trabalho de conclusão de curso · as bactérias ácido-láticas (labs) possuem histórica...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Trabalho de Conclusão de Curso

Aplicação de modelagem matemática na cinética de

crescimento de Pediococcus pentosaceus em agitador

metabólico

Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Aluno: Bernardo Salustio Pires

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pinheiro de Souza Oliveira (FBT/FCF/USP)

Universidade de São Paulo

Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF/USP)

Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica (FBT/FCF/USP)

São Paulo - SP

Abril - 2018

SUMÁRIO

1. RESUMO ................................................................................................................................................. 3

2. LISTA DE ABREVIAÇÕES ........................................................................................................................... 4

3. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................... 5

3.1. BACTÉRIAS LÁTICAS E FERMENTAÇÃO ................................................................................................ 5

3.2. PEDIOCOCCUS SPP. ........................................................................................................................... 11

3.3. INULINA E PREBIÓTICOS ................................................................................................................... 12

3.4. MODELOS DE CRESCIMENTO ............................................................................................................ 14

3.4.1. LATÊNCIA (𝒕𝑳𝑨𝑮 OU Λ) ..................................................................................................................... 18

3.4.2. TAXA MÁXIMA DE CRESCIMENTO (µ𝒎𝒂𝒙) ....................................................................................... 19

3.4.3. CRESCIMENTO MÁXIMO (𝑵𝒎𝒂𝒙) ..................................................................................................... 20

4. OBJETIVOS ............................................................................................................................................ 21

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................... 21

5. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................................... 22

5.1. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................... 22

5.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................... 22

5.2.1. CULTURAS MICROBIANAS ................................................................................................................ 22

5.2.2. ANÁLISE EXPERIMENTAL .................................................................................................................. 23

5.2.2.1. CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR .............................................................................................. 23

5.2.2.2. MONITORAMENTO DE PH ............................................................................................................ 23

5.2.2.3. DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES E ÁCIDO LÁTICO .......................................................................... 23

5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................................................... 24

5.3.1. MODELO DE GOMPERTZ ................................................................................................................... 24

5.3.2. MODELO DE PRESSER ....................................................................................................................... 24

5.3.3. MODELO DE RATKOWSKY ................................................................................................................. 25

6. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 26

6.1. ANÁLISE DA DINÂMICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO ................................................................. 33

6.2. ANÁLISE DOS FATORES DE INFLUÊNCIA NO CRESCIMENTO MICROBIANO ........................................ 37

7. CONCLUSÕES ........................................................................................................................................ 49

8. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 50

ANEXO ........................................................................................................................................................... 58

Trabalho de Conclusão de Curso: Bernardo S. Pires

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1. RESUMO

Devido a sua grande importância na indústria alimentícia e na saúde, o

entendimento de crescimento das bactérias lácticas se torna cada vez mais importante

e estudado. Este estudo utilizou de modelos matemáticos como Gompertz, Ratkowsky

e Presser para analisar condições de cultivo e cinética de crescimento de Pediococcus

pentosaceus Mees (ATCC 43200) em cultivo em caldo MRS (de Man, Rogosa e

Sharpe) em diferentes condições de pH inicial, temperatura, agitação e concentração

de inulina. Com base nas curvas de crescimento de cada cultivo, os valores de latência

(tLAG) e taxa de crescimento (µmax) foram calculados usando de regressão linear.

A cinética de crescimento de P.pentosaceus não pôde ser analisada segundo

o modelo de Gompertz devido a limitações no experimentos, no entanto os cultivos

em condições de 0% de inulina, 100rpm e 30oC se mostraram os com melhores

resultados, sendo que o cultivo a pH = 6,5 obteve a menor latência (4,05h) e maior

produção de lactato (10,40g/L), enquanto o cultivo a pH = 5,0 obteve a maior biomassa

(2,26g/L) e menor pH (3,55) a 48h. Análises de regressão mostraram que a produção

de biomassa e lactato tinham máximo próximo a pH = 5,5 , enquanto que µmax e

latência tinham condições ideais em maiores faixas de pH (estudo até pH = 6,5),

condizendo com o modelo de Presser que prediz maior µmax em pH próximo a 6,0. A

agitação também se mostrou diretamente proporcional aos valores de µmax

encontrados, no entanto temperatura e concentração de inulina não tiveram grandes

resultados observados. O modelo de Ratkowsy, entretanto, sugere que o crescimento

seria ideal próximo a 35oC. Deste modo, o fator de maior impacto sobre o cultivo de

P.pentosaceus é o pH inicial, por afetar diretamente na biomassa, consumo de

glicose, produção de lactato, latência e µmax.


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2. LISTA DE ABREVIAÇÕES

• LAB = lactic acid bacteria (bactérias ácido-láticas)

• Lag = latência

• µ = Taxa de crescimento

• umax = Taxa máxima de crescimento

• tLAG = Tempo de latência

• N = População microbiana (em g ou UFC)

• Nmax = População máxima microbiana (em g ou UFC)

• No = População inicial microbiana (em g ou UFC)

• MRS = meio de cultura artificial de Man, Rogosa e Sharpe

• UFC = Unidades formadoras de colônia

• DO = Densidade óptica

• tinf = tempo de inflexão sigmoide

• rpm = rotações por minuto

• R2 = Coeficiente de determinação da regressão

• R2 adj = Coeficiente de determinação da regressão ajustado

• R2 pred = Coeficiente de determinação da regressão previsto


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3. INTRODUÇÃO

As bactérias ácido-láticas (LABs) possuem histórica importância para o ser

humano, sendo conhecidas em alimentos fermentados desde tempos antigos. As

primeiras associações de LABs com fermentações tradicionais foram descritas a mais

de 100 anos com a cepa agora denominada de Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus (DOUILLARD; DE VOS, 2014). Atualmente, o uso de LABs na fermentação

industrial representa uma indústria bilionária de queijos, iogurtes e muitos produtos

atuais, além de importância na saúde e nutrição humana, levando a grande interesse

no estudo das funções, fisiologia e cinética destas (MARKETSANDMARKETS.COM,

2016)

3.1. Bactérias láticas e fermentação

As bactérias láticas são um grande grupo de bactérias muito estudadas pela

sua função na fermentação de alimentos. Através de diversos estudos

transcripcionais, proteômicos e metabólicos feitos para entender o crescimento e

função das LABs, sabe-se atualmente que estas são um grupo geneticamente

relacionado, como mostrado na figura 1, onde estas são organizadas

filogeneticamente com base em 7 genes de housekeeping (recA, rpoD, dnaK, infC,

rplA, rpsB e rpmA).


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Figura 1. Árvore filogenética baseada em 7 genes de housekeeping (recA, rpoD, dnaK, infC, rplA, rpsB e rpmA) de 38 espécies de LABs. As espécies foram coloridas de acordo com seu gênero (roxo: Leuconostoc spp.; amarelo: Lactobacillus spp.; azul: Pediococcus spp.; verde: Lactococcus spp.; rosa: Streptococcus spp.; laranja: Enterococcus spp.; cinza: Oenococcus spp.). Adicionalmente, foram usados círculos coloridos pra ilustrar nichos onde estes podem ser isolados (verde escuro: vegetais; verde: produtos alimentícios; laranja: cavidade oral; roxo: trato gastrointestinal; magenta: cavidade vaginal; azul: outros locais do corpo e isolados clínicos). FONTE: (DOUILLARD; DE VOS, 2014).

As bactérias ácido-láticas (LABs) ocupam um papel central nos processos

fermentativos, com um longo e seguro histórico de aplicação e consumo em alimentos

e bebidas fermentadas (CAPLICE; FITZGERALD, 1999). O importante papel das

bactérias ácido-láticas, do ponto de vista tecnológico, é ilustrado pela produção de

biomoléculas de alto valor agregado durante o processo fermentativo, produzindo

ácido lático como maior bioproduto do metabolismo, causando assim rápida

acidificação do material cru. Além disso, algumas culturas láticas produzem ácido


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acético, ácido málico, etanol, aromas (diacetil e acetoína), bacteriocinas,

exopolissacarídeos e importantes enzimas (proteases), aumentando assim, o tempo

de prateleira e segurança microbiológica do produto fermentado, além de levar a

melhorias na textura e contribuir para o perfil sensorial agradável do produto final

contribuindo no aroma e sabor dos produtos fermentados. (LEROY; DE VUYST, 2004;

MAYO et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2011; SMIT; SMIT; ENGELS, 2005; WILLIAMS;

NOBLE; BANKS, 2001; YVON; RIJNEN, 2001).

Inicialmente, a produção de alimentos fermentados era feita com base na

fermentação espontânea, ou seja, devido ao desenvolvimento da microbiota

naturalmente presente no material cru. A qualidade do produto final não era

consistente por depender da carga microbiana e espectro desta inicialmente presente

no material cru. A direta adição de starter culture, preparações microbianas com

grande quantidade de células conhecidas a serem adicionadas ao material cru de

modo a acelerar e controlar o processo fermentativo, levou a um avanço no

processamento de alimentos e bebidas fermentadas, por permitir um maior controle e

padronização do processo e do produto final (LEROY; DE VUYST, 2004).

Atualmente, a maioria das bactérias láticas probióticas é utilizada na

formulação de bioprodutos como iogurtes, leites fermentados, sorvetes e produtos

farmacêuticos visando promover efeitos positivos à saúde e prevenção de doenças

(MATTILA-SANDHOLM et al., 2002).

Embora LABs homofermentativas, como P. pentosaceus, convertam a fonte

energética (açúcar) disponível quase completamente em ácido lático através da

redução do piruvato produzido na glicólise, este pode levar a geração de diversos

outros metabólitos, como acetato, etanol, diacetil e acetaldeído. E assim, LABs

produzem diversas substâncias voláteis que levam ao sabor e aroma característicos

de produtos fermentados como massa azeda (determinada pelo balanço

lactato/acetato), kefir ou koumiss (etanol) e manteiga ou coalhada (diacetil)

(KLEEREBEZEMAB; HOLS; HUGENHOLTZ, 2000).

Além disso, polímeros de açúcar produzidos in situ por LABs

(exopolissacarídeos) estão sendo explorados como modificadores de textura naturais

em iogurtes (DE VUYST et al., 2001; DE VUYST; DEGEEST, 1999), sorvetes

(CHRISTIANSEN; MADEIRA; EDELSTEN, 1999), sour cream (DUBOC; MOLLET,

2001) e queijo mussarela low-fat (BROADBENT et al., 2001; LOW et al., 1998). Estes


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polissacarídeos aumentam a viscosidade e firmeza do produto, além de reduzir a

sinérese e contribuir para a textura em produtos de baixo teor de gordura, estando

assim sob investigação para implementação industrial em produtos fermentados (DE

VUYST et al., 2001; DE VUYST; DEGEEST, 1999; MARSHALL et al., 2001).

Ao mesmo tempo, a atividade antimicrobiana demonstrada por LABs está

sendo estudada como alternativa ao uso de aditivos alimentícios químicos como

nitritos, sulfitos, ácido propiônico, ácido sórbico e ácido benzoico, comumente

utilizados na preservação de alimentos (SMITH, 1993), para combater a contaminação

e crescimento microbiano no produto final (HOLZAPFEL; GEISEN; SCHILLINGER,

1995; LÜCKE, 2000). Isso é de especial importância pois, embora conservantes sejam

necessários para preservar produtos alimentícios de estragar e preservar suas

características organolépticas (LAW, 2001) o uso de aditivos alimentares é

considerado inseguro e não natural por consumidores atualmente (Ray, 1992).

As LABs conseguem fazer esse papel através da produção de antimicrobianos

naturais, como ácidos orgânicos (ácido lático, ácido acético, ácido fórmico e ácido

capróico), gás carbônico, peróxido de hidrogênio, diacetil, etanol, reuterina,

reutericiclina e bacteriocinas (BALCIUNAS et al., 2013; MESSENS; DE VUYST,

2002).

Bacteriocinas, em especial, são proteínas ou peptídeos de baixa massa

molecular com ação antimicrobiana restrita a bactérias Gram-positivas relacionadas.

O uso de LABs produtoras de bacteriocinas na preservação de produtos alimentícios

leva, portanto, a uma vantagem tecnológica (CLEVELAND et al., 2001; NETTLES;

BAREFOOT, 1993; OLIVEIRA et al., 2012; VUYST; VANDAMME, 1994) já que a

produção in situ de bacteriocinas aumenta a competitividade das cepas presentes na

matriz do produto alimentício, contribuindo assim para a prevenção da contaminação

deste (HUGAS et al., 1995; ROSS et al., 2000; RUIZ-BARBA et al., 1994; VOGEL et

al., 1993). LABs produtoras de bacteriocina podem ser aplicadas como uma

alternativa ao uso de nitrato de potássio na prevenção da contaminação por

Clostridium em queijos, por exemplo (DELVES-BROUGHTON, 2005; NAIDU, 2000).

Estas também podem ser usadas na supressão de contaminantes que modificam o

sabor, como por exemplo, de certas cepas de L. lactis em produtos lácteos (Stanley,

1998). Além disso, bacteriocinas são ativas contra patógenos transmitidos pelos

alimentos como Clostridium botulinum, Staphylococccus aureus e Listeria


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monocytogenes (NETTLES; BAREFOOT, 1993). O uso de LABs produtoras de

bacteriocinas como culturas starter para estes fins já foi documentada em salsichas

fermentadas (CALLEWAERT; HUGAS; VUYST, 2000; FOEGEDING et al., 1992;

HUGAS et al., 1995; VOGEL et al., 1993), olivas e vegetais fermentados (HARRIS,

1998; HARRIS; FLEMING; KLAENHAMMER, 1992; RUIZ-BARBA et al., 1994) e

produtos lácteos (BENKERROUM et al., 2002; BUYONG; KOK; LUCHANSKY, 1998;

FOULQUIÉ MORENO et al., 2003; GIRAFFA, 1995; MAISNIER-PATIN et al., 1992;

MCAULIFFE; HILL; ROSS, 1999; ROBERTS; ZOTTOLA; MCKAY, 1992;

RODRÍGUEZ et al., 1998).

Atualmente, consumidores prestam grande atenção na relação entre dieta e

saúde. Consequentemente, o mercado de alimentos com propriedades promotoras de

saúde, chamados de alimentos funcionais, tem demonstrado um grande crescimento

nos últimos anos. Nutracêuticos estão no centro desse movimento, por serem

componentes que contribuem para a saúde do consumidor através de ações

fisiológicas (ANDLAUER, W. AND FÜRST; ANDLAUER; FÜRST, 2002). Através de

seleção e otimização de processo, a atividade das LABs pode ser modificada para

aumentar o conteúdo de nutracêuticos em produtos alimentícios fermentados. Um

exemplo é o uso de LABs com alta produção de polióis, reduzindo assim o conteúdo

de açúcar e conteúdo calórico de produtos lácteos sem perda do sabor (WISSELINK

et al., 2002).

A ação fermentativa de certas cepas de LABs também pode levar a remoção

de fatores tóxicos ou antinutritivos, como lactose e galactose, tendo utilidade na

prevenção de eventos de intolerância a lactose ou acúmulo de galactose (WOUTERS

et al., 2002), rafinose, estaquiose e verbacose para prevenção de flatulência e dores

intestinais (HOLZAPFEL, 1997; SCALABRINI et al., 1998), taninos e ácido fítico para

aumentar biodisponibilidade de minerais (HOLZAPFEL, 1997; SHARMA; KAPOOR,

1996), e glucosídeos cianogênicos ou aminas biogênicas, para diminuir toxicidade

natural de certos alimentos como mandioca (HOLZAPFEL, 2002).

No entanto, as LABs possuem maior importância do que apenas na produção

de alimentos fermentados. Assim como em muitas plantas e animais, o corpo humano

é colonizado por LABs e estudos de culturas documentam a presença destes em

diversas partes do corpo.


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A colonização das LABs no corpo humano é bem estabelecida e estudos

filogenéticos e metagenômicos identificaram LABs em diversas regiões, como pele,

cavidade oral, trato gastro-intestinal e cavidade vaginal (DAL BELLO et al., 2003;

HEILIG et al., 2002; QIN et al., 2010; VAUGHAN et al., 2002; WALTER, 2008), embora

sua quantidade varie consideravelmente (Figura 2).

Figura 2. Mapa com locais de encontro de LABs no corpo, assim como a fração estimada destas dentro a população local. A fração estimada de LABs é baseada em estudos filogenéticos e metagenomicos. O número total de bactérias (por g) é baseado em tecidos homogeneizados, fluido isolado ou centímetro quadrado de pele. FONTE: (DOUILLARD; DE VOS, 2014).

Em geral, LABs são consideradas seguras e muitas espécies estão nas listas

de Qualified Presumed Safety (QPS) da European Food Safety Authority e Generally

Regarded as Safe (GRAS) da US Food and Drug Administration, à excessão de

Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, espécies que emergiram como causas

de infecção resistente a antibióticos do sangue, trato urinário e feridas cirúrgicas

(GILMORE et al., 2014) embora sejam usadas como starters em vários alimentos

fermentados, assim como comercializados como probióticos. O amadurecimento de

queijos, linguiças e azeitonas são exemplos de usos desse gênero nos alimentos.

(FOULQUIÉ MORENO et al., 2006).

No campo terapêutico, as bactérias láticas têm sido descritas por muitos

pesquisadores e suas aplicações podem ser resumidas como: aumento da modulação

imune e prevenção de certas doenças ou alterações em humanos como, por exemplo,


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diarreias, má digestão de lactose, doenças inflamatórias intestinais, síndrome do

intestino irritado, constipação, crescimento desordenado de bactérias intestinais,

câncer de bexiga, câncer cervical, alergias, colesterol, pressão sanguínea, doenças

coronárias, infecção no trato urinário, trato respiratório superior e infecções

relacionadas (FRESE et al., 2013; HOLZAPFEL et al., 1998; MATTILA-SANDHOLM;

MÄTTÖ; SAARELA, 1999; O’SHEA et al., 2012; OUWEHAND et al., 2003;

PETSCHOW et al., 2013; SAXELIN et al., 2005).

3.2. Pediococcus spp.

As bactérias do gênero Pediococcus são Gram-positivas, homofermentativas,

sem motilidade ou capacidade esporulativa, cocos anaeróbicos facultativos de

diâmetro entre 0.6 e 1.0mm, usualmente organizados em quartetos. Podem ser

isolados de uma grande variedade de plantas e de queijos maduros e têm sido

largamente usados na fermentação de vegetais, carnes, ensilagem e produção de

queijos (PORTO et al., 2017).

P. pentosaceus consegue crescer em condições de pH entre 4.5 e 8.0 com pH

ideal em 5.5, tipicamente a temperaturas próximas a 40oC mas não 50oC e 9-10% de

NaCl. São bactérias capazes de hidrolisar arginina e utilizar maltose como fonte

energética (CAI et al., 1999; COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014).

A única via fermentativa de bactérias homofermentativas como P. pentosaceus

é a de Embden-Meyerhof-Parnas (figura 3), através do qual glicose é clivada para

formação de lactato (figura 4), sendo que os Pediococcus em especial tem predileção

no uso de glicose como fonte energética e de carbono (DE SOUZA DE AZEVEDO et

al., 2017).


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Figura 3. Representação da glicólise através da via Embden-Meyerhof-Parnas, com grupos participantes de cada reação realçados. FONTE: (SHAFEE, 2015)

Figura 4. Representação da formação de lactato a partir de piruvato proveniente da glicólise. FONTE: (AHERN, 2017)

LABs do gênero Pediococcus também têm sido estudadas pela capacidade de

produção de bacteriocinas, conhecidas por pediocinas.

3.3. Inulina e prebióticos

A fim de aumentar esses efeitos terapêuticos tem sido estudada a capacidade

das bactérias láticas probióticas em fermentar ingredientes prebióticos como, por

exemplo, a inulina e frutooligossacarídeos (OLIVEIRA et al., 2012).

Prebióticos são ingredientes alimentares não digeríveis pelo corpo humano que

beneficiam o consumidor através da estimulação do crescimento ou atividade de um

número limitado de bactérias do cólon, melhorando assim a saúde do consumidor

(GIBSON; ROBERFROID, 1995; OLIVEIRA et al., 2011). Além disso, prebióticos


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podem reprimir o crescimento de patógenos (ROBERFROID, 2001). Para serem

efetivos, estes compostos devem chegar não digeridos e absorvidos ao trato

gastrointestinal superior e ser seletivamente utilizados pelas bactérias lá presentes,

como no caso dos frutanos.

Frutano é um termo geral usado para carboidratos em que ligações frutosil-

frutose constituem a maioria das ligações glicosídicas. Estes podem ser polímeros

lineares (inulinas) ou ramificados de frutose (KAUR & GUPTA, 2002). Em geral

espécies dicotiledôneas armazenam inulinas, enquanto frutanos mais ramificados e

complexos são comuns em monocotiledôneas (VIJN; SMEEKENS, 1999).

Devido a configuração β do carbono anomérico C2 em seus monômeros de

frutose, frutanos são resistentes a hidrolise por enzimas digestivas humanas, como α-

glicosidase, maltase, isomaltase e sucrase, que são especificas para ligações α-

glicosídicas. Desse modo os frutanos são considerados oligossacarídeos não

digeríveis in vitro ou in vivo. Devido a limitada hidrólise desses compostos no

estômago, os frutanos chegam ao cólon, como confirmado em estudos in vivo em

ratos e humanos. Um estudo em homens ileostomizados em especial demonstrou que

de 86 a 88% da dose (doses de 10 a 30g) de inulina e oligofrutose é recuperada no

efluente da ileostomia, suportando a ideia de que estes compostos são praticamente

não digeríveis no intestino delgado humano. A pequena perda durante a passagem

pelo intestino delgado pode ser explicada pela fermentação da população microbiana

do íleo, a qual é cerca de 100 vezes maior em pacientes ileostomizados que na

população em geral. Outra explicação para a perda é através da hidrólise ácida ou

enzimática de frutanos de baixo peso molecular, conhecidos por serem mais sensíveis

a hidrólise que componentes de maior peso molecular (COUDRAY et al., 1997).

Inulinas e oligofrutoses podem, chegando ao cólon, alterar a composição da

flora intestinal humana resultando numa comunidade com predominância de

bifidobactérias (GIBSON et al., 1995; HIDAKA et al., 1986) já que estas são usadas

como fonte de carbono por várias espécies através de enzimas específicas como a -

frutosidase (BAÑUELOS et al., 2008).

A predominância de bifidobactérias no intestino grosso é essencial para a

prevenção de diversas doenças e a manutenção da saúde do indivíduo. Estudos

mostraram que oligofrutose e inulina modificam significativamente a composição

microbiana através da estimulação do crescimento de bifidobacterias que, por sua


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parte, mudam o ambiente colônico inibindo bactérias patógenas através da formação

de bacteriocinas, competição por substrato, adesão ao epitélio gastrointestinal e

estimulação do sistema imune (BEZKOROVAINY et al., 1996; GIBSON;

ROBERFROID, 1995).

As duas espécies atualmente usadas na produção industrial de inulina são

alcachofra-de-jerusalém (Helianthus tuberosus) e chicória (Cichorium intybus), sendo

que a última é mais comumente usada para tal (DE BRUYN et al., 1992).

A inulina é processada na indústria alimentícia para produção de frutanos de

cadeia curta através de hidrólise enzimática parcial com endoinulinase e frutanos de

cadeia longa através de técnicas separação (DE LEENHEER, 2007).

A diferença no tamanho da cadeia leva a diferenças funcionais nos frutanos.

Devido a sua maior cadeia, inulina é menos solúvel que oligofrutose, formando

microcristais em água ou leite. Esses cristais não são perceptíveis na boca, porém

interagem formando uma textura cremosa, semelhante à de gorduras. Desse modo,

inulina tem sido usada com sucesso como alternativa a gorduras em patês, cremes,

produtos lácteos, doces congelados e alimentos assados (KAUR & GUPTA, 2002).

Frutanos também são não cariogênicos já que não são fermentados por

Streptococcus mutans na formação dos ácidos e glucanos responsáveis pelas cáries

dentais (KAUR & GUPTA, 2002).

3.4. Modelos de crescimento

Devido à importância do crescimento microbiano na fermentação e na

contaminação de produtos alimentícios diversos estudos foram feitos sobre os

padrões e condições deste, incluindo uma variedade de modelos matemáticos. Estes

modelos procuram descrever e prever o crescimento microbiano através do uso de

dados experimentais e sistemas fenomenológicos (LÓPEZ et al., 2004a) e suas

informações permitem prever tempo de prateleira de produtos, detecção de estágios

críticos na produção e distribuição e otimização destes (ZWIETERING et al., 1990,

1991).

Em geral, modelos de crescimento microbiano descrevem aproximadamente

um habitat fechado, ou seja, um habitat onde todos os recursos capazes de sustentar

vida são finitos e não renováveis, ao mesmo tempo que metabólitos excretados e


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células mortas não são removidos e se acumulam. Isso difere do sistema de

fermentação contínua, onde recursos são continuamente adicionados e metabólitos e

células mortas são retirados ou utilizados (PELEG; CORRADINI, 2011).

O crescimento em um habitat fechado tipicamente possui quatro estágios bem

determinados: fase de latência (lag), fase exponencial, fase estacionária e fase de

declínio ou mortalidade (MCKELLAR; LU, 2004), como mostrado na figura 5.

Figura 5. Visão esquemática de uma típica curva de crescimento microbiano num habitat fechado. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).

Figura 6. Representação dos diversos estágios de crescimento microbiano (1: latência (lag), 2: transição lag-exponencial, 3: exponencial, 4: transição exponencial-


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estacionário, 5: estacionário, 6: declínio), mostrando a taxa de crescimento e densidade populacional destes. Fonte: (MONOD, 1949).

A fase lag ou de latência representa um período em que as células estão em

adaptação ao novo ambiente e, portanto, não são replicantes. Nesta fase a taxa de

crescimento é igual a zero (µ = 0). Após a adaptação, há uma fase de crescimento

microbiano exponencial, na taxa máxima de crescimento daquele ambiente,

considerada constante (µ = µ𝑚𝑎𝑥). Há, entretanto, uma fase de transição entre as

duas fases, onde a taxa de crescimento é menor que a máxima (0 < µ < µ𝑚𝑎𝑥). É

proposto que isso se dá pela variação individual dentro da população celular. Mesmo

dentro de uma população isogenética há um grau de variação no estado fisiológico

das células, levando a diferenças nos tempos de adaptação e crescimento. A

determinação da latência (𝑡𝐿𝐴𝐺 ou λ), mostrada na figura 7, mostra o tempo para a

adaptação ao ambiente da cultura estudada e pode ser dividido entre o tempo de

adaptação celular (ta) e o tempo de geração de energia necessária para duplicação,

também chamado de tempo de geração (tg) (BUCHANAN; WHITING; DAMERT,

1997).

Na fase exponencial o logaritmo da população celular cresce linearmente com

o tempo até alcançar a fase estacionária, onde a população atinge seu máximo e o

crescimento microbiano volta a ser zero (µ = 0). Isso se dá pela população atingir a

maior densidade suportada pelo ambiente em consideração, fazendo com que a

limitação de nutrientes não permita a rápida produção de energia necessária para o

crescimento microbiano. Nesse caso presume-se que as células se tornem dormentes

ou reciclem nutrientes de outras células não viáveis. Há também um período de

transição para a fase estacionária, onde a taxa de crescimento ainda não é zero (0 <

µ < µ𝑚𝑎𝑥). É proposto que isso se dá pois devido a diminuição da concentração de

nutrientes, que não estão mais em excesso, fatores como a difusão dos nutrientes

pelo meio passam a afetar o crescimento microbiano, fazendo com que o declínio da

taxa de crescimento não seja homogêneo. Esta transição é mais dificilmente

observada em sistemas líquidos homogêneos, onde a agitação do ambiente leva a

difusão homogênea dos nutrientes e metabólitos (BUCHANAN; WHITING; DAMERT,

1997).


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Finalmente, a fase de declínio se dá pela limitação de nutrientes e acúmulo de

metabólitos, levando a morte celular e declínio da população microbiana

(BUCHANAN; WHITING; DAMERT, 1997).

No entanto, modelos de crescimento microbiano em geral estudados em

tecnologia de alimentos apenas traduzem as primeiras três fases, ignorando a fase de

decaimento, já que a grande maioria dos produtos alimentícios deixam de ser

comestíveis muito antes do início da fase de mortalidade celular, muitas vezes antes

mesmo da fase estacionária (PELEG; CORRADINI, 2011). Deste modo, uma grande

quantidade dos modelos presentes atualmente se aproxima de equações sigmoidais,

descrevendo as fases lag, exponencial e estacionária, como mostrado na figura 5.

Figura 7. Visão esquemática de uma curva sigmoidal de crescimento microbiano, mostrando a determinação tradicional da latência. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).

Em estudos de cinética de crescimento microbiano, os dados utilizados são em

geral coletados em condições ambientais controladas, como, por exemplo, condições

constantes de temperatura, pH, osmolaridade, concentração de açúcares, atividade

da água, dentre outros. Normalmente também os fatores considerados são limitados

àqueles considerados de grande importância na cinética microbiana, como os

mencionados, enquanto que fatores como difusão de gases e nutrientes, mudanças

na solubilidade e transferência de calor são comumente desconsiderados a não ser

que estes expliquem desvios consideráveis de um crescimento esperado.


18

Os modelos podem ser de vários tipos, mas os mais comumente usados são

os de expressão algébrica empírica, das quais a equação de Gompertz é a mais

conhecida e comumente utilizada, e modelos logisticos de taxa de crescimento,

derivadas em geral da equação de Verhulst (PELEG; CORRADINI, 2011).

A literatura em modelos de crescimento microbiano em geral lida com a

definição, determinação e fatores que afetam três parâmetros: latência (𝑡𝐿𝐴𝐺 ou λ),

taxa máxima de crescimento (µ𝑚𝑎𝑥) e crescimento máximo (𝑁𝑚𝑎𝑥). Os três fatores

possuem significados intuitivos e utilidade no estudo microbiológico, principalmente

em tecnologia de alimentos.

3.4.1. Latência (𝒕𝑳𝑨𝑮 ou λ)

Devido a transição continua entre as fases de latência (Lag) e exponencial, a

determinação da latência não é clara, sendo tradicionalmente determinada

graficamente pela intersecção das tangentes da fase de latência (Lag) e fase

exponencial na curva de crescimento, como mostrado na figura 7, ou por regressão

não-linear usando o latência como um dos parâmetros da equação. Ambos possuem

limitações quando se considera curvas não sigmoidais ou assimétricas, como

mostrado na figura 8 (PELEG; CORRADINI, 2011).


19

Figura 8. Representação da limitação da definição tradicional de latência quando aplicada a curvas de crescimento não sigmoidais ou assimétricas. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).

3.4.2. Taxa máxima de crescimento (µ𝒎𝒂𝒙)

Em tecnologia de alimentos a taxa máxima de crescimento microbiano é em

geral considerada uma medida da intensidade de crescimento de um organismo e,

portanto, muitos dos modelos usados nessa área foram desenvolvidos

exclusivamente para o estudo desse parâmetro. Matematicamente, a taxa máxima de

crescimento é definida como a inclinação da curva de crescimento sigmoidal em seu

ponto de inflexão, como mostrado na figura 9.


20

Figura 9. Representação da determinação matemática da taxa máxima de crescimento (µ𝒎𝒂𝒙) em uma curva de crescimento microbiano sigmoidal. Fonte: (PELEG; CORRADINI, 2011).

3.4.3. Crescimento máximo (𝑵𝒎𝒂𝒙)

O crescimento máximo microbiano representa o número ou massa de células

na fase estacionária, quando não há mais crescimento microbiano no meio. Embora

esta seja uma quantidade facilmente mensurável, frequentemente a contagem

microbiana é inserida dentro de parâmetros dos modelos de crescimento na

regressão. Isso se dá porque a medição do número de células (N) ou mesmo do

número inicial de células (No) possuem erros experimentais e a inserção desses nos

parâmetros da equação evita tais erros.

A estimativa do Nmax por regressão, entretanto, pode ser complicada. Caso uma

fase estacionária bem definida não seja alcançada durante o experimento, o valor

calculado seria uma extrapolação, o que implica em incerteza (PELEG; CORRADINI,

2011).


21

4. OBJETIVOS

Este trabalho visa o estudo da cinética de crescimento celular da cepa

Pediococcus pentosaceus, seu consumo de glicose e produção de ácido lático,

aplicando conhecimentos de modelagem matemática e análise de dados

experimentais obtidos a partir do cultivo em agitador metabólico utilizando glicose,

frutose e inulina como fontes de carbono e diferentes condições de cultivo.

4.1. Objetivos específicos

• Avaliar a influência do meio de cultivo no crescimento celular de P.

pentosaceus e na produção de ácido lático;

• Estudar a influência de fonte alternativa de carbono (glicose, frutose e

inulina) nos cultivos em agitador metabólico no crescimento celular de

P. pentosaceus e na produção de ácido lático;

• Avaliar a cinética do processo em agitador metabólico;

• Avaliação dos resultados através das ferramentas estatísticas Minitab

17, MATLAB R2015a e Excel 2016.

• Análise da cinética observada experimentalmente em relação a

equações descritas na literatura, sendo essas os modelos de Gompertz,

Presser e Ratkowsky.


22

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Planejamento experimental

A Tabela 1 se refere ao planejamento dos ensaios de cultivo de Pediococcus

pentosaceus em agitador metabólico, tendo pH, concentração de inulina, agitação e

temperatura como variáveis.

Tabela 1. Planejamento experimental dos cultivos de P.pentosaceus em questão das variáveis pH, concentração de inulina, agitação e temperatura.

Ensaios pH Conc.

Inulina (%) Agit. (rpm)

Temp. (°C)

MRS 6,5 0,0 100 30

C 5,0 0,0 100 30

E1 4,0 0,5 50 25

E2 6,0 0,5 50 35

E3 4,0 1,5 50 25

E3' 4,0 1,5 50 35

E4 6,0 1,5 50 35

E4' 6,0 1,5 50 25

E5 4,0 0,5 150 25

E5' 4,0 0,5 150 35

E6 6,0 0,5 150 35

E6' 6,0 0,5 150 25

E7 4,0 1,5 150 25

E8 6,0 1,5 150 35

Ce 5,0 1,0 100 30

5.2. Procedimento experimental

5.2.1. Culturas microbianas

Neste projeto foram utilizados micro-organismos Pediococcus pentosaceus

Mees (ATCC 43200) em meio de cultivo sintético, denominado caldo MRS (de Man,

Rogosa e Sharpe) (DifcoTM, Sparks, USA), preparado de acordo com as instruções do

fabricante e suplementado com inulina segundo o planejamento experimental (Tabela

1).


23

O pré-inóculo foi preparado adicionando-se 1 mL da cultura estoque de P.

pentosaceus ATCC 43200 em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50mL de caldo

MRS. Em seguida foi feita a incubação em agitador metabólico nas condições de 100

rpm e 30°C, até alcançar uma contagem microbiana entre 107-108 UFC/mL. A partir

deste cultivo, uma alíquota de 10mL (inóculo) foi transferida para frascos Erlenmeyer

de 250mL contendo 100mL dos diferentes meios de cultivo descritos e conduzidos

segundo o planejamento experimental (Tabela 1). O cultivo em agitador metabólico foi

baseado no estudo de DAESCHEL; KLAENHAMMER, 1985.

5.2.2. Análise experimental

Foram retiradas alíquotas do processo de cultivo a cada 2 horas. As alíquotas

foram coletadas assepticamente dos cultivos para análises de pH, açúcares (glicose

e frutose), ácido lático e concentração celular, feitas cada um em triplicata. Cada uma

das análises foi feita segundo a metodologia a seguir:

5.2.2.1. Curva de crescimento celular

A concentração celular foi obtida mediante uma curva de calibração

(evidenciada abaixo) que correlaciona dendidade ótica à 600 nm (DO600nm) com

biomassa de células. Para a elaboração desta curva, alíquotas de 3 mL provenientes

do cultivo de 100 mL de inóculo de P. pentosaceus ATCC 43200 foram filtradas

através de membrana com porosidade de 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, USA).

Após a secagem em estufa a 100 oC por 2 horas, a biomassa foi determinada através

da utilização de balança analítica. As análises foram realizadas em triplicata.

5.2.2.2. Monitoramento de pH

A pós-acidificação dos cultivos foi avaliada utilizando-se um pHmetro modelo

400M1 (Quimis, SP, Brasil).

5.2.2.3. Determinação de açúcares e ácido lático

A determinação das concentrações de açúcares (glicose e frutose) e ácido

lático foi realizada mediante análise por Cromatografia Líquida de Alta Performance

(HPLC), modelo LC-20A Prominence (Shimadzu, Kyoto, Japão), equipado com duas


24

bombas (LC-20AD), uma unidade desgaseificadora (DGU-20A), um auto injector (SIL-

20ACHT), uma coluna (CTO-20AC), um detector de índice refratário (RI-210) (Shodex,

Kawasaki, Kanagawa, Japão) e uma coluna 300 x 7.8 mm (HPX-87H) (Aminex, Bio-

Rad, CA, USA).

As análises foram realizadas a temperatura ambiente utilizando

acetonitrila:água ultra pura (75%:25%) como fase móvel a um fluxo de 0.9 mL/min.

Glicose e frutose ultra pura (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) foram utilizadas nas

concentrações de 0,1 a 2,0 g/L como soluções padrão para o preparo da curva de

calibração. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.

5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram analisados usando os softwares Minitab 17, MATLAB

R2015a e Excel 2016, onde equações de regressão foram feitas para os valores

experimentais e gráficos para os modelos da literatura.

5.3.1. Modelo de Gompertz

log𝑒N(t) = log𝑒No +Nmax

Noe

{𝑒[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]

}

Modelo largamente aplicado a crescimento microbiano em cultura isotérmica

(𝑇 = 𝑐𝑡𝑒), criado em 1825 para descrever mortalidade de populações (BUCHANAN;

WHITING; DAMERT, 1997; LÓPEZ et al., 2004b), onde:

- No = população bacteriana ou biomassa inicial

- Nmax = população bacteriana ou biomassa máxima

- µ = taxa de crescimento específica

- t𝑖𝑛𝑓 = tempo na inflexão ou tempo onde µ = µ𝑚𝑎𝑥

5.3.2. Modelo de Presser

µ𝑚𝑎𝑥

µ𝑜𝑝𝑡= (1 − 10𝑝𝐻𝑚𝑖𝑛−𝑝𝐻)(1 − 10𝑝𝐻−𝑝𝐻𝑚𝑎𝑥)


25

Modelo de taxa de crescimento por pH posteriormente expandido por

Tienungoon et al. (2000) para descrever o comportamento da taxa de crescimento por

toda a extensão do pH (PRESSER; RATKOWSKY; ROSS, 1997; TIENUNGOON et

al., 2000), onde:

- µ𝑚𝑎𝑥 = taxa máxima de crescimento experimental

- µ𝑜𝑝𝑡 = taxa máxima de crescimento ideal

- 𝑝𝐻 = pH do meio de cultura

- 𝑝𝐻𝑚𝑖𝑛 = pH mínimo de crescimento do microorganismo

- 𝑝𝐻𝑚𝑎𝑥 = pH máximo de crescimento do microorganismo

5.3.3. Modelo de Ratkowsky

(a) µmax = [b(T − Tmin)]2

(b) µmax = [b(T − Tmin)]2{1 − e[c(T − Tmax)]}

Modelo de taxa de crescimento microbiano em função da temperatura. O

modelo de Ratkowsky original (equação a) se baseia na observação de que a baixas

temperaturas a raiz da taxa de crescimento é linear com a temperatura (RATKOWSKY

et al., 1982). Para descrever a influência das temperaturas mínima e máxima sobre o

crescimento microbiano, entretanto, um modelo de Ratkowsky expandido (equação b)

é empregado (ZWIETERING et al., 1991), onde:

- µ𝑚𝑎𝑥 = taxa máxima de crescimento

- b = parâmetro de Ratkowsky para temperatura mínima

- T = temperatura do meio de cultura

- 𝑇𝑚𝑖𝑛 = temperatura mínima de crescimento do microorganismo

- c = parâmetro de Ratkowsky para temperatura máxima

- 𝑇𝑚𝑎𝑥 = temperatura máxima de crescimento do microorganismo


26

6. RESULTADOS

Os resultados da curva de calibração entre densidade ótica a 600 nm (DO600nm)

e biomassa (g/L) foram os seguintes:

Tabela 2. Concentração de celular de P. pentosaceus cultivado em meio de cultivo MRS. Resultados obtidos através das análises de biomassa por densidade ótica a 600 nm.

Diluição 1 2 3 Média D.O. Membrana*

(g) Peso (g)

Biomassa (g)

Biomassa (g/L)

S/dil 2.187 2.187 2.187 2.187 0.1251 0.1429 0.0178 1.7800

1/5 1.428 1.428 1.428 1.428 0.1246 0.1293 0.0047 0.4700

1/6 1.234 1.234 1.240 1.236 0.1285 0.1323 0.0038 0.3800

1/7 1.126 1.135 1.135 1.132 0.1295 0.1323 0.0028 0.2800

1/8 1.014 1.014 1.006 1.011 0.1300 0.1320 0.0020 0.2000

1/9 0.891 0.897 0.909 0.899 0.1295 0.1309 0.0014 0.1400

1/30 0.478 0.450 0.455 0.461 0.1291 0.1297 0.0006 0.0600

*massa da membrana de filtração: porosidade 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, USA)

Figura 10. Curva de calibração correlacionando densidade ótica a 600 nm e biomassa (g/L).

Desse modo a equação da curva de calibração usada para os experimentos

foi:

y = 3.283x + 0.2692R² = 0.9974

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

D.O

. (6

00

nm

)

Biomassa (g/L)

Curva de calibração


27

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔

𝐿) = 3,283𝐷𝑂600𝑛𝑚 + 0,2692

Comparação de dados de massa seca com massa calculada no anexo ao fim

do trabalho (tabela 3).

Com base nos procedimentos de cultivo e análises de crescimento celular,

monitoramento de pH e determinação de açúcares e ácido lático descritos foram

obtidos os seguintes resultados:

Tabela 4. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado* em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.

Média das amostras (g/L)

Tempo (h) D.O. Massa (g/L) pH Glicose Frutose Lactato

0 0,07 0,00 6,65 15,06 1,83 0,68

2 0,18 0,00 6,47 14,93 1,75 0,79

4 0,55 0,00 6,13 14,28 1,74 1,12

6 2,35 0,45 5,34 12,59 1,66 2,73

8 4,09 0,98 4,89 10,80 1,56 4,54

10 4,57 1,12 4,71 10,39 1,51 5,99

12 5,36 1,36 4,57 9,60 1,51 6,73

24 9,44 2,61 4,11 5,66 1,16 9,23

48 7,03 1,87 3,94 2,23 1,01 11,08 *Condições de cultivo: pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C

Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 11). Tabela 5. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado* em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.


Tempo (h) D.O. Massa (g/L) pH Glicose Frutose Lactato

0 0,093 0,00 5,00 18,63 0,79 0,62

2 0,104 0,00 4,97 18,15 0,76 0,62

4 0,127 0,00 4,96 18,09 0,76 0,67

6 0,229 0,00 4,94 17,66 0,72 0,78

8 0,392 0,00 4,89 17,28 0,69 1,06

10 0,812 0,00 4,78 16,76 0,61 1,60

12 1,927 0,32 4,54 15,85 0,15 2,67

24 9,130 2,51 3,82 6,99 0,12 5,35

48 8,317 2,26 3,55 5,94 0,00 9,70

*Condições de cultivo: pH 5,0; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C

Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 12).


28

Tabela 6. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E1*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.


Tempo (h) D.O. Massa (g/L) Média

pH Glicose Frutose Lactato

0 0,143 0,00 4,10 21,51 5,36 0,68

2 0,172 0,00 4,11 21,06 5,34 0,68

4 0,201 0,00 4,16 21,92 5,33 0,89

6 0,262 0,00 4,07 20,96 5,29 0,93

8 0,318 0,00 4,05 20,98 5,21 1,03

10 0,428 0,00 4,11 20,97 5,23 1,15

12 0,576 0,00 4,06 20,32 4,98 2,02

24 1,375 0,15 3,85 19,10 4,66 2,45

48 4,510 1,10 3,69 17,28 4,31 5,18

* Condições de cultivo: pH 5,0; Inulina 0,5%; 50 rpm; 25⁰C

Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 13). Tabela 7. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E3*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.




0 0,057 0,00 4,10 21,51 5,36 0,68

2 0,088 0,00 4,10 21,06 5,34 0,68

4 0,149 0,00 4,10 21,92 5,33 0,89

6 0,224 0,00 4,08 20,96 5,29 0,93

8 0,286 0,00 4,04 20,98 5,21 1,03

10 0,410 0,00 4,09 20,97 5,23 1,15

12 0,598 0,00 4,05 20,32 4,98 2,02

24 1,355 0,14 3,83 19,10 4,66 2,45

48 3,763 0,88 3,64 17,28 4,31 5,18


Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 14). Tabela 8. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E3’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.




0 0,092 0,00 4,10 25,95 13,59 0,67

2 0,105 0,00 4,10 26,05 13,71 0,66


29

4 0,129 0,00 4,10 26,18 13,83 0,69

6 0,129 0,00 4,10 24,96 12,98 0,68

8 0,145 0,00 4,10 26,28 13,92 0,74

10 0,171 0,00 4,10 24,21 12,59 0,71

12 0,208 0,00 4,10 25,70 13,57 0,77

24 0,262 0,00 4,07 25,63 13,55 1,06

48 0,672 0,00 3,97 25,44 13,67 1,60






0 0,164 0,00 4,00 20,81 4,57 0,67

2 0,079 0,00 4,00 20,78 4,53 0,67

4 0,071 0,00 4,00 21,19 4,52 0,71

6 0,104 0,00 4,00 20,81 4,52 0,76

8 0,112 0,00 4,00 20,64 4,51 0,75

10 0,109 0,00 4,00 20,58 4,50 0,77

12 0,001 0,00 4,00 20,39 4,42 0,69

24 0,157 0,00 4,00 20,86 4,79 0,83

48 0,379 0,00 4,00 19,52 4,42 1,21


Tabela 10. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E5’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.




0 0,085 0,00 4,08 20,27 5,44 0,63

2 0,126 0,00 4,08 18,94 2,55 0,67

4 0,165 0,00 4,09 20,23 5,43 0,72

6 0,198 0,00 4,06 19,61 5,26 0,74

8 0,207 0,00 4,08 20,32 5,45 0,87

10 0,215 0,00 4,11 20,15 5,34 0,83

12 0,220 0,00 4,07 19,95 5,18 0,76

24 0,252 0,00 4,05 19,70 5,14 0,84

48 0,289 0,00 4,02 18,73 4,98 0,81




30




0 0,083 0,00 4,00 28,36 12,50 0,64

2 0,098 0,00 4,00 27,38 12,36 0,64

4 0,092 0,00 4,00 27,33 11,99 0,67

6 0,142 0,00 4,00 26,99 11,84 0,67

8 0,106 0,00 4,00 26,27 11,44 0,69

10 0,106 0,00 4,00 28,02 12,29 0,69

12 0,119 0,00 4,00 28,35 13,09 0,66

24 0,135 0,00 4,00 28,30 13,09 0,80

48 0,292 0,00 4,00 27,71 12,62 1,07






0 0,054 0,00 5,80 19,51 2,49 0,65

2 0,076 0,00 5,80 21,25 2,82 0,65

4 0,295 0,00 5,71 20,84 2,77 0,86

6 1,383 0,15 5,14 19,40 2,76 2,35

8 4,702 1,16 4,57 16,29 2,60 4,64

10 5,139 1,30 4,33 14,44 2,47 5,48

12 5,613 1,44 4,20 13,71 2,39 5,88

24 7,635 2,06 4,06 11,74 2,25 7,78

48 6,269 1,64 3,99 11,14 2,33 8,21






0 0,029 0,00 5,80 28,37 6,29 0,67

2 0,051 0,00 5,80 28,18 6,15 0,70

4 0,256 0,00 5,69 28,08 6,13 0,94

6 1,311 0,13 5,08 26,39 6,01 2,54

8 4,638 1,14 4,57 23,70 6,05 4,78

10 4,931 1,23 4,30 21,16 5,75 5,89


31

12 5,245 1,33 4,18 18,74 5,50 6,55

24 6,764 1,79 4,08 18,46 5,54 7,42

48 6,083 1,58 4,06 17,98 5,42 8,23


Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 16). Tabela 14. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E4’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.

E4': pH 6,0; Inulina 1,5%; 50 rpm; 25oC




0 0,061 0,00 5,89 31,91 7,00 0,76

2 0,077 0,00 5,89 31,13 6,80 0,77

4 0,136 0,00 5,83 30,99 6,86 0,87

6 0,373 0,00 5,71 29,78 6,66 1,11

8 1,067 0,06 5,35 28,82 6,70 2,16

10 3,268 0,73 4,90 26,17 6,42 3,60

12 4,427 1,08 4,70 24,98 6,27 4,32

24 6,946 1,85 4,16 20,48 6,10 7,78

48 6,776 1,79 3,98 16,32 5,95 9,76






0 0,060 0,00 5,79 19,10 3,06 0,61

2 0,077 0,00 5,78 20,51 3,19 0,65

4 0,227 0,00 5,68 20,48 3,33 0,83

6 0,856 0,00 5,33 20,19 3,34 1,68

8 3,027 0,65 4,84 19,29 2,89 3,82

10 5,088 1,28 4,54 17,49 2,84 5,88

12 5,728 1,48 4,36 14,79 2,37 6,74

24 7,687 2,07 4,07 10,80 2,36 9,21

48 6,576 1,73 4,00 9,62 2,25 9,28




32

Tabela 16. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo E6’*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.




0 0,081 0,00 5,85 18,83 2,48 0,60

2 0,117 0,00 5,82 20,11 5,26 0,65

4 0,407 0,00 5,70 18,53 2,46 0,91

6 1,125 0,07 5,30 17,24 2,37 1,75

8 3,570 0,82 4,93 16,02 2,39 3,22

10 4,632 1,14 4,67 14,67 2,13 4,33

12 5,395 1,37 4,50 13,91 2,04 5,11

24 8,316 2,26 4,16 9,48 1,89 7,75

48 7,699 2,08 3,97 6,88 1,99 8,96






0 0,041 0,00 5,77 32,80 8,10 0,83

2 0,050 0,00 5,77 31,84 7,72 0,75

4 0,194 0,00 5,72 30,14 7,55 0,96

6 0,805 0,00 5,33 28,68 7,29 1,71

8 2,802 0,58 4,83 27,07 7,17 3,70

10 4,846 1,21 4,54 25,63 6,61 5,17

12 5,467 1,40 4,36 22,74 5,87 5,84

24 7,310 1,96 4,08 19,95 5,93 8,21

48 6,384 1,68 4,00 19,41 5,58 8,54


Determinação da regressão linear da fase exponencial para determinação de µmax no anexo ao fim deste trabalho (figura 20). Tabela 18. Crescimento celular de P. pentosaceus cultivado (cultivo Ce*) em meio de cultivo MRS, concentração de glicose, frutose e lactato.




0 0,109 0,00 4,99 24,39 5,84 0,67

2 0,226 0,00 4,97 24,02 5,66 0,79

4 0,577 0,00 4,83 24,98 7,25 1,12


33

6 1,197 0,10 4,65 22,90 5,45 1,94

8 3,243 0,72 4,41 21,97 5,33 2,92

10 4,755 1,18 4,29 21,22 4,54 3,95

12 5,763 1,49 4,18 20,04 4,33 4,68

24 7,553 2,03 4,05 18,60 4,08 5,91

48 6,872 1,82 3,96 16,88 4,06 6,50



6.1. Análise da dinâmica de crescimento microbiano

Com base nos dados experimentais de crescimento celular de P.pentosaceus

em função do tempo foi feita análise da dinâmica de crescimento microbiano.

O crescimento da biomassa microbiana nas condições de pH 6,5; Inulina 0%;

100 rpm; 30⁰C (Tabela 4), como mostra a figura 11, segue um padrão polinomial.

Figura 22. Concentração de biomassa (g/L) obtida em meio de cultivo MRS (pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C).

A mesma constatação pode ser feita para o crescimento da concentração de

lactato pelo tempo, como mostra a figura 12.

y = -7E-05x3 + 0.0021x2 + 0.1091x - 0.1754R² = 0.9751

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Bio

mas

sa (

g/L)

Tempo de fermentação (h)

Tg = 2,83 h


34

Figura 23. Concentração de lactato (g/L) obtida em meio de cultivo MRS (pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C) com equação de regressão calculada, feito no Excel 2016.

Em ambos os gráficos é observado um máximo alcançado em tempo próximo

a 35h de fermentação. Neste tempo de fermentação são obtidos os seguintes valores

máximos de biomassa e concentração de lactato através das equações de regressão:

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 = −7 ∗ 10−5𝑡3 + 0,0021𝑡2 + 0,1091𝑡 − 0,1754

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑚𝑎𝑥 = −7 ∗ 10−5353 + 0,0021 ∗ 352 + 0,1091 ∗ 35 − 0,1754 = 3, 21𝑔/𝐿

[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜] = 9 ∗ 10−5𝑡3 − 0,0134𝑡2 + 0,68𝑡 − 0,2398

[𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜]𝑚𝑎𝑥 = 9 ∗ 10−5353 − 0,0134 ∗ 352 + 0,68 ∗ 35 − 0,2398 = 11,00𝑔/𝐿

A análise da curva de crescimento microbiano também é importante para a

determinação da fase exponencial, essencial na determinação da taxa de crescimento

microbiano máxima (µmax). Através da curva de crescimento do cultivo utilizando MRS

(pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30°C) foi determinado que a fase exponencial se situa

entre 4 e 8h de fermentação. Com base nisso foi feita análise da reta tangente à curva

exponencial por regressão linear, como mostra a figura 11, para determinação de µmax,

a qual é igual à inclinação da reta.

y = 9E-05x3 - 0.0134x2 + 0.68x - 0.2398R² = 0.9687

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

[Lac

tato

] (g

/L)

Tempo de fermentação (h)

Tg = 2,83 h


35

Figura 11. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax).

Com a equação da reta determinada para a tangente da fase exponencial, foi

estimada a latência (𝑡𝐿𝐴𝐺) do cultivo como sendo o tempo em que a tangente da

inflexão cruza com o eixo, ou seja, o tempo em que 𝑚 = 0 para a tangente de µ =

µ𝑚𝑎𝑥:

0 = µmax ∗ t𝐿𝐴𝐺 + b

t𝐿𝐴𝐺 = −𝑏

µmax

Com base na equação linear da fase exponencial, portanto, é possível se

identificar a µmax e b, calculando-se assim a latência (t𝐿𝐴𝐺).

No exemplo do cultivo nas condições de pH 6,5; Inulina 0%; 100 rpm; 30⁰C, o

valor de t𝐿𝐴𝐺 = −−0,9933

0,245= 4,05ℎ

Os valores de µmax e t𝐿𝐴𝐺 para cada cultivo são mostrados na tabela 18.

Tabela 18. Planejamento experimental e resultados dos parâmetros de crescimento dos cultivos.

Condições de cultivo Parâmetros*

Ensaios pH Conc. Inulina (%) Agit. (rpm) Temp. (°C) µmax (h-1) t LAG (h)

MRS 6,5 0,0 100 30 0,24 4,05

C 5,0 0,0 100 30 0,18 10,10

y = 0.245x - 0.9933R² = 0.9978

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10

pH=6,5; 100rpm; 0% inulina; 30oC


36

E1 4,0 0,5 50 25 0,04 20,20

E2 6,0 0,5 50 35 0,24 4,34

E3 4,0 1,5 50 25 0,03 19,48

E3' 4,0 1,5 50 35 0,00 -

E4 6,0 1,5 50 35 0,24 4,34

E4' 6,0 1,5 50 25 0,26 7,56

E5 4,0 0,5 150 25 0,00 -

E5' 4,0 0,5 150 35 0,00 -

E6 6,0 0,5 150 35 0,32 5,99

E6' 6,0 0,5 150 25 0,38 5,81

E7 4,0 1,5 150 25 0,00 -

E8 6,0 1,5 150 35 0,30 6,03

Ce 5,0 1,0 100 30 0,27 5,53

* µmax calculada a partir da inclinação da tangente na fase exponencial com Excel 2016 (figuras 11 a 20)

𝐭𝑳𝑨𝑮 calculada a partir da equação 𝐭𝑳𝑨𝑮 = −𝒃

µ𝐦𝐚𝐱 com base na equação de regressão na fase

exponencial

Após determinação de µmax e t𝐿𝐴𝐺, o modelo de Gompertz torna-se interessante

para estimar matematicamente o valor de biomassa máxima:

log𝑒N(t) = log𝑒No +Nmax

Noe

{𝑒[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]

}

𝑁𝑚𝑎𝑥 =(𝑙𝑛𝑁 − 𝑙𝑛𝑁𝑜)𝑁𝑜

e{𝑒

[−µ(t−t𝑖𝑛𝑓)]}

O modelo, porém, depende do valor da biomassa inicial, a qual não é conhecida

no experimento (inóculo inicial foi feito em função de UFC/mL) e do tempo de inflexão,

ou seja, o tempo onde µ = µ𝑚𝑎𝑥 . A estimativa dos valores leva a grande incerteza

no valor calculado, como demonstrado na equação a seguir feita com 𝑁𝑜 = 0,01𝑔/𝐿

e 𝑡𝑖𝑛𝑓 = 5ℎ.

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑚𝑎𝑥 =(𝑙𝑛0,98 − 𝑙𝑛0,01)0,01

e{𝑒[−0,245(8−5)]}= 0,028𝑔/𝐿

Como observado, o valor de biomassa máxima obtido por esse método é muito

baixo e, portanto, inadequado para o estudo.

O modelo de crescimento de Gompertz, portanto, não pôde ser aplicado à

curva de crescimento experimental de P.pentosaceus, devido à ausência de

informações sobre a biomassa inicial e tempo de inflexão da curva sigmoidal, não


37

sendo assim possível analisar se este modelo reflete o crescimento da espécie nas

condições estudadas, no entanto, os parâmetros determinados (µmax e t𝐿𝐴𝐺) podem

ser usados conjuntamente aos de biomassa para análise da influência dos fatores de

cultivo sobre o crescimento microbiano.

6.2. Análise dos fatores de influência no crescimento microbiano

Foi feita uma análise do ponto final (𝑡 = 48ℎ) de cada cultivo para se analisar a

influência dos parâmetros no crescimento microbiano.

Inicialmente foi feita, com base nas tabelas 18 e 19, análise entre os diferentes

cultivos. Nesta é verificada que no ensaio denominado MRS (pH=6,5; Inulina=0%;

Agit=100rpm; T=30oC) obteve-se a menor latência (4,05h) e alto µmax (0,24h-1),

enquanto o ensaio C (pH=5,0; Inulina=0%; Agit=100rpm; T=30oC) obteve a maior

produção de biomassa (2,26g/L) e menor pH a 48h (3,55). Ambos os ensaios também

foram os com maior produção de lactato a 48h (10,40g/L e 9,08g/L, respectivamente).

Estes ensaios diferem apenas no pH inicial, levando esta condição de cultivo a ser a

primeira analisada.

Tabela 19. Valores de biomassa, pH, concentração de glicose, frutose e lactato em 48 de cultivo.

Condições de cultivo Resultados em t=48h

Ensaio pH Conc.

Inulina (%)

Agit. (rpm)

Temp. (°C)

Biomassa (g/L)

pH Consumo de glicose

(g/L)*

Consumo de frutose

(g/L)*

Produção de lactato

(g/L)*

MRS 6,5 0,0 100 30 1,87 3,94 12,84 0,82 10,40

C 5,0 0,0 100 30 2,26 3,55 12,69 0,79 9,08

E1 4,0 0,5 50 25 1,10 3,69 4,23 1,05 4,51

E2 6,0 0,5 50 35 1,64 3,99 8,37 0,16 7,57

E3 4,0 1,5 50 25 0,88 3,64 4,23 1,05 4,51

E3' 4,0 1,5 50 35 0,00 3,97 0,50 0,07 0,93

E4 6,0 1,5 50 35 1,58 4,06 10,39 0,87 7,57

E4' 6,0 1,5 50 25 1,79 3,98 15,59 1,05 9,00

E5 4,0 0,5 150 25 0,00 4,00 1,29 0,15 0,54

E5' 4,0 0,5 150 35 0,00 4,02 1,54 0,47 0,18

E6 6,0 0,5 150 35 1,73 4,00 9,48 0,81 8,67

E6' 6,0 0,5 150 25 2,08 3,97 11,95 0,49 8,36

E7 4,0 1,5 150 25 0,00 4,00 0,65 0,12 0,43

E8 6,0 1,5 150 35 1,68 4,00 13,40 2,53 7,71

Ce 5,0 1,0 100 30 1,82 3,96 7,51 1,78 5,83


38

* consumo de glicose e frutose e produção de lactato foram calculados pela diferença entre a concentração final e inicial destes, em módulo.

A Tabela 19 mostrou que a cepa P. pentosaceus obteve um crescimento celular

em 𝑝𝐻 = 4,0 baixo, chegando a valores de biomassa em 48h entre 0,00 e 1,10 g/L.

Estes valores são inferiores aos obtidos em 𝑝𝐻 = 6,0 onde foram obtidos valores de

biomassa em 48h entre 1,58 e 2,08g/L. Isto entra de acordo com a literatura, onde

consta que as condições ideais de cultivo de Pediococcus pentosaceus são em pH

entre 4,5 e 8,0 (CAI et al., 1999).

Este padrão foi expresso pela análise de regressão dos fatores ligados à

biomassa a 48h feita com o software Minitab 17 (com base nos dados da tabela 19)

obtendo a seguinte equação:

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔

𝐿) = −26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²

R² = 0,8369

R² (aj.) = 0,8097

R² (pred) = 0,7411

Esta equação mostra que a biomassa obtida após 48h de cultivo é dependente

apenas do pH. Além disso, há um valor máximo de biomassa, como mostra a figura

24 (tabela 20 no anexo apresenta resultados numéricos para melhor visualização), de

2,16g/L em 𝑝𝐻 = 5,4. Este pH é próximo ao 𝑝𝐻 = 5,5 considerado ideal no cultivo de

P.pentosaceus (CAI et al., 1999; COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014).


39

Figura 24. Gráfico de linha representando a relação entre biomassa (g/L) e pH proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.

O efeito da temperatura na biomassa a 48h, entretanto, não é tão expressiva,

como mostra a tabela 21, sendo em média 12% maior a 25⁰C em relação a 35oC.

Deste modo a ausência da temperatura como fator determinante na análise de

regressão se dá por seu consideravelmente menor efeito sobre os valores de

biomassa.

Tabela 21. Valores de biomassa a 48h a 25⁰C ou 35⁰C para cada condição de cultivo (pH, agitação e %inulina).

Biomassa a 48h (g/L)

pH Agit (rpm) Inulina (%) 25⁰C 35⁰C

4,0 50 1,5 0,88 0,00

4,0 150 0,5 0,00 0,00

6,0 50 1,5 1,79 1,58

6,0 150 0,5 2,08 1,73

Por outro lado, a taxa de crescimento máxima (µmax) não demonstra a mesma

simplicidade que a biomassa. Através de análise de regressão via Minitab 17 (feita

com base nos dados da tabela 18) obtém-se a seguinte equação:

𝜇max (ℎ−1) = −2,189 + 0,976𝑝𝐻 − 0,002500𝐴𝑔𝑖𝑡 − 0,0799𝑝𝐻2 + 0,000567𝑝𝐻𝐴𝑔𝑖𝑡

R² = 0,9638

6,05,55,04,54,0

2,0

1,5

1,0

0,5

pH

Méd

ia d

e B

iom

ass

a

(g/L

)

Gráfico de Efeitos Principais para Biomassa (g/L)Médias Ajustadas


40

R² adj = 0,9493

R² pred = 0,8982

De acordo com a equação supracitada, a velocidade de crescimento é

dependente do pH e agitação.

Figura 25. Gráfico de contorno representando a relação entre µmax, agitação e pH proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.

Na Figura 25, que representa a equação acima, se verifica que dentro dos

valores estudados, a influência de ambos os valores na taxa de crescimento é positiva,

ou seja, quanto maior o pH e agitação, maior a taxa de crescimento de P.

pentosaceus.

Isto reflete parcialmente o modelo de Presser, que diz que a taxa de

crescimento é mais próxima do ideal em pH médio entre os limites de crescimento do

micro-organismo em questão. No caso de P. pentosaceus, como mostra a figura 26,

os valores de pH mínimo e máximo de crescimento são 4,5 e 8,0 respectivamente,

levando a um pH ótimo entre 6,0 e 6,5. Isso se aproxima de dados da literatura, que

sugerem um pH ideal de cultivo de P. pentosaceus igual a 5,5 (CAI et al., 1999).

pH

Ag

it

6,05,55,04,54,0

150

125

100

75

50

>

–

–

–

–

–

–

< 0,00

0,00 0,05

0,05 0,10

0,10 0,15

0,15 0,20

0,20 0,25

0,25 0,30

0,30

(h-1)

µmax

Gráfico de Contorno de µmax (h-1) versus Agit; pH


41

Figura 26. Gráfico de µ𝒎𝒂𝒙/µ𝒐𝒑𝒕 por pH segundo a equação de Presser, feito pelo

software MatLABs R2015a usando pHmin=4,5 e pHmax=8,0.

Em relação à agitação individualmente, obtém-se uma relação linear entre esta

e a taxa de crescimento (µmax) (figura 27), com maiores agitações conseguindo

maiores taxas.


42

Figura 27. Gráfico da relação entre µmax e agitação em meio de pH=5,5, feiµto pelo software MATLAB R2015a.

Já a ausência da temperatura como variável na análise de regressão pode ser

analisada através da equação expandida de Ratkowsky. Considerando a temperatura

máxima de crescimento de P. pentosaceus como 40ºC e a mínima como 3oC,

temperatura mínima demonstrada para LABs em cultura líquida (VALÍK;

MEDVED’OVÁ; LIPTÁKOVÁ, 2008) foi obtido o gráfico da figura 28. Os parâmetros

de Ratkowsky usados foram 𝑏 = 0.025 e 𝑐 = 0.180, valores derivados de estudos com

L. rhamnosus (VALÍK; MEDVED’OVÁ; LIPTÁKOVÁ, 2008).

Figura 28. Gráfico de temperatura (oC) por velocidade de crescimento (𝒈

𝑳∗𝒉), segundo

a equação expandida de Ratkowsky, feito pelo software MATLAB R2015a usando Tmin=3,0oC e Tmax=40oC.

Segundo resultados do modelo de Ratkowsky há grande influência da

temperatura na taxa de crescimento microbiano nos valores de cultivo do estudo

(considerando b = 0,025 e c = 0,180), já que o valor de µmax para 35⁰C, segundo o

modelo, é 35% maior que a 25⁰C. No entanto, isso não é visto no estudo. Este fato

pode ser explicado devido a limitações no modelo adotado pelo uso de valores de

constantes não específicas ao microorganismo do estudo devido a limitadas

informações para P. pentosaceus.

A latência (𝑡𝐿𝐴𝐺) foi analisada através de análise de regressão via Minitab 17

em relação as condições de cultivo (com base nos dados da tabela 18), chegando na

seguinte equação:

𝑡𝐿𝐴𝐺(ℎ) = 42.41 − 6.167𝑝𝐻


43

R² = 0,8297

R² adj = 0,8107

R² pred = 0,7382

Esta equação mostra que a latência dos cultivos depende, dentro dos valores

de cultivo do estudo, exclusivamente do pH. Como pode ser visto na figura 29, a

latência, ou seja, o tempo até atingir a fase exponencial, é menor para maiores valores

de pH.

Figura 29. Gráfico de linha representando a relação entre 𝒕𝑳𝑨𝑮(h) e pH proveniente

de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software Minitab 17.

A produção total de lactato, maior produto do cultivo de P. pentosaceus, foi

analisada por regressão segundo as condições de cultivo, assim como em relação à

biomassa total via Minitab 17 (com base nos dados da tabela 19) obtendo-se a

seguinte equação:

𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢çã𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 (𝑔

𝐿) = 0,595 + 4,142𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎

R² = 0,9235

R² adj = 0,9176

R² pred = 0,9030


44

Esta equação se destaca por não mostrar relação entre qualquer das condições

de cultivo e a produção de lactato. A relação à biomassa obtida, entretanto, pode ser

analisada segundo o pH inicial de cultivo, como mostrado anteriormente, através da

equação:

𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔

𝐿) = −26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²

Usando das duas equações foi obtida a seguinte relação da produção de

lactato:


𝐿) = 0,595 + 4,142(−26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻2)


𝐿) = −4,105𝑝𝐻2 + 44,029𝑝𝐻 − 108,505

Esta equação mostra um máximo (figura 30), assim como a equação de

biomassa, em 𝑝𝐻 = 5,4, onde a produção de lactato a 48h é 9,55g/L.

Figura 30. Gráfico de linha representando a relação entre a produção de lactato (g/L) a 48h e pH inicial proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software MATLAB 2015a


45

Os consumos de glicose e frutose, principais fontes energéticas disponíveis no

cultivo, foram analisados por análise de regressão (dados do da tabela 19) via Minitab

17, obtendo-se as seguintes equações:

𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 (𝑔

𝐿) = −7,79 + 2,159𝑝𝐻 + 3,596𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎

R² = 0,8944

R² adj = 0,8768

R² pred = 0,8467

𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 (𝑔

𝐿) = −0,201 + 0,479𝐼𝑛𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎 + 0,488𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎

R² = 0,4031

R² adj = 0,3036

R² pred = 0,0891

Embora o modelo não seja suficientemente preditivo para o consumo de

frutose, é possível ver um maior consumo de frutose em presença de maior

concentração de inulina, um frutano.

No caso do consumo de glicose, este é demonstrado como baseado no pH

inicial e biomassa a 48h do cultivo. Considerando-se a biomassa a 48h de cultivo como

referente ao pH inicial do cultivo (segundo a equação 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔

𝐿) = −26,34 +

10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻²), pode-se chegar a seguinte equação:


𝐿) = −7,79 + 2,159𝑝𝐻 + 3,596(−26,34 + 10,63𝑝𝐻 − 0,991𝑝𝐻2)


𝐿) = −102,51 + 40,38𝑝𝐻 − 3,56𝑝𝐻²

Conforme esta equação e a figura 31, o consumo de glicose a 48h de cultivo

possui um máximo em pH = 5,7 onde Consumo de glicose = 12,00g/L.


46

Figura 31. Gráfico de linha representando a relação entre a consumo de glicose (g/L) a 48h e pH inicial proveniente de análise de regressão dos dados dos cultivos, feito no software MATLAB 2015ª Tabela 22. Tabela comparativa dos valores de biomassa, consumo de glicose e produção de lactato a 48h, latência e taxa de crescimento máximo (µmax) por pH inicial de cultivo relativo aos valores obtidos para pH = 5,5 (considerado ideal na literatura), de acordo com as análises de regressão obtidas. Valores destacados em uma escala de menor valor (vermelho) para maior valor (verde).

pH Biomassa

(g/L)

Consumo de glicose

(g/L)

Produção de lactato

(g/L)

Latência (h)

µmax (h-1)

4,0 15% 17% 20% 209% 50%

4,1 27% 27% 32% 202% 55%

4,2 38% 36% 42% 194% 59%

4,3 49% 45% 52% 187% 64%

4,4 58% 52% 61% 180% 68%

4,5 66% 60% 69% 173% 72%

4,6 74% 67% 76% 165% 75%

4,7 81% 73% 82% 158% 79%

4,8 86% 78% 87% 151% 82%

4,9 91% 83% 92% 144% 85%

5,0 95% 87% 95% 136% 88%

5,1 98% 91% 98% 129% 91%

5,2 100% 94% 100% 122% 94%


47

5,3 101% 97% 101% 115% 96%

5,4 101% 99% 101% 107% 98%

5,5 100% 100% 100% 100% 100%

5,6 98% 101% 98% 93% 102%

5,7 96% 101% 96% 85% 103%

5,8 92% 100% 93% 78% 105%

5,9 88% 99% 88% 71% 106%

6,0 82% 98% 83% 64% 107%

Com base nas equações de regressão foi possível se inferir que o fator de

maior impacto sobre o cultivo é o pH inicial, por afetar diretamente na biomassa,

consumo de glicose, produção de lactato, latência e taxa de crescimento máximo

(µmax).

Como mostra a tabela 22, o pH citado como ideal na literatura (CAI et al., 1999;

COSTER; WHITE, 1964; FRANZ et al., 2014) se aproxima dos valores com máximo

de biomassa (máximo em pH = 5,4), consumo de glicose (máximo em pH = 5,7) e

produção de lactato (máximo em pH = 5,4). No caso de latência e µmax, entretanto,

são obtidos melhores valores (menor latência e maior taxa de crescimento) com

maiores valores de pH.

Assim, é possível se concluir que a pH = 5,5 a bactéria P.pentosaceus fornece

ótima acidificação do meio (ideal para produção de alimentos fermentados), consumo

de glicose (para produção de alimentos de baixo teor calórico e/ou de carboidratos) e

alta biomassa final (interessante para a produção de probióticos). Em meios menos

ácidos (pH ≈ 6,0) o crescimento microbiano é mais rápido, embora menor. Isso pode

se dar por ser um meio de acidez tal a obter alta eficiência enzimática, porém menor

viabilidade celular para P.pentosaceus, levando a morte precoce de células.

Através dos cultivos não foi possível se identificar grande relação entre

temperatura e crescimento microbiano, embora cultivos a 25oC tenham obtido

ligeiramente maiores valores de biomassa final que cultivos a 35oC. Um maior número

de cultivos a diferentes temperaturas seria ideal para melhor averiguar a relação e sua

comparação com o modelo teórico de Ratkowsky (ZWIETERING et al., 1991). Através

deste modelo, entretanto, espera-se que com o aumento temperatura se observe um

aumento do crescimento microbiano (e, portanto, da biomassa final) por aumento da

eficiência enzimática e velocidade de reações químicas em geral, entretanto a partir


48

de uma temperatura máxima se observe morte celular, levando a declínio da biomassa

final.

A agitação do meio mostrou-se influenciar na biomassa final obtida, de modo a

se obter maiores valores em maior agitação (obtendo com 150rpm taxa de

crescimento cerca de 10% maior que a 50rpm). Isso muito provavelmente se deve à

maior homogeneização do meio em maior agitação, causando um crescimento mais

regular e ideal. Embora não tenha sido obtido segundo as condições experimentais

um valor máximo de agitação, é esperado que em valores mais altos de agitação a

biomassa produzida seja prejudicada devido a morte microbiana por cisalhamento.

Um estudo com cultivos em maior agitação seria necessário para se averiguar um

valor ideal de agitação para o crescimento de P.pentosaceus.

Embora sugerida relação entre concentração inicial de inulina e o consumo de

frutose, não foi obtido nenhum modelo suficientemente preditivo para esta relação.

Sendo a inulina um polímero de frutose é de se esperar que a presença desta leve a

maior disponibilidade de frutose para consumo e a um maior crescimento microbiano.


49

7. CONCLUSÕES

Este estudo possibilitou se averiguar matematicamente a influência de diversos

fatores (pH, temperatura, %inulina e agitação) sobre parâmetros do crescimento

microbiano de P.pentosaceus . Mais especificamente, as análises de condições de

cultivo levaram a conclusão de que a produção de biomassa e lactato ideal, assim

como o consumo de glicose, se dá em pH inicial próximo a 5,5 enquanto que a taxa

de crescimento (µmax) ideal se dá em maiores valores de pH inicial, agitação e

temperatura (até próximo de 30oC). Do mesmo modo, a latência para o crescimento

exponencial é ideal em maiores valores de pH inicial. Estes resultados são

exemplificados pelos ensaios MRS (pH=6,5; Inulina=0%; Agit=100rpm; T=30oC), que

obteve a menor latência (4,05h) e alto µmax (0,24h-1), e ensaio C (pH=5,0; Inulina=0%;

Agit=100rpm; T=30oC), que obteve a maior produção de biomassa (2,26g/L) e menor

pH a 48h (3,55). Ambos os ensaios também foram os com maior produção de lactato

a 48h (10,40g/L e 9,08g/L, respectivamente).

O uso do modelo de Gompertz para a modelagem da cinética de crescimento

microbiano, no entanto, não foi possível devido a limitações em relação aos dados de

crescimento, do mesmo modo que o modelo de Ratkowsky, que não correspondeu

aos achados experimentais. Estes, entretanto, demonstraram a viabilidade de uso de

modelos teóricos de crescimento microbiano para predizer dados experimentais.

Embora posteriores estudos sejam necessários para confirmar as relações dos

modelos teóricos com os dados experimentais de crescimento de P.pentosaceus.


50

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58

ANEXO

Tabela 3. Concentração celular de P. pentosaceus cultivado em meio de cultivo MRS. Resultados obtidos através de pesagem da biomassa em comparação com biomassa calculada.

Biomassa (g/L)

Biomassa (g/L)

calculada

1.78 1.78

0.47 0.36

0.38 0.30

0.28 0.25

0.20 0.22

0.14 0.20

0.06 0.06


y = 0.245x - 0.9933R² = 0.9978

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10

pH=6,5; 100rpm; 0% inulina; 30oC

y = 0.1804x - 1.8229R² = 0.9998

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 5 10 15 20 25 30

pH=5,0; 100rpm; 0% inulina; 30°C


59




y = 0.0396x - 0.8R² = 1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 10 20 30 40 50 60

pH=4,0; 50rpm; 0,5% inulina; 25°C

y = 0.0308x - 0.6R² = 1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 10 20 30 40 50 60

pH=4,0; 50rpm; 1,5% inulina; 25°C


60



y = 0.2455x - 1.066R² = 0.8895

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12

pH=6,0; 50rpm; 0,5% inulina; 35°C

y = 0.235x - 1.02R² = 0.8718

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12

pH=6,0; 50rpm; 1,5% inulina; 35°C


61



y = 0.255x - 1.9267R² = 0.9682

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12 14

pH=6,0; 50rpm; 1,5% inulina; 25°C

y = 0.32x - 1.9167R² = 0.9999

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12

pH=6,0; 150rpm; 0,5% inulina; 35°C


62




63

Figura 21. Regressão linear do crescimento em fase exponencial do cultivo MRS para determinação da inclinação da reta (µmax). Tabela 20. Valores de biomassa a 48h por pH segundo análise de regressão com enfoque ao valor máximo de biomassa, feita pelo software Minitab 17.

pH Biomassa a 48h (g/L)

4.0 0.324

4.1 0.584

4.2 0.825

4.3 1.045

4.4 1.246

4.5 1.427

4.6 1.588

4.7 1.730

4.8 1.851

4.9 1.953

5.0 2.035

5.1 2.097

5.2 2.139

5.3 2.162

5.4 2.164

5.5 2.147

5.6 2.110

5.7 2.053

5.8 1.977

5.9 1.880

6.0 1.764

y = 0.27x - 1.4933R² = 0.9927

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 2 4 6 8 10 12

pH=5,0; 100rpm; 1,0% inulina; 30°C

trabalho de conclusão de curso · as bactérias ácido-láticas (labs) possuem histórica...

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