UFRRJ

INSTITUTO DE AGRONOMIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA

TESE

Caracterização e Uso de Bactérias Diazotróficas

Isoladas de Diferentes Cultivares de Arroz

Originárias do Estado do Maranhão

Antonio Edilson da Silva Araújo

2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIROINSTITUTO DE AGRONOMIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA

CARACTERIZAÇÃO E USO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICASISOLADAS DE DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ

ORIGINÁRIAS DO ESTADO DO MARANHÃO

ANTONIO EDILSON DA SILVA ARAÚJO

Sob a Orientação do ProfessorJosé Ivo Baldani

e Co-orientação da ProfessoraVera Lúcia Divan Baldani

Tese submetida como requisitoparcial para obtenção do grau deDoutor em Ciências, no Curso dePós-Graduação em Fitotecnia,Área de Concentração emAgroecologia

Seropédica, RJFevereiro de 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIROINSTITUTO DE AGRONOMIACURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA

ANTONIO EDILSON DA SILVA ARAÚJO

Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, noCurso de Pós-Graduação em Fitotecnia, área de Concentração em Agroecologia.

TESE APROVADA EM 19/02/2008

_________________________________________________Jose Ivo Baldani. Dr. CNPAB

(Orientador)

_________________________________________________Manlio Silvestre Fernandes. Dr. UFRRJ

_________________________________________________Agostinho Dirceu Didonet. Dr. CNPAF

_________________________________________________Norma Gouvêa Rumjanek. Dr. CNPAB

_________________________________________________Altamiro Souza de Lima Ferraz Junior. Dr. UEMA

AGRADECIMENTOS

A DEUS.Aos meus orientadores Jose Ivo Baldani e Vera Lúcia Divan Baldani, pela

oportunidade, orientação, dedicação e pelo privilegio de fazer parte de sua equipe de pesquisa.Ao Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia (CPGF), pela oportunidade concedida.À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa de doutorado concedida.À Embrapa Agrobiologia (CNPAB), pelas condições oferecidas para e realização

deste trabalho.À Professora Claudia Antonia Vieira Rossetto, pelo apoio, incentivo, atenção e

ensinamentos.À Embrapa Meio-Norte, na pessoa do Dr. José Almeida Pereira, pela contribuição na

realização deste trabalho.Aos amigos da Embrapa Agrobiologia, Liamara Perin, Daniele Cristina, Joilson

Ferreira, Elisete Rodrigues, Ricardo Alexandre, Marinete Flores, Salomão Guimarães, SandyVideira, pelo auxílio, momentos de alegria e agradável convívio.

Aos funcionários da Agrobiologia, Luis Carlos, Wilson Cabral, Antonio Lúcio,Geraldo Baeta, pela disponibilidade, atenção e boa vontade nos serviços prestados.

Aos meus pais, Francisco Matias Araújo e Maria Madalena da Silva Araújo, peloesforço, apoio, incentivo, compreensão e por sempre valorizarem a educação.

Aos meus irmãos, em especial à Francisca e Ednaldo, pela confiança e por me ajudar amanter o equilíbrio emocional durante o curso.

Aos meus amigos do Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia, pela amizade ecompanheirismo.

A todos que me ajudaram ao longo do desenvolvimento deste trabalho.

BIOGRAFIA DO AUTOR

Antonio Edilson da Silva Araújo; nasceu na cidade de Timbiras, MA, em 17 de julhode 1973, filho de Francisco Matias Araújo e Maria Madalena da Silva Araújo, tornou-seTécnico em Agropecuária, em 1995, após concluir o segundo grau na Escola AgrotécnicaFederal de São Luiz. Em 1996, ingressou no curso de Engenharia Agronômica pelaUniversidade Federal Rural do Rio de Janeiro, concluindo-o em setembro de 2001. Nesteperíodo, foi bolsista de Iniciação Científica no Departamento de Fitotecnia do Instituto deAgronomia. Em março de 2002, ingressou no Curso de Mestrado em Fitotecnia pela mesmaUniversidade. Defendeu sua dissertação intitulada “Avaliação da Qualidade Sanitária eFisiológica em Sementes de Amendoim (Arachis hypogaea L.)” em fevereiro de 2004, nomesmo ano ingressou no curso de Doutorado em Fitotecnia pela Universidade Federal Ruraldo Rio de Janeiro, desenvolvendo o seu projeto de tese nas dependências da EmbrapaAgrobiologia.

RESUMO

ARAÚJO, Antonio Edilson da Silva. Caracterização e uso de bactérias diazotróficasisoladas de diferentes cultivares de arroz originárias do estado do Maranhão. 2008. 93p.Tese (Doutorado em Fitotecnia, Agroecologia). Instituto de Agronomia, Departamento deFitotecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Diversos trabalhos têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiar daassociação com bactérias diazotróficas. Entretanto, a fixação biológica de nitrogênio (FBN)em arroz é dependente de uma interação complexa entre as plantas, os microrganismos e oecossistema. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a contribuição da FBN emvariedades tradicionais de arroz do estado do Maranhão. Como objetivos específicos: a- isolare caracterizar bactérias diazotróficas nativas de solo cultivado com arroz no estado doMaranhão; b- selecionar as bactérias mais eficientes quanto ao acúmulo de biomassa eprodução de grãos; c- verificar se existe relação entre a FBN e o teor de proteínas nos grãos.Para o isolamento foi utilizada como “planta isca” as cultivares IR42 e Diamante e mais duasvariedades tradicionais de arroz do Maranhão Zebu Branco e Manteiga, crescidas emamostras de solo, provenientes de três municípios do Maranhão, sendo uma de terras altas(Bacabal) e duas de área de baixada (Arari e Vitoria do Mearim). Amostras de raízes, colmose folhas foram maceradas e inoculadas em meios semi-sólidos semi-seletivos, NFB, JNFB,LGI, LGIP e JMV, sem adição de nitrogênio. Foram obtidos 304 isolados que foramclassificados morfologicamente como pertencentes às espécies Azospirillum amazonense,Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp.,além de um grupo não identificado. A diversidade genética dos isolados foi avaliada por meioda amplificação da região 16S DNAr por meio da reação da polimerase em cadeia (PCR) e dadigestão dos produtos de amplificação com enzimas de restrição (ARDRA). O perfil defragmentos de restrição confirmou o gênero da maioria dos isolados, além disso, mostrou altadiversidade, principalmente para os isolados bacterianos caracterizados morfologicamentecomo Burkholderia. Isolados representantes dos diferentes grupos foram testados emcondições gnotobióticas, em vasos e em campo, em diferentes variedades procedentes doMaranhão utilizando-se também duas cultivares como controle. Foi observado que entre osisolados testados, AR1122 de Herbaspirillum sp. e AR3122 de A. amazonense apresentarammaior potencial para promover o crescimento das plantas e aumentar a produção de grãos nacultura do arroz.

Palavras-chave: Fixação biológica de nitrogênio, diversidade microbiana, isolamento.

ABSTRACT

ARAÚJO, Antonio Edilson da Silva. Characterization and use of diazotrophic bacteriaisolated from different rice cultivars originated from Maranhão State. 2008. 93p. Thesis(Doctor in Fitotecny, Agrobiology). Instituto de Agronomia, Departamento de Fitotecnia,Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Several works have shown that rice crop can benefit from the association withdiazotrophic bacteria. However, the biological nitrogen fixation (BNF) in rice is dependent ofa complex interaction among the plants, microorganisms and the ecosystem. The generalobjective of this work was to evaluate the contribution of BNF in varieties of rice originatedfrom the State of Maranhão. The specific objectives were: a- To isolate and characterizenative diazotrophic bacteria originated from soil cultivated with rice in Maranhão; b- to selectthe most efficient bacteria in relation to dry matter accumulation and grain yield; c- to studythe relationship between FBN and the teor of proteins in the grains. For the isolation was usedtwo rice varieties (IR42 and Diamante) and two traditional rice varieties of Maranhão (ZebuBranco and Manteiga), grown in soil samples originated from three districts of Maranhão,being one of high lands (Bacabal) and two of lowland area (Arari and Vitoria do Mearim).Samples of roots, stems and leaves were grounded and inoculated in nitrogen free semisolidsemiselective media: NFB, JNFB, LGI, LGIP and JMV. Around 304 isolates were obtainedand classified as belonging to the species Azospirillum amazonense, Azospirillum lipoferumand Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. and Burkholderia spp and a non identifiedgroup that was clustered based only in the morphological characteristics. The genetic diversityof the isolates was evaluated through the amplification of 16S DNAr subunit using thePolymerize Chain Reaction (PCR) technique and digestion of the amplified products withrestriction enzymes (ARDRA). Restriction fragment profiles confirmed the identity of most ofthe isolated and showed high diversity mainly for the bacterial isolates characterized asBurkholderia. Isolates representative from the different groups were tested in gnotobioticconditions, in pots and in the field using different rice varieties originated from the MaranhãoState. Two other cultivars were used as controls. It was observed that among the isolatestested, the Azospirillum amazonense AR3122 and Herbaspirillum sp AR1122 howed potentialto promote growth of rice plants and to increase the grain yield of this crop.

Keys words: Biological nitrogen fixation, Microbial diversity, Isolation

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AIA Ácido indol acéticoARDRA Análise de Restrição da Região 16S DNAr AMplificadaARA Atividade da Redução de AcetilenoCNPAB Centro Nacional de Pesquisa em AgrobiologiaDNAr DNA ribossomaldNTPs Desoxinucleotídeos trifosfatadosFBN Fixação Biológica de NitrogênioNMP Número Mais Provávelnif Gene que codifica a nitrogenasePCR Reação em Cadeia da Plomeraser.p.m. Rotações por minutoTAE Tris, Acetato, EDTATE Tampão Tris, EDTA

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................... 11.1 Arroz: Importância Econômica ..................................................................................... 11.2 O Arroz no Estado do Maranhão ................................................................................... 21.3 Diversidade de Bactérias Diazotróficas Associadas às Plantas de Arroz ...................... 31.3.1 O gênero Azospirillum ................................................................................................ 41.3.2 O gênero Herbaspirillum ............................................................................................ 41.3.3 O gênero Burkholderia ............................................................................................... 51.4 Colonização e Estabelecimento Endofítico de Bactérias Diazotróficas em Arroz ........ 51.4.1 Colonização por Azospirillum spp. ............................................................................. 61.4.2 Colonização por Herbaspirillum spp. ......................................................................... 61.4.3 Colonização por Burkholderia spp. ............................................................................ 71.4.4 Colonização por Azoarcus spp. .................................................................................. 71.4.5 Colonização por Rizobium spp. .................................................................................. 81.5 Fixação Biológica de Nitrogênio Atmosférico (FBN) em Arroz .................................. 81.6 Fatores que Influenciam a Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura do Arroz ....... 81.7 Avaliação da Fixação Biológica de Nitrogênio ............................................................. 10

2 CAPÍTULO I. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS NATIVAS DO ESTADO DO MARANHÃO ............................. 132.1 Resumo .......................................................................................................................... 142.2 Abstract .......................................................................................................................... 152.3 Introdução ...................................................................................................................... 162.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 172.4.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas ..................................................... 172.4.2 Caracterização morfológica ........................................................................................ 182.4.3 Caracterização molecular ........................................................................................... 182.4.4 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) ...................................... 192.4.5 Produção de compostos indólicos .............................................................................. 192.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 202.5.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas em arroz ...................................... 202.5.2 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) de culturas bacterianas in vitro ........................................................................................................................ 232.5.3 Determinação da Produção de Ácido Indol-Acético (AIA) in vitro ........................... 232.5.4 Diversidade genética dos isolados .............................................................................. 242.5.4.1 Isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp. ................... 242.5.4.2 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum spp. ....................... 282.5.4.3 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum amazonense .......... 302.5.4.4 Isolados caracterizados morfologicamente como Burkholderia spp. ...................... 322.5.4.5 Isolados caracterizados morfologicamente como não identificados ....................... 362.6 Conclusões ..................................................................................................................... 39

3 CAPÍTULO II. AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INOCULAÇÃO D E BACTÉRIAS DIAZÓTROFICAS NA PRODUÇÃO DE GRÃOS EM DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ TRADICIONAIS ........................................................... 403.1 Resumo .......................................................................................................................... 413.2 Abstract .......................................................................................................................... 423.3 Introdução ...................................................................................................................... 43

3.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 443.4.1 Avaliação preliminar das variedades e cultivares utilizadas para seleção de estirpes ... 443.4.2 Seleção de estirpes em condições gnotobióticas ........................................................ 453.4.3 Seleção de estirpes em condições de vasos e em campo ............................................ 463.4.3.1 Experimento em vasos ............................................................................................. 463.4.3.2 Experimento em campo ........................................................................................... 473.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 483.5.1 Avaliação de características agronômicas das variedades e cultivares utilizadas para a seleção de estirpes .................................................................................................... 483.5.2 Avaliação e seleção de isolados de bactérias diazotróficas em associação com diferentes variedades de arroz crescidas em condições gnotobióticas ....................... 503.5.3 Experimento de arroz cultivado em vasos com terra e inoculado com isolados previamente selecionados ........................................................................................... 513.5.4 Avaliação do efeito da inoculação com bactérias diazotróficas em diferentes variedades de arroz cultivadas em condições de campo ............................................. 563.6 Conclusões ..................................................................................................................... 57

4 CAPÍTULO III. EFEITO DA INOCULAÇ ÃO COM BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS NA GERMINAÇÃO E VIGOR DE SEMENTES ARROZ ..... 584.1 Resumo .......................................................................................................................... 594.2 Abstract .......................................................................................................................... 604.3 Introdução ...................................................................................................................... 614.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 614.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 634.6 Conclusões ..................................................................................................................... 66

5. CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................................. 67

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 68

ANEXOS ............................................................................................................................. 80

1

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Arroz: Importância Econômica

O gênero Oryza, pertence à família Poaceae (gramineae) e engloba cerca de 23espécies. Duas formas silvestres são apontadas na literatura como precursoras do arrozcultivado: a espécie Oryza rufipogon, procedente da Ásia, originando a espécie Oryza sativa;e a espécie Oryza barthii (= Oryza breviligulata), derivada da África Ocidental, dando origemà espécie Oryza glaberrima. A espécie O. glaberrima caracteriza-se por não apresentarramificações na panícula, pericarpo vermelho e lígulas mais curtas. Já a espécie O. sativacaracteriza-se por apresentar ramificações secundárias nas panículas, espiguetas persistentesno pedicelo e lígulas com até 10 mm de comprimento (PEREIRA, 2002).

A espécie O. sativa, devido a sua grande aceitação como alimento se dispersou pelomundo todo, e é considerada uma espécie polifilética resultante do cruzamento de formasespontâneas variadas. Ao longo do tempo, foram surgindo inúmeros tipos geneticamentedivergentes que foram se adaptando às mais variadas condições agroecológicas. Atualmenteesta espécie encontra-se subdividida em três subespécies indica, japonica e javanica(PEREIRA, 2002).

O arroz (Oryza sativa L.) é o principal alimento para mais da metade da populaçãomundial (YOKOYAMA et al., 1999). É o segundo cereal mais consumido no mundo,atendendo a grande parte da necessidade protéica e calórica da população (DE DATTA et al.,1987). Atualmente, cerca de 90% do volume mundial deste cereal é produzido e consumidona Ásia. É considerado pela FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)como o alimento mais importante para a segurança alimentar do mundo, por ser uma culturamuito rústica e adaptada às mais diversas condições edafoclimáticas. É o único cereal quepode ser cultivado em solos inundados, sendo considerada a espécie com maior potencial deaumento de produção para o combate da fome no mundo. Além disso, contem um excelentebalanceamento nutricional, e pode fornecer 20% da energia e 15% das proteínas necessáriasao homem e se destaca pela sua fácil digestão.

O Brasil se destaca como o principal produtor de arroz entre os países ocidentais.Apesar das reduções de produção em algumas safras nos últimos anos, devido às adversidadesclimáticas, a produção brasileira de arroz vem apresentando uma tendência de crescimento,em função, principalmente, do constante incremento de produtividade (FAO, 2006). Deacordo com dados da CONAB (2008), na safra 2006/07, o arroz foi plantado emaproximadamente 2.976 milhões de hectares no país, produzindo cerca de 11,1 milhões detoneladas com uma produtividade média de 3.865 quilos por hectare.

Durante muitos anos o Brasil foi um país exportador de arroz, na década de 80 passoua importar pequenas quantidades e, a partir de 1990, se tornou um dos principais importadoresdeste cereal, importando principalmente do Uruguai e da Argentina, que responderam porcerca de 85 a 90% das importações brasileiras (EMBRAPA, 2007). Nos últimos anos, oconsumo brasileiro de arroz vem aumentando num ritmo bem inferior ao crescimento daprodução devido a uma gradual redução do consumo per capita do cereal, como conseqüênciade uma série de modificações nos padrões e hábitos de consumo de alimentos da populaçãobrasileira. No entanto, CASSUCE et al. (2006) estudando a oferta e a demanda de produtosagrícolas no Brasil e considerando três cenários econômicos entre 2008 e 2012, observaramque a demanda de arroz será maior que a oferta nesse período.

2

1.2 O Arroz no Estado do Maranhão

O arroz é uma das plantas cultivadas mais antigas do mundo, e sua história seconfunde com a própria trajetória humana. Originário do sudeste da Ásia foi, provavelmente,a primeira planta cultivada na Ásia. O arroz se dispersou pelo mundo inteiro. Foram,provavelmente, os portugueses que introduziram esse cereal na África Ocidental, e osespanhóis, os responsáveis pela sua disseminação nas Américas (EMBRAPA, 2007).

No Brasil, a história do arroz remonta a época do descobrimento, entretanto, naquelaépoca já ocorriam no país algumas espécies silvestres. No Maranhão, a introdução do arrozocorreu no século XVII. Entretanto não é possível se determinar com precisão o ano em que oarroz foi introduzido no Maranhão. Neste estado, o arroz vermelho foi a única variedadecultivada até 1766 quando foi substituída pelo arroz branco da Carolina. Entre os anos de1768 e 1777, o arroz era o único cereal exportado pelo Brasil, sendo o Maranhão o maiorprodutor colonial (PEREIRA, 2002). Até o final do século XIX, a produção de arroz noestado sofreu oscilações. A partir da primeira metade do século XX, houve uma elevação naprodução do arroz e em 1945 o Maranhão era o nono estado maior produtor (PEREIRA,2002). As regiões mais produtoras eram a Baixada Maranhense e na região de Bacabal, ondeo cultivo era realizado por pequenos produtores espalhados pelas inúmeras roças na região(CANEDO, 1993). De 1945 até 1982, a cultura do arroz experimentou um crescimentoconstante e atingiu seu ápice em 1982, com a expansão da fronteira agrícola do Estado pormeio da abertura de áreas agrícolas ao Sul. Nesta ocasião, o Maranhão foi o terceiro maiorprodutor, perdendo somente para o Rio Grande do Sul e para Goiás. Porém, a partir deste ano,as áreas tradicionais de cultivo de arroz nos vales dos principais rios, além da baixadamaranhense foram sendo substituídas pela pecuária bovina, passando a cultura do arroz aocupar áreas marginais (PEREIRA, 2002).

Há 20 anos, a produção de arroz no Maranhão vem diminuindo a uma taxa de 2,7% aoano (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001). Segundo dados da Compania Nacional deAbastecimento (CONAB), na safra 2006/07, com a segunda maior área plantada do país, oMaranhão ocupa a quarta posição entre os maiores produtores de arroz do país, atrás do RioGrande do Sul, Santa Catarina e Mato Grosso. A produtividade de arroz no Maranhão foisempre considerada muito baixa, atualmente em torno de 1.390 kg ha-1 (CONAB, 2008). Abaixa produtividade é atribuída ao fato do arroz ser produzido por pequenos agricultores,cujas propriedades rurais, cerca de 85%, têm menos de 100 hectares. 52% da produção éoriunda de lavouras destas propriedades que têm como característica um forte auto-abastecimento e baixo emprego de tecnologia, utilizando técnicas rudimentares de cultivo, achamada roça em toco, sem preparo do solo nem adubação (MENDEZ DEL VILLAR et al.,2001).

Os ecossistemas de cultivo de arroz no Brasil estão classificados em “de várzea” e “deterras altas”, os quais, se subdividem em: a) sistema irrigado por inundação; b) sistema comirrigação não controlada; c) sistema de várzea úmida; d) sistema de sequeiro tradicional; e, e)sistema de sequeiro sob irrigação suplementar por aspersão (GUIMARÃES e SANTANA,1999). Dentre estes sistemas, o sistema irrigado por inundação, predominante nos estados doRio Grande do Sul e Santa Catarina, respondem por 60% da produção nacional, embora nãoseja o que ocupa a maior área plantada no país. Por outro lado, o sistema de sequeirotradicional, caracterizado pela total dependência de água das chuvas, ocupa a maior áreaanualmente plantada com arroz no país, no entanto, tem menor expressão em termos devolume de produção (PEREIRA, 2002).

No Maranhão se encontram todos os sistemas de cultivo, no centro-norte predomina aroça no toco, sistema de sequeiro tradicional, que é praticado pela maioria dos pequenosprodutores. Na microrregião baixada maranhense, também se encontra, em menor escala, o

3

cultivo do arroz em sistema irrigado, possuindo associações de produtores que utilizam mão-de-obra familiar e também médios produtores. Os custos de produção mais elevados sãocompensados pela maior produtividade e preço de comercialização mais alto. A colheita émecanizada ou manual, dependendo da extensão da propiedade (MENDEZ DEL VILLAR etal., 2001).

Já no Sul do Maranhão, em algumas fazendas o sistema de produção se assemelhamais ao do Centro-Oeste do país. São extensas áreas plantadas, 80 a 3.500 ha, com usointensivo de tecnologia e macanização em todas as fases do cultivo e pós-colheita, tratores,implementos, colheitadeiras, secadores, variedades de maior aceitação pelo mercado e grandeutilização de insumos. A produção atende ao mercado local e, também é vendida para outrosestados (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001).

No Maranhão, as cultivares utilizadas variam segundo o tipo de cultivo. Os grandesprodutores utilizam cultivares com grãos do tipo longo que as mesmas cultivaresrecomendadas para o Centro Oeste que tem melhor aceitação pelo mercado consumidor eadquirem suas sementes no Mato Grosso e Goiás. Esses genótipos não são obrigatoriamenteadaptados às condições técnicas e nem às condições do mercado local, enquanto que ospequenos produtores geralmente utilizam as sementes produzidas na safra anterior.

Os pequenos produtores, que não utilizam mecanização, plantam variedades comunsda região que apresentam grãos redondos e curtos. Visando mudar o costume de reutilizar assementes do ano anterior, o governo do estado tem comprado variedades testadas pelapesquisa dos estados de Mato Grosso e Goiás. No entanto, essas cultivares se mostraraminadequadas às condições de cultivo, pois necessitam de fertilizantes que não são usados pelospequenos produtores o que resulta em rendimentos muito baixos. Além disso, as plantas demenor porte dificultam a colheita manual (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001). Em funçãodo costume do agricultor de guardar sua própria semente, no estado do Maranhão se encontrao maior número de variedades tradicionais de arroz do Brasil. Essas variedades, conservadaspelo agricultor tradicional, geração após geração, representam um patrimônio genético deimportância fundamental para o futuro do melhoramento da cultura do arroz(FONSECA et al., 1982).

1.3 Diversidade de Bactérias Diazotróficas Associadas às Plantas de Arroz

Uma diversa comunidade de bactérias fixadoras de nitrogênio tem sido isolada deplantas de arroz, principalmente, àquelas pertencentes aos gêneros Azospirillum,Herbaspirillum e Burkholderia (BALDANI e DOBEREINER, 1980; BALDANI et al., 1986,2000; ENGELHARD et al., 2000). Outros gêneros bacterianos, embora menos comuns, têmsido constatados em associação com plantas de arroz tais como Clostridium (KENNEDY eTCHAN, 1992), Azotobacter (KAMUNGO et al., 1997), Azoarcus, Klebsiella, Sphingomonase Azorhizobium (ENGELHARD et al., 2000), Corynebacterium flavescens e Bacillus pumilus(BACILIO-JIMÉNEZ et al., 2001), Serratia marcescens (GYANESHWAR et al., 2001) eGluconacetobacter diazotrophicus (MUTHUKUMARASAMY et al., 2005).

As bactérias que colonizam plantas não leguminosas podem ser divididas em trêsgrupos: bactérias de rizosfera e de vida livre, que inclui todos os microrganismos quecolonizam as raízes superficialmente, tais como, Azotobacter, Beijerinckia, Derxia ePaenebacillus; bactérias associativas, capazes de colonizar as raízes externa e internamenteque são as do gênero Azospirillum; e, bactérias endofíticas, que colonizam o interior dostecidos das raízes e da parte aérea e que não causam prejuízo visível nas plantas que são,Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Azoarcus e Burkholderia (BALDANI et al., 1997). Emgeral a diversidade de bactérias encontrada na superfície e no interior das raízes de arroz émaior do que aquela do não rizosférico devido a uma variedade de compostos orgânicos

4

liberados pelas raízes que podem ser utilizados como fonte de energia e carbono(MUTHUKUMARASAMY et al., 2007).

Nos sistemas agrícolas, as bactérias de vida livre são limitadas pela disponibilidade defontes de carbono no solo. MUTHUKUMARASAMY et al. (2007) observaram que aaplicação continua de matéria organica em solo cultivado com arroz, aumenta a população debactéias diazotróficas no solo, além de reduzir o efeito inibitório da aplicação de altas dosesde nitrogênio no solo na população destas bactérias. Acredita-se que bactérias diazotróficasendofíticas por não sofrerem limitação de substâncias ricas em carbono, estarem livres decompetição com outros microrganismos e poderem transferir mais eficientemente oscompostos nitrogenados produzidos, possam ser responsáveis por disponibilizar umaquantidade significativa de nitrogênio fixado para a planta (BALDANI et al., 2002). Aassociação de bactérias endofíticas com arroz e não espécifaca e a dentro dos tecidos vegetal ébaixa (MALARVIZHI e LADHA, 1999). Dentre essas bactérias as mais estudadas para acultura de arroz são Azospirillum spp., Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp.

1.3.1 O gênero Azospirillum

Bactérias do gênero Azospirillum são heterotróficas capazes de fixar nitrogênioatmosférico. Dentre as bactérias diazotróficas as do gênero Azospirillum são as maisestudadas, as espécies desse gênero são do tipo bastonete móvel, aeróbicas heterotróficas quefixam nitrogênio em condições microaerofílicas (KENNEDY et al., 2004). Nove espéciesestão atualmente descritas: Azospirillum largimobile, Azospirillum lipoferum, Azospirillumbrasilense, Azospirillum amazonense, Azospirillum halopraeferans, Azospirillum irakense,Azospirillum doebereinerae, Azospirillum oryzae, Azospirillum melinis, Azospirillumcanadense (DÖBEREINER et al., 1995; XIE e YOKOTA, 2005; PENG et al., 2006;MEHNAZ et al., 2007). São usualmente consideradas rizosféricas, colonizandopredominantemente a superfície das raízes, sendo que algumas estirpes são capazes deinfectar e colonizar o interior dos tecidos de muitos cereais (BALDANI et al., 1997). Adistribuição ecológica de Azospirillum spp. é ampla podendo ser encontrada colonizandoplantas em todo o mundo, tanto em clima tropical quanto em clima temperado (PATRIQUINet al., 1983).

Bactérias pertencentes ao gênero Azospirillum apresentam motilidade e quimiotaxiapara ácidos orgânicos, açúcares, aminoácidos e compostos aromáticos bem como paraexudados de raízes, o que torna essas bactérias capazes de se mover para condições favoráveisde nutrientes na rizosfera da planta, onde se beneficiam dos exudados da planta como fonte decarbono e energia para multiplicação e colonização da planta (STEENHOUDT eVANDERLEYDEN, 2000). Dentre as espécies de Azospirillum, A. lipoferum, e A. brasilensesão as mais estudadas, e as que têm sido isoladas da raiz e da parte aérea de plantas de arroz(JAMES, 2000).

1.3.2 O gênero Herbaspirillum

Bactérias do gênero Herbaspirillum são bastonetes curvos, gram negativas, em formade espiral, geralmente vibróides, algumas vezes helicoidais. Em placas de meio JNFB ascolônias são inicialmente pequenas e brancas, tornando-se azulada no centro após umasemana de incubação. Membro da subdivisão β das Proteobactérias, estes organismos sãoaeróbios, não fermentam açúcares e fixam nitrogênio em condições microaerofílicas e foramprimeiramente isoladas de milho, arroz e sorgo (BALDANI et al., 1986). Posteriormenteforam também isoladas de outras gramíneas (OLIVARES et al. 1996, JAMES, 2000) e deplantas não leguminosas, como abacaxizeiros e bananeiras (CRUZ et al., 2001). Bactérias do

5

gênero Herbaspirillum apresentam baixa capacidade de sobrevivência no solo, não podendoser re-isoladas do solo após 30 dias, confirmando sua natureza endofítica, no entanto, podempermanecer no solo em um estado de latência, não podendo ser cultivadas em meio de cultura(OLIVARES et al., 1996). Este gênero possui nove espécies descritas, sendo que, apenas H.seropedicae, H. rubrisubalbicans e H. frisingense fixam nitrogênio em associação complantas não leguminosas.

1.3.3 O gênero Burkholderia

O gênero Burkholderia compreende mais de 50 espécies, sendo que poucas delas sãocapazes de fixar nitrogênio como Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kururiensis,Burkholderia tuberum, Burkholderia phynatum, Burkholderia tropica, Burkholderia unamae,Burkholderia xenovorans, Burkholderia phytofirmans e Burkholderia terrae (ESTRADA-DELOS SANTOS et al., 2001; VANDAMME et al., 2002; REIS JUNIOR et al., 2004). O gêneroBurkholderia apresenta características endofíticas, apresenta ampla distribuição geográfica ecoloniza diversas plantas como arroz, cana-de-açúcar, sorgo, milho, trigo. B. vietnamiensis,foi isolada da rizosfera de raízes de plantas de arroz cultivadas no Vietnã e é, provavelmente,a espécie predominante entre as espécies de Burkholderia em arroz. RODRIGUES et al.(2006) observaram maior número de bactérias diazotróficas endofíticas, do gêneroBurkholderia do que do gênero Herbaspirillum isoladas de duas variedades de arroz, IR42 eIAC4440, sendo que a B. vietnamiensis foi a espécie predominante.

1.4 Colonização e Estabelecimento Endofítico de Bactérias Diazotróficas em Arroz

A infecção das raízes por bactérias diazotróficas é uma condição essencial para oestabelecimento de uma associação eficiente entre as bactérias e as plantas hospedeiras.Conhecimentos básicos em colonização das raízes pelos microrganismos são importantes paramanipular a microflora da raiz com o objetivo de obter benefícios para a cultura, já que estesbenefícios dependem de uma colonização efetiva, infecção e estabelecimento das bactériasnos tecidos das plantas e expressão de genes (JAMES et al., 2002; RONCATO-MACCARI etal., 2003b).

Bactérias diazotróficas têm a capacidade de infectar e colonizar plantas de arroz e seestabelecer nos espaços intercelures do córtex, xilema e aerênquima(KENNEDY et al., 2004). A infecção e colonização das plantas é um processo dinâmico queenvolve a movimentação das bactérias em direção a planta hospedeira, sua adesão à superfíciedas plantas e posterior penetração e multiplicação no seu interior (STEENHOUDT eVANDERLEYDEN, 2000).

A movimentação dos microrganismos em direção às raízes ocorre quando existe umreconhecimento químico, quimiotaxia. Inicialmente ocorre uma adsorção reversível, e emseguida uma ancoramento irreversível, controlado por proteínas extracelulares de origembacteriana. Esta etapa é comandada por sinais moleculares emitidos pelas raízes da plantahospedeira, e a sobrevivência do microrganismo depende de fatores bióticos e abióticos(DOBBELAERE et al., 2003).

Progressos consideráveis foram alcançados nos últimos anos, no sentido de determinarcomo as bactérias diazotróficas invadem os tecidos das plantas. Porém, os exatos mecanismoscomo estas bactérias interagem com as plantas ainda não são completamente entendidos, poisbactérias diazotróficas não simbiônticas apresentam uma grande diversidade genética, o quereflete em uma larga gama de habitats onde elas podem ser encontradas. Além disso,apresentam mecanismos específicos de interação com as plantas, o que limita o conhecimentodestas interações principalmente em função da dificuldade em estudar um grande número de

6

estirpes interagindo com diversos genótipos de plantas (JAMES, 2000; KENNEDY et al.,2004). Os possíveis sítios de infecção por bactérias diazotróficas em plantas de arroz são pormeio de feridas na epiderme devido a abrazão com o solo durante o crescimento radicular, porfissuras causadas durante a emergência das raízes laterais, entre os pelos radiculares e ascélulas da epiderme e processos enzimáticos envolvendo degradação das paredes celulares(BALDANI, 1996; STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000; BACILIO-JIMÉNEZ et al.,2001).

1.4.1 Colonização por Azospirillum spp.

O processo de colonização inicia-se pelo ancoramento das bactérias a superfície dasplantas por meio de um material fibrilar. Os sítios primários de colonização são os pontos deemergência das raízes laterais e a zona de formação de pelos radiculares (BACILIO-JIMÉNEZ et al., 2001), ocorrendo a formação de pequenos agregados de células bacterianasna superfície destes pontos.

Azospirillum spp. tem sido considerada uma bactéria que coloniza principalmente arizosfera (STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000). No entanto, pode colonizar osespaços intercelulares das células da epiderme e do córtex radicular, parênquima, aerênquima,o sistema vascular e interior dos pêlos radiculares (ZHU et al., 2002; FENG et al., 2004). Acolonização de plantas por Azospirillum é um processo dependente da estirpe e da plantahospedeira (BACILIO-JIMÉNEZ et al., 2001; MOSTAJERAN et al., 2007). Utilizando afusão de genes que codificam proteína verde fluorescente (gfp) para visualizar a colonizaçãode raízes de arroz por A. irakense e A. brasilense, ZHU et al. (2002) observaram que estasduas espécies diferem quanto a modo de colonização de raízes de arroz, durante os primeirosestágios da associação planta bactéria, a colonização por A. irakense é muito mais rápida doque por A. brasilense. Em trigo, foi constatado que a Sp7 de A. brasilense, fica restrita àsuperfície das raízes enquanto que a estirpe Sp245 coloniza o interior das raízes(ROTHBALLER et al., 2003).

MOSTAJERAN et al. (2007) observaram que a parede celular exerce uma funçãoimportante na interação da planta com a bactéria e que o processo de infecção e colonizaçãode plantas de trigo por A. brasilense pode envolver enzimas que degradam polímemos daparede celular. Após a infecção e colonização das raízes de arroz, A. brasilense migram para abainha das folhas e para as folhas, provavelmente pelo espaço intercelular e pelo sistemavascular de modo silmultâneo conforme relatado por FENG et al. (2004).

1.4.2 Colonização por Herbaspirillum spp.

A colonização de plantas de arroz por Herbaspirillum spp. ocorre através da adesão dabactéria à superfície da planta, seguida de proliferação nos pontos de emergência das raízessecundárias e ferimentos na superfície da raiz causados devido a abrazão com o solo durante ocrescimento radicular. Uma vez no interior da planta, os microrganismos colonizaminicialmente as células da epiderme onde as bactérias se multiplicam e entram pelos espaçosintercelulares colonizando a raiz e os tecidos da parte aérea (BALDANI et al., 1997;RONCATO-MACCARI et al., 2003b). Quanto ao estabelecimento endofítico, estas bactériasse localizam principalmente nos espaços intercelulares, nas células mortas, nas vesículas doxilema e no aerênquima (JAMES et al., 2002).

BALDANI (1996) utilizando as técnicas de microscopia ótica e eletrônica observouHerbaspirillum spp. colonizando os espaços intercelulares das raízes de arroz, localizando-seprincipalmente nos espaços intercelulares da camada de células, imediatamente abaixo daepiderme e raramente presente no interior das células do córtex. Já ELBELTAGY et al.

7

(2001) observaram que esta bactéria não coloniza a raiz e, sim a parte aérea da plantahospedeira, colonizando preferencialmente o apoplasto dos tecidos da parte aérea das plantase não entra nos tecidos vasculares. Segundo RONCATO-MACCARI et al. (2003b) acolonização de plantas de arroz por H. seropedicae ocorre em três estágios. No primeiro, asbactérias colonizam a superfície das raízes, o segundo caracteriza-se pela infecção do tecidocortical e o terceiro pela colonização do tecido vascular. No entanto, a habilidade de infectar ecolonizar plantas de arroz não é um processo universal para todas as estirpes deHerbaspirillum spp., depende da estipe e do genótipo da planta (JAMES et al., 2002).

JAMES et al. (2002) estudando a infecção e colonização de duas variedades de arroz,IR42 e IR72, com H. seropedicae estipe ZAE67, observaram que esta bactéria se multiplicana zona de emergência das raízes laterais e depois se movem para os tecidos mais internos,colonizando rapidamente o espaço intercelular, aerênquima e xilema da raiz e da parte aéreadas duas cultivares. Herbaspirillum coloniza tecidos jovens, antes da diferenciação, sugerindoque esta bactéria aparece na parte área das plantas pelo espaço intercelular e que a motilidadee a produção de pectinases e celulases poderá esta envolvida neste processo de distribuiçãodas bactérias pelos tecidos da planta (ELBELTAGY et al., 2001). Não há diferença entre asestirpes as Nif + e Nif – de H. seropedicae quanto à habilidade de infeção e colonização deplântulas de arroz, havendo similaridade no tamanho da população das duas estirpes nostercidos da planta, indicando que a colonização não é essencial para a fixação biológica denitrogênio (RONCATO-MACCARI et al., 2003a).

1.4.3 Colonização por Burkholderia spp.

A distribuição ecológica deste gênero tem sido muito estudada. No entanto, poucosestudos foram realizados no sentido de entender o processo de infecção e colonização deplantas por estas bactérias. Resultados preliminares indicam que o processo de infecção ecolonização das plantas de arroz por estirpes de Burkholderia ocorre primeiramente pelacolonização da superfície da raiz e em seguida entra nas células pelos espaços intercelularesatravés de fendas na epiderme, particularmente nas pontas de emergência de raiz secundária(BALDANI et al. 1997). A estirpe M209 de B. brasilensis também infecta os estômatos dosfolíolos de plântulas de arroz (SILVA et al., 2000).

1.4.4 Colonização por Azoarcus spp.

Até recentemente, as bactérias do gênero Azoarcus tinham sido isoladas somente dasraízes e base do colmo da espécie Kallar grass (Leptochloa fusca) em solos salinos noPaquistão (REINHOLD-HUREK e HUREK, 1998). Entretanto, estudos em condiçõesgnotobióticas, mostraram que esta bactéria coloniza também plantas de arroz (HUREK et al.,1994; REINHOLD-HUREK e HUREK, 1998). Azoarcus spp. expressa dois tipos de enzimasceluloliticas (exo e endo glucanase) e estas enzimas podem estar envolvidas no processo deinfecção e colonização em raízes de K. grass (REINHOLD-HUREK et al., 1993).

A infecção em K. grass e arroz ocorre pela ponta das raízes e nos pontos deemergência das raízes laterais, entrando no xilema. Este processo de infecção éprovavelmente um processo ativo que envolve atividade de enzimas que degradam ospolímeros da parede celular, sendo que, dois tipos de enzimas celulolíticas foram detectadasem Azoarcus (REINHOLD-HUREK et al., 1993). Quanto ao estabelecimento endofítico, estabactéria se localiza principalmente no parênquima e nas vesículas do xilema (HUREK eREINHOLD-HUREK, 2003). A descoberta de Azoarcus spp. em células do parênquima evesículas do xilema, em K. grass e arroz, sugere que a dispersão desta bactéria no interior dasplantas ocorre provavelmente pelo sistema vascular (HUREK et al., 1994).

8

1.4.5 Colonização por Rizobium spp.

Foi observado que Rhizobium leguminosaram bv trifolli desenvolve uma associaçãonatural com plantas de arroz em campos de produção deste cereal no delta do Nilo no Egito.No Oeste da África, Bradyrhizobium spp. tem sido encontrado colonizando plantas de arrozirrigado (CHAINTREUIL et al., 2000) e Azorhizobium caulinodans também foi isolado deraízes de arroz (ENGELHARD et al., 2000). SINGH et al. (2006) mostraram que estirpes derizóbio infectam e colonizam os espaços intercelulares de raiz de arroz usando uma fusãogusA como gene repórter. A infecção das raízes de arroz ocorre por ferimentos na raiz e porfissuras criadas durante a emergência de raízes laterais, é independente de fatores Nod, nãoespecífica, embora exista diferença na interação entre as estirpes com as plantas, e nãoenvolve a formação do cordão de infecção (REDDY et al., 1997). Também, WALKER et al.(2007) observaram que estirpes de Rhyzobium spp. infectam raízes de arroz via pêlosradiculares, zona de emergência das raízes laterais e colonizam extensamente raízes.

1.5 Fixação Biológica de Nitrogênio Atmosférico (FBN) em Arroz

Diversos trabalhos têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiar daassociação com bactérias diazotróficas, obtendo significativa contribuição do nitrogêniofixado biologicamente (SHRESTHA e LADHA, 1996; BALDANI et al., 2000). No entanto,para JAMES (2000) é impossível dizer com certeza se os efeitos observados com a inoculaçãode uma bactéria diazotrófica em arroz são devido à fixação ou a outro fator. Como efeitoshormonais, aumentando a capacidade da planta de extrair N do solo em função do aumento dosistema radicular, e/ou em função de alteração no metabolismo da planta pela atividade daenzima nitrato redutase da bactéria.

RONCATO-MACCARI et al. (2003a) estudando a contribuição da fixação denitrogênio para o crescimento de plântulas de arroz, 30 dias após a inoculação com H.seropedicae com estirpes Nif + e Nif –, observaram aumento similar na produção de biomassada parte aérea e da raiz das plântulas inoculadas com ambas as estirpes. Assim, os autoressugeriram que os efeitos observados com a inoculação de bactérias diazotróficas nocrescimento de plantas podem ser parcialmente independentes da fixação biológica denitrogênio (FBN), envolvendo outros fatores de promoção de crescimento de plantas.

Os exatos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento de plantas não sãobem conhecidos. No entanto, acredita-se que em sistemas naturais podem ocorrer tantomecanismos de ação direta quanto indireta. Como exemplo dos primeiros, pode-se citar aFBN, produção de substâncias promotoras do crescimento de plantas e solubilização defosfatos. Já para os de ação indireta tem sido sugerido a indução de resistência sistêmica,produção de sideróforos, diminuição de fatores de estresse e antagonismo a fitopatógenos sejapor competição por nutrientes ou exclusão por nicho ecológico quando estes microganismopossuem mecanismos comuns para infecção dos tecidos vegetais (CHEN et al., 1995;OLIVEIRA et al., 2003).

1.6 Fatores que Influenciam a Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura do Arroz

Nos ecossistemas naturais ocorrem diversas bactérias fixadoras de nitrogênio (N2),desde as de vida livre no solo, àquelas de rizosfera, como também as consideradas bactériasendofíticas, que colonizam o interior dos tecidos das plantas, em associação com uma vastagama de plantas não leguminosas (BALDANI e BALDANI, 2005). Dentre estas, acredita-seque as bactérias endofíticas possuam maior potencial para a FBN devido a habilidade de selocalizarem em espaços inter e intra-celulares, ocupando nichos onde há menor influência de

9

fatores ambientais, menor competição com outros microrganismos por compostos orgânicos ecom baixa difusão de oxigênio (BALDANI et al., 1997). O incremento na produção de grãos,devido à fixação biológica de nitrogênio em arroz, é sensível a fatores químicos, biológicos eambientais, ou seja, é dependente de uma interação complexa entre as plantas, osmicrorganismos e o ecossistema (RAO et al., 1998). Assim o conhecimento do genótipo daplanta e do microrganismo envolvido na promoção de crescimento vegetal é de extremaimportância, além da interação com a comunidade microbiana do solo.

Em arroz, é comum se observar diferença na FBN entre os genótipos avaliados(SHRESTHA e LADHA, 1996; BALDANI et al., 2000), sugerindo que a associação entre asplantas e as bactérias fixadoras é controlada pelas plantas. Também, RETHATI et al. (2000)estudando a associação de cultivares de arroz com A. brasilense e H. seropedicae observaramque a inoculação de ambas as bactérias aumentou a massa das raízes das plantas e que esteefeito benéfico é altamente dependente da cultivar. MEHNAZ et al. (2001) quantificando afixação biológica de nitrogênio por meio da técnica de diluição isotópica do 15N em duasvariedades de arroz inoculadas com diferentes estirpes de duas espécies de bactérias,observaram que houve interação entre as variedades e as bactérias inoculadas.

A forma de inoculação de bactérias diazotróficas em arroz pode influenciar osresultados obtidos, no entanto, poucos trabalhos têm sido realizados no sentido de aprimorar oprocesso de inoculação. Inoculação é a uma técnica que consiste em colocar as sementes ou asplântulas em contato com as bactérias e inoculante é o veículo que contém estas bactérias. Oveículo mais utilizado é a turfa, mas inoculante líquido também tem sido estudadoprincipalmente para inoculação em plântulas.

Segundo ISLAM e BORA (1998) Azospirillum pode ser inoculado por três métodos:a) imersão das sementes em suspensão bacteriana por alguns minutos, seguida por secagem àsombra por duas a quatro horas; b) mergulhar as raízes de plântulas de arroz em suspensãobacteriana por alguns minutos antes do transplantio e c) aplicar a suspensão bacteriana narizosfera das plantas. O envolvimento das sementes com turfa também é uma forma deinoculação utilizada para bactérias diazotróficas em arroz (FEREIRA et al., 2003,GUIMARÃES et al., 2003).

FEREIRA et al. (2003), selecionando veículos para preparo de inoculante combactérias diazotróficas, observaram que o caldo bacteriano mantém por pouco tempo asobrevivência das células, o inoculante oleoso dificulta a germinação das sementes, sendo queo mais promissor é a turfa. Outras formas de inoculação utilizadas são a inoculação deplântula em meio de cultura (BALDANI et al. 2000, RONCATO-MACCARI et al., 2003a).

A forma de infecção e colonização das plantas pelas bactérias diazotróficas tambéminfluencia os benefícios que a planta pode ter desta associação. Quando a infecção ocorre deforma mais agressiva, estimula uma resposta de defesa da planta a esta invasão, tendo reflexosnegativos no crescimento das plantas. JAMES et al. (2002) estudando a infecção ecolonização de duas variedades de arroz com H. seropedicae estirpe ZAE67, observaram queesta bactéria entra por ferimentos na zona de emergência das raízes laterais e colonizarapidamente o espaço intercelular. Os autores observaram diferença no grau de infecção. Nacultivar IR72 o processo de invasão envolveu um grande número de bactérias colonizando azona de emergência das raízes secundárias, já na cultivar IR42 a invasão foi menos agressiva.A colonização agressiva, na cultivar IR72 provocou uma resposta defensiva da planta.

STOLTZFUS et al. (1997) observaram que entre isolados endofitícos, inoculados emplantas de arroz, certos isolados se apresentaram colonizando as plantas de forma maisagressiva, sendo que, esta colonização agressiva teve como conseqüência o retardamento docrescimento das plantas. Também RETHATI et al. (2000), observaram em cultivares de arroz,inoculadas com A. brasilense e H. seropedicae que o efeito benéfico da inoculação com estasbactérias estava associado a um número pequeno de bactérias nos tecidos das plantas. Embora

10

uma alta colonização de A. brasilense tenha sido bem tolerada pelas plantas, uma invasãodrástica de H. seropedicae provocou efeito adverso no crescimento das plantas.

A diferença entre os genótipos em relação ao nitrogênio derivado da fixação biológicapode ser mais evidente em condições de baixo teor de nitrogênio no solo. PRADHAN eMOHAN (1998), observaram que inoculação de plantas de arroz com A. brasilense, quandose utilizou metade da dose recomendada de nitrogênio para essa cultura, proporcionouaumento no vigor das plantas, avaliado aos 30 e 60 dias após a semeadura, assim como,aumento na produção de matéria seca e na produção de grãos. NIEUWENHOVE et al. (2001),estudaram o efeito da inoculação de plantas de arroz com A. caulinodans, em combinaçãocom diferentes níveis de sacarose e nitrogênio, em condições de casa de vegetação. Os autoresobservaram, pela técnica de diluição isotópica de 15N, que houve incorporação de N fixado àbiomassa das plantas inoculadas com A. caulinodans, reduzindo-se o nitrogênio derivado dofertilizante, em condições de baixo nível de nitrogênio (20 kg ha-1) e que, nesta condição, aperda de nitrogênio foi menor que em condições de alto nível de nitrogênio (60 kg ha-1). Osautores concluíram que a aplicação de 60 kg ha-1 de nitrogênio afeta negativamente aatividade da nitrogenase de A. caulinodans em associação com plantas de arroz.

A eficiência da fixação de N2 pela associação de bactérias diazotróficas com arrozpode ser limitada quando há baixa disponibilidade de matéria orgânica no solo, pois a matériaorgânica pode ser fonte de carbono e energia tanto para fixação de N pela microflora derizosfera quanto para outras atividades metabólicas. Estes efeitos são mais pronunciados emsolos inundados que em solos não inundados. LADHA et al. (1987) observaram que aaplicação de palha de arroz antes do plantio aumentou a massa microbiana do solo e, também,a de bactérias diazotróficas no solo. Já a aplicação de 50% da dose recomendada de nitrogêniona forma de vermicomposto e 50% na forma de fertilizante mais a inoculação comAzospirillum e fosfobactérias, aumentou o número de perfilhos, o número de panículas e aprodução em arroz comparado com aplicação de 100% da dose recomendada de nitrogênio naforma de fertilizante mineral (JEYABAL e KUPPUSWAMY, 2001;MUTHUKUMARASAMY et al., 2007).

O arroz é cultivado sob dois sistemas de cultivo: de sequeiro e irrigado, sendo quediferentes sistemas de cultivos têm potenciais distintos para suprir a necessidade de nitrogêniodas plantas. Em arroz de sequeiro, a fixação ocorre em bactérias aeróbicas, já em arrozirrigado, a fixação ocorre tanto em bactérias aeróbicas quanto anaeróbicas e em geral maiorescontribuições de FBN são obtidas em arroz irrigado, onde as condições ecológicas favoráveisà biota aquática favorecem também os microrganismos fixadores de nitrogênio de vida livre(OLIVEIRA, 1992).

1.7 Avaliação da Fixação Biológica de Nitrogênio

A quantificação de nitrogênio fixado biologicamente em gramíneas é fundamentalpara que se possa determinar o benefício global deste processo para os sistemas agrícolas. Noentanto, os resultados, são muito variáveis em função de diferenças metodológicas, e dadependência do genótipo da planta e das condições ambientais em que são realizados,(JAMES, 2000). Além disso, a correlação dos resultados obtidos com a população debactérias é limitada, pois é impossível se atribuir à fixação biológica a uma única espécie debactéria e, ainda, a simples presença da bactéria colonizando os tecidos da planta não significaque esta esteja fixando nitrogênio e, nem que a planta esteja se beneficiando do nitrogêniofixado (BODDEY et al., 1995).

A inconsistência dos resultados dos experimentos, tanto em condições gnotobióticas,quanto em casa de vegetação e em campo, é um grande problema para pesquisa com bactériasdiazotróficas e tem limitado o uso destas bactérias. O método de inoculação e as interações

11

entre o genótipo vegetal e da bactéria pode contribuir para o insucesso dos resultados. REISJUNIOR et al. (2006) observaram que a interação entre A. amazonense e genótipos debraquiária é dependente da estirpe. Para se obter sucesso com a inoculação é necessário que abactéria inoculada se estabeleça nas plantas e que não perca a capacidade competiva emrelação à comunidade nativa. Baixo pH, déficit hídrico e alta temperatura diminuem acolonização influenciando os resultados (DOBBELAERE et al., 2003). SALA et al. (2007)observaram efeito da inoculação de sementes de trigo com bactérias diazotróficas emCampinas, mas não em Mococa, SP, trabalhando com as mesmas estirpes e cultivar. NaTabela 1 apresenta-se, resumidos, os resultados de trabalhos de inoculação com bactériasdiazotróficas em plantas de arroz realizados nos últimos anos.

Tabela 1. Resposta de plantas de arroz à inoculação com bactérias diazotróficas em váriascondições experimentais (continua).

Espécies de bactériasCondições

experimentaisEfeito observado Referência

Azospirillum lipoferum,Azospirillum brasilense,Azospirillum amazonensee Herbaspirillum seropedicae

CampoNão houve efeito no crescimentonem na produção de grãos

PEREIRA et al. (1988)

Pseudomonasfluorescentes

Campo e em casa devegetação

Aumento na emergência dasplântulas, comprimento das raízese altura e biomassa das plantas ena produção de grãos.

DILEEP et al. (1998)

Azospirillum brasilense Campo e casa devegetação

Aumento no vigor, na produçãode biomassa, e produção de grãos.

PRADHAN e MOHAN(1998)

Azospirillum spp.Casa de vegetação,inundado, por 45 dias

Aumento na biomassa das raízes eda parte aérea e na extração de N

GUNARTO et al.(1999)

Rhodobacter capsulatus VasosAumento na biomassa, o numerode perfilhos e produção de grãos.

ELBADRY et al. (1999)

Nostoc muscorum eTolypothhrix tenuis

Casa de vegetação por25 dias

Aumento na biomassa, das raízese no comprimento das plantas.

MULÉ et al. (1999)

Azospirillum brasilense Casa de vegetação

Aumento na altura das plantasavaliadas até a fase de iniciaçãodas panículas, aumento nabiomassa da parte aérea e naprodução de grãos.

VALAZCO e CASTRO(1999)

Herbaspirillumseropedicae eBurkholderia

Casa de vegetação eem condiçõesgnotobióticas

Aumento na biomassa e nonitrogênio derivado da fixaçãobiológica (Ndfa)

BALDANI et al. (2000)

Azospirillum brasilense eHerbaspirillumseropedicae

Casa de vegetação por28 dias

A inoculação com Azospirillumbrasilense aumentou a biomassadas raízes e da parte aérea dasplantas, já com Herbaspirillumseropedicae o efeito foi negativo

RETHATI et al. (2000)

Azorhizobiumcaulinodans

Condições de casa A inoculação aumentou abiomassa das plantas, o númerode perfilhos e a incorporação deN2 fixado na biomassa, avaliadopela técnica de diluição isotópicado 15N

NIEUWENHOVE et al.(2001)

12

Tabela 1. Continuação

Herbaspirillumseropedicae

Condiçõesgnotobióticas

Aumento na atividade danitrogenase incorporação Ndfaapós incubação com 15N2 emplantas de Oryza officinalis

ELBELTAGY et al.(2001)

Azospirillum brasilense Condiçõesgnotobióticas emsolução de Hongland,por 15 dias

Inibição do crescimento dasplantas, diminuindo a altura dasplantas

BACILIO-JIMÉNEZ etal. (2001)

Espécies de bactériasCondições

experimentaisEfeito observado Referência

Azospirillum brasilense,Aeromonas eEnterobacter

Condiçõesgnotobióticas, por oitosemanas

Todas as bactérias promoveramaumento a área das raízes e oNdfa avaliado pela técnicaisotópica 15N

MEHNAZ et al. (2001)

Herbaspirillumseropedicae

Condiçõesgnotobióticas

Aumento na atividade danitrogenase aos 10 dias após ainoculação e da massa seca dascultivares IR42 e IR72 e somentea cultivar IR42 apresentouincorporação significativa deNdfa após incubação com 15N2

JAMES et al. (2002)

Herbaspirillumseropedicae

Condiçõesgnotobióticas por 30dias

Aumento na biomassa, naatividade da nitrogenase e naincorporação de 15N2

GYANESHWAR et al.(2001)

Azospirillum sp. eAzotobacter

Casa de vegetação ecampo

A inoculação com ambas asbactérias aumentou a atividade danitrogenase (ARA) nas raízes dasplantas inoculadas

DAS e SAHA (2003)

Herbaspirillumseropedicae

Condiçõesgnotobióticas

Aumento na massa das raízesquando houve limitação denitrogênio

RONCATO-MACCARIet al. (2003a)

Burkholderia brasilensise Herbaspirillumseropedicae

Condiçõesgnotobióticas, em casade vegetação e campo

Em condições gnotobióticas,houve aumento na biomassa davariedade IAC 4440 e emcondições de campo houveaumento na produção de grãosdas duas variedades testadas

FERREIRA et al.(2003)

Burkholderiabrasilensis,Herbaspirillumseropedicae eHerbaspirillumrubrisubalbicans

Casa de vegetação ecampo

Em casa de vegetação houveaumento na biomassa das plantasna avaliação realizada aos 40 diasapós o transplantio. Já em campohouve aumento na biomassa dasplantas aos 40, 45 e 130 dias apóstransplantio, e também houveaumento na produção de grãos

GUIMARÃES et al.(2003)

Azospirillumamazonense

Condiçõesgnotobióticas e casade vegetação

Em condições gmotobióticashouve efeito negativo,diminuindo a biomassa dasplântulas, em casa de vegetaçãohouve efeito positivo e negativodependendo da estirpe inoculada

RODRIGUES et al.(2007)

13

2 CAPÍTULO I

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFI CASNATIVAS DO ESTADO DO MARANHÃO

14

2.1 Resumo

Com o aumento dos custos dos fertilizantes nitrogenados e a crescente preocupaçãocom danos ambientais decorrentes do uso dos mesmos, o desenvolvimento de associaçõesentre bactérias diazotróficas e genótipos de arroz mais eficientes quanto à fixação biológica denitrogênio (FBN) pode ser uma alternativa para a redução de custos de produção e deimpactos ambientais causados por esta cultura. O objetivo deste trabalho foi isolar ecaracterizar bactérias diazotróficas nativas do estado do Maranhão com potencial parainoculação em variedades tradicionais de arroz da própria região. Foram coletadas amostrasem três solos cultivados com arroz no Maranhão, sendo dois de baixada e um de teras altas.Para o isolamento destas bactérias diazotróficas foram utilizadas três variedades de arroz e acultivar IR42 como “plantas isca”. As sementes de cada variedade foram plantadas em vasoscom solo e após 45 dias foram coletadas. As bactérias obtidas de cada amostra foramcaracterizadas morfologicamente e a sua capacidade fixar nitrogênio foi determinada pelaatividade da nitrogenase por meio do método da redução do acetileno (ARA) e a produção deácido indol-acético (AIA) pelo método colorimétrico. De acordo com a caracterizaçãomorfológica, os isolados foram classificados como pertencentes às espécies Azospirillumamazonense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp.,Burkholderia spp. e um grupo desconhecido. A técnica da ARA mostrou que os isoladosapresentaram capacidade de fixar nitrogênio atmosférico. Isolados de A. amazonenseproduziram maior quantidade de AIA quando comparados com os isolados de outras espécies.No caso dos isolados de Burkholderia spp., poucos produziram AIA e em pequenaquantidade. Foram encontrados isolados bacterianos muito eficientes na produção de ácidoindol-acético e fixação de N2, sugerindo portanto potencial para promover o crescimentovegetal quando inoculado em arroz. O perfil de fragmentos de restrição gerados pela técnicade ARDRA, confirmou o gênero da maioria dos isolados, além disso mostrou altadiversidade, principalmente para os isolados bacterianos caracterizados morfologicamentecomo Burkholderia spp.

15

2.2 Abstract

The increased costs of nitrogen fertilisers and concerning of the human being with thecurrent environmental damages caused by the excess of nitrogen application, oppened newopportunity for the exploiting the associations between diazotrophs bacteria and genotypes ofrice more efficient with respect to the biological nitrogen fixation (BNF). The aim of thisstudy was isolate and characterise native diazotrophic bacteria from soil of the MaranhãoState with potential for inoculation in traditional varieties of rice. Samples were collectedfrom three soils cultivated with rice in Maranhão, being two of highland and one of lowlandarea. It two traditional cultivars of rice (Zebu Branco and Manteiga) and two comercialvarieties (IR42 and Diamante) were used for isolation of these diazotrophic bacteria. Theseeds of each variety or cultivar were planted in pots with soil and collected 45 days later. Theobtained bacteria of each sample were morphological characterised and nitrogenase activitywas determined by the acetylene reduction technique (ARA) and the auxin production by thecolorimeter method. In agreement with the morphological characterisation, the isolates wereclassified as Azospirillum amazonense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense,Herbaspirillum spp. and Burkholderia spp. The ARA showed that most of the isolatedpresented the ability to fix nitrogen. Isolates of A. amazonense produced larger amount ofAIA as compared with the other species. In contrast, few isolates of Burkholderiaspp.produced AIA and in small amounts. It was found bacterial isolates very efficient in theindol-acetic acid production and capability to reduce acetylene the ethylene, therefore withpotential to be used as biofertilizers in rice plants. Restriction fragment profiles generated bythe ARDRA technique confirmed the identity of most of the isolates and showed highdiversity mainly for t bacterial isolates morphologically characterized as Burkholderia.

16

2.3 Introdução

O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância para populaçãomundial, sendo o segundo cereal mais consumido no mundo, atendendo a grande parte danecessidade protéica e calórica da população mundial (DE DATTA et al., 1987). O estado doMaranhão é um grande produtor e consumidor de arroz no Brasil, sendo o quarto emprodução e o terceiro em área plantada do País, no entanto, ocupa a 22a posição entre asunidades da federação em termos de produtividade (CONAB, 2008), em decorrência do baixonível de tecnologia empregado.

Um dos fatores que pode limitar a produção de arroz é a baixa disponibilidade denitrogênio nos solos, principalmente nos trópicos, que apresentam solos altamenteintemperizados e, geralmente, com baixo teor de matéria orgânica (DOBEREINER, 1997).

Embora o nitrogênio seja um elemento presente, abundante, na sua forma estável naatmosfera, para a fixação industrial do N2, a quebra da tripla ligação requer grande quantidadede energia proveniente do petróleo ou gás natural, fontes de energia não renováveis(STOLTZFUS et al., 1997), tornando estes produtos custosos tanto do ponto de vistaeconômico como ecológico. Assim, a aplicação de fertilizantes nitrogenados aumenta o custode produção e, além disso, causa impactos negativos ao meio ambiente como contaminaçãoda água pelo nitrato e emissão de gases de efeito estufa como o óxido nitroso e gás amoníaco(STOLTZFUS et al., 1997).

As gramíneas são capazes de se associar com diversas bactérias que realizam oprocesso de fixação biológica do nitrogênio atmosférico, como as pertencentes aos gênerosAzospirillum, Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum, Burkholderia e Pseudomonas(TRAN VAN et al., 2000; LADHA e REDDY, 2003; KENNEDY et al., 2004). A procura porbactérias diazotróficas, capazes de converter nitrogênio gasoso em amônia, disponível para asplantas levou ao isolamento de várias bactérias (DOBBELAERE et al., 2003).

O desenvolvimento de meios de cultura semi-sólidos sem N possibilitou o isolamentodestas bactérias em diversas culturas no decorrer dos anos (BALDANI e BALDANI, 2005). Ouso destes meios oferece uma condição ideal para o crescimento de diazotróficos com carátermicroaerofílico, que ocupam sítios onde a concentração de O2 é limitada. As recentespesquisas com bactérias diazotróficas têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiarda associação com bactérias diazotróficas, obtendo significativa contribuição do nitrogêniofixado biologicamente ou por meio de substâncias promotoras de crescimento(GYANESHWAR et al., 2001; DOBBELAERE et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007;GOVINDARAJAN et al., 2008).

Em experimentos de inoculação, em casa de vegetação, com a variedade de arrozGuarani, foi observado aumento de 22% na massa seca, 19% na produção de grãos das plantasinoculadas com a estirpe ZAE94, 27% na massa seca e de até 20% na produção de grãos paraas plantas inoculadas com a estirpe M130. Além disso, foi observado um aumento doconteúdo de nitrogênio da planta, induzido pela fixação de nitrogênio realizada porHerbaspirillum seropedicae variando entre 17 e 19% do N incorporado à planta (BALDANIet al., 2000).

No entanto, o sucesso do sistema de fixação de nitrogênio em arroz, quanto aoaumento de produção, é dependente de uma interação complexa entre as plantas, osmicrorganismos e o ecossistema (RAO et al., 1998), sendo importante considerar em estudosde inoculação e quantificação da FBN fatores como ambiente, estirpes e genótipos(BALDANI et al., 1999). STOLTZFUS et al. (1997) isolando bactérias endofitícas de raízes edos tecidos da parte aérea de diversas variedades de arroz crescidas em diferentes tipos desolo, observaram uma grande diversidade e um grupo destes isolados mostraram-se

17

cosmopolitas podendo ser isolados de diversos tipos de solos e colonizar um número grandede genótipos.

Variedades tradicionais de arroz podem abrigar populações de bactérias endofitícasdiferentes das observadas em variedades modernas. ELBELTAGY et al. (2001) observarammais bactérias endofitícas em arroz selvagem, Oryza officinalis e Oryza rufipogon, do que emcultivares modernas de O. sativa. No entanto, ENGELHARD et al. (2000) observaram que adiversidade de bactérias endofitícas culturáveis em arroz selvagem foi significativamentemenor do que em cultivares de O. sativa. Os autores sugeriram que os genótipos ou ascondições ecológicas possuem influência crucial na população de bactérias endofitícas.

No Maranhão se encontra o maior número de variedades locais de arroz do país. Estesgenótipos são menos dependentes de fertilizantes nitrogenados e é possível que exerçamefeito seletivo sobre a população de bactérias diazotróficas, podendo abrigar bactériasdiazotróficas com potencial para promover um aumento na produção de grãos sem aumentaros problemas ambientais decorrentes do uso de adubos nitrogenados. O objetivo destetrabalho foi isolar e caracterizar bactérias diazotróficas nativas do estado do Maranhão compotencial para inoculação em variedades tradicionais de arroz cultivadas neste estado.

2.4 Material e Métodos

2.4.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas

O isolamento de bactérias diazotróficas foi realizado em dois períodos. No primeiro seutilizou a variedade IR42 crescida por 45 dias, em três amostras de solo provenientes de trêsmunicípios do estado do Maranhão: Arari, Bacabal e Vitória do Mearim. No segundo,utilizou-se como “plantas isca”, as variedades Diamante, Zebu Branco e Manteiga, crescidaspor 45 dias, em amostras de solo proveniente dos mesmos locais do isolamento anterior.

O isolamento das bactérias diazotróficas foi feito de acordo com a metodologiadescrita por DOBEREINER et al. (1995), utilizando-se diluições seriadas de 10-2 a 10-7 deamostras de raízes, colmos e folhas das plantas. Foram empregados meios de cultura semi-sólidos semi-seletivos, sem adição de nitrogênio: LGIP para o isolamento deGluconacetobacter spp., LGI para Azospirillum amazonense, NFB para Azospirillum spp.,JNFB para Herbaspirillum spp. (DOBEREINER et al., 1995) e JMV para Burkholderia spp.(BALDANI, 1996).

Para o isolamento a partir das amostras de planta, foram retiradas amostras de 1 g dematéria fresca da parte aérea e da raiz. As raízes foram lavadas em água corrente eposteriormente lavadas em água destilada estéril e a da parte aérea lavada com álcool (70%) eágua estéril. As amostras foram maceradas em 9 ml de solução salina (1/4 dos sais do meioNFB) e diluídas serialmente. De cada diluição foram retiradas alíquotas de 0,1 ml einoculadas em frascos tipo penicilina contendo meio semi-sólido. Os frascos foram incubadosa 30ºC, de cinco a sete dias, após este período o crescimento bacteriano foi avaliadoverificando-se o aparecimento de película características para cada bactéria alvo.

Os frascos com crescimento positivo nas duas últimas diluições, de cada um dosmeios, foram utilizados para o isolamento, efetuando-se a repicagem das bactérias para umnovo meio semi-sólido. Após a incubação por 48 horas foi feita a riscagem em placas commeio sólido, o mesmo do semi-sólido, acrescido de extrato de levedura. As colônias formadasnos meios sólidos foram repicadas para novo meio semi-sólido e, após a incubação por 48horas, foram riscadas em meio rico, Batata ou Batata-P, para purificação final(DOBEREINER et al., 1995). As culturas puras foram preservadas em meio sólido inclinadocom óleo mineral e em água.

18

2.4.2 Caracterização morfológica

A caracterização morfológica e a motilidade celular foram determinadas durante operíodo de isolamento e após a purificação por meio de microscopia ótica com contraste defase. A morfologia das colônias foi observada por meio do crescimento dos isolados em meiossólidos, semi-específicos (LGIP, LGI, NFB, JNFB e JMV) e em meio rico (batata), onde seobservou as características morfológicas das colônias como forma, bordas, coloração e textura(DÖBEREINER et al., 1995).

2.4.3 Caracterização molecular

A extração do DNA dos isolados bacterianos para posterior amplificação foi realizadapelo método CTAB (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). 2 mL das culturas bacterianas,crescidas por 48 horas em meio Dygs líquido, pH 6,8 para isolados de Azospirillum eHerbaspirillum e pH 6.0 para isolados de Burkholderia foram centrifugados a 14.000 rpm porcinco minutos. O precipitado foi lavado em 500 µL de TE e centrifugado a 14.000 rpm porcinco minutos. Após a lavagem o precipitado foi resuspendido em 567 µL de TE, adicionou-se 30 µL de SDS (10%) homogeneizado e, em seguida, foi adicionado 3 µL de proteinase K.Após homogeneizar bem, as amostras foram incubadas em banho-maria a 37 ºC por uma hora.Terminado este período foram adicionados 100 µL de NaCl (5 M) homogeneizando-se bemadicionou-se em seguida 80 µL de CTAB/NaCl. As amostras foram incubadas por dezminutos a 65ºC em banho-maria e em seguida incubadas em agitador por cerca de 45 minutosa 30ºC. Após a incubação, o DNA foi extraído adicionado um volume defenol/clorofórmio/álcool isoamílico, homogeneizou-se bem, quando foi centrifugado a 14.000rpm por 10 minutos e, em seguida o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. Aosobrenadante foi adicionado 5 µL de RNase (5mg/µL) procedendo-se à a incubação por cercade 45 minutos em banho-maria a 37ºC. Após o tratamento com RNase foi feita uma segundaextração com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico centrifugado a 14.000 rpm por cincominutos, o sobrenadante foi transferido para um tubo novo e precipitado com isopropanol(100%), o precipitado foi lavado com etanol (70%) e solubilizado em 50 µL de TE.

Após extraido, o DNA foi quantificado por eletroforese em gel de agarose naconcentração de 1,0%, fundida em tampão TAE 1 X. O gel foi submerso em tampão decorrida TAE 1 X. Em cada canaleta do gel foi aplicado 1 µL de amostra, juntamente com doisµL de tampão de amostra, e aplicado voltagem constante de 100 volts por 30 minutos, parapromover a migração das amostras. Em seguida, o gel foi corado em solução de brometo deetídeo (5 mg/L) e visualizado sob luz ultravioleta em fotodocumentador marca Kodak,modelo EL Logic Imaging System.

A amplificação da região 16S dos isolados foi realizada utilizando os iniciadores Y1,complementar a seqüência 5’-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3’ e Y3,complementar à sequência 5’-CTAGACCCCACTTCAGCATTGTTCCAT-3’ (YOUNG etal., 1991). A reação consistiu no preparo da mistura: 10% do volume final de tampão de PCR10 X, 2 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP, 0,12 µM de cada iniciador, uma unidade da enzimaTaq DNA polimerase e de 50 a 150 ng de DNA, o volume final de reação de 50 µL. Emseguida, o material preparado foi colocado num termociclador e submetido ao programa deamplificação cujos ciclos determinados foram: um ciclo de desnaturação (93°C por doisminutos), seguido de 35 ciclos intermediários (93°C por 45 segundos, 62°C por 45 segundos e72°C por dois minutos) e um ciclo final de extensão (72°C por cinco minutos) seguido porresfriamento (15°C por 15 minutos), para finalizar a reação. Após o término do programa,

19

uma amostra de 5 µL do produto amplificado foi submetida à eletroforese, para visualizaçãodos produtos de amplificação e o restante guardado em freezer a temperatura de -20ºC.Os produtos de amplificação das regiões 16S DNAr foram digeridos com as endonucleases derestrição, AluI e MspI para Herbaspirillum; HinfI e AluI para Burkholderia; e, HaeIII e RsaIpara Azospirillum. Os sítios de corte das enzimas estão apresentados na Tabela 2. Para cadareação, foram adicionados 8,5 µL de material amplificado, 1,0 µl de tampão de reaçãoespécifico para cada enzima e cinco unidades da enzima de interesse. Os tubos foram agitadospara homogeneizar os reagentes e incubados a 37ºC em banho-maria por três horas.

Tabela 2. Sítios de restrição das endonucleases utilizadas.

Enzimas Sítios de restrição

AluI 5’-AG - CT-3’3’-TC - GA-5’

HinfI 5’- G – ANT C-3’3’- C TNA - G-5’

HaeIII 5’-GG - CC-3’3’-CC - GG-5’

RsaI 5’-GT - AC-3’3’-CA - TG-5’

MspI 5’-C – CG G-3’3’-G GC - C-5’

Todo o material, e mais 2 µL de tampão de amostra foi submetido à eletroforese emgel de agarose (3%), fundido em tampão TAE 1 X. As amostras foram distribuídas em poçosdo gel submerso em tampão de corrida TAE 1 X e submetido a 50 volts por quatro horas.Após a migração das amostras, o gel foi corado com brometo de etídeo e visualizado sobiluminação utravioleta conforme mencionado acima.

2.4.4 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA)

A determinação da atividade da nitrogenase em culturas puras foi realizada por meioda técnica de ARA (HAN e NEW, 1998). As culturas puras conservadas em óleo mineralforam crescidas em Dygs por 24 horas sob agitação de 200 rpm a 30ºC. Em seguida, ascélulas foram lavadas duas vezes em solução salina para remover o nitrogênio do meio. Apósa lavagem, foram inoculados 20 µL da suspensão em frascos de 10 mL contendo 5 mL desemi-sólido (o mesmo utilizado para o isolamento) sem biotina, sem azul de bromotimol esem fonte de nitrogênio. Os frascos foram incubados por 48 horas a 30ºC. Após este período,os frascos foram vedados e injetado 1 mL de acetileno resultando em uma atmosfera deincubação de 20%. Os frascos foram incubados a 30ºC por uma hora, logo em seguida, 0,5mL da atmosfera dos frascos foram retirados e injetados em cromatógrafo de gás PerkinElmer para analisar a concentração de etileno na amostra.

2.4.5 Produção de compostos indólicos

A produção de AIA pelos isolados foi determinada em meio liquido e semi-sólido pelométodo colorimétrico (SARVAR e KREMER, 1995). As culturas puras conservadas em óleomineral foram crescidas em Dygs por 24 horas sob agitação de 200 rpm a 30ºC. Após esseperíodo a densidade ótica foi ajustada em espectrofotômetro, com comprimento de onda de620 nm. Uma vez padronizadas as amostras, alíquotas de 20 µl foram inoculadas em tubos deensaios com meio líquido e em frascos de penicilina com meio semi-sólidos NFB, JNFB, LGI

20

e JMV (sem extrato de levedura, biotina e azul de bromotimol), com a adição de 100 µL/mLde D/L-triptofano. As amostras em meio líquido foram colocadas para incubar a 30oC por 48h sob agitação de 200 rpm. Os frascos com as amostras em meio semi-sólido foram incubados30oC por 48 h no escuro para os isolados de Azospirillum e Herbaspirillum e 96 horas para osisolados de Burkholderia. Após esse período de crescimento as culturas foram centrifugadas a7000 rpm por cinco minutos. Alíquotas de 150 µl do sobrenadante foram depositadas emmicroplaca de poliestireno seguida da adição de 100 µl do reagente de Salkowski. Após 30minutos de reação no escuro à temperatura ambiente, a intensidade da cor foi medida a 540nm em espectrofotômetro. A concentração de AIA foi determinada utilizando uma curvapadrão com concentrações crescentes de AIA sintético. Os dados foram submetidos à análisede variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.

A concentração de proteína das culturas utilizadas para análise de ARA e de produçãode AIA foi determinada pelo método de (LOWRY et al., 1951), utilizando uma curva padrãofeita a partir de concentrações crescentes de proteína (soro albumina bovina). Após aquantificação da auxina e de acetileno, as culturas foram centrifugadas a 5000 rpm por 15minutos a 4 ºC, resuspendidas em água estéril e diluídas 1:5 (100 µl da amostra e 400 µl deágua esterilizada). Em seguida, 0,5 mL da cultura diluída foi homogeneizada com 0,5 mL deNaOH 1 M em tubos de ensaio que foram colocados em banho-maria a 100 ºC por 5 minutos.Após o resfriamento adicionou se aos tubos 2,5 mL do reagente de Lowry e após reação noescuro à temperatura ambiente por 10 minutos adicionou-se 500 µl do reagente de Folin-Ciocalteu 1 M, seguida de rápida agitação. Após 30 minutos de incubação no escuro aintensidade da coloração foi medida em espectrofotômetro a 750 nm.

2.5 Resultados e Discussão

2.5.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas em arroz

Foi observada a formação de película característica indicadora de crescimento positivoem amostras de raiz lavada, raiz desinfestada e de parte aérea das plantas crescidas nos trêssolos em todos os meios semi-sólidos semi-seletivos utilizados (Tabela 3).

Tabela 3. Número Mais Provável (NMP) de bactérias diazotróficas crescidas em meios semi-sólidos sem nitrogênio provenientes de diferentes partes da planta da cv IR42 cultivada emtrês amostras de solo provenientes do estado do Maranhão.

Número de células por grama de peso fresco (x105)

Origem das amostras de solo

Arari Bacabal Vitória do MearimMeios deCultivo

RL RD PA RL RD PA RL RD PA

NFB 119,0 5,7 5,0 415,0 0,3 3,8 91,7 150,0 0,0

JNFB 37,2 1,1 27,5 1140,0 0,0 0,1 35,0 0,0 0,6

LGI 1290,0 100,0 0,6 34,5 30,9 3,8 73,5 66,7 0,0

LGIP 1430,0 42,4 11,3 603,0 50,0 3,8 190,0 54,5 0,0

JMV 11,6 0,2 0,0 0,5 0,2 0,2 6,5 15,0 0,0

RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

Pode-se observar uma maior população de bactérias diazotróficas nas raízes dasplantas, principalmente nas amostras de raiz lavada independentemente da origem da amostra

21

de solo em meio NFB, quando comparadas com a parte aérea (Tabela 3). De modo geral umapopulação maior de bactérias foi observada nos solos de Arari e Bacabal nos meios LGI,LGIP e NFB, enquanto que o solo de Vitória do Mearim foi o que mostrou tendênciaapresentar menor população de bactérias, principalmente na parte aérea das plantas.Independentemente do solo, uma menor população de bactérias diazotróficas foi observada nomeio JMV.

Embora a contagem de células bacterianas, estimadas pela técnica do Número MaisProvável no meio LGIP, semi-específico para o isolamento de Gluconacetobacterdiazotrophicus, tenha sido alta, até 108, os estudos morfológicos, das bactérias crescidas nestemeio mostraram que as mesmas não apresentavam características de Gluconacetobacter spp.,mas sim do gênero Burkholderia. No entanto, o gênero Gluconacetobacter, também pode serencontrado colonizando plantas de arroz. MUTHUKUMARASAMY et al. (2005) observarama ocorrência de G. diazotrophicus em diferentes cultivares de arroz irrigado na Índia. SegundoMUTHUKUMARASAMY et al. (2007), G. diazotrophicus apresenta uma grande distribuiçãogeográfica em plantas de arroz em clima temperado. KUSS et al. (2007) observaram umapopulação expressiva de bactérias diazotróficas no meio LGIP em diferentes cultivares dearroz irrigado no Rio Grande do Sul. No entanto, não foi feito uma caracterização dasbactérias isoladas deste meio para confirmar se pertenciam ao gênero Gluconacetobacter.

Nos meios de cultivo LGI e LGIP foi observado, tanto em meio semi-sólido quantoem meio sólido dois grupos de bactérias umas que acidificavam o meio e outras quealcalinizavam, tornando estes meios mais amarelo ou esverdeado respectivamente.RODRIGUES (2003) avaliando o crescimento de isolados de Burkholderia spp. em meioLGIP observou esta mesma característica, alguns isolados que alcalinizavam o meio e outrosque o acidificaram e que isolados de Burkholderia spp. foram capazes de crescer em meiocompletado com 10% de açúcar.

Na primeira coleta foi obtido um total de 164 isolados. Porém, não foi observada apresença de bactérias com características do gênero Herbaspirillum ou Azospirillum. Osisolados obtidos apresentaram características morfológicas semelhantes e foramcaracterizados como Burkholderia spp. Não foi possível identificar alguns isolados nesta fasee, portanto, foram agrupados como não identificados. Os isolados não identificados foramobtidos principalmente nos meios LGI e LGIP, sendo que alguns destes alcalinizaram o meiode cultivo (observado pela mudança de cor do indicador de pH do meio de cultivo) e outros,acidificaram. Quando riscadas nestes mesmos meios sólidos suplementados com extrato delevedura formaram colônias grandes e pequenas, brancas e amareladas e, também, gomosas.Já em meio NFB, sólido formaram-se colônias pequenas e azuis translúcida e em JNFBcolônias maiores, azuladas e com centro o escuro. Em microscópio óptico estes isoladosapresentaram células pequenas imóveis e em formato de gota. O número de isolados obtidosem cada meio semi-sólido e das diferentes partes da planta crescidas nas três amostras de soloencontram-se na Tabela 4. Como não foi obtido nenhum isolado dos gêneros Herbaspirillume Azospirillum, que são bactérias de ocorrência comum em arroz, julgou-se necessário fazeruma nova etapa de isolamento de bactérias utilizando-se as variedades locais.

22

Tabela 4. Número de isolados de bactérias diazotróficas obtido da cultivar IR42 crescida emamostras de solo proveniente de três municípios do estado do Maranhão.

Origem dosolo

Parte daPlanta

NFB JNFB LGI LGIP JMV Total

RL* 8 2 12 11 8 41RD 3 1 8 5 4 21ArariPA 3 0 0 0 1 4RL 2 0 6 5 7 20RD 2 1 5 8 0 16BacabalPA 6 0 4 0 2 12RL 2 0 5 16 6 29RD 1 1 3 7 1 13

Vitória doMearim

PA 3 0 1 3 1 8Total 30 5 44 55 30 164

*RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

O segundo isolamento permitiu a obtenção de 138 isolados que foram classificados deacordo com a caracterização morfológica, como A. amazonense, Azospirillum lipoferum,Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp. (Tabela 5). Muitos dosisolados, principalmente oriundos dos meios de cultivo LGI e LGIP, também não foramidentificados nesta fase e para fins de agrupamento permaneceram como não identificados.No entanto, apresentaram características semelhantes aos obtidos no primeiro isolamentosugerindo pertencer ao gênero Burkholderia. O maior número de isolados obtidos foi deBurkholderia spp., sendo 55 no primeiro isolamento e 35 no segundo, e de A. amazonense, 33isolados. Estes resultados estão de acordo com BALDANI (1996) e RODRIGUES et al.(2006) que observaram números elevados destes gêneros em cultivares de arroz IR42 eIAC4440 cultivadas em solos provenientes do estado do Rio de Janeiro e de Goiás.

Tabela 5. Número de isolados de bactérias diazotróficas obtidas das variedades de arrozDiamante, Zebu Branco e Manteiga, crescidas em amostras de solo proveniente de trêsmunicípios do estado do Maranhão.

Azospirillumamazonense

Azospirillumbrasilense

Azospirillumlipoferum

Herbaspirillumspp.

Burkholderiaspp.

Azospirillumspp.Origem dos Solos

(Variedades)R PA R PA R PA R PA R PA R PA

Arari (Diamante) 11 4 2 1 2 3 4 3 8 5 12 14

Bacabal(Zebu Branco)

2 0 1 0 2 0 1 0 7 6 7 8

Vitória do Mearim(Manteiga)

12 4 1 0 0 0 2 2 7 2 3 3

Total 33 4 7 12 35 49

R – Raiz; PA – Parte aérea.

O solo de baixada proveniente do município de Arari foi o que originou o maiornúmero de isolados de bactérias diazotróficas tanto no primeiro como no segundo isolamento,sendo que a raiz apresentou maior número de bactérias isoladas. Uma população maior de

23

bactérias diazotróficas em raízes de arroz quando comparada com a do colmo e da folha dearroz, também, foi observada por RODRIGUES et al. (2006).

2.5.2 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) de culturas bacterianasin vitro

A capacidade dos isolados em realizarem a fixação biológica de nitrogênio (FBN)determinada por meio da atividade da enzima nitrogenase medida pela técnica de redução doacetileno (ARA) demostrou que a maioria dos isolados foram capazes de reduzir o acetileno aetileno, comprovando a capacidade destas bactérias de fixarem biológicamente o nitrogênioatmosférico.

Houve uma grande variabilidade entre os isolados quanto à capacidade de redução deacetileno, variando de 0,3 a 90,2 nmol mL-1 após uma hora de incubação (dados nãoapresentados). É comum se observar uma alta variabilidade entre isolados quanto àcapacidade de reduzirem acetileno a etileno in vitro. HAN e NEW (1998) também,observaram grande variabilidade na capacidade de isolados em reduzirem acetileno em meiode cultivo. Além disso, os autores observaram que a alta FBN em meio de cultivo não serelaciona com a alta FBN em campo. Uma variabilidade acentuada na capacidade de fixar N2

também foi observada com outras bactérias isoladas de arroz (RODRIGUES et al., 2006;KUSS et al., 2007).

A técnica de ARA mostrou que a maioria dos isolados apresentou baixos valores deFBN, sendo que os isolados de A. amazonense foram aqueles que apresentaram maiorcapacidade de redução do acetileno quando comparados com os isolados de outras espécies. Atécnica de redução do acetileno é um método indireto para avaliar a FBN e estirpes queapresentam alto potencial de FBN in vitro podem não apresentar uma associação eficientecom as plantas (HAN e NEW, 1998). Além disso, a alta fixação de nitrogênio pelas bactérias,não implica em transferência do N fixado para a planta (MANTELIN e TOURAINE, 2004).Em função dessa variabilidade a atividade de redução do acetileno é considerada apenasqualitativa por alguns autores. A estirpe M2, uma mutante natural não fixadora de nitrogênio,não foi capaz de reduzir acetileno a etileno nas condições testadas confirmando suaincapacidade de fixar nitrogênio (BALDANI et al., 1997).

2.5.3 Determinação da Produção de Ácido Indol-Acético (AIA) in vitro

Os isolados das bactérias estudadas apresentaram capacidade diferenciada de produzirAIA, avaliado pelo método colorimétrico de Salkowski e, sendo os do gênero Azospirillumaqueles que produziram maiores concentrações de compostos indólicos (Tabela 6).RADWAN et al. (2004) observaram que estirpes de Azospirillum spp. produzem de três a setevezes mais compostos indólicos que estirpes de Herbaspirillum. Dentre os isolados deAzospirillum spp., os de A. amazonense produziram maior quantidade de AIA comparadoscom isolados de outras espécies (Tabela 7). A quantidade de AIA produzida pelos isolados deA. amazonense, variou de 7 a 303 µM mL-1. Estes valores são superiores aos encontrados porREIS JUNIOR et al. (2004) para A. amazonense em isolados de braquiária.

Poucos isolados de Burkholderia spp. foram capazes de produzir compostos indólicosnas condições testadas, ou seja, em meio JMV líquido e em semi-sólido, variando de nãodetectado até 8 µM mL-1 (dados não mostrados). Isolados do gênero Burkholderia podemapresentar capacidade de produzir compostos indólicos conforme indicado porKUKLINSKY-SOBRAL (2004). No entanto, MARCHIORO (2005) também observou queentre 17 estirpes de Burkholderia spp. avaliadas, apenas seis produziram compostos indólicospelo método do reagente de Salkowski e em pequena quantidade quando comparados com

24

outros gêneros de bactérias diazotróficas. GOVINDARAJAN et al. (2008) observaram aprodução de até 16 µg mL-1 de AIA por isolados de Burkholderia vietnamiensis após umasemana de incubação em meio CCM e utilizando cromatografia liquida de alta pressão(HPLC) que é um método mais sensível e preciso.

2.5.4 Diversidade genética dos isolados

2.5.4.1 Isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp.

Todos os isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp. foramutilizados para a análise da diversidade genética por meio da técnica de ARDRA. A origem decada um dos isolados encontra-se na Tabela 8. Os produtos de amplificação da região 16S doDNAr dos isolados foram digeridos com as enzimas de restrição AluI e MspI que apresentammaior poder discriminatório para Herbaspirillum spp. (BRASIL, 2005). A restrição dosprodutos de amplificação das estirpes padrões e dos isolados de Herbaspirillum spp. geraramseis perfis polimórficos para cada uma das enzimas (Figura 1). Dos 10 isolados avaliados,quatro formaram o mesmo tipo de perfil que a estirpe M4 de Herbaspirillumrubrisubalbicans. Os demais, formaram perfis distintos entre si e diferentes das estirpespadrões, sendo que nenhum dos isolados formou o mesmo tipo de perfil que as estirpesZAE94 e ZAE67 de H. seropedicae (Tabela 9).

25

Tabela 6. Produção de compostos indólicos por isolados de Azospirillum spp. isolados dediferentes partes da planta de três variedades de arroz crescidas em amostras de soloprovenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B= Bacabal e V = Vitória doMearim) e avaliados pelo método colorimétrico (média de 4 repetições).

Isolado Solo Parte da planta µM/µg µM/mLVR2112 A RD 1,20A 219AAR3156 A RD 0,77B 181BAR1161 A RL 0,72B 186BAR1131 A RD 0,66B 41CAR2128 A RD 0,56B 30CAR1246 A RD 0,54B 88BVR1134 V RD 0,51B 49CBR1142 B RD 0,43B 85BAR215 A RD 0,35C 28C

Cd 0,34C 142BBF1358 B PA 0,32C 75BAR1135 A RL 0,32C 36BBR3159 B RL 0,30C 75BBF1360 B PA 0,28C 73BBR1139 B RD 0,26C 48CAR114 A RD 0,25C 32CBR2113 B RD 0,21C 16CBR1144 B RD 0,18C 48CBF2227 B PA 0,18C 47CAR1133 A RD 0,18C 22CBR2257 B RD 0,14C 35CAR1155 A RL 0,14C 32CAR2132 A RD 0,12C 29CAR211 A RD 0,10C 19CVR113 V RD 0,095C 13CAR2141 A RD 0,092C 41CAR319 A RD 0,09C 27CAR2140 A RD 0,08C 30CAR2247 A RD 0,07C 13CVR2236 V PA 0,07C 13CAR1249 B PA 0,07C 15CAR218 A RD 0,06C 11CAF3143 A RL 0,06C 14CBR112 A RD 0,06C 15CAR1148 B RD 0,04C 9CBR1145 B RD 0,03C 7CBR117 B RD 0,01C 3CBR2110 B RD 0,00C 2CAR2111 A RD 0,00C 1C

Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

26

Tabela 7. Produção de compostos indólicos por Azospirillum amazonense isolados da raiz (R)e da parte aérea (PA) de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de trêslocalidades no Maranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo métodocolorimétrico (média de 4 repetições).

IsoladoLocal de coleta dasamostras de solo

Parte da planta µM/µg µM/mL

VF2213 V PA 1,44A 164DAR3123 A RD 1,42A 168DVR2110 V RD 1,39A 145DVR219 V RD 1,36A 175DAR3122 A RD 0,99B 186CAR3124 A RD 0,84B 174DVR218 V RD 0,83B 303AVR3125 V RD 0,83B 165DAR214 A RD 0,71B 159DAR2128 A RD 0,70B 147DVR3126 V RD 0,69B 167DVR2114 V RD 0,69B 166D

Y2 0,68B 154DAR211 A RD 0,67B 182CAR213 A RD 0,66B 159DVF227 V PA 0,65B 156D

AR3127 A RD 0,62B 154DVR2111 V RD 0,60B 139DVR3120 V RD 0,59B 164DAR215 A RD 0,57B 165DVR2112 V RD 0,409C 168DYm69 0,37C 164D

VF2215 V PA 0,36C 119EAF226 A PA 0,26C 62F

AR3118 A RD 0,12C 22GVR2116 V RD 0,06C 21GAR2117 V RD 0,02C 8GAF222 A PA 0,02C 8G

Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

Tabela 8. Origem dos isolados classificados previamente como Herbaspirillum spp.utilizados na análise caracterização genética.

Isolado Parte da planta Meio de cultivoLocal de coleta dasamostras de solo

AR1123 RD NFB ArariAR1121 RD NFB ArariVR1119 RD NFB Vitória do MearimAR2120 RD JNFB ArariVR2116 RD JNFB Vitória do MearimVR2117 RL JNFB Vitória do MearimAR1124 RD NFB ArariAR1122 RL NFB ArariAR1125 RL NFB ArariBR2126 RD JNFB Bacabal

RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

27

Figura 1. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferencia Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados.Figura A. Restrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR2116), 3 (VR2117), 4(VR1119), 5 (AR1121), 6 (BR2126), 7 (ZAE94), 8 (ZAE67), 9 (M4), 10 (marcador de 100pb). Figura B. Restrição com MspI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR2116), 3(VR2117), 4 (VR1119), 5 (AR2120), 6 (AR1121), 7 (AR1122), 8 (AR1123), 9 (AR1224), 10(AR1125), 11 (AR2126), 12 (ZAE94), 13 (ZAE67), 14 (M4), 15 (marcador de 100 pb).

Tabela 9. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferência Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados.

Perfis de restriçãoEstirpes e isolados

AluI MspITipos de

perfisM4 (Herbaspirillum rubrisubalbicans) A* A 1ZAE67, ZAE94 (Herbaspirillum seropedicae) B B 2VR2116, VR2117, AR1224, AR1125 A A 1VR1119 E F 3AR2120 C F 4AR1121 C C 5AR1122 D D 6AR1123 F E 7BR2126 D A 8

*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.

A análise do dendograma (Figura 2) mostra que os quatros isolados que se agruparamcom a estripe M4 formaram o maior grupo com 100% de similaridade. O grupo I, com 77%de similaridade, englobando também as estirpes ZAE67 e ZAE94. Já o grupo II com apenastrês isolados apresenta 70% de similaridade ao grupo anterior, os demais isoladosapresentaram maior diversidade (Grupo III) apresentando apenas 50% de similaridade.

RODRIGUES (2003) observou por meio da técnica de ARDRA que a maioria dasenzimas de restrição testadas para estudar a diversidade da população de isolados deHerbaspirillum spp. obtidos de arroz, não foi capaz de diferenciar entre estirpes padrões ediferentes isolados. No entanto, a restrição da 16S DNAr com as enzimas AluI e MspI foramcapazes de diferenciar H. seropedicae e Herbaspirillum frisingense das outras espécies.BRASIL (2005) utilizando a técnica do ARDRA para estudar a diversidade da população deHerbaspirillum spp. isolada de arroz observaram a formação de três grupos distintos, emboratenha havido grande homogeneidade entre os isolados dentro de cada grupo. O autor observou

28

a formação de perfis de restrição diferentes para a espécie H. seropedicae e H.rubrisubalbicans, mostrando que esta técnica pode ser utilizada para separar espécies deHerbaspirillum. CRUZ et al. (2001) também separaram isolados de H. seropedicae e H.rubrisubalbicans pela técnica do ARDRA. Os isolados que apresentaram perfis polimórficosdiferentes do gerado para H. rubrisubalbicans podem pertencer a outras espécies do gênero,porém estudos adicionais serão necessários para a confirmação.

Figura 2. Dendograma de similaridade de estirpes de referência Herbaspirillum seropedicae,Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados caracterizados morfologicamente comoHerbaspirillum spp. Este dendrograma foi gerado pelo programa NTSYS, algoritmo UPGMAe índice SM a partir dos perfis de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr gerados pelatécnica de ARDRA.

2.5.4.2 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum spp.

A origem dos isolados caracterizados morfologicamente como A. brasilense e A.lipoferum e de isolados similares a Azospirillum spp., utilizados para o estudo da diversidadegenética, pode ser observada na Tabela 6. A restrição dos fragmentos amplificados por PCRda região 16S DNAr foi realizada pelas enzimas HaeIII e RsaI, por apresentarem maior poderdiscriminatório para Azospirillum spp. (REIS JUNIOR et al., 2004). Estas enzimas geraramum total de 11 perfis polimórficos, sendo que a enzima HaeIII gerou seis perfis e a enzimaRsaI cinco (Figura 3). De um total de 30 isolados analisados, 16 formaram o mesmo tipo deperfil que as estirpes CD, Sp7 de A. brasilense e Sp59 de A. lipoferum. Os demais isoladosformaram oito tipos de perfis distintos, sendo que cinco destes com apenas um isolado(Tabela 10). Pela análise de agrupamento podemos observar formação de três gruposprincipais (Figura 4). No primeiro grupo, podemos observar um subgrupo que engloba maisde 50% dos isolados com 100% de similaridade com as estirpes de refência, os grupos II e IIIapresentaram maior diversidade e os isolados do grupo III apresentaram maior similaridade àA. amazonense, sendo que o isolado AR1128 apresentou mais de 90% de similaridade com aestirpe Y2 de A. amazonense.

Gru

po II

IG

rupo

IIG

rupo

I

29

Figura 3. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferência Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum e de novos isolados. Figura A.Restrição com Hae III. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (CD), 3 (Sp7), 4 (Sp59), 5(AR211), 6 (BR112), 7 (BR2110), 8 (BR2113), 9 (BF2227), 10 (AR2128), 11 (AR2130), 12(AR2132), 13 (AR1133), 14 (VR1134), 15 (VR2236), 16 (BR2137), 17 (BR1138), 18(BR1246), 19 (AR2247), 20 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com RsaI. Legenda: 1(marcador de 100 pb), 2 (AR211), 3 (BR112), 4 (VR113), 5 (AR114), 6 (BR2110), 7(BR2113), 8 (BF2214), 9 (BF2227), 10 (AR2128), 11 (AR2130), 12 (AR2132), 13 (AR1133),14 (VR2236), 15 (BR1139), 16 (VR1142), 17 (CD), 18 (Sp7), 19 (Sp59), 20 (marcador de100 pb).

Tabela 10. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpesde referencia Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum e de novos isolados.

Perfis de restriçãoEstirpes e isolados

HaeIII RsaITipos de

perfisCD, Sp7 (Azospirillum brasilense), Sp59 (Azospirillumlipoferum)

A* A 1

AR211, AR216, BR117, AR218, AR319, BR2110, BF2214,BF2227, AR2130, BR2137, BR1139, AR2141, VR1142,AR3143, AR1245, AR2247

A A 1

AR2132, VR1134 A E 2BR112 B B 3AR2128 B D 4VR113 C A 5AR114, AR215, AR1135, VF2236 D B 6AR2129, AR2130, AR1131 E A 7BR1246 A C 8AR1133 F B 9AR2111 B F 10BR2113 A D 11

*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.

30

Figura 4. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Azospirillum brasilense,Azospirillum lipoferum e Azospirillum amazonense e de isolados caracterizadosmorfologicamente com Azospirillum spp. Este dendrograma foi gerado pelo programaNTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnicade ARDRA.

Embora, as enzimas utilizadas não tenham separado as estirpes padrões de A.brasilense e A. lipoferum, metade dos isolados se agruparam com estas espécies confirmandoque estes isolados pertencem ao gênero Azospirillum. Foi observada uma grande diversidadeentre os isolados pela análise dos perfis polimóficos gerados, no entanto não foi observadoefeito dos locais de coleta ou da parte da planta no agrupamento dos isolados. BRASIL et al.(2005) observaram, também, uma alta diversidade para isolados de Azospirillum spp. obtidosde arroz, porém, embora estes autores não tenham separado as espécies A. brasilense e A.lipoferum, eles observaram a formação de dois grupos com 50% de similaridade entre estasespécies.

2.5.4.3 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum amazonense

A restrição dos fragmentos amplificados das estirpes e dos isolados de A. amazonense(Tabela 7) pelas enzimas HaeIII e RsaI gerou um total de sete perfis polimórficos, sendo quea enzima HaeIII gerou três perfis e a enzima RsaI quatro (Figura 5). De um total de 24isolados analisados, 16 formaram o mesmo tipo de perfil que as estirpes Y2 e CBAMC de A.amazonense. Os demais isolados formaram seis tipos distintos de perfis, sendo, dois com doisisolados cada um e quatro com apenas um isolado (Tabela 11). Pela análise de agrupamento(Figura 6) pode-se observar que a maioria dos isolados (66%) se agruparam com as estirpesCBAMC e Y2 com 100% de similaridade. O grupo I, divide-se em dois subgrupos, sendo umcom apenas dois isolados que apresentam 73% de similaridade com as estirpes de referência,o grupo II com três isolados apresenta 69% de similaridade com o grupo I, já o grupo IIIformado pelos isolados que apresentaram pouca similaridade com as estirpes de referência,

Gru

po II

IG

rupo

IIG

rupo

I

31

apenas 38%, e podem pertencer a gêneros ou a espécies diferentes, pois uma baixadiversidade entre isolados de A. amazonense pela técnica do ARDRA foi observada por REISJUNIOR et al. (2004). É possível se verificar uma maior diversidade entre isolados de A.amazonense quando se utiliza a região intergênica 16S – 23S (REIS JUNIOR et al., 2006).

Figura 5. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferencia Azospirillum amazonense e de novos isolados. Figura A. Restrição com RsaI.Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (AR211), 3 (AR215), 4 (VF227), 5 (VR218), 6 (VR219),7 (VR2112), 8 (VF2213), 9 (VR2114), 10 (VR2116), 11 (AR2117), 12 (VR3120), 13(AR3121), 14 (AR3123), 15 (AR3124), 16 (VR3125), 17 (AR3127), 18 (Y2), 19 (CBAMC),20 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com HaeIII. Legenda: 1 (marcador de 100 pb),2 (AR111), 3 (AF222), 4 (AR213), 5 (AR214), 6 (AR215), 7 (AF226), 8 (VF227), 9(VR2110), 10 (VR2111), 11 (VR2114), 12 (VR2215), 13 (VR2116), 14 (AR3118), 15(AR3121), 16 (AR3122), 17 (VR3126), 18 (Y2), 19 (CBAMC), 20 (marcador de 100 pb).

Tabela 11. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpesde referencia Azospirillum amazonense e de novos isolados

Perfis de restrição

Estirpes e isoladosHaeIII RsaI

Tipos deperfis

Y2, CBAMC (Azospirillum amazonense) A* A 1

AR111, AR213, AR214, AR215, VF227, VR218, VR2110,VR2112, VR2114, VR2116, VR3120, AR3122, AR3123,VR3125, VR3126, AR3127, AR2117.

A A 1

VR2111, AR3124 A B 2

VF2213, VR219 B A 3

AR3118, AR3121 B C 4

AF222 B D 5

AR2128 C A 6

AF226 C C 7

*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.

32

Figura 6. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Azospirillum brasilense,Azospirillum lipoferum e Azospirillum amazonense e de isolados caracterizadosmorfologicamente com Azospirillum amazonense. Este dendrograma foi gerado peloprograma NTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição geradospela técnica de ARDRA.

2.5.4.4 Isolados caracterizados morfologicamente como Burkholderia spp.

A análise da diversidade genética dos isolados caracterizados como pertencentes aogênero Burkholderia pela caracterização morfológica, foi realizada com 30 isoladosrepresentativos das diferentes partes da planta e das diferentes amostras de solo, todos obtidosdo meio de cultivo JMV, a origem destes isolados encontram-se na Tabela 12. Foramutilizadas as enzimas AluI e HinfI que apresentam maior poder discriminatório para isoladosde Burkholderia spp., segundo BRASIL (2005).

A restrição dos fragmentos amplificados por PCR da região 16S DNAr pelas enzimasAluI e HinfI das estirpes de Burkholderia brasilensis (M130), Burkholderia tropica (Ppe8) eB. vietnamiensis (TVV75) e dos isolados caracterizados morfologicamente comoBurkholderia spp. gerou um total de sete perfis polimórficos (Figura 7). A maioria dosisolados (54%) formaram o mesmo tipo de perfil que os das estirpes M130 de B. brasilensis eTVV75 de B. vietnamiensis. Os demais isolados formaram cinco tipos distintos de perfil,sendo, um com oito isolados e os demais com apenas um isolado cada (Tabela 13). Emboranão tenha sido observada uma grande diversidade entre os isolados, pela técnica do ARDRA,foi observada influência do local de coleta da amostra de solo na diversidade dos isolados deBurkholderia spp (Tabela 13). O tipo de perfil 3 foi mais comum no solo de Bacabal, que é deterras altas, já o tipo de perfil 1 foi mais comum nos solos de Arari e Vitória do Mearim quesão solos de baixada. Além disso, os tipos de perfil 5, 6 e 7 apareceram só no solo de Arari.

O dendograma gerado pela análise de agrupamento dos isolados caracteridos comoBurkholderia pela caracterização morfológica mostra a formação de dois grupos principais(Figura 8). O grupo I formado pelos isolados que apresentaram 100 % de similaridade com asestirpes de referência M130 e TVV75 e o grupo II com dois subgrupos apresentando mais de

G

rupo

III

G

rupo

II

Gru

po I

33

90 % de similaridade com a estirpe Ppe8 de B. tropica. A técnica do ARDRA não foisuficiente para identificar espécies

Embora tenha sido observada grande diversidade entre os isolados, não foi observadainfluência da parte da planta ou do local de coleta da amostra de solo na diversidade dosisolados. Além disso, a técnica do ARDRA não foi suficiente para identificar espécies, sendo,portanto, necessário o uso de técnicas mais precisas para a identificação dos isolados como osequenciamento da região 16S DNAr. PERIN (2007) observou grande variação entre isoladosde Burkholderia spp. obtidos de cana-de-açúcar pela técnica do ARDRA, no entando estatécnica foi capaz de identificar apenas cinco isolados, dois como B. tropica e dois comoBurkholderia uname. RODRIGUES et al. (2006) caracterizaram isolados de Burkholderiaspp. obtidos de arroz e observaram que houve prodominância das espécies B. vietnamiensis eBurkholderia kururiensis. BRASIL (2005) observou prodominância de B. vietnamiensis entreisolados de Burkholderia spp. isolados de plantas de arroz.

34

Tabela 12. Origem dos isolados classificados previamente como Burkholderia spp. utilizadosna análise de caracterização genética.

Isolados Parte da planta Local de coleta da amostra de solo

AR516 RL Arari

AR5214 RD Arari

AF5323 PA Arari

AR5130 RL Arari

AR5131 RL Arari

AF5333 PA Arari

AR5244 PA Arari

AR5145 RL Arari

AR5150 RL Arari

AF5272 PA Arari

AR5276 RD Arari

BR514 RL Bacabal

BR518 RL Bacabal

BF5325 PA Bacabal

BR5161 RL Bacabal

BR5239 RD Bacabal

BR5154 RL Bacabal

BR5256 PA Bacabal

BR5257 PA Bacabal

BR5159 RD Bacabal

VR521 RD V. do Mearim

VR5135 RL V. do Mearim

VR5138 RL V. do Mearim

VR5140 RL V. do Mearim

VR5165 RL V. do Mearim

VR5166 RL V. do Mearim

VR5168 RL V. do Mearim

VR5169 RL V. do Mearim

VR5171 RL V. do Mearim

VF5120 PA V. do Mearim

VR4175 RL V. do Mearim

RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

35

Figura 7. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e denovos isolados. Figura A. Rerstrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR521),3 (BR514), 4 (AR516), 5 (BR518), 6 (AR5214), 7 (VR5120), 8 (AF5323), 9 (BF5325), 10(AR5130), 11 (AR5131), 12 (AR5132), 13 (AF5333), 14 (VR5135), 15 (VR5138), 16(BR5239), 17 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com HinfI. Legenda: 1 (marcador de100 pb), 2 (BR514), 3 (AR516), 4 (BR518), 5 (AR5214), 6 (VR5120), 7 (AF5323), 8(BF5325), 9 (AR5130), 10 (AR5131), 11 (AR5132), 12 (AF5333), 13 (VR5135), 14(VR5138), 15 (BR5239), 16 (VR5140), 17 (TVV75), 18 (PPE8), 19 (M130), 20 (marcador de100 pb).

Tabela 13. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpesde referência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e denovos isolados.

Perfis de restrição

Estirpes e isoladosAluI HinfI

Tipos deperfis

M130 (Burkholderia brasilensis), TVV75 (Burkholderiavietnamiensis)

A* A 1

Ppe8 (Burkholderia tropica) B A 2

VR521, AR516, VR5120, AF5323, BF5325, AR5130, AR5131,VR5138, BR5239, AR5150, BR5256, AR1161, VR5168,VR5169, VF5271, AR5276

A A 1

BR514, BR518, AR5214, VR5135, BR5154, BR5257, BR5159,VR5165

B B 3

AR5145 B C 5

AF5333 D A 6

AR5244 E D 7

*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.

36

Figura 8. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Burkholderia brasilensis,Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia tropica e de isolados caracterizadosmorfologicamente com Burkholderia spp. Este dendrograma foi gerado pelo programaNTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnicade ARDRA.

2.5.4.5 Isolados caracterizados morfologicamente como não identificados

A análise da diversidade genética dos isolados denominados “não identificados” combase na caracterização morfológica, foi feita com 37 isolados representativos das diferentespartes da planta e das diferentes amostras de solo (Tabela 14). Estes isolados foram obtidosdos meios de cultivo NFB, LGI e LGIP. Os produtos de amplificação da região 16S do DNArforam digeridos com as enzimas de restrição AluI, RsaI e HinfI. A restrição dos fragmentosamplificados por estas enzimas mostrou grande diversidade entre os isolados analisados,gerando um total de 11 perfis polimórficos (Figura 9). Na Tabela 15 encontram-se os padrõesde restrição gerados por estas enzimas, onde pode se observar que o tipo de perfil 1 foi maiscomum no solo de Bacabal e Arari e os tipos de perfil 4, 6 e 8 só apareceram no solo deVitória do Mearim. Além disso, houve influência do meio de cultivo no qual estes isoladosforam obtidos. Dentre os isolados avaliados, obtidos dos meios NFB e LGIP, mais da metadeformou o mesmo perfil que o das estirpes M130 e TVV75, já os que foram obtidos do meioLGI mostraram-se mais diversos. Apenas quatro desses isolados analisados agruparam com asestirpes M130 e TVV75. Os demais formaram vários grupos, sendo três destes com apenasum isolado cada.

A análise de agrupamento mostrou que a maioria dos isolados (54%) dos isoladosanalisados se agruparam com as estirpes M130 de B. brasilensis e TVV75 de B. vietnamiensiscom 100% de similaridade (Grupo II). O grupo I foi formado por cinco isolados queapresentaram 92% de similaridade com as estirpes de referência M130 e TVV75, já o grupoIII, foi formado por isolados que apresentaram maior similaridade (96%) com a estirpe Ppe8de B. tropica. (Figura 10).

Gru

po I

Gru

po II

37

Tabela 14. Origem dos isolados classificados pertencentes ao grupo “não identificados” eutilizados para a caracterização genética.

Isolados Parte da planta Meio de cultivo Solo

AR111 RL NFB Arari

AR112 RL NFB Arari

AR223 RD NFB Arari

AF134 PA NFB Arari

BR115 RL NFB Bacabal

BR116 RL NFB Bacabal

BF137 PA NFB Bacabal

BF138 PA NFB Bacabal

BR129 RL NFB Bacabal

AR1210 RD NFB Arari

AR1111 RL NFB Arari

BR1212 RL NFB Bacabal

AR4213 RD LGIP Arari

AF4214 PA LGIP Arari

AR4115 RL LGIP Arari

AR4116 RL LGIP Arari

BR4217 RD LGIP Bacabal

BF4218 PA LGIP Bacabal

BR4119 RL LGIP Bacabal

BR4120 RL LGIP Bacabal

VF4321 PA LGIP V. do Mearim

VR4122 RL LGIP V. do Mearim

VR4123 RL LGIP V. do Mearim

VR4124 RL LGIP V. do Mearim

BR4225 RD LGIP Bacabal

AR3226 RD LGI Arari

AR3127 RL LGI Arari

AR3128 RL LGI Arari

AR3229 RL LGI Arari

BF3330 PA LGI Bacabal

BR3131 RL LGI Bacabal

BR3132 RL LGI Bacabal

BF3233 PA LGI Bacabal

VR3234 RD LGI V. do Mearim

VR3135 RL LGI V. do Mearim

VR3236 PA LGI V. do Mearim

VR3137 RL LGI V. do Mearim

RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.

38

Figura 9. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes dereferencia de novos isolados. Restrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2(BR4119) 3 (BR4120), 4 (VF4321), 5 (VR4122), 6 (VR4123), 7 (VR4124), 8 (BR4225), 9(AR3226), 10 (AR3127), 11 (AR3128), 12 (AR3229), 13 (BF3330), 14 (BR3131), 15(BR3132), 16 (BF3233), 17 (VR3234), 18 (VR3135), 19 (VR3236), 20 (marcador de 100 pb).

Tabela 15. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpesde referência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e denovos isolados não identificados pelas caracteristicas morfológicas.

Perfis de restriçãoEstirpes e isolados

AluI HinfI RsaITipos de

perfis

M130, TVV75 A* A A 1

Ppe8 B A E 2

AR112, BR115, BF137, BF138, BR129, AR1210,BR1212, AF4214, AR4115, AR4116, BR4217, BF4218,BR4120, VR4122, VR4124, BR4225, AR3226, BR3132,BF3233

A A A 1

AR4213 A A B 3

VF4321, VR4123 A B B 4

AR1111, VR3236 A D D 5

VR3234, VR3137 B C D 6

AR111, BR116, AR3127, AR3229, BF3330, C A A 7

VR3135 B E D 8

BR3131 D C E 9

AF134, AR3128 C E C 10

AR223 C D D 11

*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.

39

Figura 10. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Burkholderia brasilensis,Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e de isolados caracterizadosmorfologicamente como “não identificados”. Este dendrograma foi gerado pelo programaNTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnicade ARDRA.

2.6 Conclusões

Foram isoladas bactérias diazotróficas agrupados de acordo com a caracterizaçãomorfológica e pela técnica de ARDRA, como pertencentes aos gêneros Azospirillum,Herbaspirillum e Burkholderia.

A análise de diversidade genética mostrou que houve alta diversidade entre os isoladosobtidos, principalmente os do gênero Burkholderia.

Foram encontrados isolados bacterianos eficientes na produção de ácido indol-acéticoe capazes de fixar N2, portanto apresentam potencial para promover o crescimento vegetalquando inoculados em plantas.

Gru

po II

IG

rupo

IIG

rupo

I

40

3 CAPÍTULO II

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZ ÓTROFICASNA PRODUÇÃO DE GRÃOS EM DIFERENTES CULTIVARES DE AR ROZ

TRADICIONAIS

41

3.1 Resumo

O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância por ser uma excelentefonte de carbohidratos e proteínas. Pela sua grande adaptabilidade edafoclimática éconsiderado pela FAO como o alimento mais importante para a segurança alimentar domundo. O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados diazotróficos nativos do estado doMaranhão com base na habilidade destes em promover o crescimento de plantas. Para isso,foram instalados experimentos em condições gnotobióticas, em vasos e em campo. Foramtestados três isolados representativos de cada grupo, com base na produção de AIA e ARA eque foram inoculados em 10 variedades tradicionais de arroz do estado do Maranhão. Após ainoculação as plantas foram crescidas por 30 dias em solução de Hoaglands em tubos deensaio. Foi observado efeito positivo dos tratamentos de inoculação de alguns isolados napromoção do crescimento das plantas crescidas em condições gnotobióticas. Em vasos foramtestados sete isolados em associação com nove genótipos de arroz. Foi observado efeito dostratamentos de inoculação na produção de massa seca da parte aérea, no rendimento de grãose na massa de mil grãos, sendo que este efeito foi dependente do genótipo da planta. Emcondições de campo foram testados cinco isolados em associação com três genótipos de arroze não foi observado interação entre tratamentos de inoculação e genótipos para os parâmetrosestudados. Entretanto houve efeito simples dos tratamentos de inoculação na produção degrãos, sendo que os isolados Herbaspirillum sp. AR1122 e A. amazonense AR3122apresentaram maior potencial para promover o crescimento das plantas e aumentar a produçãode grãos na cultura do arroz.

42

3.2 Abstract

The rice (Oryza sativa L.) is an important source of carbohydrate and proteins. Due togreat edaphoclimatic adaptability it is considered by FAO as the most important food forsupplying the hungary of the World. The aim of this work was to select native diazotrophicbacteria isolated from soil of the Maranhão State based on their ability to promote growth ofrice plants. Experiments were carrid out in gnotobiotic, pots and field conditions. Isolatesselected based on the production of AIA and ARA were evaluated in association with tentraditional varieties of rice grown in Hoaglands solution for 30 days. A positive effect ongrowth promotion of the plants was observed for some isolates as compared to the non-inoculated plants. Seven isolates were tested in association with nine genotypes of rice grownin pots. The results showed an effect of the inoculation on dry mass production of aerial part,grain yield and mass of thousand grains, and this effect was dependent on the plant genotype.In the field conditions, five isolates were tested with three rice cultivars and no interactionwas observed between the inoculation treatments and genotypes for the studied parameters.Nevertheless, it was observed that among the isolates tested, the Azospirillum amazonenseAR3122 and Herbaspirillum sp AR1122 showed potential to promote growth of rice plantsand to increase the grain yield of this crop.

43

3.3 Introdução

O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância para populaçãomundial. Nos próximos anos, haverá a necessidade de se aumentar à produção mundial dearroz para atender a demanda do crescimento populacional. As práticas agrícolas existentespara atingir este objetivo requerem o uso de grandes quantidades de adubos nitrogenados,uma vez que o nitrogênio é o principal nutriente que limita o crescimento de plantas emmuitos ecossistemas, sendo que a redução do uso destes compostos é um objetivo a seratingido pela agricultura moderna. O nitrogênio molecular (N2) compõe 78% dos gases daatmosfera e pode ser fixado ou transformado em formas mais reduzidas, como NH3, quepodem ser assimiladas pelas plantas por processos biológicos mediados principalmente porbactérias (NEVES e RUMJANEK, 1998).

A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a maior responsável pelo aporte denitrogênio nos sistemas biológicos, contribuindo com cerca de 65% do nitrogênio fixado(NEWTON, 2000), fornecendo o nitrogênio necessário para o desenvolvimento vegetaldiretamente para as plantas por meio de associações, ou quando os organismos morrem e olibera no ambiente (LINDERMAN e GLOVER, 2003). As gramíneas são capazes de associar-se com diversas espécies de bactérias diazotróficas (KENNEDY et al., 2004). Experimentosrecentes têm demonstrado que plantas de arroz podem se beneficiar da associação combactérias diazotróficas, aumentando a produção quando inoculadas (TRAN VAN et al., 2000;GOVINDARAJAN et al., 2008; RODRIGUES et al., 2007).

Existem diferenças consideráveis entre genótipos de arroz quanto à obtenção denitrogênio por meio da FBN (CAMPOS, 1999; BALDANI et al., 2000). No entanto, osfatores envolvidos nestas diferenças não são bem conhecidos. A presença de um alto númerode células bacterianas diazotróficas, associadas às raízes de plantas de arroz, não significa,necessariamente que as plantas sejam beneficiadas com quantidades significativas denitrogênio via FBN (BODDEY et al., 1995). REIS JUNIOR (1998) não observou diferençaentre a população de bactérias diazotróficas presentes em genótipos de cana-de-açúcar ditoseficientes quanto ao potencial de FBN em relação aos não eficientes. Também, CAMPOS(1999) visando identificar genótipos de arroz mais eficientes quanto a obtenção de nitrógeniovia fixação biológica, constatou que não houve diferença na população de bactériasdiazotróficas entre os genótipos considerados eficientes e os ineficientes.

Alguns estudos indicam que a promoção do crescimento em plantas de arroz não estádiretamente associada à fixação biológica de nitrogênio, mas a outros mecanismos (SUTRZ etal., 2000; PENG et al., 2002). A promoção de crescimento pode ser o resultado de diversosmecanismos como indução de resistência a patógenos, aumento da disponibilidade denutrientes pela solubilização de nutrientes minerais precipitados, e/ou produção defitohormônios que induzem a formação de pêlos radiculares adicionais ou raízes laterais,produção de sideróforos e pela fixação de nitrogênio (RODRIGUEZ e FRAGA, 1999;BISWAS et al., 2000; RAMAMOORTHY et al., 2001; GOVINDARAJAN et al., 2008).

Numerosos resultados positivos têm sido obtidos, no aumento da produção de arrozdevido a inoculação com bactérias diazotróficas. No entanto os resultados são inconsistentes eisso tem dificultado a obtenção de um produto comercial (BASHAN, 1998). Isto pode seratribuído, em parte, a fatores ecológicos e ambientais como características físicas e químicasdo solo e capacidade dos microrganismos de se estabelecerem e competirem com acomunidade microbiana nativa (STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000).

O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados diazotróficos nativos do Estado doMaranhão com base na habilidade destes em promover o crescimento de plantas de arroz eaumentar a produção de grãos.

44

3.4 Material e Métodos

3.4.1 Avaliação preliminar das variedades e cultivares utilizadas para seleção deestirpes

Foram utilizadas 17 variedades tradicionais de arroz provenientes de pequenosprodutores de arroz do estado do Maranhão (Tabela 16), sendo cinco com baixo teor deproteína total nos grãos (Cutião, Cana Forte, Pingo D’água, Palha Murcha, Lajeado semPelo), cinco com médio teor de proteína nos grãos (Bacabinha Roxo, Bacaba Comprido, ZebuBranco, Lajeado Liso, Rabo de Burro) e cinco com alto teor de proteína (Cana Roxa, ZebuBranco (caru), Bacabinha, Braquiária e Arroz 70) (ARAÚJO et al., 2003) acrescidas de seiscultivares melhoradas (CNA4899, CNA7553, CNA8172, CNA3490, IR42 e IAC4440). Dadoa necessidade de multiplicar as sementes, para serem utilizadas nos experimentos deinoculação in vitro e em vasos, foi instalado um experimento, em casa de vegetação, em vasoscontendo 4 kg de terra adubada de acordo com o recomendado para a cultura com base naanálise de solo.

Tabela 16. Genótipos de arroz utilizados para a multiplicação de sementes.

Genótipo Teor de proteína Local de origem Procedência

Arroz 70 V. do Mearim Araújo (2003)Bacabinha V. do Mearim Araújo (2003)Cana Roxa Viana Araújo (2003)Manteiga Penalva Araújo (2003)Zebú Branco

Alto (>8%)

Viana Araújo (2003)

Bacaba Comprido V. do Mearim Araújo (2003)Bacabinha Roxo V. do Mearim Araújo (2003)Braquiária V. do Mearim Araújo (2003)Come Cru Vermelho Miranda Norte Araújo (2003)Pingo D’água Viana Araújo (2003)Zebú Branco (Caru)

Médio (7-8%)

V. do Mearim Araújo (2003)

Cana Forte Miranda Norte Araújo (2003)Cutião Viana Araújo (2003)Lajeado sem Pêlo Arari Araújo (2003)Lajeado Liso V. do Mearim Araújo (2003)Palha Murcha Penalva Araújo (2003)Rabo de Burro

Baixo (6-7%)

Penalva Araújo (2003)

Melhoradas

CNA4899CNA7553CNA8172CNA3490

Embrapa Arroz eFeijão

IR42 IRRIIAC4440 IAC

Os vasos foram dispostos inteiramente ao acaso em bancadas em casa de vegetaçãocom quatro repetições. As plantas foram coletadas à medida em que atingiam a fase de

45

maturação das sementes, quando foram separadas em panículas e palha e foram determinadosa produção de matéria seca total, o número de panículas por vaso, a percentagem deespiguetas cheias e estéreis por panícula, a altura das plantas, a massa de mil sementes, o teorde N das sementes e da parte aérea e a proteína bruta das sementes. A percentagem deespiguetas cheias e estéreis por panícula foi determinada em três panículas, apanhadas aoacaso de cada repetição, utilizadon-se o valor médio para cada repetição. A massa de milsementes foi determinada em amostras de 100 sementes de cada repetição e multiplicando-secada valor por 10, a fim de obter a referida massa.

As avaliações dos teores de N foram realizadas na Embrapa Agrobiologia, de acordocom o método proposto por TEDESCO et al. (1995). As amostras da parte aérea das plantasforam colocadas em estufa de circulação forçada a 65oC até peso constante e o material secofoi moído e utilizado para análise de teor de N. Os grãos foram descascados a mão e moídos,amostras de 200 mg de farinha de arroz foram digeridas com ácido sulfúrico e água oxigenadae após a destilação, obteve-se o teor de N. O conteúdo de proteína bruta dos grãos foicalculado pelo teor de N multiplicado pelo fator 5,95. Este fator é baseado no conteúdo denitrogênio (16,8%) da principal proteína do arroz, a glutelina (JULIANO, 1985).

3.4.2 Seleção de estirpes em condições gnotobióticas

Os isolados que apresentaram maior produção de AIA in vitro, foram inoculados, emcondições gnotobióticas, em 10 variedades tradicionais de arroz do Maranhão, sendo cincocom alto teor de proteína bruta (Zebu Branco, Arroz 70, Cana Roxa, Bacabinha, e Braquiária)e cinco com baixo teor de proteína bruta (Cana forte, Come Cru Vermelho, Pingo D’água,Lajeado Liso e Bacaba Comprido) (ARAÚJO et al., 2003). Além disso, foi incluída a cultivarIR42 utilizada como controle. Os ensaios foram conduzidos em tubos de ensaio transparentescom 120 mL de capacidade, contendo 60 mL de solução de Hoaglands, sem nitrogênio, em 6g de agar . L-1 (BALDANI et al., 2000). Foram conduzidos dois experimentos. No primeiro,foram utilizados 10 isolados, sendo três de Herbaspirillum ssp. (VR2117, AR1122 eAR1124), três de Azospirillum ssp. (BR2113, AR1135 e BF1358), três de Azospirillumamazonense (VR218, VF2213 e AR3122) e um de Sphingomonas spp. (AR2112). A estirpeZAE94 de Herbaspirillum seropedicae foi utilizada com controle positivo, além de umtratamento controle inoculado com células mortas de ZAE94. No segundo experimento foramutilizados três isolados de Burkholderia ssp. (BF5327, BF5276 e BF4231), além da estirpeZAE94 e do tratamento controle inoculado com células mortas por autoclavagem.

A inoculação foi realizada antes da solidificação do meio (40 a 45ºC) com 1 mL dacultura líquida de cada estirpe, crescida no meio DYGS por 16 horas contendo 109 célulasmL-1 e o controle foi inoculado com 1 mL-1 células previamente autoclavadas. Antes doplantio, as sementes foram desinfestadas e pré-germinadas em placas de ágar-água (1%), pordois dias a 30°C. Apenas as sementes livres de contaminantes microbianos foram plantadas(BALDANI et al., 2000).

Os tubos com as plântulas foram mantidos em casa de bio-segurança a 25ºC por 30dias. Após este período as plantas foram retiradas do meio e lavadas em água corrente paraeliminar resíduos do meio e postas para secar em papel toalha para retirar o excesso deumidade e determinada a massa fresca. A massa seca foi determinar após as amostras seremlevadas à estufa de circulação de ar forçado a 65ºC por 72 horas.

Os experimentos foram conduzidos no delineamento inteiramente casualizado emesquema fatorial, sendo o primeiro, 11 x 12 (11 genótipos e 12 tratamentos de inoculação) e osegundo, 11 x 5 (11 genótipos e 5 tratamentos de inoculação) ambos com quatro repetições.Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias testadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.

46

3.4.3 Seleção de estirpes em condições de vasos e em campo

3.4.3.1 Experimento em vasos

Os isolados que proporcionaram maior acúmulo de massa seca nas plantas de arroz,quando comparados com o controle positivo ZAE94 foram testados simultaneamente em doisexperimentos de inoculação, um em vasos e outro em campo. O experimento em vasos foiinstalado no dia 20 de janeiro de 2007 na Embrapa Agrobiologia em Seropédica, RJ, e o decampo no dia 08 de fevereiro de 2007 na Embrapa Meio Norte em Teresina, PI.

O experimento em vasos foi instalado em vasos plásticos, pintados externamente comtinta alumínio, contendo 4 kg de terra fina seca ao ar destorroada e peneirada proveniente deum Planossolo série ecologia. Os vasos foram mantidos ao ar livre, entre as casas devegetação, na área experimental da Embrapa Agrobiologia dispostos em blocos ao acaso emesquema fatorial (nove tratamentos de inoculação x nove genótipos) com quatro repetições.Os tratamentos consistiram da inoculação das sementes de cada genótipo com dois isolados deAzospirillum spp.: BR2113 e BF1358; dois de A. amazonense VR218 e AR3122; dois deHerbaspirillum spp. AR1122 e AR1124; e um de Sphingomonas spp. AR2112. A estirpeZAE94 de H. seropedicae foi utilizada como controle positivo, além da testemunhanitrogenada que recebeu 100 kg de nitrogênio na forma de nitrato de amônio dividido em trêsaplicações, sendo, 20 kg ha-1 no início do perfilhamento, 40 kg ha-1, 50 dias após emergênciae 40 kg ha-1 aos 75 dias após emergência.

Uma semana antes do plantio, procedeu-se a adubação com base na análise química dosolo. Os resultados da análise do solo encontram se na Tabela 17. Foi aplicada em cada vasouma dose equivalente a 120 kg de P2O5 ha-1 na forma de superfosfato simples emicronutrientes na dose equivalente a 60 kg de FTE BR-12 ha-1. No início do perfilhamento(25 dias após a emergência) em todos os tratamentos foi aplicada uma solução de NH4NO3 nadose equivalente a 10 kg de N ha-1 e uma de K2SO4 na dose 30 kg ha-1. Posteriormente, aos 50dias após a emergência foi aplicada outra dose de NH4NO3 equivalente a 10 kg de N ha-1.

Tabela 17. Análise química das amostras de solo utilizadas nos experimentos em vasos e decampo.

Solos PH/H2OAl

cmolc dm-3Ca + Mg

Ca

mg dm-3Mg P K

RJ 5,8 0,1 0,7 0,5 0,2 17,3 45,6

PI 6,1 0,1 7,4 5,9 1,5 7,8 310,0

No experimento em vasos foram utilizadas seis variedades tradicionais de arroz doestado do Maranhão, sendo três com alto teor de proteína total nos grãos (Zebu Branco, Arroz70 e Braquiária) e três com e baixo teor de proteína total (Cana forte, Come Cru Vermelho ePingo D’água) (ARAÚJO et al., 2003). Além disso, foram usadas duas cultivaresrecomendadas para o estado do Maranhão (Bonança e Canastra). A cultivar IR42 foi utilizadacomo controle positivo.

As suspensões bacterianas utilizadas no preparo do inoculante foram obtidas a partirde culturas puras crescidas por 16 horas em meio Dygs sob agitação. Após esse período, aconcentração das suspensões foi determinada por meio da densidade ótica emespectrofotômetro com comprimento de onda de 620 nm e foi ajustada para aproximadamente109 células mL-1. O inoculante foi preparado adicionando-se 15 mL da suspensão de cada

47

bactéria, em sacos de polietileno contendo 35 g de turfa (previamente moída, seca, corrigida aacidez e esterilizada). As sementes foram desinfestadas superficialmente com hipoclorito desódio a 1%, por 10 minutos, em seguido, de quatro lavagens com com água destilada estéril ecolocadas para secar em fluxo laminar por duas horas. Estas sementes foram inoculadas,utilizando-se uma proporção de 10 g do inoculante por kg de semente, empregando-se umasolução de goma arábica a 10% para fixar o inoculante às sementes e, em seguida, foramcolocadas para secar à sombra antes da utilização.

Cada vaso foi considerado como uma parcela experimental, onde foram plantadas oitosementes, sendo feito o desbaste após a emergência, deixando-se três plantas uniformes porvaso. No início da fase de florescimento foi retirada uma planta para contagem das bactériasnos tecidos vegetais, mantendo-se duas até o término do ciclo da cultura.

As plantas foram coletadas à medida em que atingiam a fase de maturação dos grãos,sendo cortadas rente ao solo e separadas em panículas e palha. Os seguintes parâmetros foramefetuados as seguintes avaliações: altura das plantas, número de panículas, número de grãospor panícula, massa de 1000 grãos, produção de massa seca da parte aérea e produção degrãos, teor de N da parte aérea e proteína bruta dos grãos.

A altura das plantas foi determinada medindo-se à distância da base da planta até oápice das folhas bandeira com os limbos distendidos, a massa de 1000 grãos foi determinadapesando-se em balança analítica 100 grãos por parcela e multiplicando-se por 10 sendo osresultados corrigidos para 13% de umidade dos grãos. A massa seca da parte aérea foi obtidapela pesagem das amostras após terem secado em estufa de circulação de ar forçada àtemperatura de 65ºC até atingirem peso constante. A produção de grãos foi determinada paracada parcela, corrigida para 13% de umidade expressos em gramas por vaso. As avaliaçõesdos teores de N foram realizadas conforme descrito anteriormente.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadaspelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

3.4.3.2 Experimento em campo

No experimento em condições de campo foram utilizadas duas variedades típicas doMaranhão, sendo uma com alto teor de proteína bruta do grão (Arroz 70) e uma com baixoteor de proteína bruta do grão (Cana Forte), além da cultivar Bonança recomendada para aregião e utilizada como controle. Foram utilizados quatro isolados (AR3122 de A.amazonense, AR1122 de Herbaspirillum spp., BR2113 de Azospirillum spp., AR2112 deSphingomonas spp.), além da estirpe ZAE94 e um controle com 100 kg ha-1 de nitrogêniomineral.

O experimento foi instalado no campo experimental da Embrapa Meio-Norte emTeresina, PI, adotando-se o delineamento experimental em blocos ao acaso, em esquemafatorial (seis tratamentos de inoculação x três genótipos de arroz de sequeiro) com quatrorepetições. Os tratamentos consistiram da inoculação das sementes de cada genótipo com cadauma das bactérias diazotróficas, mais a testemunha nitrogenada. As sementes forammisturadas à turfa na proporção de 109 células por grama de turfa, utilizando-se umaproporção de 10 g do inoculante por kg de semente e, em seguida, secas à sombra antes dautilização. Foram plantadas 100 sementes por metro linear.

Cada parcela ocupou 3 m2 (1,5 x 2 m) com cinco linhas de 2,0 m de comprimentoespaçadas de 0,30 m, sendo a área útil constituída pelas 3 linhas centrais, desprezando-se 0,5m em ambas as extremidades de cada linha.

A adubação foi realizada de acordo com o recomendado para a cultura com base naanálise de solo, aplicando-se 120 kg de P2O5 ha-1 na forma de superfosfato simples e 60 kg deK2O ha-1 na forma de cloreto de potássio no plantio. O nitrogênio (20 kg ha-1) na forma de

48

uréia) foi aplicado em cobertura, 20 dias após a emergência das plantas em todos ostratamentos. Os tratos culturais foram os recomendados para a cultura.

Na ocasião da colheita foram avaliados os seguintes parâmetros: altura das plantas,medindo-se, ao acaso, cinco plantas por parcela, a distância da superfície do solo até o ápicedas folhas bandeira com o limbo destendido; número de panículas, mediante contagem naárea útil de cada parcela; número de grãos por panícula, amostrando-se ao acaso 10 panículasem cada parcela; massa de 1.000 grãos, pesando-se em balança analítica 100 grãos oriundosdas 10 panículas coletadas ao acaso mutiplicado por 10 e os resultados expressos em peso de1.000 grãos e corrigidos para 13% de umidade; produção de massa seca, obtida pela pesagemde amostras de cinco plantas por parcela coletadas ao acaso e colocadas para secar em estufa àtemperatura de 65ºC, até atingirem peso constante. A produção de grãos foi determinada combase na área útil de 1 m2 por parcela, nas quais se determinou o peso e umidade dos grãos,sendo os resultados expressos em Mg ha-1, a 13% de umidade.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadaspelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

3.5 Resultados e Discussão

3.5.1 Avaliação de características agronômicas das variedades e cultivares utilizadaspara a seleção de estirpes

As variedades tradicionais Lajeado Liso, Lajeado sem Pelo e Rabo de Burro,apresentaram um ciclo mais longo (180 dias) e maior produção de matéria seca total e númerode panículas por vaso em relação aqueles de ciclo mais curto (Tabela 18). As variedadestradicionais apresentaram maior altura o que pode favorecer-las na competição com plantasinvasoras, podendo ser uma vantagem no sistema de cultivo de roça em toco, comum noestado do Maranhão. Houve diferença na massa de mil sementes entre os genótipos. Esta éuma variável estável dentro da variedade, porém dependente da translocação de carboidratosque tem sua síntese e remobilização influenciadas pelas condições ambientais. Todos osgenótipos apresentaram uma alta percentagem de espiguetas estéreis (dados não mostrados),embora tenha havido diferença entre estes, isto pode ter ocorrido em função das altastemperaturas observadas durante o período reprodutivo.

Houve diferença significativa para o teor de N na palha e nas sementes e de proteínabruta entre os genótipos estudados (Tabela 19). As variedades de Lajeado (sem Pelo e Liso)apresentaram menor teor de proteína nos grãos, resultados estes que estão de acordo comARAUJO et al. (2003) que observaram menor teor de proteína nos grãos nestas variedades.De um modo geral, as cultivares apresentaram um teor de proteína mais elevado que osobservados por ARAUJO et al. (2003) quando trabalharam com as mesmas variedadesprocedentes do estado do Maranhão. Também FERRAZ JUNIOR et al. (2001) observaramque algumas variedades apresentaram teores diferentes de proteína bruta quando cultivadas noRio de Janeiro ou no Maranhão enquanto que para outras variedades não houve alteraçãoneste parâmetro. Segundo JULIANO (1985), os teores de proteína bruta dos grãos podemvariar muito, devido a mudanças nas condições ambientais, sendo que para o arroz, adisponibilidade de N é um dos principais fatores ambientais que afetam o teor de proteínabruta dos grãos.

49

Tabela 18. Biomassa da parte aérea e número de panículas, número de espiguetas, massa demil sementes, altura das plantas e ciclo em dias de 23 genótipos de arroz cultivados em vaso.

GenótipoBiomassa secade palha (g)

Número depanículas

Número deespiguetas por

panícula

Massa de 1000sementes (g)

Altura dasplantas (cm)

Ciclo(dias)

Cutião 14,35D* 5,25B 68,33C 31,45C 101 120IAC4440 23,23B 10,50A 77,66C 24,88F 80 120IR42 24,89B 9,25A 91,33B 22,45G 81 135Arroz 70 12,85E 6,00B 47,5F 33,86B 91 135Bacabinha 13,88D 4,00C 125,00A 20,65H 112 135Cana Roxa 16,40C 4,25C 85,33B 28,43D 117 135Manteiga 16,37D 4,25C 109,16A 21,82G 107 135Zebu Branco 14,76D 4,00C 95,58B 28,82D 125 135Braquiária 17,78C 4,75C 72,25C 25,22F 121 135Bacaba Comprido 16,94C 5,25B 83,83B 30,98C 120 135Bacabinha Roxo 11,19E 3,00C 94,25B 27,33E 105 135Come Cru Vermelho 15,01D 5,75B 73,00C 30,58C 103 135Pingo D’água 17,10C 6,75B 61,49D 26,26F 118 135Zebu Branco (Caru) 11,72E 3,50C 89,45B 29,45D 118 135Cana Forte 15,35D 4,50C 62,75D 27,52E 106 135Palha Murcha 14,43D 5,00C 65,00C 36,36A 103 135CNA4899 22,93B 10,00A 78,00C 22,36G 75 135CNA7553 22,68B 11,50A 77,66C 22,45G 76 135CNA8172 09,52E 4,50C 73,50C 25,81F 69 135Lajeado Liso 46,58A 10,75A 69,75C 23,55G 115 180Lajeado sem Pelo 46,77A 10,50A 82,16E 21,95G 118 180Rabo de Burro 20,52B 6,00B 105,91A 22,01G 99 180CNA3490 17,63C 7,75B 62,75D 19,69H 70 180C.V. (%) 11,16 9,20 7,5 3,78

* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.

Tabela 19. Teor de N nas sementes e na parte aérea e ter de proteína bruta total de 23genótipos de arroz.

Genótipo Teor de N na semente (%) Teor de N na palha (%) Proteína brutaArroz 70 1,55A* 0,45E 9,24ABacabinha 1,52A 0,452E 9,02ACana Roxa 1,43B 0,42E 8,48BManteiga 1,39B 0,44E 8,27BZebu Branco 1,36B 0,43E 8,08BBraquiária 1,44B 0,38E 8,54BBacaba Comprido 1,34B 0,37E 7,96BBacabinha Roxo 1,42B 0,45E 8,46BCome Cru Vermelho 1,33B 0,36E 7,87BPingo D’água 1,45B 0,35E 8,63BZebu Branco (Caru) 1,34B 0,42E 7,94BCana Forte 1,35B 0,49C 8,04BPalha Murcha 1,38B 0,44E 8,21BCutião 1,42B 0,49E 8,24BLajeado Liso 1,08D 0,79B 6,38CLajeado sem Pelo 1,11D 0,72C 6,61CRabo de Burro 1,39B 0,81B 8,28BCNA4899 1,54A 0,55D 9,14ACNA7553 1,39B 0,49D 8,32BCNA8172 1,68A 0,64C 9,96ACNA3490 1,32B 0,98A 7,82BIR42 1,32B 0,54D 7,82BIAC4440 1,23C 0,58D 7,34BC.V. (%) 7,10 13,61 7,10

* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.

50

3.5.2 Avaliação e seleção de isolados de bactérias diazotróficas em associação comdiferentes variedades de arroz crescidas em condições gnotobióticas

Os resultados obtidos nos experimentos de inoculação em condições gnotobióticas,não mostraram interação entre as estirpes inoculadas e os genótipos das plantas testados(Tabela 20). Embora tenha havido diferença entre as estirpes inoculadas quanto acúmulo dematéria seca pelas plantas, não foi observado efeito positivo da inoculação para os diferentesgenótipos de arroz, sendo observado até efeito negativo na maioria das estirpes inoculadasquando comparadas com o controle não inoculado (Tabela 21). Somente os isolados AR3122de A. amazonense e AR2112 de Sphingomonas spp. não promoveram a diminuição daprodução de matéria seca quando comparados com o controle não inoculado. FERREIRA etal. (2003) também não observaram interação entre estirpes de H. seropedicae ZAE94 e B.brasilensis M130 e as variedades de arroz IR42 e IAC4440 em condições gnotobióticas,embora não tenha sido observado efeito inibitório no crescimento das plantas. Entre 80isolados testados em condições gnotobióticas apenas quatro apresentaram efeito positivo parao crescimento de plantas (BALDANI et al., 2000).

Tabela 20. Acúmulo de massa seca (mg) em 11 genótipos de arroz inoculadas com diferentesisolados bactérias diazotróficas dos gêneros Herbaspirillum e Azospirillum em condiçõesgnotobióticas.

IsoladosCanaRoxa

ZebuBranco

Bacabinha BraquiáriaArroz70

Bacabacomprido

PingoD’água

LageadoLiso

CanaForte

ComeCru

IR42 Média

AR3122 62,3* 52,0 44,7 61,0 58,2 52,0 51,2 52,7 63,0 58,5 51,255,2a

AR2112 55,5 47,0 42,0 51,2 60,7 58,5 47,2 43,0 48,2 55,2 45,5 50,4ab

VR218 57,5 46,5 45,3 50,7 58,0 47,0 47,7 38,0 48,2 50,0 45,5 48,0abVF2213 44,3 51,0 40,7 46,7 54,0 46,2 40,0 27,5 41,5 53,7 41,0 44,0bcBF1358 36,0 37,7 32,7 52,2 51,7 46,5 34,7 24,7 27,7 41,7 48,7 39,5cd

AR1135 33,5 40,5 25,0 37,7 35,2 40,0 36,0 23,0 30,2 40,2 30,0 33,7deAR1124 34,0 28,5 24,7 32,0 42,7 32,0 32,7 15,5 25,7 41,2 31,2 30,9efBR2113 40,7 29,7 13,0 36,0 37,2 37,7 27,2 23,0 35,2 27,5 31,0 30,7ef

VR2117 37,0 25,0 19,7 31,5 35,0 37,2 27,7 24,2 27,7 36,5 23,0 29,5fAR1122 35,5 29,7 27,2 26,5 31,7 38,2 23,2 15,0 31,7 34,2 25,5 28,0fZAE94(controlepositivo)

40,3 41,0 35,7 35,0 43,2 47,3 35,0 31,2 43,2 34,2 38,5 38,6cd

Testemunhaabsoluta

48,5 51,0 48,2 56,7 60,2 50,7 50,0 43,0 42,5 61,5 42,2 50,7ab

Média 43,7AB 39,9AB 33,3CD 43,1AB 47,3A 44,4AB 37,7CD 30,0D 38,7BC 44,5AB 37,5BC

C.V. (%) 28,00

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

O efeito negativo pode ter ocorrido em função do alto número de células utilizadas noinóculo o que pode ter desencadeado uma resposta defensiva da planta. JAMES et al. (2002)observaram que a colonização muito agressiva por H. seropedicae na cultivar IR72 ocasionouuma resposta defensiva da planta à colonização com efeitos negativos ao crescimento vegetal.A resposta da planta ao AIA, liberado por bactérias, pode variar de efeito benéfico a inibitóriodependendo da concentração. Quando a concentração de AIA endógeno nas raízes já seencontra em níveis ótimos para o crescimento, o AIA adicional liberado pelas bactérias podealterar o metabolismo da planta e afetar o crescimento (BARAZANI e FRIEDMAN, 1999).Estes autores observaram que altas concentrações de AIA, produzido por bactérias, inibiram ocrescimento de raízes de alface em condições axênicas.

51

Tabela 21. Acúmulo de massa seca (mg) em 11 genótipos de arroz inoculados com bactériasdiazotróficas do gênero Burkholderia em condições gnotobióticas.

IsoladosCanaRoxa

ZebuBranco

Bacabinha BraquiáriaArroz70

Bacabacomprido

PingoD’água

LageadoLiso

CanaForte

ComeCru

IR42 Média

BF4231 44,0* 36,5 28,3 37,2 49,0 45,2 37,2 33,0 42,7 55,5 38,540,6b

BF5327 36,5 44,5 32,0 40,7 43,5 44,2 38,2 24,2 43,5 48,7 40,7 39,7bBF5276 45,5 36,5 31,7 35,2 54,0 41,0 40,7 34,0 35,0 43,2 34,5 39,2bZAE94(controlepositivo)

40,2 41,0 35,7 35,0 43,2 47,2 35,0 31,2 43,5 34,2 38,5 36,6b

Testemunhaabsoluta

48,5 51,0 48,3 56,7 60,2 50,7 50,0 43,0 42,5 61,5 45,2 50,7a

Média 42,9AB 41,9AB 35,2BC 40,0AB 50,0A 45,7AB 40,2AB 33,1C 41,4AB 48,6A 39,5BC

C.V. (%) 25,06

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Os isolados de A. amazonense e o de Sphingomonas spp. que produziram as maioresquantidades de AIA in vitro, foram aqueles que causaram menor efeito inibitório aocrescimento das plantas, sugerindo que o efeito inibitório não é devido ao AIA produzido,mas sim a outros fatores como, por exemplo, outros fitohormônios. RODRIGUES et al.(2007) não observaram correlação entre a produção de compostos indólicos in vitro e apromoção do crescimento de plantas de arroz das cultivares IR42 e IAC4440 por isolados deA. amazonense quando avaliados em condições gnotobióticas. Os autores observaram aindaque os tratamentos de inoculação para a maioria dos isolados testados apresentaram efeitoinibitório no crescimento de plantas. Também, BACILIO-JIMÉNEZ et al. (2001) observaramefeito inibitório em plantas de arroz inoculadas com Azospirillum brasilense crescidas emcondições gnotobióticas. A resposta da planta à produção de compostos indólicos porbactérias é influenciada pelo genótipo da planta e do microrganismo. JAIN e PATRIQUIN(1985) observaram, em trigo, que as mudanças na ramificação das raízes das plantas foraminfluenciadas por estirpes de Azospirillum spp. e a cultivar de trigo.

A comparação do efeito da inoculação dos diferentes isolados com a estirpe ZAE94,usada como controle positivo, mostrou que houve maior produção de matéria seca nas plantasinoculadas com os isolados de A. amazonense (AR3122, VR218 e BR2113),Sphingomonas spp. (AR2112) e Azospirillum spp. (BF1358) (Tabela 20). Já para os isoladosde Burkholderia spp. (Tabela 21), não foi observado diferença quando comparados com aestirpe ZAE94. Por outro lado, foi constatada entre as variedades de arroz utilizadas, nos doisexperimentos de inoculação em condições gnotobióticas, diferenças no ganho de massa seca(Tabelas 20 e 21). Estas diferenças podem ser em função exclusiva do genótipo das plantasindependentemente dos tratamentos de inoculação.

3.5.3 Experimento de arroz cultivado em vasos com terra e inoculado com isoladospreviamente selecionados

A análise dos dados do experimento realizado em vasos, mostrou que houve interaçãoentre tratamentos de inoculação e os genótipos de arroz no acúmulo de massa seca da parteaérea, rendimento de grãos, número de grãos cheios por panícula e massa de mil grãos(Tabelas 22, 23 e 24). Para estes parâmetros, a resposta das plantas à inoculação combactérias diazotróficas foi dependente do genótipo da planta de arroz. Em arroz, é comum seobservar diferença na FBN entre os genótipos avaliados (SHRESTHA e LADHA, 1996;BALDANI et al., 2000), sugerindo que a associação entre as plantas e as bactérias fixadoras écontrolada pelas plantas. Também, RETHATI et al. (2000) estudando a associação de

52

cultivares de arroz com A. brasilense e H. seropedicae observaram que a inoculação de ambasas bactérias aumentou a massa das raízes das plantas e que este efeito benéfico, devido àinoculação, foi altamente dependente da cultivar.

Tabela 22. Acúmulo de massa seca (g/planta) da parte aérea de nove genótipos de arroz,inoculados com isolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp.(BR2113 e BF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp.(AR2112) em vasos.

IsoladosZebuBranco

Arroz 70 BraquiáriaCanaForte

PingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 9,3ABb* 10,6Aa 6,5CDb 8,6BCb 8,2BCd 7,2BCbc 6,4CDa 8,9ABab 6,0Dbc 7,8VR218 8,5Abc 8,2Abc 6,2Ab 8,4Ab 7,8Ad 8,2Aab 7,1Aa 6,3Ac 7,4Aab 7,6AR1124 8,3ABbc 9,8Aab 5,7Db 8,3ABb 9,4Abc 6,7BCc 5,9CDa 7,1CDbc 4,7Dc 7,5BF1358 7,6ABbc 6,7ABcd 6,2BCb 7,6ABb 8,7Acd 8,2ABbc 5,6Ca 6,5ABc 5,3Cbc 7,0AR2112 6,8Ccd 9,6ABab 6,6Cb 7,8BCb 11,4Ac 6,6Cc 6,3Ca 6,7Cbc 6,1Cbc 7,6AR3122 6,8BCcd 7,7BCbc 7,4BCab 11,7Aa 8,7Bcd 6,5BCc 7,8BCa8,2CDab 6,8BCbc 7,6BR2113 6,1Dd 9,0ABbc 6,7CDab 9,2ABb 10,6Abc 8,4BCbc 6,1Da 6,0Cc 6,2Dbc 7,8ZAE94 (controlepositivo)

8,7Abbc 7,4BCcd 6,0Cb 9,8Aab 9,7ABbc 9,4ABab 6,1Ca 6,3Cc 5,4Cbc 7,7

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

13,6Aba 11,3CDa 9,0DEa 11,8BCa 15,1Aa 10,2Ea 7,9Ea 10,4CDa9,5DEa 11,0

Média 8,4 8,9 6,7 9,2 7,0 7,9 6,5 7,4 6,4C.V. (%) 13,15

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Tabela 23. Produção de grãos (g/vaso) de nove genótipos de arroz, inoculados com isoladosde Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.

IsoladosZebuBranco

Arroz 70 BraquiáriaCanaForte

PingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 5,7BCa* 8,1ABa 6,6BCb 6,6BCab 6,8BCab 6,4BCa 5,8BCab 9,2Aab 4,8Cb 6,7VR218 4,7Ca 6,6ABab 7,6ABab 8,0Aa 6,3ABCb 7,8ABa 5,5BCb 7,6ABb 5,7BCab 6,5AR1124 6,0Aa 7,3Aab 7,1Aab 6,1Aab 6,5Ab 7,2Aa 5,2Ab 7,2Ab 5,2Aab 6,4BF1358 6,8ABa 7,0ABab 7,0ABab 6,0ABab 5,1Bb 6,4ABa 4,8Bb 7,7Ab 5,5ABab 6,3AR2112 6,7ABa 7,2ABab 7,0ABab 5,1Bb 5,6Bb 5,8Ba 5,6Bb 8,7Aab 6,5ABab 6,5AR3122 5,6Ba 6,9ABab 7,6ABab 6,9ABab 5,4Bb 6,5Ba 6,2Bab 9,2Aab 5,8Bab 6,7BR2113 5,4ABa 7,4ABab 6,6ABb 6,3ABab 6,3ABb 7,2ABa 5,1Bb 7,7Ab 6,2ABab 6,5ZAE94 (controlepositivo)

6,1Ba 5,7Bb 7,2ABab 6,9ABab 6,2Bb 6,0Ba 5,4Bb 8,7Aab 5,9Bab 6,5

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

6,5Ca 7,0BCab 9,0Aba 7,3BCab 9,1ABa 6,3Ca 8,1BCa 10,7Aa 7,4BCa 7,9

Média 5,9 7,0 7,3 6,6 6,4 6,5 5,8 8,5 5,7C.V. (%) 15,71

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

53

Tabela 24. Grãos cheios por panícula de nove genótipos de arroz, inoculadas com isolados deAzospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.

IsoladosZebuBranco

Arroz 70 BraquiáriaCanaForte

PingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 71,0Aab* 61,0ABa 43,0BCb 57,3ABab 50,0BCbc46,8BCbc 56,8ABa 36,3Ca 56,0BCa 53,11VR218 52,5Ab 60,8Aa 45,5ABb 64,5Aa 52,5Abc 49,3ABbc 60,0Aa31,8Ba 60,5Aa 53,03AR1124 56,5ABb 53,3ABa 50,5ABab 44,0ABb 59,8Aab 54,0ABbc 53,3ABa 37,0Ba 47,8ABa 50,66BF1358 67,5Aab 51,0ABa 54,5Aab 48,8ABab 52,3ABbc 62,3Aabc48,0ABa 34,0Ba 49,8ABa 52,00AR2112 61,3Ab 61,5Aa 58,8ABab 50,0ABab 41,0BCc 53,0ABbc 47,0BCa 34,3Ca 59,5ABa 51,80AR3122 82,0Aa 51,3BCa 54,3ABab 44,3Cb 69,3ABa 42,8Cc 58,5BCa 39,3Ca 56,3BCa 55,30BR2113 60,3ABb 58,5ABa 52,3ABab 55,5ABab 46,0ABbc 66,5Aab59,0ABa 42,0Ba 53,3ABa 54,91ZAE94 (controlepositivo)

55,3Ab 54,8Aa 58,3Aab 51,0Aab 62,0Aab57,3Aabc

56,0Aa 42,8Aa 50,5Aa 54,19

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

60,3ABb 59,3ABa 68,5Aa 63,5Aab 60,8ABab

73,3Aa

66,8Aa 41,3Ba 60,5ABa 61,55

Média 62,9 56,8 53,9 53,2 54,9 56,1 56,1 38,5 54,9C.V. (%) 20,17

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Para altura de plantas e número de panículas por vaso, não houve efeito dostratamentos de inoculação em nenhum dos genótipos estudados (dados não mostrados).DILEEP et al. (1998) observaram que a inoculação com Pseudomonas fluorescences em arrozcultivado sob condições de campo e em casa de vegetação, aumentou a altura e biomassa dasplantas. Já VALAZCO e CASTRO (1999) observaram que a inoculação de arroz, crescido emcasa de vegetação, com A. brasilense aumentou a altura das plantas avaliada até a fase deiniciação das panículas. No entanto, no final do ciclo da cultura não foi observado efeito dostratamentos de inoculação para este parâmetro.

O maior acúmulo de massa seca da parte aérea para todos os genótipos foi observadocom adubação nitrogenada de 100 kg N ha-1 (Tabela 22). Os isolados AR1122 e AR1124 deHerbasprillum spp., proporcionaram maior produção de massa seca nas variedades Arroz 70 eZebu Branco, enquanto que para as variedades Braquiária e Cana Forte, os isolados VR218 eAR3122 de A. amazonense proporcionaram maior produção de matéria seca com rendimentoigual ou superior à inoculação com a estirpe ZAE94. Na cultivar IR42 os isolados AR1122 deHerbaspirillum spp. e AR3122 de A. amazonense proporcionaram a maior produção de massaseca. Estes dois isolados proporcionaram maior produção massa seca da parte aérea para amaioria dos genótipos testados, embora menor do que a testemunha nitrogenada.

VALAZCO e CASTRO (1999) observaram que a inoculação de arroz com A.brasilense, cultivado em casa de vegetação aumentou a massa seca da parte aérea. Também,BISWAS et al. (2000), estudando rizobactérias promotoras do crescimento de plantas,Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Azospirillum lipoferum e Gluconacetobacterdiazotrophicus, em condições de casa de vegetação, observaram que algumas das estirpes debactérias testadas estimularam o crescimento das plantas (massa seca), sendo o efeito dainoculação dependente das estirpes e variedades das plantas. GUIMARÃES et al. (2003)avaliando plantas de arroz crescidas em casa de vegetação, observaram efeito positivo noacúmulo de massa seca de plantas de arroz da variedade Guarani aos 40 dias após transplantiodas plântulas inoculadas com estirpes de Herbaspirillum e Burkholderia, mas não aos 70 e130 dias após o transplantio.

A análise de produção de grãos mostrou que a inoculação com o isolado AR1122 deHerbaspirillum na variedade Arroz 70 apresentou uma produção de grãos igual à testemunhanitrogenada (Tabela 23). Além disso, o mesmo isolado proporcionou uma produção de grãosigual ou superior àquela proporcionada pela estirpe ZAE94 para todos os genótipos testados.

54

Já a inoculação dos isolados de A. amazonense VR218 e AR3122 resultaram em umaprodução de grãos significativamente maior quando comparada com a estirpe ZAE94, navariedade Cana Forte e nos genótipos Arroz 70 e Bonança respectivamente. Nas variedadesCome Cru e Zebu Branco não houve diferença entre os tratamentos de inoculação paraprodução de grãos e nem destes para a testemunha nitrogenada (100 kg N ha-1) para aprodução de grãos (Tabela 23).

Os efeitos da inoculação de plantas com bactérias diazotróficas nem sempre serefletem em aumento de produção de grãos no campo (PEREIRA et al., 1988).RAMAMOORTHY et al. (2000) observaram que a inoculação de sementes de arroz comAzospirillum aumentou o vigor das plantas, embora isso não tenha se refletido na produção degrãos. Já BISWAS et al. (2000), em condições de casa de vegetação, observaram que ainoculação de sementes de arroz pré-germinadas com estirpes de Rhizobium spp. aumentou avelocidade de emergência, o acúmulo de massa seca nas plantas e proporcionou maioreficiência de absorção de nutrientes. PRADHAN e MOHAN (1998) observaram queinoculação de plantas de arroz com A. brasilense, quando utilizou a metade da doserecomendada de nitrogênio para a cultura do arroz, proporcionou aumento no vigor dasplantas aos 30 e 60 dias após a inoculação e aumento na produção de grãos. Também,GUIMARÃES et al. (2003) observaram aumento de até 25% na produção de grãos navariedade Guarani inoculada com estirpes de Herbaspirillum e Burkholderia, em condiçõesde casa de vegetação e campo.

A análise do número de grãos cheios por panícula mostrou que o isolado AR3122 deA. amazonense aumentou o número de grãos por panícula na variedade Zebu Branco e PingoD’água, quando comparado com os outros tratamentos de inoculação e com a testemunhanitrogenada (Tabela 24). Já nas variedades Cana Forte e Come Cru, esta mesma bactériapromoveu uma redução no número de grãos cheios por panícula. O isolado VR218 de A.amazonense promoveu um maior número de grãos por panícula na variedade Cana Forte,enquanto que nas variedades Braquiária e Come Cru o maior número de grãos por panículafoi obtido com a testemunha nitrogenada (100 kg N ha-1), Em contraste, não houve efeito dostratamentos de inoculação para os genótipos Arroz 70, Bonança, IR42 e Canastra (Tabela 24).

Pode-se observar pelas Tabelas 23 e 24 que as diferenças na produção de grãosocorreram principalmente, em função do número de grãos por panícula. Este efeito pode serclaramente observado na variedade Cana Forte inoculada com o isolado VR218 de A.amazonense. Já o isolado AR2112 de Sphingomonas spp. promoveu uma menor produção degrãos e menor número de grãos por panícula, esta tendência não seja constante claro paratodos os tratamentos.

A análise da massa de mil grãos mostrou que houve efeito da inoculação nos genótiposZebu Branco, Braquiária, e IR42 (Tabela 25). O isolado BR2113 de Azospirillum spp.promoveu o desenvolvimento de grãos mais pesados na variedade Zebu Branco, a estirpeZAE94 na variedade Braquiária e o isolado VR218 de A. amazonense na cultivar IR42. Nosreferidos genótipos, como também, na variedade Come Cru, a massa de mil grãos foi maiornas plantas inoculadas do que na testemunha nitrogenada (100 kg N ha-1). TRAN VAN et al.(2000) observaram que a adubação com 0, 45 e 90 kg N ha-1 não afetou a massa de mil grãos,sendo que a inoculação com Burkholderia vietnamiensis aumentou a massa de mil grãosquando comparado com os tratamentos não inoculados. GOVINDARAJAN et al. (2008)também observaram que a inoculação de G. diazotrophicus, H. seropedicae, A. lipoferum e B.vietnamiensis aumentou o peso de mil grãos em duas cultivares de arroz, sendo que esteparâmetro foi um importante componente de produção. SALA et al. (2007) observaram emtrigo que a inoculação com bactérias diazotróficas, aumentou a massa de 1000 sementes, noentanto, o local de cultivo influenciou a resposta da planta.

55

Tabela 25. Massa de 1000 grãos (g) de nove genótipos de arroz, inoculados com isolados deAzospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),Herbaspirillum sp (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.

Isolados Zebu Branco Arroz 70 BraquiáriaCanaForte

PingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 27,7ABab* 26,4Ba 30,8Aab 27,1Ba 24,7BCa26,9Ba 22,8Ca 21,8Cb 22,8Ca 26,7VR218 27,9ABa 28,0ABa 31,2Aab 26,5Ba 25,0BCa 27,0Ba 22,9BCa 26,6Ba 22,4Ca 26,4AR1124 27,6ABab 26,4BCa 30,9Aab 28,2ABa 24,9Ca 27,5BCa 23,5Ca 24,3CDab 23,2Da 26,2BF1358 28,3ABa 27,0BCa 31,3Aab 27,3BCa 24,4CDa 27,2BCa 23,4Ea 24,7CDab 23,6DEa 26,3AR2112 26,1BCab 25,0BCa 30,8Aab 27,7ABa 23,2CDa 27,5ABa 22,9CDa 23,9CDab 22,2Da 25,5AR3122 28,1ABa 26,6Ba 30,6Aab 27,5ABa 24,9BCa 28,3ABa 22,3Ca 23,1Cb 22,9Ca 26,0BR2113 28,6Aa 26,5BCa 29,8Aab 27,6ABa 24,4CDa 24,0CDa 23,4CDa 23,1Db 23,2CDa 26,2ZAE94 (controlepositivo)

26,8BCab 26,8BCa 32,5Aa 26,7BCa 24,7CDa29,0Ba

23,6CDa 21,9Db 23,0Da 26,1

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

24,3BCb 24,6BCa 28,5Ab 25,3ABa 22,9BCa

22Cb

24,6BCa 21,9BCb 24,3BCa 24,2

Média 27,3 26,4 30,7 27,1 24,2 27,1 23,3 23,5 23,1C.V. (%) 5,99

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Para acúmulo de nitrogênio na biomassa da parte aérea das plantas houve interaçãoentre tratamentos de inoculação e os genótipos de arroz, sendo que o isolado VR218 de A.amazonense se destacou em todos os genótipos testados. Com aumento variando entre 160 a390 %, dependendo do genótipo, em relação a testemunha nitrogenada que recebeu 100 kg denitrogênio ha-1 (Tabela 26). O isolado AR1122 de Herbaspirillum spp. se destacou nosgenótipos Cana forte, Zebu branco e Come cru, com aumento de 150 % no nitrogênioacomulado na biomassa em relação a testetemunha nitrogenada. As cultivares melhoradasBonança e Canastra apresentaram maior acúmulo de N na biomassa com a adubaçãonitrogenada do que os tratamentos de inoculação com exceção da inoculação com o isoladoVR218.

Não houve efeito dos tratamentos de inoculação no acúmulo de proteína nos grãos(Tabela 27), independentemente do genótipo da planta quando comparado com a estirpeZAE94. Somente os grãos provenientes do tratamento testemunha nitrogenada, que recebeu100 kg N ha-1, apresentaram maior teor de proteína. RODRIGUES et al. (2007) nãoobservaram efeito significativo no acúmulo de N nos grãos da cultivar IR42 inoculada comdiferentes isolados de A. amazonense em condições de vasos. Também, FERREIRA et al.(2003) não constataram aumento no acúmulo de N-Toltal nos grãos da cultivar IR42inoculada com H. seropedicae em condições de casa de vegetação, já em condições de campoestes autores observaram aumento de 20% de nitrogênio nos grãos com a inoculação de H.seropedicae na mesma cultivar.

56

Tabela 26. Acúmulo de nitrogênio (%) na biomassa de nove cultivares de arroz inoculadascom isolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 eBF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) emvasos.

IsoladosZebuBranco

Arroz 70 Braquiária Cana FortePingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 0,70ABa 0,43CDb 0,48CDbc 0,56BCb 0,44CDb 0,66ABb 0,38Db 0,46CDb 0,77Ac 0,54VR218 0,84Da 0,98BCa 1,05Ba 0,78Da 0,81Da 1,66Aa 0,75Da 0,85CDa 1,58Aa 1,02AR1124 0,41ABbc 0,37CDb 0,43BCc 0,34Cc 0,35Cbc 0,53Abc 0,32Cb 0,36Cbc 0,5ABde 0,40BF1358 0,38ABbc 0,31ABb 0,37ABc 0,32ABc 0,38ABbc 0,32ABd 0,28Bb 0,34ABbc 0,45Ae 0,35AR2112 0,36BCbc 0,33Cb 0,42ABCc 0,36BCc 0,32Cbc 0,52Abc 0,36BCb 0,32Cbc 0,47ABde 0,38AR3122 0,28Cc 0,32Cb 0,40CDc 0,30Cc 0,29Cc 0,53ABbc 0,29Cb0,33Cbc 0,61Ad 0,37BR2113 0,33Cbc 0,35Cb 0,43BCc 0,30Cc 0,33Cbc 0,63Ab 0,33Cb0,37BCbc 0,51ABde 0,40ZAE94 (controlepositivo)

0,33DEbc 0,30DEb 0,43BCDc 0,31DEc 0,32DEbc 0,56Bbc 0,28Eb0,45BCbc 0,92Ab 0,43

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

0,47CDb 0,38Db 0,60BCb 0,38Cc 0,40Cbc 0,42Ccd 0,67Ba 0,41Cbc 0,96Ab 0,52

Média 0,45 0,42 0,51 0,40 0,40 0,63 0,41 0,43 0,75C.V. (%). 13,15* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Tabela 27. Acúmulo de proteína (%) nos grãos de nove cultivares de arroz inoculadas comisolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 eBF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) emvasos.

IsoladosZebuBranco

Arroz 70 BraquiáriaCanaForte

PingoD’água

ComeCru

Bonança IR42 Canastra Média

AR1122 4,5* 5,9 7,2 6,3 6,4 6,6 8,1 5,62 7,81 6,69bVR218 6,4 6,8 6,6 5,6 5,4 6,2 7,3 6,87 7,11 6,41bAR1124 6,1 6,1 7,2 6,8 5,8 6,0 8,2 5,54 7,11 6,48bBF1358 6,4 5,8 6,7 5,8 6,1 6,1 7,5 5,62 7,42 6,39bAR2112 6,6 6,4 7,3 6,1 5,9 7,2 7,2 5,23 7,30 6,57bAR3122 6,6 6,0 6,9 5,8 6,6 7,1 7,2 5,56 6,81 6,51bBR2113 6,1 5,5 6,9 7,1 6,5 6,4 8,2 5,31 7,27 6,57bZAE94 (controlepositivo)

6,1 5,5 6,1 6,2 6,15,9

8,0 5,367,06

6,25b

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).

8,6 7,3 8,0 7,1 7,8

8,1

9,2 7,33

8,09

7,94a

Média 6,6CD 6,1DE 7,0BC 6,2DE 6,3DE 6,6CD 7,9A 5,8E 7,3ABC.V. (%). 11,16

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si peloteste de Tukey a 5% de probabilidade.

Todas as variedades apresentaram baixo teor de proteína nos grãos, entre 6 e 7%,independentemente dos tratamentos de inoculação. Mesmo as variedades Arroz 70, ZebuBranco e Braquiária, que foram escolhidas por apresentarem alto teor de proteína nos grãos(>8%), contrastando com as variedades Come Cru, Cana Forte e Pingo D’água (6-7%)apresentaram baixo teor de proteína nos grãos, sugerindo que as plantas se desenvolveram emcondições de deficiência de nitrogênio. A diferença entre os genótipos em relação aonitrogênio derivado da fixação biológica pode ser mais evidente em condições de baixo nívelde nitrogênio no solo (PRADHAN e MOHAN, 1998). Este efeito também foi observado porNIEUWENHOVE et al. (2001) estudando a inoculação de plantas de arroz com Azorhizobiumcaulinodans, em combinação com diferentes níveis de sacarose e nitrogênio, em condições decasa de vegetação. Esses autores observaram, pela técnica de diluição isotópica de 15N, quehouve incorporação de N2 fixado na biomassa das plantas inoculadas com A. caulinodans, em

57

condições de baixo nível de nitrogênio (20 kg ha-1) e que, nesta condição, a perda denitrogênio foi menor que em condições de alto nível de nitrogênio (60 kg ha-1).

3.5.4 Avaliação do efeito da inoculação com bactérias diazotróficas em diferentesvariedades de arroz cultivadas em condições de campo

No experimento realizado em condições de campo, a variedade Cana Forte nãocompletou o ciclo devido à falta de chuvas na fase de enchimento dos grãos. Assim, a análisedos dados foi realizada somente com os genótipos Arroz 70 e Bonança. A análise de variânciamostrou que não houve interação entre genótipos e as estirpes inoculadas nas sementes paranenhum dos parâmetros estudados. É possível que seja devido ao efeito residual de adubaçãocom nitrogênio em cultivos anteriores na área, tendo em vista que a produção obtida (mais de3500 kg ha-1) foi muito superior à média nacional para arroz de sequeiro (1500 kg ha-1).

Pode-se observar que houve efeito dos tratamentos de inoculação no rendimento degrãos e no teor de proteína nos grãos sem considerar a testemunha nitrogenada (Tabela 28). Ainoculação com o isolado AR1122 de Hebaspirillum spp. proporcionou uma maior produçãode grãos independentemente do genótipo produzindo 11% a mais que a inoculação com aestirpe ZAE94, apresentando o mesmo teor de proteína nos grãos que a testemunhanitrogenada (Tabela 28). Já a inoculação com o isolado BR2113 de Azospirillum spp. foi otratamento que apresentou a menor produção de grãos, assim como, o menor teor de proteínanos grãos independentemente do genótipo da planta.

Tabela 28. Produtividade de dois genótipos de arroz, submetidas à inoculação com estirpes deAzospirillum amazonense (AR3122), Azospirillum spp. (BR2113), Herbaspirillum spp.(AR1122) e Sphingomonas spp. (AR2112) em condições de campo.

Produção (Kg . ha-1) Biomassa seca (g)/planta Proteína (%)Isolados

Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média

AR1122 4336,2 5061,6 4698,9a 21,8 8,5 15,1 a 8,75 8,25 8,50aAR3122 3562,5 4884,7 4223,4ab 31,5 10,3 20,9 a 8,50 6,75 7,62abAR2112 3006,4 5081,4 4043,9ab 24,8 10,8 17,8a 6,75 7,75 7,25abBR2113 2550,5 4523,1 3536,8b 25,8 7,0 16,4a 6,50 6,50 6,50bZAE94 (controlepositivo) 3362,4 5011,9 4187,7ab 20,5 10,5 15,5a 7,00 6,50 6,75b

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).3931,5 4929,9 4430,7ab 26,5 8,3 17,4a 9,50 7,75 8,62a

Média 3458,3B 4915,4A 25,1A 9,2B 7,83A 7,23AC.V. (%) 14,61 22,22 14,31

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferementre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

A análise de outros parâmetros agronômicos mostrou que a inoculação não afetou onúmero de panículas por m2, a massa de mil grãos e nem o número de grãos por panícula(Tabela 29). Embora não tenha havido diferença significativa para estes parâmetros, adiferença na produção observada entre os tratamentos de inoculação com a bactéria AR1122 eBR2113 pode ter ocorrido em função do maior número de panículas por m2 e do número degrãos por panícula.

Tabela 29. Dados médios de número de panículas por m2, massa de mil grãos e número degrãos por panícula de plantas de dois genótipos de arroz submetidos à inoculação com

58

Azospirillum amazonense (AR3122), Azospirillum spp. (AR2113), Herbaspirillum spp.(AR1122) e Sphingomonas spp. (AR2112) em condições de campo.

Número de panículas m2 Massa de mil grãos Nº de grãos por panículaIsolados

Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança MédiaAR1122 207 226 216a 28,692 24,982 26,837a 73 91 82aAR3122 198 227 212a 25,907 25,067 25,487a 67 85 76aAR2112 170 247 208a 27,497 24,190 25,844a 68 80 74aAR2113 146 243 194a 25,497 25,977 25,640a 73 72 72aZAE94 (controlepositivo) 171 246 209a 29,647 25,317 27,837a 70 80 75a

Testemunha

Nitrogenada

(100Kg/há).175 243 209a 27,737 25,852 26,837a 75 75 75a

Média 178B 239A 27,46A 25,23B 71B 80AC.V. (%) 18,09 7,18 9,12

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferementre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Em aveia, SALANTUR et al. (2005) observaram que o aumento de produção de grãosem função da inoculação com bactérias diazotróficas foi devido ao aumento de panículas porm2 e do número de grãos por panícula. No entanto, GOVINDARAJAN et al. (2008)observaram em arroz que o aumento de produção, também, ocorre em função do aumento namassa de mil grãos.

A fixação biológica de nitrogênio pelas bactérias inoculadas pode não ter sido oprincipal fator que influenciou a resposta das plantas aos tratamentos de inoculação. Outrosfatores podem ter influenciado, tendo em vista que no experimento em condições de vasos,embora tenha ocorrido efeito na produção de grãos e seus componentes, não houve efeito noteor de proteína nos grãos.

Entre os isolados estudados, AR1122 de Herbaspirillum spp. e AR3122 de A.amazonense foram os que se mostraram mais promissores para promover o crescimento deplantas de arroz. Por outro lado, não foi observada relação entre o alto teor de proteína nosgrãos observado para algumas variedades tradicionais de arroz do Maranhão e a fixaçãobiológica de nitrogênio. No entando, novos estudos são necessários para confirmar osresultados.

3.6 Conclusões

Houve efeito positivo da inoculação dependente do genótipo vegetal, nosexperimentos em condições de casa de vegetação e em campo, sendo os isolados VR218 de A.amazonense e AR1122 de Herbaspirillum spp foram os mais promissores.

Não houve relação entre o alto teor de proteína algumas variedades tradicionais dearroz do Maranhão com a fixação biológica de nitrogênio.

59

4 CAPÍTULO III

EFEITO DA INOCULAÇÃO COM BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS NAGERMINAÇÃO E VIGOR DE SEMENTES ARROZ

60

4.1 Resumo

Bactérias diazotróficas são freqüentemente associadas a plantas de arroz, podendopromover a germinação de sementes e o crescimento de plantas. O objetivo deste trabalho foiavaliar a germinação e o vigor de sementes de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas.Para isso, foram instalados dois experimentos em condições de laboratório. No primeiro, doislotes distintos de sementes de arroz da cultivar IAC4440 foram inoculados com oito estirpesde bactérias diazotróficas (Cd, ZAE94, M130, AR2112, BR2113, AR3122, AR1122 eBF1358). No segundo experimento, sementes recém-colhidas da cultivar IR42 e da variedadeZebu Branco, recém-colhidas, foram inoculadas com seis estirpes de bactérias diazotróficas(ZAE94, M130, AR2112, AR3122, AR1122 e BF1358). Além disso, foram utilizados doistratamentos adicionais nos dois experimentos: controle com a turva umedecida com o meio decultivo estéril e sementes não inoculadas. Os resultados mostraram que a inoculação com asbactérias AR1122, M130, BF1358, ZAE94 e AR3122 favoreceu a germinação das sementesde arroz do lote que apresentava menor poder germinativo e maior contaminação por fungos.No segundo experimento, a inoculação com as bactérias diazotróficas favoreceu a velocidadede germinação das sementes das cultivar IR42 e da variedade Zebu Branco, porém nãoproporcionou aumento da germinação das sementes com alto poder germinativo e baixacontaminação por fungos. Testes in vitro mostraram que as estirpes BF1358, M130, AR1122e ZAE94 apresentaram, respectivamente, elevados efeitos antagônicos ao fungo Fusariumspp. isoladas das sementes de arroz.

61

4.2 Abstract

Diazotrophic bacteria are frequently associated whit plant of rice (Oryza sativa), andcould promove the seed germination and the growth of plants. The objective of this work wasto evaluate the rice seeds germination and the vigour as affected by the inoculation withdiazotrophic bacteria. Two experiments were conduced in laboratory conditions. In the first,two lots of rice seeds of cultivar IAC4440 were inoculated with eight strains of diazotrophicbacteria (Cd, ZAE94, M130, AR2112, BR2113, AR3122, AR1122 e BF1358). In the secondstudy, seeds of cultivar IR42 and the variety Zebu Branco, recently harvested were inoculatedwith six strains (ZAE94, M130, AR2112, AR3122, AR1122 e BF1358). In both studies, therewere also two additional treatments (control with the peat soil humidified with a sterilemedium and seeds without no inoculation). The results showed that the inoculation with thebacteria AR1122, M130, BF1358, ZAE94 and AR3122 favoured the germination of rice seedsof the lot stored four years and with low germination and high fungi contamination. In thesecond experiment, the inoculation with the bacteria favoured the speed of seed germinationof cultivar IR42 and the variety Zebu Branco, although it did not increased seeds germinationwith high germination and low contamination by fungi. In vitro experiment showed that thestrains BF1358, M130, AR1122 and ZAE94 produced, respectively, the highest antagonisticeffects against Fusarium sp. isolated from rice seeds.

62

4.3 Introdução

Um numeroso e diverso espectro de bactérias diazotróficas tem sido recentementeisolado de plantas de arroz (ELBELTAGY et al., 2001). Segundo PENG et al. (2002) épossível que muitas destas bactérias associadas às plantas de arroz estejam envolvidas napromoção do crescimento de plantas. A capacidade da população de microrganismospromover o crescimento de plantas envolve mecanismos como a fixação biológica denitrogênio (HAN et al., 2005), a produção de fitohormônios e, ou, a solubilização de fosfato eo aumento na formação de pelos radiculares e, ou, a formação de raízes laterais(RODRIGUEZ e FRAGA, 1999), a inibição do crescimento de fungos e a indução deresistência sistêmica no hospedeiro (BEVIVINO et al., 2005). Atualmente, alguns trabalhostêm sido realizados no sentido de avaliar os aspectos benéficos da associação de plantas combactérias diazotróficas com a germinação de sementes. RAMAMOORTHY et al. (2000)observaram aumento na germinação de sementes de arroz de dois lotes (com alto e baixovigor) inoculadas com Azospirillum lipoferum e Azospirillum brasilense após 14 dias deinstalação. Também, KARTHIKEYAN et al. (2007) avaliando as sementes de Catharanthusroseus, observaram que a inoculação da semente com bactérias diazotróficas (Azospirillumspp. e Azotobacter spp.), isoladas da rizosfera e da raiz desta planta, aumentou a percentagemde germinação, assim como o vigor e o acúmulo de massa seca das plântulas em condiçõesgnotobioticas. Em soja, foi observado que a presença de Methylobacterium spp. estimulou aemissão de raiz primária das plântulas após 5 dias da instalação devido a estimulo hormonal equebra de dormência (KOENIG et al., 2002). Também, BARAZANI e FRIEDMAN (1999)constataram que a maioria das bactérias isoladas da rizosfera de plantas são produtoras defitohormônios. Fitohormônios são essenciais na coordenação de diferentes aspectos dafisiologia de plantas, como germinação de sementes e formação de raízes, dentre outros(RAVEN et al., 2001). ARSEGO et al. (2006) observaram que o tratamento de sementes dearroz com giberelinas proporcionou o desenvolvimento de plântulas com desempenhosuperior. Plântulas vigorosas podem competir mais eficientemente, principalmente emcondições de estresse, por luz, nutrientes e água, influenciando no estabelecimento dapopulação e na produção de grãos (FAROOQ et al., 2006). Assim, a aplicação de bactériasdiazotróficas com o objetivo de melhorar a germinação e o estabelecimento das plantas dearroz, pode ser uma tecnologia de baixo custo e de fácil aplicação. Nesse sentido, o objetivodeste trabalho foi o de avaliar a germinação e o vigor de sementes de arroz, por meio dainoculação com bactérias diazotróficas.

4.4 Material e Métodos

Foram conduzidos dois experimentos no Laboratório de Análise de Sementes daUFRRJ, com sementes de arroz (Oryza sativa L.), no ano 2007. No primeiro experimento,foram utilizados dois lotes de sementes da cultivar IAC 4440, sendo que um delesarmazenado em câmara localizada na Embrapa-CNPAB, com 15ºC e 50% de umidaderelativa do ar por quatro anos (lote 1) e o outro por um ano, nas mesmas condições do lote 1(lote 2). No segundo experimento, foram utilizadas sementes de arroz da cultivar IR42(genótipo 1) e da variedade Zebu Branco (genótipo 2) recém colhidas da área experimental daEmbrapa Agrobiologia, no ano de 2007, em Seropédica, RJ. O delineamento experimentaladotado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial (10 procedimentos de inoculaçãox dois lotes no primeiro experimento e oito procedimentos de inoculação x dois genótipos nosegundo experimento) com quatro repetições. Os tratamentos consistiram da inoculação dassementes com o inoculante a base de turfa empregando as bactérias diazotróficas bem como

63

de um tratamento somente com a turva umedecida com o meio de cultivo estéril, denominadode controle e o outro tratamento, sem o procedimento de inoculação, denominado detestemunha. No primeiro experimento, foram utilizadas, as seguintes estirpes: 1 - Azospirillumbrasilense Cd, 2 - Herbaspirillum seropedicae ZAE94, 3 - Burkholderia brasilensis M130 equatro isoladas da raiz de arroz que apresentaram alta produção de compostos indolicos invitro, em testes prévios, 4 - Sphingomonas spp. AR2112, 5 - A. brasilense BR2113, 6 -Azospirillum amazonense AR3122, 7 - Herbaspirillum AR1122 e 8 - Azospirillum sp.BF1358. No segundo experimento, foram utilizadas 1 - H. seropedicae ZAE94, 2 - B.brasilensis M130, 3 - Sphingomonas spp. AR2112, 4 - A. amazonense AR3122, 5 -Herbaspirillum AR1122 e 6 - Azospirillum sp BF1358.

As suspensões bacterianas foram preparadas a partir de culturas puras crescidas por 16horas em meio Dygs sob agitação. Após esse período, a concentração das células foideterminada por meio da densidade ótica em espectrofotômetro com comprimento de onda de620 nm e foi ajustada para aproximadamente 109 células mL-1. O inoculante foi preparadoadicionando 15 mL da suspensão de cada bactéria, em sacos de polietileno contendo 35 g deturfa (previamente moída, seca, corrigida acidez e esterilizada). Após o preparo, o inoculantefoi mantido em estufa a 30ºC por 24 horas, em seguida, realizou-se a contagem das células emmeio semi-sólido por meio da técnica do Número Mais Provável. O controle consistiu naadição de 15 mL do meio de cultivo estéril em 35 g de turfa.

A inoculação das sementes foi realizada após a desinfestação superficial das sementescom hipoclorito de sódio a 1%, por dez minutos (CHUN et al., 1997) e em seguida, estasforam lavadas por quatro vezes em água destilada estéril e colocadas para secar em fluxolaminar por duas horas. Estas sementes foram inoculadas, utilizado uma proporção de 10 g doinoculante por kg de semente, empregando uma solução de goma arábica a 10% para fixar oinoculante às sementes e, em seguida, colocadas para secar à sombra antes da utilização.

As sementes inoculadas foram submetidas aos testes de germinação e de vigor(primeira contagem de germinação e classificação das plântulas). O teste de germinação foirealizado seguindo as recomendações prescritas nas Regras para Análise de Sementes(BRASIL, 1992). As sementes foram distribuídas em papel germitest previamenteesterilizados e umedecidos com o volume de água 2,5 vezes a massa do substrato. Os rolos depapel com as sementes foram mantidos a 25oC sob 12 horas de luz. As avaliações foramrealizadas aos cinco e aos 14 dias. Em conjunto com este teste foi realizado o teste deprimeira contagem de germinação que constou na determinação da porcentagem de plântulasnormais, verificadas no quinto dia após a instalação do teste também em conjunto, foirealizado o teste de classificação de plântulas. As plântulas normais foram classificadas emfortes e fracas (KRZYZANOWSKI et al., 1999). Os dados obtidos foram transformados emraiz de (x + 0,5) e submetidos à análise de variância. A comparação entre médias foi feita pormeio do teste de Tukey a 5% de probabilidade.

No primeiro experimento, as bactérias que mostraram maior capacidade de inibir ocrescimento de fungos durante o teste de germinação foram submetidos a ensaios contraFusarium spp., que foram os fungos presentes em maior quantidade nas sementes analisadas eque foram isolados durante a realização do teste de germinação. Para isso, foi utilizado ummeio rico (Dygs), colocando-se um disco de ágar de 0,5 cm de diâmetro com crescimentoabundante dos fungos a 1,5 cm da borda da placa e na outra extremidade uma estria dabactéria (MELO et al., 1995), mais um tratamento controle que recebeu apenas o disco comcrescimento do fungo sem presença da bactéria. Após sete dias de incubação a 28°C efotoperíodo de 12 horas, o crescimento micelial foi medido. O delineamento utilizado foi ointeiramente ao acaso com quatro repetições por tratamento. Os dados foram submetidos aanálise de variância, e as médias, comparadas através do teste de Tukey, a 5% deprobabilidade.

64

4.5 Resultados e Discussão

No primeiro experimento, foi constatado que houve interação entre lotes e ostratamentos de inoculação para germinação quando se avaliou o efeito dos tratamentos deinoculação em dois lotes distintos de sementes, que permaneceram armazenadas pordiferentes períodos (Tabela 30). Assim para o lote 1, que estava armazenado por mais tempo ecom menor valor de germinação (58%), houve aumento da germinação das sementessubmetidas aos tratamentos de inoculação com as bactérias AR1122, M130, BF1358, Z94 eAR1122, provavelmente devido a redução da contaminação fúngica, como contatado peladiminuição da percentagem de plântulas anormais deterioradas (Tabela 30).

Tabela 30. Efeito da inoculação com bactérias diazotróficas na percentagem de germinação,plântulas anormais deformadas, plântulas anormais infeccionadas em dois lotes de sementesde arroz cv. IAC 4440.

GerminaçãoPlântulas anormais

deformadasPlântulas anormais

deterioradasTratamentosLote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias

AR1122 89Aa* 96Aa 92 6Abcd 2Aa 4 5Ade 3Aa 4M130 88Aa 93Aa 90 2Acd 3Aa 3 3Ae 0Aa 1BF1358 84Bab 97Aa 91 2Ad 2Aa 2 2Ae 0Aa 1ZAE94 80Bab 96Aa 88 6Abcd 3Aa 4 7Acde 1Ba 4AR3122 67Bcd 98Aa 83 7Abcd 2Aa 4 18Aab 0Ba 9AR2112 66Bde 95Aa 81 9Abcd 1Ba 5 13Aabc 2Ba 7Cd 62Bde 99Aa 81 15Aab 1Ba 8 8Abcd 0Ba 4BR2113 62Bde 93Aa 78 20Aa 3Ba 12 8Abcd 1Ba 4Controle 58Bde 90Aa 74 16Aab 4Ba 10 19Aab 5Ba 12Testemunha 50Be 94Aa 72 12abc 3Ba 7 24Aa 1Ba 12Médias 71 95 9 2 10 1C.V.(%) 4,71 41,64 38,02

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para lotes e minúsculas para procedimento deinoculação) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Pela Tabela 31 e Figura 11 pode-se notar que estas bactérias foram capazes de inibir odesenvolvimento de fungo in vitro, permitindo, assim, que as sementes germinassem melhor.Bactérias diazotróficas associadas as gramíneas têm sido relatadas como importantes agentesno biocontrole de patógenos nestas plantas (CAVAGLIERI et al., 2005; HAN et al., 2005).Bactérias do complexo Burkholderia cepaceae são capazes de colonizar plantas de culturasimportantes como milho, arroz e trigo e são importantes antagonistas de patógenos do solopodendo ser utilizadas em biocontrole contra Fusarium spp. (BEVIVINO et al., 1998, 2005).Para KIM et al. (1998) Sphingomonas spp. são freqüentemente encontradas em sementes dearroz e em outras partes desta planta, podendo ser utilizadas para o controle de patógenos emarroz.

TRAN VAN et al. (2000) observaram que Burkholderia vietnamiensis TVV75 inibe ocrescimento de vários fungos fitopatogênos. Também NANDAKUMAR et al. (2001)demonstraram que apenas uma aplicação de Pseudomonas fluorescens na cultura do arrozinduziu resistência sistêmica contra o fungo Rhizoctonia solani, impedindo o crescimentomiceliano e a incidência da doença. Já SCHLOTER et al. (1997) observaram antagonismo deRhizobium leguminosarum bv trifolii quando inoculado em plantas leguminosas e nãoleguminosas em casa de vegetação.

65

Tabela 31. Inibição de crescimento micelial de Fusarium spp. por bactérias diazotróficasmais controle sem inoculação. Médias de quatro repetições.

Crescimento micelial (cm)Tratamentos

Fusarium sp.Controle 6,4a*H. seropedicae ZAE94 5,3bHerbaspirillum sp. AR1122 5,0bcBurkholderia brasilensis M130 4,5cdAzospirillum spp. BF1358 4,2dC.V.(%) 5,85

* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Figura 11. A) inibição do crescimento micelial de Fusarium spp. por Burkholderia brasilenisM130 e B) controle.

Já, para as sementes do lote 2 que apresentava inicialmente 90% de germinação apósdois anos de armazenamento, não houve efeito dos tratamentos de inoculação na germinaçãoe percentagem de plântulas anormais (deterioradas e deformadas) (Tabela 30). Em relação aavaliação do vigor não foi constatado efeito da aplicação dos tratamentos de inoculação comas bactérias no vigor das sementes do lote 1, avaliado pelo teste primeira contagem degerminação (Tabela 32). Pelo teste de classificação das plantas independentemente do lote, assementes submetidas a inoculação com a bactéria AR3122 apresentaram maior vigor, ou seja,maior percentagem de plântulas normais fortes (bem desenvolvidas). No entanto, LEE et al.(2006) trabalhando com bactérias metilotróficas do gênero Methylobacterium e outrasbactérias (Enterobacter spp. e Burkholderia spp.) diazotróficas constataram que estasbactérias foram capazes de produzir compostos indólicos in vitro e que o tratamento desementes de arroz com estas bactérias favoreceram a germinação e a velocidade degerminação de sementes de arroz. Também, BISWAS et al. (2000), observaram aumento docoleoptilo e da radícula de sementes de arroz inoculadas com estirpes de Rhizobium spp. após120 horas de incubação a 30ºC no escuro. Já RAMAMOORTHY et al. (2000) após remoçãodas sementes contaminadas, observaram que a inoculação de sementes de arroz comAzospirillum spp. aumentou a germinação das sementes de arroz de dois lotes com diferentesníveis de vigor, aos 14 dias, embora isso não tenha se refletido na produção de grãos.

A B

66

Tabela 32. Dados médios, em percentagem, de plântulas normais na primeira contagem degerminação, e de plântulas normais (fortes e fracas) obtidas de dois lotes de sementes de arrozda cv. IAC 4440, após inoculação com bactérias diazotróficas mais os tratamentos testemunhae controle.

Primeira contagem degerminação

Plântulas normais fortes Plântulas normais fracasTratamentos

Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 MédiasAR1122 19Ba* 31Abcd 25 30 52 41abc 56Aab 43Aab 49M130 17Aa 21Ac 19 27 48 38bc 60Aa 43Bab 51BF1358 21Aa 23Abc 22 33 50 42abc 46Aab 42Aab 44ZAE94 26Ba 37Aabc 31 38 65 52ab 43Aab 35Aab 39AR3122 27Aa 30Aabc 29 38 67 53ª 30Ab 26Ab 28AR2112 27Aa 34Aabc 30 29 50 40abc 40Aab 46Aa 43Cd 20Aa 25Abc 22 28 52 40abc 32Aab 43Aab 37BR2113 19Ba 35Aabc 27 25 60 42abc 38Aab 34Aab 34Controle 22Aa 29Aabc 26 25 43 34c 34Bb 47Aa 40Testemunha 19Ba 43Aa 31 23 58 40abc 28Ab 37Aab 32Médias 21 31 29B 55A 40 39C.V. (%) 12,23 10,36 11,21

*Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para lotes e minúsculas para procedimento de inoculação) nãodiferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

No segundo experimento, não houve interação entre tratamentos e genótipos napercentagem de germinação de sementes de arroz, provavelmente devido à baixacontaminação por fungos, como constatados pela percentagem de plântulas anormaisdeterioradas (Tabela 33). No entanto, os tratamentos de inoculação com todas as bactériasaumentaram o vigor, avaliado pelo teste de primeira contagem de germinação, das sementesdo G1 e das sementes do G2 com exceção da bactéria AR2112, este efeito também foiobservado pelo teste de classificação de plântulas, principalmente para as bactérias BF1358 eAR3122 (Tabela 34).

Tabela 33. Dados médios, em percentagem, de germinação e de plântulas anormais(deformadas e deterioradas) obtidas de sementes de dois genótipos de arroz IR42 (G1) e ZebuBranco (G2), após inoculação com bactérias diazotróficas mais os tratamentos controle etestemunha.

GerminaçãoPlântulas anormais

deformadasPlântulas anormais

deterioradasTratamentosG1 G2 Médias G1 G2 Médias G1 G2 Médias

BF1358 99 93 96a* 0 3 2a 0 3 2aAR3122 97 95 96a 2 4 3a 0 3 2aAR1122 96 89 93a 2 7 5ab 0 0 0aZAE94 93 88 91a 7 8 8ab 0 1 1aM130 91 92 92a 8 6 7ab 0 0 0aAR2112 90 91 91a 6 6 6ab 1 1 1aControle 95 86 91a 4 11 8ab 3 3 3aTestemunha 93 88 91a 4 9 7ab 0 4 2aMédias 94 90 4B 7A 1A 2A

C.V.(%) 2,84 45,23 60,86

*Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para genótipos e minúsculas para procedimento de inoculação)não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

67

Tabela 34. Dados médios, em percentagem, de plântulas normais na primeira contagem degerminação e de plântulas normais (fortes e fracas), obtidas de sementes de dois genótipos dearroz IR42 (G1) e Zebu Branco (G2), após inoculação com bactérias diazotróficas mais ostratamentos controle e testemunha.

Primeira contagem degerminação

Plântulas normais fortes Plântulas normais fracasTratamentos

G1 G2 Médias G1 G2 Médias G1 G2 MédiasBF1358 60Aa* 51Aa 56 74Aa 59Ba 67 25Ab 34Aa 30AR3122 57Aab 46Aa 52 61Aabc 57Aa 59 36Abc 38Aa 37AR1122 43Abc 51Aa 47 51Abcd 53Aab 52 45Aab 35Aa 40ZAE94 56Aab 50Aa 53 62Aab 56Aa 59 31Abc 32Aa 32M130 53Aab 48Aa 50 57Aabc 52Aab 55 34Abc 40Aa 37AR2112 40Abc 37Aab 39 62Aab 47B 55 26Bb 44Aa 36Controle 29Ad 36Aab 33 42Ad 44Aab 43 53Aa 42Aa 47Testemunha 32Ad 27Ab 29 46Acd 40Ab 43 47Aab 48Aa 48Médias 45 44 56 51 37 39C.V. (%) 8,22 6,68 9,91

* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para genótipos e minúsculas para procedimento de inoculação)não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

No entanto, em sementes de C. roseus, KARTHIKEYAN et al. (2007) observaram quequando inoculadas com bactérias diazotróficas (Azospirillum spp. e Azotobacter spp.),isoladas da rizosfera e da raiz desta planta, apresentaram maior percentagem de germinação ede vigor. Também em soja, foi observado que a inoculação de sementes comMethylobacterium spp., estimula a emissão de raiz primária do primeiro ao quinto dia dassementes, devido a estímulo hormonal (KOENIG et al., 2002). O efeito na germinação sãoatribuídos à capacidade destes microrganismos em produzir fitohormônios que aumentam aatividade de enzimas como amilases (RAMAMOORTHY et al., 2000). A habilidade deAzospirillum spp. em reduzir os efeitos de déficit de hídrico em sementes de cereais sobestresse osmótico ou salino, também são atribuídos à sua capacidade de produzir giberelinas(CREUS et al., 2004).

4.6 CONCLUSÕES

A inoculação com as bactérias AR1122, M130, BF1358, ZAE94 e AR3112 favoreceua germinação das sementes de arroz com menor poder germinativo e maior contaminação porfungos.

A inoculação com as bactérias diazotróficas favoreceu a velocidade de germinação dassementes das cultivar IR42 e da variedade Zebu Branco, embora não tenha proporcionadoaumento da germinação de sementes com maior poder germinativo e menor contaminação porfungos.

68

5 CONCLUSÕES GERAIS

Foram isoladas bactérias diazotróficas que foram agrupadas de acordo com acaracterização morfológica e pela técnica de ARDRA como pertencentes aos gênerosAzospirillum, Herbaspirillum e Burkholderia.

Foram encontrados isolados bacterianos eficientes na produção de ácido indol-acéticoe capazes de fixar N2, portanto apresentam potencial para promover o crescimento vegetalquando inoculado em plantas.

Houve efeito positivo da inoculação dependentes do genótipo vegetal, nosexperimentos em condições de casa de vegetação e em campo.

Não foi observada relação entre o alto teor de proteína observado em algumasvariedades tradicionais de arroz do Maranhão com a fixação biológica de nitrogênio

Bactérias diazotróficas, principalmente Burkholderia, possuem potencial para controlede patógenos em sementes.

69

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARAUJO, E. S.; SOUZA, S. R.; FERNANDES, M. F. Características morfológicas emoleculares e acúmulo de proteína em grãos de variedades de arroz do Maranhão. PesquisaAgropecuária Brasileira, Brasília, v. 38, n. 11, p. 1281-1288, 2003.

ARSEGO, O.; BAUDET, L.; AMARAL, A. S.; HÖLBIG, L.; PESKE, F. Recobrimento desementes de arroz irrigado com ácido giberélico, fungicidas e polímero. Revista Brasileirade Sementes, Brasília, v. 28, n 2, p. 201-206, 2006.

BACILIO-JIMÉNEZ, M.; AGUILAR-FLORES, S.; DEL VALLE, M. V.; PEÉREZ, A.;ZEPEDA, A.; ZENTENO, E. Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonization ofroots by Azospirillum brasilense. Soil Biology e Bioqhesmestry, Elmsford, v. 33, p. 167-172,2001.

BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D.; SELDIN, L.; DOBEREINER, J. Characterization ofHerbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium.International Journal of Systematic Bacteriology. v. 36, p. 86–93, 1986.

BALDANI, J, I.; CARUSO, L.; BALDANI, V. L. D.; GOI, S. R.; DOBEREINER, J. Recentadvances in BNF with non-legume plants. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 29, n.5/6, p. 911-922, 1997.

BALDANI, J. I.; AZEREDO, M. S.; REIS, V. M.; TEIXEIRA, K. R.; OLIVARES, L.; GOI,S. R.; BALDANI, V. L. D.; DOBEREINER, J. Fixação biológica de nitrogênio emgramíneas: avanços e aplicações. In: SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S., LOPES, A. S.;GUILERRME, L. R. G.; FAQUIN, V.; FURTINI NETO, A. E.; CARVALHO, J. G. (Org.).Inter-relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. Viçosa: SBCS, 1999. p.621-666.

BALDANI, J. I.; REIS, V. M.; TEIXEIRA, K. R. S.; BALDANI, V. L. D. Potencialbiotecnológico de bactérias diazotróficas associativas e endofíticas. In: SERAFINI, L. A.;BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L. (Org.). Biotecnologia: avanços na agricultura e naagroindústria. Caxias do Sul: EDUCS, 2002. p. 195-232.

BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation research ingraminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da AcademiaBrasileira de Ciências, v. 77, n. 3, p. 549-579, 2005.

BALDANI, V. L. D. Efeito da inoculação de Herbaspirillum spp. no processo decolonização e infecção de plantas de arroz e ocorrência e caracterização parcial de umanova bactéria diazotrófica. 1996, 262 f. Tese (Doutorado em Agronomia) – UniversidadeFederal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

BALDANI V. L. D.; DOBEREINER, J. Host-plant specificity in the infection of cereals withAzospirillum spp. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 12, p. 433–439, 1980.

BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; DOBEREINER, J. Inoculation of rice plants with theendophytic diazotrophs Herbapirilum seropedicae and Burkholderia spp. Biology andFertility of soils, Berlin, v. 30, p. 485-491, 2000.

70

BARAZANI, O.; FRIEDMAN, J. Is IAA the major root growth factor secreted from plant-growth-mediating bacteria? Journal of Chemical Ecology, New York, v. 25, n. 10, p. 35-44,1999.

BASHAN, Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture.Biotechnology Advances, v. 16, p. 729–770, 1998.

BEVIVINO, A.; SARROCCO, S.; DALMASTRI, C.; TABACCHIONI, S.; CANTALE, C.;CHIARINI, L. Characterization of a free-living maize-rhizosphere population of Burkholderiacepacia: Effect of seed treatment on disease suppression and growth promotion of maize.FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v. 27, n. 3, p. 225-237, 1998.

BEVIVINO, A.; PEGGION, V.; CHIARINI, L.; TABACCHIONI, S.; CANTALE, C.;DALMASTRI, C. Effect of Fusarium verticillioides on maize-root-associated Burkholderiacenocepacia populations, Research in Microbiology, Paris, v. 156, n. 10, p. 974-983, 2005.

BISWAS, J. C.; LADHA, J. K.; DAZZO, F. B. Rhizobia inoculation improves nutrient uptakeand growth of lowland rice. Soil Science Society and America Journal, v. 64, n. 5, p. 1644-1650, 2000.

BODDEY, R. M.; OLIVEIRA, O. C.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M.; OLIVARES, F. L.;BALDANI, V. L. D.; DOBEREINER, J. Biological nitrogen fixation associated with sugarcane and rice: Contributions and propects for improvement. Plant and Soil, Dordrecht, v.174, p. 195-209, 1995.

BRASIL. Regras para análise de sementes. Brasília: Ministério da Agricultura e ReformaAgrária, Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária, Departamento Nacional de DefesaVegetal, 1992. 365 p.

BRASIL, M. S. Ocorrência e diversidade genética de bactérias diazotróficas endofíticasem diferentes variedades de arroz. 2005, 105 f. Tese (Doutorado em Agronomia) –Unversidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

BRASIL, M. S.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. Ocorrência e diversidade de bactériasdiazotróficas associadas a gramíneas forrageiras do Pantanal Sul Matogrossense. RevistaBrasileira de Ciência do Solo, Brasília, v. 29, p. 179-190, 2005.

CAMPOS, D. V. B. Identificação de genótipos de arroz irrigado com potencial parafixação biológica de nitrogênio. 1999, 94 f. Tese (Mestrado em Agronomia) – UniversidadeFederal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

CANEDO, O. S. V. E. Organização do espaço agrário maranhense até os anos 80:distribuição da terra e atividades agrícolas. São Luís: Ed. Norte Sul, 1993. 125 p.

CASSUCE, F. C. C.; MATTOS, L. B.; GOMES, S. T. Oferta e demanda de produtosagrícolas no Brasil 2008 e 2012. Revista de Política Agrícola, Brasília, v. XV, n. 2, 2006.CAVAGLIERI, L.; ORLANDOA, J.; RODRÍGUEZ, M.I.; CHULZEB, S.; ETCHEVERRY,M. Biocontrol of Bacillus subtilis against Fusarium verticillioides in vitro and at the maizeroot level. Research in Microbiology, Paris, v. 156, p. 748-754, 2005.

71

CHAINTREUIL, C.; GIRAUD, E.; PRIN, Y.; LORQUIN, J.; BÂ, A.; GILLIS, M.;LAJUDIE, P., DREYFUS, B. Photosynthetic Bradyrhizobia are natural endophytes of theAfrican wild rice Oryza breviligulata. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 66, n. 12, p. 5437-5447, 2000.

CHEN, C.; BAUSKE, E. M.; MUSSON, G.; RODRÍGUEZ-CABAÑA, R.; KLOEPPER, J.Biological control of Fusarium on cotton by use of endophytic bacteria. Biological Control,Orlando, v. 5, p. 83-91, 1995.

CHUN, S. C.; SCHNEIDER, R. W.; COHN, M. A. Sodium hypochlorite: Effect of solutionpH on rice seed disinfestation and its direct effect on seedling growth. Plant Disease, SaintPaul, v. 81, p. 821-824, 1997.

CONAB. Acompanhamento de Safra. Disponível em:<http://www.conab.gov.br/download/safra>. Acesso em: 15 jan. 2008.

CREUS, C. M.; SUELDO, R. J.; BARASSI, C. A. Water relations and yield in Azospirillum–inoculated wheat exposed to drought in the field. Canadian Journal of Botany, Ottawa,v. 82, p. 273-281, 2004.

CRUZ, L. M.; SOUZA, E. M.; WEBER, O. B.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J.;PEDROSA, F. O. 16S ribossomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacterial isolatedfrom banana (Musa spp.) e abacaxi (Ananas comosus (L.) Merril). Applied andEnvironmental Microbiology , Washington,v. 67, p. 2375-2379, 2001.

DAS, A. C.; SAHA. D. Influence of diazotrophic inoculations on nitrogen nutrition of rice.Australian Journal of Soil Research, Melbourne, v. 41, n. 8, p. 1543-1554, 2003.

DE DATTA, S. R.; OBCEMEA, W. N.; CHEN, R.Y.; CALABRIO, J. C.; EBANGELISTA,R. C. Effect of water depth on nitrogen use efficiency and N15 balance in lowland rice.Agronomy Journal, Madison, v. 79, p. 210-216, 1987.

DILEEP, C.; KUMAR, B. S. D.; DUBE, H. C. Promotion of plant growth and yield by tworhizoplane fluorescent pseudomonads. Indian Journal of Experimental Biology, New Delhi,v. 36, p. 399-402, 1998.

DOBBELAERE, S.; VANDERLEYDEN, J.; OKON, Y. Plant growth-promoting effects ofdiazotrophs in the rhizosphere. Critical Reviews in Plant Sciences, Boca Raton, v. 22, n. 2,p. 107-149, 2003.

DOBEREINER, J. Biological nitrogen fixation in the tropics: Social and economiccontribuitions. Soil Biology and Biochemistry, Oford, v. 29, n. 5/6, p. 771-774, 1997.

DOBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificarbactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília: Embrapa-SPI, 1995. 60 p.

ELBADRY, M.; GAMAL-ELDIN, H.; ELBANNA, K. Effects of Rhodobacter capsulatusinoculation in combination with graded levels of nitrogen lysimeter experiments. WorldJournal of Microbiology & Biotechnology, Oxford, v. 15, p. 393-395, 1999.

72

ELBELTAGY, A.; NISHIOKI, K.; SATO, T.; SUZUKI, H.; YE, B.; HAMADA, T.; ISAWA,T.; MITSUI, H.; MINAMISAWA, K. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixationby a Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Applied and EnvironmentalMicrobiology , Washington, v. 67, p. 5285-5293, 2001.

EMBRAPA. Origem e História do Arroz. Disponível em:<http://www.cnpaf.embrapa.br/arroz/historia.htm>. Acesso em: 20 set. 2007.

ENGELHARD, M.; HUREK, T.; HUREK, B. R. Preferential occurrence of diazotrophicendophytes, Azoarcus spp., in wild rice species and land races of Oryza sativa in comparisonwith modern races. Environmental Microbiology, Oxford, v. 2, n. 2, p. 131-141, 2000.

ESTRADA-DE LOS SANTOS, P.; BUSTILLOS-CRISTALES, R.; CABALLERO-MELLADO, J. Burkholderia a genus rich in plant-associated nitrogen fixers with wideenvironmental and geographic distribution. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 67, p. 2790-2798, 2001.

FAO. Faostat Agriculture Data. Disponível em:<http://apps.fao.org/pag/collections?subset=agriculture>. Acesso em: 20 jan. 2006.

FAROOQ, M.; BARSA, S. M. A.; WAHID, A. Priming of field-sown rice seed enhancesgermination, seedling establishment, allometry and yield. Plant Growth Regulator,Dordrecht, v. 49, p. 285-294, 2006.

FENG, C.; SHI-HUA, S.; SAN-FENG, C.; YU-XIANG, J. Migration of Azospirillumbrasilense Yu62 from root to stem and leaves inside rice and tobacco plants. Acta BotanicaSinica, Peiping, v. 46, n. 9, p. 1065-1070, 2004.

FERRAZ JUNIOR, A. S. L.; SOUZA, S. R.; STARK, E. M. L. M.; FERNANDES, M. S.Crude protein in rice grown in different environmental conditions. Physiology andMolecular Biology of Plants, New Delhi, v. 7, n. 2, p. 149-157, 2001.

FERREIRA, J. S.; SABINO, D. C. C.; GUIMARÃES, S. L.; BALDANI J. I.; BALDANI V.L.D. Seleção de veículo para o preparo de inoculante com bactérias diazotróficas para arrozinundado. Agronomia, Itaguaí,v. 37, n. 2, p. 6-12, 2003.

FONSECA, J. R.; RANGEL, P. H.; BEDENDO, I. P.; SILVEIRA, P. M.; GUIMARÃES, E.P.; CORANDIN, L. Características botânicas e agronômicas de cultivares e raçasregionais de arroz (Oryza sativa L.) coletadas no Estado do Maranhão. Goiânia: Embrapa-CNPAF-Cernagen, 1982. 42 p. (Boletim de Pesquisa, 1).

GOVINDARAJAN, M.; BALANDREAU, J.; KWON, S. W.; WEON, H. Y.;LAKSHMINARASIMHAN, C. Effects of the inoculation of Burkholderia vietnamensis andrelated endophytic diazotrophic bacteria on grain yield of rice. Microbial Ecology, NewYork, v. 55, p. 21-37, 2008.

GUIMARÃES, E. P.; SANT’ANA, E. P. Sistema de cultivo. In: EMBRAPA ARROZ EFEIJÃO (Org.). A cultura do arroz no Brasil. Goiânia: EMBRAPA, 1999. p. 17-35.

73

GUIMARÃES, S. L.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. Efeito da inoculação de bactériasdiazotróficas endofíticas em arroz de sequeiro, Agronomia, Itaguaí, v. 37, n. 2, p. 25-30,2003.

GUNARTO, L.; ADACHI, K.; SENBOKU, T. Isolation and selection of indigenousAzospirillum spp. from a subtropical island, and effect of inoculation on growth of lowlandrice under several levels of N application. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 28, p.129-135, 1999.

GYANESHWAR, P.; JAMES, E. K.; MATHAN, N.; REDDY, P. M.; REINHOLD-HUREK,B.; LADHA, J. K. Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratiamarcescens. Journal of Bacteriology, Washington, v. 183, n. 8, p. 2634-2645, 2001.

HAN, S. O.; NEW, P. B. Variation in nitrogen fixing ability among natural isolates ofAzospirillum. Microbial Ecology, New York, v. 36, p. 193-201, 1998.

HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W. Characterizationof a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as adiazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens. Systematic andApplied Microbiology , Stuttgart, v. 28, n. 1, p. 66-76, 2005.

HUREK, T.; REINHOLD-HUREK, B.; VAN MONTAGU, M.; KELLENBERGER, E. Rootcolonization and systemic spreading of Azoarcus sp. strain BH72 in grasses. Journal ofBacteriology, Washington, v. 176, p. 1913-1923, 1994.

HUREK, T.; REINHOLD-HUREK, B. Azoarcus sp. strain BH72 as a model for nitrogen-fixing grass endophytes. Journal of Biotechnology, Washington, v. 106, p. 169-178, 2003.

JAIN, D. K.; PATRIQUIN, D. G. Characterization of a substance produced by Azospirillumwhich causes branching of wheat root hairs. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v.31, p. 206-210, 1985.

JAMES, E. K. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field CropsResearch, Amsterdam, v. 65, p.197-209, 2000.

JAMES, E. K.; GYANESWAR, P.; MATHAN, N.; BARRAQUIO, W. L.; REDDY, P. M.;IANNETTA, P. P. M.; OLIVARES, F. L.; LADHA, J. K. Infection and colonization of riceseedlings by the plant growth-promoting bacterium Herbaspirillum seropedicae Z67.Molecular Plant Microbe Interactions, Saint Paul, v. 15, n. 9, p. 894-906, 2002.

JEYABAL, A.; KUPPUSWAMY, G. Recycling of organic wastes for the production ofvermicompost and its response in rice–legume cropping system and soil fertility. EuropeanJournal of Agronomy, Amsterdam, v. 15, n. 3, p. 153–170, 2001.

JULIANO, B. O. Polysaccharides, proteins and lipids of rice. In: JULIANO, B. O. (Org.).Rice: chemistry and technology. 2. ed. Saint Paul: American Association of CerealChemists, 1985. p. 59-175.

74

KAMUNGO, P. K.; RAMAKRISHNAN, B.; RAO, V. R. Placement effect of organic sourceson nitrogenase activity and nitrogen-fixing bacteria in flooded rice soils. Biology andFertility of Soils, Berlin, v. 25, p. 103-108, 1997.

KARTHIKEYAN, B.; JALEEL, C.A.; GOPI, R.; DEIVEEKASUNDARAM, M. Alterationsin seedling vigour and antioxidant enzyme activities in Catharanthus roseus under seedpriming with native diazotrophs. Journal of Zhejiang University, v. 8, n. 7, p. 453-457,2007.

KENNEDY, I. R.; TCHAN, Y. Biological nitrogen fixation in non leguminous field crops:recent advances. Plant and Soil, The Hague, v. 141, p. 93-118, 1992.

KENNEDY, I. R.; CHOUDHURY, A. T. M. A.; MIHA’LY, L. K. Non-symbiotic bacterialdiazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth promotion be betterexploited? Soil Biology & Biochemistry, Elmsford, v. 36, p. 1229-1244, 2004.

KIM, H.; NISHIYAMA, M.; KUNITO, T.; SENOO, K.; KAWAHARA, K.; MURAKAMI,K.; OYAIZU, H. High population of Sphingomonas species on plant surface. Journal ofApplied Microbiology, Oxford, v. 85, n. 4, p. 731-736, 1998.

KOENIG, R. L.; MORRIS, R. O.; POLACCO, J. C. tRNA is the source of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology,Washington, v. 184, p. 1832-1842, 2002.

KRZYZANOWSKI, F. C.; VIEIRA, R. D.; FRANÇA NETO, J. B. Vigor de Sementes:conceitos e testes. Londrina: ABRATES, Comitê de Vigor de Sementes, 1999. 218 p.

KUKLINSKY-SOBRAL, J.; ARAUJO, W. L.; MENDES, R.; GERALDI, I. O.;PIZZIRANIKLEINER, A. A.; AZEVEDO, J. L. Isolation and characterization of soybean-associated bacteria and their potential for plant growth promotion. EnvironmentalMicrobiology , Oxford, v. 6, n. 12, p. 1244-1251, 2004.

KUSS, A. V.; KUSS, V. V.; LOVATO, T.; FLÔRES, M. L. Fixação de nitrogênio e produçãode ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa AgropecuáriaBrasileira, Brasília, v. 42, n. 10, p. 1459-1465, 2007.

LADHA, J. K.; TIROL-PADDRE, A.; DAROY, M. L. G.; PUNZALAN, G.; WATANABE,I. The effect on N2 fixation (C2H2 reducing) activity and plant growth characters of 16wetland rice varieties. Biology and Fertility of Soil, Berlin, v. 5, p. 106-111, 1987.

LADHA, J. K.; REDDY, P. M. Nitrogen fixation in rice systems: state of knowledge andfuture prospects. Plant and Soil, The Hague, v. 252, p. 151–167, 2003.

LEE, H. S.; MADHAIYAN, M.; KIM, C. W.; CHOI, S. J.; CHUNG. K. Y. Physiologicalenhancement of early growth of rice seedlings (Oryza sativa L.) by production ofphytohormone of N2-fixing methylotrophic isolates, Biology and Fertility of Soils, Berlin, v.42, p. 402–408, 2006.

LINDERMANN, W. C.; GLOVER, C. R. Nitrogen fixation by legumes. CooperativeExtension Service - College of Agriculture and Home Economics, Guide A-129, 2003. 4 p.

75

LOWRY, º H.; ROSERBRUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDAL, R. J. Protein measurementwith folin phenol reagent. Journal of biology and chemistry, London, v. 183, p. 265-275,1951.

MALARVIZHI, P.; LADHA, J. K. Influence of available N and rice genotype on associativenitrogen fixation. Soil Science Society and America Journal, Madison, v. 63, p. 93-99,1999.

MANTELIN, S.; TOURAINE, B. Plant growth-promoting bactéria and nitrate avaialbility:impacts on root development and nitrate uptake. Journal of Experimental Botany, Oxford,v. 55, n. 394, p. 27-34, 2004.

MARCHIORO, L. E. T. Produção de ácido indol acético e derivados por bactériasfixadoras de nitrogênio. 2005, 74 f. Tese (Mestrado em Ciências Biológicas) – UniversidadeFederal do Paraná, Curitiba.

MEHNAZ, S.; MIRZA, M. S.; HAURAT, J.; BALLY, R.; NORMAND, P.; BANO, A.;MALIK, K. A. Isolation and 16S rRNA sequence analysis of the beneficial bacteria from therhizosphere of rice. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 47, p. 110-117, 2001.

MEHNAZ, S.; WESELOWSKI, B.; LAZAROVITS, G. Azospirillum canadense sp nov., anitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere. International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology, Reading, v. 57, n. 3, p. 620-624, 2007.

MELO, I. S.; VALARINE, P. J.; FAULL, J. L. Controle biológico de Fusarium solani f. sp.phaseoli por Bacillus subtilis isolado da rizosfera do feijoeiro. Fitopatologia Brasileira,Brasília, v. 20, p. 342, 1995.

MENDEZ DEL VILLAR, P.; DUCOS, A.; FERREIRA, N. L. S.; PEREIRA, J. A.;YOKOYAMA, L. P. Cadeia produtiva de arroz no Maranhão. Brasília: Embrapa MeioNorte, 2001. 136 p.

MOSTAJERAN, A.; AMOOAGHAIE, R.; EMTIAZI, G. The participation of the cell wallhydrolytic enzymes in the initial colonization of Azospirillum brasilense on wheat roots.Plant and Soil, The Hague, v. 291, p. 239–248, 2007.

MULÉ, M. C. Z.; CAIRE, G. Z. C.; CANO, M. S.; PALMA, R. M.; COLOMBO, K. Effect ofcyanobacterial inoculation and fertilizers on rice seedlings and postharvest soil structure.Communications in soil science and plant analysis, New York, v. 30, n. 1/2, p. 97-107,1999.

MUTHUKUMARASAMY, R.; CLEENWERCK, I.; REVATHI, G.; VADIVELU, M.;JANSSENS, D.; HOSTE, B.; GUM, K. U.; PARK, K. D.; SON, C. Y.; SA, T.;CABALLERO-MELLADO, J. Natural association of Gluconacetobacter diazotrophicus anddiazotrophic Acetobacter peroxydans with wetland rice. Systematic and AppliedMicrobiology , Stuttgart, v. 28, p. 277-286, 2005.

MUTHUKUMARASAMY, R.; KANG, U. G.; PARK, K. D.; JEON, W. T.; PARK, C. Y.;CHO, Y. S.; KWON, S. W.; SONG, J.; ROH, D. H.; REVATHI. G. Enumeration, isolation

76

and identification of diazotrophs from Korean wetland rice varieties grown with long-termapplication of N and compost and their short-term inoculation effect on rice plants. Journalof Applied Microbiology , Oxford, v. 102, p. 981-991, 2007.

NANDAKUMAR, R.; BABU, S.; VISWANATHAN, R.; RAGUCHANDER, T.;SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistance in rice against sheath blight disease byPseudomonas fluorescens. Soil biology and biochemistry, Elmsford, v. 33, p. 603-612,2001.

NEVES, M. C. P.; RUMJANEK, N. G. Ecologia das bactérias diazotróficas nos solos. In:MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Org.). Ecologia Microbiana . Jaguariúna: EMBRAPA-CNPMA, 1998. p. 15-60.

NEWTON, W. E. Nitrogen fixation in perspective. In: NITROGEN FIXATION: FROMMOLECULES TO CROP PRODUCTIVITY, 12., 1999, Foz do Iguaçu. Proceeding . Foz doIguaçu: Klumer Academic Publishers, 2000. p. 3-8

NIEUWENHOVE, C. V.; VAN HOLM, R. M. L.; VLASSAK, K. Dinitrogen fixation activityof Azorhizobium caulinodans in the rice (Oryza sativa L.) rhizosphere assessed by nitrogenbalance and nitrogen-15 dilution methods. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 33, n. 1,p. 25-32, 2001.

OLIVARES, F. L.; BALDANI, V. L. D.; REIS, V. M.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J.Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. in roots, stems, and leaves,predominantly of Gramineae. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 21, p. 197-200, 1996.

OLIVEIRA, E. Estudo da associação entre bactérias diazotróficas e arroz. 1992, 96 f.Tese (Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Itaguaí.

OLIVEIRA, F. L. M.; URQUIAGA, S.; BALDANI, J. I. Processos e mecanismosenvolvidos na influência de microrganismos sobre o crescimento vegetal. Seropédica:Embrapa Agrobiologia , 2003. v. 1, 40 p.

PATRIQUIN, D. G.; DÖBEREINER, J., JAIN, D. K. Sites and processes of associationbetween diazotrophs and grasses. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 29, p. 900-915. 1983.

PENG, G.; WANG, H.; ZHANG, G.; HOU, W.; LIU, Y.; WANG, E. T.; TAN, Z.Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Reading, v. 56, n. 6,p. 1263-1271, 2006.

PENG, S.; BISWAS, J. C.; LADHA, J. K. Influence of rhizobial inoculation onphotosynthesis and grain yield of rice. Agronomy Journal, Madison, n. 94, p. 925-929, 2002.

PEREIRA, J. A. R. A Cultura do arroz no Brasil: Subsídios para sua história. Brasília:Embrapa Meio Norte, 2002. 226 p.

77

PEREIRA, J. A. R.; CAVALCANTE, V. A.; BALDANI, J. I.; DOBEREINER, J. Fieldinoculation of sorghum and rice with Azospirillum spp. and Herbaspirillum seropedicae,Plant and Soil, The Hague, v. 110, p. 269-274, 1988.

PERIN, L. Estudo da comunidade de bactérias diazotróficas do gênero Burkholderia emassociação com cana-de-açúcar e descrição de Burkholderia silvatlantica. 2007, 88 f. Tese(Doutorado em Agronomia) – Unversidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

PRADHAN, S.; MOHAN, J. Response of cereals to Azospirillum brasilense. Indian Journalof Agricultural Science, New Delhi, v. 68, n. 10, p. 701-703, 1998.

RADWAN, T. E. S.; DESOUK, E.; MOHAMED, Z. K.; REIS, V. M. Efeito da inoculação deAzospirillum e Herbaspirillum na produção de compostos indólicos em plântulas de milho earroz. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 39, n. 10, p. 987-994, 2004.

RAMAMOORTHY, K.; NATARAJAN, N.; KILLIKULAM, T. N. A . U.; VALLANAD, P.O. Seed biofortification with Azospirillum spp. for improvement of seedling vigour andproductivity in rice (Oryza sativa L.). Seed Science and Technology, Zurich, v. 28, n. 3, p.809-815, 2000.

RAMAMOORTHY, V.; VISWANATHAN, R.; RAGUCHANDER, T.; PRACKASAM, V.;SAMIYAPPAN, R. Induction of systemic resistence by plant growth promoting rhizobacteriain crop plants against pests and diseases. Crop Protection, Guildford, v. 20, n. 1, p. 1-20,2001.

RAO, V. R.; JENA, P. K.; ADHYA, T. K.; Inoculation of rice with nitrogen – fixing bactéria– problems and perspectives. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 26, p. 4-21, 1998.

RAVEN, P. H.; EVERT, R. F.; EICHHORN, S. Regulando o crescimento e odesenvolvimento: os hormônios vegetais. In: RAVEN, P.H. (Org.). Biologia Vegetal. 6. ed.Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. p. 649-675.

REDDY, P. M.; LADHA, J. K.; SO, R. B.; HERNANDEZ, R. J.; RAMOS, M. C.;ANGELES, O. R.; DAZZO, F. B.; BRÜIJIN, F. J. Rhizobial communication with rice roots:induction of phenotypic changes, mode of invasion and extent of colonization. Plant andSoil, The Hague, v. 194, p. 81-98, 1997.

REINHOLD-HUREK, B.; HURECK, T.; CLAEYSSENS, M.; VAN-MONTASU, M.Cloning expression in Escherchia coli and Characterization of cellulolytic enzyrnes ofAzoarcus sp. Journal of Bacteriology, Washington, v. 175, p. 7056-7065, 1993.

REINHOLD-HUREK, B.; HUREK, T. Interactions of gramineous plants with Azoarcus spp.and other diazotrophs: identification, localization, and perspectives to study their function.Critical Review in Plant Science, Boca Raton, v. 17, p. 29-54, 1998.

REIS JUNIOR, F. B. Influência do genótipo da planta, micropropagação e fertilizaçãonitrogenada sobre a população de bactérias diazotróficas em cana-de-açúcar(Saccharum spp.). 1998, 120 f. Tese (Mestrado em Agronomia) – Universidade FederalRural do Rio de Janeiro, Seropédica.

78

REIS JUNIOR, F. B.; SILVA, M. F.; TEIXEIRA, K. R. S.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M.Identificação de isolados de Azospirillum amazonense associados a Brachiaria spp., emdiferentes épocas e condições de cultivo e produção de fitormônio pela bactéria. RevistaBrasileira Ciência do Solo, Campinas, v. 28, p. 103-113, 2006.

REIS JUNIOR, V. M.; ESTRADA-DE LOS SANTOS, P.; TENORIO-SALGADO, S.;VOGEL, J.; STOFFELS, M.; GUYON, S.; MAVINGUI, P.; BALDANI, V. L. D.; SCHMID,M.; BALDANI, J. I.; BALANDREAU, J.; HARTMANN, A.; CABALLERO-MELLADO, J.Burkholderia tropica sp. nov., a novel nitrogen-fixing, plant-associated bacterium.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Reading, v. 54, p.2155-2162, 2004.

RETHATI, B.; DALLMANN, K.; SIMON, I. K.; BALINT, A. Characterization of hungarianrice cultivars in nitrogen fixing associations with bacteria. Cereal research communications,Szeged, v. 28, p. 9-16, 2000.

RODRIGUES, E. P.; RODRIGUES, L. S.; OLIVEIRA, A. L. M.; BALDANI, V. L. D.;TEIXEIRA, K. R. S.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M. Azospirillum amazonense inoculation:effects on growth, yield and N2 fixation of rice (Oryza sativa L.). Plant and Soil, The Hague,v. 20, p. 35-48, 2007.

RODRIGUES, L. S. Estudo da diversidade de bactérias diazotróficas endofiticasassociadas a cultivares de arroz inundado. 2003, 85 f. Tese (Doutorado em Agronomia) –Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.

RODRIGUES, L. S.; BALDANI, V. L. D.; REIS, V. M.; BALDANI, J. I. Diversidade debactérias diazotróficas endofíticas dos gêneros Herbaspirillum e Burkholderia na cultura doarroz inundado Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41, n. 2, p. 275-284, 2006.

RODRIGUEZ, H.; FRAGA, R.; Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growthpromotion. Biotechnology Advances, New York, v. 17, n. 3/4, p. 319-339, 1999.

RONCATO-MACCARI, L. D. B.; RAMOS, H. J.O.; PEDROSA, F. O.; ALQUINI, Y.;CHUBATSU, L. S.; YATES, M. G.; RIGO, L. U.; STEFFENS, M. B. R.; SOUZA, E. M.Endophytic Herbaspirillum seropedicae expresses nif genes in gramineous plants. FEMSMicrobiology Ecology, Amsterdam, v. 45, p. 39-47, 2003a.

RONCATO-MACCARI, L. D. B.; RAMOS, H. J. O.; PEDROSA, F. O.; ALQUINI, Y.;CHUBATSU, L. S.; YATES, M. G.; RIGO, L. U.; STEFFENS, M. B. R.; SOUZA, E. M.Root colonization, systemic sprieading and contribuition of Herbaspirillum seropedicae togrowth of rice seedling. Symbiosis, Philadelphia, v. 35, p. 261-270, 2003b.

ROTHBALLER, M.; SCHMID, M.; HARTMANN, A. In situ localization and PGPR-effectof Azospirillum brasilense strains colonizing roots of different wheat varieties. Symbiosis,Philadelphia, v. 34, p. 261–279, 2003.

SALA, V. M. R.; CARDOSO, E. J. B. N.; FREITAS, J. G.; SILVEIRA, A. P. D. Resposta degenótipos de trigo à inoculação de bactérias diazotróficas em condições de campo. PesquisaAgropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, n. 6, p. 833-842, 2007.

79

SALANTUR, A.; OZTURK, A.; AKTEN, S.; SAHIN, F.; DONMEZ, F. Effect of inoculationwith non-indigenous and indigenous rhizobacteria of Erzurum (Turkey) origin on growth andyield of spring barley. Plant and Soil, The Hague, v. 156, p. 275-147, 2005.

SAMBROOK, R.; RUSSEL, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. 3 ed. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. v. 3.

SARVAR, M.; KREMER, R.J. Determination of bacterially derived auxins using a microplatemethod. Letters of Applied Microbiology , Oxford, v. 20, p. 282-285, 1995.

SCHLOTER, M.; WIEHE, W.; ASSMUS, B.; STEINDL, H.; BECK, H.; HOFLICH, G.;HARTMANN, A. Root colonization of different plants by plant-growth-promoting Rhizobiumleguminosarum bv. trifolii R39 studied with monospecific polyclonal antisera. Applied andEnviromental Microbiology , Oxford, v. 63, p. 2038-2046, 1997.

SHRESTHA, R. K.; LADHA, J. K. Genotypic variation in promotion of rice dinitrogenfixation as determied by nitrogen-15 diluation. Soil Science Society of American Journal,Madison, v. 60, p. 1815-1821, 1996.

SINGH, R. K.; MISHRA, R. P. N.; JAISWAL, H. K.; KUMAR, V.; PANDEY, S. P.; RAO,S. B.; ANNAPURNA, K. Isolation and identification of natural endophytic Rhizobia fromrice (Oryza sativa L.) through rdna pcr-rflp and sequence analysis. Current Microbiology ,New York, v. 52, p. 117–122, 2006.

STEENHOUDT, O.; VANDERLEYDEN, J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixingbacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects.FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v. 24, p. 487-506, 2000.

STOLTZFUS, J. R.; SO, R.; MALARVITHI, P. P.; LADHA, J. K.; BRUIJN, F. J. Isolation ofendophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice withbiologically fixed nitrogen. Plant and soil, The Hague, v. 194, p. 25-36, 1997.

SUTRZ, A. V.; CHRISTIE, B. R.; NOWAK, J. Bacterial endophytes: potential role indeveloping sustainable system of crop production. Critical Review in Plant Science, BocaRonta, v. 19, p. 1-30. 2000.

TEDESCO, J. M.; GIANELLO, C.; BOHNEN, H.; VOLKWEISS, S. J. Análise de solos,plantas e outros materiais. Porto Alegre: UFRGS, 1995. 174 p.

TRAN VAN, V.; BERGE, O.; KE, S. N.; BALANDREAU, J.; HEULIN, T. Repeatedbeneficial effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensis on early andlate yield components in low fertility sulphate acid soils of Vietnã. Plant and Soil, TheHague, v. 218, p. 273-284, 2000.

VALAZCO, A., CASTRO, R. Estudio de la inoculación de Azospirillum brasilense en elcultivo del arroz (variedad A’82) en condiciones de macetas. Cultivos Tropicalis, v. 20, n. 1,p. 5-9, 1999.

80

VANDAMME, P.; GORIS, J.; CHEN, W. M.; VOS, D. P.; WILLEMS, A. Burkholderiatuberum sp. nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes.Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v. 25, p. 507-512, 2002.

WALKER, P.; FRANCINE, M.; PRAYITNO, J.; ROLFE, B. G.; WEINMAN, J. J.;HOCART, C. H. Infection process and the interaction of rice roots with rhizobia. Journal ofExperimental Botany, Oxford, v. 58, n. 12, p. 3343-3350, 2007.

XIE, C. H.; YOKOTA, A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolatedfrom the roots of the rice plant Oryza sativa. International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology , Reading, v. 55, n. 4, p. 1435-1438, 2005.

YKOYAMA, P. L.; RUCATT, G. E.; KLUTHOCOUSKI, J. Economia da produção:conjuntura, mercado e custos. In: VIEIRA, N. R. A.; SANTOS, A. B.; SANT’ANA, E. P.(Org.). A cultura do arroz no Brasil. Brasília: Embrapa Arroz e Feijão, 1999. p. 36-57.

YOUNG, J. P. W.; DOWNER, H. L.; EARDLY, B. D. Philogeny of phototrophic strain BTAi 1 by plymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA segment. Journal ofBacteriology, Washington, v. 173, p. 2271-2277, 1991.

ZHU, G. Y.; DOBBELARE, S.; VANDERLEYDEN, J. Use of green protein to visualize riceroot colonization by Azospirillum irakense and A. brasilense. Functional Plant Biology,Victoria, v. 29, n. 11, p. 1279-1285, 2002.

81

ANEXOS

Anexo A. Resumo da análise de variância para os dados de produção de compostos indólicospor isolados de Azospirillum spp., isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA) de três variedadesde arroz crescidas em solo provenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B=Bacabal e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.

Anexo B. Resumo da análise de variância para os dados de de produção de compostosindólicos por isolados de Azospirillum amazonense, isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA)de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de duas localidades noMaranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.

Anexo C. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo massa seca da parteaérea, número de panículas, % de sementes chochas e cheias por panículas massa de milsementes de 23 genótipos de arroz.

Anexo D. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11variedades de arroz inoculadas com diferentes isolados de bactérias diazotróficas dos gênerosHerbaspirillum e Azospirillum.

Anexo E. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11variedades de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas do gênero Burkholderia.

Anexo F. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca da parteaérea (MSP), altura de plantas (Altura), produção de grãos (Produção), número de panículapor vaso (NPAN), número de sementes por panícula (NSP), massa de 1000 grãos (MMS) eacúmulo de proteína em diferentes genótipos de arroz inoculados com bactérias diazotróficasem condições de vaso.

Anexo G. Resumo da análise de variância dos dados de acúmulo de massa seca da parteaérea, produção de grãos, altura de plantas, numero de panículas por m2 e número de grãospor panícula de dois genótipos de arroz submetidas à inoculação com diferentes bactériasdiazotróficas em condições de campo.

Anexo H. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementesde dois lotes arroz da cultivar IAC 4440, em função de distintos procedimentos de inoculaçãocom bactérias diazotróficas.

Anexo I. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementesde arroz das cultivares IR42 e Zebu branco, em função de distintos procedimentos deinoculação com bactérias diazotróficas.

Anexo J. Resumo da análise de variância para os dados de inibição do crescimento micelialde Fusarium sp. causado por bactérias diazotróficas.

Anexo K. Todos os isolados de bactérias diazotróficas obtidos de amostras de soloproveniente de três municípios do estado do Maranhão.

82

Anexo A. Resumo da análise de variância para os dados de produção de compostos indólicospor isolados de Azospirillum spp., isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA) de três variedadesde arroz crescidas em solo provenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B=Bacabal e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.

Quadrado médioFontes de variação GL

Mg/mL µM/µg

Isolado 38 11238.072921** 0.315119**

Resíduo 199 240.797633 0.066094**

C.V. (%) 32,57 96,15

** significativo a 1%.

Anexo B. Resumo da análise de variância para os dados de de produção de compostosindólicos por isolados de Azospirillum amazonense, isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA)de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de duas localidades noMaranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.

GL Quadrado médioFontes de variação

Mg/mL µM/µg

Isolado 38 20421.418329** 0.632864**

Resíduo 199 369.097874 0,222116

C.V. (%) 13,90 76,21

** significativo a 1%.

83

Anexo C. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo massa seca da parteaérea, número de panículas, % de sementes chochas e cheias por panículas massa de milsementes de 23 genótipos de arroz.

Quadrado médio

Fontes devariação

GL Massa seca(g/ planta)

AlturaNo de panícula

por plantaNo de grãos por

panículaMassa de

1000 grãos

Teor de Nna parteaérea

Proteína

Trat. 22 364,2299** 1295,6375** 28,54249** 1618,91666** 0,795675** 0,10602** 2,430636**

Resíduo 69 4,594573 15,880627 1,387681 234,446970 0,009840 0,005081 0,338808

C.V. (%) 11,16 3,78 18,46 20,20 3,78 13,61 7,10

** significativo a 1%.

Anexo D. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11variedades de arroz inoculadas com diferentes isolados de bactérias diazotróficas dos gênerosHerbaspirillum e Azospirillum.

Quadrado médioFontes de variação GL

PS

Variedade (V) 11 0,003901**

Isolado (I) 10 0,001319**

V x I 110 0.000084ns

Resíduo 396 0,000110

C.V. (%) 28,00

** significativo a 1%.

84

Anexo E. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11variedades de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas do gênero Burkholderia.

Quadrado médioFontes de variação GL

PS

Variedade (V) 11 0,001118**

Isolado (I) 10 0,000517**

V x I 110 0.000083ns

Resíduo 396 0,000110

C.V. (%) 25,06

** significativo a 1%.

Anexo F. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca da parteaérea (MSP), altura de plantas (Altura), produção de grãos (Produção), número de panículapor vaso (NPAN), número de sementes por panícula (NSP), massa de 1000 grãos (MMS) eacúmulo de proteína em diferentes genótipos de arroz inoculados com bactérias diazotróficasem condições de vaso.

Quadrado médioFontes devariação GL

MSR MSP Altura Produção NPAN NSP MMS Proteína

Bloco 3 18,003501** 0,529855ns 153,11214** 2,584080ns 1,887860ns 128,92489ns 2,39551ns 0,594537ns

Isolado (I) 8 33,272863** 154,6017** 58,80729ns 8,754631** 3,540223** 365,8194** 16,22414** 8,84220**

Variedade (V) 8 69,094772** 90,17337** 9263,0937** 27,212956** 171,2831** 1646,4513** 231,5199** 14,84599**

I x V 64 5,812919** 31,83595** 34,38541ns 2,109089** 1,310089ns 187,5503** 4,766668** 0,68446ns

Resíduo 240 2,519817 24,333430 35,310185 1,111310 1,077160 82,725309 2,394498 0,551651

C.V. (%) 16,33 13,15 7,20 15,71 20,17 16,82 5,99 11,16

ns = não significativo; ** significativo a 1%.

85

Anexo G. Resumo da análise de variância dos dados de acúmulo de massa seca da parteaérea, produção de grãos, altura de plantas, numero de panículas por m2 e número de grãospor panícula de dois genótipos de arroz submetidas à inoculação com diferentes bactériasdiazotróficas em condições de campo.

Quadrado médio

Fontes de variação GL Massa seca porplanta

Rendimento AlturaNo de panículas

m2No de grãos por

panícula

Bloco 3 95,225775** 5528,815746ns 1456,6600** 4674,243056ns 1618,916667**

Isolado (I) 5 32,752547ns 12256,036007* 62,388889ns 451,720833ns 87,833333ns

Variedades (V) 1 3048,301880** 254809,780724** 8809,387222** 44469,18750** 1064,083333*

I x V 5 35,048186 3794,03030ns 90,459222ns 1826,58750ns 141,433333ns

Resíduo 33 14,490866 3740,862637 154,724275 1421,136995 234,446970

C.V. (%) 22,22 14,61 9,12 18,09 20,20

ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.

Anexo H. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementesde dois lotes arroz da cultivar IAC 4440, em função de distintos procedimentos de inoculaçãocom bactérias diazotróficas.

Quadrado médio

Fontes devariação

GLGerminação

Plântulasanormais

deformadas

Plântulasanormais

infeccionadas

Sementesmortas

Primeiracontagem degerminação

Plântulasnormais fortes

Plântulasnormais fracas

Estirpes (E) 9 1,459606** 2,636889** 4,390853** 2,420739** 1,153397** 1,555268** 2,698348**

Lotes (L) 1 37,637110** 37,092876** 70,645701** 56,202042** 16,394438** 79,653908** 0,055768ns

E x L 9 1,254174** 2,467298** 2,563969** 1,306347* 0,821066* 0,487190ns 1,277952*

Resíduo 60 0,183121 0,780498 0,61110 0,542014 0,383565 0,439807 0,496366

C.V. (%) 4,71 41,64 38,02 33,70 12,23 10,36 11,21

ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.

86

Anexo I. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementesde arroz das cultivares IR42 e Zebu branco, em função de distintos procedimentos deinoculação com bactérias diazotróficas.

Quadrado médio

Fontes devariação

GLGerminação

Plântulasanormais

deformadas

Plântulasanormais

infeccionadas

Sementesmortas

Primeiracontagem degerminação

Plântulasnormais fortes

Plântulasnormaisfracas

Estirpes (E) 7 0,126722ns 2,680404* 0,214286ns 0,613941ns 4,426993** 2,480723** 2,243566**

Variedade (V) 1 0,701823** 6,166821* 0,12500ns 3,202415ns 0,004760ns 2,298822** 0,476776ns

E x V 7 0,0733330ns 0,725202ns 0,339286ns 0,404052ns 0,604335* 0,383214ns 1,115959**

Resíduo 48 0,074627 0,969823 0,416667 0,539260 0,292037 0,240667 0,373958

C.V. (%) 2,84 45,23 60,86 67,48 8,22 6,68 9,91

ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.

Anexo J. Resumo da análise de variância para os dados de inibição do crescimento micelialde Fusarium sp. causado por bactérias diazotróficas.

Fontes de variação GL Quadrado médio

Tratamento 5 3,924417**

Resíduo 18 0,09639

C.V. (%) 5,85

** significativo a 1%.

87

Anexo K. Todos os isolados de bactérias diazotróficas obtidos de amostras de soloproveniente de três municípios do estado do Maranhão.

NúmeroCódigoantigo

CódigoNovo

NúmeroCódigoantigo

Código Novo NúmeroCódigoantigo

CódigoNovo

1 A11 ARM-ID-1 51 A31 ARM-ID-51 101 A31 ARM-ID-1012 A11 ARM-ID-2 52 B33 BRM-ID-52 102 A31 ARM-ID-1023 D11 VRM-ID-3 53 B33 BRM-ID-53 103 A31 ARM-ID-1034 A22 ARM-ID-4 54 A33 ARM-ID-54 104 D32 VRM-ID-1045 A13 AFM-ID-5 55 A33 ARM-ID-55 105 D32 VRM-ID-1056 B12 BRM-ID-6 56 A31 ARM-ID-56 106 D32 VRM-ID-1067 A11 ARM-ID-7 57 A31 ARM-ID-57 107 D32 VRM-ID-1078 B11 BRM-ID-8 58 A32 ARM-ID-58 108 D32 VRM-ID-1089 A21 ARM-ID-9 59 A32 ARM-ID-59 109 D32 VRM-ID-10910 A12 ARM-ID-10 60 B33 BFM-ID-60 110 B32 BRM-ID-11011 A11 ARM-ID-11 61 B33 BFM-ID-61 111 B32 BRM-ID-11112 B12 BRM-ID-12 62 A32 ARM-ID-62 112 B32 BRM-ID-11213 B22 BRM-ID-13 63 A32 ARM-ID-63 113 A32 ARM-ID-11314 A11 ARM-ID-14 64 B31 BRM-ID-64 114 A42 ARM-ID-11415 A21 ARM-ID-15 65 B31 BRM-ID-65 115 A42 ARM-ID-11516 B13 BFM-ID-16 66 A32 ARM-ID-66 116 A42 ARM-ID-11617 B13 BFM-ID-17 67 A32 ARM-ID-67 117 A41 ARM-ID-11718 B11 BRM-ID-18 68 B32 BRM-ID-68 118 A41 ARM-ID-11819 B11 BRM-ID-19 69 B32 BRM-ID-69 119 B42 BRM-ID-11920 B12 BRM-ID-20 70 A31 ARM-ID-70 120 B41 BRM-ID-12021 A11 ARM-ID-21 71 A31 ARM-ID-71 121 A41 ARM-ID-12122 B12 BRM-ID-22 72 B33 BFM-ID-72 122 A41 ARM-ID-12223 A12 ARM-ID-23 73 B33 BFM-ID-73 123 A41 ARM-ID-12324 A11 ARM-ID-24 74 A31 ARM-ID-74 124 B42 BRM-ID-12425 B13 BFM-ID-25 75 A31 ARM-ID-75 125 A41 ARM-ID-12526 B13 BFM-ID-26 76 A31 ARM-ID-76 126 A41 ARM-ID-12627 B13 BFM-ID-27 77 A31 ARM-ID-77 127 B42 BRM-ID-12728 A12 ARM-ID-28 78 A31 ARM-ID-78 128 A41 ARM-ID-12829 A13 AFM-ID-29 79 A31 ARM-ID-79 129 A41 ARM-ID-12930 A11 ARM-ID-30 80 B32 BRM-ID-80 130 B41 BRM-ID-13031 A13 AFM-ID-31 81 B32 BRM-ID-81 131 A41 ARM-ID-13132 B11 BRM-ID-32 82 B31 BRM-ID-82 132 B42 BRM-ID-13233 A11 ARM-ID-33 83 B31 BRM-ID-83 133 B41 BRM-ID-13334 B12 BRM-ID-34 84 A31 ARM-ID-84 134 A42 ARM-ID-13435 B13 BFM-ID-35 85 A31 ARM-ID-85 135 B43 BFM-ID-13536 A32 ARM-ID-36 86 B32 BRM-ID-86 136 A42 ARM-ID-13637 A32 ARM-ID-37 87 B32 BRM-ID-87 137 B42 BRM-ID-13738 B31 BRM-ID-38 88 B33 BFM-ID-88 138 B41 BRM-ID-13839 B31 BRM-ID-39 89 B33 BFM-ID-89 139 A42 ARM-ID-13940 A31 ARM-ID-40 90 A31 ARM-ID-90 140 B41 BRM-ID-14041 A31 ARM-ID-41 91 A31 ARM-ID-91 141 A42 ARM-ID-14142 B31 BRM-ID-42 92 A32 ARM-ID-92 142 B41 BRM-ID-14243 B31 BRM-ID-43 93 A32 ARM-ID-93 143 B42 BRM-ID-14344 B32 BRM-ID-44 94 B31 BRM-ID-94 144 A41 ARM-ID-14445 B32 BRM-ID-45 95 B31 BRM-ID-95 145 B41 BRM-ID-14546 B31 BRM-ID-46 96 A32 ARM-ID-96 146 B41 BRM-ID-14647 B31 BRM-ID-47 97 A32 ARM-ID-97 147 D41 BRM-ID-14748 A32 ARM-ID-48 98 A31 ARM-ID-98 148 D43 VFM-ID-14849 A32 ARM-ID-49 99 A31 ARM-ID-99 149 D43 VFM-ID-14950 A31 ARM-ID-50 100 A31 ARM-ID-100 150 D41 VRM-ID-150

88

Anexo K. Continuação.

Número Código antigo Código Novo Número Código antigo Código Novo151 D41 DRM-ID-151 201 AR1125 ARM-HE-201152 D43 VFM-ID-152 202 BR2126 BRM-HE-202153 D41 VRM-ID-153 203 AR211 ARM-AZ-203154 D41 VRM-ID-154 204 AR212 ARM-AZ-204155 D43 VFM-ID-155 205 VR113 ARM-AZ-205156 D41 VRM-ID-156 206 AR114 ARM-AZ-206157 D41 VRM-ID-157 207 AR215 ARM-AZ-207158 D41 VRM-ID-158 208 A216 ARM-AZ-208159 D43 VFM-ID-159 209 BR117 ARM-AZ-209160 D41 VRM-ID-160 210 AR218 ARM-AZ-210161 D41 VRM-ID-161 211 AR319 ARM-AZ-211162 D52 VRM-BU-162 212 BR2111 BRM-AZ-212163 D51 VRM-BU-163 213 A2112 ARM-SP-213164 D51 VRM-BU-164 214 B2113 BRM-AZ-214165 B51 BRM-BU-165 215 BF2227 BFM-AZ-215166 A52 ARM-BU-166 216 AR2128 ARM-AZ-216167 A51 ARM-BU-167 217 AR2129 ARM-AZ-217168 B51 BRM-BU-168 218 AR2130 ARM-AZ-218169 B51 BRM-BU-169 219 AR1131 ARM-AZ-219170 B51 BRM-BU-170 220 AR2132 ARM-AZ-220171 B51 BRM-BU-171 221 AR1133 ARM-AZ-221172 A51 ARM-BU-172 222 VR1134 VRM-AZ-222173 A51 ARM-BU-173 223 AR1135 ARM-AZ-223174 A52 ARM-BU-174 224 VF2236 VFM-AZ-224175 A52 ARM-BU-175 225 BR2137 BRM-AZ-225176 A51 ARM-BU-176 226 BR1138 BRM-AZ-226177 A52 ARM-BU-177 227 BR1139 BRM-AZ-227178 A52 ARM-BU-178 228 AR2140 BRM-AZ-228179 D51 VRM-BU-179 229 AR2141 ARM-AZ-229180 D51 VRM-BU-180 230 BR1142 BRM-AZ-230181 D51 VRM-BU-181 231 A2111 ARM-AM-231182 A51 ARM-BU-182 232 AF22 AFM-AM-232183 A53 AFM-BU-183 233 AR213 ARM-AM-232184 B53 BFM-BU-184 234 AR214 ARM-AM-234185 B-53 BFM-BU-185 235 AR215 ARM-AM-235186 A51 ARM-BU-186 236 AF226 AFM-AM-236187 B53 BFM-BU-187 237 VF227 VFM-AM-237188 B51 BRM-BU-188 238 VR218 VRM-AM-238189 B53 BFM-BU-189 239 VR219 VRM-AM-239190 A51 ARM-BU-190 240 AR2110 ARM-AM-240191 D2231-3A VFM-HE-191 241 VR2111 VRM-AM-241192 VR2116 VRM-HE-192 242 VR2112 VRM-AM-242193 VR2117 VRM-HE-193 243 VF2213 VFM-AM-243194 A2231-2C AFM-HE-194 244 VR2114 VRM-AM-244195 VR1119 VRM-HE-195 245 VF2215 VFM-AM-245196 AR2120 ARM-HE-196 246 VR2116 VRM-AM-246197 AR1121 ARM-HE-197 247 AR2117 ARM-AM-247198 AR1122 ARM-HE-198 248 AR3118 ARM-AM-248199 AR1123 ARM-HE-199 249 VR3119 VRM-AM-249200 AR1124 ARM-HE-200 250 VR3120 VRM-AM-250

89

Anexo K. Continuação.

Número Código antigo Código Novo Número Código antigo Código Novo251 AR3121 ARM-AM-251 295 D5131-2B VRM-BU-295252 AR3122 ARM-AM-252 296 B5231-2B VFM-BU-296253 AR3123 ARM-AM-253 297 D5131-1A VRM-BU-297254 AR3124 ARM-AM-254 298 A5141-1B ARM-BU-298255 VR3125 VRM-AM-255 299 B4231-2C BFM-BU-299256 VR3126 VRM-AM-256 300 A5141-1B ARM-BU-300257 AR3127 ARM-AM-257 301 A5231-1B AFM-BU-301258 AR2128 ARM-AM-258 302 A5131-2B ARM-BU-302259 A312-2B ARM-ND-259 303 A511-1B ARM-BU-303260 A3131-2B ARM-ND-260 304 A511-1A ARM-BU-304261 A312-2A ARM-ND-261 305 A5142-1B ARM-BU-305262 B312-1A BRM-ND-262 306 A512-1B ARM-BU-306263 B3152-2C BRM-ND-263 307 A5132-1A ARM-BU-307264 B312-3A BRM-ND-264 308 A5132-1A ARM-BU-308265 B3231-1C BFM-ND-265 309 A5132-1B ARM-BU-309266 D3131-1C VRM-ND-266 310 A512-1A ARM-BU-310267 D3231-1B VFM-ND-267 311 B5131-1B ARM-BU-311268 A4141-1B ARM-ND-268 312 B4231-2C BFM-BU-312269 A411-1A ARM-ND-269 313 B521-1C BFM-BU-313270 A4141-4D ARM-ND-270 314 B5231-2B BFM-BU-314271 A4142-4A ARM-ND-271 315 B512-1B BRM-BU-315272 A421-2A AFM-ND-272 316 B5142-4B BRM-BU-316273 A4141-1A ARM-ND-273 317 B512-2A BRM-BU-317274 A4231-1B AFM-ND-274 318 B5142-4A BRM-BU-318275 A4131-2B ARM-ND-275 319 B512-2B BRM-BU-319276 A4141-3A ARM-ND-276 320 A5142-3A ARM-BU-320277 A4131-1A ARM-ND-277 321 B5132-1A BRM-BU-321278 A4231-3A AFM-ND-278 322 D512-2A VRM-BU-322279 B4231-2A BFM-ND-279 323 D5131-1B VRM-BU-323280 B411-1B BFM-ND-280 324 D5132-3A VRM-BU-324281 B4231-3B BFM-ND-281 325 D5132-3A VRM-BU-325282 B4231-1B BFM-ND-282 326 D512-2A VRM-BU-326283 B4231-1B BFM-ND-283 327 D512-1A VRM-BU-327284 D3141-1A VRM-ND-284 328 D5131-1A VRM-BU-328285 B411-2A BRM-ND-285 329 A5231-2B AFM-BU-329286 D4131-2A VRM-ND-286 330 A5141-1B ARM-BU-330287 D4131-2A VRM-ND-287 331 A5141-1B ARM-BU-331288 A5141-1B ARM-BU-288 332 A5141-1D ARM-BU-332289 A511-1A ARM-BU-289 333 A5231-1B AFM-BU-333290 A5231-1B AFM-BU-290 334 A511-1B ARM-BU-334291 A511-1B ARM-BU-291 335 A511-1A ARM-BU-335292 D5131-1B VRM-BU-292 336 A4231-2C AFM-BU-336293 A5131-1B ARM-BU-293 337 B5131-1C ARM-BU-337294 B521-1C BFM-BU-294 338 D5131-1A VRM-BU-338

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo