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ELUCIDAO ESTRUTURAL E QUANTIFICAO POR RMN H

1 DOS PRINCPIOS ATIVOS DO EXTRATO DAS

FOLHAS DE Zeyheria tuberculosa (VELL) BUREAU (BIGNONIACEAE)

Maria Amlia Lima dos Santos

UFAL INSTITUTO DE QUMICA E BIOTECNOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO

EM QUMICA E BIOTECNOLOGIA

Universidade Federal de Alagoas

Campus A. C. Simes Tabuleiro dos Martins

57.072-970 Macei-AL

Livros Grtis

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ELUCIDAO ESTRUTURAL E QUANTIFICAO POR RMN H

1 DOS PRINCPIOS ATIVOS DO EXTRATO DAS

FOLHAS DE Zeyheria tuberculosa (VELL) BUREAU (BIGNONIACEAE)

Maria Amlia Lima dos Santos

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica.

Orientador: Prof. Dr. Edson de Souza Bento Co-orientador: Prof. Dr. Antnio Euzbio Goulart SantAna

Macei Alagoas Novembro de 2009

UFAL

Universidade Federal de Alagoas Instituto de Qumica e Biotecnologia

Programa de Ps-Graduao em Qumica e Biotecnologia

PPGQB

IQB

ii

AGRADECIMENTOS

Ao Senhor Jesus Cristo, pelo seu infinito amor e pela sua presena e providncia em todas as minhas alegrias e aflies;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) do Ministrio da Cincia e Tecnologia (MCT) do Governo Brasileiro por ter fomentado a nossa pesquisa e por ter fornecido uma bolsa de mestrado;

Aos meus queridos orientadores, Prof. Dr. Antnio Euzbio Goulart SantAna e Prof. Dr. Edson de Souza Bento, exemplos de dedicao cincia e ao trabalho, pela orientao, oportunidade, confiana e incentivo durante o mestrado;

Ao Instituto de Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas pelo Programa de Ps-graduo em Qumica e Biotecnologia, responsvel pela minha qualificao profissional;

Coordenao do Programa de Ps-graduao de Qumica e Biotecnologia pelo apoio e dedicao;

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) do Ministrio da Educao (MEC) pelo cuidado com a excelncia dos Cursos de ps-graduao stricto sensu e pelo acesso aos Peridicos da Capes;

Ao Instituto do Milnio do Semi-rido pelo material vegetal fornecido pelo projeto IMSEAR; Aos Laboratrios de Pesquisa em Recursos Naturais e de Ressonncia Magntica Nuclear do Instituto de Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas onde foram desenvolvidos os experimentos e anlises; Ao Laboratrio de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia do Centro de pesquisas Gonalo Moniz da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pela avaliao da atividade farmacolgica; Ao Prof. Dr. Joo Xavier de Arajo Jnior, pelos ensinamentos e pela contribuio prestada durante a parte experimental deste trabalho;

Aos Professores Doutores Lucia Maria Conserva, Lcia Maria Cunha Rebouas, Marcia Pletsch, Marlia Oliveira Fonseca Goulart e Nivaldo Alves Soares pelos excelentes cursos ministrados;

Aos meus queridos Ruy Albuquerque Tenrio e Yuri Cavalcante Albuquerque Tenrio, pelos ensinamentos, pela ajuda na formatao desta dissertao, enfim, por terem contribudo de forma significativa para a concluso deste trabalho.

A minha querida MsC. Natlia Velsquez, pela significativa contribuio a este trabalho, pelo apoio constante e pelos bons momentos juntas.

iii

Aos tcnicos Aldy Santos e Margarida Teodoro que sempre estiveram disponveis e muito contriburam para este trabalho;

Aos colegas de laboratrio MsC. Daniel de Melo, MsC. Edjane Vieira, MsC. Alan John, MsC. Cristiane Omena e MsC. Roberta Costa por terem contribudo de forma significativa para a realizao deste trabalho;

Ao tcnico MsC. Marcos S pela dedicao nas anlises de RMN e a tcnica MsC. Cenira Monteiro pela contribuio para o bom andamento deste trabalho;

Aos alunos de iniciao cientfica (IC) Maria dos Prazeres Menezes, Leandro Duarte e Tain Tenrio pelas contribuies prestadas durante a parte experimental deste trabalho;

Raquel Ferreira (IC), sis Torres (IC) e aos demais colegas dos laboratrios de Ressonncia Magntica Nuclear e de Pesquisa em Recursos Naturais pelas contribuies neste trabalho.

Aos colegas de sala de aula que de alguma forma contriburam para a minha formao durante o Curso de Mestrado e tambm pelos bons momentos juntos;

Aos meus queridos pais, Erivaldo Soares dos Santos e Maria Lcia Lima dos Santos, e aos meus irmos, Camila Maria Lima dos Santos, Erivaldo Soares dos Santos Jnior, pelo amor, apoio e pelas oraes;

Aos servidores da UFAL responsveis pela higienizao dos ambientes de estudo e trabalho.

iv

Dedico este trabalho:

Aos meus amados pais, Erivaldo Soares

dos Santos e Maria Lcia Lima dos Santos, por todo o amor, o cuidado, a entrega e os sacrifcios.

Aos meus amados irmos, Camila Maria

Lima dos Santos e Erivaldo Soares dos Santos Jnior, pelo apoio e companheirismo.

Aos meus amados Ruy Albuquerque

Tenrio e Yuri Cavalcanti Albuquerque Tenrio, pelo amor, os cuidados constantes e as oraes.

v

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... viii

LISTA DE TABELAS .......................................................................................... xiii

LISTA DE FLUXOGRAMAS ............................................................................... xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ....................................................... xv

RESUMO.............................................................................................................. 1

ABSTRACT.......................................................................................................... 2

1. INTRODUO................................................................................................. 3

1.1 Objetivo Geral................................................................................................ 6

1.2 Objetivos Especficos..................................................................................... 6

1.3 Justificativa.................................................................................................... 6

2. REFERENCIAL TERICO.............................................................................. 8

2.1 A Espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau.............................................. 8

2.2 Linfoproliferao............................................................................................ 12

2.3 Consideraes Gerais sobre Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)......... 13

3. EXPERIMENTAL............................................................................................ 18

3.1 Local de Realizao do Trabalho................................................................... 18

3.2 Material Botnico............................................................................................ 18

3.3 Material, Equipamento, Mtodo de Extrao e Purificao....................... 19

3.3.1 Solventes..................................................................................................... 19

3.3.2 Anlise Cromatogrfica............................................................................... 19

3.3.3 Reveladores................................................................................................ 19

3.3.4 Mtodo de Extrao.................................................................................... 20

3.3.5 Mtodo de Purificao................................................................................. 20

3.3.6 Espectrmetros........................................................................................... 20

3.3.7 Polarmetro.................................................................................................. 21

3.4 Etapas de Isolamento do Princpio Ativo........................................................ 21

3.4.1. Preparao do Extrato Etanlico Bruto das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................

21

3.4.2. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................

21

3.4.3. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB............................. 22

vi

3.4.4. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2............................ 23

3.4.5. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3......................... 24

3.4.6. Fracionamento Cromatogrfico I, Cristalizao e Recristalizao das Fraes Reunidas da Filtrao da ZTF3.3...........................................................

25

3.4.7. Fracionamento Cromatogrfico II, Cristalizao e Recristalizao da Subfrao (48 - 78) Proveniente da Coluna I.......................................................

26

3.4.8. Fracionamento Cromatogrfico III, Cristalizao e Recristalizao da Frao ZTF3.2......................................................................................................

28

3.5 Prospeco Fitoqumica................................................................................. 29

3.5.1. Teste para Fenis e Taninos...................................................................... 29

3.5.2. Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonides............................ 29

3.5.3. Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas...................... 30

3.5.4. Teste para Flavonis, Flavanonas, Flavanonis e Xantonas..................... 31

3.5.5. Teste para Esteroides e Triterpenoides..................................................... 31

3.5.6. Teste para Saponinas................................................................................ 31

3.5.7. Teste para Alcalides................................................................................. 32

3.5.8. Teste para Antraquinonas, Antronas e Cumarinas.................................... 32

3.6 Ensaio Biolgico............................................................................................. 32

3.7 Resultado da Prospeco Fitoqumica do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa......................................................................................

34

3.8 Resultado do Bioensaio................................................................................. 35

3.8.1 Atividade Citotxica do Extrato e Fraes das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................

35

3.8.2 Atividade Inibitria da Linfoproliferao in vitro, da Frao Clorofrmica das Folhas de Z. tuberculosa...............................................................................

35

3.9 Identificao Estrutural das Substncias Isoladas da Frao ZTP2.............. 36

3.10 Identificao Estrutural da Substncia Codificada como ZTC9................... 36

3.11 Identificao Estrutural da Substncia Codificada como ZTC10................. 58

3.12 Metodologia das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1................................................................................................................

79

3.13 Resultados das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1..........................................................................................................

82

3.13.1 Resultado da Quantificao da Substncia ZTC9 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) das Folhas de Z. tuberculosa......................................................................................................

85

vii

3.13.2 Resultado da Quantificao da Substncia ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) das Folhas de Z. tuberculosa...................................................................................................

94

4. 4. CONSIDERAES FINAIS......................................................................... 104

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................... 105

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Zeyheria tuberculosa; (a) Folhas e Flores, (b) Frutos, (c) Sementes, (d) Casca, (e) Madeira.............................................................

8

Figura 02. Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais (a),

Laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear (b)......................................

18

Figura 03. Espectro da Substncia ZTC9 na Regio do Infravermelho [Y=Transmitncia/X=nmero de ondas (cm-1)]...............................................

36

Figura 04. Espectro de RMN H1 de ZTC9 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1..............................................................................

38

Figura 05. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................

38

Figura 06. Espectro de RMN C13 de ZTC9 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................

39

Figura 07. Expanso do Espectro de RMN C13 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

40

Figura 08. Espectro de RMN DEPT 90 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

40

Figura 09. Expanso do Espectro de RMN DEPT 90 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

41


41

Figura 11. Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

43

Figura 12. Expanso do Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1 ............................................................................

43

Figura 13. Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................

45

Figura 14. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

45


46

Figura 16. Reduo dos Sinais da Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1...................................

46

Figura 17. Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................

47

Figura 18. Expanso do Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

48

Figura 19. Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

48

ix

Figura 20. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

49

Figura 21. Montagem Estrutural da ZTC9..................................................... 50

Figura 22. Correlaes Observadas no Espectro HMBC de ZTC9

(a) 2-4JC,H; (b) 2JC,H; (c)

3JC,H; (d) 4JC,H............................................................................................

51

Figura 23. Correlaes Observadas no Espectro COSY de ZTC9.............. 52

Figura 24. Correlaes Observadas no Espectro NOESY de ZTC9............ 52

Figura 25. Estrutura do (+)-cido Urslico (ZTC9)....................................... 55

Figura 26. Espectro de Massas (m/z) do cido Urslico (ZTC9)................. 57

Figura 27. Fragmentao do cido Urslico do Tipo Retro-Diels-Alder............................................................................................

57

Figura 28. Espectro da Substncia ZTC10 na Regio do Infravermelho [Y=Transmitncia/X=nmero de ondas (cm-1)].............................................

58

Figura 29. Espectro de RMN H1 de ZTC10 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

59

Figura 30. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

60

Figura 31. Espectro de RMN C13 de ZTC10 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

61

Figura 32. Expanso do Espectro de RMN C13 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

61


62

Figura 34. Espectro de RMN DEPT 135 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................

62

Figura 35. Expanso do Espectro de RMN DEPT 135 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

63

Figura 36. Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

64

Figura 37. Expanso do Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

65

Figura38. Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

66


67


67

Figura 41. Reduo dos Sinais da Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.................................

68

Figura 42. Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC10,

x

Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................. 69

Figura 43. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

69

Figura 44. Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

70


70


71

Figura 47. Montagem Estrutural da ZTC10................................................... 72

Figura 48. Correlaes Observadas no Espectro HMBC de ZTC10 (a) 2-4JC,H; (b)

2JC,H; (c) 3JC,H; (d)

4JC,H............................................................. 73

Figura 49. Correlaes Observadas no Espectro COSY de ZTC10............ 74

Figura 50. Correlaes Observadas no Espectro NOESY de ZTC10.......... 74

Figura 51. Estrutura do (+)-cido Oleanlico (ZTC10) ................................ 76

Figura 52. Espectro de Massas (m/z) do cido Oleanlico (ZTC10).......... 78

Figura 53. Fragmentao do cido Oleanlico do Tipo Retro-Diels-Alder............................................................................................

78

Figura 54. Espectro de RMN H1 de ZTC9 (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC9), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.......

82

Figura 55. Espectro de RMN H1 da Frao Clorofrmio (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC9), Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................

83

Figura 56. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC9 (A), ZTC10 (B) e Frao Clorofrmica (C), Solvente CDCl3/MeOD 3:1....................................

83

Figura 57. Espectro de RMN H1 de ZTC10 (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC10), Solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................................

84

Figura 58. Espectro de RMN H1 da frao clorofrmio (Deslocamentos dos picos escolhidos para a quantificao de ZTC10), solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................................

84

Figura 59. Espectro de RMN H1 de ZTC9, ZTC10 e Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................

85

Figura 60. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................

88

Figura 61. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................

88


89


89

xi


90


90


91


91


92


92


93


93

Figura 72. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 1-6), solvente CDCl3/MeOD 1:1.............................................................................

94


97


97


98


98


99


99


100


100


101

Figura 82. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 5), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.....................................

101

Figura 83. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................

102

Figura 84. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro

xii

de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1..................................... 102

Figura 85. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 1-6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.....................................................

103

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB .................. 23

Tabela 02. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da ZTP2............................. 24

Tabela 03. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3.............. 24

Tabela 04. Fracionamento Cromatogrfico das Fraes Reunidas da

Filtrao da Frao ZTF3.3................................................................................ 26

Tabela 05. Fracionamento Cromatogrfico da Subfrao (48 - 78) ................. 27

Tabela 06. Fracionamento Cromatogrfico da Frao ZTF3.2........................ 28

Tabela 07. Variao de Colorao Observada nos Tubos (I)........................... 30

Tabela 08. Variao de Colorao Observada nos Tubos (II).......................... 30

Tabela 09. Resultado da Prospeco Fitoquimica do Extrato ZTB da Folha de Z. tuberculosa................................................................................................

34

Tabela 10. Apresentao dos Resultados Obtidos Neste Trabalho Acerca da Atividade Inibitria da Linfoproliferao da Frao Ativa ZTP2 da Partio da Folha de Z. tuberculosa................................................................................

35

Tabela 11. Dados de RMN H1, C13 (DEPT 90 e 135), HSQC, HMBC, COSY e NOESY, para a Amostra ZTC9. Valores de Deslocamento Qumico em ppm, Solvente CDCl3/MeOD.............................................................................

56

Tabela 12. Dados de RMN H1, C13 (DEPT 90 e 135), HSQC, HMBC, COSY e NOESY, para a Amostra ZTC10. Valores de Deslocamento Qumico em ppm, Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................................

77

Tabela 13. Quantificao da ZTC9.................................................................... 86

Tabela 14. Quantificao da ZTC10................................................................. 95

xiv

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa....................................................................................................

22

Fluxograma 2. Esquema Geral das Etapas Experimentais................................... 33 Fluxograma 3. Metodologia das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1.................................................................................................

81

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

Deslocamento Qumico

AcOEt Acetato de Etila CC Cromatografia em Coluna CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analtica COSY Correlation Spectroscopy d Dupleto dd Duplo Dupleto DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer EtOH Etanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantun Coherence Hz Hertz IV Infravermelho IMSEAR Instituto do Milnio do Semi-rido J Constante de Acoplamento MeOH Metanol MeOD Metanol Deuterado m Multipleto MHz Megahertz mL Mililitros nm Nanmetro NOE Nuclear Overhauser Effect OC Onda Contnua OMS Organizao Mundial de Sade RMN C13 Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono Treze RMN H1 Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio s Simpleto t Tripleto TF Transformada de Fourier L Microlitros

1

RESUMO

Desde os tempos antigos, os produtos naturais so utilizados como fonte de

medicamentos, para prevenir e tratar doenas. Embora os extratos vegetais

continuem a ser utilizados como remdios, estes esto sendo substitudos pelos

compostos ativos isolados dos extratos brutos e seus derivados sintticos. Este

trabalho teve como objetivo o isolamento e a identificao estrutural dos princpios

ativos do extrato das folhas de Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau e suas

quantificaes por RMN H1. O extrato etanlico de Z. tuberculosa foi ativo no ensaio

de inibio da linfoproliferao. O extrato etanlico desta planta foi submetido

anlise cromatogrfica e o isolamento guiado pelo ensaio da linfoproliferao indicou

que a frao em clorofrmio era a mais ativa. A partir desta frao clorofrmica, dois

principais compostos foram isolados, ZTC9 e ZTC10. Estes compostos foram

analisados por RMN visando elucidao estrutural e quantificao. A elucidao

estrutural detalhada destes dois compostos foi feita com base na anlise espectral

de RMN, incluindo experimentos 1D (H1, C13, DEPT 90, DEPT 135) e 2D (COSY,

HSQC, HMBC e NOESY). Para o estudo da quantificao, uma srie de cinco

solues foi preparada para cada composto, variando a concentrao de ZTC9 e

ZTC10. Cada uma das solues foi submetida a um experimento de RMN H1. A

partir dos espectros de RMN H1 obtidos, alguns sinais selecionados foram

integrados e suas intensidades foram utilizadas para quantificar os compostos

presentes no extrato ( 5,39 e 2,33 para ZTC9; 5,38 e 2,96 para ZTC10). Os

dados de RMN H1 foram processados e analisados utilizando os softwares TOPSPIN

(Bruker) e SpinWorks. A anlise dos espectros de RMN 1D e 2D identificou as

estruturas qumicas de ZTC9 e ZTC10, como sendo, respectivamente, cido

Urslico e cido Oleanlico. Os estudos da quantificao de cido Urslico e cido

Oleanlico indicaram, respectivamente, os valores de 43% e 45,9%, em massa, e

concentraes de 4,71 x 10-3 mol.L-1 e 5,04 x 10 -3 mol.L-1.

Palavras-chave: RMN, cido Urslico, cido Oleanlico, Quantificao.

2

ABSTRACT

Since ancient times, vegetables are used as source of medicine, to prevent and treat

disease. Although plants extracts continue to be used as medicine, it has been

replaced by the actives compounds isolated from crude extracts and its synthetic

derivatives. This study aimed at the isolation and the structural identification of the

actives principles extract of the leaves of Zeyheria tuberculosis (Vell) Bureau and its

quantification by H1 NMR. The ethanolic extract of Z. tuberculosa was active in the

tests tripanossida of inhibition of NO generation and lymphoproliferation. The

ethanol extract of this plant was submitted to chromatographic analysis and the

isolation process, guided by lymphoproliferation test, indicated that the fraction in

chloroform was the most active. From this chloroform fraction, two major compounds

were isolated, ZTC9 and ZTC10. These compounds were analyzed by NMR aiming

its structural elucidation and quantification. The detailed structural elucidation of

these two compounds was done on the basis of NMR spectral analysis, including 1D

experiments (H1, C13, DEPT 90 and DEPT135) and 2D (COSY, HSQC, HMBC and

NOESY). For the quantification studies, a series of five solutions were prepared for

each compound by varying the concentration of ZTC9 and ZTC10. Each one of these

solutions was submitted to a H1 NMR experiment. From the NMR H1 spectra

obtained, some selected signals were integrated and its intensities used to quantify

the compounds present in the extract ( 5,38 and 2,33 for ZTC9; 5,38 and 2,96

for ZTC10). The NMR H1 data had been processed and analyzed using the

TOPSPIN (Bruker) and SpinWorks softwares. The analysis of the spectra of 1D and

2D NMR identified the chemical structures of ZTC9 and ZTC10, as, respectively,

Ursolic Acid and Oleanolic Acid. The quantification studies of Ursolic Acid and

Oleanolic Acid showed, respectively, the values of 43% and 45,9%, in mass, and

concentration of 4,71 x10-3 mol.L-1 and 5,04 x 10-3 mol.L-1.

Key-words: NMR, Ursolic Acid, Oleanolic Acid, Quantification.

3

1. INTRODUO

Desde os tempos primitivos os vegetais so necessrios existncia da

sociedade como fonte de alimentos, de materiais para o vesturio, construo de

casas, defesa e ataque, na produo de meios de transporte, como instrumento de

trabalhos artsticos, culturais e religiosos, no controle de pragas e ainda com fins

medicinais, para preveno, tratamento e cura de doenas (PINTO et al., 2002;

SIMES et al., 2003).

Dentro desse campo vasto de utilizao dos vegetais ser enfocado neste

trabalho apenas o seu potencial medicinal. Porm nem todos os vegetais possuem

propriedades medicinais. A Organizao Mundial de Sade (OMS) define planta

medicinal como todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais rgos,

substncias que podem ser utilizadas para fins teraputicos (TRRES et al., 2005;

VEIGA JNIOR et al., 2005).

As substncias que podem ser usadas na teraputica so conhecidas como

metablitos secundrios, no sendo comuns maioria das plantas, mas so

caractersticos de grupos taxonmicos como famlia e gnero, possuindo funes

especficas que podem ser de defesa, atrao, entre outras, e so classificados de

acordo com a sua rota biossinttica (HARBORNE, 1999; MACEDO JNIOR, 2007).

Dentre os metablitos secundrios existe a famlia dos terpenides conhecidos pelas suas funes fisiolgicas e biolgicas, sendo usados como anti-

inflamatrios, analgsicos, anti-tumorais e aes no sistema cardiovascular, tendo

os triterpenos como um grupo importante (NIERO e MALHEIROS, 2007; PINTO et

al., 2008).

Os triterpenos (C30) originam-se da ciclizao do esqualeno, a exemplo do

cido Oleanlico e seu ismero, o cido Urslico. Estes compostos triterpnicos

encontrados nas plantas apresentam efeitos hipoglicmico, antioxidante e anti-

hipertensivo. Este ltimo foi atribudo a um potente efeito diurtico e natriurtico

desses compostos (SOMOVA et al., 2003).

At a dcada de 1950, houve pouco progresso na caracterizao dos

princpios ativos e elucidao desses compostos secundrios presentes nas

espcies vegetais, por isso as plantas medicinais in natura e seus extratos

constituam a maioria dos remdios, que naquela poca eram de uso quase

4

exclusivo na teraputica medicamentosa, os quais paulatinamente vm sendo

substitudos por medicamentos contendo as substncias ativas deles extrados ou

seus derivados sintticos (SOUZA et al., 2007; SIMES et al., 2003).

A falta de progresso deveu-se s inmeras limitaes existentes como os

mtodos qumicos de anlise que consistiam no uso de reaes para degradar,

derivatizar e identificar grupos funcionais, e a necessidade de grandes quantidades

da substncia a ser analisada, que na maioria das espcies so isoladas na ordem

de miligramas (SOUZA et al., 2007).

Foi a partir do advento dos mtodos fsicos de purificao e de anlise, como

a cromatografia gasosa (GC), a cromatografia lquida de alta performance (HPLC), a

espectroscopia na regio do Visvel, Ultravioleta e Infravermelho, alm da

Ressonncia Magntica e Espectrometria de Massas, que a rea dos produtos

naturais pde se desenvolver (SOUZA et al., 2007).

O desenvolvimento da qumica analtica, designadamente, atravs dos

modernos mtodos cromatogrficos, espectromtricos, e radioimunolgicos,

apoiados em aparelhos cada vez mais sofisticados, possibilitou um melhor

conhecimento da composio qumica dos frmacos vegetais e da estrutura dos

seus componentes ativos (PEREIRA et al., 2005).

Tambm foram desenvolvidos bioensaios simplificados, que podem ser

utilizados em bancadas de laboratrios de qumica e so teis para direcionar a

seleo de extratos, fraes e substncias a serem isoladas (HAMBURGER e

HOSTETTMANN, 1991; MCLAVGHLIN et al., 1993).

Todas essas novas possibilidades analticas permitem rapidez no isolamento

e identificao de substncias ativas inditas e na aquisio de informaes sobre

constituintes em amostras complexas como os extratos vegetais, alm do

reconhecimento de molculas j conhecidas, que de outro modo requereriam

investimentos em tempo e recursos materiais para os processos de isolamento e

identificao.

Frente a todo esse progresso, a substituio progressiva das plantas

medicinais e dos seus extratos pelos compostos reconhecidos como responsveis

pela sua ao farmacolgica, no representou apenas o surgimento de um grupo

novo de substncias, mas originou a identificao de uma nova possibilidade de

interveno teraputica (TRRES et al., 2005; SIMES et al., 2003).

5

O principal motivo para essa substituio o difcil controle de qualidade

qumica, fsica, farmacolgica ou toxicolgica dos extratos vegetais. Contudo, apesar

destas mudanas, a diversidade gentica vegetal bastante expressiva e poucas

espcies (15 a 17%) tm sido cientificamente estudadas para a avaliao de suas

qualidades, eficcia clnica e segurana (TEIXEIRA et al., 2003; CALIXTO, 2007;

SOARES et al.,2006).

No Brasil, a Resoluo RDC 17, prope o estudo das espcies para

comercializao, mas independente disso, as feiras livres e ervanrios, algumas

pequenas indstrias e farmcias continuam comercializando tais espcies

desconhecidas cientificamente (TOLEDO et al., 2003).

Apesar dos riscos, a crescente comercializao prova clara de que a

maioria da populao de baixa e mdia renda continua recorrendo s plantas

medicinais como nico alvio para seus males (IMS, 1992; SIMES et al., 2003;

GUIMARES et al., 2007). No incio da dcada de 1990, a Organizao Mundial de

Sade (OMS) divulgou que 65 80% da populao dos pases em desenvolvimento

dependiam das plantas medicinais como nica forma de acesso aos cuidados

bsicos de sade (VEIGA JNIOR et al., 2005; BAGATINI et al., 2007).

No Brasil, at 1996, a estimativa do consumo de medicamentos sintticos era

em torno de 63%, adquiridos por apenas 20% da populao. O restante utilizava os

produtos de origem natural, principalmente as plantas medicinais e seus extratos,

como a principal ou a nica opo teraputica. Atualmente, 82% da populao

brasileira aproximadamente, utiliza produtos base de ervas (AQUINO, 2007).

A recorrncia devido ao fato de que, mesmo com a grande evoluo da

medicina convencional a partir da segunda metade do sculo XX, ainda existem

dificuldades bsicas na sua utilizao pelas populaes carentes, que vo desde o

acesso aos centros de atendimentos hospitalares obteno de exames e

medicamentos (VEIGA JNIOR et al., 2005).

Alm disso, a facilidade na aquisio de plantas, o baixo custo, a eficincia na

preveno e no tratamento de doenas, e a tradio do uso de plantas medicinais,

contribuem para a grande utilizao desses produtos naturais pelas populaes dos

pases em desenvolvimento (SIMES et al., 2003).

Observa-se assim, a importncia e a necessidade de se chegar no apenas

ao fitoterpico (simples preparao tradicional a partir de partes de uma espcie

6

medicinal que tenha avaliada sua eficcia, inocuidade e qualidade), mas tambm ao

farmacoterpico (composto quimicamente definido e com atividade farmacolgica

determinada). Tudo isso de acordo com as exigncias da legislao em vigor e

considerando os aspectos de preservao das reservas naturais dentro da

perspectiva do desenvolvimento sustentvel (DI STASI, 1996; TOLEDO et al., 2003).

Neste contexto social em que as plantas medicinais adquirem importncia

como agentes teraputicos, faz-se necessrio no s a busca de provas cientficas

quanto segurana e eficcia teraputica destas plantas, mas tambm o apoio

governamental com o objetivo de aproximar grupos de pesquisadores

interdisciplinares, multifuncionais e interinstitucionais, privilegiando aquelas

pesquisas que compreendem toda a cadeia de produo de determinada espcie de

interesse at a determinao de doses e ensaios clnicos, contribuindo desta forma,

para o desenvolvimento de novos fitoterpicos e farmacoterpicos (BRESOLIN e

CECHINEL FILHO, 2003; TOLEDO et al., 2003).

1.1 Objetivo Geral

Contribuir para o estudo fitoqumico, guiado pelo bioensaio de inibio da

linfoproliferao in vitro, da espcie Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau.

1.2 Objetivos Especficos

Determinao e quantificao por RMN H1 dos princpios ativos do extrato

das folhas de Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau.

1.3 Justificativa

O nosso grupo faz parte do projeto do Milnio do Semi-rido para o estudo da

biodiversidade do Semi-rido nordestino, cabendo ao grupo realizar o estudo

fitoqumico (determinao do princpio ativo) de cinco espcies de plantas escolhidas

pelo IMSEAR (INSTITUTO DO MILNIO DO SEMI-RIDO), com base em um

trabalho de seleo de plantas ativas quanto atividade tripanocida,

linfoproliferao, inibio de NO e atividade antibitica. Entre estas cinco espcies

7

encontra-se a Zeyheria tuberculosa, cuja frao clorofrmica da partio do extrato

bruto das folhas, feita pelo IMSEAR, apresentou-se ativa quanto inibio da

linfoproliferao e por isso a planta nos foi enviada para o isolamento do(s)

princpio(s) ativo(s) responsvel(is) por esta atividade.

8

2. REFERENCIAL TERICO

2.1 A espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau

A espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau (Figura 01), de acordo com a

linha filogentica de Arthur Cronquist (BASTOS, 2008) apresenta a seguinte

classificao sistemtica:

Domnio: Eukaryota

Reino: Plantae

Sub reino: Viridaeplantae

Filo: Tracheophyta

Sub filo: Euphyllophytina

Infra filo: Radiatopses

Classe : Magnoliopsida

Sub classe : Lamiidae

Super ordem: Lamianae

Ordem: Scrophulariales

Famlia: Bignoniaceae

Gnero: Zeyheria

Espcie: Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau

Figura 01. Zeyheria tuberculosa; (a) Folhas e Flores, (b) Frutos, (c) Sementes (d) Casca (e) Madeira.

Fonte: http://www.achetudoeregiao.com.br/Arvores/Zeyheria_tuberculosa.htm, acessado em novembro de 2007.

a

b c d e

http://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Eukaryota_Domain.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Plantae_Kingdom.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Viridaeplantae_Subkingdom.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Tracheophyta_Phylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Euphyllophytina_Subphylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Radiatopses_Infraphylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Magnoliopsida_Class.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Lamiidae_Subclass.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Lamianae_Superorder.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Scrophulariales_Order.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Bignoniaceae_Family.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Zeyheria_Genus.asphttp://www.achetudoeregiao.com.br/Arvores/Zeyheria_tuberculosa.htm

9

A famlia Bignoniaceae, representada por mais de 100 gneros e 800

espcies com distribuio pantropical, sendo o maior nmero de espcies desta

famlia encontradas no Neotrpico (MACHADO et al., 2006).

O gnero Zeyheria composto pelas espcies Z. barbata Miq., Z. digitada

Miq., Z. fluviatilis Miq., Z. hamburiana Corr. Mello, Z. kuntzei K. Shum., Z.

surinanmensis Miq., Z. velloziana Miers, Z. montana Mart., Z. digitalis (Vell.) Hoehne

e Z. tuberculosa (Vell) Bureau (BASTOS, 2008).

A espcie Z. tuberculosa recebe vrios nomes populares como ip-tabaco,

ip-felpudo, bucho-de-carneiro, bucho-de-boi, ip branco, bucho de bode e ocorre no

Brasil em rea de mata atlntica a florestas decduas de So Paulo a Pernambuco,

em altitudes de 50-1000 m (ZIDKO, 2002; LUCCHESE, 2006).

A rvore de mdio a grande porte, atinge mais de 30 m de altura. Possui

folhas em tufos terminais, opostas cruzadas, pentadigitadas, grandes (40-60 cm de

comprimento x 25-40 cm de largura), com pecolo longo (15-30 cm), grosso, rolio e

felpudo. A folha inteira, assim como o resto da planta, recoberta por um tomento

espesso, semelhante a um veludo, pulverulento, sendo desta caracterstica a origem

do nome felpudo (FERREIRA e LUZ, 1985).

A inflorescncia surge aps a brotao das folhas, em pancula terminal com

20-30 cm, densa, ereta, piramidal, felpuda, com dezenas de pequenas flores (menos

de 2 cm) pouco vistosas. O fruto possui cpsula do tipo sliqua, lenhosa, grande

(desde 13x10 cm at 20x15 cm), achatada, oval a oblonga e externamente

muricada, isto , revestida de densas expanses semelhantes a um plo grosso,

com 1-2 cm de espessura, pulverulentas, sendo esta a razo do nome da espcie, Z.

tuberculosa, termo alusivo a pequenas salincias; pelo mesmo motivo, vulgarmente

tambm conhecida por bucho-de-boi (FERREIRA e LUZ, 1985).

As sementes so aladas, achatadas; ncleo cordiforme, branco-amarelado,

felpudo, com 2 cm ou menos de dimetro e no possuem dormncia, germinando

facilmente entre 1 e 2 semanas quando colocadas sob uma fina camada de solo ou

palha umidoso (FERREIRA e LUZ, 1985).

Espcies pertencentes famlia Bignoniaceae (Jacaranda micranta Cham.,

Tabebuia caraiba Bur., Tecoma sambucifolia Kunth e T. stans L.) foram bastante

utilizadas como anestsico, antiinflamatrio, anticoncepcional, antisifiltico e

antireumtico por culturas indgenas da Amrica do Sul (BASTOS, 2008).

10

Quanto s espcies do gnero Zeyheria, as razes da Z. montana so

bastante usadas na medicina popular contra as doenas de pele. H indicao de

que o extrato aquoso da Z. tuberculosa seja utilizado no tratamento do cncer, e

estudos biolgicos realizados com o caule desta espcie revelou atividade

antimicrobiana (BASTOS, 2008; SILVEIRA et al., 1975; WEINBERG et al., 1976). A

frao clorofrmica desta espcie apresentou-se ativa quanto inibio da

linfoproliferao, em testes feitos pelo IMSEAR.

A literatura descreve o estudo fitoqumico de trs espcies do gnero

Zeyheria: a Z. Montana M., onde da madeira (extratos benznico e etanlico) foi

isolada uma naftoquinona, o Lapachol (1), e das razes os quinides -Lapachona

(2), o Desidro--Lapachona (3) e o 4-hidroxi--Lapachona (4) (JCOME et al., 1999;

MAGANHA et al., 2006); a Z. digitalis (Vell.), de onde foi isolado a D-glicose (5), o

cido Vertrico (6), a Vanilina (7), o Lapachol (1), a lignana Zeyherol (8) e o

-Sitosterol (9) (SILVEIRA et al., 1975; FACCIONE et al., 2004); e a Z. tuberculosa

(Vell) Bureau, onde do extrato da folha foram isolados a lignana Zeiherol (8), os

flavonides 5,6,7-Trimetoxiflavona (10), 5,6,7,8-Tetrametoxiflavona (11), 4-Hidroxi-

5,6,7,8-Tetrametoxiflavona (12) e 3,5,7,8-Tetrametoxiflavona (13), o Lapachol (1), -

Lapachona (2), o Desidro--Lapachona (3) o 4-Hidroxi--Lapachona (4) e o -

Sitosterol (9) (BASTOS, 2008; GRAHAM et al., 2000; KUTNEY e HANSSEN, 1971;

WEINBERG et al.; 1976).

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(1) (2)

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(3) (4)

11

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(10) (11)

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(12) (13)

12

2.2 Linfoproliferao

A Linfoproliferao est relacionada imunomodulao, que um mecanismo

fisiolgico de regulao da resposta imunolgica, que estimula ou suprime esta

resposta. Portanto, a imunomodulao divide-se em imunoestimulao e

imunossupresso (RUBEL, 2006).

A imunoestimulao implica diretamente na estimulao do sistema imune e

potencializao da resposta de defesa. Ao contrrio, a imunossupresso implica

principalmente no decrscimo da atividade do sistema imune, ocorrendo devido a

vrios fatores genticos, ambientais e teraputicos, favorecendo o estabelecimento

de infeces, mas sendo, porm, de suma importncia no sucesso dos transplantes

(PATWARDHAN et al., 1990; MAKARE et al., 2001).

A imunossupresso pode ser no-especfica, como na administrao de

agentes imunossupressores (medicamentos, radiao) ou pela diminuio de

linfcitos, ou pode ser especfica como na dessensibilizao ou administrao

simultnea de antgenos e drogas imunossupressivas, sendo uma das principais

causas da imunossupresso a administrao de frmacos para impedir a rejeio de

um rgo transplantado ou o transplante de medula ssea (SILVA e FIGUEIREDO,

1998).

Nas ltimas dcadas, o aumento do nmero de rgos transplantados levou a

um incremento e aperfeioamento da teraputica imunossupressora, objetivando a

preservao do rgo transplantado com um mnimo de efeitos colaterais para o

doente. Mais de 40 doenas decorrentes de respostas imunolgicas so passveis

de tratamento com agentes inibidores da resposta imune (STITES et al., 2000).

As respostas imunes e inflamatrias podem ser modificadas por certas

classes de frmacos: Os corticosterides, com ao moduladora da ativao de

macrfagos (essa ativao leva produo de NO entre outros mediadores

imunolgicos) e linfcitos, que suprimem as respostas imunes e reduzem a

inflamao; e os imunossupressores no corticosterides que impedem a rejeio de

rgos transplantados e podem ser utilizados no tratamento da doena auto-imune

(RUDNICK, 2003).

Considerando as necessidades de controle e equilbrio entre as duas

atividades (a imunoestimulao e a imunossupresso) para o funcionamento

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=imunossupressores&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=radia%C3%A7%C3%A3o&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=linf%C3%B3citos&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=ant%C3%ADgenos&lang=3

13

imunolgico normal, a busca por novos medicamentos com baixa toxicidade e mais

eficazes no tratamento das imunopatologias, e o fato da grande diversidade vegetal

do nosso planeta poder ser uma importante fonte de substncias com atividade

imunomoduladora, desde a dcada de 80 a identificao e caracterizao de

compostos naturais com atividade imunomodulatria tem se apresentado como rea

de interesse cientfico (COSTA et al., 2008; PHILLIPSON, 2003).

A linfoblastognese, ou ensaio de proliferao de linfcitos, um dos modelos

in vitro empregados para avaliar o efeito desses compostos naturais sobre a

proliferao celular (DEVI et al., 2003).

2.3 Consideraes Gerais sobre Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)

A espectroscopia de RMN foi desenvolvida no final da dcada de 1940

objetivando-se o estudo das propriedades de ncleos atmicos. Em 1951, os

qumicos perceberam que a espectroscopia de RMN tambm poderia ser usada para

determinar as estruturas de substncias orgnicas (SILVERSTEIN, 1998).

Segundo esse estudo, os ncleos de alguns elementos, como 1H e 13C,

comportam-se como se fossem ms girando em torno de um eixo. Desta forma, se

um composto contendo H1 ou C13 for colocado em um campo magntico muito forte

e irradiado simultaneamente com energia eletromagntica, os seus ncleos podem

absorver energia atravs de um processo chamado de ressonncia magntica.

Nesse contexto, ressonncia refere-se transio do spin nuclear entre os nveis

de energia e em resposta radiao de radiofreqncia (KOSKELA, 2005;

SILVERSTEIN, 1998).

Essa absoro de energia quantizada e produz um espectro caracterstico

para o composto, sendo a absoro medida em espectrmetros de RMN. Para isso

dois tipos de espectrmetros podem ser utilizados: os de Onda Contnua (OC) e os

de Transformada de Fourier (TF) (BENTO, 1997; GIL e GERALDES, 1987).

Mtodo de Onda Contnua (CO):

No espectrmetro de onda contnua utiliza-se um m que gera um campo

magntico e um oscilador de freqncia de rdio. A condio de ressonncia pode

14

ser obtida de duas maneiras: irradiando a amostra com energia eletromagntica de

freqncia varivel, enquanto que o campo magntico mantido constante, ou ainda

irradi-la com freqncia constante, enquanto a fora do campo magntico variada

(KOSKELA, 2005).

Estas duas abordagens so chamadas de freqncia varrida e campo varrido,

respectivamente, e nas duas tcnicas, a amostra est em continua irradiao da

radiofreqncia transmitida. Cada ncleo excitado individualmente, levando-se

vrios minutos para ser fornecido o espectro, originado diretamente como uma

funo da freqncia (BENTO, 1997; WILLIAMS e FLEMING, 1987).

Mtodo de Transformada de Fourier (TF)

Ao contrrio do mtodo OC, no qual cada ncleo irradiado com freqncias

consecutivas, a amostra irradiada por um pulso curto e poderoso de rdio

freqncia, que excita todos os ncleos simultaneamente. Quando os ncleos

relaxam, produzem um sinal complexo chamado decaimento livre da induo (FID)

(GIL e GERALDES, 1987; SILVA, 2002).

Um computador converte as informaes que so fornecidas como uma funo

do tempo (FID) para um formato em funo da freqncia, atravs de uma operao

matemtica chamada Transformada de Fourier, produzindo um espectro em poucos

segundos. Neste espectro podem ser explorados, entre outras caractersticas, o

deslocamento qumico (posio do sinal), os acoplamentos (interaes) mostrados

pelos sinais desdobrados e a rea do pico (integrao) (HOLLER et al., 2002).

Deslocamento Qumico () em ppm

Em uma determinada molcula alguns ncleos esto em regies de maior

densidade eletrnica do que os outros e, como resultado, os ncleos absorvem

energia em foras de campos magnticos ligeiramente diferentes.

Conseqentemente, os sinais para esses prtons ocorrem em posies diferentes

no espectro de RMN. A posio na qual um sinal aparece no espectro de RMN

chamada deslocamento qumico, e esse deslocamento depende do ambiente

15

magntico de cada ncleo, do efeito anisotrpico, do efeito do solvente e das

ligaes de hidrognio (GIL e GERALDES, 1987; SILVERSTEIN, 1998).

Os deslocamentos qumicos so medidos em uma escala de (). Diz-se que os

sinais esquerda do espectro aparecem em campo baixo (alta frequncia) e aqueles

direita aparecem em campo alto (baixa frequncia). Uma caracterstica observada

a relao entre o nmero de sinais no espectro e o nmero de diferentes tipos de

ncleos de hidrognio no composto (PARELLA,1998; WILLIAMS e FLEMING, 1987).

Acoplamento (J) em Hz

A multiplicidade de um sinal em um espectro de RMN aparece como uma

conseqncia das interaes magnticas entre ncleos com spin (I 0) transmitido

atravs das ligaes da molcula e isto conhecido como acoplamento escalar

(spin-spin). O sinal de RMN de um ncleo acoplado para n ncleos equivalentes

com spin I ser dividido em um multipleto com (2nI+1) linhas (KOSKELA, 2005).

distncia, em hertz (Hz), entre duas linhas, ou seja, entre dois picos adjacentes

de um sinal de RMN desdobrado, chamado de constante de acoplamento (J). No

caso do acoplamento a trs ligaes em fragmentos H-C-C-H, o J ir depender do

ngulo diedro, no qual a relao de Karplus correlaciona o valor da constante de

acoplamento com o ngulo diedro (SILVA, 2002; MACKIN, 1996).

Integrao

No clculo das reas de cada sinal, o mais importante no a sua altura, mas a

rea abaixo deste sinal. Esta rea proporcional ao nmero de hidrognios que

deram origem ao sinal. O programa que gera o espectro mede essas reas

automaticamente e constri curvas de integrao sob cada sinal (SHOOLERY, 1972;

SILVERSTEIN, 1998).

Relaxao Nuclear

Existem dois tipos principais de processos de relaxao em RMN: a relaxao

spin-rede (ou longitudinal) e a relaxao spin-spin (ou transversal). A relaxao

16

longitudinal um decaimento exponencial de primeira ordem, caracterizado por um

tempo de relaxao T1 (tempo de vida mdio dos ncleos no estado de maior

energia). A relaxao transversal tambm um processo de primeira ordem, que

pode ser caracterizada por um tempo de relaxao T2, sendo a causa do

alargamento das linhas de RMN (MACKIN, 1996; HOLLER et al., 2002).

RMN de 13C

Os espectros de C13 so normalmente menos complexos e mais fceis de

interpretar do que os espectros de RMN H1. Um aspecto dos espectros de RMN de

13C que simplifica o processo de interpretao que cada ncleo de carbono em

uma molcula orgnica produz apenas um pico de RMN de C13, isto por que os

efeitos do acoplamento carbono-carbono, responsveis pelo desdobramento de

sinais em picos mltiplos, so cancelados (HOLLER et al., 2002; PARELLA,1998).

Os ncleos de C13 so de baixa abundncia, de pequena razo giromagntica e

de sensibilidade baixa. Os espectros de RMN de C13 s podem ser obtidos por

espectrmetros de pulso de RMN TF, onde se torna possvel o acmulo de FIDs

(HOLLER et al., 2002; REIF et al., 1996).

DEPTs

Na interpretao de um espectro de RMN de C13 de grande utilidade

identificar quais sinais pertencem ao ncleo de C (quaternrio), CH (metnico), CH2

(metilnico) e CH3 (metila). Para as aplicaes de rotina, os experimentos DEPT 90

e DEPT 135, so suficientes. O DEPT 90 gera somente os sinais dos grupos CH,

enquanto que o DEPT 135 gera sinais negativos para os ncleos de carbono em

grupos CH2 e sinais positivos para os grupos CH e CH3 (SILVA, 2002).

Experimentos de RMN Bidimensionais

- COSY (Homonuclear Correlation Spectroscopy)

17

Um dos experimentos de RMN 2D aplicado ao 1H chamado de

espectroscopia de correlao 1H - 1H (COSY). No espectro COSY, sinais de

correlao so observados quando dois ncleos interagem um com o outro atravs

de um acoplamento escalar. Com esta tcnica possvel estabelecer as correlaes

entre os hidrognios que esto acoplados por 2-3JH,H (acoplamentos geminais e

vicinais), discernindo a multiplicidade dos sinais do espectro de RMN 1H (PARELLA,

1998; KAISER, 2000).

- HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Atravs dessa tcnica, que depende dos acoplamentos 1JC,H, pode-se

distinguir os carbonos que contm os hidrognios j anteriormente assinalados no

espectro de RMN1H, ou vice-versa. O espectro apresenta um eixo horizontal,

dimenso F2, que corresponde ao H e um eixo vertical, dimenso F1,

correspondente ao C (KAISER, 2000; SILVA et al., 2005).

- HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

O experimento HMBC, normalmente realizado para a caracterizao estrutural

de molculas orgnicas naturais e sintticas, uma tcnica de correlao

heteronuclear que fornece informaes sobre as interaes escalares entre prtons

e carbonos a longa distncia e separados por duas, trs ou quatro ligaes

covalentes (SILVA et al., 2005; RICCIO et al., 2003).

- NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)

O NOESY tem o aspecto de um COSY e a sua utilizao permite que

correlaes espaciais, estreitamente espaadas, entre ncleos sejam observadas

simultaneamente em uma nica experincia. Assim, esta tcnica mostra as

correlaes que envolvem interaes devidas ao NOE entre hidrognios que esto

espacialmente prximos, estabelecendo a configurao de cada hidrognio na

molcula, podendo definir a geometria molecular do composto em estudo (BENTO,

1997; KAISER, 2000).

18

3. EXPERIMENTAL

3.1 Local de Realizao do Trabalho

A coleta do material botnico foi realizada em Salinas (MG) pelo grupo de

botnica da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), dentro do projeto

do Milnio de estudo da biodiversidade nordestina (IMSEAR).

Os procedimentos de preparao do extrato e de isolamento, purificao e

identificao estrutural dos constituintes qumicos do extrato etanlico das folhas de

Z. tuberculosa foram realizados nos Laboratrios de Pesquisa em Recursos Naturais

(Figura 02-a), e de Ressonncia Magntica Nuclear (Figura 02-b), do Instituto de

Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas.

Os ensaios de atividades biolgicas (inibitria da linfoproliferao) dos

extratos e fraes de Z. tuberculosa foram realizados no Laboratrio de Engenharia

Tecidual e Imunofarmacologia do Centro de Pesquisas Gonalo Muniz da Fundao

Oswaldo Cruz em Salvador-BA.

Figura 02. Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais (a), Laboratrio de

Ressonncia Magntica Nuclear (b)

3.2 Material Botnico

A espcie Z. tuberculosa foi coletada em agosto de 2006, na cidade de

Salinas (MG), pela Dra. Tnia Ribeiro, e selecionada no projeto do Milnio de estudo

da biodiversidade nordestina IMSEAR. Uma exsicata encontra-se depositada no

Herbrio de Plantas Medicinais da UEFS em Feira de Santana (BA), com o n 186.

a b

19

3.3 Material, Equipamento, Mtodo de Extrao e Purificao

3.3.1 Solventes - Os solventes utilizados foram: etanol, hexano, clorofrmio, acetato

de etila, acetona, metanol e gua destilada, sendo que na preparao do extrato

bruto, nas parties, filtraes e colunas cromatogrficas os solventes utilizados

foram destilados no Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais, enquanto que

nas cristalizaes e recristalizaes foram utilizados solventes de grau PA (Merck).

3.3.2 Anlise cromatogrfica - O adsorvente utilizado nas filtraes e separaes

cromatogrficas em coluna foi o gel de slica G 60 (70-230 Mesh ASTM, Merck,

Darmstadt - Alemanha) e nas anlises feitas atravs de cromatografia em camada

delgada (CCD) utilizou-se como adsorvente a slica gel 60 PF254 da Merck

(Darmstadt - Alemanha). Na preparao das placas de CCD foi utilizado um

espalhador mecnico com espessura de 0,25 mm, para a distribuio da suspenso

de slica com gua destilada (10 mL) sobre as placas de vidro, que foram ativadas

em estufa a 100 por uma hora. Tambm foram utilizadas placas de CCD da Merck

(Merck, Darmstadt - Alemanha); o comprimento e o dimetro das colunas utilizadas

variaram conforme as quantidades das amostras e de gel de slica utilizados. A

quantidade da slica foi de 20 a 25 vezes a quantidade da amostra.

3.3.4 Reveladores - Os cromogramas nas cromatoplacas foram visualizados por

irradiao com Luz na regio do Ultravioleta (UV), nos comprimentos de onda 254 e

366 nm, por imerso em cuba com Iodo, seguindo-se por borrifao com Sulfato

Crico, ou Anisaldedo, ou soluo de cido Fosfomolibdico 5% ou soluo de

Liebermann-Burchard. As placas aps borrifao foram aquecidas em estufa por 5

minutos, a 100 C.

- Para a soluo de Sulfato Crico dissolveu-se 2,1 g de Ce(SO4)2 em uma soluo

contendo 21 mL de H2S04 e 50 mL de gua destilada. Em seguida adicionou-se mais

gua destilada completando o volume da soluo para 300 mL.

- Para a soluo de Anisaldedo foi preparada uma mistura de 3 mL de Anisaldedo

com 150 mL de cido Actico Glacial, a qual foi adicionada a uma soluo de 6 mL

de H2S04 e 141 mL de gua destilada.

20

- Para a soluo de cido Fosfomolibdico 5% dissolveu-se 5 g de cido

Fosfomolbdico em 100 ml de lcool Etlico a quente (80-90C), por 5 minutos.

- Para a soluo de Liebermann-Burchard misturou-se 50 mL de Anidrido Actico

com 10 gotas de cido Sulfrico concentrado.

3.3.5 Mtodo de Extrao - Na preparao do extrato etanlico utilizou-se uma

forrageira para triturao das folhas (Nogueira, Itapia - So Paulo) e um extrator de

ao inoxidvel para extrao (Fabra - So Paulo). As concentraes das solues

contendo grandes volumes de solventes foram efetuadas em evaporador rotativo

sob presso reduzida, enquanto que as solues contendo pequenos volumes foram

concentradas temperatura ambiente em capela de exausto.

3.3.6 Mtodo de Purificao - O procedimento de isolamento do princpio ativo do

extrato etanlico envolveu um conjunto de tcnicas seqenciais como: a partio

lquido-lquido, a coluna filtrante de slica, a cromatografia em coluna de slica e

cristalizao. Esse conjunto de tcnicas fez-se necessrio por que o extrato bruto da

planta utilizada rico em diversos componentes e sua anlise cromatogrfica direta

seria extremamente trabalhosa, por isso o uso prvio da partio lquido-lquido e da

coluna filtrante permitiu o fracionamento do extrato etanlico bruto em misturas

menos complexas e em nmero pequeno, facilitando o trabalho de isolamento. A

pureza das substncias isoladas foi visualizada pela obteno de uma s mancha na

placa cromatogrfica, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes.

3.3.7 Espectrmetros - Os espectros de RMN unidimensionais (H1, C13, DEPT 135,

DEPT 90) e bidimensionais (HSQC, HMBC, COSY e NOESY) foram realizados em

espectrmetro BRUKER AVANCE (400 MHz para H1 e 100 MHz para C13). Os

deslocamentos qumicos dos sinais dos carbonos dos solventes deuterados

utilizados foram expressos em escala de (delta). A espectrometria de massas foi

realizada em aparelho Shimadzu, modelo GCMS-QP5050A acoplado ao

cromatgrafo gasoso. Foram obtidos os espectros de massas por ionizao qumica

com isobutano no modo positivo. Os espectros na regio do Infravermelho da

substncia ZTC9, foram feitos em soluo de KBr na forma de pastilhas.

21

3.3.8 Polarmetro - A rotao ptica foi realizada em polarmetro Rudolph Research

Analytical (AUTOPOL IV, Automatic Polarimeter), em cubeta de 10 cm, utilizando-se

o comprimento de onda de 589 nm a temperatura de 26,6 C.

3.4 Etapas de Isolamento do Princpio Ativo

3.4.1 Preparao do Extrato Etanlico Bruto das Folhas de Z. tuberculosa

As folhas secas de Z. tuberculosa (5400 g) foram trituradas a p em uma

forrageira (Nogueira, Itapira So Paulo). O material depois de pulverizado foi

submetido extrao com 20 L de Etanol a 90 % a temperatura ambiente (261 C)

por 3 dias e filtrado. O procedimento de extrao com o resduo foi repetido por trs

vezes. Aps evaporao do solvente por destilao a presso reduzida em aparelho

rotatrio a 50 C e remoo da gua residual em dessecador obteve-se o respectivo

extrato bruto (600,45 g), identificado como ZTB.

3.4.2 Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa

Uma suspenso de 100 g do extrato etanlico bruto em uma soluo de

gua/Metanol (3:2) foi extrada sucessivamente com Hexano (4 x 500 mL),

Clorofrmio (4 x 500 mL), Acetato de Etila (4 x 500 mL) e Butanol (4 x 500 mL). O

processo foi realizado seis vezes. Aps remoo do solvente por destilao a

presso reduzida foram obtidas seis fraes em Hexano (ZTP1) (90,30 g; 13,59 %),

Clorofrmio (ZTP2) (223,60 g; 33,65 %), Acetato de Etila (ZTP3) (25,40 g; 3,82 %);

Butanol I (ZTP4) (15,45 g; 2,33 %), Butanol II (ZTP5) (20,70 g; 3,11 %) e

Hidroalcolica (ZTP6) (220,5 g; 20,39 %) (Fluxograma 1, p. 22).

A partio com Butanol deu origem a duas fraes: ZTP4 e ZTP5. Isto

aconteceu porque medida que a fase butanlica foi sendo concentrada as

primeiras coletas apresentaram-se como sendo um concentrado oleoso, j as

ltimas coletas quando concentradas mostraram-se slidas, por isso a fase foi

separada em duas fraes, butanlica I (oleosa) e butanlica II (slida).

No projeto do Milnio do Semi-rido estas fraes j tinham sido preparadas

e submetidas aos ensaios de atividade inibitria da linfoproliferao, na

22

FIOCRUZ/BA. A frao clorofrmica apresentou-se ativa quanto inibio da

linfoproliferao. Por isso, a ZTP2 tambm foi a frao escolhida, nesta nova

partio, para dar continuidade ao processo de isolamento do princpio ativo.

Fluxograma 1. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de

Z. tuberculosa.

3.4.3 Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB

Aps solubilizao em Clorofrmio, a frao ZTP2 (215,0 g) foi incorporada

em gel de slica ativada utilizando como solvente: Hexano, Clorofrmio, Metanol e

mistura dos mesmos, fornecendo nove fraes identificadas conforme mostra a

23

tabela 01, as quais foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD e

reveladas com Anisaldedo, Sulfato Crico e/ou vapores de Iodo.

A anlise das fraes provenientes da ZTP2 em CCD serviu de suporte para

esta prxima cromatografia, onde foi selecionada para fracionamento a frao em

clorofrmio identificada por ZTF3. Esta frao foi escolhida porque estava mais pura

a olho nu.

Tabela 01. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB

Frao da Filtrao Peso da Amostra

Hexano (ZTF1) 0,40 g

Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF2) 105,80 g

Clorofrmio (ZTF3) 10,80 g

Clorofrmio/Metanol 2% (ZTF4) 15,75 g




Clorofrmio/Metanol 1:1 (ZTF8) 13,25 g

Metanol (ZTF9) 9,00 g

3.4.4 Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2

A frao ZTF3 (10,50 g) de cor verde-escura, aps solubilizao em

clorofrmio, foi incorporada em slica gel ativada e submetida a cromatografia em

uma coluna de slica (200 g). Foram utilizados como solventes: Hexano, Clorofrmio,

Metanol e mistura dos mesmos, fornecendo oito fraes, conforme mostra a tabela

02 (p. 24).

Essas fraes foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD e

reveladas com Anisaldedo, Sulfato Crico e/ou vapores de Iodo.

24

Tabela 02. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2


Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.1) 0,06 g

Clorofrmio (ZTF3.2) 2,55 g

Clorofrmio/Metanol 2% (ZTF3.3) 5,25 g




Clorofrmio/Metanol 1:1 (ZTF3.7) 0,07 g

Metanol (ZTF3.8) 0,03 g

3.4.5 Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3

Aps a anlise das fraes da filtrao da ZTF3 atravs de cromatografia em

camada delgada (CCD) e revelao com Sulfato Crico, foi realizada ento uma

filtrao com a frao identificada como ZTF3.3 (5,0 g) de maior massa. Esta frao

foi solubilizada em Clorofrmio e incorporada em gel de slica ativada utilizando

como solventes: Hexano, Clorofrmio, Metanol e mistura dos mesmos, fornecendo

cinco fraes, identificadas como mostra a tabela 03.

Essas fraes foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD

usando Sulfato Crico como revelador. Todas as fraes desta filtrao mostraram

ser iguais na CCD e por isso foram reunidas e fracionadas em uma coluna

cromatogrfica.

Tabela 03. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3


Hexano/Clorofrmio 30 % (ZTF3.3.1) 2,20 g

Hexano/Clorofrmio 30 % (ZTF3.3.2) 1,30 g

Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.3.3) 1,15 g

Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.3.4) 0,10 g

Clorofrmio (ZTF3.3.5) 0,05 g

25

3.4.6 Fracionamento Cromatogrfico I, Cristalizao e Recristalizao das

Fraes Reunidas da Filtrao da ZTF3.3

O material obtido aps a reunio das fraes da filtrao da ZTF3.3 (4,80 g),

foi solubilizado em Clorofrmio, incorporado em slica (8 g) e submetido a uma

cromatografia em coluna de slica gel. Foram utilizados como fase mvel os

seguintes solventes: Hexano, Clorofrmio, Metanol e misturas destes. Foram

coletadas 85 subfraes com um volume de 5 mL cada. Essas subfraes, aps

anlise comparativa atravs de CCD, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes e

revelao com cido fosfomolibdico e sulfato crico, foram reunidas conforme a

Tabela 04 (p. 26).

As subfraes, na anlise comparativa atravs de CCD, mostravam uma

grande quantidade de clorofila. O trabalho de isolamento de constituintes de extratos

de folhas normalmente apresenta como problema a remoo da clorofila, pois a sua

natureza qumica e cor forte se torna um problema na purificao dos compostos.

Para a remoo da clorofila, as fraes foram lavadas com acetona. O

processo foi satisfatrio, possibilitando a cristalizao de um slido de cor branca,

que foi separado de sua gua-me de cor verde por filtrao em funil de buckman.

O slido foi solubilizado com Etanol (P. A.), a quente, a seguir submetido a

ultrassom e aps 24 h, foi filtrado em um funil de Bchner. Seguiram-se

recristalizaes de cada subfrao e anlise em CCD. A subfrao (48 78)

mostrou dois pontos na placa e devido quantidade foi selecionada para

fracionamento em coluna (II).

As subfraes (1), (2 - 4) e (79 - 85) no foram trabalhadas devido pequena

quantidade e complexidade demonstrada em CCD. As demais subfraes

codificadas conforme mostra a Tabela 04 (p. 26) demonstraram em CCD apenas um

ponto na placa, e apesar da semelhana entre si receberam cdigos diferentes e

foram levadas para anlise de RMN.

26

Tabela 04. Fracionamento Cromatogrfico das Fraes Reunidas da Filtrao da Frao ZTF3.3

Subfraes Reunidas

Condio de Eluio Massa (g) das Subfraes

Substncias Isoladas

(1) Clorofrmio/Hexano 1:1 0,12

(2 4) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,08

(5 9) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,59 ZTC1




(32 34) Clorofrmio 0,53 ZTC5

(35 47) Clorofrmio 1,98 ZTC6

(48 78) Clorofrmio/Metanol 5 % 4,55

(79 85) Clorofrmio/Metanol10 % 0,04

3.4.7 Fracionamento Cromatogrfico II, Cristalizao e Recristalizao da

Subfrao (48 78) Proveniente da Coluna I

A subfrao (48 78) (4,00 g), proveniente da coluna I foi solubilizada em

Clorofrmio/Metanol 5%, incorporada em gel de slica e submetida a uma

cromatografia em coluna de slica (100 g). Foram coletadas 56 subfraes com um

volume mdio de 5 mL cada, utilizando-se como fase mvel Hexano, Clorofrmio,

Metanol e mistura destes. Essas subfraes, aps anlise comparativa atravs de

CCD, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes e revelao com cido

Fosfomolibdico e Sulfato Crico, foram reunidas em 8 grupos (Tabela 05, p 27).

27

Tabela 05. Fracionamento Cromatogrfico da Subfrao (48 78)

Subfraes Reunidas Condio de Eluio Massa(g) Substncias Isoladas

(1 3) Hexano/Clorofrmio (30%, 40%, 50%)

0,81

(4 12) Hexano/Clorofrmio (60%, 80%)

0,31

(13 19) Clorofrmio e

Clorofrmio/Metanol (2%, 5%)

0,41 ZTC7

(20 26) Clorofrmio/Metanol (5%, 10%)

0,18 ZTC8

(27 31) Clorofrmio/Metanol (10%, 20%)

0,17 ZTC9

(32 34) Clorofrmio/Metanol (20%)

0,30

(35 42) Clorofrmio/Metanol

(20%, 50%) 0,79

(43 56) Metanol 0,39

As subfraes (1 - 3) e (4 - 12) so oleosas e mostraram-se complexas em

CCD, As subfraes (32 - 34), (35 - 42) e (43 - 56) demostraram, aps anlise

comparativa em CCD, possuirem o mesmo slido encontrado na subfrao (27 - 31),

alm de vrias outras substncias, e por isso no foram trabalhadas. As subfraes

(13 - 19), (20 -26) e (27 - 31), apresentaram um nico ponto em CCD, foram

solubilizadas com Etanol (P. A.) a quente, a seguir submetido a ultrassom. Aps 24

h, foram filtradas em um funil de Bchner.

Aps recristalizaes sucessivas em Etanol, obteve-se um produto slido de

cor branca, para cada uma das trs amostras codificadas como mostra a Tabela 05.

Estas trs subfraes foram submetidas anlise de RMN.

28

3.4.8 Fracionamento Cromatogrfico III, Cristalizao e Recristalizao da

Frao ZTF3.2

A frao ZTF3.2, tabela 02 (p. 24), (2,30 g) foi lavada com acetona, seguindo-

se cristalizao de grande quantidade de um slido de cor branca, que foi separado

de sua gua-me de cor verde com o auxlio de uma pipeta. O slido foi ento

recristalizado em Etanol (PA). A anlise em CCD mostrou mais de um ponto na

placa, sendo necessrio o seu fracionamento cromatogrfico.

A frao ZTF3.2 (2,30 g) foi solubilizada em Clorofrmio, incorporada em gel

de slica e submetida a uma cromatografia em coluna de gel de slica (50 g). Foram

coletadas 35 subfraes com um volume mdio de 5 mL cada, utilizando-se como

fase mvel Hexano, Clorofrmio e mistura destes.

Essas subfraes, aps anlise comparativa atravs de CCD, utilizando-se

diferentes sistemas de eluentes e revelao com cido fosfomolibdico e sulfato

crico, mostraram-se puras e semelhantes s subfraes (ZTC 1 - 6) j isoladas da

coluna I. Apesar da semelhana, as fraes 10, 19 e 27, escolhidas de forma

aleatria, receberam cdigos diferentes como ZTC10, ZTC11 e ZTC12 (Tabela 06),

sendo ento enviadas para identificao e posterior comparao com as subfraes

isoladas da coluna I.

Tabela 06. Fracionamento Cromatogrfico da Frao ZTF3.2

Subfraes Condio de Eluio Massa (g) Substncias Isoladas

(10) Clorofrmio/Hexano

2:1 0,06 ZTC10


2:1 0,11 ZTC11


2:1 0,09 ZTC12

29

3.5 Prospeco Fitoqumica

Foram realizados os testes de prospeco fitoqumica com o extrato ZTB das

folhas da Zeyheria tuberculosa, seguindo-se a descrio de Matos, 1997. Os

mtodos utilizados nesta abordagem so apenas qualitativos. Para os testes foram

utilizados sete tubos de ensaio, numerados de 1 a 7. Em cada tubo foram colocados

3 mg do extrato solubilizados em 4 mL de Etanol.

3.5.1. Teste para Fenis e Taninos

Para esse teste foram utilizadas duas solues que j estavam preparadas:

- Soluo de cloreto frrico (FeCl3) Adicionou-se 9 g de FeCl3 em 50 mL de

gua destilada contendo 2 mL de cido clordrico 3 mol.L-1. Em seguida completou-

se o volume para 100 mL com etanol, em um balo volumtrico.

- Soluo de HCl 3 mol.L-1 Adicionou-se 33,3 mL de HCl concentrado em

gua destilada suficiente para 100 mL de soluo, em um balo volumtrico.

No tubo de ensaio de nmero 1 foram adicionadas trs gotas de soluo

alcolica de FeCl3 1 mol.L-1. Agitou-se bem e observou-se a variao de cor e a

formao de precipitado verde escuro abundante. Este resultado foi comparado com

um teste em branco, usando-se gua e FeCl3. A colorao variando entre azul e

vermelho indicativo de fenis. A formao de um precipitado azul escuro indica a

presena de taninos piroglicos (taninos hidrolisveis). A cor verde indica a presena

de taninos flobabnicos (taninos condensados ou catquicos).

3.5.2 Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonoides

Para este teste foi preparada um soluo de NaOH 1 mol.L-1 dissolvendo-se 4

g deste reagente em gua destilada para 100 mL de soluo em balo volumtrico.

O tubo de nmero 2 foi acidulado com HCl 3 mol.L-1 a pH 3 e os tubos 3 e 4 foram

alcalinizados com NaOH 1 mol.L-1 a pH 8,5 e 11, respectivamente. A observao de

30

qualquer mudana da colorao da soluo foi interpretada como mostrado na

tabela 07.

Tabela 07. Variao de Colorao Observada nos Tubos (I)

Constituintes

Cor

Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

cido pH = 3

Alcalino pH = 8,5

Alcalino pH = 11

Antocianinas e Antocianidinas Vermelha Lils Azul Prpura

Flavonas, Flavonis e Xantonas - - Amarela

Chalconas e Auronas Vermelha Vermelha - Vermelho Prpuro

Flavanonis - - Vermelho Laranja

3.5.3 Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas

O tubo 5 foi acidulado por adio de HCl 3 mol.L-1 at pH 1 - 3 e o tubo 6 foi

alcalinizado com NaOH 1 mol.L-1 at pH 11. Os tubos foram cuidadosamente

aquecidos. Foi observada modificao na colorao por comparao com os tubos

com pH correspondentes usados no teste anterior. A interpretao dos resultados foi

feita como mostrado na tabela 08.

Tabela 08. Variao de Colorao Observada nos Tubos (II)

Constituintes

Cor

Tubo 5 Tubo 6

Meio cido Meio Alcalino

Leucoantocianidinas Vermelha -

Catequinas (Taninos Catquicos) Pardo-amarelada -

Flavononas - Vermelho Laranja

31

3.5.4 Teste para Flavonis, Flavanonas, Flavanonis e Xantonas

No tubo de nmero 7, foram adicionados alguns miligramas de magnsio

granulado e 0,5 mL de HCl concentrado. Aguardou-se o trmino da reao indicado

pelo fim da efervescncia. Comparou-se a cor dos tubos 5 e 7 (acidificados). O

aparecimento ou intensificao da cor vermelha indicativo da presena de

flavonis, flavanonas, flavanonis e/ou xantonas, livres ou seus heterosdios.

3.5.5 Teste para Esteroides e Triterpenoides

Adicionou-se 10 mL de uma soluo etanlica do extrato em um bquer e

deixou-se secar em banho-maria. Extraiu-se o resduo seco do bquer com trs

pores de 2 mL de CHCl3. Filtrou-se a soluo clorofrmica em um pequeno funil

fechado com um pouco de algodo, coberta com uma pequena quantidade de

Na2SO4 anidro, para um tubo de ensaio bem seco. Adicionou-se 1 mL de anidrido

actico e agitou-se suavemente. Juntou-se cuidadosamente trs gotas de H2SO4

concentrado. Tornou-se a agitar suavemente, e foi observado se havia o rpido

desenvolvimento de cores. A colorao azul seguida da verde permanente um

indicativo da presena de esterides livres. A colorao parda at vermelha indica

triterpenides pentacclicos livres.

3.5.6 Teste para Saponinas

Os resduos insolveis em clorofrmio, separados no teste anterior, foram

solubilizados em gua destilada e a soluo foi filtrada para um tubo de ensaio.

Agitou-se fortemente o tubo com a soluo, por trs minutos e observou-se a

formao da espuma. Uma espuma persistente e abundante (colarinho) indica a

presena de saponinas.

32

3.5.7 Teste para Alcalides

O extrato foi colocado em um tubo de ensaio, solubilizado com metanol e

submetido CCD. Aps eluio, a placa foi revelada com reagente de Dragendorff.

O surgimento de manchas de cor alar

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