FAHESA Faculdade de Cincias Humanas, Econmicas e da Sade de Araguana ITPAC Instituto Tocantinense Presidente Antnio Carlos Odontologia

Relatrios de Aulas Prticas de Microbiologia

Las Cardoso Mainara Defavari Luciana Nogueira Layza Tosta Jucimria Lima Geraldo Pereira

Araguana/TO Junho/2012

Las Cardoso Mainara Defavari Luciana Nogueira Layza Tosta Jucimria Lima Geraldo Pereira

Relatrios de Aulas Prticas de Microbiologia

Araguana/TO Junho/2012

SUMRIO

1. INTRODUO____________________________________________________4 2. NORMAS DE BIOSSEGURANA PARA AULAS PRTICAS EM MICROBIOLOGIA ___________________________________________________5 3. ABUNDNCIA E DIVERSIDADE MICROBIANA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS_______________________________________________________10 4. ISOLAMENTO DE BACTRIAS DA MICROBIOTA HUMANA ______________13 5. COLORAO DE GRAM___________________________________________19 6. TCNICA DE DILUIO SERIADA E CONTAGEM DE COLNIAS _________24 7. ANTIBIOGRAMA _________________________________________________26 8. CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE FUNGOS____________________29 9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS___________________________________34

Introduo

Este material apresenta a relao de trabalhos e pesquisas em prtica laboratorial de Microbiologia. Correlacionando com a literatura aquilo que foi praticado em aula. Desde biossegurana e mtodos laboratoriais, a tipos de colorao para observao microscpica, caractersticas morfolgicas de fungos e bactrias, culturas de microrganismos do ser humano, etc. A pesquisa foi baseada na observao de resultados dos procedimentos executados pelos alunos, logo, esses resultados podem ser falhos ou incoerentes, devido no padronizao de mtodos prticos ou erros na execuo de

procedimentos. No entanto, apresentao e prtica de tais mtodos acrescenta conhecimento ao aluno.

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1. Normas de Biossegurana para aulas prticas em Microbiologia

O laboratrio de Microbiologia um ambiente de estudo e pesquisa onde h o manuseio de diferentes tipos de microrganismos, sendo estes patognicos ou no,o que pode oferecer um grau de risco varivel para queles que esto trabalhando nesse ambiente,seja diretamente na pesquisa, ou auxiliando na organizao e higienizao.H relatos de casos de diferentes graus de contaminao a partir do manuseio de microrganismos patognicos em laboratrio microbiolgico, seja por descuido em lavagem das mos ou hbitos de levar objetos boca, ou mesmo pela falta de EPI (Equipamentos de Proteo Individual) adequado e ocorrncia ento de aspirao do patgeno, ou contato com a mucosa da conjuntiva se este tiver disperso no ambiente.Deve-se ter cuidado com a assepsia, quando se trabalha com microrganismos para evitar a prpria contaminao com algum patgeno, a contaminao do meio de cultura com microbiota normal,alterando seu resultado na pesquisa,e o transporte de fmites (carregam microrganismos patgenos) de dentro do laboratrio para outros ambientes.

A degermao das mos ou manilvio (L:mani + luviu) um procedimento simples,efetivo e barato que deve ser feito criteriosamente pelo profissional e seus colaboradores. [...] A degermao das mos pode incluir a lavagem e, j que impossvel eliminar todos os microrganismos das mos, a anti-sepsia imediata para suprimir a microbiota residual enquanto se usa as luvas. [...] A pele normal colonizada por bactrias,tanto na superfcie como nos poros profundos e nos ductos sudorparos e glndulas sebceas. ( JAIRO GUIMARAES JR.,2001 )

Os EPIs so de extrema importncia em ambiente de pesquisa e manipulao de patgenos, no s como proteo para quem est ali presente,mas tambm para no influenciar nos resultados que se deseja obter.O uso de gorro,luvas,mscara,culos, considerado praxe.Assim como a presena de EPC (Equipamento de Proteo Coletiva) no ambiente laboratorial, como pias,chuveiro, lava-olhos e extintor de incndio especfico para materiais oxidantes, ou corrosivos.5

Caractersticas dos germicidas (anti-spticos) tpicos usados no manilvio Produtos Modo de ao Iodforos Oxidao Triclosan Ruptura parede celular Bactrias Gram + Bactrias Gram M. tuberculosis Fungos Vrus Rapidez de ao Atividade residual Excelente Boa Boa Boa Boa Mdia Mdia Boa Mdia Mdia M Desconhecida Mdia Excelente Clorexidina da Desnaturao de Protenas Excelente Boa M Razovel Boa Mdia Excelente

Afetado

por Mnima

Mnima

Mnima

matria orgnica Segurana toxicidade e Absoro pela Falta de dados Ototoxicidade ceratite e

pele: toxicidade

GUIMARAES JR.,Jayro.Biossegurana e controle de Infeco cruzada em Consultrios Odontolgicos.So Paulo:Livraria Santos, 2001. 216p.

Chuveiro e Lava Olhos, para lavagem com gua corrente da regio contaminada.6

No ambiente de um laboratrio acadmico, onde h o primeiro contato do estudante com o laboratrio da disciplina, importante haver a apresentao dos materiais que sero manuseados com freqncia nos meses seguintes,e ateno para os protocolos que devem ser seguidos para obteno de melhores resultados,para no haver ocorrncia de infeces,ou transporte de fmites do ambiente laboratorial para outros lugares.Medidas estas como a lavagem de mos antes e aps cada aula, o uso de EPIs descartveis, o manuseio de tubos e placas sempre perto da chama do Bico de Baunsen, e evitar o uso de materiais pessoais durante s prticas laboratoriais, restringindo-se apenas caneta ou lpis,que devem ser desinfetados com lcool aps o trmino da aula.

Lavagem das mos, e desinfeco com lcool

O Laboratrio de Microbiologia ainda conta com todo o aparato de armazenamento e esterilizao de meios de cultura, vidrarias, e outros materiais usados na prtica e pesquisa.Como a Autoclave, que faz esterilizao por meio de calor mido,causando desnaturao das protenas que formam a parede do microrganismo,e gerando perda de lquido intra-celular deste;a Estufa,que faz esterilizao por meio do calor seco,oxidando os microrganismos,e o forno de Pasteur segue esse mesmo princpio,ambos sendo indicados apenas para materiais7

secos.Logo,os meios de cultura,por serem lquidos,no so indicados esse tipo de esterilizao.Sendo indicados para a esterilizao na autoclave a 121C,durante 15 a 20 min.Eles no podem ser esterilizados dentro das placas de Petri,pois haveria ressecamento do meio ou desnaturao dos nutrientes,e o tornaria invivel.

esquerda, desinfeco da ala de inoculao na chama do bico de Baunsen, e esquerda, medidas de segurana com a presena do extintor de incndio.

Esses meios de cultura servem para promover crescimento controlado, bacteriano ou fngico, em ambiente laboratorial. Dependendo daquilo que objetiva ser cultivado,varia-se o meio de cultura.Podendo ser sinttico,ou natural.Consistindo numa associao qualitativa e quantitativa de nutrientes especficos para promover esse crescimento. O Agar serve de nutriente s bactrias ali cultivadas.H diversos tipos especficos,a variao depende do que se deseja obter.Os diferentes tipos de Agar servem como forma de favorecimento ao microrganismo que deseja-se cultivar,e inibio para os outros que estiverem dispersos no mesmo meio de cultura. O Agar est incluso nas categorias de Meios de Cultura para transporte de conservao e Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento. Alguns tipo de Agar so:8

gar nutriente:usado frequentemente para conversao e manuteno de culturas a temperatura ambiente; usado para observao de esporos de bacilos Gram positivos; feito a base de protenas. gar chocolate: produzido a base de sangue de cavalo, podendo ser substitudo por sangue de coelho ou carneiro, que submetido altas temperaturas para causar lise nas hemcias,afim de estas liberarem hemina e hematina,compostos fundamentais para que microrganismos exigentes cresam. gar Thayer-Martin Chocolate :contm antibiticos em sua forma,para inibir o crescimento de bactrias especficas,quando as amostras forem coletadas de stios contaminados. gar Salmonela-Shigella (SS) : possui componentes que inibem o crescimento de microrganismos gram positivos,como sais de bile e citrato de sdio gar Mac Conkey: inibe o crescimento de bacilos Gram positivos,em especial estafilococos e enterococos.

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2. Abundncia e diversidade de microbiota em amostras ambientais

A superfcie inerte oferece stio de colonizao para diferentes tipos de microrganismos, seja fungos ou bactrias, em locais como paredes de banheiro, maanetas de portas, esponjas de loua, celulares, etc. Ambientes que oferecem condies para a reproduo desses microrganismos. Microrganismos estes, em sua maioria, nocivos ao seres humanos. O ambiente hospitalar, por outro lado, oferece uma maior facilidade na transmisso de microrganismos patgenos, devido o fato de reunir pessoas doente e imunossuprimidas no mesmo ambiente, e ter diversas superfcie que podem servir como meio de contaminao, como materiais prfuro-cortantes e fontes de ventilao de ar. Quase todos os micrbios podem causar infeco hospitalar, embora infeces por protozorios sejam raras. O perfil das infeces hospitalares modificou-se com o passar do tempo, refletindo os avanos na medicina e o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Na era pr-antibitica, a maioria das infeces era causada por germes Gram-positivos, particularmente Streptococcus pyogenes e Sthaplylococcus aureus. Com o advento da penicilina e outros antibiticos de atividade inibitria para os estafilococos, organismos gram-negativos como Escherichia coli e Pseudomona aeruginosa emergindo como patgenos importantes. Mais recentemente, o desenvolvimento de antimicrobianos de amplo espectro, mais potentes, e o aumento das tcnicas mdicas invasivas foi acompanhado de um aumento na incidncia: germes Gram-positivos resistentes a antibiticos [...], germes Gram-negativos multirresistentes, [...], Candida. (CEDRIC MIMS,2005) A infeco hospitalar, tambm chamada de nosocomial, pode ser dividida em dois grupos: exgena e endgena. A exgena causada por microrganismos de origem externa, como pessoas, ambiente ou fmites. Devido o fluxo de pessoas doentes, pessoas portadoras no-sintomticas e o manuseio de equipamentos em diversos pacientes. Na endgena, a causa so os prprios microrganismos da flora normal do indivduo. Microrganismos estes oportunistas, que causam infeco ao10

indivduo aproveitando o seu quadro de imunossupresso.

Para controlar esse tipo de situao, medidas comuns devem ser tomadas, como o uso de EPIs pelos funcionrios, esterilizao adequada dos instrumentais, desinfeco de superfcies comuns todos, como maanetas, cadeiras,etc. Trocas de roupas de cama a cada paciente, desinfeco do cho com detergentes bactericidas, assim como ps paredes e teto de ambientes cirrgicos. E medidas de bom senso, como no deixar circular pelo hospital visitantes que podem carregar doenas sem apresentar sintomas; separar os pacientes por grau de contaminao da doena que eles apresentam, etc.

Prtica laboratorial

Foram coletadas amostras do ambiente, sendo estas de superfcies inertes e do solo. Com o auxlio do swab e soluo salina estril amotras de maanetas, celulares, etc, foram coletadas e cultivadas em placa de Petri com gar nutriente, que permite o crescimento apenas de bactria. E, aps diluda em soluo, a amostra de solo foi cultivada em placa de Petri contendo gar sabourad, meio de cultura que permite o crescimento tanto de bactrias quanto de fungos. O resultado foi observado aps 3 dias. Na placa de Solo observou-se o crescimento de colnias de fungos, que so filamentosas e lembram algodo, e de bactrias, pequenos pontos brilhantes e circulares. Nas placas de superfcies observou-se o crescimento de bactrias, algumas superfcies apresentaram nmero mais significativo, outras, nem tanto. O resultado de ambos os cultivos podem ser observados nos grficos.

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Placas de solo tiveram variao na quantidade de ufcs

A quantidade de ufcs foi expressivamente maior nas placas de maaneta.

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3. Isolamento de bactrias da microbiota humana

A microbiota normal aquela que habita a pele e as mucosas do homem. encontrada em pessoas sadias e exerce papis importantes,como competio com microrganismos patognicos por stios e nutrientes,e sntese de vitaminas.Alguns rgos so necessariamente estreis,como crebro,meninges,corao e fgado.A placenta tambm isenta de microrganismos,porm,algumas horas aps o nascimento,j podem ser encontrados microrganismos na cavidade bucal do beb, microrganismos estes oriundos do canal vaginal da me, se o parto tiver sido normal, da amamentao, e do ar ambiente. A flora microbiana no interior e na superfcie do corpo humano est num estado contnuo de fluxo determinado por uma variedade de fatores,como idade, dieta, estado hormonal, sade e higiene pessoal.[...]A populao microbiana continua a mudar ao longo da vida do ser humano.Alteraes na sade podem romper drasticamente o delicado equilbrio que mantido entre os organismos heterognicos que coexistem em nosso interior. (PATRICK R. MURRAY,2010) A microbiota humana normal classificada em: Residente:Microrganismos consideravelmente regulares em algum stio.De acordo com sua freqncia subdividida em Indgenas (quando em relao ao total de microrganismos,representa mais que 1%) e Suplementares (em proporo menor que 1%). Transitria:Microrganismos oriundos do ambiente,como do ar,mos,alimentos. Instalam-se apenas quando ocorre imunodepresso do organismo

hospedeiro.Podem ser patognicos,ou no.

provvel que os microrganismos que podem ser cultivados em laboratrio representa apenas uma frao na flora microbiana normal ou transitria.[...] O nmero de espcies que compem a flora microbiana provavelmente muito maior do que se conhece. Desta forma, a compreenso da flora normal est em transio. (JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG,2009)13

OLHO A conjuntiva normalmente habitada por difterides (Corynebacterium xerosis)e estreptococos no-hemolticos.O fluxo de lgrimas contm lizosima bacteriana,que controla a proliferao de bactrias.

TRATO RESPIRATRIO O nariz habitado por estreptococos,estafilococos,como S. aureus e S. epidermidis, e corinebactrias.Na faringe encontra-se estreptococus no

hemolticos, estafilocos, difterides e pneumococos Mycoplasma e Prevotella.Estes tambm podem ser encontrados nos brnquios.Geralmente os bronquolos e os alvolos so estreis.

BOCA A cavidade bucal oferece stios diversos aos microrganismos, como a superfcie dental, o sulco gengival, o dorso da lngua e as amgdalas. Geralmente encontra-se espcies de Actinomyces nas amgdalas e gengivas, e Streptococcus mutans associados a crie dental.

TRATO GASTROINTESTINAL O esfago habitado por algumas microrganismos comuns a orofaringe, mas acredita-se que a maioria presente nele sejam transitrias que no se estabeleam.O estmago tem pH cido,logo as bactrias l encontradas so cido tolerantes (Lactobacillus e Streptococcus).A populao microbiana deste rgo pode estar alterada em pacientes que estejam utilizando medicamento que reduzam o pH gstrico. O nmero de bactrias da flora intestinal 10 vezes maior que o nmero de clulas que formam os nossos rgos e tecidos, isto , 10 14 bactrias para 1013 clulas humanas.(LUIZ RACHID TRABULSI,2005) O intestino humano dividido em dois grandes stios, o intestino delgado e o intestino grosso,estes subdivididos em stios menores.O intestino delgado formado por 3 pores:o duodeno, que uma extenso do estmago, habitado por14

diferentes bactrias, fungos e parasitas, em sua maioria anaerbios, alguns responsveis por doenas gstricas, como Peptostreptococcus, Porphynomas e Prevotella; jejuno,a maior poro, colonizado em suas maioria por espcies aerbias de estreptococcos, estafilococos e lactobacilos; o leo,que liga-se ao

intestino grosso, apresenta uma diversidade maior de microrganismos, pois passa a incluir coliformes e bacterides, fusobactrias e clostrdeos, que so bactrias anaerbias. O baixo potencial de oxirreduo no leo explica a presena da flora anaerbia nessa regio. (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). O intestino grosso o stio do corpo humano mais habitado por microrganismos. dividido em colo ascendente, transverso e descendente. No intestino grosso, as bactrias anaerbias superam as demais (facultativas e aerbias) por um fator de 102-104. Predominam os bacterides,bifidobactrias e fusobactrias. Os lactobacilos, estreptococos, clostrdeos e enterobactrias so tambm bastante freqentes. Calcula-se que a flora intestinal compreenda em torno de 500 espcies pertencentes a 200 gneros, mas desses somente em torno de 20 so representados de maneira significativa. (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). As bactrias mais freqentes incluem Bifidobacterium, Eucabacterium, Bacteroides, Enterococcus, Clotridium, Pseudomonas, Streptococcus, Lactobacillus,

Fusobacterium, e Staphylococcus. A flora intestinal importante na para a absoro de nutrientes, sntese de vitamina K (que um fator de coagulao sangunea) e converso de cidos biliares. A ingesto de antimicrobianos, no tratamento de doenas, altera a oferta de bactrias, podendo causar diarria antibitico-induzida e dificuldade na absoro e redistribuio de medicamentos, como no caso dos contraceptivos orais, que podem perder o efeito se associado ao uso de antibiticos.

TRATO GENITAL No sistema genital feminino,a uretra anterior e a vagina so normalmente colonizadas por microrganismos.A flora de ambos formada por uma variedade de lactobacilos, estreptococos e estafilococos. As variaes de pH controlam a diversidade desses stios. Em pH cido (+/- 5) h predominncia de Lactobacillus e em pH neutro predominam as outras bactrias. A variao de pH, por sua vez, est relacionada com a quantidade de glicognio na vagina. A fermentao deste15

polmero pelos lactobacilos abaixa o pH, criando um ambiente desfavorvel ao crescimento das bactrias que proliferam em pH neutro. (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). A bexiga urinria pode ser colonizada transitoriamente por bactrias da uretra,mas a ao bactericida de clulas uroepiteliais e o jato de urina eliminam os microrganismos de l.O tero, e demais rgos relacionado ao sistema genitourinrio devem ser estreis.O controle microbiano tambm ocorre pela ao do muco cervical que contm lisozima,uma enzima com atividade antibacteriana. A uretra masculina normalmente colonizada pelos mesmos microrganismos da uretra feminina.

PELE Em virtude de sua constante exposio e contato com o meio ambiente, a pele mostra-se particularmente propensa a abrigar microrganismos transitrios. Entretanto, existe uma flora residente constante e bem-definida, modificada em diferentes reas anatmicas por secrees, uso habitual de roupas ou proximidade de mucosas (boca, nariz e rea perineal). (JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG, 2009) Os microrganismos mais comuns pele so bacilos difterides aerbios e anaerbios (Corynebacterium, Propionibacterium) e estafilococos aerbios e

anaerbios no-hemolticos,como o Staphylococcus epidermidis. H presena,em menor quantidade, de Enterococcus. O pH baixo, os cidos graxos e a presena de lisozima so condies que resultam na eliminao de microrganismos no-residentes da pele. No entanto, nem a lavagem e banho, nem a sudorese so capazes de alterar significativamente a flora residente.

Prtica Laboratorial

Com o objetivo de cultivar microrganismos na flora humana normal, que importante na competio com os patognicos por stios e nutrientes,foi realizada a coleta de amostras de diferentes locais.O procedimento de coleta foi feito com o16

swab,em reas como a boca e unha, umedecido em soluo salina estril,e feito ento um esfregao em zigue-zague na Placa de Petri contendo gar nutriente. Os microrganismos nas reas coletadas so abundantes, e a presena deles normal, no estando relacionada com o estado de doena. As placas foram incubadas a 37 por 24 horas e aps 3 dias os resultados foram observados. Macroscopicamente, as colnias tinham aparncia diferentes, pois no eram dos mesmos locais anatmicos e, portanto, apresentavam flora normal distinta. A placa da boca apresentava colnias mdias, de cor amarelada, circulares com bordas lisas e elevao cncava. A da unha,no entanto, tinha colnias pequenas, de cor branca, forma circular, elevao ondulada e estavam bem agrupadas.

Placa de Petri da aula: O stio de cima o da boca, pode ser observada a colorao amarela das colnias, o stio de baixo representa a unha, e a cor branca evidente. Conclui-se ento que so microrganismos de espcies diferentes.

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Para a visualizao microscpica das UFCs da placa montada,foi realizada a montagem de lminas de esfregao com colorao com o azul de metileno. E levando a lmina ao aquecimento rpido no Bico de Baunsen. O azul de metileno um sal, Cloreto de azul de metileno, consiste num ction de azul de metileno e num nion de cloreto. Colore as clulas a partir da associao do ction com estas. Ele reage com as clulas uma taxa lenta de 30-60 segundos. Na visualizao microscpica observou-se na lmina de boca a presena predominante de estafilococos,e tambm estreptococos e diplococos,na lmina se unha observou-se a presena de cocos livres e muitas ttrades. Boca

Unha

4.Colorao de Gram18

4. Colorao de Gram

O mtodo de Colorao de Gram tem como objetivo facilitar a diferenciao das bactrias baseado na constituio de suas camadas,podendo ser Gram Positivas ou Gram negativas.A colorao facilita ainda a observao da morfologia das clulas,se estas so cocos ou bacilos,e seus arranjos em grupos. O mtodo tradicional da colorao foi desenvolvido por Hans Christian Gram,mas existem inmeras variaes baseadas neste,como de Hucker, e de Kopeloff.Os princpios so os mesmo,varia-se apenas os corantes,ou a sequncia destes. O princpio geral deste mtodo o de fixao,colorao e desidratao das clulas,que dependendo da constituio de suas paredes,perde ou mantm a colorao.Este ser descrito adiante. Quanto a estrutura e composio das clulas: O principal componente estrutural da parede celular um peptidoglicano (mucopeptdeo ou murena), um polmero misto de acares hexoses (N-acetilglicosamina e cido N-acetilmurmico) e aminocidos.Nas bactrias gram-positivas,o peptidoglicano forma uma camada espessa (20-80 nm) externa membrana celular e pode conter outras macromolculas.Nas espcies gram-negativas, a camada de peptidoglicano fina (5-10 nm) e recoberta por uma membrana externa ancorada s molculas de lipoprotenas na camada de peptideoglicano. As molculas principais da membrana externa so lipopolissacardeos e lipoprotenas.Os polissacardeos e os aminocidos carregados na camada de peptidoglicano a tornam altamente polar, promovendo a bactria com uma superfcie hidroflica espessa.Essa propriedade permite que os organismos gram-positivos resistam atividade da bile. Por outro lado, a camada digerida pela lisozima, uma enzima presente nas secrees do corpo, a qual consequentemente apresenta propriedade bactericidas.A sntese do peptidoglicano interrompida pelos antibiticos penicilina e cefalosporinas.Nas bactrias gramnegativas, a membrana externa e tambm hidroflica, porm os componentes lipdicos das molculas constituintes lhe conferem tambm propriedades

hidrofbicas. A entrada de molculas hidroflicas como acares e aminocidos necessria para a nutrio e conseguida pelos canais ou poros formados por19

protenas chamadas porinas.O lipopolissacardeo (LPS) na membrana confere ambas as propriedades: antignica (os antgenos O das cadeias de carboidrato) e txica (a endotoxina do lipdeo A).Nas micobactrias gram-positivas, a camada peptidoglicano apresenta uma base qumica diferente para a ligao cruzada camada de lipoprotenas, e o envelope esterno contm uma variedade de lipdios complexos (cidos miclicos). Isto cria uma camada serosa, qual altera as propriedades de colorao desses organismos (as chamadas bactrias cidoresistentes) e lhes d considervel resistncia ao ressecamento e utros fatores ambientais. Os componentes da parede celular das micobactrias tambm apresentam uma atividade adjuvante pronunciada (i.e promovem resposta imunolgica). No lado externo da parede celular,pode haver uma cpsula adicional de polissacardeos de alto peso molecular (ou aminocidos no bacilo do antraz) que confere uma superfcie viscosa. A cpsula fornece proteo contra fagocitose pelas clulas do hospedeiro e um importante determinante de virulncia. (CEDRIC MIMS,2005).

Gram-positiva

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Gram-negativa

O material para colorao foi obtido a partir de uma amostra de mucosa oral colocado em um meio de A.N. cerca de 7 dias antes. Com o auxlio da ala de rubro,esta j submetida chama do bico de Bausen,coletamos uma pequena quantidade de uma UFC da placa de Petri ,e ,sobre uma lmina com uma gota de lcool,espalhamos suavemente a amostra coletada.Em seguida,para fixar o material, e evitar a remoo das bactrias no momento da colorao,por 3 vezes flambamos a lmina rapidamente.Deixar esfriar. O esfregao agora deve ser coberto por uma camada do principal corante,o Cristal Violeta, e reservar por 1 minuto.Este corante entra no citoplasma das clulas,sejam estas Gram+ ou Gram -, corando ambas.Despejar o excesso. Fazer uma nova camada sobre a lmina com Lugol,um fixador que ir reagir com o Cristal Violeta,formando cristais grandes o bastante para no sarem da celular,formando um complexo chamado de violeta-iodo,violeta-lugol ou iodo-pararosanilina.Lavar a lmina com gua corrente.Em seguida,lavar a lmina com lcool por 15 segundos. A aplicao de lcool desidrata a peptideoglicana das clulas gram-positivas para torn-lo mais impermevel ao cristal violeta-iodo. O efeito nas clulas gramnegativas bem diferente: o lcool dissolve a membrana externa das clulas gramnegativas,deixando tambm pequenos buracos na fina camada de

peptiodeoglicanos pelos quais o cristal violeta-iodo se espalha.Como as bactrias21

gram-negativas ficam incolores aps a lavagem com lcool, a adio de safranina (contracorante) torna as clulas cor-de-rosa. (GERARD J. TORTORA,2005)

Ilustrao do procedimento: lmina e lamnula

A composio bsica das solues utilizadas na tcnica esto descritas a seguir:

CRISTAL VIOLETA Cristal violeta cido fnico lcool absoluto gua destilada

LUGOL Iodo Iodeto de potssio gua destilada

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FUCSINA Fucsina lcool etlico gua destilada

Desenho das bactrias visualizadas por microscopia ptica na aula prtica. A visualizao foi aumentada 400x,colocando sobre a lmina o leo de emerso.

Gram-positiva:

Gram-negativa:

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5. Tcnica de diluio seriadas e contagem de colnias

Cada mililitro de uma suspenso de clulas bacterianas deve conter milhes de clulas, porm, nem todas so viveis. O nome dado s clulas viveis Unidade formadora de colnia (UFC). A tcnica de diluio seriada tem como objetivo facilitar o isolamento de microrganismo e principalmente permitir a contagem dessas UFCs a partir de uma proporo de diluio. O mtodo baseia-se no princpio de que cada uma dessas unidades formadas oriunda de uma nica clula bacteriana vivel. A quantificao das unidades envolve alguns cuidados, como assepsia, para no contaminar o preparo, e o meio de cultivo que deve ser pobre em carboidratos, pois este pode estimular a produo de cpsula, gerando uma aderncia das clulas umas s outras, e assim dificultando a contagem. A diluio sofre outras diluies em alquotas, para assim encontrar um nmero menor e contvel, baseado em uma proporo.

Prtica laboratorial

A partir de uma amostra em soluo com concentrao de 10-1 em 1ml fazer sucessivas diluies em amostras salinas estreis tambm na quantidade de 1ml, at a proporo de 10-7. Escolher 3 propores para o cultivo em placa. As propores escolhidas foram 10-3,10-5 e 10-7. As solues foram cultivadas em diferentes placas de Petri e o resultado foi observado aps 3 dias. A contagem de ufcs foi possvel nas trs placas. A concentrao de bactrias seguiu decrescentemente as propores: 10-3,10-7 e 10-5. Diferentes unidades foram observadas: amarelas e brancas, com bordas circulares e uniformes, circulares e irregulares, com superfcies convexas e onduladas.

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Representao de diluio.

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6. Antibiograma

O antibiograma um teste laboratorial que consiste em verificar qual a resistncia de um determinado microrganismo a um agente bactericida, que interrompe sua atividade, ou bacteriosttico, que o mata. Assim possvel ter uma especificidade sobre qual agente antimicrobiano utilizar em um tratamento. Logo, recomendado para grupos de bactrias que adquiram resistncia facilmente. Alm disso, um teste til para teste com novos antibiticos e pesquisas epidemiolgicas. O antibiograma indicado para qualquer microrganismos estreitamente relacionado ao processo infeccioso, cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na terapia no seja previsvel. o caso das enterobactrias, S. aureus, bacilos Gram-negativos no fermentadores etc. Estas bactrias sofrem forte presso seletiva, j que pela ao das drogas h o extermnio das bactrias sensveis e crescimento das bactrias resistentes, que estavam misturadas na populao bacteriana. (MARIANGELA CAGNONI RIBEIRO,2000) H inmeros procedimentos para testar a eficcia de antimicrobianos, como testes quantitativos, com um ponto final especfico conhecido como Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e testes qualitativos, como o mtodo de difuso em disco, onde as bactrias isoladas podem ser classificadas em resistente,intermediria ou sensvel. Mas pode ser resumida em duas principais: resistente e sensvel. A resistncia encontrada em alguns tipos de bactrias pode ser explicada pela composio das suas paredes. [Concentrao Mnima Bactericida] a mais baixa concentrao do antibitico capaz de eliminar completamente o microrganismo. O procedimento semelhante ao realizado para a medida da CMI. A diluio do antibitico que for capaz de eliminar totalmente os microrganismo e impedir que o microrganismo cresa no meio sem o antimicrobiano considerada a concentrao mnima bactericida (CMB). A CMB mais utilizada para pacientes imunossuprimidos ou em pacientes acometidos por endocardites. (ALANE BEATRIZ VERMELHO,2006)

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Prtica laboratorial

O mtodo escolhido foi o de difuso em disco, e, ao invs de antimicrobianos, trs enxaguantes bucais foram escolhidos para ter sua eficcia testada. O mtodo o de Kirby-Bauer, aceito como mtodo-padro para a realizao de antibiogramas. Em uma placa com Agar nutriente, espalhar uma soluo com bactrias sobre ela de maneira uniforme, e, com o auxlio de uma pina, umedecer um par de discos, um sobre o outro, nos lquidos a serem testados. Repetir isso em todos os lquidos os enxaguantes a serem testados. Os escolhidos foram Oral B, Listerine,e Perio Plark. Com a placa marcada com pincel, colocar os discos sobre a marca e incub-los. O resultado observados aps trs dias foi a eficincia do Perio Plark, pois na sua composio h clorexidina, um anti-sptico de amplo espectro no controle de bactrias gram-positivas, gram-negativas e fungos, que no agride as mucosas. O Listerine teve menor eficcia, mas ainda assim presente, devido o lcool na sua composio, que tambm tem ao anti-sptica. E o Oral B no teve eficincia expressa.

Halos de inibio (mdia) Perio Plak 1,5 mm Listerine 0,5 mm Oral B 0,1mm

Perio Plak: Microrganismo sensvel Listerine: Microrganismo com sensibilidade intermediria baixa. Oral B: Microrganismo resistente

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Houve variao em alguns resultados quanto o Oral B e Listerine, talvez devido erros no procedimento, porm, o Prio Plak foi eficiente em todos os casos.

Os resultados podem ser observados no grfico

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7. Caractersticas morfolgicas de fungos

Os fungos so seres eucariotos, anaerbios ou aerbios, quimioheterotrficos, necessitando de componentes orgnicos para energia e carbono, multicelulares ou unicelulares, no caso das leveduras, e se reproduzem de forma sexuada e assexuada. Os fungos normalmente crescem melhor em ambiente em que o pH prximo a 5, que muito cido para o crescimento da maioria das bactrias comuns. Quase todos os fungos so aerbicos. A maioria das levedura anaerbica facultativa. A maioria do fungos mais resistente preso osmtica que as bactrias; muitos consequentemente, podem crescer em concentraes

relativamente altas de acar ou sal. Os fungos podem crescer sobre substncias com baixo grau de umidade, geralmente to baixo que impede o crescimento de bactrias. Os fungos necessitam de menos nitrognio para o crescimento equivalente ao das bactrias. Os fungos so frequentemente capaz de metabolizar carboidratos complexos, tais como lignina (um dos componentes da madeira), que as bactrias no podem utilizar como nutriente.Essas caractersticas permitem que os fungos se desenvolvam em substratos diversos como parede de banheiro, couro de sapatos, e jornais velhos. (GERARD J. TORTORA, 2005) Na observao de caractersticas macroscpicas, aspectos importantes a serem observados so: tamanho, que varia bastante, de acordo com a qualidade e quantidade de substrato ofertado;bordas, podendo estar ter vrias formas, sendo bem delimitadas ou irregulares, lembrando franjas; textura, esta talvez a mais importante caracterstica de uma colnia fngica, essas colnias podem ser colnias algodonosas (com aspecto de algodo), furfurceas (lembram substncia farincea espalhada numa superfcie), penugentas (lembram fragmentos de penas de aves), arenosas (com aspecto de areia), veludosas (assemelha-se a tecido aveludado), glabrosas (aspecto de cera ou manteiga,sendo observada em leveduras,que se assemelham colnias bacterianas); quanto o relevo a colnia fngica pode ser cerebriforme (com ondulaes que lembram um crebro), rugosas (com ondulaes menos evidentes), apiculadas (salincia no ponto central lembra um cume), e29

crateriformes (lembram cratera devido uma depresso central); e a pigmentao, que pode estar presente s na superfcie da colnia, no seu reverso, em ambos, e ser ou no difusvel ao meio. A caracterizao de uma colnia, visando auxiliar a identificao de determinada espcie fngica, nada mais do que um conjunto de caractersticas subjetivas, de expresso fenotpica, encontradas em determinada espcie. As alteraes fenotpicas, por sua vez, nada mais so do que uma tentativa de adaptao do fungo ao meio bitico e abitico ao qual a colnia est submetida. No raro, as caractersticas clssicas deixam de se manifestar e apontam em direo a uma outra espcie fngica, no correlacionada aos achados. (JOS JLIO COSTA SIDRIM,2004) Os elementos gerais de um fungo, alm da colnia, so miclios e o talo. O miclio um filamento semelhante a um tecido, formado por um conjunto de hifas, fcil de confundi-lo com a cultura no cultivo, tem funo de elemento de sustentao e absoro de nutrientes. As subdivises dos miclios so feitas de acordo com sua situao (se areo ou profundo) ,sua septao (contnua ou septada), sua funo (vegetativo ou reprodutivo) e pela disposio das suas hifas (podem ser em anis, rizomorfas, haustrios,etc).E o talo o corpo do fungo, pode ser unicelular ou miceliano (filamentoso);ele formado por clulas agrupadas ou separadas, sem uma ligao muito rgida, sendo comum s leveduras. Microscopicamente, as estruturas responsveis pela diferenciao da espcies de fungos filamentosos so conhecidas por nomes de estruturas de frutificao e de ornamentao. Essas estruturas de frutificao so clulas pertencentes s hifas que sofrem modificaes, dependendo da condio biolgica, para originar dois tipos primrios de clulas: as esporognicas e as conidiognicas. O que as diferencia o fato de que a primeira vai originar esporos, que ficam dentro de uma bolsa conhecida como esporngio, enquanto na segunda no se observa estrutura de envolvimento externo. Ambas as clulas tem funo final de reproduo assexuada, mas no caso dos condios de fungos filamentosos, estes esto livres para se destacar da hifa e dar origem a um novo fungo. Outras estrutura, denominadas de ornamentao, que no se conhece sua funo especfica, tambm auxiliam na diferenciao de espcie dos fungos.30

Procedimento Laboratorial

Com o auxlio de um palito, foram coletadas amostras dos gneros Penicillium, Aspergillus e Candida para serem observadas em microscopia tica. Durante a preparao das lminas as amostras receberam a colorao do azul de metileno para auxlio na observao. Procurar coletas amostras do centro da cultura, pois estas j esporularam.

Penicillium macroscopicamente, com colorao esverdeada em verso, bordas brancas, superfcie rugosa e veludosa.

Microscopicamente, pode ser visualizada as hifas septadas com filides e condios nas extremidades, sem a presena de vesculas.

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Aspergillus: superfcie cebriforme e algodonosa, com colorao no verso.

Microscopicamente, pode ser observada uma vescula na extremidade de um conidiforo, e essa vescula cercada por condios.

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Candida, com aparncia de colnias de bactrias, sendo globosas, brilhantes e com superfcie cncava

Microscopicamente, so observados brotos, ou pseudohifas, brotos que no se separaram.

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Referncias Bibliogrficas

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