transformação genética e suas aplicações em pesquisa...
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GaTE LabGenomics and Transposable Elements
Transformação genética e suas aplicações em pesquisa e
biotecnologia
Profa. Dra. Magdalena Rossi
Que é um organismo geneticamente modificado
(OGM)?
•São aqueles que recebem um ou mais genes de outro organismo e passam assim a expressar uma
nova característica de interesse.
•OGMs = melhoramento genético clássico.-cruzamentos naturais ou forçados com seleção humana
(milho/teosinte?)-introgressão de genes de espécies selvagens em S.
lycopersicum.
•OGMs= tão antigos quanto a agricultura (mas não são produzidos por
transformação).
DNAGenes de interesse:existem na natureza, não são
“inventados nem “sintetizados”.” Célula:animal, vegetal, bactéria, etc
Que é um transgênico?
Melhoramento genético:
Característica de interessePlanta de interesseEstabilidade da informação transferida
Gene de interessePlanta de interesseEstabilidade da informação transferida
Ambos dependem da seleção das cultivarespara uso comercial em etapas subsequentes.
“CLÁSSICO” “TRANSFORMAÇÃO DIRETA”
As transgênicas e o melhoramento genético
• Técnicas de transformação genética de plantas:
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtostransgênicos)
• Técnicas de transformação genética de plantas:– Agrobacterium (método biológico)– Bombardeamento (método físico)– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtostransgênicos)
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledôneas, mono) e Gimnospermas)
Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium)
A. tumefaciens(galha-da-coroa)
A. rhizogenes
A. tumefaciens
Histórico
• 1907; descreve-se a doença
• 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium
• 1970; constata-se a correlação entre a doençae um plasmídeo
• 1979; transferência de um fragmento de DNA da bactéria para a célula vegetal
A. tumefaciens
• pTi• tumor: tecido
mosaico!• Porque forma o
tumor?
A. tumefaciens
A. rhizogenes
• pRi• raizes são clones
celulares• porque surgem
raizes?
Uma interação peculiar ...
Agrobacterium
- Transfere um fragmento de DNA, o T-DNA, do
plasmídio Ti no genoma vegetal.
- Inserção em posição aleatória dentro do
genoma.
- Induz a proliferação celular originando
tumores ou raízes a partir da célula transformada.
- As células vegetais transformadas sintetizam
substâncias chamadas opinas que são a fonte de
C e N das bactérias.
Organização de pTi ou pRi
síntese de opinas e oncogenes (síntese de citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas)
(conjugação entre
agrobactériasdo solo)
(origem de replicação e região de
incompatibilidade)
(catabolismo de opinas)
(transferência do T-DNA: genes de
virulência)200Kb
Borda esquerda
Borda direita
Região transferida
PLANT CELL
AGROBACTERIUM
PhenolicsProduced by Wounded Plant cell
VirA VirG
Phenolicsdetected by the VirA/VirG two component sensor system.
VIP1 associates with the complex to target it to the nucleusVIP2 associates the complex to transcriptionallyactive DNAT-DNA integrates into plant DNA
and gall production is initiated.
Gall Formation!
Vir Gene expression induced
Bacterial Plasmid Formation of T-Pilus (VirB and VirD4
T-DNA
Vir D1 & D2 cut T-DNA at right and left borders and starts T-DNA synthesis (VirC)
VirD2 attaches to exposed 5I end
Formation of T-complex
VirE2
Transferência do T-DNA
Transformação via Agrobacterium
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção na bactéria.
-Introdução da construção na célula vegetal pela bactéria.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organização de pTi ou pRi
GENE DE INTERESSE + MARCADOR DE SELEÇÃO
(conjugação entre
agrobactériasdo solo)
(origem de replicação e região de
incompatibilidade)
(catabolismo de opinas)
(transferência do T-DNA: genes de
virulência)200Kb
Borda esquerda
Borda direita
Região transferida
Transformação de explantes
T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantesSEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Células 3-4 dias em cultura liquido
4 ml
Bactérias de 1-2 dias em cultura
50 – 100 ul
3 dias de co-cultivo
ReplaqueamentoReplaqueamento ememmeiomeio seletivoseletivo
Meio + antibióticospara seleção
Após 7 dias
1 2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
Transformação de células
ReplaqueamentoReplaqueamentoemem meiomeio seletivoseletivo
Meio MS30 sólido Carb + Vanc + Higro
1 2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle -
Transformação de células e seleção
Células crescendo emmeio seletivo
Células que não cresceramem meio seletivo
U3B::GUS
O processo de regeneração:
Seleção de linhagens portadoras do gene de interesse.
Transformação via bombardeamento (canhão gênico)
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um mecanismo físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de
tecidos).
Gene de interesseProm
VETOR
Bombardeador
Partículas de tungstêniocarregando DNA
Transformação genética de plantas: bombardeamento
Gene de interesse+
Gene de resistência para seleção de transformantes
Bombardment
Diferênça com vetor de Agro!
Transformação via eletroporação
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um método físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
D
E
F
Transformação genética de plantas: eletroporação
Gene de interesse+
Gene de resistência para seleção de transformantes
Gene de interesseProm
VETOR
E
• Técnicas de transformação genética de plantas:– Agrobacterium (método biológico)– Bombardeamento (método físico)– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada– Conhecer o padrão temporal de expressão de um gene (?)– Conhecer o padrão espacial de expressão de um gene (?)– Conhecer a resposta de um gene a diferentes estímulos– Estudar os genes envolvidos nos diferentes processos
fisiológicos (ex. resistência a patógenos, floração, etc)
• Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)