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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Avaliao dos polimorfismos do cido Delta-aminolevulnico desidratase

(ALAD) e Glutationa peroxidase (GPx) sobre estresse oxidativo em

trabalhadores ocupacionalmente expostos ao chumbo

Airton da Cunha Martins Junior

Ribeiro Preto

2014

RESUMO

MARTINS JUNIOR, A. C. Avaliao dos polimorfismos do cido Delta-aminolevulnico desidratase (ALAD) e Glutationa peroxidase (GPx) sobre estresse oxidativo em trabalhadores ocupacionalmente expostos ao chumbo. 2014. 61f. Dissertao (Mestrado). Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2014.

O chumbo (Pb) um metal altamente txico no qual os sinais de intoxicao variam bastante ao considerar as diferenas interindividuais. Um dos principais mecanismos de toxicidade do Pb ocorre pela inibio da enzima cido delta aminolevulnico desidratase (ALAD) no sistema hematopoitico. O Pb tambm desempenha um importante papel no desbalano do estado redox, pois sabe-se que ele tem o potencial de aumentar a concentrao de espcies reativas de oxignio (EROS) e inibir enzimas antioxidantes, como por exemplo a glutationa peroxidase (GPx). No entanto, poucos estudos avaliaram estes parmetros em populao ocupacionalmente exposta brasileira. Assim, o presente estudo, objetiva estudar a correlao entre as concentraes de Pb no sangue (Pb-S) de trabalhadores de fbricas de bateria e as atividades das enzimas ALAD e GPx associados com os polimorfismos genticos da ALAD e GPx. Para tal, foram utilizadas 278 amostras de sangue de trabalhadores expostos ao Pb. As determinaes de Pb foram realizadas por espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (ELAN DRCII Perkin- Elmer). As genotipagens dos polimorfismos genticos da ALAD e da GPx foram realizadas pela Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real e as atividades das enzimas ALAD e GPx foram determinadas no sangue por espectrofotometria de UV/VIS. A mdia da concentrao de Pb-S foi de 22,8 14,7 g/dL. Foram observadas correlaes negativas entre Pb-S e atividade da ALAD (rs -0,24 p0,05) e a concentrao de Pb-S. No foram observadas associaes entre o polimorfismo rs1800668 e a atividade de GPx (gentipo CT: -0,016 P>0,05; gentipo TT: -0,004 P>0,05). No entanto, foi constatada uma associao entre o gentipo ALAD 1-1 do polimorfismo rs1800435 e a atividade da enzima ALAD ( 3,5 P

INTRODUO

Concluso | 4

1 INTRODUO

1.1 O chumbo e seus efeitos sade

O chumbo (Pb) um metal abundante e amplamente distribudo na crosta

terrestre, sendo encontrado livre e em associao com outros elementos. Seu

nmero atmico 82, sua massa atmica, 207,21 e seu ponto de fuso, 337C. A

partir de 550C, h emisso de vapores, entrando em ebulio ao atingir cerca de

1,740C. Em associao com outros elementos, o metal origina compostos tais

como: sulfato de chumbo, arsenato de chumbo, dixido de chumbo, chumbo-

tetraetila, chumbo tetrametila, litargrio e zarco (CORDEIRO; LIMA-FILHO, 1995).

Desde a antiguidade o Pb fundido e utilizado na fabricao de armas e

utenslios domsticos como copos, taas e recipientes para armazenamento de

lquidos e alimentos, alm de utilizao em aquedutos e reservatrios para

fermentao e acondicionamento de bebidas alcolicas. Durante o Imprio Romano

foi utilizado na forma de xidos para a conservao e correo do sabor dos vinhos,

sendo este um hbito mantido por pequenas vincolas europeias at poucas

dcadas atrs. Alm disso, no sculo III a.C., os romanos utilizavam o metal para a

fabricao de canos e ainda hoje, esses canos de Pb continuam presentes em

casas mais antigas e outras edificaes erguidas antes de 1978. Atualmente, o Pb

usado como componente da manufatura da borracha, como ingrediente de tintas,

constituinte de vitrificados, esmaltes, vidros e, particularmente, muito utilizado em

fbricas de baterias (DE CAPITANI; PAOLIELLO; ALMEIDA, 2009).

O metal pode ser encontrado no ar, nos rios, lagos e oceanos, no solo e na

cadeia alimentar, portanto a exposio ambiental ao Pb pode ocorrer tanto pela

Concluso | 5

ingesto de alimentos contaminados, seja pela produo agrcola ou diretamente da

ingesto, os quais tendem a incorporar Pb em maior ou menor proporo

dependendo de variveis, como por exemplo, a forma qumica do metal, idade e

sexo (ATSDR, 2007; KELADA et al., 2001).

O Pb no desempenha nenhum papel fisiolgico conhecido no organismo e,

desta maneira, a exposio ao metal pode causar efeitos adversos em vrios

sistemas, tais como nervoso, renal, gastrintestinal, reprodutor, endcrino e

hematopoitico (FLORA; GUPTA; TIWARI., 2012). Os sinais e sintomas

ocasionados nas intoxicaes por Pb so inespecficos. Ainda que incomuns, as

intoxicaes agudas podem apresentar nuseas, dores abdominais, vmitos,

sensao adstringente pronunciada na boca e gosto metlico, as fezes podem

apresentar colorao negra em virtude da reao do Pb com compostos sulfurados

existentes nos gases intestinais. A intoxicao crnica, por outro lado, mais

comum e ocorre quando as concentraes do metal no sangue aproximam-se da

faixa de 40-60 g/dL, sendo caracterizada por vmito persistente, encefalopatia,

letargia, delrio, convulses e coma (FLORA et al., 2006; PEARCE, 2007). Esta

intoxicao por Pb denominada Saturnismo (Cordeiro, 1995).

1.2 Exposio ocupacional ao Pb no Brasil

Embora esteja bem estabelecido que a exposio ao Pb cause os diversos

efeitos adversos supracitados, a sua produo e consequente utilizao na indstria

vem aumentando. Em 2012, as reservas mundiais atingiram 89 Mt e as brasileiras

149 Mt, representando 0,17% da reserva global. A produo brasileira em 2012 de

concentrado de chumbo, em metal contido, foi de 8,9 Mt, representando 0,2% da

file:///D:/User/Desktop/Qualificao%20Airton%20%2030%2004%202013.doc%23_ENREF_3

Concluso | 6

produo mundial. O Brasil no tem produo primria de chumbo metlico refinado.

Toda a produo deste metal obtida a partir de reciclagem de material usado,

especialmente de baterias automotivas, industriais e de telecomunicaes. No

Brasil, as usinas refinadoras esto nas regies Nordeste (Pernambuco), Sul (Rio

Grande do Sul e Paran) e Sudeste (So Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais),

com uma capacidade instalada em torno de 160 Mt/ano. A produo secundria do

chumbo metlico, em 2012, foi de 165,4 Mt, um crescimento de 19,39% em relao

ao ano anterior, o que correspondeu a 17,05 milhes de novas baterias, em um

universo de 14,60 milhes de baterias vendidas para o mercado de reposio

(DNPM, 2013).

A exposio ao Pb caracterizada como ocupacional quando decorre da

utilizao do metal em alguma etapa no processo de trabalho (PAOLIELLO; DE

CAPITANI, 2007)Hipkins e colaboradores (1998) listaram mais de 200 atividades

envolvendo a exposio de trabalhadores ao Pb. No Brasil, a principal fonte de

exposio ocupacional ocorre nas fbricas de baterias automotivas, seguida das

indstrias de pigmento e o setor eletro-eletrnico (soldas e ligas) (DE CAPITANI;

PAOLIELLO; ALMEIDA, 2009).

Neste contexto, o Ministrio do Trabalho e Emprego do Governo Federal do

Brasil, estabeleceu diretrizes com o objetivo de minimizar os efeitos adversos

causados pela exposio ao metal. A Norma Regulamentadoras n 15 (NR-15.

Portaria MTb n 3.,214, de 08 de junho de 1978) estabeleceu os limites de tolerncia

em relao sua concentrao mxima no ambiente de trabalho, fixado em 100

g/m3 de ar (para jornadas de 48 horas semanais). Ainda, de acordo com a NR-15, a

exposio ao Pb em fbricas de baterias classificada como insalubridade de grau

mximo. J a Norma Regulamentadora n7 (NR-7. Portaria GM n, 3.214, de 08 de

Concluso | 7

junho de 1978, modificada pela Portaria SSST n. 24, de 29 de dezembro de 1994)

estabeleceu os bioindicadores de exposio e efeito, para monitoramento biolgico

dos trabalhadores expostos e so eles: concentraes de Pb no sangue (Pb-S) e do

cido delta-aminolevulnico urinrio (ALA-U), respectivamente. Alternativamente, a

determinao da zincoprotoporfirina no sangue (ZPP) tambm pode ser utilizada

como um indicador biolgico de efeito. Alm disso, a NR-7 estabeleceu os ndices

Biolgicos Mximos Permitidos (IBMP) em trabalhadores expostos ao metal, ou seja,

as concentraes mximas permitidas de Pb-S, ALA-U e ZPP: 60 g/dL, 10 mg/g de

creatinina e 100 g/dL, respectivamente. Ainda, a NR-7 apresenta os valores

denominados de referncia, levando em conta dados obtidos de populaes no

expostas ao Pb no ambiente de trabalho: at 40 g/dL de Pb-S, at 4,5 mg de ALA-

mg/g creatinina e at 40 g/dL de ZPP.

Para efeitos de comparao, os valores permissveis adotados nos Estados

Unidos, sob regulamentao da Administrao de Segurana e Sade Ocupacional

(OSHA, EUA), determina que o ambiente de trabalho no deva exceder a

concentrao de 30 g/m3 de ar; j em relao ao bioindicador de exposio, Pb-S,

as concentraes do metal no devem ultrapassar 40 g/dL; valores estes utilizados

como referncia em populaes brasileiras no expostas. A OSHA no estabelece

limites para concentraes de ALA-U e ZPP, uma vez que a relao entre a

exposio ao metal e as concentraes destes biomarcadores no esto muito bem

estabelecidas e podem apresentar amplas variaes. Comparando-se as

legislaes, um enorme contraste observado em relao aos limites das

concentraes de Pb no ambiente: como mencionado, no Brasil, a legislao

estabelece a concentrao de 100 g de Pb/m3; esta mesma concentrao, de

acordo com o Instituto Nacional de Segurana e Sade Ocupacional (NIOSH, EUA),

Concluso | 8

caracterizada como concentrao imediatamente perigosa vida ou sade. A

discrepncia entre estes dados demonstra a necessidade de uma reviso da

legislao brasileira, que se encontra defasada (a ltima atualizao a respeito foi

publicada em 1994).

Embora diversos estudos relacionados ao biomonitoramento e aos efeitos

txicos induzidos pela exposio ao Pb tenham sido conduzidos (BERGDAHL ;

SKERFVING, 2008; GARCIA-LESTON et al., 2012; GARCON et al., 2004), dados

referentes exposio e efeitos adversos em populaes brasileiras so escassos,

mas preocupantes, pois apontam para uma prevalncia de exposio relativamente

alta. Estudos realizados na cidade de Bauru, SP, entre 1985 e 1987 identificaram

seiscentos casos de saturnismo entre trabalhadores de fbricas de baterias

(CORDEIRO, 1988). O trabalho de Melo Mattos et al., (1994) estudou 1520

trabalhadores na regio metropolitana de Belo Horizonte e observou que 70%

tinham Pb acima de 40 g/dL e destes, 38% estavam acima de 60 g/dL. No estudo

realizado por Arajo et al., (1999) com trabalhadores de fbricas de baterias do setor

de montagem com mais de seis meses de exposio apresentaram concentraes

de Pb-S na faixa de 38-60 g/dL (mdia = 48 g/dL). Este resultado bastante

semelhante ao encontrado por Menegotto e Paoliello (2001), onde a mdia de Pb-S

foi de 45 g/dL. Em um trabalho prvio do nosso grupo, Silva (2008) relatou uma

mdia de 6,44 g/dL em populao exposta ambientalmente ao metal, prximos a

uma fbrica de bateria na cidade de Bauru-SP.

Em 2012, o Programa Nacional de Toxicologia (NTP, DHHS, EUA), publicou

uma srie de monografias demonstrando que h evidncias relacionadas aos efeitos

adversos sade em adultos com concentraes sanguneas de Pb menores que

10 g/dL (tais como aumento da presso arterial e tremor) e em crianas com

Concluso | 9

concentraes menores que 5,0 g/dL (efeitos renais e de desenvolvimento), o que

refora ainda mais a necessidade de uma ampla e constante reviso das legislaes

vigentes.

1.3 Toxicodinmica do Pb

Muitos so os mecanismos bioqumicos pelos quais o Pb exerce a sua

toxicidade em nvel celular e molecular. Sabe-se, por exemplo, que este pode afetar

um vasto conjunto de sistemas biolgicos, devido sua capacidade de mimetizar o

clcio nestes sistemas, devido semelhana bioqumica e biofsica, o que permite o

acesso do Pb a organelas crticas, como a mitocndria (BERNARD, 1999; FLORA;

2012).

Alm disso, o Pb possui grande afinidade pelos radicais COOH, NH2 e SH

(presentes em protenas estruturais, enzimas, sistemas de transporte e receptores),

com os quais forma ligaes estveis, podendo induzir alteraes na estrutura

proteica ou atividade enzimtica, (BERNARD, 1999; FLORA; 2012). Neste contexto,

o Pb interage com diversas enzimas, tais como as enzimas que participam da

sntese do grupo heme e enzimas que atuam como antioxidantes, como a glutationa

peroxidase (GURER et al., 2004; SUGAWARA et al., 1991 ONALAJA; CLAUDIO,

2000; KELADA et al., 2001)

1.3.1 Inibio da sntese do grupo heme

Um dos principais mecanismos de toxicidade do Pb ocorre pela inibio da

sntese do grupo heme. O Pb interfere com a sntese do heme pela inibio de trs

Concluso | 10

enzimas da sntese: a enzima cido delta-aminolevulnico desidratase (ALAD), a

coproporfirina oxidase e a ferroquelatase (WHO, 1995; OSHA, 2008; PAOLIELLO;

DE CAPITANI, 2007). A srie de reaes que conduzem a sntese do grupo heme

comea com a succinil coenzima A (CoA) e glicina, e termina com a insero de um

Fe2+ em uma molcula de protoporfirina. No primeiro passo da sntese do heme, a

enzima cido aminolevulnico sintase (ALA-S) catalisa a formao de ALA a partir

de glicina e succinil CoA dentro da matriz mitocondrial (RABINOWITZ, 1977, WHO,

1995). Posteriormente, a ALAD catalisa a formao de porfobilinognio a partir de

duas molculas de ALA. Por fim, no ciclo hematopoitico a enzima ferroquelatase

introduz ferro dentro da molcula de protoporfirina para formar o grupo heme (WHO,

1995; OSHA, 2008; PAOLIELLO; DE CAPITANI, 2007).

O Pb apresenta uma grande afinidade ao grupamento -SH da enzima ALAD,

inativando-a. Esta inibio resulta na reduo da sntese do grupo heme e

consequente acmulo de ALA, o que pode causar diversos danos hematolgicos

(DUYDU et al., 2001; FARANT ; WIGFIELD, 1982; HOFFMAN et al., 2000). Alm

disso, est bem estabelecido que o ALA, em altas concentraes, atua como um

pr-oxidante, causando tambm, distrbios no status redox dos indivduos

(PATRICK, 2006). Vale ressaltar, finalmente, que a inibio da ALAD pelo Pb

resulta em uma relao exponencial negativa entre ALAD e Pb no sangue perifrico

(ONALAJA; CLAUDIO, 2000).

Outra enzima que pode ser inibida a coproporfirina oxidase, que se

utilizando do coproporfirinognio III formado, gera o protoporfirinognio, atravs de

reaes onde dois grupos propinicos so descarboxilados em grupos vinlicos. A

inibio desta enzima resulta num aumento dos nveis coproporfirina na urina.

...

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