1

UFRRJ

INSTITUTO DE VETERINÁRIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA

DISSERTAÇÃO

Avaliação da Microbiota Vaginal de Cadelas Usando

como Diagnóstico o Isolamento Microbiológico e a

Colpocitologia

Andrea Gonzaga dos Santos

2006

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3

636.708981

5

S237a

T

Santos, Andrea Gonzaga dos, 1977-

Avaliação da microbiota vaginal

de cadelas usando como diagnóstico

o isolamento microbiológico e a

colpocitologia / Andrea Gonzaga dos

Santos. – 2006.

29f. : il.

Orientador: Vera Lúcia Teixeira

de Jesus.

Dissertação (mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Instituto de

Veterinária.

Bibliografia: f. 25-28.

1. Cão – Doenças – Teses. 2.

Vagina – Doenças – Teses. 3.

Colpocitologia – Teses. 4. Vagina –

Microbiologia – Teses. I. Jesus,

Vera Lúcia Teixeira de, 1959-. II.

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro. Instituto de

Veterinária. III. Título.

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINARIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA

ANDREA GONZAGA DOS SANTOS

Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em Microbiologia Veterinária como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências em Microbiologia Veterinária.

DISSERTAÇÃO APROVADA EM:-17/02//2006.

____________________________________________ Vera Lúcia Teixeira de Jesus Dra. UFRRJ

(Orientadora)

_____________________________________________

Carlos Alberto da Rocha Rosa. PhD. UFRRJ

_____________________________________________

Andréa Maria de Araújo Gabriel. Dra. UNESA

5

Aos meus pais Alberto e Regina, e irmãos

Alexandre e Marcos. Minha família, minha

alegria, minha vida. Ao meu avô, Rutyro, eterna

saudade.

6

AGRADECIMENTOS

Agradeço a DEUS por estar aqui, concluindo esta etapa, com saúde, fé e perseverança.

Agradeço ao meu PAI, que sempre comigo, me incentivou, orientou e me fez quem

sou hoje.

Agradeço à minha MÃE, sempre presente, que me escutou, acalmou, me fez sempre ir

em frente, e me fez quem sou hoje.

Agradeço aos meus irmãos ALEXANDRE e MARCOS, que mesmo em outros

Estados, estiveram sempre ao meu lado, no meu pensamento, mente e coração.

Agradeço à minha orientadora VERA LÚCIA T. de JESUS, que em todos os

momentos esteve presente, orientando, auxiliando, escutando, e que soube fazer de mim uma

amiga verdadeira.

Agradeço à minha amiga JULIANA ANDRADE, que me ajudou imensamente na

execução do meu trabalho, e que sem ela, este trabalho não sairia.

Agradeço ao Professor MARCELO FRAGA, que sempre atencioso e com uma boa

vontade constante, auxiliou na identificação dos fungos.

Agradeço à Professora MILIANE MOREIRA, e a todas as meninas do Laboratório de

Bacteriologia da UFRRJ (LIGIA, DEBORA, LIDIANE, SHANA), que disponibilizaram o

Laboratório, e ajudaram imensamente na identificação bacteriológica.

Agradeço ao Professor FRANCISCO BARONNI, pela identificação das leveduras.

Agradeço ao amigo PEDRO AFONSO, pela inestimável ajuda na organização dos

dados e na estatística e na elaboração da apresentação.

Agradeço ao WALTER LEIRA TEIXEIRA FILHO, pelo auxílio na coloração das

lâminas.

Agradeço ao Professor FABIO SCOTT, e THAIS RIBEIRO, sempre prestativos e

atenciosos, pela ajuda na coleta e pela disponibilização das cadelas do Laboratório de

Desenvolvimento de Produtos Parasiticidas (LDPP), Departamento de Parasitologia Animal,

Instituto de Veterinária, UFRRJ.

Agradeço às CADELAS de que colhi amostras, pela colaboração ao meu trabalho.

Agradeço à COORDENAÇÃO, pelo apoio, auxílio e atenção.

Agradeço enfim a todos que de algum modo me auxiliaram, me incentivaram,

estiveram comigo.

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RESUMO

SANTOS, Andrea Gonzaga dos. Avaliação da microbiota vaginal de cadelas usando como

diagnóstico o isolamento e a colpocitologia, Seropédica: UFRRJ, 2006. 29p. (Dissertação,

Mestrado em Microbiologia Veterinária).

O objetivo deste estudo foi demonstrar a aplicação da colpocitologia vaginal como método de diagnóstico reprodutivo preventivo em cadelas. Para tal foram caracterizadas as variáveis pertinentes ao animal e ao manejo, relacionando os dados com a observação do esfregaço vaginal e com os resultados do isolamento microbiológico. Foram utilizadas 40 cadelas hígidas, provenientes de canis domiciliares e comerciais. Questionários foram aplicados aos responsáveis que responderam sobre o manejo, histórico reprodutivo e clínico das cadelas, e em seguida realizado a coleta de muco vaginal para o isolamento bacteriano e fungico, bem como a citologia das mesmas. Para o isolamento bacteriano, procedeu-se à coleta com swab estéril da mucosa vaginal, que foi acondicionado em Ágar Nutriente e posteriormente semeado nos meios Ágar MacConkey, Ágar Seletivo para Estreptococos, Ágar EMB, Ágar Sangue e Ágar Manitol Vermelho de Fenol. Em seguida foram realizadas as provas bioquímicas necessárias para a identificação das bactérias. No isolamento fúngico, utilizou-se um swab estéril, acondicionando-o em Água Peptonada a 1%, e semeado após incubação em Ágar Sabouraud a 2% com e sem acréscimo de cloranfenicol. Para o exame colpocitológico foram utilizadas escovas ginecológicas estéreis e o esfregaço obtido foi corado pela técnica do Panótico Rápido. Observou-se quanto ao perfil das cadelas que 35,0% estavam na faixa etária de 6 a 24 meses, 60,0% eram criadas em canis comerciais com acesso a terra, 65,0% eram nulíparas e 42,5% estavam em anestro. Quanto ao isolamento bacteriano houve maior freqüência de isolamento de Micrococcus spp (24,6%), Streptococcus spp (13,24%), Streptococcus schleiferi coagulans (9,56%) e Escherichia coli (9,56%) e o isolamento fúngico de maior freqüência foi Cladosporum spp (20,0%), seguido do Fusarium spp (16,3%) e Curvularia spp (10,9%). Quando todas as variáveis foram associadas, concluiu-se que a citologia vaginal foi um bom indicativo para a observação da presença de bactérias e leveduras, bem como para a identificação da fase do ciclo estral, mas não foi um bom indicativo para a identificação de fungos filamentosos, quando comparada ao isolamento microbiológico.

Palavras chave: isolamento bacteriano, isolamento fúngico, citologia vaginal.

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ABSTRACT

SANTOS, Andrea Gonzaga dos. Evaluation of the vaginal microbiota of bitches using the

isolation diagnostic and colpocitology, Seropédica: UFRRJ, 2006. 29p. (Dissertation,

Master’s Degree in Veterinary Microbiology).

The objective of this study was to demonstrate the applicability of the vaginal colpocytology as a preventive reproductive diagnostic method in bitches. To this

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SUMÁRIO DE TABELAS

11 Tabela 1 Distribuição da faixa etária das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e exame colpocitologia vaginal, em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

11 Tabela 2 Freqüência do sistema de criação das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

12 Tabela 3 Freqüência do número de crias das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

12 Tabela 4 Freqüência da fase do ciclo estral das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

13 Tabela 5 Distribuição de isolamentos bacterianos das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

14 Tabela 6 Distribuição de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo a faixa etária, em meses em freqüência absoluta (Fa).

15 Tabela 7 Distribuição de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo o sistema de criação em freqüência absoluta (Fa).

16 Tabela 8 Freqüência de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo o número de crias em freqüência absoluta (Fa).

17 Tabela 9 Freqüência de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo a fase do ciclo estral em freqüência absoluta (Fa).

18 Tabela 10 Freqüência de isolamentos fúngico em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

19 Tabela 11 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo a faixa etária, em meses.

20 Tabela 12 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo o sistema de criação.

10

20 Tabela 13 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo o número de crias.

21 Tabela 14 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo a fase do ciclo estral.

22 Tabela 15 Freqüência da morfologia das bactérias encontradas na colpocitologia.

11

SUMÁRIO

1 1 INTRODUÇÃO

2 2 REVISÃO DE LITERATURA

2 2.1 Microbiota bacteriana vaginal

4 2.2 Microbiota fúngica vaginal

5 2.3 Avaliação citológica vaginal

8 3 MATERIAL E MÉTODOS

8 3.1 Animais

8 3.2 Análise Bacteriológica Vaginal

8 3.2.1 Materiais para coleta

8 3.2.2 Procedimento da coleta

8 3.2.3 Isolamento e identificação

9 9 9 9 9 9 9

10 10 10 10

3.3 Análise Fúngica Vaginal 3.3.1 Materiais para coleta 3.3.2 Procedimento de coleta 3.3.3 Isolamento e identificação 3.4. Análise Citológica vaginal 3.4.1 Materiais para coleta 3.4.2 Procedimento da coleta 3.4.3 Análise do esfregaço 3.4.3.1 Células epiteliais 3.4.3.2 Microrganismos 3.4.3.2 Análise estatística

11 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

11 11

4.1 Animais 4.1.1 Faixa etária

11 4.1.2 Manejo

12 17

4.2 Isolamento Bacteriológico 4.3 Isolamento Fúngico

21 4.4 Comparação da maior freqüência de bactérias e fungos nas diferentes variáveis

22 4.5 Exame Colpocitológico 23 4.6 Associação do Isolamento Microbiológico com a Colpocitologia

24 5 CONCLUSÕES

25 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

29 7 ANEXO

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1 INTRODUÇÃO

O crescimento significativo da população canina nas últimas décadas tem levado a um aumento e a uma diversificação da atuação do Médico Veterinário, tanto em praticas médicas curativas como em bases epidemiológicas preventivas, inclusive na área de reprodução assistida. O aprimoramento de canis especializados em reprodução e a pressão de proprietários em clínicas veterinárias estão trazendo os profissionais para a maior atuação tanto na prevenção de doenças reprodutivas quanto no acompanhamento da gestação e na realização de técnicas reprodutivas como inseminação artificial com acompanhamento da citologia vaginal. O diagnóstico precoce de patologias ligadas ao sistema genital feminino, como vaginites, metrites e piometras, é fundamental para um melhor aproveitamento da vida reprodutiva da fêmea.

A colpocitologia, citologia vaginal ou citologia esfoliativa em mulheres tem sido usada a varias décadas como método preventivo para doenças do trato reprodutor, como neoplasias e processos inflamatórios. Em cadelas seu uso se restringia até pouco tempo ao monitoramento do ciclo estral, ou seja, acompanhamento das mudanças hormonais durante o ciclo, através das alterações celulares vaginais para determinação do momento ótimo para a inseminação artificial ou monta natural.

O uso da citologia vaginal como método preventivo em cadelas não é ainda bem estudado. A sua utilização como diagnóstico da microbiota vaginal, infecções e inflamações, é pouco explorada mesmo sendo uma boa fonte de visualização de bactérias (cocos e bacilos), leveduras, fungos filamentosos, neutrófilos e hemácias. A identificação da microbiota existente no ambiente vaginal é feito geralmente através do isolamento em meios de culturas.

A correta interpretação dos resultados requer o histórico da cadela, pois as bactérias isoladas de uma cadela com alterações reprodutivas são as mesmas em amostras de animais saudáveis.

O objetivo do presente estudo é demonstrar a efetividade e a importância da colpocitologia como método preventivo em cadelas, através da observação do esfregaço vaginal a quantidade e tipo de bactérias presentes e de possíveis alterações, como presença de neutrófilos e hemácias em fases em que não são características, comparando os resultados com os dados do isolamento microbiológico vaginal, associando as variáveis manejo e características das cadelas.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

Infecções do trato reprodutivo de cadelas são achados patológicos encontrados comumente e são motivo de atenção e cuidados especiais tanto dos proprietários, quanto dos médicos veterinários (NELSON e COUTO, 1992), pois podem acarretar uma diminuição da eficiência reprodutiva e à infertilidade (TORRES et al., 1998). Estas alterações possuem grande influência na reprodução e o conhecimento relativo aos agentes microbianos que habitam contínua ou ocasionalmente o ambiente vaginal é relevante para melhor entender essa patologia (MORAES, 2004).

A utilização do exame ginecológico completo nas cadelas é de suma importância para o pronto diagnóstico de patologias da reprodução, necessitando da utilização de exames complementares para a conclusão da etiologia, como a citologia e cultura e antibiograma de secreções vaginais (SANTOS, 2005).

Vários estudos têm sido realizados no intuito de analisar a microbiota do trato reprodutivo de cadelas utilizando o isolamento microbiológico como método para a identificação. Alguns associam a presença dos microrganismos à fase do ciclo estral, mas poucos utilizam a citologia vaginal como diagnóstico microbiológico. 2.1 Microbiota Bacteriana Vaginal

O trato genital feminino possui uma microbiota residente desde suas regiões externas ao óstio cervical. A vagina contém bactérias compostas principalmente por espécies anaeróbias obrigatórias e aeróbias facultativas, que são em torno um décimo das anaeróbias. A função da microbiota vaginal é incerta, mas deve ser considerada como protetora (HIRSH, 2003).

Os hormônios possuem um papel à parte na proteção do sistema genital. Os estrógenos aumentam o suprimento sanguíneo para a vagina e útero, e o número de leucócitos polimorfonucleares se eleva, sendo este fenômeno de extrema importância devido à possível contaminação por agentes nocivos durante o coito (HIRSH, 2003). O exame bacteriológico de amostras vaginais de cadelas é feito para a identificação de possíveis agentes etiológicos associados à infertilidade, vaginites e natimortos. A correta interpretação dos resultados requer o histórico da cadela, pois as bactérias isoladas de uma fêmea com alterações reprodutivas são as mesmas em amostras de animais saudáveis (BJURSTRÖM, 1993), e estas existem em um balanço natural com o hospedeiro, e podem até protegê-lo de infecções (BJURSTRÖM e LINDE-FORSBERG, 1992). Cadelas com vaginites apresentam microrganismos quantitativa e qualitativamente semelhantes a microbiota bacteriana vaginal normal, o que justifica o interesse na sua identificação (NELSON e COUTO, 1992). Não se sabe por que ou quando este equilíbrio se desfaz, e os agentes bacterianos se tornam patogênicos (MELLO, 2005). O isolamento de patógenos oportunistas não é prova de infecção, embora o crescimento maciço de um único agente possa ser significativo (BABA et al., 1984). Alvarenga (1990) descreve a grande importância da distinção entre os microrganismos contaminantes daqueles que estejam realmente provocando agressão e reposta inflamatória.

Ao longo dos anos, diversos trabalhos vêm sendo realizados com o intuito de identificar a microbiota bacteriana vaginal de cadelas saudáveis, com alterações reprodutivas, nas diversas fases do ciclo estral. Osbaldiston et al. (1972) estudaram a microbiota em dois grupos de fêmeas, e isolaram Escherichia coli em 50% das fêmeas, Enterococos spp em 30%, Corynebacterium spp em 20%, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Haemophilus spp e Pseudomonas spp em 10%.

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Moreno et al. (1973) avaliaram os aspectos bacteriológicos vaginais de 100 cadelas com alterações genitais, e encontraram maior porcentagem de isolamento de Staphylococcus

aureus (23,8%), Escherichia coli (25,5%), Streptococcus β hemolítico (20,5%), Pseudomonas

aeroginosa (15,2%), Proteus morganii (2,9%) e Aerobacter aerogenes (1,5%). Hirsh e Wiger (1977) compararam a microbiota de 62 fêmeas clinicamente normais

que não se encontravam em estro, de onde isolaram Streptococcus spp, Escherichia coli,

Staphylococcus spp, Proteus morganii, Corynebacterium spp, Pseudomonas spp, Enterococos, Pasteurella spp, Flavobacterium spp, Bacillus spp, Enterobacter spp, Moraxella spp.

Osbaldiston (1978) estudou em 50 cadelas sadias em anestro e em 297 com processo infeccioso do trato genital, isolando em fêmeas sadias Escherichia coli, Staphylococcus spp, Enterobacter spp, Proteus spp, Enterococci spp, Corynebacterium spp, Streptococcus spp, Haemophilus spp, Pseudomonas spp e das fêmeas com alterações genitais principalmente Streptococcus spp, Escherichia coli, Staphylococcus spp, Proteus spp e Pasteurella spp.

Allen e Dagnall (1982) observaram a microbiota bacteriana do trato genital de 143 fêmeas, sendo 74 em estro, 47 com corrimento vaginal, 22 com alterações reprodutivas e 51 machos, isolando Streptococcus spp, Escherichia coli, Pasteurella spp e Staphylococcus spp, deduzindo que essas bactérias faziam parte da microbiota normal das fêmeas e dos machos e que podiam ser transmitidas durante a cobertura.

Gentilini e Denamiel (1983) estudaram a microbiota vaginal aeróbia de 100 fêmeas, da espécie canina, livre de problemas genitais e em anestro, obtendo em 58% das fêmeas Staphylococcus epidermidis, em 29% Streptococcus spp, em 15% Escherichia coli.

Baba et al. (1983) identificaram e quantificaram a microbiota aeróbia e anaeróbia de 82 amostras vaginais e 78 uterinas, obtidas de fêmeas adultas em diferentes estágios do ciclo estral. Do total das amostras vaginais em 96% houve crescimento, sendo isolados com maior freqüência Streptococcus spp, Bacteroidaceae, Staphylococcus spp, Micoplasma spp. A contagem das bactérias na fase de estro foi mais elevada do que no anestro, prenhez e puerpério, entretanto, quanto ao número de espécies bacterianas identificadas, não observaram diferenças significantes entre os estágios do ciclo estral.

Olson et al. (1986) analisaram as bactérias vaginais de 81 fêmeas púberes em diferentes fases do ciclo estral, e de 41 pré-púberes. Verificaram que nas pré-púberes a maior freqüência de microrganismos era Staphylococcus spp, Streptococcus spp e Escherichia coli, enquanto nas púberes isolaram Streptococcus spp, Escherichia coli e Staphylococcus spp. Concluíram não haver diferença significativa entre os microrganismos isolados nas diferentes fases do ciclo estral.

Bjurström e Linde-Forsberg (1992) estudaram os microrganismos do trato genital de 59 cadelas, e identificaram como bactérias mais comumente isoladas Pasteurella multocida, Streptococcus β-hemolíticos e Escherichia coli.

Bjurström (1993) fez um estudo retrospectivo de espécies de bactérias aeróbias encontradas na vagina de 203 cadelas com alterações reprodutivas e encontraram Escherichia

coli, Streptococcus β-hemolíticos, Staphylococcus intermedius, e Pasteurella multocida.

Watts et al. (1996) coletaram amostras vaginais e uterinas de 19 cadelas em diferentes estágios do ciclo reprodutivo. Isolaram com mais freqüência Escherichia coli, Haemophilus

spp, Streptococcus β-hemolíticos, Corynebacterium spp, Streptococcus canis, Pasteurella spp e Proteus mirabilis, indicando que a microbiota vaginal durante o estro e pró-estro é semelhante à do útero.

Oliveira et al. (1998) determinaram a microbiota aeróbia e sua variação em 90 cadelas hígidas durante as fases do ciclo estral confirmadas pela citologia vaginal. Isolaram 169 microrganismos, sendo os mais freqüentemente isolados Staphylococcus spp (56,7%),

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Streptococcus spp (42,2%) e Escherichia coli (24,4%). Não houve variação na freqüência total de isolamento dos microrganismos em função da fase do ciclo estral. Stornelli et al. (2000) fizeram um estudo sobre bactérias aeróbias vaginais em 33 cadelas saudáveis, e encontraram mais freqüentemente Staphylococcus spp (39%) e Escherichia coli (21%). Mais importante que se isolar as bactérias presentes no ambiente vaginal das cadelas é conhecer o seu potencial patogênico. Das bactérias encontradas, as mais citadas nos estudos foram Escherichia coli, Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Pasteurella spp, Mycoplasma spp, Pseudomonas spp e Proteus spp. A espécie Escherichia coli é patógena para os animais e é encontrada como microbiota normal do trato gastrintestinal, podendo ser causa de doença septicêmica em filhotes (HIRSH e ZEE, 2003). Linde (1983) descreve um abortamento em cadela causado pela Escherichia

coli, de onde foi isolada cultura pura da bactéria na descarga hemorrágica genital e do útero. Hirsh e Zee (2003) cita o papel do hormônio progesterona na suscetibilidade do sistema genital à Escherichia coli na fase luteínica, quando receptores específicos desta bactéria são expressados. A colonização por E. coli expressa adesinas apropriadas que resulta em hiperplasia endometrial cística, e por fim, piometra. Streptococcus spp são encontrados em infecções do trato urinário de cães, e em casos de mastite bovina. S. agalactiae pode causar infecções neonatais em cães e gatos e S.

zooepidemicus condições genitais e neonatais (HIRSH e ZEE, 2003). O gênero Pasteurella spp, com as espécies P. multocida e P. canis são encontradas juntamente com bactérias aeróbias que predomina em infecções e feridas, e não são associadas à doenças reprodutivas em cães. A espécie P. aerogenes pode causar abortamento em suínos (HIRSH e ZEE, 2003). Várias espécies de Mycoplasma spp podem ser encontradas em cães, entretanto pouco se conhece sobre o papel que desempenham nas doenças. Evidências experimentais sugerem que M. canis cause doença do trato urogenital, como prostatite, orquite, epididimite e endometrite, mas a sua importância em doenças reprodutivas de cadelas é obscura (HIRSH e ZEE, 2003). Dentre as espécies de Pseudomonas spp de importância em Medicina Veterinária se destaca P. aeroginosa, que é encontrada usualmente em otite externa e cistite caninas (HIRSH e ZEE, 2003). O gênero Proteus pertence à família Enteribacteriaceae, e causa patologias do trato urinário, podendo ser encontrado no ambiente vaginal, mas não está relacionado diretamente a alterações reprodutivas. 2.2 Microbiota Fúngica Vaginal

Fungos têm sido isolados do trato genital de animais desde 1920, quando Smith descreveu isolamentos a partir de membranas fetais e de útero bovino. Apesar da grande quantidade de trabalhos sobre as bactérias que se encontram no ambiente vaginal de cadelas, os estudos sobre os fungos habitantes do sistema genital feminino são escassos. Microrganismos já foram isolados de órgãos genitais de diferentes espécies, causando abortos, endometrites e cervicites.

Ainsworth e Austwick (1973) descreveram casos de abortos micóticos em bubalinos e bovinos causados por Aspergillus spp, Candida spp e Zygomycetes.

Moreno et al. (1973) isolaram Candida albicans em 100 fêmeas com alterações genitais.

Baba et al. (1983) relataram em seu estudo em que foi feito o isolamento microbiano em 82 amostras vaginais, o crescimento de fungos, sem, contudo, identificá-los.

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Chengappa et al. (1984), em um estudo com várias espécies, isolaram em cadelas

Candida parapsilosis a partir de duas amostras vaginais de cadelas. Oliveira et al. (1998) encontraram em amostras de 90 cadelas hígidas a presença em

duas amostras de Penicillium spp e Malassezia pachydermatis.

Sória et al. (2001) em um estudo específico para o isolamento de leveduras em amostras vaginais de cadelas, verificando diferenças durante o ciclo reprodutivo, isolaram Candida spp, Rhodotorula spp e Malassezia pachydermatis em todas as fases do ciclo estral, encontrando maior prevalência no pró-estro.

Cleff et al. (2001) em continuação ao trabalho anterior, identificaram as diferentes espécies de Candida spp isoladas, e encontraram maior prevalência de Candida parapsilosis, concluindo que os fungos são parte da microbiota vaginal normal, tendo variação de acordo com a fase do ciclo estral, podendo assim constituir uma fonte endógena de infecção.

Devido ao risco em potencial que os fungos representam como fontes endógenas de infecção é necessária a identificação dos fungos filamentosos e leveduras na microbiota vaginal, contribuindo para o conhecimento do seu papel na vaginite e conseqüentemente na reprodução animal (MORAES, 2004).

A grande maioria das espécies de levedura do gênero Candida é associada aos mais diversos habitat, mas poucas causam doenças nos animais. A espécie C. albicans é responsável pela candidíase, que acomete as superfícies mucosas, como trato digestivo e genital (HIRSH e ZEE, 2003). 2.3 Avaliação Citológica Vaginal A citologia vaginal ou colpocitologia foi preconizada por PAPANICOLAOU em 1942, quando, em seu estudo em citologia examinou amostras vaginais de porcas (ROSZEL, 1977), e se baseia nas alterações celulares do epitélio vaginal causadas pelas mudanças hormonais (SHUTTE, 1967). A avaliação das células esfoliadas do trato genital é útil para se determinar os estágios do ciclo estral canino, determinar o melhor momento para a monta natural ou inseminação, além de servir como diagnóstico para diversas desordens reprodutivas (OLSON, 1984), através da detecção de células refletindo processos patológicos como leucócitos, hemácias e células tumorais, por exemplo (WRIGHT e PARRY, 1989). A colpocitologia permite associar tipos celulares encontrados com achados clínicos, tais como a presença de leucócitos não somente no diestro de cadelas sadias, mas em outros períodos, como indicativo de infecções inaparentes relacionadas ao trato reprodutivo, a presença de bactérias em número aumentado logaríticamente durante o estro, células neoplásicas como sendo indicativo de tumores diversos (JOHNSTON et al., 2001).

O epitélio vaginal é classificado histologicamente como estratificado pavimentoso, sendo particularmente sensível às alterações hormonais, em especial ao estrogênio. O epitélio da vagina responde de forma característica à ação hormonal, permitindo diferenciar cada fase do ciclo estral através da presença de determinados tipos celulares. Sob estimulação estrogênica ocorrem espaçamentos do epitélio, tornando as células do lúmen vaginal cada vez mais distantes do seu suprimento sanguíneo e promovendo assim a proteção da mucosa na hora da cópula. Neste sentido as diferentes células encontradas na citologia vaginal designam distintos estágios de morte celular. Da lâmina própria em direção ao lúmen vagina, podem ser encontradas seqüencialmente as células basais, parabasais, intermediárias e superficiais (NEVES, 2001). Na fase de pró-estro, há uma elevação na concentração de estrogênio, o epitélio vaginal prolifera e as hemácias passam através dos capilares uterinos (CONCANNON, 1986). As células parabasais, intermediárias grandes e pequenas e células superficiais são

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características. Há presença marcante de hemácias, polimorfonucleares, e bactérias livres ou junto à superfície das células (HOLST, 1986). No estro, 70,0 a 90,0% das células são caracterizadas como superficiais, com bordas frágeis e indistintas. Os esfregaços não contem polimorfonucleares e as hemácias estão ausentes, ou em número pequeno. É comum a presença de bactérias ao redor das células epiteliais (ROSZEL, 1977), em grande quantidade, até o final do estro (ALLEN, 1995). No diestro, ocorre uma mudança abrupta no número de células superficiais no esfregaço, com o reaparecimento de células parabasais e intermediárias. Há o reaparecimento dos polimorfonucleares intra e extracelulares, (SCHUTE, 1967; CONCANNON, 1986). A grande quantidade de neutrófilos durante o início do diestro não está associada a qualquer processo patológico ou a corrimento vulvar, sendo considerado fenômeno normal. Grandes quantidades de neutrófilos durante outro estágio do ciclo indicam processo inflamatório (ETTINGER e FELDMAN, 1997). As bactérias desaparecem dramaticamente no final do estro, coincidindo com o afluxo de neutrófilos e o aparecimento de mucos e debris (ALLEN, 1995). O anestro é caracterizado por um reduzido número de células esfoliadas no esfregaço, com a predominância de células parabasais e intermediárias pequenas, envolvidas por muco. Observam-se raros polimorfonucleares (COWELL e TYLER, 1989) e raras bactérias (ALLEN, 1995). A amostra do esfregaço vaginal pode ser obtida por meio de swab de algodão estéril, espátula ou escova ginecológica (OSBALDISTON, 1978). Alguns trabalhos citam o uso do swab para a coleta da amostra (ALLEN, 1995; ETTINGER e FELDMAN, 1997), mas Alvarenga ; Mattos (1990) descrevem o uso da escova ginecológica para o emprego de coleta de amostras endometriais em éguas como de excelente qualidade, tanto na celularidade, quanto no material obtido, como também na segurança do diagnóstico dos processos inflamatórios agudos leves. Chaves (2003) conclui que a coleta cérvico-vaginal através da escova ginecológica estéril é um método adequado para a realização das avaliações hormonal e microbiológica, sendo imprescindível para a avaliação oncótica em cadelas. A obtenção de esfregaço colpocitológico para análise adequada com diagnóstico correto implica coleta da amostra em condições satisfatórias, rápida fixação com fixadores adequados, manipulação laboratorial e uso correto de corantes (MOTTA et al., 2001) . Exames de esfregaços de cadelas com vaginite aguda revelam células epiteliais correspondentes à fase do ciclo estral, com alterações degenerativas, como vacuolização do citoplasma e inclusões citoplasmáticas, células de metaestro espumosas, microbiota bacteriana aumentada, polimorfonucleares em degeneração ou com granulação tóxicas e fagocitose dos restos celulares, linfócitos, hemácias, além de metacromasia das células vaginais (MELLO, 2001). Em casos de vaginite crônica, pode ser observado aumento da descamação das células epiteliais vaginais, alterações da morfologia e da coloração, aumento da microbiota bacteriana, destruição celular e presença de células de defesa nos esfregaços (JOHNSON, 1994). Roszel (1977) relata a presença de células de metaestro e espumosas (“foam cells”) em processos infecciosos.

Bactérias são frequentemente observadas nas amostras citológicas em casos de vaginites. Deve-se atentar ao fato de que a vagina possui normalmente uma microbiota residente e são consideradas importantes citologicamente e clinicamente quando são observadas em conjunto com reação inflamatória e especialmente quando são vistos fagocitados por macrófagos e/ou neutrófilos (WRIGHT e PARRY, 1989).

O diagnóstico de vaginite bacteriana é baseado em vários fatores, incluindo a presença de descargas vaginais, e no esfregaço, a identificação de células chamadas “clue cells” que são células do epitélio vaginal encobertas por cocobacilos (MAZZULI, 1980).

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Além destes critérios, observa-se a quase ausência de Lactobacilos de Döerdelein e elementos leucocitários. A exacerbada microbiota bacteriana está representada por cocos e microbacilos (SILVA FILHO, 2001).

O exame colpocitológico pode ser utilizado como método complementar de diagnóstico microbiológico e representa um instrumento para a reprodução assistida, no que diz respeito à prevenção e controle de patologias (CHAVES, 2003) e permite observar a presença de agentes microbiológicos específicos, como fungos e outros microrganismos e, apesar de não ser o exame de escolha para o diagnóstico de vaginites, é possível obter identificação microbiológica (SILVA FILHO, 2001). Outro aspecto que tem fortalecido a necessidade da utilização do exame citológico na rotina da avaliação ginecológica tem sido o fato de que a concordância entre os exames bacteriológicos e ci

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3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais

Para a realização do trabalho foram utilizadas 40 cadelas de idade, porte e raças variadas. As cadelas foram provenientes de criações particulares, de canis, e do Departamento de Parasitologia Animal, Laboratório de Desenvolvimento de Produtos Parasiticidas (LDPP), Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, UFRRJ. Após anamnese e exame clínico, as cadelas consideradas saudáveis (ausência de febre, bom estado físico, ausência de secreção vaginal), foram selecionadas e foi preenchido um formulário (Anexo 1) sobre o histórico reprodutivo de cada fêmea: data do primeiro cio, intervalo entre cios (regular, irregular, média de período interestral), prenhez (número de gestações, se já sofreu abortamento) e patologias reprodutivas (vaginites, metrites, piometras). As cadelas foram classificadas de acordo com o número de crias, sendo que as que não tiveram cria são chamadas de nulíparas, e as que já tiveram pelo menos uma cria, são chamadas de paridas. Finalizada a etapa do preenchimento do questionário, iniciou-se a etapa de coleta. 3.2 Análise Bacteriológica Vaginal 3.2.1 Materiais para coleta Foram utilizados swabs estéreis com hastes flexíveis e de ponta de algodão hidrofílico1 (BJURSTRÖM, 1993; WATTS et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1998), meio de transp1orte sólido Agar Nutriente para o acondicionamento do swab, soro fisiológico e luva descartável. 3.2.2 Procedimento da coleta Com a cadela em estação foi feita a limpeza externa da vulva com solução fisiológica a 0,9 % e a posterior secagem com papel toalha. Procedeu-se o afastamento dos lábios vulvares evitando assim a contaminação externa (BJURSTRÖM, 1993), e com as mãos enluvadas foi introduzido o swab estéril na região caudal da vagina, com uma inclinação de 45º em relação ao solo, e então feitas várias rotações na mucosa interna vaginal. O swab foi então acondicionado no meio para transporte Agar Nutriente por até 24 horas e refrigerado em até 15ºC (BJURSTRÖM, 1993), e levado para o laboratório de Bacteriologia do Instituto de Veterinária (IV) da UFRRJ onde o material foi processado. 3.2.3 Isolamento e Identificação

O swab foi semeado em cinco meios de cultivo distintos: Ágar MacConkey (ALLEN e DAGNALL, 1982), Ágar seletivo para Estreptococos, Ágar EMB (Eosina Azul de Metileno), Ágar sangue (LING e RUBY, 1978; BABA et al., 1983) e Ágar Manitol Vermelho de Fenol. As placas semeadas foram incubadas em estufa a 37ºC por 24 a 48 horas. Após o crescimento das colônias, estas foram caracterizadas quanto ao seu aspecto, e realizou-se as provas iniciais de identificação: coloração de Gram, prova da catalase e de hidróxido de potássio a 3% (KOH 3%). Com estes resultados, pôde-se separar em grupos as bactérias isoladas e realizar a identificação bioquímica de cada grupo, que foi realizada segundo Lennette (1985), sendo os microrganismos classificados de acordo com Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology (KRIEG e HOLT, 1984).

1 Johnson & Johnson

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3.3 Análise Fúngica Vaginal 3.3.1 Materiais para coleta Foram utilizados swabs estéreis, Meio de transporte líquido Água Peptonada a 1% para o acondicionamento dos swabs. 3.3.2 Procedimento da coleta Com a cadela em estação foi feita a limpeza externa da vulva com solução fisiológica e a posterior secagem com papel toalha. Procedeu-se o afastamento dos lábios vulvares com

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as mãos enluvadas e introduzida a escova ginecológica na região caudal da vagina, com uma inclinação de 45º em relação ao solo, e então feitas várias rotações para a melhor obtenção de células vaginais. Foi então feito o rolamento da escova ginecológica sobre a lâmina de microscopia. Esta foi identificada com o nome da cadela e a data da coleta. A lâmina foi então fixada em álcool absoluto, e corada com Diff Quick®, e a leitura feita no Laboratório de Fisiopatologia da Reprodução, do Convênio Embrapa/UFRRJ.

3.4.3 Análise do esfregaço 3.4.3.1 Células epiteliais

O esfregaço foi observado à microscopia direta, no microscópio ótico da marca Leitz, com a ocular de 10 e objetiva de 10, 40 e 100X, sendo analisados a coloração, o tipo celular, a aparência das células, tamanho e presença de núcleos. Para a identificação da fase do ciclo estral foram utilizados além do histórico e exame clínico do animal, o método colpocitológico, adotando-se os critérios de classificação de ROSZVEL (1977) e OLSON et al. (1984). 3.4.3.2 Microrganismos

Os microrganismos foram identificados como bactérias (cocos, bacilos), leveduras e fungos. O critério para a avaliação foi feito segundo ALLEN (1985), que quantificou as estruturas observadas em raras (+), freqüentes (++), abundantes (+++) e incontáveis (++++). 3.5 Análise Estatística

Os dados obtidos foram colocados em planilha Excel e analisadas pelo Χ2 (qui-

quadrado) para permitir a análise estatística utilizando o programa Epi info (CDC, 2004). Quando necessário utilizou-se o Fischer exato em parcelas menores que cinco (SAMPAIO, 2000).

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Animais

Dos dados obtidos em relação às raças das 40 cadelas, verificou-se maior freqüência, 60,0% da raça Beagle, 27,5% da raça Pastor Alemão e 12,5% de outras raças.

4.1.1 Faixa Etária

Os animais do estudo foram agrupados de acordo com a faixa etária, a fim de verificar o intervalo de maior freqüência, compreendido entre seis a 24 meses (35,0%), 25 a 48 meses (17,5%), 49 a 72 meses (32,5%), e acima de 73 meses (15,0%), como demonstrado na tabela 1.

Tabela 1 Distribuição da faixa etária das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e exame colpocitologia vaginal, em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

Faixa etária Fa Fr

6 a 24 meses 14 35,0 25 a 48 meses 07 17.5 49 a 72 meses 13 32.5 Acima 73 meses 06 15,0 Total 40 100,0

4.1.2 Manejo

Com relação ao manejo sanitário, 100% das fêmeas examinadas eram vacinadas e vermifugadas, fato este justificado, em virtude de terem sido visitados canis que tinham a finalidade de pesquisa e outro com animais de guarda, portanto locais que possuíam uma assistência veterinária permanente.

Levando em consideração que 100% destes animais eram de canis, a diferença entre eles foi o local de maior permanência destes animais, pois 24 (60,0%) das fêmeas pertenciam a canil comercial com acesso a terra, 11 (27,5%) pertenciam a canil comercial sem acesso a terra e 5 (12,5%) pertenciam a canil não comercial (Tabela 2).

Tabela 2 Freqüência do sistema de criação das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

Tipo de Canil Fa Fr

Canil comercial com acesso à terra 24 60,0

Canil comercial sem acesso à terra 11 27,5

Canil não comercial 05 12,5

Total 40 100,0

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As 40 fêmeas examinadas possuíam histórico reprodutivo, cujos dados estão demonstrados na tabela 3.

Tabela 3 Freqüência do número de crias das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

Atividade sexual Fa Fr

Nulíparas 26 65,0

Paridas 14 35,0

Total 40 100,0

Pode–se observar que a maior freqüência das fêmeas foi de nulíparas (65,0%), podendo ser explicado pelo fator idade, pois 35,0% das fêmeas deste experimento estavam na faixa etária de seis a 24 meses (Tabela 1). Foi feita também a avaliação da fase do ciclo estral das cadelas, representada na tabela 4.

Tabela 4 Freqüência da fase do ciclo estral das cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

Atividade sexual Fa Fr

Anestro 18 45,0

Pró-estro 02 5,0

Estro 03 7,5

Diestro 17 42,5

Total 40 100,0

Analisando a tabela 4 observa-se que as cadelas se encontravam com mais freqüência na fase de anestro (45%), seguido da fase de diestro (42,5%).

Observando as variáveis de histórico e manejo pode-se caracterizar o grupo das cadelas, na sua maioria, 60,0% raça Beagle, 35,0% com idade de seis a 24 meses, 60,0% criadas em sistema de criação comercial com acesso à terra, 65,0% nulíparas e 42,5% em anestro.

4.2 Isolamento Bacteriológico

A identificação de microrganismos potencialmente causadores de patologias no trato reprodutivo de cadelas representa talvez a solução de inúmeros distúrbios ainda pouco explicados e controlados pela Medicina Veterinária. Sabe-se que a microbiota bacteriana normal do trato reprodutivo pode eventualmente tornar-se patogênica, tem sido associados a quadros de abortamentos e infertilidade em diversas espécies domésticas. A freqüência de isolamentos bacteriológicos obtidos das 40 cadelas neste estudo está representada na tabela 5.

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Tabela 6 Distribuição de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo a faixa etária, em meses em freqüência absoluta (Fa).

Faixa etária

Microrganismos Isolados 6 a 24 25 a 48 49 a 72 73 < Total

Micrococcus spp 10 6 12 5 33 S. schleiferi coagulans 8 3 2 0 13 Escherichia coli 8 1 3 1 13 Streptococcus spp 5 2 10 1 18 Klebsiella pneumoniae 4 1 2 0 07 Corynebacterium spp 4 3 1 0 08 Staphylococcus aureus 2 1 0 3 06 Listeria spp 3 2 6 1 12 Citrobacter diversus 2 0 0 0 02 Edwarsiella tardia 2 1 1 0 04 Yersinia enterocolitis 1 2 0 1 04 Enterococcus spp 1 1 1 0 03 Pseudomonas aeroginosa 1 0 1 0 02 Enterobacter agglomerans 0 1 1 3 05 Staphylococcus spp coagulase negativo 0 1 1 4 06 Total 51 25 41 19 136

Analisando os dados obtidos, pode-se observar um maior número de isolamentos em cadelas com idade de seis a 24 meses (51/136), e o menor número de isolamentos foi na faixa etária com mais de 73 meses (19/136), o que pode ocorrer devido a resistência adquirida às bactérias ao longo da vida. Constatou-se uma significância (p<0,05), da bactéria Streptococcus spp, para a faixa etária de 49 a 72 meses (p=0,035), o que corresponde o maior período de atividade sexual das cadelas. Neste período, pode ocorrer, devido ao fator hormonal, histórico de parição e cobertura, um desencadeamento de um processo patogênico (HIRSH, 2003). Também se constatou uma significância (p=0,031) para a bactéria S.

schleiferi coagulans para a faixa etária de seis a 24 meses, o que pode ser justificado também pelo fator ambiente, pois as cadelas nesta faixa etária deste trabalho vivem em canis comerciais com acesso à terra.

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Tabela 7

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Tabela 9 Freqüência de isolamentos bacterianos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal segundo a fase do ciclo estral em freqüência absoluta (Fa).

Fase do ciclo estral

Microrganismos Isolados Anestro Pro estro Estro Diestro Total Micrococcus spp 14 14 03 02 13 S. schleiferi coagulans 07 05 01 00 13 Escherichia coli 07 05 01 00 18 Streptococcus spp 06 10 00 02 07 Klebsiella pneumoniae 03 03 01 00 08 Corynebacterium spp 04 03 01 00 06 Staphylococcus aureus 02 02 00 02 12 Listeria spp 06 05 00 01 02 Citrobacter diversus 0 02 00 00 04 Edwarsiella tardia 03 01 00 00 04 Yersinia enterocolitis 02 02 00 00 03 Enterococcus spp 02 01 00 00 02 Pseudomonas aeroginosa 01 01 00 00 05 Enterobacter aglomerans 03 02 00 00 06 Staphylococcus spp coagulase negativo 02 02 02 00 13 Total 62 58 09 07 136

4.3 Isolamento Fúngico

Apesar da grande quantidade de estudos sobre as bactérias que se encontram no ambiente vaginal de cadelas, os estudos sobre os fungos habitantes do sistema genital feminino são escassos. Neste trabalho foram isolados 13 gêneros diferentes de fungos nas 40 cadelas. A freqüência de isolamento dos fungos nas cadelas está representada na tabela 10.

Analisando os dados obtidos, pode-se observar que maior freqüência de isolamento em relação ao número total de fungos isolados foi de Cladosporum spp (20,0%), seguido do Fusarium spp (16,3%) e Curvularia spp e Aspergillus spp (10,9%). Esses resultados diferem dos de Moreno et al. (1973), que isolaram predominantemente Candida albicans, e de Oliveira et al. (1998), isolaram em duas amostras Penicillium spp e Malassezia

pachydermatis, por trabalharem com pequenas amostras, os resultados observados neste estudo e nos citados na revisão, necessitam de outros estudos com intuito de explicar estes achados.

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Tabela 10 Freqüência de isolamentos fúngico em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) e freqüência relativa (Fr).

Fungos Isolados Fa Fr

Cladosporum spp 11 20,0

Fusarium spp 09 16,3

Aspergilus spp 06 10,9

Curvularia spp 06 10,9

Candida spp 05 9,0

Cryptococcus spp 04 7,2

Rhodotorula spp 04 7,2

Scopulariopsis spp 02 3,6

Pichia spp 02 3,6

Trichosporon spp 02 3,6

Acremonium strictum 02 3,6

Trichoderma spp 01 1,8

Monocillium spp 01 1,8

Total 55 100,0

Como no isolamento bacteriano, foi feita a associação do número de isolamentos de cada fungo encontrado nas cadelas, pelas variáveis faixa etária, tipo de criação, número de crias, e fase do ciclo estral. Na tabela 11 foi feita a freqüência dos isolamentos segundo a faixa etária.

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Tabela 11 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo a faixa etária.

Faixa etária (meses)

Microrganismos 6 a 24 25 a 48 49 a 72 mais 73 Total

Cladosporum spp 2 2 6 1 11 Fusarium spp 3 2 2 2 9 Aspergillus spp 0 1 4 1 6 Curvularia clavata 0 1 4 1 6 Candida spp 1 1 1 2 5 Cryptococcus spp 3 0 0 1 4 Rhodotorula spp 2 0 2 0 4 Scopulariopsis spp 0 1 1 0 2 Acremonium strictum 0 0 1 1 2 Trichosporon spp 1 0 0 1 2 Pichia spp 1 0 0 1 2 Trichoderma spp 0 1 0 0 1 Monocillium spp 1 0 0 0 1 Total 14 9 21 11 55

Analisando os dados obtidos, pode-se observar uma maior prevalência de isolamentos em cadelas com idade de 49 a 72 meses, e um menor número de isolamentos na faixa etária com mais de 25 a 48 meses.

Na tabela 12 observa-se os resultados da freqüência de isolamentos fúngicos de acordo com o sistema de criação, e na tabela 13, a freqüência de isolamento fúngico pela o número de crias do animal.

Houve maior freqüência de isolamentos fúngicos (35/55) na criação comercial onde as cadelas têm acesso a terra. Este fato pode ser explicado devido ao contato íntimo dos animais com a terra, que pode levar a uma contaminação da região vaginal pelos fungos, tendo o ambiente relação com a microbiota local.

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Tabela 12 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo o sistema de criação.

Tipo de criação

Microrganismos Com. c/ terra Com s/ terra Não com. Total Cladosporum spp 6 5 0 11 Fusarium spp 8 0 1 09 Aspergillus spp 0 5 1 06 Curvularia clavata 5 1 0 06 Candida spp 2 1 2 05 Cryptococcus spp 3 0 1 04 Rhodotorula spp 4 0 0 04 Trichosporon spp 1 0 1 02 Acremonium strictum 1 0 1 02 Scopulariopsis spp 1 1 0 02 Trichoderma spp 1 0 0 01 Monocillium spp 1 0 0 01 Total 35 13 07 55

Em se tratando da freqüência de isolamentos por número de crias, observada na tabela 13, pode-se constatar maior freqüência de isolamento fúngico para as fêmeas nulíparas (32/55) e quando aplicado o teste do qui-quadrado e o Fischer exato, não se observou nenhuma diferença significativa, fato este justificado, em virtude das fêmeas trabalhadas não possuírem histórico de distúrbio reprodutivo.

Tabela 13 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento

microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo o número de crias.

Número de crias

Microrganismos Paridas Nulíparas Total Cladosporum spp 7 4 11 Fusarium spp 4 4 09 Aspergillus spp 1 5 06 Curvularia clavata 3 3 06 Candida spp 3 2 05 Cryptococcus spp 2 2 04 Rhodotorula spp 0 4 04 Scopulariopsis spp 2 0 02 Trichosporon spp 2 0 02 Pichia spp 1 1 02 Acremonium strictum 1 1 02 Trichoderma spp 1 0 01 Monocillium spp 0 1 01 Total 24 31 55

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Na tabela 14 observa-se a freqüência dos isolamentos de fungos durante as fases do ciclo estral.

Tabela 14 Freqüência de isolamentos fúngicos em cadelas submetidas ao isolamento microbiológico e colpocitologia vaginal em freqüência absoluta (Fa) segundo a fase do ciclo estral.

Fases do ciclo estral

Fungos isolados Anestro Pro estro Estro Diestro Total

Cladosporum spp 4 0 0 7 11 Fusarium spp 5 0 1 3 09 Aspergillus spp 2 1 1 2 06 Curvularia clavata 4 0 0 2 06 Candida spp 4 0 1 0 05 Cryptococcus spp 1 0 0 3 04 Rhodotorula spp 2 0 0 2 04 Scopulariopsis spp 2 0 0 0 02 Trichosporon spp 0 0 1 1 02 Pichia spp 1 0 0 1 02 Acremonium strictum 1 0 0 1 02 Trichoderma spp 1 0 0 0 01 Monocillium spp 0 0 0 1 01 Total 27 1 4 23 55

Na tabela 14 constatou-se um maior número de fungos isolados na fase de anestro (27/55). Estes dados podem ser explicados, pelo fato de que 18/40 (45,0%) cadelas se encontravam em anestro no momento da coleta. Analisando os fungos isoladamente, observou-se que não houve diferença significativa dentro das diferentes fases do ciclo estral (p > 0,005). Estes achados diferem dos descritos por Soria (2001), que isolou fungos em todas as fases do ciclo estral, encontrando maior prevalência no pró-estro.

4.4 Comparação da maior freqüência de bactérias e fungos nas diferentes variáveis

Com os resultados obtidos pode-se fazer uma comparação sobre a maior freqüência de isolamento das bactérias e fungos nas diferentes variáveis. Na variável faixa etária a maior freqüência de isolamentos de bactérias foi na faixa etária de seis a 24 meses, enquanto que os fungos foram na faixa de 49 a 72 meses. Já nas variáveis tipo de criação, número de crias e fase do ciclo estral a maior freqüência de isolamentos se apresentou igual para os dois microrganismos: em canil comercial com terra, nas nulíparas e nas em anestro. Estes resultados podem ser explicados devido ao fato de os canis com acesso à terra serem mais úmidos, com temperaturas amenas e com nutrientes para o crescimento dos microrganismos. Sobre o fato de terem sido mais freqüentemente isolados microrganismos em cadelas nulíparas e em anestro, pode-se explicar pelo fato da maioria das cadelas deste estudo serem nulíparas e estarem em anestro.

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4.5 Exame Colpocitológico

Os esfregaços vaginais foram analisados, observando a presença de bactérias, caracterizando-as segundo a sua morfologia em bacilos e cocos, segundo a quantidade de bactérias e de quantidade de neutrófilos, classificadas segundo Allen (1985), e segundo a presença de leveduras e fungos nas lâminas. Em todas as lâminas foi possível a observação de microrganismos, entre eles, bactérias (cocos e bacilos) e leveduras. Este achado difere de Chaves (2003) que encontrou em 159 amostras, apenas 49 positivas para a presença de pelo menos um microrganismo.

A tabela 15 demonstra a morfologia das bactérias presentes nas lâminas de colpocitologia, segundo a morfologia de cocos, bacilos.

Tabela 15 Freqüência da morfologia das bactérias encontradas na colpocitologia

Morfologia das bactérias Total

Bacilos 00

Cocos 28

Cocos e bacilos 12

Total 40

Analisando os dados da tabela 15, pode-se observar uma freqüência em 100% das lâminas de bactéria tipo cocos, o que concorda com os achados obtidos no isolamento bacteriano. Estes dados não correspondem aos encontrados por Chaves (2003), que encontrou em 26,1% das amostras a presença de bactérias tipo cocos e 37,7% tipo lactobacilos, fato este explicado por ter sido estudado um grupo de fêmeas gestantes. As bactérias na citologia vaginal das cadelas foram visualizadas em 100% das lâminas. Este achado era esperado, na medida a vagina possui normalmente uma microbiota residente (WRIGHT e PARRY, 1989). A presença de bactérias em 100% das lâminas levou à observação destas pelas variáveis: faixa etária, sistema de criação, atividade reprodutiva e ciclo estral

Pode-se observar uma maior quantidade de bactérias nas cadelas na faixa etária de 49 a 72 meses. Este resultado difere de Chaves (2003) que encontrou uma maior freqüência na faixa etária de 73 meses ou mais (de 84 a 108 meses). Pode-se observar que o sistema de criação canil comercial sem terra concentra o maior número de bactérias encontradas nas lâminas. Este fato pode ser devido ao contato das cadelas com a terra.

Observa-se que as cadelas nulíparas apresentam maior concentração de bactérias, enquanto na figura 4 pode ser observado que a maior freqüência de bactérias encontradas na colpocitologia está na fase de pró-estro, em concordância com os achados de Concannon (1986) e Holst (1986) que citam a presença marcante de bactérias livres ou junto à superfície das células no esfregaço citológico vaginal, nesta fase do ciclo estral.

Os neutrófilos também são achados comuns na colpocitologia, e a sua presença ou ausência, em fases que lhe são ou não características, podem também ser usadas como métodos de diagnóstico para possíveis processos inflamatórios. Para analisar então a freqüência destas células nas lâminas segundo as mesmas variáveis..

Pode ser observada uma maior quantidade de neutrófilos em canis comerciais sem terra. Este fato pode ser explicado devido ao fato das cadelas nestes canis estarem em sua

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maioria na fase de diestro e na faixa etária de seis a 24 meses, portanto sem terem atividade sexual. Analisado os dados pode-se observar que a maior quantidade de neutrófilos está concentrada nas fêmeas nulíparas. Enquanto a maior quantidade de neutrófilos se encontra na fase de diestro, concordando com Schute (1967) e Concannon (1986) que descrevem o reaparecimento dos polimorfonucleares intra e extracelulares, e que a presença de grandes quantidades de neutrófilos durante outro estágio do ciclo indicam processo inflamatório, e com Ettinger e Feldman (1997), que relatam a grande quantidade de neutrófilos durante o início do diestro.

Feita a associação da presença de bactérias e neutrófilos pelas variáveis faixa etária, sistema de criação, atividade reprodutiva e fases do ciclo estral, , observou-se na fase de anestro pouca quantidade de neutrófilos e de bactérias; na fase de diestro grande quantidade de neutrófilos com poucas bactérias; no estro e pró-estro grande quantidade de bactérias com poucos neutrófilos, concordando com a literatura vigente sobre o estudo da colpocitologia vaginal para a detecção de cio em cadelas, segundo Olson et al. (1984).

4.6 Associação do Isolamento Microbiológico com a Colpocitologia Em 52,5% das amostras (21/40) foi observada a presença de formas características de leveduras, sendo que no isolamento microbiológico foi detectada a presença em 37,5% amostras (15/40), demonstrando que a citologia vaginal é um meio confiável para a detecção de leveduras vaginais, quando comparado com os fungos filamentosos, não houve esta associação, pois foram isolados em 34 cadelas, nove espécies diferentes, não sendo constatado pela colpocitologia. Quanto ao isolamento bacteriano houve uma concordância de 100%, pois em todas as lâminas se observou a presença de bactérias e se isolou as mesmas em amostras, demonstrando que a colpocitologia é um ótimo método para a identificação de bactérias.

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5 CONCLUSÕES

• A citologia vaginal foi um indicativo de qualidade no que diz respeito à identificação da fase do ciclo estral, da presença e quantificação de bactérias e de neutrófilos.

• A citologia vaginal não foi um indicativo no que diz respeito à identificação de fungos

filamentosos, quando se comparando ao isolamento microbiológico, apresentou 100% de concordância.

• Para uma análise segura dos achados colpocitológicos e microbiológicos deve ser

levado em consideração o habitat do animal, para diremir dúvidas quanto à qualidade do isolado e de possíveis contaminantes no momento da coleta da amostra.

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6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO 1 Formulário de identificação dos animais

Número do formulario: Identificação do animal e proprietário Manejo geral Profilaxia Histórico reprodutivo

Proprietário: Tel:

Endereço:

Nome do Animal:

Raça:

Idade

1.Tipo de canil?

( ) Comercial sem acesso à terra

( ) Comercial sem acesso à terra

( ) Não comercial

1. A cadela é regularmente vacinada? Sim ( ) ou Não ( )

2. A gata é regularmente vacinada? Sim ( ) ou Não ( )

1.Cicla normalmente? Sim ( ) ou Não ( )

2. O animal é castrado? Sim ( ) ou Não ( )

3. Já cruzou? Sim ( ) ou Não ( )

4. Pariu quantas vezes? ( )

5. Está amamentando no momento? Sim ( ) ou Não ( ))

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