lutz. 2010; 69(4):439-45.
38. Deisboek TS, Zhang L, Martin S. Advancing Cancer Systems Biology: Introducing the
Center for the Development of a Virtual Tumor, CViT. 2007;2:1–8.
39. Heijstek MW, Kranenburg O, Borel Rinkes IHM. Mouse Models of Colorectal Cancer and
Liver Metastases. Dig Surg. 2005;22:16-25.
40. Fantozzi A, Christofor G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res.
2006;8(212):1-11.
41. Tennant JR. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.
Transplantation Rev. 1964;2:685–94.
18
42. Calixto-Campos C, Zarpelon AC, Corrêa M, Cardoso RDR, Pinho-Ribeiro FA, Cecchini R,
Moreira EG, Crespigio J, Bernardy CCF, Casagrande R, Verri Jr WA. The Ehrlich tumor
induces pain-like behavior in mice: a novel model of cancer pain for pathophysiological studies
and pharmacological screening, Biomed Res Int. 2013;2013:1-12,
43. Ayers GD, McKinley ET, Zhao P, Fritz JM, Metry RE, Deal BC, Adlerz KM, Coffey RJ,
Manning HC. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by
ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 2010;29(6):891–
901.
44. Sastra SA, Olive KP. Quantification of murine pancreatic tumors by high resolution
ultrasound. Methods Mol Biol. 2013;980:249–66.
45. Boretius S, Kasper L, Tammer R, Michaelis T, Frahm J. MRI of cellular layers in mouse
brain in vivo. Neuroimage. 2009;47(4):1252–60.
46. Stacer AC, Nyati S, Moudgil P, Iyengar R, Luker KE, Rehemtulla A, Luker GD. NanoLuc
reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 2013;12(7):1–13.
47. Nelson SJ, Kurhanewicz J, Vigneron DB, Larson PEZ, Harzstark AL, Ferrone M, Van
Criekinge M, Chang JW, Bok R, Park I, Reed G, Carvajal L, Small EJ, Munster P, Weinberg
VK, Ardenkjaer-Larsen JH, Chen AP, Hurd RE, Odengardstuen LI, Robb FJ, Tropp J, Murray
JA. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-13C] pyruvate.
Sci Transl Med. 2013;5(198):198-208.
48. Wathen CA, Foje N, VanAvermaete T, Miramontes B, Chapaman SE, Sasser TA, Kannan
R, Gerstler S, Leevy WM. In vivo x-ray computed tomographic imaging of soft tissue with
native, intravenous, or oral contrast. Sensors. 2013;13(6):6957–80.
49. Lalwani K, Giddabasappa A, Li D, Olson P, Simmons B, Shojaei F, VanArsdale T,
Christensen J, Jackson-Fisher A, Wong A, Lappin PB, Eswaraka J. Contrast agents for
quantitative microCT of lung tumors in mice. Comp Med. 2013;63(6):482–90.
50. Beekman F, van der Have F. The pinhole: gateway to ultra-high-resolution three-
dimensional radionuclide imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2007;34:151–161.
51. Mezzanotte L, An N, Mol IM, Lowik CWGM, Kaijzel EL. A new multicolor
bioluminescence imaging platform to investigate NF-kappaB activity and apoptosis in human
breast cancer cells. PLoS One. 2014;9:1-12.
52. Ellenbroek SI, VanRheenen J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer.
2014;14:406–18.
53. Ritsma L, Steller EJ, Ellenbroek SI, Kranenbirg O, Rinkes IHMB, VanRheenen J. Surgical
implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat Protoc. 2013;8:
583–94.
54. Echeverría-García B, Borbujo J, Alfageme F. Incorporación de la ecografía em
Dermatología. Actas Dermosifiliogr. 2014;105(10):887-90.
19
55. Rumack CM, Wilson SR, Charboneau JW, Levine D. Física do ultrassom. In: Rumack CM,
Wilson SR, Charboneau JW, Levine D. Tratado de Ultrassonografia diagnóstica. 4a ed. Rio de
Janeiro: Elsevier. 2012. 32-43p.
56. Kleinerman R, Whang TB, Bard RL, Marmur ES. Ultrasound in dermatology: principles
and applications. J Am Acad Dermatol. 2012;67:478-87.
57. Wortsman X, Wortsman J. Clinical usefulness of variable-frequency ultrasound in localized
lesions of the skin. J Am Acad Dermatol. 2010;62:247-56.
58. Patel JK, Konda S, Perez OA, Amini S, Elgart G, Berman B. Newer technologies,
techniques and tools in the diagnosis of melanoma. Eur J Dermatol 2008;18:617-31.
59. Hernández C, del Boz J, de Troya M. ¿Esla ecografía cutánea de alta frecuencia una
alternativa en el diag-nóstico y manejo del carcinoma basocelular? Actas Dermosifiliogr. 2014;
105:107-11.
60. Naqvi J, Yap KH, Ahmad G, Ghosh J. Transcranial Doppler Ultrasound: A Review of the
Physical Principles and Major Applications in Critical Care. Int J Vasc Med [online]. 2013;
2013: 1-13. [acesso 04 fev 2017]. Disponível em: http://dx.doi.org/10.1155/2013/629378.
61. King AM. Development, advances and application of diagnostic ultrasound in animals. Vet
J. 2006; 3 (171):408-20.
62. Carvalho CF, Chammas MC, Cerri GG. Princípios físicos do Doppler em ultrassonografia:
revisão bibliográfica. Ciên. Rural. 2008;38(3):872-9.
63. McDicken WN, Hoskins PR. Physics: Principles, Practise and Artefacts. In: Pozniak MA,
Allan PL. Clinical Doppler Ultrasound. 3rd ed. China: Elsevier; 2014. 1-24p.
64. Carvalho CF. Ultrassonografia Doppler em pequenos animais. São Paulo: Roca; 2009.
274p.
65. Viecelli, C. F.; Martins, W. P.; Gallarreta, F. M. P.; Barra, D. A; Ferreira, C; A.; Ferreira,
A. C.; Mauad Filho, F. Ultrassonografia Doppler em ginecologia. Femina. 2008; 36(8):497-
503.
66. Sigel B. A brief history of doppler ultrasound in the diagnosis of peripheral vascular disease.
Ultrasound in Med. & Biol. 1998; 24(2):169–76.
67. Carvalho CF, Cerri GG, Chammas MC. Parâmetros Doppler velocimétricos das artérias
renais e da aorta abdominal em gatos da raça persa. Ciên. Rural. 2009;39(4):1105-10.
68. Roy HS, Zuo G, Luo Z, Wu H, Krupka TM, Ran H, Li P, Sun Y, Wang Z, Zhengy Y. Direct
and Doppler angle-independent measurement of blood flow velocity in small-diameter vessels
ultrasound microbubbles. Clin Imag. 2012;36(5):577-83.
69. Torp-Pedersen ST, Terslev L. Settings and artefacts relevant in colour/power Doppler
ultrasound in rheumatology. Ann Rheum Dis [online]. 2008; 67: 143-149 [acesso 12 jan 2017].
Disponível em: http://ard.bmj.com.
20
70. Nyman HT, Kristensen, AT, Lee FJ, Martinussen T, Mcevoy FJ. Characterization of canine
superficial tumors using gray-scale B mode, color flow mapping, and spectral Doppler
ultrasonography — a multivariate study. Vet. Radiol. Ultrasound. 2006;47:192–8.
71. Paltiel HJ, Diamond DA, DiCanzio J, Zurakowski D, Borer JG, Atala A. Testicular volume:
Comparison of orchidometer and US measurements in dogs. Radiology. 2002;222(1):114–9.
72. Papini E, Guglielmi R, Bianchini A, Crescenzi A, Taccogna S, Nardi F, Panunzi C, Rinaldi
R, Toscano V, Pacella CM. Risk of malignancy in nonpalpable thyroid nodules: predictive
value of ultrasound and color-Doppler features. J Clin Endocr Metab. 2002;87(5):1941–6.
73. Nyman HT, Nielsen OL, Mcevoy FJ, Lee MH, Martinussen T, Hellmén E, Kristensen AT. Comparison of B-mode and Doppler ultrasonographic finding with histologic features of benign
and malignant mammary tumors in dogs. Am J Vet Res. 2006;67(6)985-91.
74. Soler M, Dominguez E, Lucas X, Novellas R, Gomes-Coelho KV, Espada Y, Agut A.
Comparison between ultrasonographic findings of benign andmalignant canine mammary gland
tumours using B-mode, colour Doppler, power Doppler and spectral Doppler. Res Vet Sci.
2016;107:141–46.
75. Khurana I, Satia MN. Preoperative evaluation of ovarian masses with color Doppler and its
correlation with pathological finding. Int J Reprod Contracept Obstet Gynecol. 2016;5(7):
2084-92.
76. Xuan JW, Bygrave M, Jiang H, Valiyeva F, Dunmore-Buyze J, Holdsworth DW, Izawa JI,
Bauman G, Moussa M, Winter SF, Greenberg NM, Chin JL, Drangova M, Fenster A, Lacefield
JC. Functional neoangiogenesis imaging of genetically engineered mouse prostate cancer using
three-dimensional Power Doppler ultrasound. Cancer Res. 2007;6(6):2830-9.
77. Sohail SK, Sarfraz R, Imran M, Khan NA, Yusuf NW. Power doppler ultrasonography
guided and random prostate biopsy in prostate cancer diagnosis: a comparative study. J Pak
Med Assoc. 2015;65:65-8.
78. Lordanescu I, Becker I, Zetter B, Dunning P, Taylor GA. Tumor vascularity: evaluation in
a murine model with contrast-enhanced color Doppler US—effect of angiogenesis inhibitors.
Radiology. 2002;222:460–7.
79. Gee MS, Saunders HM, Lee JC, Sanzo JF, Jenkins WT, Evans SM, Trinchieri G, Sehgal
CM, Feldman MD, Lee WMF. Doppler ultrasound imaging detects changes in tumor perfusion
during antivascular therapy associated with vascular anatomic alterations. Cancer Res. 2001;61:
2974–82.
80. Alhasan MK, Liu L, Lewis MA, Magnusson J, Mason RP. Comparison of optical and power
Doppler ultrasound imaging for non-invasive evaluation of arsenic trioxide as a vascular
disrupting agent in tumors. PLoS One. 2012;7:1-9.
81. Kim SJ, Kim SK, Lee ES, Ro J, Kang SH. Predictive value of 18-FDG PET for pathological
response of breast cancer to neoadjuvant chemotherapy. Ann Oncol. 2004;15(9):1352-7.
82. Gandhi R, Nayyar AS, BhowateR, Gandhi S, Dongerwar G. Color Doppler
Ultrasonography in Mapping Oral Squamous Cell Carcinoma. Middle East J Cancer. 2015;
6(3):179-87.
21
83. Nelson TR, Pretorius D H. The Doppler signal: where does it como and what does it mean?
Am J Roentgenol. 1988 ;151:439-47.
22
CAPÍTULO 2 – ARTIGO
Redigido de acordo com as normas do Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
(Anexo B)
B-MODE AND DOPPLER ULTRASONOGRAPHY OF SOLID EHRLICH
CARCINOMA INOCULATED IN MICE
[Ultrassonografia em modo B e Doppler de carcinomas sólidos de Ehrlich inoculados em
camundongos]
ABSTRACT
Ehrlich Solid Carcinoma (ESC) is one of the tumor models used against cancer research.
Although ESC is a widely used tumor model, there are no ultrasonographic descriptions of it.
In this study, serial ultrasonographic exams were performed during 35 days, in B-mode and
Doppler, in ESC inoculated in 18 Swiss albino mice. From the measurements obtained by
ultrasound, the growth patterns were analyzed and the tumors were separated in two groups
depending on specific growth rate (SGR), a high rate group (HR) and a low rate group (LR).
Ultrasonographic characteristics of capsule, margins, echotexture, vascular flow and Doppler
indices of Resistive Index (RI) and Pulsatility Index (PI) were compared between two groups.
High vascularization was correlated with HR group (p<0.05). On the other hand, tumors that
presented some exam without detectable blood flow and homogeneous echotexture were
correlated with LR group (p<0.05). Additionally, were compared RI and PI between
intratumoral and extratumoral vessels and resulted in significant differences (extratumoral: RI=
0.71 ± 0.11 and PI=1.72 ± 0.93; intratumoral: RI= 0.63 ± 0.07 and PI= 1.19 ± 0.24). In
conclusion, ESC presented some ultrasonographic differences between the high and low SGR
tumors. The higher SGR tumors presented characteristics that may be related to greater
aggressiveness and invasiveness.
Key words: Doppler, Ehrlich Solid Carcinoma, Ultrasound
23
RESUMO
O Carcinoma de Ehrlich Sólido (ESC) é um dos modelos tumorais usados na pesquisa contra o
câncer. Mesmo sendo um modelo muito usado em pesquisas, não existem descrições
ultrassonográficas dele. Nesse estudo foram realizados exames ultrassonográficos seriados
durante 35 dias, em modo-B e Doppler, em ESC inoculados em 18 camundongos Swiss albinos.
A partir das medidas obtidas por ultrassom, foram analisados os padrões de crescimento e os
tumores foram separados em dois grupos dependendo da taxa específica de crescimento (SGR),
num grupo de alta taxa (HR) e outro de baixa taxa (LR). Foram comparadas as características
ultrassonográficas de presença de cápsula, margens, ecotextura, distribuição e quantidade de
fluxo e os índices Doppler Índice de Resistividade (IR) e Índice de Pulsabilidade (IP). Alta
vascularização foi relacionada com pertencer ao grupo HR (p<0.05). Por outro lado os tumores
que apresentaram algum exame com ausência de fluxo e os que apresentam ecotextura
homogênea foram relacionados com pertencer ao grupo LR (p<0.05). Além disso, foram
comparados IR e IP entre vasos intratumorais e extratumorais e resultou em diferenças
significativas (extratumorais: RI = 0,71 ± 0,11 e PI = 1,72 ± 0,93; intratumorais: RI = 0,63 ±
0,07 e PI = 1,19 ± 0,24). Foi concluído que os ESC apresentam características
ultrassonográficas diferentes entre os carcinomas de alto e baixo SGR. Os carcinomas com
maiores SGR apresentaram características relacionadas com maior agressividade e capacidade
de invasão.
Palavras chave: Carcinoma de Ehrlich sólido, Doppler, Ultrassonografia.
INTRODUTION
Cancer is one of the most common and serious diseases of current clinical medicine
and one of the main causes of high death rates due to the late diagnosis. Tumor models are tools
of great importance in cancer research, in vivo mouse models capture the complexity of the
tumor growth and metastatic process in a living system, but viewing the steps individually and
quantitatively extracting data is generally difficult (Katt et al., 2016). Mice models have
developed and improved in their ability to model many diverse aspects of the human disease,
so too has the need for imaging approaches to measure key biological parameters noninvasively.
In this context, ultrasound imaging is especially useful for measuring the size and aspects of
vascularity and blood perfusion in soft tissue tumors (Lyons, 2015).
24
The Ehrlich carcinoma is a tumor model largely used in cancer research; it is
originates from spontaneous murine mammary adenocarcinoma and adapts to an ascites form
by intraperitoneal serial passages (Jaganathan et al., 2010). The solid form (ESC) is generated
from subcutaneous inoculation and is considered an important tool to investigate antineoplastic
treatments (Elmorsi et al., 2013).
The aim of this study was to describe the B-mode and Doppler ultrasonographic
aspects of Ehrilch Solid Carcinoma (ESC) inoculated in mice and to study the growth kinetics
with the size measurements obtained by ultrasound, the correlation between specific growth
rate (SGR), morphological aspects and blood flow characteristics and analyze the Doppler
index in the intra and extra-tumor vessels. Besides that, demonstrate ultrasound as a tool that
can help predict behavior and growth of ESC.
MATERIAL AND METHODS
The study was part of an integrated research project approved in the Animal Use
Ethics Committee of Federal University of Goiás (CEUA / UFG) with protocol number 098/14.
Animals
In the study were included a total of 18 male Swiss albino mice, with body weight
between 25 to 40 grams, and six to eight weeks of age at the moment of inoculation. The animals
came from the central bioterium of UFG. The animals were maintained under standard
laboratory conditions (temperature 22–25ºC with a dark/light cycle of 12/12 h) and were
allowed free access to a standard dry pellet diet and water ad libitum. The mice were
anesthetized at a dose of 0.2 ml / 100g of a solution of 100mg/ml of ketamine and 12.5mg/ml
of xylazine by an intraperitoneally injection and euthanized by cervical dislocation. The
procedures involving the management and care of the animals were based on the Niehs
Handbook for investigators and technicians of National Institute of Environmental Health
Science (NIEHS, 2007) in order to minimize the pain of the animals through the correct
accomplishment of all the procedures that involve them.
Mouse tumor model
To generate solid tumors, Ehrlich Ascitic Carcinoma (EAC) was maintained in
Swiss mice intraperitoneally. Seven days after cell inoculation, the peritoneal fluid of an animal
25
with EAC tumor was aspirated, the cells were washed in sterile PBS and an aliquot of the cell
suspension was put in trypan blue 1% (m/v) (Sigma, St Louis, MO) and quantified by Luna
automated cell counter (Logos, Biosystems, Annandale, VA). Only the cell dilutions with 90%
of viable cells were injected in the subcutaneous tissue of the left scapular region of the mice,
for induced ESC in a total of 18 animals (n = 18).
Ultrasonographic study
The first ultrasonographic examination was performed in each animal the day of
tumor induction. The other ultrasound examinations were performed on days 5, 10, 12, 14, 16,
18, 20, 23, 26, 28, 30, 32 and 35 after induction. For ethical reasons, when a tumor exceeded
the volume of 4000mm3 or the skin was highly ulcerated, the animal was euthanized even before
day 35 after induction.
The mice were anesthetized and accommodated in ventral recumbence on a kind of
polyurethane foam bed specially designed for that purpose (Fig.1). After evaluation, the Ehrlich
induced subcutaneous tumors were ultrasonographically examined with 18MHz linear
transducer (Mylab 30, Esaote, Genova, Italy). Using as a reference imaging settings for small
body parts, a specific preset for subcutaneous tumor models in mice, was created. Depth of
3cm, gain B-mode 52% without gelatin, dynamic range of ten and two focal areas were
standardized.
Figure 1. A Swiss albino mouse in ventral
recumbence in the foam bed, with the acoustic solid
gelatin on him.
26
The ultrasonographic features evaluated using the B-mode were: volume, capsule,
echotexture and margins (Nyman et al., 2006a). Longitudinal and transversal views were
obtained from each tumor to calculate the volume using the empiric formula of Lambert: length
(L) × width (W) × height (H) × 0.71 (Fig. 2) (Paltiel et al., 2002). The specific growth rate
(SGR) was calculated with the formula, SGR = ln (V2/V1)/ (t2 – t1), where V2 was final volume,
V1 was initial volume, t2 was final time and t1 was initial time (Mehara et al., 2007). To calculate
SGR, data with volumes between 300 mm3 and 1000 mm3 were used. Margins of the tumors
were classified as circumscribed or indistinct depending on whether the margin between the
tumor and surrounding normal tissue was distinct or not (Nyman et al., 2006a). A capsule was
considered present when the tumor had already more than one image with the most part around
the tumor with a hyperechogenic line clearly around it. Echotexture was classified as
homogeneous or heterogeneous. Although interpretation of an ultrasonographic texture is
subjective, it has been proposed that an echotexture is homogeneous when dots size and spacing
is uniform or regular, and heterogeneous when it is not uniform or irregular (Matton and
Nyland, 2015). To diminish this parameter of subjectivity and as ultrasonography is operator
dependent, the ultrasonographic studies were always performed by the same person.
Figure 2. B-mode ultrasound images of Ehrlich Solid Carcinoma induced in the
subcutaneous tissue of Swiss albino mouse, showing in A) Longitudinal view showing
the measurements of length and height, B) Cross-sectional view showing width and height
measurements. 18 MHz transducer.
Doppler examination was performed using acoustic solid gelatin with the same
function and similar characteristics as a commercial standoff pad (Fig. 1). The aim of using this
acoustic solid gelatin was to prevent echo reverberations in the area of interest by placing it in
the focal zone of the transducer. The standoff pad has been used to evaluate tendons, testicle,
superficial lymph node, and other organs in cats and small dogs (Biller and Myer, 1988).
Color flow mapping was used in different planes to evaluate the vascular supply in
the tumor and the peripheral tissue. Color gain was adjusted to reduce excessive color noise
27
when blood flows were too slow and the pulse repetition frequency (PRF) was 2.1 kHz. The
number of vessels in each plane were quantified, and the tumors were classified as having no
vessels, a maximum of two, three to five and more than five vessels, on average, inside the
tumor, for each plane. When vascular supply was detected, the distribution of vascular flow
was classified into three flow patterns; central, peripheral, and mixed (central and peripheral)
(Nyman et al., 2006b).
Doppler analysis was performed keeping the angle between the Doppler beam and
the long axis of the vessel (θ) under 60°. The Doppler gate was established at 2 mm. The
transducer was manipulated to optimize the spectral waveform. Resistive index (RI) and
pulsatility index (PI) were measured by using on-board software as follows: RI = (pV - end
diastolic velocity)/ pV; PI = (pV - end diastolic velocity)/time-averaged maximum velocity.
Three measurements were taken for each parameter in different locations within the tumor and
the average of these measurements was used in the analysis. Images were recorded and stored
digitally for subsequent analysis and calculations.
Statistical analysis
The mice were separated in two groups according to the SGR, grouping animals
with similar rates and separating animals with significant differences according to “quantile”,
with “classIntervals” function of the classInt package (Bivand, 2015). Eight animals belonged
to the high SGR group and ten to the low SGR group.
In order to evaluate independence of the groups an exact Fisher test (“fisher.test”
function) was performed. Each test was implemented for morphology variables (margins,
echotexture and capsule), distribution (central, periphery and mixed) and number (absent, one
to two, two to five and more than five) of the vessels (Nakazawa, 2015).
Student’s t-test (“t.test” function) was conducted for comparing the growth groups
with the mean resistive index (RI) and pulsatility index (PI).
Wilcoxon test with “wilcox.test” function was used for know if exist difference
between intra and extra tumor vessels in RI and PI. All analyses were accomplished with R
software (R core team, 2016).
28
RESULTS
Tumor volume was calculated at each moment, from the mean value of at least three
measures of longitudinal diameter, transverse diameter and depth. On the first ultrasound exam
no animal showed signs of tumor or any difference to animals without an induced tumor. Five
days after induction, only five animals (26%) presented growth, with volumes between 217 e
370mm3. It was not until day 16 that all of the tumors grew (volumes between 41 to 5240mm3).
Only six animals were evaluated until day 35, the other twelve were euthanized for different
reasons, seven because they had large ulcerations on the skin in the tumor region and the other
five because surpassed the volume of 4000mm3. One of them has already passed this volume
on the day 16 (Table1).
Table 1. Volume (mm3) of tumors, according the days after induction, scored using specific
growth rate (SGR). Tumors with a SGR equal to or less than 0.13 belonged to the low rate
group, while tumors with a rate equal to or greater than 0.15 belonged to the high rate group.
In blue: initial volume of tumors that only grew after day 16 after induction. In red: larger volumes of
4000mm3, these animals had to be euthanized without being able to continue with the experiment.
29
SGR of each tumor were analyzed and the mice separated in two groups with
significant difference, the groups were named high rate (HR) and low rate (LR). In the HR
group were eight animals and in the LR ten. The SGR ranged from 0.054 to 0.4428, with a
mean value of 0.1753 ± 0.11; and DT ranged from 1.57 to 12.83 days, with a mean value of
5.66 ± 3.32 days. The mean values of de SGR and DT of the LR group were 0.0958 ± 0.03 and
8.33 ± 2.81 days while of the HR group were 0.2747 ± 0.1 and 2.86 ± 1.08.
Analyzing the morphology variables, all tumors were presumed with capsule (Fig.
3a), but in nine animals (50%) the capsule presented discontinuity in some images, giving rise
to images with indistinct margins (Fig. 3b and 3c). Percentages of tumors with discontinuity in
the capsule and indistinct margins were different between HR and LR groups (Tab. 2).
Figure 3. B-mode ultrasound images of Ehrlich Solid Carcinoma induced in the
subcutaneous tissue of Swiss albino mice; showing in A) complete capsule and
circumscribed margins; B) discontinuity in the capsule (marked by arrow), giving rise to
an image with partially undefined margins, C) significant discontinuity in the capsule
(marked by arrows), giving rise to an image with indistinct margins, evidencing too, the
homogeneous and hipoechogenic interior; D) heterogeneous interior. (+) mesurements of
length, width or height.
The other morphology variable, echotexture, was considered changeable on the
time. Four tumors could be observe with homogeneous echotexture in all exams, seven with
heterogeneous echotexture and seven with variable echotexture. Percentages of each
echotexture were different depending on the group (Tab. 2). The tumors with homogeneous
30
echotexture were observed as tumors with a hyperechogenic capsule and the homogeneous
hypoechogenic interior (Fig. 3d). In contrast, heterogeneous echotexture tumors were observed
as tumors with hyperechogenic capsule and heterogeneous interior, with parts of the same
echogenicity as the capsule and others with low echogenicity or anechogenic (Fig. 3c).
A fisher test was performed to determine if there is a correlation between these
morphological variables and groups separated by growth rates (HR and LR ) and the results
showed that there was not a significant correlation for margins and capsule (margins p=0.3469,
capsule p=1) but there was a significant correlation for echotexture (p=0.02443). There was a
correlation between belonging to the LR group and presenting homogenous echotexture, all of
animals that presents homogenous echotexture in all tests belong to this group.
Table 2. Percentages of tumors with each morphological characteristic evaluated by
ultrasonography.
Color flow mapping was used to study the presence and absence of blood flow and
the quantity of vessels (Fig. 4). All tumors presented detectable blood flow at least in two
exams. Considering the exams individually, 23% did not present blood flow while 77% did
(29% one or two vessels, 48% more than three vessels in average for plane). There were seven
animals (39%) that presented flow in all exams and all of them were part of the HR group. In
addition, five animals (28%) had three or more vessels for plane in all exams and all of them
were part HR group. Considering the exams individually, there are important differences too
(Tab. 3). A fisher test was performed to correlate the frequency of different divisions of vessel
quantities and groups separated by growth rates (HR and LR). There was significant
correlations between exams without detectable blood flow and the tumor belongs to LR group.
In addition, there was a correlation between exams with more than five vessels and the tumor
belongs to HR group (Tab. 3).
Color flow mapping was used to study the blood flow distribution too. Considering
only the exams where it had blood flow, in 9% of exams the flow was central (Fig. 4b), 54%
31
was peripheral (Fig. 4c) and 37% mixed (Fig. 4d). A fisher test was performed to correlate the
frequency of different kinds of blood flow distribution in HR and LR and there were not
significant correlations (Tab. 3).
Table 3. Percentages of exams that belongs to high rate (HR) and low rate (LR) groups in each
category of quantity of vessels and blood flow distribution pattern evaluated by
ultrasonography, and p-value of correlation between each category and group.
Figure 4. Color Doppler mode ultrasound images of Ehrlich Solid Carcinoma induced in
the subcutaneous tissue of Swiss albino mice; showing in A) tumor without vascular flow,
the signals of flow in the skin marked with (*) are not considered tumor flow; B) image
with a single intratumoral vessel with central distribution flow pattern; C) image with
four intratumoral vessels with peripheral distribution flow pattern; D) image with more
than five intratumoral vessels with mixed distribution flow pattern.
The RI ranged from 0.5 to 0.84, with a mean value of 0.63 ± 0.0767. The PI ranged
from 0.91 to 1.85, with a mean value of 1.17 ± 0.0235. A t-student test was performed and no
32
correlation between the RI and PI and the groups separated by growth rate or growth curve was
shown.
Additionally, a study was made to find out the ultrasonographic differences
between intratumoral (Fig. 5a) and extratumoral (Fig. 5b) circulation comparing the RI (Fig.
5a) and PI (Fig. 5b). These indexes were obtained in intra and extratumor vessels at different
moments in 15 of the animals and the average was obtained. The averages between intra and
extratumoral vessels of each animal were compared with a Wilcoxon test and resulted in
significant differences in RI and PI (RI p = 0.03213, PI p = 0.01807) (Fig. 6). The mean values
were 0.71 ± 0.11 and 1.72 ± 0.93 for extratumoral RI and PI; and 0.63 ± 0.07 and 1.19 ± 0.24
for intratumoral RI and PI.
Figure 5. Triplex Doppler mode ultrasound images of Ehrlich Solid Carcinoma induced
in the subcutaneous tissue of mice; showing in A) intratumoral vessel and their spectral
trace showing the minimum of three consecutive waves marking the peak of systolic
velocity and the end of diastolic velocity (+ cursors) to calculate the resistivity index,
B) extratumoral vessel and their spectral trace showing the delimitation of the maximum
speed average (green trace) for calculating the pulsatibility index.
Figure 6. Graphic showing the statistical differences between the mean of
extratumoral and intratumoral Resistive Index and Pulsatility Index.
33
DISCUSSION
In this study, ESC presented different patterns of growth. Studies of the growth and
behavior of EAC show different rates in different strains of mice and that nonspecific
inflammatory mechanisms are relevant in tumor-host interactions in this model (Bergami-
Santos et al., 2004). There is an important relationship between immune system responses and
tumor development, because tumors should elude the immune response of the host to
proliferate, although the role of these inflammatory and immune responses remains unclear
(Segura et al., 2000). Although all of them were mice of the same genetic lineage, they may
have had intrinsic characteristics that made a difference in their immune system.
In comparison with the EAC, the growth of ESC is slower (Frajacomo et al., 2016).
This is probably because, cells in EAC are more resistant to anoxia than in ESC, where there is
evidence that cells may die soon after becoming anoxic. Another important point for this
individual growth difference may lie in the tumor's own behavior. A previous study,
demonstrates a rapid deceleration of growth in smaller solid tumors, probably because of an
increase in the cell loss factor in contrast to larger tumors, which can retain a high rate of cell
production (Tannock, 1969).
Although having different growth patterns, some mean values of volume and some
rates are similar to those of other previous reports. The mean value of volume in the days 14
and 21 after inoculation were very similar with the mean values of volume related by Frajacomo
et al. (2016) for the same days. On days seven and 28, the mean values were different, showing
a higher slope, higher SGR and lower DT than Frajacomo et al. (2016) data.
In this study, the ESC were observed by ultrasound as tumors with a
hyperechogenic capsule. Sometimes, the capsule lost the continuity, appearing an image with
indistinct margins. The internal echotexture was variable and could be observed homogeneous
or heterogeneous. This description can be compared with an histopathologycal description and
biological characteristics related in previous reports. ESC have large necrotic center or central
necrotic areas around which there is a shell of viable tissue and fibrous capsule (Tannock, 1969;
Kleeb et al., 1997). Large tumor masses present invasion of adjacent structures (Kleeb et al.,
1997; Areida et al., 2015). As in the previous histopathological reports (Tannock, 1969; Kleeb
et al., 1997; Areida et al., 2015), in the ultrasound exams a capsule was observed. The
continuity of this capsule may appear altered in the ultrasound images of tumors that presented
invasion of adjacent tissues. The discontinuity in the capsule that allows invasion to surrounding
tissues and causes the appearance of indistinct margins is probably due to the degradation of
34
adhesion proteins. To be able to invade adjacent tissues, there is also loss of adhesion between
cells, this is a characteristic of malignancy, since it can give rise to motility of the cells, being
the first step for the distance dissemination (Brasileiro Filho et al. 2013). HR group had a greater
number of tumors with indistinct margins than LR group, but the difference was not significant.
All tumors was malignant, invasiveness is a hallmark of malignant tumors but in this study was
not related to rapid growth. Rapid growth is not a hallmark of malignancy, but may be related
because faster growth and higher rate of mitosis increase the chances of new mutations (Cullen
et al., 2016).
As in the histopathological examinations of previous studies (Tannock, 1969; Kleeb
et al., 1997; Areida et al., 2015), in ultrasonography images the interior of the tumor presented
two forms of tissue organization. Some tumors presented an hypoechogenic center surrounded
by hyperechogenic tissue, giving rise to an image of fairly homogeneous appearance, which
corresponds to tumors with a single central focus of necrosis. Other tumors presented a
hypoechogenic or anecogenic parts surrounded by hyperechogenic tissue, giving rise to an
heterogeneous image, which corresponds to tumors with several focus of necrosis.
Our results revealed a correlation between the echotexture and growth velocity, the
tumors with low growth presented homogeneous echotexture. Previous reports comparing
ultrasonographic characteristics between benign and malignant tumors described differences
with echotexture in these groups (Nyam et al., 2006b; Soler et al., 2016), but others reports
describe a similar proportion of benign and malignant tumors having homogeneous echotexture
(Feliciano et al., 2012). These studies that reported differences, one of them shows a higher
frequency of heterogeneity in malignant tumors (Soler et al., 2016) and the other a higher
proportion of benign tumors showing heterogeneous echotexture (Nyam et al. 2006b).
In our study, tumors were malignant neoplasms, the fact that more number of
necrosis focuses was been related with fast growth, could be explained with the intrinsically
characteristics of ESC, which are grossly necrotic tumors. The rate of growth depends on three
factors: the rates of cell production and cell death, and the rate of reabsorption of necrotic tissue.
In heterogeneous tumors, the focuses of necrosis are with more contact with the functional
tissue and therefore with better rates of reabsorption of the necrotic tissue, favoring growth
(Tannock, 1969). Additionally, necrosis is associated with tumor progression, increased
aggressiveness and metastatic potential. Necrosis is related to inflammatory response,
inflammatory mediators and reactive oxygen species production, which can activate
macrophages causing the release of tumor necrosis factor-α (Brasileiro Filho et al. 2013).
35
In tumors with higher specific growth rates, visible flow appeared earlier. When in
a Doppler ultrasonographic exam of ESC, no blood flow was detected, there was a high chance
of it being a low-growth tumor. Absence of blood flow was frequent in ESC with slow growth
mainly in the very early stages but it could appear in other stages too. Previous reports
comparing the presence of vascular flow observed by Color Doppler ultrasonography between
benign and malignant tumors do not show the same results, some authors did not find statistical
differences (Soler et al., 2016) while others found greater increases of vasculature flow in
malignant than in benign tumors (Khurana and Satia, 2016). There is no unanimous conclusion
about the relation between increased flow observed by ultrasonography and malignancy (Soler
et al., 2016; Khurana and Satia, 2016), but in our study the comparison was between the same
type of malignant tumor, and significant differences were observed between the groups of
higher and lower growth. Thinking about the physiology of ESC, it has to be considered that,
in initial periods, solid tumor growth is dependent on passive diffusion of oxygen from the
surrounding stroma, but when the tumor lesion grows up to 2 mm, some cells start to experience
hypoxia and nutrient deprivation and accumulate hypoxia inducible factors, which triggers a
phenotypic transition to activate angiogenesis (Song et al., 2014). The vascular flow is
necessary to growth, since the tumor volume is really small.
The characteristics of arterial resistance to blood flow are similar, because there are
no difference between RI or PI in different groups. With respect to RI and PI, in previous reports
comparing benign and malign tumors there were no significant differences. (Nyam et al., 2006;
Soler et al., 2016). It was to be expected that there would be no difference because in all tumors
neovascularization is disorganized and even more in this work, that it treated the same type of
cancer in all cases.
All tumor vessels develop structural and physiological abnormalities, normal
vasculature is composed of mature vessels with hierarchical distribution of arterioles,
capillaries, and venules. Abnormal tumor vasculature typically lacks hierarchical structure and
is composed of immature differentiated and undifferentiated vessels with increased
permeability (Qin et al., 2012 ) These differences were reflected when comparing the indices
between intra and extra tumor vessels. The spectral Doppler indices RI and PI were significantly
lower in intratumoral vessels than extratumoral vessels. In another study were mapped by
Doppler ultrasound, oral squamous cell carcinoma and compared Doppler indices with healthy
oral mucosa, and the indices resulted significantly lower in the patients with oral squamous cell
carcinoma (Ghandi et al,. 2015). These differences between tumor vessels indices and healthy
tissue vessels indices indicates lower resistivity of tumor vessels and suggests higher
36
intratumoral metabolism. This suggestion of increased metabolism reinforces the idea that
physiology of solid tumors is different from that of normal tissues in several important aspects,
for example the well-know vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling is crucial for
sprouting angiogenesis as well as recruitment of circulating progenitor endothelial cells to
tumor vasculature (Ghandi et al,. 2015; Quian et al., 2016).
CONCLUSION
In ESC, ultrasonographic feature of high vascularization was related to high growth
rates. On the other hand, absents of blood flow and homogeneous echotexture were related to
low growth rates. Significant differences were obtained between HR and LR groups, for
echotexture, and quantity of flow. Other feature related to malignancy, indistinct margins, were
observed in the tests indistinctly between these groups.
This demonstrate that ultrasonography is useful in preclinical studies with ESC to
prevent tumor behavior and obtain more reliable and accurate data. These findings about tumor
ultrasonographic characteristics can also be applied in clinics. Other features such as the
observation of indistinct margins may be used as an indicative of malignancy in the clinic, but,
in this study, were not related to the group of higher growth.
The blood flow in Ehrlich Solid tumors inoculated in mice is detectable in devices
commonly used in veterinary clinics coupled to high frequency transducers (18mHz). The
differences between physiologies of intratumoral and extratumoral vessels were reflected in
spectral Doppler indices that could help the early diagnosis of neoplasms.
REFERENCES
AREIDA, S.K.; ABD EL-AZIM, A.O.; AMER, M.E. Protective and curative effect of
thymoquinone on Ehrlich solid carcinoma inoculated mice. Egypt. J. Hospital Med., v.58,
p.129-142, 2015.
BERGAMI-SANTOS, P.C.; MARIANO, M.; BARBUTO J.A.M. Dual role of
polymorphonuclear neutrophils on the growth of Ehrlich ascites tumor (EAT) in mice. Life Sci.,
v.75, p.245–255, 2004.
BILLER, D.S.; MYER, W. Ultrasound scanning of superficial structures using an ultrasound
standoff pad. Vet. Radiology, v.29, n.3, p.138-142, 1988.
BIVAND, R. ClassInt: Choose Univariate Class Intervals. R package version 0.1-23, 2015.
37
BRASILEIRO FILHO, G.; PEREIRA, F. E. L.; Guimarães, R. C. Distúrbios do crescimento e
da diferenciação celulares. In: BRASILEIRO FILHO, G., editor. Bogliolo patologia geral. 5a
ed. Belo Horizonte: Guanabara Koogan; 2013. 243-253p.
CULLEN, J. M.; PAGE, R.; MISORP, W. An Overview of cancer pathogenesis, diagnosis and
management. In: MEUTEN, D. J., editor. Tumors in domestic animals. 5th ed. North Carolina:
Wiley-Blackwell; 2016. 1-14p.
ELMORSI, Y.M.; EL-HAGGAR, S.M.; IBRAHIM, O.M.; MABROUK, M.M. Effect of
ketoprofen and indomethacin on methotrexate pharmacokinetics in mice plasma and tumor
tissues. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet, v.38, p.27-32, 2013.
FELICIANO, M.A.; VICENTE, W.R.; SILVA, M.A. Conventional and Doppler ultrasound for
the differentiation of benign and malignant canine mammary tumours. J. Small Anim. Pract.,
v.53, p.332–337, 2012.
FRAJACOMO, F.T.T.; PADILHA, C.S.; MARINELLO, P.C. et al. Solid Ehrlich carcinoma
reproduces functional and biological characteristics of cancer cachexia. Life Sci., v.162, p.47–
53, 2016.
GANDHI, R.; NAYYAR, A.S.; BHOWATE R. et al. Color Doppler Ultrasonography in
Mapping Oral Squamous Cell Carcinoma. Middle East. J. Cancer., v.6, n.3, p.179-187, 2015.
JAGANATHAN, S.K.; MONDHE, D.; WANI, Z.A. et al. Effect of honey and eugenol on
Ehrlich ascites and solid carcinoma. J. Biomed. Biotechnol., v.2010, p.1-5, 2010.
KATT, M.E.; PLACONE, A.L.; WONG, A.D. et al. In Vitro Tumor Models: Advantages,
Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Front. Bioeng. Biotechnol., v.4,
n.12, p.1-14, 2016.
KHURANA, I.; SATIA, M.N. Preoperative evaluation of ovarian masses with color Doppler
and its correlation with pathological finding. Int. J. Reprod. Contracept. Obstet. Gynecol., v.5,
n.7, p.2084-2092, 2016.
KLEEB, S.R.; XAVIER, J.G.; FRUSSA-FILHO, R.; DAGLI, M.L.Z. Effect of haloperidol on
the development of the solid Ehrlich tumor in mice. Life Sci., v.60, n.4, p.69-74, 1997.
LYONS, S.K. Imaging Mouse Models of Cancer. Cancer J., v.21, p.152-164, 2015.
MATTON, J.S.; NYLAND, T.G. (Ed). Small Animal Diagnostic Ultrasound. USA:
MISSOURI, 2015. p.1-49.
MEHARA, E.; FORSELL-ARONSSON, E.; AHLMAN, H.; BERNHARDT, P. Specific Growth
Rate versus Doubling Time for quantitative characterization of tumor growth rate. Cancer Res.,
v.67, n.8, p. 3970-3975, 2007.
NAKAZAWA, M., Fmsb: Functions for Medical Statistics Book with some Demographic Data.
R package version 0.5.2., 2015.
NATIONAL INSTITUTE OF ENVIRONMENTAL HEALTH SCIENSES (NIEHS). Niehhs
Handbook for investigators and technicians: North Carolina, 2007. p.38-54.
38
NYMAN, H.T.; NIELSEN, O.L.; MCEVOY, F.J. et al. Comparison of B-mode and Doppler
ultrasonographic finding with histologic features of benign and malignant mammary tumors in
dogs. Am. J. Vet. Res., v.67, p.985-991, 2006a.
NYMAN, H.T.; KRISTENSEN, A.T.; LEE, F.J. et al. Characterization of canine superficial
tumors using gray-scale B mode, color flow mapping, and spectral Doppler ultrasonography —
a multivariate study. Vet. Radiol. Ultrasound, v.47, p.192–198, 2006b.
PALTIEL, H.J.; DIAMOND, D.A.; DI CANZIO, J. et al. Testicular volume: Comparison of
orchidometer and US measurements in dogs. Radiology, v.222, p.114–119, 2002.
QIAN, C.; TAN, M.; YANG, J.; CAO, Y. Revisiting tumor angiogenesis: vessel co‑option,
vessel remodeling, and cancer cell‑derived vasculature formation. Chin. J. Cancer, v.35, n.10,
p.1-6, 2016.
QIN, L.; BROMBERG-WHITE, J.L.; QIAN, C.N. Opportunities and challengesin tumor
angiogenesis research: back and forth between bench and bed. Adv. Cancer Res., v.113, p.191-
239, 2012.
R CORE TEAM. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for
Statistical Computing, Austria: VIENNA, 2016.
SEGURA, J.A.; BARBERO, L.G.; MÁRQUEZ, J. Ehrlich ascites tumour unbalances splenic
cell populations and reduces responsiveness of T cells to Staphylococcus aureus enterotoxin B
stimulation. Immunology Letters, v.74, p.111–115, 2000.
SONG, H.G.; PARK, K.M.; GERECHT, S. Hydrogels to model 3D in vitro microenvironment
of tumor vascularization. Adv. Drug Deliver. Rev., v.xxx, p.xxx–xxx, 2014.
SOLER, M.; DOMINGUEZ, E.; LUCAS, X. et al. Comparison between ultrasonographic
findings of benign and malignant canine mammary gland tumours using B-mode, colour
Doppler, power Doppler and spectral Doppler. Res. Vet. Sci., v.107, p.141–146, 2016.
TANNOCK, I.F. A comparison of cell proliferation parameters in solid and ascites Ehrlich
tumors. Cancer Res., v.29, p.1527-1534, 1969.
39
CAPÍTULO 3 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente trabalho evidencia a importância da ultrassonografia na avaliação de
modelos tumorais murinos, apresentando as possibilidades e limitações que essa modalidade de
imagem oferece.
No estudo realizado, foram analisadas a cinética de crescimento a partir do volume
calculado a partir de medidas obtidas por imagens ultrassonográficas e as características
ultrassonográficas, tanto morfológicas como vasculares de um dos modelos tumorais in vivo
mais usado na pesquisa, o carcinoma de Ehrlich.
O carcinoma de Ehrlich sólido mostrou-se como um tumor encapsulado, mas que
pode perder a continuidade da cápsula e invadir tecidos circundantes, dando lugar a imagens
com margens parcialmente indefinidas e que apresenta um foco de necrose central ou vários
focos divididos por tecido sólido, com ecotextura homogênea na primeira situação e
heterogênea na segunda. Os tumores apresentaram padrões de crescimento diferentes, podendo
ser divididos conforme a taxa de crescimento. Algumas características ultrassonográficas como
a ecotextura e quantidade e distribuição dos vasos apresentaram diferenças significativas entre
os grupos.
Essas características definem o carcinoma de Ehrlich sólido como um modelo
tumoral apto para estudos que precisem de tumores com uma certa variabilidade, imitando
situações clínicas. Também mostrou ser um modelo bom para avaliação em modo Doppler com
fluxo detectável até em tumores de tamanho pequeno. Esse estudo aportou informações para
ajudar a prever o crescimento e comportamento do carcinoma de Ehrlich sólido, a partir de
avaliação ultrassonográfica. Os resultados obtidos, também podem ajudar a desenvolver um
pré-prognóstico na rotina clínica enquanto se espera o diagnóstico histopatológico.
Por outro lado, a comparativa entre os índices Doppler IR e IP dos vasos
intratumorais e extratumorais faz pensar na ultrassonografia Doppler como uma ferramenta que
pode ajudar na detecção precoce de neoplasias.
Espera-se também que, com o aumento de informações e publicações, o uso da
ultrassonografia nos estudos pré-clínicos aumente, melhorando assim a precisão dos dados e,
com isso, haja redução do número de animais necessários para obter resultados significativos.
40ANEXO A
41
ANEXO B
Normas para publicação na revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Política Editorial O periódico Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
(Brazilian Journal of Veterinary and Animal Science), ISSN 0102-0935 (impresso) e 1678-
4162 (online), é editado pela FEPMVZ Editora, CNPJ: 16.629.388/0001-24, e destina-se à
publicação de artigos científicos sobre temas de medicina veterinária, zootecnia, tecnologia e
inspeção de produtos de origem animal, aquacultura e áreas afins. Os artigos encaminhados
para publicação são submetidos à aprovação do Corpo Editorial, com assessoria de especialistas
da área (relatores). Os artigos cujos textos necessitarem de revisões ou correções serão
devolvidos aos autores. Os aceitos para publicação tornam-se propriedade do Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (ABMVZ) citado como Arq. Bras. Med. Vet.
Zootec. Os autores são responsáveis pelos conceitos e informações neles contidos. São
imprescindíveis originalidade, ineditismo e destinação exclusiva ao ABMVZ. Reprodução de
artigos publicados A reprodução de qualquer artigo publicado é permitida desde que seja
corretamente referenciado. Não é permitido o uso comercial dos resultados. A submissão e
tramitação dos artigos é feita exclusivamente on-line, no endereço eletrônico
<www.abmvz.org.br>. Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram-se disponíveis
nos endereços www.scielo.br/abmvz ou www.abmvz.org.br. Orientação para tramitação de
artigos Toda a tramitação dos artigos é feita exclusivamente pelo Sistema de publicação online
do ABMVZ no endereço www.abmvz.org.br. Apenas o autor responsável pelo artigo deverá
preencher a ficha de submissão, sendo necessário o cadastro do mesmo no Sistema.
Toda comunicação entre os diversos atores do processo de avaliação e publicação (autores,
revisores e editores) será feita exclusivamente de forma eletrônica pelo Sistema, sendo o autor
responsável pelo artigo informado, automaticamente, por e-mail, sobre qualquer mudança de
status do artigo. A submissão só se completa quando anexado o texto do artigo em Word e em
pdf no campo apropriado. Fotografias, desenhos e gravuras devem ser inseridas no texto e
também enviadas, em separado, em arquivo com extensão jpg em alta qualidade (mínimo
300dpi), zipado, inserido no campo próprio. Tabelas e gráficos não se enquadram no campo de
arquivo zipado, devendo ser inseridas no corpo do artigo. É de exclusiva responsabilidade de
quem submete o artigo certificar-se de que cada um dos autores tenha conhecimento e concorde
42
com a inclusão de seu nome no mesmo submetido. O ABMVZ comunicará via eletrônica a cada
autor, a sua participação no artigo. Caso, pelo menos um dos autores não concorde com sua
participação como autor, o artigo seráconsiderado como desistência de um dos autores e sua
tramitação encerrada.
Tipos de artigos aceitos para publicação Artigo científico É o relato completo de um trabalho
experimental. Baseia-se na premissa de que os resultados são posteriores ao planejamento da
pesquisa. Seções do texto: Título (português e inglês), Autores e Filiação, Resumo, Abstract,
Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão (ou Resultados e Discussão),
Conclusões, Agradecimentos (quando houver) e Referências. O número de páginas não deve
exceder a 15, incluindo tabelas e figuras. O número de Referências não deve exceder a 30.
Relato de caso Contempla principalmente as áreas médicas, em que o resultado é anterior ao
interesse de sua divulgação ou a ocorrência dos resultados não é planejada. Seções do texto:
Título (português e inglês), Autores e Filiação, Resumo, Abstract, Introdução, Casuística,
Discussão e Conclusões (quando pertinentes), Agradecimentos (quando houver) e Referências.
O número de páginas não deve exceder a 10, incluindo tabelas e figuras. O número de
Referências não deve exceder a 12.
Comunicação É o relato sucinto de resultados parciais de um trabalho experimental, dignos de
publicação, embora insuficientes ou inconsistentes para constituírem um artigo científico. O
texto, com título em português e em inglês, Autores e Filiação deve ser compacto, sem distinção
das seções do texto especificadas para "Artigo científico", embora seguindo aquela ordem.
Quando a Comunicação for redigida em português deve conter um "Abstract" e quando redigida
em inglês deve conter um "Resumo". O número de páginas não deve exceder a 8, incluindo
tabelas e figuras. O número de Referências não deve exceder a 12.
Preparação dos textos para publicação Os artigos devem ser redigidos em português ou inglês,
na forma impessoal. Para ortografia em inglês recomenda-se o Webster’s Third New
International Dictionary. Para ortografia em português adota-se o Vocabulário Ortográfico da
Língua Portuguesa, da Academia Brasileira de Letras. Formatação do texto O texto não deve
conter subitens em qualquer das seções do artigo e deve ser apresentado em Microsoft Word,
em formato A4, com margem 3cm (superior, inferior, direita e esquerda), em fonte Times New
Roman tamanho 12 e em espaçamento entrelinhas 1,5, em todas as páginas e seções do artigo
(do título às referências), com linhas numeradas. Não usar rodapé. Referências a empresas e
43
produtos, por exemplo, devem vir, obrigatoriamente, entre parêntesis no corpo do texto na
seguinte ordem: nome do produto, substância, empresa e país.
Seções de um artigo Título: Em português e em inglês. Deve contemplar a essência do artigo e
não ultrapassar 150 dígitos. Autores e Filiação: Os nomes dos autores são colocados abaixo do
título, com identificação da instituição a que pertencem. O autor para correspondência e seu e-
mail devem ser indicados com asterisco.
Nota: o texto do artigo em Word deve conter o nome dos autores e filiação; o texto do artigo
em pdf não deve conter o nome dos autores e filiação. Resumo e Abstract: Deve ser o mesmo
apresentado no cadastro contendo até 2000 dígitos incluindo os espaços, em um só parágrafo.
Não repetir o título e não acrescentar revisão de literatura. Incluir os principais resultados
numéricos, citando-os sem explicá-los, quando for o caso. Cada frase deve conter uma
informação. Atenção especial às conclusões. Palavras-chave e Keywords: No máximo cinco.
Introdução: Explanação concisa, na qual são estabelecidos brevemente o problema, sua
pertinência e relevância e os objetivos do trabalho. Deve conter poucas referências, suficientes
para balizá-la. Material e Métodos: Citar o desenho experimental, o material envolvido, a
descrição dos métodos usados ou referenciar corretamente os métodos já publicados. Nos
trabalhos que envolvam animais e/ou organismos geneticamente modificados deverá constar,
obrigatoriamente, o número do protocolo de aprovação do Comitê de Bioética e/ou de
Biossegurança, quando for o caso. Resultados: Apresentar clara e objetivamente os resultados
encontrados. Tabela: Conjunto de dados alfanuméricos ordenados em linhas e colunas. Usar
linhas horizontais na separação dos cabeçalhos e no final da tabela. O título da tabela recebe
inicialmente a palavra Tabela, seguida pelo número de ordem em algarismo arábico e ponto
(ex.: Tabela 1.). No texto a tabela deve ser referida como Tab seguida de ponto e do número de
ordem (ex.: Tab. 1), mesmo quando se referir a várias tabelas (ex.: Tab. 1, 2 e 3). Pode ser
apresentada em espaçamento simples e fonte de tamanho menor que 12 (o menor tamanho
aceito é 8). A legenda da Tabela deve conter apenas o indispensável para o seu entendimento.
As tabelas devem ser, obrigatoriamente, inseridas no corpo do texto preferencialmente após a
sua primeira citação. Figura: Compreende qualquer ilustração que apresente linhas e pontos:
desenho, fotografia, gráfico, fluxograma, esquema, etc. A legenda recebe inicialmente a palavra
Figura, seguida do número de ordem em algarismo arábico e ponto (ex.: Figura 1.) e é referida
no texto como Fig seguida de ponto e do número de ordem (ex.: Fig.1), mesmo se referir a mais
de uma figura (ex.: Fig. 1, 2 e 3). Além de inseridas no corpo do texto, fotografias e desenhos
devem também ser enviadas no formato jpg com alta qualidade, em um arquivo zipado, anexado
44
no campo próprio de submissão na tela de registro do artigo. As figuras devem ser,
obrigatoriamente, inseridas no corpo do texto preferencialmente após a sua primeira citação.
Nota: Toda tabela e/ou figura que já tenha sido publicada deve conter, abaixo da legenda,
informação sobre a fonte (autor, autorização de uso, data) e a correspondente referência deve
figurar nas Referências. Discussão: Discutir somente os resultados obtidos no trabalho. (Obs.:
As seções Resultados e Discussão poderão ser apresentadas em conjunto a juízo do autor, sem
prejudicar qualquer das partes e sem subitens). Conclusões: As conclusões devem apoiar-se nos
resultados da pesquisa executada e serem apresentadas de forma objetiva, sem revisão de
literatura, discussão, repetição de resultados e especulações. Agradecimentos: Não obrigatório.
Devem ser concisamente expressados. Referências: As referências devem ser relacionadas em
ordem alfabética, dandose preferência a artigos publicados em revistas nacionais e
internacionais, indexadas. Livros e teses devem ser referenciados o mínimo possível, portanto,
somente quando indispensáveis. São adotadas as normas gerais ABNT, adaptadas para o
ABMVZ conforme exemplos:
Como referenciar: 1. Citações no texto A indicação da fonte entre parênteses sucede à citação
para evitar interrupção na sequência do texto, conforme exemplos: autoria única: (Silva, 1971)
ou Silva (1971); (Anuário..., 1987/88) ou Anuário... (1987/88) ü dois autores: (Lopes e Moreno,
1974) ou Lopes e Moreno (1974) mais de dois autores: (Ferguson et al., 1979) ou Ferguson et
al. (1979) mais de um artigo citado: Dunne (1967); Silva (1971); Ferguson et al. (1979) ou
(Dunne, 1967; Silva, 1971; Ferguson et al., 1979), sempre em ordem cronológica ascendente e
alfabética de autores para artigos do mesmo ano. Citação de citação: Todo esforço deve ser
empreendido para se consultar o documento original. Em situações excepcionais pode-se
reproduzir a informação já citada por outros autores. No texto, citar o sobrenome do autor do
documento não consultado com o ano de publicação, seguido da expressão citado por e o
sobrenome do autor e ano do documento consultado. Nas Referências, deve-se incluir apenas a
fonte consultada. Comunicação pessoal: Não fazem parte das Referências. Na citação coloca-
se o sobrenome do autor, a data da comunicação, nome da Instituição à qual o autor é vinculado.
2. Periódicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.): ANUÁRIO
ESTATÍSTICO DO BRASIL. v.48, p.351, 1987-88. FERGUSON, J.A.; REEVES, W.C.;
HARDY, J.L. Studies on immunity to alphaviruses in foals. Am. J. Vet. Res., v.40, p.5-10,
1979. HOLENWEGER, J.A.; TAGLE, R.; WASERMAN, A. et al. Anestesia general del
canino. Not. Med. Vet., n.1, p.13-20, 1984.
45
3. Publicação avulsa (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
DUNNE, H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo. México: UTEHA, 1967. 981p. LOPES, C.A.M.;
MORENO, G. Aspectos bacteriológicos de ostras, mariscos e mexilhões. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 14., 1974, São Paulo. Anais... São Paulo:
[s.n.] 1974. p.97. (Resumo). MORRIL, C.C. Infecciones por clostridios. In: DUNNE, H.W.
(Ed). Enfermedades del cerdo. México: UTEHA, 1967. p.400-415. NUTRIENT requirements
of swine. 6.ed. Washington: National Academy of Sciences, 1968. 69p. SOUZA, C.F.A.
Produtividade, qualidade e rendimentos de carcaça e de carne em bovinos de corte. 1999. 44f.
Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Escola de Veterinária, Universidade Federal
de Minas Gerais, Belo Horizonte.
4. Documentos eletrônicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
QUALITY food from animals for a global market. Washington: Association of American
Veterinary Medical College, 1995. Disponível em: <http://www.org/critca16.htm>. Acessado
em: 27 abr. 2000. JONHNSON, T. Indigenous people are now more cambative, organized.
Miami Herald, 1994. Disponível em: <http://www.summit.fiu.edu/MiamiHerld-Summit-
RelatedArticles/>. Acessado em: 5 dez. 1994.
Nota:
Artigos que não estejam rigorosamente dentro das normas acima não serão aceitos para
avaliação.
O Sistema reconhece, automaticamente, como "Desistência do Autor" artigos em diligência
e/ou "Aguardando liberação do autor", que não tenha sido respondido no prazo dado pelo
Sistema.
Taxas de submissão e de publicação Taxa de submissão. A taxa de submissão de R$50,00
(cinquenta reais) deverá ser paga por meio de boleto bancário emitido pelo sistema eletrônico
de submissão de artigos. Ao solicitar o boleto bancário, o autor informará os dados para emissão
da nota fiscal. Somente artigos com taxa paga de submissão serão avaliados. Caso a taxa não
seja quitada em até 30 dias será considerado como desistência do autor. Taxa de publicação. A
taxa de publicação de R$150,00, por página, por ocasião da prova final do artigo. A taxa de
publicação deverá ser paga por meio de boleto bancário emitido pelo sistema eletrônico de
submissão de artigos Ao solicitar o boleto bancário, o autor informará os dados para emissão
da nota fiscal.
46
Recursos e diligências No caso de o autor encaminhar resposta a diligências solicitadas pelo
ABMVZ, ou documento de recurso, o mesmo deverá constar como a(s) primeira(s) página(s)
do texto do artigo somente na versão em Word. No caso de artigo não aceito, se o autor julgar
pertinente encaminhar recurso, o mesmo deve ser feito pelo e-mail