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  • TT31

    A DETERMINAO DA TOXICIDADE AGUDA DE EFLUENTES COM BACTRIAS MARINHAS - VIBRIO FISCHERI

    JOSIMAR ALMEIDA

    BILOGO PS-DOUTORADO ENGENHARIA AMBIENTAL.PROFESSOR ESCOLA DE ENGENHARIA DA UFRJ/PROFESSOR ASSOCIADO DO IPEN/USP

    GUSTAVO AVEIRO LINS

    BILOGO, ESPECIALISTA EM MEIO AMBIENTE E EM EDUCAO. PROF. SEE/RJ/ CEDERJ; AGENTE DE SANEAMENTO CEDAE

  • A DETERMINAO DA TOXICIDADE AGUDA DE EFLUENTES COM BACTRIAS MARINHAS - Vibrio fischeri JOSIMAR ALMEIDA; GUSTAVO AVEIRO LINS NATUREZA DO TRABALHO: PROFISSIONAL A determinao da toxicidade aguda de substncias qumicas e efluentes lquidos pode ser de grande importncia na definio de um impacto ambiental. A tcnica apresentada utiliza bactrias marinhas da espcie, Vibrio fischeri, na constatao da toxidade em efluentes lquidos e guas residuais, superficiais e lenis freticos. Contaminao, BTEX, BIOSCREEN, Biorremediao.

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  • Resumo

    A determinao da toxicidade aguda de substncias qumicas e efluentes lquidos para bactrias marinhas - Vibrio fischeri, determinada pela inibio da emisso de luz nas culturas das referidas bactrias, atravs do acompanhado por uma combinao especfica de volumes da amostra testada ou da diluio da amostra com a suspenso de bactrias nas cubetas. O critrio do teste o decaimento da luminescncia medida atravs do contato da amostra com a suspenso bacteriana em 5, 15 e 30 minutos, levando em conta o fator determinado pelo controle. A porcentagem de inibio calculada a cada concentrao testada e depois com estes dados agrupados possvel calcular a concentrao da soluo testada que causou 50% de inibio a populao de bactrias submetidas amostra.

    O mtodo aplicvel para todos os tipos de efluentes lquidos, guas residuais com cor, substncias qumicas solveis em gua ou que nela possam ser dispersadas por meios qumicos (solventes orgnicos) e/ou fsicos (agitao mecnica, banho ultra-som), guas superficiais e lenis freticos.

    O objetivo principal do trabalho descrever a metodologia empregada na determinao da toxicidade aguda de efluentes lquidos e de substncias qumicas para bactrias bioluminescentes marinhas Vibrio fischeri. EXPOSIO REAGENTES E SOLUES: Soluo de lcool a 70%

    Em uma proveta de 1000 mL, adicionar 700 mL de lcool etlico hidratado e completar para 1000 mL com gua destilada e deionizada (gua d.d.). Encher alguns pissetes com esta soluo.

    Soluo de ajuste osmtico NaCI 22% Pesar 220g de NaCI e dissolver em um bcher de 1000mL adicionar 800mL de gua destilada e deionizada ou Milli-Q depois avolumar em balo de 1000mL e ajustar o pH. Soluo diluente (soluo de cloreto de sdio P.A. NaCI a 2% - soluo salina) Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Soluo de cido sulfrico 0,1 Mol (H2SO4 0,1 N) Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Soluo de cido sulfrico 1 Mol (H2SO4 1 N) Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Soluo de hidrxido de sdio 0,1 Mol (NaOH 0,1 N)

    Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Soluo de hidrxido de sdio 1 Moi (NaOH 1 N)

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  • Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Solues de hidrxido de sdio e soluo de cido sulfrico concentradas tambm podem ser usadas

    Conforme TRLAB-MA-28 "Preparo de Solues" Bactrias bioluminescentes marinhas - Vibrio fisheri. RECURSOS Materiais:

    Fotmetro de preciso MICROTOX M500 ou 2055 Micropipeta de 10 a 1000 J-lL e respectivas ponteiras Macropipeta de 5 mL com volume varivel Medidor de pH (pH-metro) Cubetas de leitura para Microtox (corpo nico e cubetas de leitura para

    correo de cor) 5.2.6 - Pipetas Pasteur Geladeira Freezer (preservao de bactrias). Autoclave Centrfuga Sacos plsticos para autoclavagem Fita autoclave Pissete Cronmetro Capela de fluxo laminar

    Organismos-teste

    Como organismo-teste, utilizam-se bactrias bioluminescentes marinhas Vibrio fisheri. Obteno de bactrias marinhas liofilizadas (Vibrio fishen) para ensaio

    Retirar um frasco contendo bactrias liofilizadas marinhas do freezer e deixar chegar temperatura ambiente durante 15 minutos, com auxlio de um cronmetro calibrado.

    Transferir 1 mL da soluo reconstituinte ou soluo salina a 2% para uma cubeta de leitura deixar na cmara de estocagem de um dos instrumentos, previamente ligado, durante 15 minutos.

    Remover a tampa do frasco do liofilizado de bactrias. Retirar a cubeta contendo soluo reconstituinte ou soluo salina a 2%

    aclimatada, da cmara de estocagem, e to rpidO quanto possvel, transferir o contedo da cubeta para o frasco de liofilizado. Nota: No usar pipeta para reconstituio do liofilizado.

    Homogeneizar o liofilizado reconstitudo (suspenso bacteriana) com auxlio de uma pipeta de 0,5 mL, enchendo-a e esvaziando-a, repetidamente, por cerca de 10 vezes. Nota: O liofilizado reconstitudo contm, aps sua

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  • reconstituio, aglomerados microscpicos. A mistura acima quebra estas aglomeraes, auxiliando na disperso uniforme do liofilizado. .

    Preservar a soluo-estoque, com bactrias marinhas na cmara de estocagem do instrumento.

    Obteno de bactrias marinhas (Vibrio fishen) para ensaio:

    Alm de liofilizadas as bactrias podem estar em meios lquidos. Em meio lquido basta apenas em capela de fluxo laminar retirar 1 mL da suspeno para uma cubeta de leitura e acondicionar no espao destinado ao reagente no Microtox. Solues-teste: Inspeo visual da amostra:

    Amostras fortemente coloridas, turvas ou com slidos em suspenso podem interferir no resultado do teste. Uma inspeo visual da amostra deve ser feita para verificar se esta possui cor, turbidez ou slidos suspensos suficientes para interferir ou no no ensaio, procedendo da seguinte maneira.

    Amostras de Efluentes

    Se a amostra possuir grande quantidade de slidos suspensos, ajustar o pH entre 7,0 +/- 0,2 com as solues descritas nos itens 4.1.3 a 4.1.7, e deix-Ia em repouso para que ocorra a decantao das suspenses ou centrifug-Ia, de maneira que a fase lquida clarificada seja suficiente para a realizao do ensaio.

    Caso a amostra seja turva e a decantao no seja vivel para a separao das fases (slida da lquida), deve-se realizar o ensaio, verificando se a faixa de inibio est relacionada com a diluio que apresenta a turbidez, (ver exemplos 1 e 2).

    Caso a amostra possua forte colorao, porm sem slidos em suspenso, proceder a neutralizao e o ensaio da mesma, verificando se a faixa de toxicidade est relacionada com a diluio que apresenta colorao, (ver exemplos 1 e 2). Ex. 1:

    Diluio Inibiao (%)50% 100% 25% 100% 12,5% 100% 6,2% 100% 3,1% 80%

    Obs. : Neste caso no necessrio o ensaio de correo de cor da amostra; Ex. 2:

    Diluio Inibio (%)50% 100% 25% 85% 12,5 63%

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  • 6,2% 39% 3,1% 15%

    Obs.: Neste caso, como na diluio com a colorao mais forte houve inibio, que foi decrescendo de acordo com a diminuio da colorao, necessrio o ensaio de correo de cor da amostra (item 7.0 deste procedimento). Amostras de Substncias Qumicas:

    Caso a amostra possua forte colorao, porm sem slidos em suspenso, proceder a neutralizao e o ensaio da mesma, verificando se a faixa de toxicidade est relacionada com a diluio que apresenta colorao, (ver exemplos 1 e 2). PROCEDIMENTO DE ENSAIO:

    Colocar cubetas limpas nas cmaras de incubao e de estocagem. Adicionar 1 mL de soluo de reconstituio para uma cubeta e colocar na

    cmara de estocagem por 10 minutos, com auxlio de um cronmetro calibrado, e transferir 1 mL de diluente (soluo de NaCI 2%) nas cubetas de A 1 a A4. No adicionar nada na cubeta A5. Transfira 500 L de diluente (soluo de NaCI 2%)nas cubetas B1 a B5. Obs.: Estas diluies devem ter duas vezes o valor da concentrao que se quer testar, pois ao se misturar suspenso bacteriana na razo 1:1 nas cubetas de leitura, obtem-se as concentraes desejadas. Ex.: Para analisar uma amostra a 25%, deve-se prepar-Ia a 50%. Desta maneira, quando a mesma for misturada na cubeta na razo 1:1 com soluo diluente (NaCI 2%) ficar, ento, com concentrao final de 25%.

    Reconstitua o reagente biolgico vertendo rapidamente o contedo da cubeta que se encontrava no espao destinado ao reagente no reagente biolgico. Homogeneizar o contedo e esperar mais 10 minutos, com auxlio de um cronmetro calibrado, antes de transferir aliquotas desta soluo para as cubetas teste.

    Preparo da amostra:

    Adicionar 2,5 mL da amostra na cubeta A5 e adicionar 250 L de soluo de ajuste osmtico.

    Para preparar as diluies transfira 1 mL da amostra de A5 para A4, homogeneizar e assim por diante at a cubeta A2. A cubeta A1 ser a cubeta do controle e dever ter 1 mL da soluo de NaCI a 2%.

    Transfira 10L da suspenso bacteriana para as cubetas B1 a B5. Ateno para no se formarem bolhas durante a pipetagem garantindo que o volume tenha sido totalmente adicionado, esperar 15 min, com auxlio de um cronmetro calibrado, para que seja atingido o equilbrio trmico, antes de comear a ler a intensidade luminosa.

    Aps os 15 minutos ler as cubetas 81 a 85 (esta a leitura no tempo O). Transfira 500L da cubeta A1 para B1, A2 para B2 e assim sucessivamente at A5 para B5.

    Repita a operao de leitura 15 minutos aps ter adicionado as amostras nas cubetas com bactrias (esta a leitura no tempo 15), com auxlio de um

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  • cronmetro calibrado. Execuo do teste: O teste pode ser executado em uma ou duas etapas:

    a) Se necessrio, um teste preliminar pode ser executado para estabelecer o intervalo de concentraes a ser testado no ensaio definitivo (em geral, necessrio realizar este teste para substncias qumicas e amostras que nunca tenham sido analisadas por este mtodo).

    b) Teste definitivo que permite determinar os resultados finais.

    1) Para realizao de um teste preliminar da substncia-teste, preparar solues-teste de modo a abranger uma faixa ampla de concentraes em progresso geomtrica, preferencialmente com razo 10 entre as concentraes, por exemplo: 0,1; 1; 10 e 100 mg/I (substncia-qumica).

    2) Para realizao do teste definitivo utilizar a razo 2 para o intervalo das concentraes, por exemplo: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 e 3,2 mg/I (subst.-qumica) ou 1; 2; 4; 8; 16 e 32 % (efluente). RESULTADOS Clculo da porcentagem de inibio:

    O efeito txico da substncia-teste sobre as bactrias luminescente calculado da seguinte maneira: IAO x (IC15/ICO) - IA15 / IAO x (IC15/ICO) * 100 = % INIB. Onde, % INIB = % inibio da emisso de luz na concentrao/diluio i (soluo-teste). IAO = Intensidade luminosa ( na diluio/concentrao i ) da soluo-estoque de bactrias sem presena da amostra, no tempo zero. IA 15 = Intensidade luminosa da sol.-estoque de bactrias em presena da substncia-teste no tempo 15. ICO = Intensidade luminosa do controle no tempo zero. IC15 = Intensidade luminosa do controle no tempo 15. Clculo de CE50 Para Efluentes

    Calcular a CE50 graficamente plotando os valores de % inibio versus as correspondentes concentraes ou diluies da substncia-teste em papel grfico semilogartimico ou logprobit (concentraes na escala logartimica). Ajustar uma reta para os pontos. Extrair deste grfico a CE50 - concentrao da amostra correspondente a 50% de inibio de emisso de luz. Para Substncias Qumicas

    Calcular a CE50 e seu intervalo de confiana a 95 % pelo mtodo de prbitas,

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  • conforme procedimento. Correo da cor:

    Amostras aquosas extremamente coloridas, particularmente aquelas que so vermelhas ou marrons, podem causar redues no-especficas no nvel de luz emitida quando testadas de acordo com este mtodo. Estas redues no nvel de luz no podem ser distinguidas, pelo instrumento, daquelas causadas por ao txica. O procedimento abaixo. utilizando-se cubetas de correo da absorvncia (CCA - corpo duplo) especialmente desenhadas, mede a magnitude da interferncia devido cor de uma amostra. Esta medida ento usada para corrigir matematicamente os resultados obtidos pelo mtodo padro.

    Usar o seguinte procedimento para executar a medida de correo da absorvncia:

    Pipetar 1,5 mL de soluo salina a 2% na cmara externa da CCA e colocar na torre de leitura do fotmetro.

    Pipetar 1,0 mL de suspenso bacteriana em uma cubeta padro e colocar numa das cmaras de incubao do fotmetro.'

    Pipetar 2,0 mL de amostra na concentrao escolhida, normalmente a maior concentrao testada, em uma cubeta padro e coloc-Ia numa das cmaras de incubao do analisador.

    Esperar por, pelo menos, 5 minutos, com auxlio de um cronmetro calibrado, para que todas as solues possam atingir o equilbrio trmico. As medidas de correo da absorvncia devem ser feitas na mesma temperatura do teste.

    Transferir, para a cmara interna da CCA, uma quantidade de suspenso bacteriana, previamente climatizada, suficiente para igualar o nvel de lquido com a soluo salina na cmara externa.

    Ajustar a faixa de medio e ao 16 minuto, comear a registrar as leituras da emisso de luz apresentadas no instrumento, a cada minuto, at o 20 minuto, com auxlio de um cronmetro calibrado.

    Considerar os cinco ltimos minutos de registro para efeito de clculos. Logo aps o 20 minuto, com auxlio de um cronmetro calibrado, to rpido

    quanto possvel, remover a maior quantidade possvel da soluo-salina da cmara externa da CCA com auxlio de uma pipeta de Pasteur, sem retir-Ia da torre.

    Rinsar a cmara externa da CCA com amostra na concentrao desejada, adicionando e, em seguida, retirando aproximadamente 1 mL de amostra na cmara externa, com o auxlio de uma pipeta de Pasteur.

    Com a CCA ainda na torre, adicionar a amostra na cmara externa at o nvel da suspenso na cmara interna.

    Retomar a leitura da emisso de luz a partir do 22 minuto, registrando as leituras da emisso de luz apresentadas no instrumento, a cada minuto, at o 26 minuto, com auxlio de um cronmetro calibrado.

    Clculos para correo da absorvncia Clculo da IO e do IF. IO = l20 min. - ((I16 min. - I20 min) /4)

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  • IF = l28 min. + 7 ((I28 min. - I32 min.) /4) Clculo da absorvncia devido cor na concentrao da amostra usada no ensaio de correo (Ac).

    Ac =3,1 ln * IO / IF

    Obs.: A constante 3,1 um fator para a CCA que corrige diferenas geomtricas entre ela e a cubeta padro. Clculo da absorvncia devido cor para cada concentrao de interesse (Ax). Ax = C / Co * XAc Onde C a concentrao de interesse e Co a concentrao para qual Ac determinada. Clculo da transmitncia para cada concentrao testada (Tx). Tx = 1- C-Ax / AxClculo da correo das % inibio. %INIBjC = %INIBjC -100 (1- Tx) Tx Onde %INIBiC = % inibio da emisso de luz na concentrao i, aps correo do efeito da absorvncia. PROCEDIMENTOS DE BIOSSEGURANA NO MANUSEIO DA BACTRIAS LIOFILIZADAS MARINHAS

    Todo material utilizado na manipulao de "Bactrias Liofilizadas Marinhas" deve ser acondicionado em bcher de vidro contendo etanol a 70% ou embrulhado em papel alumnio. O material deve ser, posteriormente, autoclavado a 121C por 20 minutos, com auxlio de um cronmetro calibrado.

    Caso haja derramamento de suspenso de "Bactrias Liofilizadas Marinhas", deve-se desinfetar o local imediatamente com papel absorvente molhado em etanol a 70%. O material usado na desinfeco deve ser adicionado a bcher de vidro forrado com saco de autoclavagem contendo lcool a 70% ou embrulhado em papel alumnio. O material deve ser, posteriormente, autoclavado a 121C por 20...

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