transformação genética de eucalyptus camaldulensis por

XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS

IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008

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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE Eucalyptus camaldulensis POR AGROBIOBALÍSTICA E EFICIÊNCIA DO GENE GUS

EVÂNIA GALVÃO MENDONÇA 1, LUCIANO VILELA PAIVA 2, CAROLINA DELFIM FERNANDES LIMA3, HUMBERTO HENRIQUE CARVALHO4, GUILHERME ARAÚJO

LACERDA5, BRENO RÉGIS SANTOS6

RESUMO O presente trabalho teve como objetivo otimizar a metodologia de transformação de plantas de Eucalyptus camaldulensis, uma importante espécie florestal amplamente cultivada no Brasil. Foi estudada a transformação por agrobiobalística de explantes foliares, a técnica causa microferimentos nos explantes aumentando a penetração da Agrobacterium nos tecidos vegetais. Na agrobiobalística o explante é submetido ao bombardeamento com micropartículas seguida por inoculação com a bactéria. O experimento de transformação foi avaliado pela análise da expressão transitória do gene repórter gus. O parâmetro estudado na transformação por agrobiobalística foi tempo de infecção, sendo que, a freqüência mais elevada da expressão da β-glucuronidase foi observada utilizando tempo de infecção de 8 minutos, onde, a pressão utilizada foi de 1350 PSI de gás hélio, 9,5 cm de distância de vôo dos microprojéteis. Apesar do maior tempo de infecção apresentar maior número de pintas azuis, pela análise estatística foi possível observar que não houve diferença significativa entre os tempos de infecção analisados (4, 6 e 8 minutos). Os resultados demonstraram que o uso da técnica de agrobiobalística é viável e que um menor tempo de infecção é capaz de promover a transformação de eucalipto com Agrobacterium. Palavras-chave: eucalipto, β-glucuronidase, bombardeamento, cultura bacteriana. INTRODUÇÃO

O gênero Eucalyptus L’Hér. (Myrtaceae) é nativo da Austrália, muitas espécies e híbridos são cultivados em larga escala em várias regiões de clima tropical e subtropical em todo o mundo, incluindo Argentina, Austrália, Brasil, Marrocos, Portugal, África do Sul, Espanha, Estados Unidos e Uruguai (Eldridge et al., 1994).

Atualmente, o Brasil possui a maior área plantada de eucalipto do mundo (mais de 3 milhões de hectares). A produção brasileira concentra-se em Minas Gerais e São Paulo, os quais lideram a produção nacional e, em seguida, com menor produção, nos Estados do Paraná e Santa Catarina, devido às restrições climáticas para o gênero (Sociedade Brasileira de Silvicultura, 2007).

1 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail: [email protected] 2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: [email protected] 3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected] 4 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail: [email protected] 5 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected] 6 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail: [email protected] 6 Universidade Federal de Alfenas, Departamento de Ciências Biológicas, Setor de Biotecnologia Vegetal, E-mail: [email protected]



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A alta produtividade em plantios florestais se deve ao melhoramento genético e as práticas silviculturais que contribuíram significativamente para o ganho genético em espécies de grande valor econômico. A aplicação de métodos de melhoramento genético, por sua vez, apresenta limitações devido ao longo ciclo reprodutivo das espécies arbóreas e à dificuldade em conseguir melhorias significativas em caracteres complexos tais como: propriedades da madeira, controle de pragas e doenças, e tolerância a estresses abióticos (Nehra et al., 2005). Desta forma, a biotecnologia através da transformação genética, possibilita a introdução de genes de interesse em uma única geração podendo alterar características como conteúdo de lignina, resistência a insetos, resistência à herbicida e alteração de rotas metabólicas. A aplicação desta nova tecnologia no melhoramento do Eucalyptus pode levar a um aumento de produtividade, atendendo a uma demanda crescente de produtos florestais de qualidade com baixo custo de produção (Andrade, 2001). O E. camaldulensis foi a primeira espécie utilizada para estudos de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens e atualmente, é a espécie mais pesquisada devido à relevância econômica e facilidade de regeneração (Kawazu et al., 1990; Mullins et al., 1997; Ho et al., 1998; Chen et al., 2003). O processo de transformação genética de plantas tem sido aprimorado desde a década de 80, quando Stachel & Zambryski (1986) relataram o uso de Agrobacterium tumefaciens, modificada geneticamente, para introdução de genes exógenos em plantas. Entretanto, apesar dos progressos alcançados nos últimos anos, muitos ainda são os desafios encontrados na transformação de algumas espécies lenhosas, atribuídos principalmente à baixa eficiência na inserção estável de um gene no genoma da planta e na habilidade para regenerar uma planta a partir da(s) célula(s) transformada(s) (De Bondt et al., 1994). O método de transformação por biobalística, também conhecida como método de bombardeamento com micropartículas ou aceleração de partículas é um processo que emprega microprojéteis com alta velocidade para inserir ácidos nucléicos e outras substâncias em diferentes órgãos, tecidos que em geral não dependem do genótipo usado. Uma variação desta tecnologia é a utilização dessa técnica em associação com a transformação via Agrobacterium. Nesse caso o bombardeamento é utilizado para provocar a indução de macro e microferimentos no tecido vegetal, que libera compostos fenólicos e por sua vez, mobiliza a transferência do T-DNA para a célula hospedeira. A técnica tem a vantagem de aumentar a freqüência de transformantes, uma vez que os microferimentos não prejudicam a célula vegetal e são suficientes para a indução da transferência do T-DNA. Atualmente este novo método de transformação é conhecido como Agrobiobalística (Bidney et al., 1992; Brasileiro et al., 1996). Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de transformação genética por agrobiobalística através de explantes foliares de E. camaldulensis via co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens em diferentes tempos de infecção e avaliar a expressão do gene repórter gus. MATERIAL E MÉTODOS Material O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório Central de Biologia Molecular (LCBM), vinculado a Pró-Reitoria de Pesquisa, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais. Foram utilizados explantes (foliares) oriundos de plantas de Eucalyptus camaldulensis germinadas in vitro, cultivadas em sala de crescimento pertencente ao LCBM. As plantas foram mantidas em sala de crescimento, sob fluorescente branca fria com



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densidade de fluxo fotossintético de 40 µmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 27 ± 2°C. As culturas foram realizadas em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e 2 cm de altura, contendo 50 mL de meio de cultura e vedadas com filme PVC, ou em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9 cm de altura, contendo 50 mL de meio de cultura cada um e vedados com tampa de polipropileno rígido. Todos os meios de cultura tiveram o pH ajustado em 5,8 e foram autoclavados durante 20 min a 120°C. Métodos Cultura bacteriana No experimento de transformação utilizou-se a linhagem de Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 contendo o plasmídio com a construção 35S::GUS::NOS. A agrobactéria foi inoculada em meio YEP líquido com o antibiótico kanamicina (50mg/L) a 28ºC overnight sob agitação constante (200 RPM). Após este período, 100µL da cultura acima foi colocada em tubo Falcom contendo 3mL de meio YEP (sem antibiótico) a 28ºC overnight, sob agitação constante (200 RPM). Posteriormente a Densidade Óptica (D.O.) foi medida. Transformação por biobalística O acelerador de partículas utilizado para realizar o bombardeamento foi o PDS1000/HeTM (BioRad) descrito por Sanford et al. (1991). Emprega gás hélio à alta pressão para gerar a onda de choque que acelera as micropartículas. Os parâmetros pressão de hélio e a distância de vôo das micropartículas utilizadas foram os mesmos estabelecidos por Andrade em 2001. As micropartículas utilizadas nos experimentos de bombardeamento foram as de tungstênio M10 (GTE Sylvania Chemicals/Metals), sendo que, o preparo das mesmas baseou-se no sistema desenvolvido no laboratório Biobalística do CENARGEN-EMBRAPA (Aragão et al., 1996). Infecção dos explantes e expressão de atividade da β-glucuronidase Os explantes foliares para inoculação e co-cultura foram cortados em discos de aproximadamente 0,5cm2, bombardeados com partícula nula e colocados em contato com a cultura bacteriana (4, 6 e 8 minutos) sobre agitação. Após o contato com a bactéria os explantes foram lavados em água destilada estéril e levemente secos em papel toalha estéril. Os explantes foram co-cultivados com a bactéria por 2 dias sendo colocados em meio MS(Murashige & Skoogs, 1962) suplementado com 1 mg.L-1 de BAP, 0,5 mg.L-1 de ANA, 3% de sacarose, 0,6 % de agar e 2,5g.L-1 de carvão ativado. A eficiência da transformação foi avaliada após os 2 dias de co-cultivo dos explantes com a agrobactéria através do ensaio histoquímico de expressão da β-glucoronidase (gus). Para a análise foram retirados 2 explantes aleatoriamente de cada placa de Petri, totalizando 10 explantes por tratamento, sendo estes incubados em tampão de reação contendo: 10mM Na2EDTA.H2O, 0,1% Triton X-100, 0,1M NaH2PO4, 0,5M K3Fe(CN)6, e 250 µg.mL-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-glucuronic acid (X-GLUC, Inalco-USA). A reação foi incubada por 16 horas a 37°C. Depois de decorrido o tempo de reação, as amostras foram transferidas para etanol 70%, para retirar a clorofila de tecidos verdes e permitir uma melhor visualização da coloração azul. A avaliação da expressão gus foi feita com o auxilio do estereoscópio OLYMPUS SZH10 com máquina fotográfica CANON POWER SHOT A620 acoplada. Foram contados os números de pontos azuis referentes aos ferimentos realizados pelo bombardeamento com partícula de tungstênio. As imagens foram registradas digitalmente e gravadas sendo contado o número de pontos azuis por explante.



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Análise dos dados Os dados foram expressos na forma de média e desvio padrão. A análise do experimento foi realizada pelo teste Scott-Knott (Ferreira, 2000) o delineamento experimental foi totalmente casualizado com 5 repetições totalizando 50 explantes por tratamento. RESULTADOS E DISCUSSÃO A influência de diferentes tempos de inoculação na transformação genética de E. camaldulensis via A. tumefaciens foi avaliada por meio de expressão transiente da enzima β-glucuronidase em explantes foliares, onde se considerou resultado positivo pintas com coloração azul (Figura 1).

Figura 1 – Expressão transiente do gene gus em folhas de E. camaldulensis, após co-cultura em OD600nm= 0,95 . (A) Folha não inoculada; (B) Folha exibindo expressão do gene gus – inoculação 4 minutos; (C) Folha exibindo expressão do gene gus – inoculação 6 minutos; (D) Folha exibindo expressão do gene gus – inoculação 8 minutos. Barras = 1mm. Quando considerado a eficiência da técnica de agrobiobalística, onde a pressão de disparo utilizada foi de 1350 PSI, os resultados demonstraram uma maior expressão transiente do gene gus quando os explantes foram submetidos à infecção por 8 minutos. Entretanto não houve diferença significativa entre os tempos de inoculação 4, 6 e 8 minutos (Figura 2). Sendo este resultado de acordo com o observado por Andrade 2001, que encontrou maior expressão transiente em pressões de disparo maiores que 1000 PSI. Porém, devido à ausência de trabalhos publicados considerando a técnica de biobalística associada à influência do tempo de infecção da A. tumefaciens em explantes foliares E. camaldulensis, não foi possível comparar as porcentagens aqui observadas com os resultados de outros autores.



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Figura 2 – Avaliação de tempo de infecção. Explantes foliares submetidos a diferentes tempos de infecção, bombardeados com uma pressão de disparo de 1350 PSI a uma distância de 9,5 cm do alvo. Avaliações realizadas 2 dias após a inoculação. Médias com a mesma letra não diferem significativamente ao nível de 5% pelo Teste de Scott-Knott. Visto que, a Agrobacterium tumefaciens é uma espécie altamente virulenta e que as espécies vegetais diferem grandemente em sua susceptibilidade à infecção, quanto maior o tempo de contato da bactéria com o explante, maiores são os danos causados no tecido dificultando a regeneração da planta transformada. Sugere-se o tempo de infecção de 4 minutos como o tratamento capaz de promover uma transformação eficiente com menores danos ao explante. CONCLUSÃO Observou-se expressão transiente do gene gus nos tempos de infecção 4, 6 e 8 minutos de infecção. Não houve diferenças significativas entre os tempos analisados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, A. Avaliação de parâmetros que influenciam a transformação genética do Eucalyptus grandis via Agrobacterium. 2001. 81p. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2001. ARAGÃO, F.J.L.; BARROS, L.M.G.; BRASILEIRO, A.C.M.; RIBEIRO, S.G.; SMITH, F.D.; SANFORD, J.C.; FARIA, J.C.; RECH, E.L. Inheritance of foreing genes in transgenic bean (Phaseolus vulgaris L) co-transformed via particle bombardment. Theoretical and Applied Genetics, v.93, n.1-2, p.142-150, 1996. BIDNEY, D.; SCELONGE, C.; MARTICH, J.; BURRUS, M.; SIMS, L.; HUFFMAN, G. Microprojectile bombardment of plant-tissues increases transformation frequency by Agrobacterium-tumefaciens. Plant Molecular Biology, v.18, n.2, p.301-313, 1992. BRASILEIRO, A.C.M.; ARAGÃO, F.J.L.; ROSSI, S.; DUSI, D.M.A.; BARROS, L.M.G.; RECH, E.L. Susceptibility of common and tepary beans to Agrobacterium-mediated transformation using microprojectile bombardment. Journal of American Society for Horticultural Science, v.121, n.5, p.801-815, 1996. CHEN, Z. Z.; CHANG, S. H.; HO, C. K.; CHEN, Y. C.; TSAI, J. B.; CHIANG, V. L. Plant production of transgenic Eucalyptus camaldulensis carrying the Populus tremuloides cinnamate 4-hydroxylase gene. Journal Forestry Science, v. 16, p.249-258, 2003.



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