transglutaminase

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UNIVERSIDADE FEDERAL RIO GRANDE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTO Disciplina: Seminários UNIVERSIDADE FEDERAL RIO GRANDE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTO Disciplina: Processos enzimáticos Mestrando: Whallans Raphael C. Machad Proteases: transglutaminase

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Transglutaminase

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Page 1: Transglutaminase

UNIVERSIDADE FEDERAL RIO GRANDEPÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTO

Disciplina: Seminários

UNIVERSIDADE FEDERAL RIO GRANDEPÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE

ALIMENTODisciplina: Processos enzimáticos

Mestrando: Whallans Raphael C. Machado

Proteases: transglutaminase

Page 2: Transglutaminase

Introdução

• Proteases- Um dos mais importantes grupos de enzimas;

• Mercado;• • Obtenção;

• Transglutaminase (TGase) – ligações: grupos γ-carboxiamina ;

Page 3: Transglutaminase

Proteases

• As enzimas –biocatalizadores, utilizadas nas indústrias de alimentos, farmacêutica, de diagnóstico e na indústria química;

• Proteases (proteinases, peptidases ou enzimas proteolíticas);

• O processo é chamado de clivagem proteolítica, um mecanismo comum de ativação ou inativação de enzimas envolvidas principalmente na digestão e na coagulação sanguínea. Como uma molécula de água é utilizada no processo, as proteases são classificadas como hidrolases.

Page 4: Transglutaminase

• As peptidases - classificação: Endopeptidases ou proteinases e exopetidases;

• Endopeptidases : Regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N- e C-terminal. A presença de grupos α-amino ou α-carboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima;

• As exopeptidases : Finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal;

Proteases

Page 5: Transglutaminase

• Proteases são encontradas em vários microrganismos, como vírus, bactérias, protozoários, leveduras e fungos;

• Fontes: microbianas;

• Os microrganismos representam uma excelente fonte de proteases devido a sua grande diversidade bioquímica e facilidade de manipulação genética.

Proteases

Page 6: Transglutaminase

• A União Internacional de Bioquímica (IUB):

• Proteases de serina protease I (ex.: tripsina e elastase);

• Proteases serina protease II (ex.: subtilisina);• Proteases de cisteína (ex.: papaína);• Proteases aspartato (ex.: pepsina);• Metalo proteases I (ex.: carboxipeptidase

bovina);• Metalo protease II (ex.: termolisina).

Proteases

Page 7: Transglutaminase

• pH – classificação:• Proteases ácidas; • Proteases neutras; • Proteases básicas (ou proteases alcalinas);

• Mercado mundial – 60% protease, 40% microbiana;

• Proteases – Utilização: Detergente, preparação de couros, recuperação de proteína ou solubilização, amaciamento de carne, e também na recuperação e aproveitamento de resíduos e subprodutos.

Proteases

Page 8: Transglutaminase

• Plantas, animais e microrganismo;

• Cultivo submerso;

• Processo em estado sólido: mas em menor grau;

• As proteases obtidas da extração de plantas

• Papaína: Bromelina:

Fontes de obtenção de proteases

Page 9: Transglutaminase

• Fonte: micro-organismos: crescimento; espaço; estabilidadede; e produção;

• Comercialmente: • Aspergillus niger; • Aspergillus oryzae; • Streptomyces mobaraensis;

• Aplicações - Fabricação de cerveja, a maturação de queijo, o amaciamento de

• carnes, a panificação, e na fabricação de adoçantes artificiais;

Fontes de obtenção de proteases

Page 10: Transglutaminase

• A transglutaminase (TG: EC 2.3.2.13) - 331 aminoácidos;

• Proteína-glutamina γ-glutamil-transferase - Reação de acil-transferência, na qual os grupos γ-carboxiamida dos resíduos de glutamina de uma cadeia polipeptídica atuam como acil-doadores;

• Encontras;

Característica da enzima transglutaminase

Page 11: Transglutaminase

• Transglutaminase microbiana – ausência de Ca;

• É uma enzima natural;

• Catalisadora: reações de polimerização e ligações entre moléculas de proteína;

• Streptoverticillium mobaraence;

Característica da enzima transglutaminase

Page 12: Transglutaminase

• Caraterísticas:

• Ponto isoelétrico de 8,9;

a) b)

Figura 1: a) Atividade relativa da TGase em relação ao pH. b) atividade relativa à TGase em relação à temperatura Fonte: PICCOLO (2006).

Característica da enzima transglutaminase

Page 13: Transglutaminase

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.

MicrorganismopH ótimo de

atividadeTemp. ótima

de ativ. (°C)pH de

estabilidadeEstabilidade

térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.Microrganismo

pH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp. 6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.

MicrorganismopH ótimo de atividade

Temp. ótima de ativ. (°C)

pH de estabilidade

Estabilidade térmica

Streptoverticillium sp.

6-7 50 5-9 40-50

Streptoverticillium mobaraense

6 52 5-7 20-40

Streptoverticillium ladakanum

5-6 40 5-7 50-55

Streptocopicus hygroscopicus

6-7 37-45 5-8 50

Bacillus subtilis 8,2 60 - -

Tabela 1: Características enzimáticas de algumas TGases microbianas

Fonte: SOUZA (2008), adaptada.

Característica da enzima transglutaminase

Page 14: Transglutaminase

• Transferência de grupos acila entre os γ-grupo carboxiamida dos peptídeos ligados aos resíduos de glutamina (doador de acila) e os grupos de aminos primários de compostos (receptor de acila), o resultado é a geração de uma ligação covalente entre dois substratos, liberação de amônia, formação de ε-(γ-glutamina) lisina e formados ligações intra e intermolecularmente;

Mecanismo de catalise da transglutaminase

Page 15: Transglutaminase

Mecanismo de catalise da transglutaminase

Page 16: Transglutaminase

• Desaminação transglutaminase

• R-Gln-(CH2)2-CO-NH2 + H2O R-Gln-(CH2)2-CO-OH +NH3

• Resíduo glutamina

• Figura 3: Mecanismos desaminação. Fonte: GAUCHE (2008).

Mecanismo de catalise da transglutaminase

Page 17: Transglutaminase

Mecanismo de catalise da transglutaminase

Page 18: Transglutaminase

• Dois métodos que se obter a Tgase:• Extração;

• Fermentação;

Aplicação industrialde

Page 19: Transglutaminase

• Uso das enzimas microbianas;• 1940;• A atual produção industrial de enzimas;

• Condições de processo - TGase: fermentação, temp., tempo de fermentação;

• Extração: líq.-líq.;

Transglutaminase microbiana

Page 20: Transglutaminase

Transglutaminase microbiana

Figura 1: A) Estrutura 3D da TGase microbiana de Streptomyces mobaraensis. B) centro ativo da enzima. Fonte: ARRIZUBIETA (2007).

Page 21: Transglutaminase

Transglutaminase microbiana

Figura 1: A) Estrutura 3D da TGase humana. B) centro ativo da enzima. Fonte: ARRIZUBIETA (2007).

Page 22: Transglutaminase

Transglutaminase microbiana

Figura 3: Comparação dos centros ativos de TGase humano (cinza escuro) e MTG (cinza claro). Fonte: ARRIZUBIETA (2007).

Page 23: Transglutaminase

• Processamento – Reestruturação, textura formação de gel e produtos;

• Aplicação - salsichas cozidas e escaldadas, presuntos e fiambres, salames, iogurte e leite, bolinhos de peixe, macarrão, produtos de panificadora e muitos outros;

• TGase influência: • Capacidade de gelatinização; Viscosidade;

Estabilidade térmica; Capacidade de retenção de água e Valor nutricional.

Aplicações e propriedades da Tgase nos alimentos

Page 24: Transglutaminase

• Imobilizar enzimas - rede de ligação : resíduos de lisina ou glutamina;

• Modificação genética da enzima;

• Formação de biosensores;

• Josten et al. (1999) - Propriedade do cross-linkers - Streptoverticillium mobaraense para imobilizar lactato oxidase;

• Caseína, gelatina ou fibrinogênio.

Imobilização

Page 25: Transglutaminase

• Eletroudos com TGase a vida foi de 133 ± 26h e para o padrão foi de 53h ± 9h, ambos ate apresentar uma sensibilidade de 50%;

• Tominaga (2004): • Técnica de recombinação proteica;• Uma proteína foi marcada com peptídeo curto

(MKHKGS); • Suporte de resina poliacrílico;• Caseína.

Imobilização

Page 26: Transglutaminase

• AJINOMTO. Transglutaminase. Disponível em: <www.ajinomoto.com.br>. Acesso em: 02 de dezembro de 2011.

•  • ARRIZUBIETA, M. J. Transglutaminases. J. Polaina and A.P. MacCabe (eds.), p. 567–581, 2007. •  • GAUCHE, C.; TOMAZI, BORDIGNON-LUIZ, M. T. Polimerização das proteínas do leite por

transglutaminase: modificação das propriedades funcionais e aplicação em produtos lácteos. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, v. 26, n. 1, p. 111-122, 2008.

•  • GIONGO, J. L. Caracterização e aplicação de proteases produzidas por linhagens de Bacillus sp.

Porto Alegre – RS, 95p. Dissertação (Pós-graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente). Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRG), Faculdade de Agronomia.

•  • JOHNVESLY, B.; NAIK, G. R. Studies on production of thermostable alkaline protease from thermophilic

and alkaliphilic Bacillus sp. JB-99 in a chemically defined medium Process Biochemistry, v. 37, Issue 2, p. 139-144., 2001.

•  • JOSTEN, A.; MEUSEL, M., SPENER, F.; HAALCK, L. Enzyme immobilization via microbial

transglutaminase: a method for the generation of stable sensing surfaces. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 7, Issues 1-4, p. 57-66, 1999.

•  • MACARI, S. M. Desenvolvimento de formulação de embutidos cozidos à base de tilápia do Nilo

(Oreochromis niloticus). Curitiba–SC, 122p. Dissertação (Pos-Graduação em Tecnologia de Alimento). Universidade Federal do Paraná.

•  

Referências

Page 27: Transglutaminase

• MACEDO, J. A.; SATO, H. H. Propriedades e aplicações da transglutaminase microbiana em alimentos. Alim. Nutr., v.16, n.4, p.413-419, 2005.

• NASCIMENTO, W. C. A.; MARTINS, M. L. L. Produção de proteases por Bacillus sp SMIA-2 crescido em soro de leite e água de maceração de milho e compatibilidade das enzimas com detergentes comerciais. Ciênc. Tecnol. Aliment., 2006, v. .26, n.3, p. 582-588.

•  • PICCOLO, K. C. Avaliação do efeito da enzima transglutaminase no processo de produção de

requeijão cremoso. São Caetano do Sul–SP, 102p., 2006. Dissertação (Pós-Graduação em Engenharia de processos químicos e bioquímicos). Escola de Engenharia Mauá do Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia.

•  • SOARES, L. H. B.; ALBUQUERQUE, P. M.; ASSMANN, F.;  AYUB, M. A. Z. Physicochemical properties of

three food proteins treated with transglutaminase. Cienc. Rural, v.34, n.4, p. 1219-1223, 2004. •  • SOUZA, C. F. V. Caraterização da transglutaminase (EC 2.3.2.13) do isolado amazônico Bacillus

circulans. Porto Alegre – RS, 263. Tese (Pos-Graduação em Biologia Celular e Molecular). Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRG), Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul.

•  • TOMINAGA, J.; KAMIYA, N.; DOI, S.; ICHINOSE, H.; GOTO, M. An enzymatic strategy for site-specific

immobilization of functional proteins using microbial transglutaminase. Enzyme and Microbial Technology, v. 35, Issues 6-7, p. 613-618, 2004.

Referências

Page 28: Transglutaminase

Obrigado pela atenção