Ultrassom pulsado de baixa intensidade no tratamento de úlceras venosas crônicas: avaliação histopatológica pelo ImageJ

Ana Elisa S. Jorge1 e Marco Andrey C. Frade1,2 1 Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia – EESC/ FMRP/ IQSC – USP,

São Carlos, Brasil 2 Divisão de Dermatologia do Departamento de Clínica Médica – FMRP/ USP,

Ribeirão Preto, Brasil anaelisa.jorge@gmail.com

Resumo - A úlcera venosa representa a maior incidência (70 a 80 %) das úlceras de perna. Os impactos psicossocial e econômico dessas lesões crônicas repercutem em elevados custos financeiros e em má qualidade de vida aos pacientes acometidos. Este artigo apresenta a avaliação histopatológica de úlceras venosas crônicas tratadas pelo ultrassom pulsado de baixa intensidade. Para tanto, durante 90 dias, úlceras venosas (N = 8) foram irradiadas 3 vezes por semana com um aparelho de US (intesidade SATA de 30 mW/cm2; frequência de ressonância de 1,5 MHz; modo pulsado) elaborado pelo Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia da Escola de Engenharia de São Carlos/USP. As biópsias, realizadas na borda e no centro dessas feridas, foram colhidas no 1º (inicial) e 45º dias de seguimento terapêutico. A partir das lâminas processadas com hematoxilina-eosina, as imagens obtidas foram analisadas pelo software ImageJ para quantificação de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos. Os resultados estatísticos (modelo de Poisson com efeitos aleatórios) apontaram diferenças significativas (p < 0,05) tanto entre as duas regiões observadas (borda/centro) quanto nos diferentes períodos realizados (1º/45º dias) para as diferentes variáveis. Com isso, podemos afirmar que a aplicação da onda sonora estimula o reparo tecidual de úlceras venosas crônicas por acelerar a fase inflamatória e ativar a fase proliferativa da cicatrização.

Palavras-chave – úlcera venosa, ultrassom, análise histopatológica, ImageJ.

I. INTRODUÇÃO s úlceras venosas são feridas crônicas que advêm da Insuficiência Venosa Crônica (IVC), caracterizada pela hipertensão venosa crônica. Tal deficiência

ocasiona mudanças estruturais nos capilares sanguíneos, edema, inflamação, necrose, ulceração e fibrose da pele [1].

O objetivo das pesquisas no reparo dessas feridas é desenvolver produtos, técnicas e métodos que estimulem e acelerem o processo cicatricial e evitem recidivas. Dentre as inúmeras formas de tratamento das úlceras venosas crônicas, o uso terapêutico do ultrassom (US) pulsado de baixa intensidade está indicado como co-adjuvante. Desde a década de 60, pesquisas apontam evidências consideráveis sobre uso do US como recurso terapêutico na cicatrização dessas feridas [2] – [7].

O US pulsado de baixa intensidade é tido como um agente pró-inflamatório, pois potencializa a resposta macrofágica [8] no sítio da lesão, facilitando o desbridamento de tecidos desvitalizados ou necróticos da ferida e aumentando a liberação de fatores de crescimento

fundamentais para a cicatrização. Desempenha também um papel importante no recrutamento de fibroblastos [9] – [11], os quais sintetizam matriz extra-celular para dar suporte ao tecido neo-formado. Além disso, esse estímulo sonoro incrementa a angiogênese local [12], [13], [14], o que contribui para a formação do tecido de granulação, que dará suporte à migração dos fibroblastos. Dessa forma, o US acelera as fases inflamatória e proliferativa da cicatrização, o que favorece o reparo tecidual das úlceras crônicas.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do tratamento de úlceras venosas crônicas com US pulsado de baixa intensidade pela análise histopatológica - contagem de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos.

II. MATERIAIS E MÉTODOS Oito pacientes com úlceras venosas crônicas

(caracterizadas clinicamente pelos sinais de IVC, como edema, varicosidades, eczema e lipodermatoesclerose) foram tratados no Ambulatório de Úlceras da Dermatologia (AUD) do Centro Saúde Escola (CSE) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CSE conforme processo número 019/2008.

O tratamento consistiu na troca do curativo diariamente (comumente realizado apenas com gazes e soro fisiológico 0,9%) e na aplicação do US, realizada pelo fisioterapeuta responsável.

A. Aplicação do US O Programa de Pós-Graduação Interunidades em

Bioengenharia da Escola de Engenharia de São Carlos/USP forneceu o aparelho de US com as seguintes características: baixa intensidade (30 mW/cm2); modo pulsado com burst de 1,5 MHz; largura de pulso 200 µs; frequência de repetição de pulso de 1 kHz e diâmetro do transdutor de 22 mm.

Após assepsia com álcool 70%, o transdutor foi coberto por um filme de PVC a fim de promover higiene adequada na interface aparelho/paciente. Como agente acoplador, foi utilizado um gel estéril à base de água, demonstrado pela Fig. 1.

A

Fig. 1: Aparelho de US e seu transdutor devidamente acondicionado.

O US foi aplicado sobre o leito da úlcera na técnica estacionária durante 3 minutos até cobrir toda extensão dessa ferida.

B. Estudo Histopatológico As biópsias foram executadas pelo dermatologista

responsável do AUD em duas etapas: 1º dia (pré-tratamento) e após 45 dias. Com um punch de 6 mm foram colhidos fragmentos da borda e do centro das úlceras, para posterior processamento, emblocagem e confecção das lâminas, coradas por Hematoxilina-Eosina (HE).

As imagens dessas lâminas foram capturadas pela câmera Leica® DFC 280 embutida no microscópio óptico Leica® DM 4000B e processadas pelo software LAS - Leica® Application Suite - versão 3.2.0 (Leica® Microsystems - Wetzlar, Alemanha) no Laboratório da Dermatologia da FMRP/USP. Com aumento de 400 vezes, foram obtidos 10 campos (264 x 211 µm) aleatórios de cada lâmina para posterior quantificação no ImageJ.

C. Análise das Imagens Para análise das imagens foi utilizado o programa

ImageJ versão 1.36. Esse software, de acesso livre, processa e analisa imagens em computadores que possuam Java.

Com as imagens obtidas pelo software LAS, foi possível fazer a contagem do número de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos do tecido ulcerado a partir do ImageJ, como mostra a Fig. 2.

Fig. 2 - Contagem de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos corados com HE (400x).

D. Análise Estatística O modelo de Poisson com efeito aleatório foi utilizado

para analisar a contagem de Fibroblastos, Células Inflamatórias e Vasos Sanguíneos nos diferentes dias analisados (1º e 45º dia) e em ambos locais da ferida (borda e centro).

Para tanto, os testes foram estabelecidos com 95% de potência (p < 0,05) a fim de verificar possíveis diferenças significantes entre os grupos.

III. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise estatística dos dados obtidos pela contagem de

fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos encontram-se nas Fig. 3, 4 e 5, respectivamente.

Fig. 3 – Amostragem para a variável Fibroblasto.

Fig. 4 – Amostragem para a variável Células Inflamatórias.

Fig. 5 – Amostragem para a variável Vasos Sanguíneos.

Em relação ao número de fibroblastos antes do tratamento e após 45 dias, podemos afirmar que o US incrementou significantemente a proliferação dessas células, tanto na borda, quanto no centro da úlcera. Essa observação é corroborada pelo estudo de [9], que observaram um aumento significativo de fibroblastos em lesão de pele de ratos tratada com US pulsado de intensidade SATA de 0,1 W/cm2. Devido a isso, o US pode acelerar a cicatrização da úlcera por atingir a fase proliferativa mais rapidamente, aumentando a síntese da matriz extra-celular (principalmente colágeno).

Já na variável células inflamatórias, o estímulo sonoro diminuiu significantemente a quantidade do infiltrado inflamatório do centro da úlcera, onde inicialmente continha mais células. Isso ocorre porque o estímulo sonoro potencializa a resposta macrofágica, encurtando a fase inflamatória. Essa observação está de acordo com o estudo de [10], que também indica um aumento na resposta macrofágica em culturas de células irradiadas com US de intensidade baixa (0,5 W/cm2) e frequência de 0,75MHz.

O US apresentou também um papel angiogênico [14], por aumentar significantemente o número de vasos sanguíneos na borda da úlcera, local em que ocorre a proliferação das células quiescentes que darão suporte à reepitelização da ferida.

IV. CONCLUSÃO Podemos afirmar que a aplicação do US pulsado de

baixa intensidade estimula o reparo tecidual de úlceras venosas crônicas por acelerar a fase inflamatória e ativar a fase proliferativa da cicatrização.

AGRADECIMENTOS À técnica do Laboratório da Dermatologia da

FMRP/USP, Marilena Heredia e à CAPES, pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS [1] T. Mustoe, “Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis

on their pathogenesis and implications for therapy” The American Journal of Surgery, vol. 187, pp. 65S-70S, 2004.

[2] M. Dyson, C. Franks e J. Suckling, “Stimulation of healing of varicose ulcers by ultrasound”, Ultrasonics, vol. 14, n. 5, pp. 232-236, Sept. 1976.

[3] M. J. Callam, “A controlled trial weekly ultrasound therapy in chronic leg ulceration”, The Lancet, vol. 2, pp. 204-206, July 1987.

[4] M. L. Hilário, “Radiação Ultra-Sônica de Baixa Intensidade na Reparação Tecidual de Úlceras Tróficas de Perna”, Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, EESC/FMRP/IQSC/USP, São Carlos, 153 pp., 1993

[5] M. Weichenthal, P. Mohr, W. Stegmann e E. W. Breitbart, “Low-frequency ultrasound treatment of chronic venous ulcers” Wound Repair and Regeneration, vol. 5, n. 1, pp. 18-22, 1997.

[6] M. A. D. J. Anastácio, “Reparação Epitelial em Úlceras Vasculares após Estimulação do Ultra-Som Pulsado de Baixa Intensidade”, Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, EESC/FMRP/ IQSC/USP, São Carlos, 89 pp., 2000.

[7] L. A. Santana, “Tratamento de úlceras venosas por ultra-som de baixa intensidade: avaliação por análise de imagem e imunohistoquímica”, Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, São Carlos: EESC/FMRP/IQSC -USP, 127 pp., 2006.

[8] S. R. Young e M. Dyson, “Macrophage responsiveness to therapeutic ultrasound”, Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 16, n. 8, pp. 809-816, 1990.

[9] S. R. Young e M. Dyson, “Effect of therapeutic ultrasound on the healing of full-thickness excised skin lesions” Ultrasonics, vol. 28, n. 3, pp. 175-80, 1990.

[10] S. Zhou, A. Schmelz, T. Seufferlein, Y. Li e J. Zhao, “Molecular mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts” The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, n. 52, p. 54463-54469, 2004.

[11] D. F. Webster, J. B. Pond, M. Dyson e W. Harvey, “The role of cavitation in the in vitro stimulation of protein synthesis in human fibroblasts by ultrasound” Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 4, n. 4, pp. 343-51, 1978.

[12] C. Uhlemann, B. Heinig e U. Wollina, “Therapeutic ultrasound in lower extremity wound management”, Lower Extremity Wounds, vol. 2, n. 3, pp. 152-7, 2003.

[13] M. Peschen, M. Weichenthal, E. Schöpf e W. Vanscheidt, “Low-frequency ultrasound treatment of chronic venous leg ulcers in an outpatient therapy”, Acta Dermatology and Venereology (Stockholm), vol. 77, pp. 311-4, 1997.

[14] S. R. Young e M. Dyson, “The effect of therapeutic ultrasound on angiogenesis”, Ultrasound in Medicine and Biology, vol. 16, n. 3, pp. 261-269, 1990.