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5/10/2018 Trascri o - slidepdf.com

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C A P I T U L O

1 1T r a n s u i ~ a o eP r o c e s s a m e n t o d o R N A

T o p i c o sIII 0 Controle Genetico do

Metabolismo: Uma Visao Geral

• Transfereneia da mformacae

Genetica: 0 Dogma Central

• 0 Processo de Expressao Genica

• Transcrlcao em Procariontes

• Transcricao e Processamento de

RNAem Eucariontes

II Genes Interrompidos em

Eucariontes: Excmse introns

II Remor;a.o de int.rons por

Recomposic;ao do RNA

Spliceossomo processando um transcrito genico,

E s t o c a g e m e T r a n s m i s s a o d a I n fo r m a \a o

c o m C 6 d ig o s S im p le sVivemos na era do computador. Ele tem um impacto em praticamente todos

os aspectos de nossas vidas, desde dirigir ate 0 trabalho de observer naves

espaciais pousando na lua, Estas rnagicaseletronicas podem estocar, recupe-

rar e analisar dados com a velocidade da luz. a "cerebro" do computadore urn pequeno chip de sllicio, 0 microprocessador, que contern urnarranjo

sofisticado e integrado de circuitos eletronicos capazes de responder quase

instantaneamente a impulses codlficados de energia eletrica. Efetuando coi-

sas incriveis, 0cornputador usa urn ccdigo binario, uma linguagem baseada

em 0 e 1 . Assim, a alfabeto usado pelos computadores e como 0do codigoMorse (pontos e traces) usado na telegrafia. Ambos consistem emapenas

dais sirnbolos, em marcante contraste com as 26 tetras do alfabeto Ingles.

2 8 9



1 9 0 I I T R A N S C R I ~ A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

Obviamente, se 0 computador pode fazer suas magicas com um alfabeto binario,

grandes quantidades de informac;:6es podem ser estocadas e recuperadas sem usar

c6digos complexos ou alfabetos extensos. Neste e no capitulo seguinte, exarninare-

mos (1) como a inforrnacao genetica dos seres vivos e escrita em um alfabeto com

apenas quatro letras, os quatro pares de bases no DNA, e (2) como essa inforrnacao

genetica e expressa durante 0 crescimento e 0 desenvolvimento de um organismo.

Veremos que 0 RNA tem um papel central no processo da expressao genica.

o C O N T R O l E G E N E T I C O D O M E T A B O L I S M O :U M A V I S A O G E R A lOs genes codificam enzimas, e as enzimas catalisam os

processos rnetabollcos em organismos vivos.

A capacidade dos organismos vivos de crescer e se re-

produzir depende de urn grande mirnero de reacoes quimi-

cas. Os organismos devem sintetizar muitos tip os diferen-

tes de rnoleculas das quais sao compostos e degradar outras

molecules para obter energia utilizada no crescimento. As

plantas tern a capacidade de usar energia da luz do sol para

a sintese de macromolecules, mas os animais devem obter

energia dos alimentos que ingerem. Essa energia e obtidapor quebra de moleculas grandes em moleculas menores e

conversao da energiaderivada deste processo em energia

quirnica estocada. Todas as reacoes que ocorrem em orga-

nismos vivos coletivamente sao chamadas de metabolismo,

e uma molecula organics que e sintetizada ou degradada edenominada metabolite. Nos quatro capitulos seguintes, exa-

minaremos urn quadro detalhado do controle genetico do

metabolismo e apresentaremos evidencias que documentam

as caracteristioas mais irnporrantes deste guadro. Cornecare-

mos com uma breve revisao do controle genetico do meta-

bolismo, que deve ajudar-nos a integrar as varias partes do

quadro a rnedida que cada componente e adicionado.

Nos anos 1850, Louis Pasteur estudou a conversao de

acucar em alcool por "fermentos" em Ieveduras, Os ferrnen-

tos de Pasteur foram depois chamados de enzimas, e, em

1897, Eduard Buchner extraiu enzimas de celulas de leve-

dura, permitindo que tais "catalisadores" sejam estudados

in vitro.

Um catalisador e uma substancia que perrnire que uma

reacao ocorra sem ser modificada no processo. As enzimas

catalisam reacoes metab6licas ligando-se fortemente a mo-

leculas especfficas, chamadas substratos, e as mantem em jus-

taposicao, de modo que a energia necessaria para a reacao,

a e ne rg i» d e a ti va [i io , seja reduzida. 0 resuitado final e queligacoes covalentes podem ser rearranjadas em temperaturas

biologicas, as temperaturas do corpo de organismos vivos.

Embora lisados celulares fossem amplarnente usados para

estudar reacoes catalisadas por enzirnas durante a primeira

quarts parte do seculo vinre, a natureza quimica das enzimaspermaneceu aberta a debates. Entao, em 1926,]ames Sum-

J

ner extraiu a enzima urease de carocos de jaca, purificou-a na

forma cristalina e demonstrou que ela consistia inteiramente

em urn tipo de. macromolecula chamada proteina, Sabe-se

que proteinas contern constituintes chamados aminodcidos

desde 0 inicio dos anos 1900, mas somente nos anos 1950,

quando a estrutura da pequena proteina insulina foi deter-minada, e que a cornplexidade de cada protefna foi avaliada.

Aminoacidos sao pequenas moleculas organicas com uma

gama de estruturas quimicas, mas todos contern um grupo

amino (-J\THz) e urn grupo carboxila (-COOH). Os 20 ami-

noacidos diferentes presentes em proteinas fornecem-Ihes

uma grande diversidade estrurural, Uma proteina pode con-

ter uma unica cadeia de aminoacidos, chamada polipeptideo,

ou duas ou rnais cadeias (Cap. 12).

Milhares de enzimas ja forarn purificadas. A maioria ede proteinas com atividade catalitica, mas algumas sao mais

complexes, com cornponentes adicionais, As enzimas exibem

especificidade marcante - cada enzima catalisa uma reacao

ou algumas reacoes muito similares, Elas variam de tamanho

de cerca de 12.000 a mais de 1rnilhao de daltons. A especifi-

cidade de cada enzima resulta de sua sequencia {mica dos 20

arninoacidos. De fato, foi essa variabilidade essencialmente

ilimitada de estruturas de proteina que Ievou muitos geneti-

cistas a acreditar que as proteinas, e nao os acidos nucleicos,

estocavarn a inforrnacao genetica.

A sequencia de arninoacidos de cada polipeptideo e C011-

trolada por urn gene, e cada polipeptideo tern um papel es-

trutural, regulat6rio ou enzimatico na celula. Alem disso,

cada enzima catalisa uma reacao metab61ica especifica. E11-

tretanto, 0 quadro fica mais complexo neste ponto porque

os processos metabolicos raramente envolvem apenas uma

reacao catalisada por enzima. Em vez disso, a sintese ou a

degradacao de um metabolito especifico em geral ocorre par

uma sene de reacoes catalisadas por enzimas, 0 conjunto

completo de reacoes catalisadas por enzimas necessarias para

sintetizar on degradar um deterrninado rnetabolito e cha-mado uma via metabolica. Por exemplo, considere a biossm-

tese da arginina, um dos 20 arninoacidos presentes na maio-

ria das proteinas. Em E. coli, a sintese de arginina ocorre em

oito etapas, cada uma catalisada pot uma enzima especifica

(Fig. 11.1). As oito enzimas sao compostas de nove produtos

genicos; uma enzima, a ornitina-carbamoiltransferase, con-

tern dois produtos genicos diferentes (ArgF e ArgI).

Em geral, cada etapa de uma via metabolica requera ati-vidade de nma enzirna, e cada enzima con tern um ou mais

{



T R A N S F E R E N C I A D A I N F O R M A \ A O G E N E T I C A : 0 D O G M A C E N T R A L a 2 9 1

Gene

Glu tamato

COOH - CH - ICHz )z - COOHINH 2

0 G ' ~Enzimar argA ~ N-Acei i lgluiamai t rs in tase

J

Acetilglutariato

COOH - CH - (CH2h -COOHI

CH ,.- C - NH~ II

o . IargB ~ N-Acet i lglutamato-Cinase 'i't

A c et il gl ut am i lf o s fa to

COOH - CH - (CH2 i2- C - 0-0I II

CH3-C -NH 0IIo

"\AP'I

t\L Ac etlig IU ia mllto sfa tC 1'- re ou ta se ~' •

Acetaglutarnato-seraie lce lco

COOH - CH - (CH 'iz - e - HI i II

CH , - e - NH ao II

o

argO c : : : : > N-Acet i lorn i t lna.t ransamin i lSP " 0 7+Acetilornitina

eOOH - CH -ICH 2h - NH2I '

eH 3 - C - NHIIo

lJ'~rgE ~. N-Acet l lDrl l i l lnase

Orni t ina

eOOH - CH - (C H 2 )3 - NH 2 '

I

NH 2

argF +Orn rnne -carbamcut rans t e -ase "'~-Y

arg i V

Citruhna

COOH - CH - (CH 2 )3 - NHI . . I

NH z NHrC=O

J"\Apl

argG c:8> Argln inDsSUCClnatO'5ln tetase ~-y ,

Argin inos.5ucc inato

COOH - CH - (CHz )r NH COOHI I INH2 NH2 - C~N - CH

ICHzICOOH

argH c : : : : 3 > Argtn inossuCCInase

Arginma

COOH - CH - (CHz )r NHI INH2 NHz - C ~NH

Fig .11 .1 _ 0 controle genetico da via biossinterica dearginina em

E. coli. Nove genes codifitam oito enzirnas que catalisam as oito

etapas desta via metabolica.

polipeptfdeos, Como cada polipepndec eespecificado por

urn gene, cada uma das etapas em uma via metabolica preci-

sad. do produto de pelo menos urn gene. Urn quadro geral

de controle das vias metabolicas e apresentado na Fig. 1L2.Embora a maioria dos genes codifiquern proteinas, os pro-

dntos finais de alguns genes sao rnoleculas de RNA. Vanas

destas molccnlas de RNA tern papeisessenciais na sintese

de proteinas. Consideraremos suas funcoes em detalhes no

Cap. 12. Como as genes control am as estruturas dosRNA

e.de proteinas, devernos perguntar em seguida como as se-

quencias de pares de nucleotideos nas moleculas de DNA

especificarn as seqiiencias de nucleotfdeos no RNA e de ami-

noacidos nas rnoleculas de protefna.

_ P O N T O S I M P O R I A N T E S

I l!i 0 metabolisrno ocorre por sequencias de reac;6es catalisadas

par enzimas, com cada enzima especificada por urn ou rnais

genes,

T R A N S F E R E N C I A D A I N F O R M A ~ A O

G E N E T I C A : 0 D O G M A C E N T R A L

o dogma central da biologia e que a informacaoestocada no DNA etransferida para molecules de

RNA durante a transcricao e para proteinas durante a

traducao.

De acordo com 0 dogma central da biologia molecular,

a informacao genetica geralmente flui (1) de DNA para DNA

durante sua transmissaode gera~ao a gera~ao e (2) do DNA

para proteina durante a expressao fenotipica em urn orga-

nisrno (Fig. 11.3). Durante a replicacao de virus com RNA,

a informacao tambem e transmitida de RNA para RNA, A

transferencia de inforrnacao genetica do DNA para prote-

ina envolve duas etapas: (1) rranscricao, a transfereneia de

informacao genetica do DNA para 0 RNA, e (2) tradueao,

a transferencia de informacao do RNA para proteina. Alem

disso, a inforrnacaogenetica flui do RNA par(l 0 DNA du-

rante a conversao dos genomas dosvirus mmorais com RNApara suas formas pro-virais com DNA (Cap. 18). Assim, a

transferencia de informacao genetics do DNA para 0 RNA

a s vezes e reversfvel, enquanto a transterencia da informacso

do RNA para proteina e sempre irreversivel.

Transcri~i l)e Tr adu~ao

Como jii discutido, a expressao da inforrnacao genetics ocorre

em duas etapas: transcricso e traducao (Fig, U.3), Durante

a transcricao, urn filamento de DNA de urn genee usado

como urn molde para sintetizar urn filamento complemen-

tar de RNA, denorninado transcrito genico. Par exemplo,

na Fig, 11.3,0 filamento de DNA contendo a sequencia de

nucleondeos AAA e usado como urn molde para produzir a

- - - ~ ~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -



1 9 2 ill T R A N S C R I~ A o E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

I G en e A

tE nzim a A

Gen e B

+Enz ima B

Gen e C,Enz ima C

Gen e D

VEnz ima D

Fig . 112 • 0 controle genetico

do metabolisrno. A via rnetabolica

mostrada contern quatro eta pas;

algumas vias sao rnais curtas e outras

sao muito majores. Alern disso,

algumas enzimas contern os produtos

de dois ou rnais genesdiferentes.

Su bs tr a to - -- -- -- .. ln te rrn ed ia rio I ~ ln te rm eo ia rlo II ____ .... ln te rrn ed ia rio III ___ ..... Produto f ina l

R e a < ;a o 1 Real;3o 2 Reacao 3

o dogma centralF lu xo d e i n l o rmacao gene t i ca :

1. P e rp etu ac ao d e in to rrn ae ao g en etic a d e gera~ao a g e ra ca o

2.Contro le

do

fenotipo:

Pol ipeptideo I./\J\.I\f\_fV Fen

Repticacao

DNA-polimerJse

dependente de DNA

Fxpressao

gen i ca

Transcricao reversa

DNA-po l imerase dependen te

de RNA ( tr an s c ri pt as e r ev e rs a l

TraducaoP t oc e s so c o rn p te x o

envolvendo r ibossornos,

tRNA e outras

molecu les

sequencia complementar UU1J no RNA transcrito. Durante

a traducao, a sequencia de nucleotideos no RNA transcrito

e convertida na sequencia de aminoacidos do polipeptideo

produzido pelo gene. Essa conversao e governada pelo co-

digo genetico, a especificacao de arninoacidos por trincas

de nucleotideos chamadas codons no transcrito genico. POl'

exemplo, a trinca UUD no RNA transcrito mostrado na Fig.

11.3 especifica 0 arninoacido fenilalanina (Fen) no polipep-

tfdeo produzido pelo gene. A traducao ocorre em maquinas

macromoleculares complexas chamadas ribossomos, que

sao compostas de tres a cinco moleculas de RNA e 50 a

90 proteinas diferentes. Entretanto, 0processo de traducao

tarnbem requer a participacao de rnuitas outras rnacromole-

culas. Este capitulo enfoca transcricao; traducaoe0 assunto

do Cap. 12.

Reacao 4

Fig . 11 .3 • 0 fluxo da inforrnacao genetica de

acordo com 0 dogma central da biologia molecular.

Replicacao, transcricao e traducao ocorrem em

todos os organismos; ocorre transcricao reversa em

celulas infectadas por alguns virus com RNA. Nao e

mostrada a transferencia de inforrnacao de RNA para

RNA durante a replicacao de virus com RNA.

As moleculas de RNA que sao traduzidas nos ribossomos

sao chamadas RNA mensageiros (mRNA). Em procarion-

tes, 0 produto de transcricao, 0 transcrito primario, em

geral e equivalente a rnolecula de mRNA (Fig. 11.4,1) . Em

eucariontes, os transcritos primaries geralmente devem ser

processados pela excisao de seqiiencias especificas e pela mo-

dificacao de ambas as pontas antes que sejam traduzidos (Fig.

ll.4b). Assim, em eucariontes, transcritos primaries geral-

mente sao precursores de mRNA e, como tal, sao chamados

de pre-mRNA. A maior parte dos genes nucleares em eu-

cariontes superiores e alguns eucariontes inferiores contem

seqiiencias nao codificantes chamadas introns gue separam as

seqiiencias expressas ou exons destes genes. Seqiiencias in-

teiras destes genes divididos sao transcritas em pre-mRNA, e

as seqiienoias Intron 11aO codificantes sao subsequentemente



o P R O C E S S O D E E X P R m A o G E N I C A iii 2 9 3

(aj Procariontes.

m R N A f W 1 G ~ ( A ) n

VTradur.;:~o

(b ) Eucar ion tes .

fig.11.4 • A sintese. de proteinas envolve duas eta pas: transcricao

e traducao, tanto em procariontes (a ) quanto em eucariontes ( b ) .

Alern disso, em eucariontes, os transcritos primaries ou pre-mRNA

em geral devern ser processados pela rernocao de intronse a adicao

em 5' de Cap. 7-metilguanosina (MG)e caudas poli(A) [ (A}n] em 3'.

removidas por r ea qoe s d e r ecompo siq iio Coplic in g) feitas em estru-

turas macromoleculares chamadas spliceossomos.

C i n c o T i p O S d e M o l e c u l e s d e R N A

Cinco classes diferentes de rnoleculas de RNA desempe-

nharn papeisessenciais na cxpressiio genica. J a discutimos as

RNA mensageiros, os intermediaries que levam inforrnacao

genetics do DNA para.os ribossornos onde sao sintetizadas

as proteinas. Os RNA transportadores (tRNA) Sao peque-

nas moleculas de RNA que funcionam como adaptadores

entre aminoacidos e os c6dons no mRNA durante a tra-

ducao. Os RNA ribossflmicos (rRNA) sao componentesestruturais e cataliticos dos ribossomos, rnaquinas complexas

que traduzem as sequenciasde nucleotideos dos mRNA em

seqtiencias de aminoacidos de polipepndeos. Os pequenos

RNA nueleares (snRNA) sao componentesestrururais dos

spliceossornos, estruturas nucleares que rernovem intronsde. geues nucleares. Os micro-RNA (niiRNA) sao RNA

unifilamentares curtos, com 20 a 22 nucleotideos, que sa o

corrades de precursores peqllenos em forma de grampo e

bloqueiam aexpressao de mR.c~A cornplernentares on par~

cialmente cornplementares causando sua degradacao ou re-

primindo sua traducao, Os papers dos mRNA e snRNA sao

discutidos neste capitulo. As esrruturas e funcoes dos tRNA

.e rRNA serao discutidas em detalhe no Cap. 12. Os rneca-

nisrnos pelos quais os rniRNA regulam a expressao genica

sao discutidos no Cap. 21.

Todos os cinco tipos de RNA - mRNA, tRNA, rRNA,

snRNA e rniRNA - san produzidos pOl' transcricao, Ao con-

trario dos mRNA, que especificam polipeptideos, os produ-tos finais dotRNA, do rRNA, do snRNA e do miRNA sao

rnoleculas de RJ."\TA.s molecula« de RNA transportador, do

RNA ribossomioo, do snRNA e do miRNA nao sao tradu-

zidas. A Fig. 11.5 rnostra uma visao geral da sintese de pro-

tefnas em eucariontes, destacando a origem transcricional e

funcoes dos cinco tipos de rnoleculas de RNA. Q prQcesso

e similar em procariontes. Entretanto, em procariontes, 0

DNA naoe separado dos ribossomos por urn envoltorio

nuclear. Alern disso, genes procarioticos raramente contem

sequencias nfio codificantes que sao rernovidas durante. 0

processamento do RNA transcrito.

_ P O tH O S I M P O R T A N T E S

• 0 dogma central da biologia molecular e que a informacao

genetica flui de DNA para DNA durante a replicacao crornosso-

mica, do DNA para 0RNA durante a transcricao e do RNA para

proteina durante a traducao.

II A rranscricao envolve a sintese de um RNA transcrito comple-

mentar a um filarnento de DNA de um gene.

• Traducao e a conversao de lnforrnacao estocada na sequencia

de nudeotideos no RNA transcrito para a sequencia de amino-

acidos no polipeptfdeo produzido pelo gene, de acordo com

as especificacoes do codigo genetico.

o P R O C E S S O D E E X P R E S S A O G E N I C A

A inforrnacao estocada nas sequenclas de nucleotideos

dos genes e traduzida em sequencias de arninoacidos de

prcteinas par interrnediarios instaveis charnados.Rblx

mensageiros.

De gue modo os genes controlam 0 fenotipo de urn

organismo? Como as sequencias de nucleotideos dos genes

dirigem 0 crescimento e 0 desenvolvimento de uma celula,

urn tecido, urn orgao ou todo urn ser vivo? Os geneticistas

sabem que 0 fen6tipo de urn organismo e produzido pelosefeitos combinados de todos os seus genes queagem dentro

- - . ~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -



I

1 9 4 T R A N S C R I t ; : A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

l)

I snRNA I s >o u

rRNA

O U

tRNA

(a) T ra n sc ri ca o e p ro ce s sam e nt o d o RNA o co rre m n o ru icleo,

T R A D U < ; A O

C I T O P L A S M A

Ribossomo

I

Cade i a /Ja

po li pep t fd i ca - c.@(,=v~

.G)-v

8"

~~G f /

~r.::::Iw.0Y

Reserva tor fos

c it op la smat ic o s d eam in o ac id o s, t RNA,

subun idades r ibosso rn ice«

~~

@ ) ~

~ C i 0~(i)8

Am in oacldos+- ~

Subunidades nboss6micas

~

We

________ ~ m iRNA

/~ /ou""

- - e ~Clivagem

do mRfIlA

mRNA - Q-AAAA~

R e p - r e s s a o

da t r a d u c ; a o

(b) T r ad uc ao o co rre n o c it op la sm a .

F ig .1 1..5 • Uma visao geral da sintese de proteinas, destacando a origem transcrlcional de miRNA, snRNA, tRNA, rRNA e mRNA, a funcao

de recornposicao de snRNA, a regulacao da expressao genica par miRNA e as papers traducionais de tRNA, rRNA, mRNA e r ibossomos, Dicere urna nuclease que process-a 0precursor de miRNA em miRNA, e RiSe e 0camplexo s ilenciador induzido par RNA.



o P R O C E S S O D E E X P R E S S A O G E N I C A I I I 2 9 S

h W m

[ N ' F o g u t T E t N I C O : I v i d e n c i a d e u r n R N A M e n s a g e i r o I n s t a v e lA prirneira evidencia da existenciade um RNA .interrnediarto na

Ifritese de pretefnasvelo de estudos de Elliot Yolkin e Lawrence

Astrachan ern bacterias infectedas por virus bacterlanos, Seus re-

s,ult<\.dos"publi,cados em 1956, sugeriram que.a sintese de protei-

nas virais ernbacterlas infectadas envolvia molecules instaveis de

RN',4.especificadas por ciNAviral ..Yoikin e Astrachan observararn

urnsilrto de sintesede RNA apos infsccao de bacterias E . coli com

o~bactenofago Tl..Ma:rcando 0 RNA com 0 isotcpo radioativo

32p, eles dernonsrrararn que as rnoleculas de RNA recern-sinte-

tiz~as erarn instaveis, renovando-se com rneia-vida de apenas

aLguns.minl:I.tQS,Alk'm pisso, 'eies mostraram que a cornposicac de

nl-!clegtideos.dcisRNAinstaveis era similar a cornpesicao do DNA.de'T2 e diferente da do DNA de E . coli. Seus resultados logo foram

arnpliadnspor estudos em outros laboratories.

Em 1961, Sol Spiegelman e colaboradores relataram que os

RNA instaveis strtretizados em celulas infectadas pelo fago T4 po-

derlarn formar dupJices RNA-DNA com DNA de T4 desnaturado,

mas nao com DNA de E. coli desnaturado, Eles fizeram pulses de

marcacao das bacteriascom 3H-uridina em varies momentos apos

infecc;1io com fago T4, isolaram 0 RNA total destascelulas e de-

terminaram se as molecules de RNA radieativo hlbridlzavarn com

o DNA'de E. coli ou do fago T4; Seu experimento esta diagrarnado

na Fig..1.

Seus resultados (Fig. 2) demonstraram que a rrraiorla das rno-

leculas de RNA de vida curta. sintetizadas ap6s infeccao eramcomplementares a filarnerrtosunicos do DNA do fago T4 e nao

coml?lerIJentares a filarnentos unicos do DNA de E . coli,.indicando

Cfueelas foram produzidas a partir de moldes do DNA do fago T4,

e nao de moldes do DNA de f.coli.

Na mesmo ano em que Spiegelman e colaboradores publica-

ram seus resultados, Sydney Brenner, Franc;ois Jacob e Matthew

Meseisqn demcnstraram que as proteinas do fago T4 erarn sinte-

tizadaserrr ribossornos de E. coli. Assirn, as sequencias de amino-

acidos das proteinas T4nao foram centroladas par componentes

dos rlbossomos. Em vez dissc os rtbossornos eram as bancadas de

-trabalhonas quais ocorria asintese.de proteinas, mas naoderarn

as especificacoes para proteinas individuais. Estes resultados for-

taleceram a ideia, primeiro formalmente proposta por Francois

Jacob ~Jacques Monod em 1961, de que molecules instaveis de

RNA levavam as especiflcacoes para sequencias de amtnoacidos

de produtos genicos individuals dos gene.s <lOS ribossomos. Pes-

quisas subsequentes estabeleceram firmemente 0 papel desses

RNA instaveis, hoje chamados de RNA mensagelros oumRNA, na

transferencta de inforrnacao genetica de genes para ossitios de

sinte~e·de proteinas no citoplasrna.

r : i g . J IIllI0 €xperimento deSpiegelman,

\?d> ,

"Q"lnfectarbacterias f. c olie om b ac te rio fa go T 4,

" , , - pIt'' A dic io na r 3 H·u rid in aa o m e io e m v arie s

tem pos - 2, 4, 6 , 8 e 10 m inutos-a p6 s in fe cc ao e in cu ba r c elu la s.m fe ct ad as p er u m m in ute .

RNA rad.iQatiitoe s irr te tiz ad o .na bac te ria . ~ . _

.... , "~." ' :".3H·uridinan o m eio4. :'.:~';.·.:.~·,'o ••..

e nas ce lu las .. ' . ..?: .~:....:.c,

"AI'

~-y Rompe r a b a cte ri ae is o la r 0 RNA .

,\Ap

l)7 D ete rm in e q ue p rp po rcfie s doRNA r ad io a tiv o h ib ri dz ar n c omD NA de ·f. co l i e com DNA do fago T4 .

- ,

T od o D N A e d e sn a tu ra do p e lo calor.

Membwnas de DNA den i t roce lu lose contendo: fa go T 4

8ernD N A

DNA de

E . col i

/\f\./, /'\./'V

/\/V /\.f\J.'

-\ ~(-

So lu c ao d e h ib ri di za ( :a oc on te n do R N A radioauvo

"AI'

l!f ln cuba r a 6 5°C de u rn d ia p arao utre , R em ov er e la va r b ern o s

f il tr os . D o sa r r ad io a tiv id ad e emcada filtro.

RNA rao ioanvohibr id izado com DNAdo fago T4

)C(}O()C ..

xxxxx :'~'W

j/\/V~~~.

<.»>Rad ioa t iv i dade a r nb ien ta l



I

1 9 6 • T R A N S C R I ( ; : A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

E N F O Q U E T E C N I ( O : E v i d e n c i a d e u r n R N A M e n s a g e i r o I n s t a v e l ( ( G n t i n H a ~ a o )

RNA rad ioa t iv o

h ib r id iz a do c om

D NA do fago T4

RNA rad ioa t iv o

h ib r id iz a d o c omD N A de E . co li

de lirnitacoes impostas pelo ambiente, Eles tambem sabemque 0 nurnero de genes em urn organismo varia em uma

ampla gama, a mirnero.de genes aumentando de acordo com

a complexidade relacionada ao desenvolvimel~to da especie.

Os genomas de RNA dos menores VIruS tais como 0 fago

MS2 concern apenas quatro genes, enquanto virus maiores

tais como 0 fago T4 tern cerca de 200 genes, Bacterias tais

como E. c o l i tern aproximadamente 4.000 genes, e mamife-

ros, incluindo seres humanos, tern cerca de 25.000 genes.

Neste capitulo enos seguintes, enfocaremos os mecanismos

pelos quais os genes dirigem a sintese de seus produtos, os

RNA e protefnas. Os mecanismos pelos quais estes produtos

genicos coletivamente controlam os fen6tipos de organis-

mos adultos sao discutidos em capitulos subsequences, espe-cialmente 0 Cap. 22.

U r n m R N A I n t e rm e d i a r i o

Se a maioria dos genes de urn eucarionte estao situados no

nticleo e se as proteinas sao sintetizadas no citoplasma, como

estes genes controlam as seqiiencias de aminoacidos de seus

produtos protei cos? A informacao genetica estocada nas se-

qiiencias de pares de nucleotideos nos genes deve de algum

modo ser transferida para os locais de sintese de proteinas no

citoplasrna. Mensageiros sao necessaries para transferencia

de informacso genetics do niicleo para 0 citoplasma. Em-

bora a necessidade de tais mensageiros seja mais 6bvia em

fig. 2 • Mudan9a rapida da transcricao de genes de E coli para genes

do fago T4 em bacteria infectatla pelo T4 .

eucariontes, a primeira evideneia de sua existencia veio deestudos de procariontes (veja Enfoque Tecnico: Evidencia

de urn RNA Mensageiro Instavel).

A sintese de RNA mensageiros on precursores de mRNA

nos nucleos de eucariontes e seu subsequente transporte

para 0 citoplasma pode ser documentada por experimentos

de marcacao de pulso, experimentos de pulso-caca e auto-

radiografia. Se uma celula que cresce em cultura e expostaa urn precursor de RNA radioativo tal como 3H-uridina ou

3H-citidina pOl' alguns minutos e a localizacao intracelular

da radioatividade incorporada e deterrninada por anto-ra-

diografia, 0 RNA marcado esta presente quase que exclu-

sivamente no nucleo (Fig. 11.6a). Entretanto, se a curta ex-

posicao ao precursor radioativo for seguida de urn periodode crescimento em meio niio radioativo, a maioria da radio-

atividade incorporada estara presente no citoplasma (Fig.

1l.6b). Assim, os RNA intermediaries insraveis sao sinteti-

zados no micleo e sao transporrados para 0 citoplasma, onde

dirigem a sintese de proteinas. Neste capitulo, enfocaremos

a sintese, 0 processamentb e 0 transporte destas moleculas

de RNA mensageiro.

C a r a c t e r i s t i c a s G e r a i s d a S in te s e d e R N A

A sintese de RNA ocorre por urn mecanisme que e similarao da sintese de DNA (Cap. 10) excero que (1) os precurso-

res sao trifosfatos de ribonucleosideos e nao trifosfatos de



o P R O m S O D E E X P R E S S A O G E N 1 (A ~ 2 9 7

(a)

(b)

Fig .11 .6 • Auto-radiografias demonstrando a sintese de RNAno

nucleo e seu subsequente transporte para 0citoplasma. Cadaauto-radlografla e superposta sabre uma fotode um corte fino

da celu]a. Os pontos pretos representam gr2lnulos de prata na

ernulsao auro-radiografice que reagiram com eletrons emitidos

pelo decaimento dos atom os de 3H . (a) Uma ce lu la de Tetrahymena

marcada com 3H-citidina par 15minutes. ( b ) Uma celula de

Tetrahymena que foi cultivada em meio nao radioativo par 88

minutes ap6s exposicao a 3H-citidina par 12 minutos.

DNA 3 ' "\!l';\rA'i I'X\ rA'irA'\ r l\\~ /liI \ll\·J ila llle n to m ulde.5'.l!I \W '-'1/ \;IV '-'1/ \XI "",~o,w \.IV" F i lamen t o n a o -mo ld e

S in t ese

de R NA

B 3'

\

\

\

\ P ilam en to rn o lde

3 '-CGTATGCTAGTCC(;A T IGCO-5 '

: ,GCATACGATCAGGCTAACGC3 '

F i lamen to nao - rno lds

m R N A 5'

\

\

5 -GCAUACGAUCAGGCUAACGC-3 '

F ilam en tn de R NA com se ntido

Fig . 11.7 II A sintese de RNAusa urnfiilamento de DNA de urngene como molde .

desoxirribonucleosideos, (2) apenas urn filamento de DNA

e usado como rnolde para a sintese de uma cadeia de RNA

complernentar em determinada regiao e (3) as cadeias de

RNA podem ser iniciadas de novo, sem nenhuma necessi-dade de umfilamento primer preexistente. A molecule de

RNA produzidnsera cornplementar -ao.filamento molde, de

DNi!> . e identica, exceto que as uri din as sao substitnidas por

timidinas, ao filarnenro nao-molde de DNA (Fig. 11.7). Se

a molecula de RNA e um lIiRt"'lA, ela ira especificar aminoa-

cidos no produto genico proteico, Portanto, asmoleculas de

mRt"\fA sao filamentos codificantes de RNA. Elas tambem

sao chamadas filamentos com senrido, de RNA, pois suas

seqiiencias de nuclcotideos "fazem sentido' em especificar

sequencias de arninoacidos nos produtos genicos proteicos.

Uma molecula de RNA que e cornplementar a urn mRNA

e chamada RNA anti-sentido. Esta terminologia a s vezes

e estendida aos dois filamentos de DNA. Entretanto, 0 usados termos com sentido e arui-sentida para indicar os filarnen-

tos de DNA e inconsistente, Ass i rn , usaremosfilamento malde

e [ilamento ndo-moldc para referir-nos aos filamentos trans-

crito e nao transcrito, respectivarnente, de urn gene.

A sintese de cadeias de RNA, como a das cadeias de DNA,

ocorre no sentido 5' ~ 3', com a adicao de ribonucleotideos

ao grupo 3'-hidroxila 110 final da cadeia (Fig. 11.8). A reacao

envolve urn ataque nucleofilico pela 3' -OR ao atomo de

fosforo nucleotidil (interior) do precursor de trifosfato de

S e gm e n to t er mi na l

3 ' de filam en to de

R N A nascen te

I ponta 5'o

I

~O-P=O

I

oI

H 2C

Fi lamento

m olde de

o 0 ~OH

II II \~ ~~O-P-O-P-O-P-O-

I I Io 0_ 0

Trifosfatoe rib on uc le osld co q ue c he ga\

.S en tid o 5 ' ·3 ' d e

crescrnertc dacadeia. . 5'

fig.11.8 IllIA reacao de alongamento de cadeia do RNAcatalisada pela RNAcpolimerase,

. . . ~ . = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -



29 8 III T R A N S C R I \A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

ribonucleosideo com a eliminacao de pirofosfato, como na

sintese de DNA. Esta reacao e catalisada par enzimas cha-

madas RNA-polimerases. A reacao geral e a seguinte:

moldede DNA

n(RTP) (RMP)n + i l . (PP)

RNA-polimerase

onde n e 0rnimero de moles de trifosfato de ribonucleotideo

(RTP) consumido, monofosfato de ribonucleotideo (RMP)

incorporado ao RNA e pirofosfato (PP) produzido.

As RNA-polimerases iniciarn a transcricao em seqiiencias

especfficas de nucleotideos chamadas promotores, que sao

diferentes em procariontes e eucariontes. Uma iinica RNA-

polirnerase faz toda a transcricao na maioria dos procarion-

tes, enquanto tres RNA-polimerases diferentes esrao pre-

sentes em eucariontes, sendo cada polimerase responsavelpela sintese de uma classe distinta de RNA. A sintese de

RNA ocorre dentro de urn segmento de DNA localmente

desenrolado, as vezes chamado bolha de transcricao, que

e produzido pelaRNA-polimerase (Fig. 11.9). A sequencia

de nucleotideos de uma molecula de RNA e complementara de seu filamento rnolde de DNA, e a sintese de RNA egovernada pelas mesrnas regras de parearnento de bases que

a sintese de DNA, mas uracil substitui tirnina.

P O N T O S I M P O R T A N T E S

• Em eucariontes, os genes estao presentes no nucleo, enquanto

as poHpeptideos sao sintetizados no citoplasma.

• As molecules de RNA mensageiro funcionam como intermedi-aries que levam lnforrnacao gcnettca do DNA para os ribosso-

mos, on de as protefnas sao sintetizadas.

A sintese de RNA, catalisada pelas RNA-polimerases, e similara sfntese de DNA em muitos aspectos.

A sintese de RNA ocorre dentro de uma regiao localizada de

separacao dos filamentos, e apenas um filamento do DNA fun-

ciona como molde para sfntese de RNA.

S eg me nto de D NAloca lm en te dese li c oi d iz ado

Fig.11.9 II Sintese de RNAocorre dentro de um segmento

localmente deselicoidizado de DNA.Esta bolha de transcricao

permite que alguns nucleotideos no filamento molde facarn pares de

bases com a ponta crescente da cadeia de RNA.A deselicoidlzacao e

a reelicoidizacao da rnolecula de DNA sao catalisadas pela

RNA-polimerase.

T R A N S C R I ~ A O E M P R O C A R I O N T E S

A transcricao, a primeira etapa na expressao genica,transfere a informacao genetics estacada no DNA, nos

genes, para rnoleculas de RNA mensageira que levam a

inforrnacao para os ribossornos - os sftios de sintese de

protein as - no citoplasma.

As caracteristicas basicas da transcri-

cao sao as rnesmas em procariontes e

eucariontes, mas rnuitos dos detalhes,

tais como as seqiiencias prornotoras,

sao diferentes. A RNA-polimerase de

E.co l i foi estudada em grande detalhe e sera discutida aqui.

EJa catalisa toda a sintese de R-NA nesta especie. As Rl~A-

polimerases de archaea tern estrururas bem diferentes; elasnao serao discutidas aqui.

Urn segmentode DNA que e transcrito para produzir uma

molecula de RNA e chamado de unidade de transcricao.

A s unidades de transcricao podem ser equivalentes a genes

individuais ou podem incluir varies genes conriguos. Grandes

transcritos que levam as sequencias codificantes de varios ge-

nes sao comuns em bacterias, 0 processo de transcricao pode

ser dividido em tresestagios: (1) iniciacao de uma nova cadeia

de RNA, (2) aIongamento da cadeia e (3) termino da trans-

cricao e liberacao da molecula nascente de RNA (Fig. 11.10).

:;'A~'Y

o Inicia'tao da cadeia de RNA

RNA·po l imerase

DNA :

pon ta 5 ' do R NA

"AI'"'1ft! .V' Alongamento da cadeia de RNA

DNA :

5

Cad ei a c re s ce n te d e RNA",AI'

~'Y Termine da cadeia de RNA

DNA :

M o le cu le n as ce n te d e R N A

Fig. 11.10 III Os tres estagios da transcricao: iniciacao, alongamento

e termino.



T R A N S C R I \ A O tM P R O C A R IO N T E S I I I 1 9 9

Ao discutir a transcricao, os bi61ogosgeralmente usam

os term os upSN'eam (amecedente) e down.ltream (posterior)

para se referir .as regioes que estao para a ponta 5' e ponta

3', respectivamente, do transcrito de urn ponto na mole-

cula de mRNA. Estes rermos sao baseados no faro de que a

sintese de RNA sempre ocorre no sentido de 5' para 3I.A~

regioes antecedente e posterior dosgenes sao as seqiiencias

de DNA que especificam os segmentos correspondentes 5'e 31 de seus transcritos em relacao a um ponto especifico de

referencia,

R N A - p o l i m e r a s e s : E n z im a s ( o m p l e x a s

A s RNA-polimerases que catalisam a transcricao Sao pro-

teinas complexas, rnultimericas. A RNA-polimerase de E.

coli tern peso molecular de cerca de 480.000 e consiste em

cinco polipeptfdeos. Dois deles sao identicos; portamo, a

enzima contern quatro polipeptideos distintos. A rnolecula

completa de RNA-polimerase, a holoenzima, tern a com-

posicao a2~WCi.As subunidades a estao envolvidas na mort-

tagem do cerne tetramerico (a2~W) da RNA-polimerase.

Asubunidade ~ con tern 0 sitio de ligacao d€::trifosfato de

ribonucleosfdeo e.a subunidade W abriga a regiao de ligac;:ao

ao rnolde de DNA.

Vma subunidade, 0 fator sigma (0), esta envolvido ape~

nas no inicio da transcricao. Ele nao desernpenha papel no

alongamento da cadeia. Ap6s tel' ocorrido inicio da cadeia de

RNA, 0fator o e liberado,e 0 alongamento da cadeia (veja

Fig, 11 . 8 ) e catalisado pela enzima cerne «((2 ~W). A funcaode sigma e reconhecer eligar a RNA-polimerase ao inicio da

transcricao OU sitios promotores no DNA. A enzima cerne

(sern c) ira catalisar a sintese deRNA a partir de moldes de

DNA i n v it ro , mas, ao fazer isto, ira iniciar cadeias de RNA

ern sitios aleat6rios ern ambos os filamentos de DNA. Em

contraste, a holoenzima (0 presente) inicia cadeias de RL'fA

in vitro apenas em sftiosusados i n v iv o.

I n i c ia ( a o d a s ( a d e i a s d e R N A

A iniciacao das cadeias de R_NA envnlve tres etapas: (1)

ligacao da holoenzima RNA-polimerase a uma regiao pro-

motora no DNA; (2) a deselicoidizacao localizada dos dois

filamentos de DNA pela RNA-polimerase, fornecendo

um filamento molde livre para fazer pares de bases com

nucleotideos que cheguem; e (3) a formacao de Iigacoes

fosfodiester entre os primeiros ribonucleotideos na cadeia

nascente de RNA. A holoenzima permanece ligada a regiaopromotora durant€:: a sintese das primeiras oito ou nove

Iigar;:oes. Entao, 0 fator sigma e liberado, e 0 cerne da en-

zima corneca a fase de alongamento dasmtese de RNA.

Durante a iniciacao, cadeias curtas de dais a nove ribonu-

cleotideos sao sintetizadas e Iiberadas, Essa sintese abortiva

cessa quando tiverem sido sintetizadas cadeias com 10 au

.mais ribonucleotideos e a RNA-polimerase tiver cornecadoa se afastar do promotor.

Porconvencao, os pares de nacleotideos dentro de unida-

des de transcricao .e adjacentes a elas sao numerados em re-

lac;:aoaoinicio da transcricao (designada como +1) ~ 0pat de

nuclectideos corresporrdente ao primeiro nucleotideo (5')

do RNA transcrito. Os pares de bases que precedem 0 sitio

de inicia<;ao recebem prefixes menos (-); os seguintes (em

relacao ao sentido da transcricao) ao sitio de inicio recebem

o sinalmais (+ ) . As sequencias de nucleotideos que precedem

o sitio de iniciacao sao chamadas seqiiencias antecedentes;

as que vern depois do sitio de iniciacao saochamadas seqiien-

cbs posteriores.

Como j:i foi mencionado, a subunidade sigma da RNA-

polimerase medeia sua liga<;ao a promotores.l1o DNA Cen-

renas de promotores de E. coli forarn seqiienciados e tern Sllr-

preendentemente ponco em comum. Duas seqiiencias curtas

dentro desses promotores sao suficientemente conservadns

para serern reconhecidas, mas mesmo estas raramente saoidenticas em dois promotores diferentes. a s POlltOS medics

das duas seqiiencias conservadas ocorrem a cerca de 10 e

35 pares de nudeotideos, respectivamente, antes do sitio de

.inicio da transcricao (Fig. 11.11). Assim, elas sao chamadas

sequencia ~1Oe sequencia -35, respectivamente. Embora

tais seqiiencias variem urn pouco de gene para gene, alglln·s

nucleotideos sao alrarnente conservados. A s seqiiencias de

nucleotfdeos qu e estao presentes em tais e l emen tos geneti-

cos conservados sao mais frequentemente chamadas de se-

qiiencias de consenso, A sequencia de consenso ~1O no fi-

lamento nao-molde, e TATAAT; a sequencia de consenso -35

e TrGACA. A subunidade sigma inicialmente .reconhece a

sequencia -35 e se liga .aela; assim, esta sequencia a s vezes echamada sequencia de reconhecimento. A sequencia -10

rica em A-T facilita a deselicoidizacao localizada de DNA,

que e urn pre-requisite essencial pan a sfntese de uma nova

cadeia de RNA. A distancia entre as sequencias ~35 e-10 ealtamente conservada em prornotores de E . coli, nunca sendo

menor que 15 ou maior que 20 pares de nucleotfdeos de

tarnanho, Alem disso, a primeira base, ou 5 1 , nos RNA de E.

coli geralmente (>90%) e uma purina.

IranscricaoSequencia -10 .

F r lam en to mo ld e G r · ~ . .. TTA - - T

S eque n c ia -35 .'~ 5 p-;~ " ,,....-A---, A

3' C;; : : : ; ; , : : :~ : : : :s : : : :E"~.m m --\6-l9,pb-

5'

F il am en t o n a o -r n ol de

Dese l ic o i di z acao loca l iz ada

F ig . 1 1, 11 Estrutura de umpromotor tipico em E c.oli. A

RNA-polimerase riga-58 Ii sequencia -35 do promotor e inicia a

desel lcoldizacao dos fl larnentos de DNA nl sequencia -10 rica em

A-T. A transcricao corneca dentro da bolha de transcricao em urnsitio de cinco a nove pares de bases alern da sequencia -10.



3 0 0 ill T R A N S (R I ~ A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

A t o l 1 g a m e n t o d a s C a d e i a s d e R N A

o alongarnento das cadeias de RNA e catalisado pelo cerne

da enzirna RNA-polimerase, apos a liberacao da subunidade0. A ampliacao covalente das cadeias de RNA (veja Fig.

11.8) ocorre dentro da bolha de transcricao, urn segmento

localmente desenrolado do DNA. A molecula de RNA-po-

Iimerase contern atividades tanto de desenrolamento quanto

de reelicoidizaeao do DNA. A RNA-polimerase desenrola

continuamente a dupla helice de DNA a frente do sitio de

polimerizacao e reenrola os filamentos complementares de

DNA arras do sitio de polimerizacao a medida que se mo-

virnenta ao lange da dupla helice (Fig. 11.12). Em E. coli, o

tamanho medic de uma bolha de transcricao e de 18 paresde nucleotideos, e cerca de 40 ribonucleotideos sao incor-

porados na cadeia crescente de RNA por segundo. A cadeia

nascente de RNA e deslocada do filamento molde de DNAa medida que a RNA-polimerase se move ao lange da mo-

lecula de DNA. A regiao de parearnento transitorio de ba-

ses entre a cadeia crescente e 0 filamento molde de DNA emuito curta, talvez apenas tres pares de bases de tamanho. A

estabilidade do complexo de transcricao e mantida prirnaria-

Sltio de chegada de

t rif os fa to d e n b on u cl eo s fd e o

5'

S it io d edese l i co id izacao

(a) RNA-po l imerase e l igada a o D N A e c ov ale n te m en te a m pliaa ca de ia de R NA .

Mov imen to da RNA·po l imerase

\)

C ad eia cre sc en ts de R NA

(b) R N A·p olim e ra se m o ve u-s e p ara a le rn d e s ua p os ic ao e m (a),

a rn p lia nd o p ro ce ss iv am e nte a c ad eia d e R N A n a sc en te .

F ig . 1 1.1 2 I I Alongamento de uma cadeia de RNA catalisadapela RNA-polimerase em E . coli.

mente pela liga~ao do DNA e da cadeia crescente de RNA

a RNA-polimerase, e nao pelo parcarnento de bases entre 0

filamento molde de DNA e 0RNA nascente.

T e rm i n o d a s C a d e i a s d e R N A

o terrnino das cadeias de RNA ocorre quando a RNA-poli-

merase encontra um sinal de termino, Quando isto ocorre,o complexo de.transcricao se dissocia, liberando a molecula

nascente de RNA. Existem dois tipos de finalizadores de

transcricao em E. coli. Um tipo resulta em termino apenas na

presen~a de uma protein a chamada rii (p). Portanto, tais se-

qiiencias finalizadoras sao chamadas [ ina ii zador e s dependen te s

d e ro. 0 outro tipo resulta no termino da transcricao sem 0

envolvimento de ro. Tais sequencias sao chamadas Jina!iza-

d or es in dc pe nd cn te s d e r o .Os finalizadores independentes de r6 contem uma regiao

rica em G-C seguida de seis ournais pares de bases A-T, com

os A presentes no filamento molde (Fig. 11.13, em cima). A

sequencia de nudeotideos da regiao rica em G-C e tal queregioes nnifilamentares do RNA podem fazer pares de bases

e forrnar estruturas em grampo (Fig. 11.13, embaixo). As

estrururas em grampo do RNA formam-se, imediatamente

apes a sintese das regioes participantes cia cadeia de RNA e

retard am 0 movirnento das moleculas de RNA-polimerase

ao longo do DNA, causando pausas na arnpliacao da cadeia.

Como 0 parcarnento de bases A-U e fraco, precisando de

menos energiapara separar as bases que qualquer outro par

de bases padrao, a serie de U apes a regiao do grampo prova-

velmente facilita a liberacao das cadeias de RNA recern-sin-

tetizadas a partir do molde de DNA quando a estrutura em

grampo faz com que a RNA-polimerase pare neste sitio.

o mecanisme pelo quai. oeorre 0 terrnino da transcricao

dependente de 1'6ainda e incerto, As sequencias de termino

dependentes de rotern de 50 a 90 pares de bases de com-

primento e especificam RNA transcritos que sao ricos em

C e muito desprovidas de G. Alem disso, sinais de termino

diferentes depcndentes de 1'6tern POllCO em cornum, A pl'O-

teina r o liga-se a cadeia crescente de RNA e se move de 5'

para 3' ao lange do RNA, parecendo seguir a molecule de

RNA-polimerase que catalisa a sintese da cadeia, Quando a

RNA-polimerase diminui ou para na sequencia de terrnino

dependente de 1'0, r6 junta-se a polimerase e tira a cadeia

nascente de RNA da bolha de transcricao,

T r a n $ ( r i ~ a o , T r a d u ~ a o e D e g ra d a ( a o C o n c o m i t a n t e s

d o m R N A

Em procariontes, a traducao e a degradar,;ao de uma mo-

lecula de mRNA em gera} comecarn antes que sua sintese

(transcricao) esteja completa, Como as mokiculas de mRNA

sao sintetizadas, traduzidas e degradadas nci sentido 5' para

3', todos as tres processos podem ocorrer sirnultaneamente

na mesma molecula de RNA. Em procariontes, a rnaquinaria

.de sintese de polipeptideos nao e separada pOl' um envolto-



T R A N S C R It ; A O E M P R O C A R I O N T E S iii 3 0 1

5 'CCCACA&CCG CCAG TTCCGG T~ 'GCG GCA lllJAACTTTCTTTAATGA - 3 '

D NA : 3 ' G G G TG TC GG C G GTC AAG GC GAC CG C C GT AAAAT TG AAAG AAATTAC T -5 '

/.F ila me nlo m old e de D NA

RNA : 5 ' CCCACAGC 'CGOGAGUUCCGCUG GCG8CAUUUJ ,J OH-3 '

! D ob ra rn e nto ra pid o d o R N A

CU C

U G

RNA transc r ito

G 1 1 1 1 1 1 CA 1 1 1 1 1 1 UC 1 1 I 1 1 1 G

. C 1 1 1 1 1 1 GG I II II I CC 1 1 1 1 1 1 GC 1 1 1 1 1 1 G

-G 1 1 1 1 1 1 C

A A

5 '-CCCAC UUUU OH-3 '

RNA dobr ad o :

C ade i» de R NA

d ob ra da a ju da ate rr nn o d a c a da ia ,

Fig. n.B iii Estrutura de um finalizador de transcrlcao independente de r6. Assequencias finalizadoras independentes de r:6corrtern uma

regiao rica em G-C seguida de pelo rnenos seis pares de bases A-T. A transcricao de tal seque-ncia finalizadora produz uma cadeia de RNA

com segmentos r ices em G -C que fazem pares de bases un s com o s o u tro s imediatamente apo s a sintese pa ra fo rm ar um a estrutura em

grampo. Esta estrutura retarda 0movimento da RNA-pollmeraseao longo da rnolecula de DNA, 0que resulta.no terrnino da transcricao na

via A-Tadjacente e na l i bera cao da cadeia nascente de RNA.

rio nuclear do local de sfnrese do mRNA. Portanto, urna

vez que renha sido sintetizada a ponta 5' de urn mRNA, ele

pode ser imediatarnente usado como molde para a sintese de

polipeptfdeos. De fato, a transcricao e a traducao em geral

sao muito acopladas em procariontes. Oscar Miller, Barbara

Hamkalo e colaboradores desenvolveram tecnicas que lhes

permitern visualizar este acoplamcnto entre. transcricao e

traducao em bacterias pm rnicroscopia eletr6nica. Urna de

suas fotos mostrando a transcricao acoplada de UID gene e a

traducao de seu mRNA produzido em E. coli e mostrada na

Fig. 11.14.

_ P O N T O S I M P O R T A N U S

II As intese de RNA ocorre em tres estagios: (1 ) iniciacao, (2) alon-

gamento e (3) terrnino.

• RNA-polimerases, as enzimas que catalisarn a transcricao, SaO

proteinas rnultirnericas eomplexas.

• A ampliacao covalente das cadeias de RNA oeorre dentro de

segmehtos de DNA desenrolados localmente.

III 0 alongamento da cadeia para quando a RNA-polimerase en-

contra um sinal de termino de transcricao.

• Transcricao, traducao e degradacao de moleculas de mRNAem

geral oeorrem simultaneamente em proeariontes.

F ig .1 1.1 4 • Micrografia eletr6nica preparada por Oscar Miller e Barbara Hamkalo mostrando a transcricao e a traducao acoplada de um

gene em E . coli. Sao visfveis 0DNA,os mRNAe.os ribossornos que traduzem moleculas individuais de mRNA. As cadeias polipeptidicas

nascentes que estao sendo sintetizadas nos ribossomos nao sao visiveis a medida que se dobram em sua configuracao tridimensional durante

a sintese.



3 0 1 1 1 T R A N S ( R I~ A O [ P R O C E S S A M E N T O D O R N A

IT R A N S C R I ~ A O E P R O C E S S A M E N T O D E R N A

E M E U C A R I O N T E STres enzimas diferentes catalisam a transcricao em

eucariontes, e os transcritos de RNA resultantes

sofrem tres rnodificacoes importantes, incluindo a

excisao de sequencias nao codificantes chamadas

fntrons. As sequencias de nucleotfdeos de alguns RNA

transcritos sao modificadas p6s-transcricionalmente

par edicac do RNA.

Embora 0 processo geral de sintese de

RNA seja similar em procariontes e

eucariontes, 0processo e eonsideravel-mente mais eomplexo em eucariontes,

Em eucariontes, 0 RNA e produzidono micleo, e a maioria dos RNA que codificarn proteinas

devern ser transportados para 0 citoplasma para serem tra-

C ap 5 '

duzidos nos ribossornos, Entretanto, existern evidencias in-

dicando que algumas traducdes emeucariontes podem ocor-

rer no micleo. Os mRNA procari6tieos em geral contern as

regioes eodificantes de dois au rnais genes. Tais mRNA saoditos multigenicos. Em contraste, muitos dos transeritos eu-

cari6tieos que foram caracterizados con tern a regiao codifi-

cante de urn unico gene (sao monogenicos). Entretanto, ate

urn quarto das unidades de transcricao no pequeno verme

Ca e no rb ab di ti s e le ga ns podem ser rnultigenicas. Claramente,

os mRNA eucari6ticos podem ser rnonogenicos ou multige-

nicos. Estao presentes tres RNA-polimerases diferentes em

eucariontes, Cada enzima catalisa a transcricao de uma classe

especifica de genes. Alem disso, em eucariontes, a rnaioria

dos transcritos primaries dos genes que codificam polipep-

tideos sofrern tres modificacoes importantes antes de serem

transportados ate 0 citoplasma para traducao (Fig. 11.15).

1. Acrescimos ( raps) de 7-metilguanosina sao adicionados as

pontas 5' dos transcritos primarios.

,jAP

0" Cap 7·MG e adicionadoa p on ta 5 '.

,

•

,jAP

Ifa u da p o li {A )e adic ionada .

Cap 5' - - - - -- - - -- - - -- - - - Cauda 3 ' -p o li (AJ

•

,jAP-Y

o In tron ere rnov ido .

Cap 5' - - - - - - . - - o - v - - - - c a u d a 3"pol i (A)Fig. l1.1S. Em eucariontes,

a maioria dos transcritos

genicos sofre tres tipos

diferentes de processamentopos-tra nscrici ona I.R NA Cap5------------- Cauda 3 "po l i( A )



T R A N S C R I \ A O E P R O m S A M E N T O D E R N A E M E U C A R IO N T E S I I 3 0 3

2. Caudaspoli(A) sao adicionadas a s pontas 3' dos transcri-

t05, que sao geradas por clivagern e nao por termino da

ampliacao da cadeia.

3. Quando presentes, as seqiiencias Intron sao rernovidasdos transcritos.

Oeap de S' na maioria dos mRl'JA eucari6ticos e uma 7-

metilguanosina unida ao nucleosideo inicialdo transcrito

por uma.Iigaciio 5' - 5' fosfato. A cauda poli(A) e uma serie

de adenosinas com 20a 200 rrucleotideos de tamanho,

Em eucariontes, a populacao de transcritos primaries

em urn nucleoe chamada RNA heterogeneo nuclear

(hnRNA) devido it grande variacao de tamanhos das mole-

culas de Rl'JA pl'esentes. As principais partes desses hnRNA

sao seqiiencias intron nao codificantes, que sao removidas

dos transcritos primaries e degradadas no nticleo, Assim,

grande parte do hnRNA 11averdade consiste em moleculas

de pre-mRNA que passam par varies eventos de processa-

menta antes de deixar a micleo. Tambem, em eucariontes,

os RNA transcritos sao revestidos de proteinas de Iigacao

ao RNA durante ou imediatamente apos sua sintese, Estas

proteinas protegem ostranscritos genicos da degradacao por

ribonucleases, enzimas que degradam moleculas de MTA,

durante processamento e transporte para 0 citoplasma. A

vida media de urn transcrito de um gene em eucariontes e decerca de cinco horas, em contraste com a vida media de me-

nos de cinco minutos em E. coli. Esta estabilidade acentuada

de transcritos genicos em eucariontes e dada, pelo menos

em pane, por sua presenr;:a em complexes com protefnas de

ligacao ao RNA.

T r e s R N A - p o l i m e r a s e s /T r e s ( o n j u n t o s d e G e n e s

Enquanto uma unica RNA-polimerasecatalisa toda a trans-

cricao em E . c oli, as eucariontes, que variam em complexi-

dade de uma 56 ceiula em leveduras ate humanos, contern

tres RNA-polimerases diferentes. Todas as tres enzimas eu-

carioticas, chamadas RNA-poliIllerases I, IT e ill, sao mais

complexas, com 10 ou mais subunidades, que a RNA-poli-

merase de E. coli. Ale11ldisso, .:10 contrarinda enzima de E.

coli, todas as tres RNA-polimerases eucarioticas precisam da

ajuda de outras protefnas chamadas fatores de transcricaopara iniciar a sintese de cadeias de RNA.

As principais caracteristicas das tres RNA-polimerases

eucarioticas estao resurnidas no Quadro 11.1. A RNA-po-

limerase I esta situada no nucleolo, uma regiao distinta do

QUADRO 11.1

micleo onde as rRNA sao sintetizados e combinados com

proteinas ribossomicas, A RNA-polimerase I catalisa a sin-

tese de todos os RNA riboss6micos exceto 0pequeno rRNA

5S. A RNA-polimerase II transcreve genes nucleates quecodificam proteinase talvez outros genes que especificam

hnRNA. A RNA-polimel'ase m caralisa a sintese das 1110-

leculas de RNA transportador, as moleculas de rRNA 5S e

pequenos RNA nucleares,

As tres RNA-pohmerases apresentam sensibilidades

muito diferentes a inibicao por o-amanirina, urn veneno

metabolico produzido pelo cogumelo Amanita phalloides.

Enquanto a arividade da RNA-polimerase I e insensfvel ao.-amanitina, a atividade da RNA-polimerase II e totalmenteinibida por haixas concentracoes de ce-amunitina, e a RNA-

polimerase III exibe um nivel interrnediario de sensibilidade

a esta droga. Assirnv rx-amanitina pode ser usada para de-

terminal' qual RNA-polimerase catalisa atranscricao de urndeterminado gene.

I n i c ia ~ a o d a s ( a d e i a s d e R N A

Ao contrario de suas contrapartes procarioticas, as RNA-

polimerases eucarioticas nao podem iniciar a transcricao

par si mesmas. Todas as tres RNA-polimerases eucarioticas

precis am cia ajuda de fatores de transcricao proteicos para

cornecar a sintese de uma cadeia de RNA Estes fatores de

transcricao devem Iigar-se a uma regiao promotora no DNA

e formar urn complexo de iniciacao apropriado antes que a

RNA-polimerase se Iigue e inicie a transcricao. Sao usadospromotores e fatores de transcricao diferentes pelas RNA-

polirnerases I, II e III. Nesta sel,{ao,enfocaremos a inicia-

c ; ; a o da sintese de pre-mRNA p e l a RNA-polimerase II, que

transcreve a maioria dos genes eucarioticos,

Em todos as casos, a iniciacao da transcricao envolve a

formacao de urn segmento localmente deselicoidizado de

DNA, fornecendo um filarnento de DNA livre para funcio-

nar como urn mol de para a sfntese de urn filamento comple-

merrtar de RNA (veja Fig. 11.9). A forma<;:iio do segmento

localmente deselicoidizado de DNA requerido para iniciar a·

transcricao cnvolve a interacao de varies fatores de transcri' ..

<;20 com seqiiencias especfficas no promotor para a unidade

de transcricao. Os promotores reconhecidos pela RNA-po-limerase II consistem em curtos elementos conservados.xru

modules, situados antecedentes ao ponto inicia] de trans-

cricao. Os componentes do promotor do gene de timidina-

cinase de camundongo sao mostrados na Fig. 11.16. Outros

Enzima Localiza"ao

Caracteri$ticas dal Tres RNA-polimerases de Eu<:ariontes :: ':, ~

Produtos Sensibilidade a a;-Amanitina

ill\IA-polimerase I

RNA-polimerase IIRNA-polimerase III

Nucleolo

NiiclcoNiicleo

RNA ribossomicos, exduindo 0 55 rRNA

Pre-mRNA nucleatestRNA, 55 rRNA e outros RNA pequenos nucleares

Sem sensibilidade

Sensibilidade completa

Sensibilidade inrerrnediaria



3 0 4 I I T R A N S C R I < ; A O E P R O C E S S A M E N T O 0 0 R N A

Boxe

octarnero

GC

boxeC M T

bcxe

G C

b o x e

T A T A

b o x eP o n t o d e i n i c i o

da transcricao~

~120

.~ )C o n s e n s o C o n s e n s o

ATTIGCAT GGGCGG

+1

C on se n so Con sen so

GG GCGG TATAAAA

Fig.1116 • Estrutura de um promotor reconhecido pela RNA-polimerase II.Os TATAe CAATboxes estao situados mais ou menos nas

mesmas posicoes nos promotores da maioria dos genes nucleates que codificam proteinas. Os GC boxes e octarneros podem estar presentes

ou ausentes. Quando presentes, eles ocorrem em muitos locals diferentes, seja isoladamente ou em varlas copias. Assequencias mostradas

aqui sao as sequencias de consenso para cada urn dos elementos promotores. Os elementos promotores conservados sao mostrados em seus

locals no gene de timidina-cinase de camundongo.

promotores que sao reconhecidos pela RNA-polimerase II

contern parte desses componentes mas niio todos eles, a

elernento conservado mais proximo do sitio de inicio da

transcricao (posicao +1) e chama do TATA boxe. Ele tern

a sequencia de consenso TATAAAA (lendo de 5' para 3'

no filamento nao-molde) e e centra do na posicao -30. a

TATA boxe tern urn papel irnportante em posicionar 0ponto

de inicio da transcricao, 0 segundo elemento conservado

e chama do CAAT boxe. Ele geralmente ocorre perro daposicao -80 e tern a sequencia de consenso GGCCMTCT.

Dois outros elementos conservados, 0 GC boxe, consenso

GGGCGG, e 0 boxe octamero, consenso ATITGCAT,

geralmente estao presentes nos prornotores da RNA-poli-

merase U. Eles influenciam a eficiencia de urn promotor em

iniciar a transcricao.

o inicio da transcricao pela RNA-polimerase II requer a

assistencia de varios fatores basais de transcricao, Outros

fatores de transcricao e seqiiencias regulat6rias charnados de

acentuadores e silenciadores modulam a eficiencia da iniciacao

(Cap. 21). Os fatores basais de transcricao devern interagir

corn promotores na sequencia correta para iniciar efetiva-

mente a transcricao (Fig. 11.17). Cada fator basal de trans-

cricao e indicado como TFIIX (fator de transcricao para

a polirnerase I1), em que X e a letra que identifica 0 tator

individual).

As posicoes nas quais cada urn desses fatores de transcri-

c;:aose liga ao DNA do promotor foram estabelecidas em

parte deterrninando-se que segmentos de DNA estao prote-

gidos da degradacao por nucleases quando um fator especi-

fico foi adicionado ao complexo de iniciacao. As seqtiencias

de DNA que estfio protegidas por fatores de transcricao au

outras proteinas de ligacao ao DNA podem ser identificadas

par experimentos de foot printing de DNase. Pequenas mo-

leculas hornogeneas de DNA que contern 0 sitio potencial

de ligac;:aosao isoladas e marcadas em uma ponta com um

isotope radioativo ou corante fluorescente ..Metade das 010-

leculas sao incubadas com a proteina de ligacao ao DNA de

interesse e metade e mantida livre de proteinas. Ambas as

amostras de DNA sao entao rapidarnente tratadas - apenas

o suficiente para que a maioria das rnoleculas de DNA sejam

clivadas uma vez - com DNase I pancrearica, uma enzima

que faz cortes internos aleatorios no DNA. as produtos re-

sultantes de clivagem sao enrao separados com base no ta-

manho por eletroforese em gel (veja Cap. 9). A arnostra livre

de proteina content fragmentos de DNA de todos os tama-

nhos possfveis produzidos por clivagem entre todos os pares

de nucleotideos adjacentes na molecula. as produtos de eli-

vagem produzidos a partir do DNA ao qual a proteina es-

tava ligada exibirao urna "pegada" ( j O o t p T i l 1 t ) onde nao existir

ponta de fragmento de DNA. A sequencia a qual a proteinae ligada sed protegida de divagem pela DNase 1 . Compa-

rando as bandas de DNA radioativo produzidas nas duas

amostras, com e sem proteina de Iigal;,:aoao DNA, um pes-

quisador pode definir com precisao a sequencia de nucleo-

tideos a qual a proteina se liga.

TFIID e 0primeiro fator basal de transcricao a intera-

gir com 0 promotor. Ele contern uma proteina de ligac;:aoa

TATA (TBP) e varias pequenas proteinas associadas a TBP

(Fig. 11.17). Em se6ruida, TFIIA junta-se ao complexo, se-

gllido por TFIIB. TFIIF primeiro associa-sea RNA-poli-

me rase II, e enrao TFIIF e RNA-polimerase II juntarn-se ao

cornplexo de iniciacao da transcricao. TFIIF contem duas

subunidades, uma das quais tem atividade de deselicoidizar 0

DNA. Portanto, TFIIF provavelmente catalisa 0 deselicoi-

dizar localizado da dupla helice de DNA necessario para ini-

ciar a transcricao. TFIIE entao se junta ao complexo de ini-

ciacao, Iigando-se ao DNA posterior (downstrerrm) do ponto

de inicio da transcricao. Dois Olmos fatores, TFIIH e TFIIJ,

juntam-se ao complexc apes TFIIE, mas suas localizacoes

no cornplexo sao desconhecidas.

As RNA-polimerases I e III iniciarn a transcricao por pro-

cessos que sao similares, mas um POllCO mais simples, que

o usado pela polirnerase II. Entretanto, os promorores dos

genes transcritos pelas polimerases I e III sao bem diferen-

tes dos usados pela polimerase II, muito embora a s vezescontenham alg·uns dos mesmos elementos de acao cis. Os



T R A N S C R I t ; A o E P R O C E S S A M E N T O D E R N A E M E U C A R I O N T E S I I 3 0 5

r ln lc io d a

+1 t ranscr icao

'I I I I 1 '1 I I I I II I I I II I I I1I I I r nl I I I 1'1I r r l I iilllill)

J I I 1.11.111.1111I j I I I 111.11III II II I I I I I I) II II) II I J I)

,;;.At;• TFIID liga-se ao

TATAboxe.

: ~ : : : : : : : : & : . : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :

o

;;.At;o TFIIAju nta -s e a Dcomplexo de iniciacao.

, ; ; . A P "o TFIIBliga-se ao

complexo de in ic iacao,

o.,~ TFIIF,qu e tem atividade

V de de se lic oidiza ca o, lig a-seao c om p le xo : p olim e ra se II

tarnbernse liga aqui.

D

' ;; 'A~ 0FIIEliga-se ao

complexo de inlclacao.

F ig . 1 1.1 7 0 inicio da transcricao pela RNA-polimerase II requer

a formacao de um complexo basal de inicio de transcricao na regiao

promotora. A montagem deste complexo corneca quando TFIID, que

contern a proteina de l igacao a TATA (TBP), l iga-se ao TATA boxe. Os

outros fatores de transcricao e a RNA-polimerase II juntam-se aocomplexo na sequencia mostrada.

prornotores daRNA-polimerase I sao bipartidos, com uma

sequencia cerne que se estende cle cerca de -45 a.+20 e um

elemento antecedente de controle que vai de -180 a cerca de

-105. As duns regi6es tern sequencias similares, e arnbas saoricas cleG-c. A sequencia cerne e suficiente para a iniciacao,

Entretanto, a eficiencia da iniciacao e forternente aumentada

pela present;a do elernento de controle anteccdcntc.

Curiosamente, os promotores cia maioria clos genes

transcritos pela RNA-polimerase I I I estao situados dentro

das unidades de transcricao, posteriores aos pontos de inf-

cio da transcricao, e nao antecedentes como nas unidades

transcritas pelas RNA-polimerases I e II. Os prornotores de

outros genes transcritos pela polimerase II I estfio situados

antecedentes ao ponto de inicio da transcricao, como para

as polimerases I e I I . De faro, os promotores da polimerase

III podem ser divididos em tres classes, duas das quais tern

promotores situados dentro da unidade de transcricao,

A lo n g a m e n t o d a C a d e i a d e R N A e a Adi~ao d e

5 ' M e t il g u a n o s i n a

Quando as RNA-polimerases eucari6ticas sao liberadas de

seus complexes de iniciacao, elas catalisarn 0 alongamento

da cadeia de RNA pelo rnesrno mecanismo utilizado pelas

RNA-polimerases de procariontes (veja Figs. l lS e 11.9).

F ig .11 .18 I II Modelo da estrutura da RNA-pol imeras€ IIna levedura

S. cerevisiae. Os sulcos na superfic ie da enzima parecem ser si tios de

ligacao para 0DNA ea cadeia crescente de RNA. Um sulco com cerca

de 2,5 nm de largura e 1nm de profundidade e 0 si tio.hipotetico de

liga<;ao para0DNA (a cadeia com 10 contas de tamanho); outro sulco

com cerca de 1,5nm de largura e 2 nm de profundidade liga-se acadeia crescente de RNA (a cadeia com 4 contas de tamanho).



3 0 6 a T R A N S C R I \A o E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

A analise estrutural da RNA-polimerase II de S. ceretnstae

revela a presenca de sulcos de superficie tidos como sendo

sitios de ligacao de DNA e RNA (Fig. 11.18).

No inicio do processo de alongamento, as pontas S' dospre-mRNA eucarioticos sao modificadas pela adicao de

"revestirnentos" (caps) de 7-metilguanosina (7-MG). Estes

"revestimentos" 7-MG sao adicionados quando as cadeias

crescentes de RNA tern apenas cerca de 30 nucleotideos de

tamanho (Fig. 11.19).0 7-MG contern uma liga,>=aonco-

mum 5'-5'-trifosfato (veja Fig. 11.15) e dois oumais gn~pos

metila. Esses revestimentos de S' sao adicionados co-trans-

cricionalmente pela via biossintetica mostrada na Fig. 11.19.

Os caps 7-MG sao reconhecidos por fatores proteicos envol-

vidos na iniciacao da transcricao (Cap. 12) e tambem ajudam

a proteger as cadeias crescentes de RNA de degradacao pOl'

nucleases.

Lembre que genes eucarioticos estao presentes na croma-tina organizada em nucleossomos (Cap. 9). Como a RNA-

polimerase trans creve DNA acondicionado em nucleosso-

mos? Os nucleossomos tern que ser desmontados antes que

o DNA dentro dele possa ser transcrito? Surpreendente-

mente, a RNA-polimerase II e capaz de mover-se atraves

dos nucleossomos com a ajuda de urn complexo proteico

chamado FACT (facilitador de transcricao da cromatina),

que remove dimeros de ruston as H2NH2B dos nucleosso-

lllOS deixando "hexassornos" de histona, Ap6s a polirnerase

5, "

(a) E sta gi,o in ic ia f n a tra ns cric ao d e u m g en e p ela R N A·p olim e ra se II.

,

\, C ap 5' "

, C H3-G pppN pN p ~I

CH3

t 2'-O-meti l t ransferase

CH3-GpppNpNp 'ffi

t Guanina-Zrnet i l t ransferase

GpppNpNp'ffi

PP i + Pi

i l i l t ransferase

G T P

pon ta 5 ' do , tr an s c ri to p p pNpNp =pnmano t t

(b) V ia d e b io ss in te se d o cap 7 -MG .

Fig . 11.19 • Os revestimentos de 7-metilguanosina (7-MG)sao

adicionados as pontas s' des pre-mRNA logo apos comecar 0

processo de alongamento.

II mover-se atraves do nucleossomo, FACT e outras prote-

inas acessoriasajudam a redepositar os dimeros de histona,

restaurando a estrurura do nucleossorno. Devemos notar

tambem que a cromatina que contern genes que estao sendotranscritos tern uma estrutura menos compacta do que a

crornatina que contem genes inativos, A cromatina na qual

genes ativos estao compactados tende a conter histonas com

muitos gmpos acetiIa (Cap. 9), enquanto a cromatina com

genes inativos contem histonas COlD menos gmpos acetila.

Estas diferencas sao mais discutidas no Cap. 21.

T e r m i n o P o r C l i v a g e m d a (a dela e a A di~ io d e

C a u d a ! 3 ' P o li ( A }

As pontas 3 ' dos RNA transcritos sintetizados pela RNA-

polirnerase II sao produzidas por clivagem endonucleoliticados transcritos primaries, e nao peIo terrnino da transcricao

(Fig. 11.20). Os eventos de termino de transcricao em ge-

ral ocorrem em varies sitios que estao localizados l.000 a

2,000 nucleotideos posteriores ao sitio que ira tornar-se a

ponta 3' do transcrito final. Isto e , a transcricao continua

alern do sitio que ira tornar-se a ponta 3', e 0 segmento

distal e removido por clivagem endonucleolitica. 0 evento

de clivagem que produz a ponta 3' de um transcrito geral-

mente ocorre no sitio de 11 a 30 nucleotideos posteriores asequencia conservada de consenso AAUAAAe antecedente asequencia rica em G-U siruada perto da poma da unidade de

transcricao. Ap6s a clivagem, a enzima poli(A)-polimerase

RNA - p al im e r as e I I

----I5'

3'

0A~ ~C liv ag em p ar e n do n uc le a se V

Cl i vagemendonucleol i t ica

5'7·MG======~~~=A"i'iFi"T""=A A U A A A

3'

\Ap \)

" 8 " A di~ ao d e c au da p oli(A )p e l a po IHA )' p ol ime r a se

5' 7·MG=~======~~=,rr,T. PT,T, ==N1AAAAI'953'

A A U A A A ~

Cauda po li (A )

Fig . 11 .20 • Caudas poli(A) sao adicionadas as pontas 3'

dos transcritos pela enzima poli(A)-polimerase. As pontas 3',

substratos para a poli(A)-polimerase, sao produzidas par clivagem

endonudeolitica do transcrito posterior ao sinal de poliadenllacao,que tem a sequencia de consenso AAUAAA,



T R A N S C R I \ A O E P R O C E S S A M E N T O D E R N A E M E U C A R I O N T E S m 3 0 7

adiciona candas poli(A), trechos de adenosina-monofosfato

com cerca de 200 nudeotideos de tamanho, a s pontas 3' dos

transcritos (Fig. 11.20). A adicao de caudas poli(A) a mRNA

eucarioticos e chamada poliadenilacao.A formacao de candas poli(A) em transcritos requer um

componente especifico que reconhece e se liga a sequencia

AAUAAA, um fator estimularorio que se liga a sequencia

rica em G-U, uma endonuclease, e a polimerase poli(A). Es-

tas proteinas formam urn complexo multimerico que efetua

tanto a clivagem quanto a poliadenilacao em reacoes muito

acopladas. As caudas poli(A) de mRNA eucari6ticos acen-

tuam su.a estabilidade e tern urn papel importante em seu

trans porte do micleo para 0 citoplasma.

Em contraste corn a RNA-polimerase II, tanto a RNA-

polimerase I quanto a III respondem a discretos sinais de

termino. A RNA-polimerase Itermina a transcricao em

resposta a uma sequencia de 18 nucleotfdeos de tamanho

que e reconhecida por uma proteina de terrnino associada.

A RNA-polimerase III responde a urn sinal de termino que

e similar ao finalizador independente de ro em E . c o l i (veja

Fig. 11.13).

E d i ~ a o d o R N A : A l t e r a n d o 0 ( o n t e u d o d a I n f o r m a ~ a o

de M o l e c u l a s d e m R N A

De acordo com 0 dogma central da biologia molecular, a in-

formacao genetica flui do DNA para 0RNA para a protein a

durante a expressiio genica. Normalmente, a informacao ge-

netica nao e alterada no mRNA interrnediario. Entretanto,

a descoberta da edicao do RNA mostrou que ocorrem ex-

cecoes. Os processos de edicao do RNA alterarn 0 conteiido

da informacao dos transcritos genicos de dais modos: (1 )

mudando as estruturas de bases individuais e (2) inserindo

ou deletando monofosfatos de uridina,

o primeiro tipo de edicdo de RNA, que resulta na subs-

tiruicao de uma base pOl' outra, e raro, Este tipo de edicao

foi descoberto em estudos dos genes da apolipoproteina B

(apo-B) e mRNA em coelhos e humanos, As apolipoprote-

fnas sao protefnas sanguineas que transportam alguns tipos

de rnoleculas de gordura no sistema circulatorio. No figado,

o mRNA da apo-B codifies lima grande proteina com 4.563arninoacidos de tamanho. No intestino, 0 mRNA da apo-

B dirige a sintese de uma proteina com apenas 2.153 ami-

noacidos de tamanho. Aqui, uma citosina no pre-mRNA e

convertida em U, gerando urn codon interno UAA de ter-

mino de traducao, que resulta na apolipoproteina truncada

(Fig. 11.21). UAA e um dostres codons que terminam as ca-

deias polipeptidicas durante a rraducao. Se urn codon UAA

e produzido dentro da regiaocodificante de urn mRNA, ele

prematuramente termina 0polipepndeo durante a traducao,

gerando um produto genico incompleto. A conversao C -+

U e catalisada por uma proteina de ligacao ao RNA espe-

effiea de sequencia com uma atividade que remove grupos

amino das citosinas, Urn exemplo similar de edicao de RNAfoi documentado para urn mRNA que especifica urna prote-

5' .. CAA 5'DNA 3'~GH~0\_3'

F fg ;0dO . Transer. i~aO~lntest inoe l im inacao de

se que n c ia s in tron .m R NA n ao

editado ~ s,:"

5'=CAA= 3' 5.'. CAA·'" 3

Desaminase de

ligaelio a RNA ~

Edcao de RNA:

d e sa r nn a c a o o x td a ti vad e e i to s in a

mRNA

editad~

5'~3'

Traducao0

H2N~COOH

Apo li po p ro t ei n a c om

2 .1 5 3 am in o a ci do s

ta n()_ rCOOHH2N~-a-(S..... -

Apolipoproteina co m4 .5 6 3 am in o ac id os

F ig . 1 1.2 1 • Edicao do mRNA daapolipoproteina-B no intestino de

rnarniferos.

ina (0 receptor de glutamato) presente em celulas do cerebra

de rato, A edi~ao mais ampla do mRNA do tipo C -+ U

ocorre nas mirocondrias das plantas, enquanto a maioria dos

transcritos genicos sao editados em algum grau. As mito-

condrias tern seus proprios genomas de DNA e maquina-

ria de sintese de prorefnas (Cap. 19). Em alguns transcritos

presentes em mitocondrias de plantas, a maioria das C sao

convertidas em U.

Urn segundo tipo, mais complexo, de edicao de RNA

ocorre nas mitoc6ndrias de tripanossomas (urn grupo de

protozoarios flagelados que causam a doenca do sana ern'

humanos), Neste caso, monofosfatos de uridina sao inseri-

dos em (e ocasionalmente deletados de) transcritos gerucos,

causando grandes mudancas nos polipepndeos especificadospelas rnoleculas de mRNA. 0 tipo de edi\rao mitocondrial de

tripanossoma e ilustrado na Fig. 11.22, que mostra asseqiien-

cias do filamento codificante de DNA, 0RNA transcrito pre-

edicao e a mRNA editado do gene de cirocrorno b de Leish-

mania tarentolae. (Citocromo b e uma proteina envolvida na

producao de energia qufmica.) Este processo de edicao de

RNA e mediado por RNA guias transcritos de diferentes

genes mitocondriais. Os RNA guias contem sequencias que

sao parcialmente eomplementares aos pre-mRNA a serern

editados, 0 pareamento entre os RNA guias e os pre-mRNA

resulta em espa~os com unidades A nao pareadas nos RNA

guias. Os RNA guias servem como moldes para edicao, e as

U sao inseridas nos espa\ros nas moleculas de pre-mRNAemoposicao as A nos RNA guias (Fig. 11.22).



3 0 8 1 1 1 T R A N S (R I ~ A O E P R O C E S S A M £ N T O D O R N A

F ilam en to m ol d e de D NA

3'TT TCG CC TCT CTT TTC TTT T C C G AAATT GAAG TC CAACAAATAATG CTC ATATAC C -5 '

{}

'\/>.I>

"'0'Transcr i cao

Pre-mRNA

5 '-A AAG CG G AG AG AA AA GA AA A G G C U UU AA CU UC AG G UU GU UU AU UA CG AG UA UA UG G-3'

P re-mRNA n "''!:amento com RNA guia G-3 '

5' A A \7 parcialmen te complemen tar J> ..G uf:> ,.\lf',\.lG

- A G C G G A G A G Gu\.l\. lJ>..\l\l f\CG

A A A ! l G AAA A G G C UUUAACUUCAGG \l1 jI I I I I I I I 1 1 1 I 1 I 1 1 1 1

1 jJ>. . f' ,f ', \ lUUAAAUAUAAUAGAAAAUUG AAGU U C A G U A

~~~ ~~~3' - f \ \. lf '. 1 j . '\AI> IIU A A U A A U '

RNA guia D " ' O ' N A U S

l nse rcao de mono fos fa t os de u ri di naPre -mRNA GG 3 '

5' -A A A G c G G A G A G G\l\l\. lf ' ,\ l \ lJ>..CGf',G\l\\lf ' . \. l

A A A A G AAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCA GG \ j1 jIII11I11II I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

f '. f '. f' .\ l UUUAAAUAUAAUAGAAAAUU GAAGU U C A G U

,\~IJ\.lCf\f' ,\. lJ>..f' .\. l D '\AI> A U L j C A C U A U ~3'- f \vC ' " ' 0 : 7 r j A U A A U

RN A u ia A A U _ 5g L ib era (:a o d e R NA guia do m RN A

mRNA ed rt ad o

5 '·AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUU CAGGUUGUUUUAUUACGAGUAUAUGG3 '

F ig . 1 1.22 • Edicao do pre-mRNA do citocrorno b mitocondrial no tripanossoma Leishmania torentolae. As uridina-monofosfato (U ) que

foram inseridas nos espacos no pre-mRNA durante a processo de edicao estao destacadas em l aranja, Pareamento de bases entre 0

pre-mRNA eo RNAguia e representado por linhas verticais entre as duas moleculas.

Em alguns casos, dois ou mais RNA guias diferentes par-

ticiparn da edicao de um unico pre-rnlcNa. Os RNA guias

nao so fornecem os rnoldes para os processos de edicao, mas

tambern doarn monofosfatos de uridina que sao inseridos nos

pre~lllRNA. Os RNA guias tern caudas oligo(lJ) em 3', com

5a 24 nucleotideos de tamanho. Estas U sao insericlas nos

pre-mRNA durante 0 processo de edicao par urn complexo

mecanisme de duas etapas (Fig. 11.23), Na primeira etapa,a 3' -OH livre no RNA guia ataca e rompe lima ligas;ao es-

ter interna no pre-mRNA, formando lima Iigas;ao covalente

com a parte 3' do pre-mRNA clivado, Na segunda etapa, a

3' -OH livre na parte 5' do pre-mRi'\fA c1ivado ataca lima

Iiga<;aoester entre duas Unas pontas cia cauda oligo(U) do

RNA guia, reestruturando a rnolecula de pre-mRNA, mas

agora com uma U inserida no sitio do ataque inicial,

Por que ocorrem estes processos de edicao de RNA? Par

que as sequencias finais de nucleotideos destes mRNA nao

sao especificadas pelas sequencias dos genes mitocondriais

como sao na maioria dos genes nucleares? As respostas a es-

tas interessanres perguntas sao purarnente especulativas. Os

tripanossomas sao eucariontes unicelulares primitivos que

divergiram de outros eucariontes bem cedo na evolucao. Al-

guns evolucionistas especulam que a ecli<;aodo RNA era co-

mum em celulas ancestrais, em que muitas reacoes parecem

ser catalisadas par moleculas de RNA em vez de proteinas,

Outra posicao e que a edicao do RNA e um mecanisme pri-

mitivo para alterar os padroes de expressao genica. Por qual-

quer motivo, a edi<;ao do RNA tem urn papel importante

na expressao de genes nas mitocondrias de tripanossomas eplantas.

_ P O N T O S IM P O R T A N T E S

• Tres RNA-polimerases diferentes estao presentes em euca-

riontes, e cada polimerase transcreve um conjunto distinto

de genes.

• Os transcritos genicos eucari6ticos geralmente sofrem tres

rnodificacoes importantes: (1 ) a adf~ao de caps de 7-metilgua-

nosina as pontas 5', (2) a adrcao de caudas poli(A) na ponta 3' e

(3) a ramocao de sequencias intron nao codificantes.

• 0 conteudo de inforrnacoes de alguns transcritos eucari6ticos

e alterado pela edicao do RNA, que muda a sequencia de nu-

deotideos dos transcritos antes de sua traducao.



G E N E S I N T E R R O M P I D O S E M E U C A R IO N T E S ; E X O N S E I N T R O N S ill 3 0 9

: ; ' A ; Yo C liv ag em d e lig a( :a o e st er em p re -mRNA e f or ma ca ci d e um a

l iga (: ao es te r en t re 0 R NA g u ia e a p arte 3 ' do p re -m RN A,

Pre·mRNA

5 O ~P ~O e=r=r+r=r=r=r= 3 '

ataque~~U-OH 5'

Uu RNA g uia

5----0H •

:;'AP"

U C liv ag em d a lig ar ;: ao e ste r e n tr e d ua s U te rm in ais d o R N A g uia ,reconst i tuindo 0pre- rnRNA, mas com uma U i ns e ri da n o s it io

de c li vagem In ic ia l na e tapa L

5----OH

5 '

ore·mRNAparcialmente editado

5------U------ 3

HO -U U 5 'R N A guia

fig. 11.23 II 0mecanismo de duas etapas pelo qual

ur idina-rnonofosfato sao inseridas em rnoleculas de pre-mRNA

durante sua edicao em mitoc6ndrias de tripanossomas.

' I G E N E S I N T E R R O M P I D O S E M E U C A R I O N T E S :, -E X O N S E I N T R O N SAmaioria dos genes eucari6ticos contsm sequencias

nao codificantes charnadas fntrons que interrompem

as sequencias codiflcarrtes, os exons, Os introns sao

removidos dos RNAtranscritos antes de seu transporte

para 0 citoplasma.

A maioria dos genes bern caracterizados de procarion-

tes consistem em sequencias continuas de pares de nucleoti-

deos, que especificam sequencias co-lineares de aminoacidos

nos produtos gen.icos polipeptidicos. Entretanto, em 1977, a

analise molecular de tres genes eucarioticos produziu umagrande surpresa. Estudos de genes de ~-globina (urna das

duas proteinas diferenrcs na hemoglobins) de camundon-

gos e~coelhos e do gene de ovalburnina de galinhas (uma

protefna de estocagem no ovo) revelaram que eles contem

seqiiencias nao codificantes intercalares entre seqiienciascodificantes, Eras foram subsequenternente encontradas em

regioes nao traduzidas de alguns genes. Eras sao ehamadas

Introns (de seqiiencias intercalates). As,seqiiencias que per-

manecern presentes em moleculas finais de mRNA (tanto

seqiiencias codificantes guanto HaO codificantes) sao chama-

das de exons (para seqiiencias express as). A descoberta de

fntrons e 0 tema do Marco deste capitulo (veja Um Marco

na Genetics: Introns). Os geneticistas hoje sabem que os

introns interrornpem a maio ria dos genes eucarioticos mas

nao todos eles,

A l g u n s G e n e s E u c a r i o t i c o s M u i t o G r a n d e sSubseqiiente aos estudos pioneiros sobre os genes de glo-

bina de mamiferos e 0 gene de ovalbumina de galinhas (veja

Marco), Introns nao codificantes forarn demonstrados em

grande mimero de genes eucarioticos. De fato, g·enes in-

rerrompidos sao muito mais comuns gue genes nfio inter-

rompidos em animais e plantas superiores. Por exemplo, 0

gene de X e l l O p u s larois g i le codifica a vitelogenina A2 (que

gera a proteins da gema do 01'0) contem 3 3 . introns, e 0

gene do colag-eno leQ de galinha contem pelo menos 50

introns, 0 ge11e do colageno tem 37.000 pares de nucleon-

deos, mas origina uma molecule de mRNA com apenas cerca

de 4.600 nucleotideos de tamanho. Outros genes conternrelativamente poucos fntrons, mas alguns dos introns sao

muito grandes. Por exemplo, 0 gene Ultrabitbora« (Ubx) de

Drosophila contem um intron que possui aproximadamente

70.000 pares de nucleutideo, de tamanho. 0 maior gene

caracterizado hoje em dia e o gene hurnano DMD, que causa

a distrofia muscular Duchenne quando tornado nao funcio-

naI por rmrtacao. 0 gene nMD tem 2,5 milhoes de pares de

nucleotideos e contern 78 introns.

Embora os inrrons estejarn presentes 1 1 < 1 maioria dos ge-

nes de anitnais e plantas superiores, eles nao sao essenciais

porque nem todos estes genes contem Inrrous. Os genes de

histona do ourico do mar e quatro genes h eat sh ock (cho-

que de calor) de Drosophila estavarn entre os prirneiros genes

animais que nao tinham introns, Hoje sabemos que rnuitos

genes de animais e plantas superiores nan tern introns.

i n t r o n s : S i g n i f ic a d o 8 . i o l o g i c o ?

No memento, os cientistas sabem relativamente pouco

sobre 0 significado biologico da estrutura exon-Intron de

genes eucarioticos, Os introns sao altamente variaveis em

tamanho, indo de cerca de 50 pares de nudeotideos ate mi-

lhares de pares de nucleotideos de tamanho. Este fato levou

a especulacao de que os introns possam ter um papel na re-

gulacao da expressao genica. A transcricao de genes comgrandes introns leva mais tempo do que a transcricao de



3 1 0 !II T R A N S C R I ( A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

Ge n eenes com pequenos Introns ou sern introns. Assim, seria

esperado que a presen~a de grandes introns em genes re-

duziria a taxa de aciimulo de transcritos ern uma celula. 0

fato de que as introns acurnularn novas mutacoes muito maisrapidamente que os exons indica que as seqiiencias de pares

de nucleotideos especificas dos fntrons, excluindo as pontas,

nao sao muito importantes.

Ern alguns casos, os exons diferentes dos genes codificam

dominies funcionais diferentes dos produtos genicos pro-

teicos, Isto e rnaisaparente no caso de genes que codificarn

cadeias pesadas e leves de anticorpos (Cap. 23). No caso de

genes de globina de mamiferos, 0 exon do meio codifica 0

dominio de Iigacao de hemo cia proteina, Tem havido urna

consideravel especulacao de que a estrutura exon-Intron de

genes eucari6ticos tenha resultado da evolucao de novos ge-

nes pela fusao de genes ancestrais nso interrompidos (iinico

exon), Se esta hipotese estiver correta, os introns podem serrneramente reliquias do processo evolutivo.

Altemativamente, os Introns podern fornecer urna van-

tagem seletiva aumentando as taxas em que as seqiiencias

codificantes em exons diferentes de urn gene podem rees-

trururarse por recornbinacao, acelerando assim 0 processo

de evolucao. Em alguns casos, vias alternativas de recompo-

sicao de urn transcrito produzern uma familia de proteinas

correlatas (veja Fig. 14.27). Nesses cases, os introns resultam

em varios produtos de urn iinico gene. A recornposicao alter-

nativa do transcrito troponina T de rato e ilustrada na Fig.

21.4. No caso do gene mitocondrial de Ievedura que codifica

o citocrorno b , os introns contem exons de genes que codi-

£learn enzimas envolvidas no processamento do transcritoprimario do gene. Assim, introns diferentes podem de fato

tel' papeis diferentes, e muitos introns podem nao tel' signi-

ficado biol6gico. Como muitos genes eucarioticos nao tern

introns, estas regioes nao codificantes nao sao necessarias

para a expressao genica normal.

P O N T O S I M P O R T A N T E S

II A maioria dos genes eucari6ticos, mas nao todos eles, sao divi-

didos em sequencias codiflcantes cham adas exons e nao codi-

ficantes chamadas introns.

• Alguns genes contcrn Introns muito grandes; outros abrigam

grandes nurneros de pequenos introns.

II 0 significado biologico dos mtrons ainda esta aberto a debates.

R E M O ~ A O D E i N T R O N S P O RR E C O M P O S I ~ A O D O R N AOs lntrons nao codificantes sao removidos de

transcritos genicos por varies mecanismos diferentes.

A maioria dos genes nucleares que codificam protei-

nas em eucariontes multicelulares contem introns. Menos,

mas ainda muitos, dos genes de eucariontes unicelulares tais

E xon 1 i n t t o n A E x o n 2 lntron B b o n 3

D N A

~ T ra ns cric ao

T ran scr ito 5 ' E xo n 1 E xon 2 ln tro n B E x o n 3 3'n t ron A

or i rnano " V,' C6don n

h)C6don n +1

m R N A

, , ,

" \ " l { } ~ ro c e~ )am e~ ~ ? d e R N A

", .....~ I I ~~ ~

\,.E xo n'l ' E xo n 2'E;on 3./

VVCodon n n + 1

{} T ra du ca o

~olipeptldeo

F ig . 11 .24 • A rernocao de sequencias intron de transcritos

primaries por recomposicao do R N A . 0 mecanisme de

recornposicao deve ser preciso para 0unico nucleotideo garantlr

que os cedens nos exonsseguintes sejam traduzidos corretamente

para produzir a sequencia correta de aminoacidos no produto

polipeptidico.

como leveduras contern introns. Genes raros de archaea e

de alguns virus de procariontes tambern contern introns. No

caso destes genes "divididos", 0 transcrito primario contern

toda a sequencia do gene, e as seqiiencias intron sao excisa-

das durante 0 processamento do RNA (veja Fig. 11.15).

Para genes que codificam proteinas, 0mecanismo de re-composicao deve ser preciso. Ele deve unir seqiiencias exon

com precisao de cada nucleotideo para garantir que c6dons

em exons distais a introns sejam corretamente lidos (Fig.

11.24). A precisao a este grau parece requerer sinais precisos

de recomposicao, supostamente sequencias de nucleotfdeos

dentro de introns e nas juncoes exon-Intron, Entretanto, nos

transcritos primaries de genes nucleates, as {micas seqiien-

cias cornpletamente conservadas de introns diferentes sao

seqiiencias de dinucleotfdeos nas pontas dos Introns, como

por exernplo,

intron

(~

exon-G'T' AG-exon

As seqiiencias mostradas aquisao para 0 filamento de DNA

nao-molde (equivalente ao RNA transcrito, mas com T em

Iugar de U). Alem disso, existem curtas sequencias de con-

sense nas juncoes exon-intron. Para genes nucleares, as jun-

coes de consenso sao

eXOl1xon Intron

~~.------~'\;4G73 G IOO T 1OOA6sA"RG S4 T 63 6Pi74_S7N C65AIOOG[oo N



R E M O ~ A o D E I N T R O N S P O R R E C O M P O S I ~ A O D O R N A 1 1 . 1 3 1 1

Os subscritos numericos indicam as porcentagens defreqtien-

cias das bases de consenso em cada posicao. Assim, urn subs-

crito 100 indica que uma base sempre esta presente nesta posi-

r,;ao.N e Pi indicam que qualquer urn dos quatro nucleotideospadroes ou pirimidinas, respectivamente, podem estar presen-

tes na posicao indicada. A s juncoes exon-intron sao diferen-

tes para genes de tRNA e genes estruturais em mitoc6ndrias

e cloroplastos, que usam mecanismos diterentes de recompo-

sir;ao do RNA (veja a secao seguinte). H a apenas urna sequen-cia curta conservada, 0TACTAAC hoxe, situada a cerca de

30 nucleotideos antecedentes ao sftio de corte 3 I dos introns

em genes nucleares, 0 TACTAAC boxe e bern conservado nalevedura do pao, mas 11aO em eucariontes rnulticelulares. 0

'L'\.CTAA.C boxe exihe uma forte preferencia para Ulnapurina

ou uma pirimidina em cada sitio, Como 0 seguinte:

Pigo N Piso P iS7 Pu? 5 A 100 Pi95

A adenina na sexta posicao do TACTAAC boxe e completa-menteconservada e se sabe que desempenha urn papel im-

portante na reacao de recornposicao. Com a excecao dos

dinucleotide os terrninais e do TACTAAC boxe, as seqiien-

cias de fntron dos genes nucleares sao sequencias altarnenre

divergentes aparentemente aleat6rias. Os introns de genes

de mitoc6ndrias e cloroplastos tambern contern seqiiencias

conservadas, mas elas sao diferentes das de genes nucleares.

A natureza altamente conservada dos sitios de corte 5'

e 3' e 0 TACTAAC boxe indicam que eles tern urn papel

importance no processo de expressao genica. Evidencia di-

reta de sua importancia foi dada por muracoes nesses sitiosque causarn fen6tipos mutantes em muitos eucariontes dife-

rentes. De fato, tais mutacoes as vezes sao responsaveis por

doencas hereditarias em humanos, tais como disnirbios da

hemoglobina.

A descoberta de introns nao codificantes em genes esti-

mulou 0 interesse nos mecanismos pelos quais seqiiencias

Intron sao removidas durante a expressao genica. A demons-

tracao inicial de que as seqiiencias intron em genes eucari-

oticos erarn transcritas juntamente com as sequencias exon

enfocou pesquisas no processamento de transcritos genicos

primaries. Do mesmo modo que os sistemas in vitro deram

P re cu rso r de tR N A

3'OH

5 ' E n don u c le a se

P de rec o rnpo s ic a o

I

inforrnacoes importantes sobre os mecanismos de transcri-

cao e traducao, a chave para a cornpreensao de eventos de

recomposican do RNA foi 0desenvolvirnento de sistemas de

recomposicao in vitro. Usando estes sistemas, pesquisadoresmostraram que existern tres tipos distintos de rernocao de

introns dos Rl'\fA transcritos.

1. Os Introns de precursores de tRNA sao rernovidos por

clivagem endonucleolftica precisa e reacoes de Iigacao

catalisadas pot endonuclease especial de recomposicao e

atividades de ligase.

2. Os introns de alguns precursores de rRNA sao rernovidos

autocataliticamente em uma unica reacao mediada pela

propria rnolecula de RNA. (Nao esta envolvida nenhuma

ativ:idade enzimatica proteica.)

3. Os inrrons de transcritos nucleares pre-niRNA (hnRNA)

sao removidos em reacoes de duas etapas efetuadas porcomplexas partfculas de ribonucleoproteinas chamadas

spliceossomos.

Estes tres mecanismos de remocao de fntrons sao discutidos

nas tres secoes seguintes. Existem outros mec:mismos de re-

mocao de inrron, mas por questao de simplificacao eles nao

serao discutidos aqui,

R e c o m p o s i ~ a o d e P r e c u r s o r d e t R N A : A t iv i d a d e s

U n i c a s d e N u c l e a s e e L i g a s e

A reacao de recomposicao do precursor de tRNA foi es-clarecida em detalhes na levedura Saccha r omyces ce reu is ia e .

Tanto os sistemas de recomposicao in vitro quanto os mutan-

tes de recornposicao sensiveis a temperatura foram usados

para dissecar 0mecanismo de recomposicao de tRNA em S.cereuisiae. A remocao de introns de precursores de tRNA em

leveduras ocorre em dois estagios (Fig. 11.25). No estagio

I, uma endonuclease de recomposicao nuclear ligada amembrana faz dois cortes exatamente nas pontas do intron.

Entao, no estagio II, uma ligase de recomposicao junta as •

duas metades do tRNA para produair a forma final da mo-

lecula de tRNA. A especificidade destas reacoes reside nas

tR N A fin a l

3'OH

fig. 1 1 .25 • A rernocao de

introns dos precursores de tRNA

e urn processo de do is estagios:

(I ) c1ivagens endonucleoliticas

n a s extremidades do intron e (II)

ligacao das pontas recern-forrnadas

dos dois exons, 0 processo de.

ligacao envolve tres reacoss

distintas, todas catalisadas pela

ligase de recornposicao. Esta

e nz im a u nica contem a t i v idades de

fosfodiesterase, cinase e lig as e.

3' 3'

OH OH

~ ' ~ . _ ~ · b _ L i g a s e d eecomposicao

rJ~ II

OH b~Hp

HO- -p

5 ' ln tro n 3 '



1 1 2 I I T R A N S C R I ( ;A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

caracterfsticas tridirnensionais conserv:adas dos precursores

de tRNA, e nao nas seqtiencias de nucleotideos em si.

R e (o m p o s i~ a o A l it o c a t a l i t i c a

Um tema geril na biologi.a e que 0metabolismo ocorre me-

diante seqiiencias de reacoes catalisadas por enzimas. Essas

enzirnas muiro importantes ern geral sao proteinas, as vezes

polipeptfdeos iinicos e as vezes complexes heteromultirne-

ros. Ocasionalmente, as enzirnas precisam de co-fatores nao

proteicos para desernpenhar suas funcoes. Quando Iiga-

<;:oescovalentes estao sendo alteradas, geralmente e supostoque a reacao esta sendo catalisada por uma enzima. Assim,

a descoberta em Tetrahymena tbermopbila de que 0 fntron

no precursor de rRNA foi removido sem a envolvimentode nenhuma arividade catalitica proteica surpreendeu. En-

tretanto, hoje esta claramente estabelecido que a atividadede recomposicao que remove 0 intron deste precursor de

rRNA e intrinsica a propria molecula cle RNA. Alem disso,

foi dernonstrado que tal auto-recornposicao ou atividade

autocatalitica ocorre em precursores de rRNA de varies eu-

cariontes inferiores e em grande mimero cle precursores de

rRNA, tRNA e mRNA em mitocondrias e cloroplastos cle

muitas especies difercntes, No caso de muitos destes introns,

o mecanisme de auto-recornposicao e 0 meSl110 claquele

usaclo pelos precursores de rRNA de Tetrahymena ou muito

semelhante a ele (veja Fig. 11.26). Para outros, 0mecanisme

de auto-recomposicao e similar ao mecanismo de recompo-

sicao observado com precursores nucleates de mRNA, mas

sem 0 envolvimento do spliceossomo (veja Fig. 11.27).A excisao autocatalftica do intron no precursor de rRNA

de Tetrahymena e de alguns outros lritrOl1S nao requer uma

Fonte de energia extern a e nenhuma atividade catalftica pro-

teica. Em vez disso, 0 mecanisrno de recornposicao envolve

uma serie de transferencias de ligacoes fosfoester, sem liga-

coes perdidas ou ganhas no processo. A reacao requer um

nucleosideo on nucleotideo guanina com urn grupo 3' -OR

livre (GTP, GDP, GMP ou guanosina funcionais) como co-

fator mais urn cation monovalente e um cation clivalente. A

necessidade de G- 3' -OE e absoluta. N enhuma outra base

pode ser substituida no co-fator nucleosideo ou nucleotideo.

o Intron e removido por meio de duas transferencias de liga-

<;aofosfoester, e 0 intron removido pode subsequenternente

ser circularizado por meio de outra transferencia de ligacao

fosfoester, Estas reacoes estao diagramadas na Fig. 11.26.

A circularizacao autocatalitica do Intron removido sugere

que a auto-recomposicao destes precursores de rRNA reside

primariamente, ou totalrnente, dentro da propria estrutura do

Intron. Supostamente, a atividade autocatalitica e dependenteda estrutura secundaria do Intron ou pelo menos da estrurura

secundaria da molecula precursora cle RNA. A s estruturas

secundarias desses RNA auto-recompostos deve colocar os

gropos reativos em justaposicao para perrnitir que a trans-

ferencia da liga<;:aofosfoester ocorra, Como as transferen-

cias das ligacoes fosfoester de auto-recomposicao sao reacoes

potencialmente reversiveis, a rapida degradacao dos Introns

removidos, ou 0 envio de rRNA recomposros para 0 cito-

plasma, pode ativar a recomposicao no sentido para diante.

Note que as reacoes de recomposicao autocataliticas sao

cle natureza intramolecular e portanto nan sao dependentesde concentracao. Alem disso, os precursores de RNA sao

capazes de formar tim centro ativo ao qual se liga 0 co-fa-

tor guanosina-3' -OB. A recomposicao-autocatalitica des-

ses precursores de rRNA demonstra que os sitios cataliticos

nao sao restritos a protefnas. Entretanto, nao h a atividade

trans catalitica como para enzimas, mas apenas atividade cis

catalftica. Alguns cientistas acreditam que a recomposicao

Precursor de rRNA:

E xon 2

, : ;. A p ,o L iga< ;ao fos foeste r

na i u n ~ a o exon

l-fntron e t r ans fenda

para G - O H, c or ta n do

a l igat;:ao ex o n l-Jntron.

Exon 1 E x o n 2

5P-C=~ OH 3'

,\Ap

"'ft.'V. ig a ca o f os fo e st er na

j un c a o i nt ro n -e x o n 2 etran sfe nda pa ra a p on ta

3 ' do e xon 1 , jun tan do

exons 1 e 2.

Exon 1

;E xon 2

-0-P -OH 3 '

' :; 'AP"

o Circular izacso defntron po r t ra n s fe r e n ci a

d e l ig ac a o I os to es te r

in terna.

i n t ron

r emovido

Fig.11.26 III Dagrama do mecanisme de auto-recornposicao do

precursor de rRNA de Tetrahymena thermophila e a subsequente

circularizacao do intron removido.



R E M O ~ A O D E iN T R O N S P O R R t : C O M P O S I \A O D O R N A I I I m

Fig.11.27 • Fotos de microscopia eletronica de spliceossomos

purificados. Note a marcante subestrutura das particulas, que tern

dimens6es de 40 a 60 nan6metros. 0detalhe (acima a esquerda)mostra urna particula com um filamento fino e uma particula menor

no final do fHamento.

autocatalitica do RNA possa ser Ulna relfquia de urn mundo

inicialmente baseado em Rt"'\fA.

Recomposi~aod e P re -m R N A : s n R N A , s n R N P e 0

S p l i c e o s s o m o

Os Introns em pre-mRNAs nucleates sao removidos em duas

etapas, como as fntrons nos precursores de tRNA de levedu-

rase precursores de rRNA de Tctrabvmen» que foram discu-

tidos nas duas secoes precedentes. Entretanto, os introns nao

sao removidos par simples nucleases e ligases de recornposi-

«ao ouautocataliticamente, e nao e necessaria nenhum co-Ea-

tor guanosina. Em vez disso, a recomposicao de pre-mRt"'\fA

nuclear e feita por estruturas complexas de Rt"'\fA/proteina

chamadas spliceossomos (Fig. 11.27). Estas esrruturas sao

de muitos modos como pequenos ribossomos, Elas contern

um corrjunto de pequenas moleculas de RNA denorninadas

snRNA (RNA pequenos nucleates) e cerca de 40 proteinas

diferentes. As duas estapas na recornposicao do pre-mRNA

nuclear sao conhecidas (Fig. 11.28). Entretanto, alguns deta-

lhes do processo de recornposicao ainda s a o . incertos,Cinco snRNA, chamados UI, U2, U4, US e U6, estao

envolvidos na recornposicao do pre-mRNA nuclear como

cornponentes do spliceossomo. (snRNA U3 esta localizado

no nucleolo e provavelmente esta envolvido 1 1 a formacao

de ribossomos.) Em rnamiferos, estes snRNA variarn de

tamanho de 100 nucleotideos (U6) a 215 nucleotide os

(U3). Alguns dos snRNA 1 1 a levedura S. cereuisiae sao.mnito

maiores. Esses snRNA nao existern como moleculas livres

de RNA. Em vez disso, eles estao presentes em comple-

xos de pequeno RNA nuclear - protefna chamados snRNP

(pequenas rihonucleoproreinas nucleares), Os spliceosso-

mas sao compostos de quatro snRNP diferentes e fato-

res de recomposicao de protefnas durante 0 processo derecomposicao. A caracterizacao dos snRNP foi facilitada

pela descoberta de que alguns pacientes com uma doenca

auto-imune a s vezes fatal chamada lupus eriternatoso sis-

ternico produzem anticorpos que rea gem com rnuitos de

seus proprios companentes celulares incluindo proteinassnRNP. Tais anticorpos sao chamados auto-anticorpos por-

que des reagem com as proteinas do proprio padente.

Normalmente, 0 sistema imune humano produziraape-

nas anticorpos que reagem com proteinas ex6genas (Cap.

23). Em pacientes com lupus, os auto-anticorpos causarn

inflarnacoes de tecidos e 6rgaos que podem resulrar em

funcionamento anormal do coracao, dos rins ou do figado

e ate. mesmo na morte. Os auto-anticorpos de pacienres

com lupus eritematoso sistemico podem ser usados para

precipitar snRNP. Assim, eles facilitam rnuito a purificacao

dos snRNP paraesrudos estruturais e funcionais,

5

~A .p

"'. 0 sp lic e o ss om n com p le topa rtic ipa n a c l i vagem da

ligacao I os 'o es te r n o s it iode co rte do in tro n em 5 ' e

n afo rm a ca o d e u ma lig ac aofo sfo die ste r e ntre 5 ' G d oin tron e A c on se rv ad a p er to

da pon ta 3 ' do in tro n . sn RN A

U4 e l iberado.

Exon 2

l i l i i i i . . . . l 1 l i ' ~I '-P

" '0" 0 s i t io de c orte d o in tr0 l2 3e c liva do e do is e xo ns sao

u o id o s p o r u m a li ga ~ aof a sf o di e s te r .

E xo n 2xon 1_____ 3'

mRNA r e compos to

Fig. 11.28 II Os papeis postuladosdos snRNP contendo snRNA narecomposicao nuclear do pre-mRNA



3 1 4 I I T R A N S C R I \A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

U M M A R £ O N A G E N E T l C A : I n t r o n sDuranteos anos 1960 e 0 inicio dos anos 1970, surgiu urna visao

eJegantemente simples do gene. 0gene era uma sequencia linear

de pares de bases codtficando uma sequencia co-linear de amino-

acidos em seus produtos pofipeptfdicos. Esta visao do gene foi de-

senvolvida quase que exclusivamente mediante estudos de proca-

riontese seus virus. Lcgicarnente, nos tarrrbernsabemos que apenas

1a 2 por cento do DNA em mamiferos especificou as ssquencias de

arn lnoacldos em prote jnas. Entretanto, todos foram surpreendidos

em 19 7 7 quando sequencias nao codificantes foram descobertas

entre as sequenclas codificantes de genes eucarioticos.

A prime ira evidencla de que algo inesperado estava ocorrendo

veio deestudcs

em adenovirus, um virus com DNA queinfecte hu-manes. Quandb Susan Berget e Claire Moore, trabalhando no labo-

ratorio de Philip Sharp no MIT, hibridizaram mRNA purificado de

adenovirus com DNA adenoviral uriifilamentar , eles descobriram

que 0mRNA nao se hibridizava com uma regiao do DNA como

esperado, Em vez disso, 0 mRNA se hibridizava com tres regi6es

diferentes no fi larnento de DNA (Fig. 1}.1De algum modo, segmen-

tos diferentes do mRNA transcrito haviam sido recompostos. Os

mesrnos resultados foram obtidos independentemente por Louise

Chow e colaboradores no grupo de Richard Roberts no Cold Spring

Harbor Laboratory/ Nessa epoca, muitos cierrtistas pensaram que

lBerget. S. M., C Moore e P.A.Sharp, 1977.Spiked segments at the 5' terminus

of adenovirus 2 late RNA ProeNatl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 3171-3175.

2Chow, L . \ " R. E. Gelinas, T . R.Broker e R.J. Roberts, 1977.An amazing sequence

arrangement at the 5 ' ends of adenovirus 2 mRNA Cell 12:1-9.

tal estranha recomposir;ao de segrnerr tos do mRNA podla,se: a]$q

u n'iGo de virus. Eritretanto, essa vis~o logose rnostrou er~ad~. .'. " ..

Pesquises em quatro laboratories diferenres'demenstrafarn q~~

sequencias intercalates estavarn presentee- em genes ~¢djfi2frrl~

tes de tipos diferentes de protefnas em vertebrados; 9traQalh6

sobre 0 gene de ~-globjna de coelho no [ i; lboratdrio deR'iChard

Flavell,3 0 gene de ~-globina de comundongo no laboratorto de

Philip Leder4 e 0 gene de ovalbumina de galinha nos labotatorlos

de Pierre Charnborr' e de Bert W. O'Mallel docurnentaram inde-

pendentemente a presence de sequencias intercalares hao cadi-

ficantes, hoje charnadas [ntrons, nestes genes estruturais, Todos

o s quatro es tudos depende ram dodesenvo ! vimen to d e n ; r e t o d o spelos quais genes individuais puderam ser isolados fclQnad6s") e

caracterizados (Cap. 15).Quando os genes forarn oornparadoscorn

seus produtos de mRNA, foi visto que etes continham sequencias

de nucleotldeos que na9 estayam presentesnos mRNA .

' Jeffreys, A )., e R.A. Flavell , 1977, The rabbit ~-globin gene contains a lar:ge

insert inthe coding sequence. Cell 12 : 1097-~108.

"Tllghman, $,M, D. C . Tiemeier, F . Polsky, M. H.Edgell.], G.Seidman, A Leder, L

W . Enquist, R . Norman e P . Leder, 1977. Cloning specific segments of the mam-

malian genome: Bacteriophage J c containing mouse globin and surr6undrng

gene sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 74: 4406-4410.

SSreathnack, R., C . Benoist, K. O'Hare, F.Gannon e P.Chambon,.1978. Ovalbu-

min gene: Evidence for a leader sequence in mRNA and DN A sequences at theexon-intron boundaries. Proc. Natt. Acad. Sci. USA 75: 485~-4857.

6W OO , S . L C , A . D ug a ic zyk, M -J Tsa l , E. C . La i, J F . Ca t tera l l e B . W , O'MaIlO!y,

1978. The ovalbumin gene: Cloning of the natural gene. Proe. Nat!. Acad. SCi.

US.A 75 : 3688-3691.

(a ) Microg r9f ia e le tr on ic a (b ) Diagrama in te rp re ta tiv e d e (a J,

F ig . 1 • A prirneira evidencia de

intronse recornposicao.do RNA. (a )

Micrografia eletronica mostrando

a estrutura do heteroduplice

forrnado por-hibridizacao do

mRNA final de adenovirus com 0

filamento complementar de DNA

no cromossomo de adenovirus

(reproduzida com perrnissac de S:

M. Berget, C . Moore e: P . A . Sharp.

1 977 . P roc . N at!. A cad . Sc i. U .s.A . 7 4:

3171-3175), (b ) Desenlio interpretativo

daestrutura mostrada em (a). ( . e )

Diagrama rnostrandoas localizacces

dos introns [sequencias intercalates] e

exons na ponta 5' docromossomo-de

adenovirus.

5 ' ~ I - - - - - - ' U. .f f r L : L · r u r : : : ' - - - ' B : _ _ _ _ _ L L_ f n _ t r c = - ? n _ s _ ! _ r - - " " - ~~ JL___ - - I 7 1 3 '1.----------EcoR A--------~ r-rtb

(e l l .ocal izacoas d a s seq i i enc i as e x o n e i n t r o n n o genoma de adenovirus.



R [M O ~ A o D E i N T R O N S P O R R [C O M P O S I \ A o D O R N A III m

U M M A R C ON A

G E N E T I C A ( c o n t i m i a ( a o ).....Algumas das prirneiras evidenoias de introns em genes de

B-globinade mamlferos resultaram da vlsuallzacao de hibridos

. genomicos de DNA-mRNA por rnicroscopla eletronica. Os du-

pUces DNA-RNA sao mais estaveis que a dupla helice de DNA.

Assirn, se as duplas helices de DNA parcialmente desnaturadas

sao incubadas com molecules hom6logas de RNA em condi-

coes aprcpriadas, os filamentos de RNA irao hibridizar com fi-

larnentos complementares de DNA, deslotando os filamentos

equivalentes de DNA (Fig. 2). As estruturas hibridas DNA-RNA

resultantes conterao regioes unifilamentares de DNA chamadas

aleas R , onde as molsculas de RNA deslocaram filamentas de

DNA para formar regloes duplices DNA-RNA. Essas alcas R po-dem ser visualizadas diretamente por microscopia eletr6nica.

Assima hibridizacao de alca Rea rnicroscopia eletr6nica pro-

porctonaram um poderoso instrumento para estudos da estru-

tura genica,

Quando Shirley Tilghman, Philip Leder e colaboradores hibridiza-

ram mRNA purificado de ~-globina de camundongo com uma rno-

l e cu la de DNA que continha a gene de ~-globina de camundongo,

eles observaram duas a lc as R separadas pe r uma a ka de DNA bif i la -

Mais

RNA5 ' 3'

~

nD es na tura ca o p arc ia l d o D NA e mcon dicoes que perm item ao R NAdes locar 0 f il ame n to h om61o gode D NA

o R NA faz pa r com 0 fila me nto c om ple me ntar de D NA ,fo rm an do u m d up lic e D N A-R N A, d eix an do u ma re gia ou nifi la rn en ta r d e D N A c ha ma da a lc a R .

A h ;: a R

5' I5'

Du p li ce DNA - DNA

DupliceDNA-RNA

Fig. 1 • A tecnica de hibridizacao de alca R.

mentar [F ig , 3aj? Seusresultadcsdernonstrararrr a presence de uma

sequencia de pares de nucleondeos no meio do gene de ~-globiJ1a

que nao esta presente no mRNA de ~-globina e, portanto, nao codi-

fica aminoacidcsno polipeptfdeo de~-globina, Quando Tilghmali

e colaboradores repetiram osexperimentos corn.alca $ .. usancro,

transcrito.s do gene purificado de ~-globina isolados de nucleos

e tides como sendo transcritosgenicos primaries ou molecules de

pre-mRNA, em lugar do mRNA citoplasmatlco de ~·cglobinai cites

observaram apenas urna alca R (Fig, 3b), Este resultado indicou que

o transcrito prirnaric contern a sequencia completa do gene estru-

tural, incluindo tanto exons quanta introns. Juntos, os resultados

de a l c a s R : obtidos com mRNAdtoplasmatico e pre-mRNA nucleardemonstram que as sequencias intron sao removidas e as sequen-

cias exon sao recompostas durante 0, processamento que converte

o transcrito prirnario no mRNA final.

Tilghman e colaboradores logo verificaram sua interpretacao

dos resultados de alca R sequenciando ur n segmento do gene de

~-globina de camundongo que envolve a juncaoentre este grande

lntron e a excn precedente:8 Quando eles usararn os cedens es-

tabelecidos para comparar a sequencia de n!;lcieotfdeos do-gene

de j)-globina de camundongo com a sequencia conheclda de ami-

noacidos da ~-globina de carnundorigo, apresenea da sequencia

nao codificante ficou clara (Fig, 4 ). Se nao houver fntron nesta

pcsicao no gene de ~-globina de camundongo; a sequencia de

nucleotldeos preve que os arninoacidos. 105 ate 110 seriam Val-Ser-Leu-Met-Gli-Tre, Entretanto, a sequencia de amlnoacldos.de

~-globina de camundongo foi determinada experlmentalmente, e

os arninoacidos 105 ate 110 sao l.eu-Leu-Gli-Asn-Met-lle. Em uma

publlcacao posterior, Tilghman, Leder e colaboradcres sequen-

ciaram 0 resto do gene de ~-globina de camundongo e rnostra-

ram que os arninoacidos 105 a 110sao codificados pelosprimeiros

seis pares de trincas de nuclectideos no exon distal a este. lntron,

o grande fntran do gene de ~-globina caracterizado nestes pri-

meirosestudos tern 653 pares de nucleotldeos de tamanho. Logo·.

apes a descoberta do grande fntron,Tilghman, Leder e colabora-

dores descobrirarn que 0gene de ~-globina de camundongo Con"

tinha um segundo fntron menor, com 116 pares de nudeotideos

de tamanho (Fig. 4). Os resultados de Richard Flavell e colabora-

dares mostraram que a estrutura do gene de ~~globina de.coelhe

e muito similar a de camundongo.

Est:udos de Tom Maniatis, Richard Flavell e outros rnostraram

que a estrutura do gene humano de ~-globina tarnberne multo s i-

rnilara do gene de ~-globina dscamundengo. Amboscontern oo is

lntrons que separam tres exons. Cada urn.dos dois genes humanos

de a-globina tarnbern contern dais Introrrs. De fate, os genes hu-

7Tilgfl l 'nao, s.M., D.C . Tiemeier, J. G. Seidman, B.M . Peterlin, M.Sullivan,). v .Maizel e P.leder, 1978. Intervening sequence of DNA identifledih the structu-

ral portion of a rnousef-globin gene. Proe.Nat/.Acad. Sci.(j,S.A 75: 7.25.729,

8lbid.



~ 1 6 T R A N S C R I ~ A O E P R O C E S S A M E N T O D O . R N A

Micmgraf laeletronica D i a g ra r n a i n te r p re t a ti v e

DNA bi f il a rnentarde fa go :\

(Ii) A I~ as R fo rm ada s p or m R NA de ~ -g lo bin a.

f\ ' \ ic:rograflC!elet r6nica D iag rama in terpretat ive

DNA bi ti la rnentarde fago' ic

(b) AI<;a R fo rm a da p elo tra ns cr ito p rim a rio (p re -m R NA ) d e ~ -g lo bin a.

G en e de B-globinae c amundongo

653

[; In tron

Fig. 3 • Evidencia de alca R para um intron no-gene

de ~-g[obina de carnundongo. (a ) Quando os genes

de ~-g[obina de camundongo e os mRNAforam

hibridizados em condicoes de al<;.aR,duas alcas R

foram observadas nos hibridos RNA-DNAresultantes.

(b ) Quando transcritos primaries de prtHnRNA de

genes de P:globina de camundongo forarn usados nos

experimentos de alca R,.observou-se urna unica alca R.

Estes resultados demonstram que a sequencia irrtron

esta presente no transcrito prirnario mas e removidadurante 0processamento do transcrito prima rio para

produzir 0mRNAfinal.

260

S eq ue ncia de n ucle otide os : T GT G AC A AG C TG C AT G T G G AT C C T G AG A AC T IC A GG G TG ;~ Gl' C iQ AT G G G C A Ce

( nao t raduz idos )

F ig. 4 • Estrutura do .gene principal dep-globina de camundongo. Os tres exons

[sequencias codificantes] sao rnostrados

em purpura, e os dois Introns (seqnenclas

nao codificantes) sao mostrados em

verrnelho, A correlacao das sequencias

exon no gene com as sequencias de

mRNA e indicada pelas linhas diagonals

tracejadas. As sequencias de nucleotideos

do filamento de DNA nao transcrito sao

mostradas para asduas jun<;O'es

exon-Intron. Essas sequencias de

nucleotideos sao as mesmas das

sequencias de mRNA, mas T substitul U.

iO-globina:

S e qu e nc ia d e a rn in o ac id os : C i s- A $p - Li s- Le u -H i s- V ai -A s p -P r o, G lu -A s n -F e n - Ar g

95 100 104105 110

S eq ue n6 ia o re vis te d e a rn in oa cid os se i nt ro n f os se codi f i cante:, ,

Val;~erle u - M e t -G II-Tre, ,-~--_ - - - - --

Sequenc i a d e n u c te o tl de o s :

S eq ue nc ia d e a ru no a ci do s :

~-glob' ina:

S eq u~ nc ia p re vis ta d e aminoec idos se

o l nt ro n f o s se c od if ic a n t e :

(nao haduzido.sl

TCT TCe A lA TIe eCA CAG eTC CTG G Ge AAT ATG ATC

100 104 105

Leu -Le u- G I i -Asn-M et-Il e

110

S e r - S e r - T ie - F en - P ro - G in



R E M O f ;A O D E I N T R O N S P O R R E C O M PO S I f ; A O D O R N A II:m

j ItM't'.

U M M A R C O N A G E N t m A ( c o n f m u ~ a o )manes codificantesdascadeias de glcbina embtionariasimilares

a C(l ; (~le Sirtlil\lres,a: S (E l, da cadeia de globina fetal tipo.!3 (y ) e da

cadeiade globina adulta tipo ~ (0),todos contern dois intronse

t l e :~~xo .ns , Ar~m dtsso, todos os gene's hurnanas quecedificam

glpbinas tipe a tem Irrtrons nas rnesrnas P9sk;6es [separande 0.

codon 31 do 32 eo codon 99 do 100), como todos os genes hu-

rnanos que codificarn globinas tipo ~. [separandoo codon 30 do

31e 0 codon 104 de 105). Portanto, as posieoes dos introns foram

altamente conservadas durante a evolucso des genes de globina

humana.

Enquantc Philip Leder, Richard Flavell e colaboradores esta-

yam dernenstrarrdo a presen<;a de dois introns em genes de 1 3 -globinade rnarmferos, Pierre Chamben, Bert W . O'Malley e seus

colaboradores estavam fazendo experimentos simi lares no . gene

de ovalbumlna de galinha. Quando. 0. filamento transcrito do gene

de.ovalburnina de galmha foi hibridizadorom 0.mRNA de ovalbu-

mina e visuallzade por rnicrescopia eletronica, sete alcas unifila-

mentares de DNA forarn observadas (Fig, 5), sugerindo que 0gene

de ovalbumina contern sete mtrons. Experimentos posteriores,

(n) M i c; ro g ra fi a e l et r6 n ic a d o h e te ro dOp li ce DNA -mRNA

d e o v al bum iH a.

induindo comparacces diretas das sequ~l1dasdogel1ee~'ci;,i1t~~Ai, .

rnostrararn concluslvamente que ogene de()valbutniha'd~gclqh~~'

contern sete intr()ns separando oito exons.E:stl,Jd6ssl,lbseq(jl'!~t¢g,;

mostraram que os Intrens-sao uma caractenstica comljro'(jt(nal}:i~

ria dos genes eucarloticos. Entretanto, amda ternos muito; o gqe .

aprender sobre suas funcoes,

QUES TO ES P A RA D IS CU SS O ES

1 . Os mtronscorrespondem a quase um quarto. do DNA no .g~-

noma humane. Os introns sap apenas sequeneias "sucata':?Ou

eles tern papeis irnportantes errrorganisrrros eucari6ticos? Que

funcoes voce pode pensar que tenham as sequsnclas de DNA

situadas em Introns?

2. Poucos genes procarloticos contern mtrons, enquantoa maio-

ria dos genes eucari6ticos contern Introns. V o . r , ; ; e pode pensar

em possiveis expllcacoes paraestadiferenca? Qual desuas

explicacoes voce acha que e mais provavelrrrente a·corrlilta"?

Por que?

(b) D ia g ram a in te rp re ta tiv o d o h e te ro du ph ce DNA-mRNA

Fig, 5 II Evidencia de sete introns no gene de ovalbumina de galinha. A molecula de mRNAe representada poruma linha vermefha·.

tracejada; 0f ilamento de DNA e mostrado como uma linhaverde. As sequencias tntron sao alcas de DNA unifilarnentar rnarcadas-de.A-ate-G,

Csda urn dos snRNA U1, U2 e U5 esta presente em uma

partfcula espedfica de snRNP. Os snRl~A U4 e U6 estao

prcsentcsjuntoscrn urnquarto SnRNP; os snRNA U4 e U6

contem duas regi5es de complernentariedade intermolecular

que fazem pares de bases no snRNP U4/U6. Cada um dos

quatro tipos de partfculas de snRNP contern urn subgrupo

de sete proreinas snRNP bern caracterizadas mais uma ou

mais proteinas tinicas para 0 tipo particular de partfcula de

snRNP. Todos os quattO complexes de snRNPestao presen-tes nos spliceossomos isolados mostrados na Fig. 11.27.

A primeira etapa na recornposicao nuclear de pre-mRNA

envolve clivagem no sitio de clivagem do intron em 5 ' ( . j , .

GU-lhtron) e a formacao de uma Iigacao fosfodiester intra-

molecular entre 0 carbono 5' cia G no sftin de clivagem e 0

carbone 2' de uma Aconservada perto da ponta 3' do Intron.

Esta etapa ocorre em spliceossomos completes (Fig. 11.28) e

requer a hidrolise de KfP. Evidencias indicam que 0 snRNP

U1 deve ligar-se.ao sitio de corte 5' antes da reacao inicial de

divagem. 0 .reconhecimento do sitio de clivagem na ponta5' do in tron provavelmente envolve parearnento de bases



3 1 8 I I T R A N S (R I ~ A O E P R O C E S S A M E N T O D O R N A

entre a sequencia de consenso neste sitio e uma sequencia

complementar petta da ponta 5' do snRNA VI. Entretanto,

a especificidade cialigacao de pelo menos alguns dos snRNP

a s seqiiencias de consenso do intron envolve tanto os snRNAquanto proteinas snRNP especfficas,

A segunda snRNP a ser adicionada ao complexo de re-

composicao parece ser a snRNP V2. Ela se liga a sequencia

de consenso que contern a A conservada que forma o ponto

de ramificacao na estrutura em laco do intron recomposto.

Portanto, 0 snRNP V5 liga-se ao sitio 3' de recomposieao,

e 0 snRNP V4IU6 e adicionado ao complexo para produzir

urn spliceossomocompleto (Figs. 11.27 e 11.28). Quando 0

sitio de recomposicao do intron 5 ' e cortado na etapa 1, 0

snRNA V4 e liberado do spliceossorno. Na etapa 2 da reacao

de recomposicao, 0 sitio de recomposicao em 3' do intron ecortado, e os dois exons sao unidos por uma ligacao fosfodi-

ester normalS' com 3' (Fig. 11.28). 0mRNA recomposto

esta agora pronto para ser mandado para 0 citoplasma e tra-

duzido em ribos501110S.

. . . ! 'O N T O S I M P O R T A N T E S

III Sequencias fntron nao codificantes sao removidas dos RNA

transcritos no nucleo antes de seu transporte para 0cito-

plasma.

• Os introns em precursores de tRNA sao removidos pela acao

conjunta de uma endonuclease e uma ligase de recornposicao

enquanto os fntrons em alguns precursores de rRNA sao rerno-

vidos autocataliticamente, sem proteina catalitica envolvida.

I I I i I Os fntrons em pre-mRNA nucleares sao removidos em estrutu-

ras ribonucleoproteicas complexes chamadas spliceossomos.

• 0processo de rernocao de introns deve ser precise, com exa-

tidao no nivel de nucleotideo, para garantir que cedens em

exons distais a introns sejam lidos corretamente durante a tra-

ducao.

f x e r c f c i o s B a s i c o s lIustram a analise genetica basica,

1. Se 0 f ilamento molde de urn segmento de urn gene tern a sequen-

cia de nucleotide os 3' -GCTAAGC-5', que seqi:iencia de nucle-

otideos esrara presente no RNA transcrito especificaclo por estesegmento genico?

Resposta: 0RNA transcrito S e r a complemental' ao filamento

molcle e terri polaridade quimica oposta, como na ilustracao se-

guinte:

filamento molde de DNA:

RNA transcrito:

3 '-GCTAAGC-5'..................

S '-CGAUUCG-3'

2. Se 0filamento nao-molde de urn gene em E . coli tern a sequencia:

5'-TIGACA-(18 bases)-TATAAT-(8 bases)-GCCTICCAGTG-3'

que sequencia de nucleotfcleos estaria presente no RNA trans-crito deste gene?

Resposta: 0 gene contern seqiiencias promotoras perfeiras -35

e -10. A transcricao cleve ser iniciada em um sitio de cinco a

nove bases posteriores it sequencia -10 TATA!\T, e 0 termino

5' do transcrito cleve conter uma purina. 0 filame~J.to molde na

ponta 5' clo transcrito deve ter a seguinte estrutura:

Filamento molde de DNA:

(sequencia -35) (sequencia -10)

3'-AACTGT-(18 bases)-ATATTA-(8bases)-CGGAAGGTCAC-5'

RNA transcrito: 5'-GCCUUCCAGUG-3'

3. Se 0 filamento nao-rnolde mostraclo no exercicio 2 fosse parte

de ll111 gene em Drosophila no lugar de E . coli, seria produzido 0

mesmo transcrito?

Resposta: Nao, pois a s sequencias promotoras que controlam

a transcricao em eucariontes tais como Drosophila sao cliferentes

dos prornotores em procariontes tais como E . coli. Portanto, 0

gene de E. coli provavelmente nao seria transcrito se presente

em Drosophila.

4. Uma cientista esta estudando a transcricao de urn gene em celu-

las de camundongo em culrura. Como ela pode determinar se 0

gene e transcrito por RNA-polimerase I, RNA-polimerase II ouRNA-polimerase III?

Resposta: Ela deve dererrninar que efeito 0 tratamento das

celulas com cc-amanitina rem na transcricao do gene. Se a 0:-

amanirina nao river efeito na transcricao, ogene e transcritopela RNA-polimerase I; se a cc-amanitina bloqueia a transcricao,

ogene e transcrito pela RNA-polimerase II; se a o:-amanitina

diminui mas nao bloqueia totalrnente a transcricao, a gene etranscrito pela RNA-polimerase III.

5.0 transcrito primario au pre-mRNA de urn gene nuclear em

urn chimpanze rem a sequencia:

5' -G--exon l-AGGUAAGC-intron-CAGUC---exon 2-A-J'

Apos 0fntron ter sido rernovido, qual a sequencia mais provavel

domRNA?

Resposta: Os introns contem pontas dinucleotidicas altarnente

conservadas: 5'-GT-AG-3' no filamento molde do DNA ou

5'-GU-AG-3" no RNA transcrito. Assim, a sequencia Intron

e quase certarnente 5' -GUUAAGC-intron--CAG- 3'. Com a

precisa remocao do intron, a sequencia do mRNA sera:

5'-G-exon l-AGUC---exon 2-A-3'



Q U E ST O E S E P R O B L E M A S II s

T e s t a r ~ e u s ( o n h e c i m e n t o s Integra eeneeitos e tecnicas diferentes.

1. Algumas proteinas humanas de importancia medica tais como

a insulina e 0hormonio de crescimento hoje estao sendo pro-

duzidas em bacterias. Usando-se as ferramentas de engenharia

generica, seqiiencias de DNA que codificam estas proteinas fo-

ram introduzidas em bacterias, Voce quer introduzir urn gene

humano em E . c o l i e. fazer com que este gene produza grandes

quantidades do prcduto genico humano nas celulas bacterianas,

Supondo-se que 0 gene humano de interesse possa ser isolado

e introduzido em E . c oli, que problemas voce reria em tentar

atingir sua meta?

Resposta: As sequencias promotoras necessarias para iniciar

a transcricao sao muito diferentes em rnamiferos e bacterias.

Portanto, seu gene nao sera expresso em E . coli a menos que

voce primeiro junte sua regiao codificante a uma promotor bac-

teriano. Alem disso, seu gene humano provavelmente contera

introns. Como E . coli nao contern spliceossomos ou maquinaria

equivalente que remova introns dos RNA transcritos, seu gene

humano nao sera expresso corretamente se contiver introns.

Como voce pode ver, a expressao de genes eucarioticos em celu-

las procarioticas nao e uma tarefa trivial.

2. Um gene humane de ~-globina foi purificado e inserido em

urn cromossomo linear de bacteri6fago lambda, produzindo a

seguirtte molecula de DNA:

A . DNA Exon 1 in tron 1 Exon 2 In tron 2 Exon 3 A , DN A

I I I I

Se esta molecula de DNA e hibridizada com um mRNA hu-

mana de l3-g1obina usando-se condicoes que favorecem duplices

DNA-Rl"JA em relacao a duplices DNA-DNA (condicoes de

mapeamento de alca R) e 0 produto e visualizado por micros-

copia eletronir:a, que estrutura de acido nucleico voce esperaria

ver?

Resposta, 0 transcrito prirnario deste gene humane de l3-g1o-

bina contera ambos os Introns e todos as tres exons. Entretanto,

antes de manda-lo para 0 citoplasma, as sequencias de Intron

serao rernovidas do transcrito, Assim, a molecula de mRNA fi-

nal con ted as tres sequencias exon reunidas sem a presen\;a de

seqiiencias Intron. Em condicoes de 31\;aR, 0mRNA ira helicoi-

dizar-se com 0 filamento complcmentar de DNA, deslocando

o filamento equivalente de DNA_ Fntreranto, como 0mRNA

nao contem sequencias intron, os Introns permanecerao como

regioes de DNA bifilamentar como mostrado no diagrama se-

guinte.

DNA u n if rl am e n ta r d e e x o n d e sl oc a do

L.1. D N A

m R N A

I

E xon 1

Q u e s t o e s e P r o b l e m a s Acentuam a compreensae e desenvolvem as habilidades analitieas.

11.1. Distinga 0DNA do RNA (a) quimicamente, (b) funcional-

mente e (c) pela localizacao na celula.

11.2. Que bases no mRNA transcrito represenrariam a seguinte

sequencia molde de DNA: 5'-TGCAGACA-3'~

113. Que bases no filarnento transcrito cle DNA dariam origem

a seguinte sequencia de bases do mRNA: 5'-CUGAU-3'?

11.4. Com base em que evidencia foi estabelecida a hip6tese do

RNA mensageiro?

11.5. Em que locais cia celula eucari6tica ocorre a sintese de pro-

tefnas?

11.6. Cite tres rnodos pelos quais os mRNA de eucariontes dife-

rem dos mRNA de procariontes.

11.7. Que tipos diferentes de moleculas de RNA estao presen-

tes em celulas procari6ticas? em celulas eucari6ticas? Que

papeis estas classes diferentes de molecnlas de RNA ternna celula>

11.8. Muitos genes eucari6ticos contem introns nao codificantes

que separam as seqiiencias codificantes ou exons destes g-e-

nes. Em que esragio durante a expressao destes genes divi-

didos sao removidas as sequencias Intron nao codificantes?

11.9. Por varias decadas, 0dogma na biologia tem sido que as rea-

coes moleculares em celulas vivas sao catalisadas por enzimas

compostas de polipeptideos. Sabernos hoje que os Introns de

algumas moleculas precursoras de RNA tais como os precur-

sores derRNA em Tetrahymena sao removidos autocatalitica-

mente ("auto-recompostos") sern envolvimento de nenhuma

proteina catalftica. 0 que a dernonstracao da recornposicao

autocatalftica indica sobre 0 dogma de que as reacoes biolo-

gicas sao sempre catalisadas por enzimas proreinaceas?

11.10. Que papel(eis) tern os spliceossomos na expressao genica?

Qual a Sua estrutura macromolecular?

11.11. Que componentes dos introns de genes nucleates codifi-

cantes de proteinas em eucariontes superiores sao conser-

vades e necessaries para a remocao correta de sequenciasintron de transcritos primariospor spliceossomos?



3 1 0 I I T R A N S C R I \ A O E P R .O C E S S A M E N T O D O R N A

11.12. Faca a correspondencia entre os seguintes termos comcada

uma das d es cri< ;:Q es d ad as a ba ix o ..Termos: (1 ) fatorsigrna (0);

(2) cauda poh(A); (3) TATA~T: (4) exons; (5) TATAAAA;

(6) RNA-polimerase III: (7) intron; (8) RNA-polirl1erase II:

(9) RNA heterogeneo nuclear (hnRNA); (10) snRNA; (11)

RNA-polimerase I; (12) TTGACA: (13) GGCCAATCT

(CAAT boxe).

Descridics:

(a) Sequencia intercalar encontrada em muitos genes eu-

cari6ticos.

(b) Sequencia conservada de nucleotfdeos (-3d) ern promo-

tores eucari6ticos envolvida no inicio da transcricao.

(c) Pequenas moleculas de RNA que estao localizadas nos

rnicleos de celu.as eucarioticas, na maioria como com-

ponentesdo spliceossomo, que participam na remocao

dos introns de transcritos de genes nucleares.

(d) Uma sequencia (-10) no filamento nao-moltle do pro-

motor de E. mlique facilitaa deselicoidizncao locali-

zada de DNA quando em conjunto com a RNA-poli-

rnerase.

(e) A RNA-polimerase no micleo que cataiisa a smtese de

todos os rRNA exceto 0 pequeno 5S TRNA.

(f) A subunidade c ia RNA-polimerase procari6tica que eresponsive! pela iniciacao da transcricao em ptomo-

tores,

(g) Uma sequencia promotora de E . coli situada 35 nu-

c1eotfdeos antecedentes ao sitio de inicio da transcri-

c;ao. Serve COmo U1Il 51ti 'O de reconhecimento do fator

slgma.

(h) A RNA-polimerase no nucleo que catalisa a sintese das

moleculas de RNA transporrador e p equ en' O s RNA nu -

cleares.

(i) Uma serie de poliadenosinas com 20 a 20.0 nucleoti-

deos de tarnanho que e adicionada a ponta 3' da maio-

ria dos RNA mensageiros eucarioticos,

(j) A RNA-polimerase que transcreve genes nucleares que

corlificarn proteinas.

(k) Uma sequencia conservada no filarnento nao-molde

de prornotores eucari6ticos que esni Iocalizada a cerca

de 80 nucleotideos antecedentes ao sftio de inicio de

transcricao,

(I) Segmentos de urn gene eucari6tico que corresponrlem

a s sequencias no RNAttanscrita e processado no final

do gene.

(m) A populacao de transcritos primarios no micleo de.urnacelulueucariotica.

11.13. (a') Quais das seguintes seqiiencias de nucleotfdeos de pre-

mRNA nuclear potencialmente contern urn Inrron?

(1) 5'- UGACCAUGGCGCU_A.A.CACUGCCAlI.UUG-

GCAAUACUGACCUGAUAGCAUCAGCCA.A.-:l'

(2) 5' -UAGUCUCAUCUGUCCAUUGACUUCGAAACU-

GMl.[CGl)MC1JCC1JACGUCUAUGGA- 3'

(3) 5' -UAGCUGOUUGUCAUGACUGACUGGUCAC-

UAUCGUACUAACCl.[GUCAUGCAAVGUC- 3'

(4) 5' -UAGCAGUUCUGUCGCCDCGUGGUGCU-

GCUGGCCCl]1}CGUCGCUCGGGCUUAGCUA-3'

(5) 5'-UAGGUOCGCAUUGACGUACUUCUGAAAC-

UACUAACUACUAACGCt'tUCGAGUCUCM-3'

(b) Urn dos cinco pre- mRNA rnostrados em (a) pode sofrer

recornposicao de Rl"JA para remover uma sequencia In-

tron. Que sequencia de nucleotideos do mRNA resulta-

ria deste evento de recomposicao?

11.14. Qual a funcao dos fntrons em genes eucari6ticos?

11.15. Um determinado gene e inserido no crornossorno do fago

lambda, e ressaltado que contem tres introns. C a) 0 transcrito

primario deste gene e purificado de micleos isolados, Quando

este transcrito primario e hibridizado em condicoes de alca R

com 0 crornossomo lambda recombinanre que leva 0 gen'e,

qual sera 0 aspectodas estruturas em alcaR?Marque sen dia-

grama. (b ) 0mRNA produzido pelo transcrito primario destc

gene e entao isobdo de polirribossomos citoplasmaticos e si-

milarmente examnado pelo procedimento de hihridivacao

de alp R que usa 0 crornossorno lambda recornhinanre que

leva '0 gene. Faca unr diagrama de como sera 0 aspecto das es-

truturas ernalca R quando e usado 0mRNA citoplasmatico.

Novamente, marque os componentes de.seu diagrams.

11.16. Urn segmento de DNA em E. coli tern a seguinte sequencia

de pares de nucleotideos:

3' - ATGCTACTGCTA TTCGCTGT ATCG- 5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I5'-IACGATGACGATAAGCGACATAGC-3'

Quandoeste segmentc deDNA e transcrito pela RNA-poli-

merase, qual sera a sequencia de nucleotideos no RNA trans

crito se 0 promotor estiver siruado a esquerda da sequen-

cia mostrada?

1LI 7. Urn segmento de DNA ern E. coli tern a seguinte sequencia


3'-AT ATTACTGCA ATC'..GGCTGT ATCG-

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I5'-TATAATGACGTTACCCGACATAGC-

ATGCTACTGCT ATTCGCTGT.ATCG- 5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ITACGATGACGATAAGCGACATAGC-3'

Quando este segmento deDNA e transcrito pela RNA-polime-rase, qual sera a sequencia de nucleotideos no R.NA transcrito]

11.18. Um segmento i:leDNA em E. coli tern a seguinte seqiiencia

de pares de nucicotidcos:

3'-AACTGTACGTGCTACCTfGCTGATATfACT-

. I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 .1 1 I 1 I I I5'-TTGACATGCACGATGGAACGACTATAATGA-

GCAATGGGCTGTATCGATGCTACTGCTAT-5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ICGTTACCCGACATAGCTACGATGACGATA-3'

Quando este segmento de DNA e transcrito peJa RNA-

polimerase, qual sera a sequencia de nucleotideos no RNAtranscrito?



Q U E S T O E S E P R O B L E M A S !II J 1 l

11.19. Umsegmento de.DNA humane tern a seguinte sequencia


3'-ATA TTT ACGTGCTACC1TGCTGATAGGACT-

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I5 '-1'ATAAATGCACGATGGAACGACTATCCTGA-

GCi\A'r'GGGCTGTATCGATGCTACTGCTAT-5'

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ICGTTACCCGACATAGCTACGATGACGATA-3 '

Quandoeste segmento de DNA e transcrito pela RNA-palime-rase, .qual sera a sequencia de nucleorideos no R_l\fAtranscrito?

11.20. 0g'enama de urn humano cleve estocar uma imensa quan-

tidade de inforrnacoes usando os quatrD pares de nucleo-

tideos presentes no. DNA. 0 que 0. c6digo Morse e a lin-

guagem dos cornputadores nos dizem sabre a possibilidade

'de estocar grandes quantidades de informacoes usando um

alfabeto composto de apenas quatro letras?

11.21. A biossfnrese do metabolite X ocorre mediante seis etapas

catalisadas por seis enzimas difererrres, Qual 0numero mf-

nimo de genes nccessario para 0 controle genetico desra via

metab61ica? Mais genes podem estar envolvidos? Por que?

11.22. Qual 0dogma central da genetic amolecular? Que impacto teve

a descoberta dos virus tumorais com RNA no dogmacentl"al?

B.23. 0 que os processos de smrese de DNA, sintese de RNA e

sfntese de polipeptideos tern em comum?

11.24. Quais sao os dois escigios cia expressao genica? Onde eles ocor-rem em lima ce lu la eucari6tica? em u ma c el ula procari6tica?

11.25. Compare as estruturas dos transcritos primaries com as dos

mRNA em procariorites e eucariontes, Em media, em que

gmpos de organismos eles diferem mais?

11.26. Que cinco tipos de moleculas de R._l\fAparticipam do pro-

cesso de expressao genica? Quais sao as funcoes de cada

tipo de RNA? Que tipos de RNA desernpenham suas fun-

90es no (a) nuclco e (b) no ci toplasma?

11.27. Dois genes eucarioticos codificam dois polipepndeos di-

Ierentes, cada lim dos quais com B 5 aminoacidos de ta-

manho. Um gene contern 11Ill unico exon; 0 outre gene

contem umIntron com 41.324 pares de nucleotidcos de

tarnanho. Que gene voce esperaria que· fosse transcriro no

menor tempo? Por que? Quando os rnRNA especificados

por estes genes sao traduzidos, que mRNA voceesperaria

que Fo s s e traduzido no menor tempo? P o r que?

11.28. Por que a necessidade de um RNA iruennedi-irio nasfntese

de proteina» e mais 6bvia em eucariontes? CDInOos pesquisa-

dores primeiro demonsrrararn que a sintese de RNA OCor1"eU

no nucleo e a sintese de proteins ocorreu no citoplasrna?

11.29. Crie urn experimento para demonstrar que os RNA trans-

critos sao sintetizados no micleo de eucariontes e sao subse-quentemente transportados para 0citoplasma,

1130. RNA total foi isolado de celnlas hurnanas crescidasern cnl-

tura, Este RNA foi misrurado com filamentos nao-moldes

(unifilamenrarcs) do gene humano que codifiGl a enzima

rimidina-cinase, e 3 mismra Rt"JA-DNA foi incubada por

12 horas em condicoes de renaturacao, Voce esperaria que

alguIn rhiplice RNA- DNAfosse formado durante a incuba-

t;ao? Caso sim, por que.? Caso niio, por quenao? 0 mesmo

experimento for entao feito usando-se 0 filarnento molde do

gene de timidina-cinase, Voce esperaria que algum diiplice

RNA-DNA fosse forrnarlo neste segundo experirnento?

Caso sim, por que? Casonao, por que nao?

1l.3l. Duas preparacoes de RNA-polimerase>de E. coli foram usa-

das em experirnentos separados para catalisar a sintese de

RNA in vitro usando-se urn fragmento purifieado de DNA

que leva 0 gene a 1 " g H (Fig. 1L 1) como molde de DNA.

Uma preparacao catalisa a sfntesc de cadeias de R_NAque

sao altamente heterogeneas em tamanho, A outra prepara-

;;:aocatalisa a sintese de cadeias de RNA que sa o todas do

mesmo tamanho. Qual a diferenca rnais provavel na COITI-

posicao das RNA-polirnerases nas duas preparacoes?

11.32. Transcricao e traducao sao acopladas em procariontes. Pot

que isto nao ocorre.ern eucariontes?

11.33. Que dois elementos estao quase sempre presences nos pro-

motorcs de genes eucarioricos que s a o transcritos pela RNA-

pol imerase II?Onde estes elernentosesrao situados com rela

cao ao sitio de inicio da transcricao? Quais saosuas fi.mt;6es-

11.34. De que modos a maioria des transcritos de genes eucarioti-

cos sao modificados? Quais sao as funcoes destas modi fica-

<;6espostranscricionais?

11.35. De que modo a edi;;:aodo RNA contribui para a diversidade

de protemas ern eucariontes? Que papeis os RNAguias tern

na cdicao db RNA?

11.36. Como diferem os mecanismos de remocao dos introns de

precursores de tRNA, precursores do rRNA de Tetrahy-

mena e.pre-mRNA nucleares? Em quais processos estao

envolvidos os snRNA? Quepapeis tern os snRNA?

11.37, Que papel 0gene da doenca hurnana lupus eritematoso siste-

micodesempenham na caracterizacaodos snRNP humanos?

11.38. Umamuta9ao em um genehurnano essencial muda 0sitio decorte em 5' de urn grande intronde GT para CC. Preveja 0

fenoripo de uma pessoa homozigota para esta mutacao,

11.39. RNA total foi isolado de micleos de celulas humanas que cres-

cern em culrura. Este Rt'JA foi misturado com urn fragmento

desnaturado e purificado de DNA que leva l1IUgrande fntron

de um gene de manutencao (urn gene expresso ernguase

todas as eelu.as), e a rnistura RNAcDNA foi incubada pot

12 horas em condicoes de renaturacao, Voce esperaria que

Fosse formado algum duplice RNA-DNA durante a incuba-

" , a o ? Caso sim, pOl' que? Caso nao, por qlle ! l a o ? 0 mesmo

experimento foi entao feito usando-se 0RNA citoplasrnatico

total destas celulas. V q c e i esperaria que Fosse formado algum

duplice RNA-DNA neste segundo experirnento? Caso sirn,par que) Caso nao, por que nao?

trascrição

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