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Revista Granma Ciencia. Vol. 17, no. 1 enero - abril 2013

ISSN 1027-975X

Recibido: noviembre 2012. Aprobado: febrero 2013

Título: Presencia de Alternaria alternata (Fr) Keissler como agente causal de la mancha foliar en plantas de lechuga (Lactuca sativa, L.).

Title: Presence of Alternaria alternata (Fr) Keissler as causal agent of foliar spot on lettuce plants (Lactuca sativa L.).

Autores: Lilita Sueiro - Pelegrín1 Raquel Arévalo - Arévalo2 Dagoberto García - Fernández1 Ángel De Souza - Torres3 Elia Porras - León1 Instituciones: 1Centro de Investigaciones, Servicios y Tecnologías Ambientales de Granma (CISTAG), I.I.A.”Jorge Dimitrov”. Granma. Cuba. 2 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal, Granma. Cuba. 3Universidad de Granma. Carretera Bayamo - Manzanillo, Km. 17½. Apartado 21. Bayamo. Granma. Cuba. E-mail: [email protected]

RESUMEN

Se caracterizó el agente causal de la mancha foliar del cultivo de la lechuga, los síntomas que produce y su patogenicidad en aislamientos de cinco organopónicos del municipio Bayamo, provincia Granma. Para la caracterización del agente causal se realizaron determinaciones de la dimensión de los conidios (µm), esporulación y diámetro de las colonias del patógeno y la caracterización morfológica de las colonias. La evaluación de la patogenicidad se siguió con el desarrollo de los síntomas y el porcentaje de superficie foliar cubierta por las lesiones. Los resultados indican la presencia de Alternaria alternata (Fr) Keissler como agente causal de la mancha foliar de la lechuga, con una dimensión de sus conidios de 24.75±3.54 x 9.79±1.77, una esporulación entre 2.0 a 2.1 x 105 (conidios/placa Petri), sin diferencias significativas entre los aislamientos (p<0.05) y un crecimiento micelial entre 56.2 y 60.3 (mm). Los síntomas se desarrollaron a partir de las 24 h y hasta las 192 h, desde la presencia de puntos cloróticos, pasando por el desarrollo de manchas con anillos concéntricos hasta la presencia de manchas colapsadas en forma de tizón, cubriendo hasta un 30 % de la superficie de la hoja. Palabras clave: Alternaria alternata, mancha foliar, lechuga.

ABSTRACT

The causal agent of foliar spot of growing lettuce, symptoms that produce and its pathogenicity in five isolation nurseries, were characterized in Bayamo, Granma province. To characterize the causal agent conidial determinations were made of the

mailto:[email protected]


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conidial dimension (µm), sporulation and diameter of the pathogen colonies and colonies morphological characterization. The pathogenicity evaluation was followed with the symptoms development and the percentage foliating surface covered by lesions. The results indicate Alternaria alternata (Fr) Keissler presence as causal agent of lettuce leaf spot, with a conidial dimension of 24.75 ± 3.54 x 9.79 ± 1.77, a sporulation between 2.0 to 2.1 x 105 (conidial / pustule Petri), no significant differences between the isolations (p <0.05) and mycelial growth between 56.2 and 60.3 (mm). Symptoms were developed from 24 h to 192 h, from the chlorotic dots presence, passing by the development of spot with concentric rings until the stains presence of collapsed smut as covering up to 30% of the surface sheet.

Keywords: Alternaria alternata, foliating spot, lettuce.

INTRODUCCIÓN

La lechuga es un cultivo de gran importancia en Cuba pues ocupa un lugar primordial en la preferencia de la población, siendo una hortaliza que se cultiva de forma intensiva en sistema de producción de organopónicos y se encuentra disponible todo el año. Alternaria es un género fúngico muy común y ampliamente distribuido en el suelo y la materia orgánica en descomposición. Incluye numerosas especies que invaden los vegetales antes y después de la recolección y es responsable de considerables pérdidas económicas debido a que reduce el rendimiento de las cosechas. A. alternata es una de las especies fúngicas más frecuentemente implicadas en la podredumbre de las hortalizas, produciendo la mayoría de las micotoxinas descritas en este género (Pavón et al., 2009), también es un hongo oportunista y su presencia, en el cultivo de la lechuga, dependerá del estado nutricional de la planta. Las plantas débiles son más propensas al ataque de Alternaria y hay riesgo de infestación cuando las condiciones de humedad son altas (Theodoracopoulos et al., 2008). En algunos organopónicos del municipio Bayamo, vienen apareciendo en las hojas del cultivo de la lechuga, manchas color café oscuro con anillos concéntricos que deterioran su apariencia y hacen que disminuyan los rendimientos de este, aun sin una certeza del organismo que la produce (Vega, 2011). Por tanto, se propone como objetivo de esta investigación caracterizar el agente causal de la mancha foliar en el cultivo de la lechuga, en áreas productivas del municipio Bayamo, provincia Granma.

MATERAILES Y MÉTODOS Se colectaron plantas de lechuga, con manifestaciones de manchas foliares con más de 20 días de edad, en cinco organopónicos del municipio Bayamo, perteneciente a la provincia Granma, separando las hojas con síntomas, para un total de 30 muestras por organopónico. Las muestras fueron colocadas en bolsas plásticas humedecidas y


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fueron transportadas hasta el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal para la posterior identificación del agente causal. Los tejidos con síntomas de las hojas seleccionadas se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1 % durante 2 minutos, se colocaron en agua destilada estéril y se secaron con papel de filtro estéril. Luego se incubaron fragmentos de hojas sintomáticas de aproximadamente 2 cm, en cámara húmeda que contenía dos capas de papel de filtro, embebido con 5 ml de agua destilada estéril, durante 48 h, a temperatura de 28 ± 2 °C. Una vez que las lesiones de las hojas estaban esporuladas, se tomaron conidios de cada localidad por separado y se sembraron en placas Petri que contenían agar-agua (AA), de donde se obtuvieron cultivos monospóricos. Para la caracterización morfológica de las colonias se sembraron discos portadores del micelio de los 5 aislamientos, en placas Petri con medio Papa-Dextrosa-Agar (PDA), se ajustó el pH a 6.2 y las placas inoculadas se incubaron durante 10 días a una temperatura de 25 ± 1 °C (temperatura del laboratorio) y oscuridad constante. El experimento se dispuso en un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones por tratamiento (aislamiento). Se realizó la caracterización morfológica de las colonias (color, textura, exuberancia, formación de anillos y la profundidad del crecimiento) y se evaluó el crecimiento micelial (mm) de las colonias, la esporulación (conidios/placa Petri) y las dimensiones de los conidios (mµ). Para la identificación del hongo se hicieron montajes en lactofenol y las tinciones se realizaron con azul de algodón, realizándose observaciones y mediciones de conidios a partir de las lesiones esporuladas sobre el tejido vegetal y de conidios formado sobre el medio de cultivo. Para determinar las dimensiones de los conidios en las especies evaluadas se realizaron mediciones de largo y ancho a 50 conidios por localidad, a los cuales se les halló el promedio y la desviación estándar de los valores obtenidos. Para la identificación final del patógeno se utilizaron métodos de descripción taxonómica de hongos, mediante las características morfológicas observadas a partir de la clave de Barnett y Hunter (1972) para identificar el género y las claves de Rotem (1994) y Simmons (1967, 1995) para identificar la especie. Una vez identificado el patógeno se comprobaron sus síntomas en plantas de lechuga de la variedad Black Seeded Simpson (BSS), las cuales se sembraron en bandejas de polietileno expandido, con una mezcla esterilizada de tierra, humus de lombriz y zeolita de 2:1:1. A los 15 días se trasplantó una planta por bolsa de polietileno que contenía una mezcla de tierra, humus y aserrín con una proporción de 2:1:1. Las plantas se dispusieron en una casa de cultivo, protegida con malla antiáfido, con riego diario y previo a la inoculación se mantuvieron cubiertas con bolsas plásticas perforadas y mantenidas a la sombra por 48 h para acelerar la infección. El inóculo se preparó a partir del vertido de 10 ml de agua destilada estéril en cada placa que contenía cada


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uno de los aislamientos del cultivo del hongo, raspando la superficie de la colonia con un pincel para el desprendimiento de los conidios, obteniéndose una suspensión que se filtró a través de cuatro capas de gasa estéril para eliminar los restos de micelio, luego se mezclaron 500 ml de la suspensión de conidios que contenía cada uno de los cinco aislamientos y se determinó la concentración de estos utilizando una cámara de Neubauer, ajustándose a 105 conidios/ml. Se agregó, como agente tensoactivo, una gota de Tween 80 por cada 100 ml de suspensión conidial. La prueba de patogenicidad se le realizó a 10 plantas que fueron asperjadas con la suspensión de inóculo cuando las plantas tenían 20 días de sembradas (5 días de trasplantadas), con un atomizador manual a razón de 10 ml por planta y luego se mantuvieron a 28.5 °C de temperatura y 89.7 % de humedad relativa. La caracterización de los síntomas y la patogenicidad se determinaron mediante observaciones diarias y determinaciones del progreso de la enfermedad, desde las 24 h (1 día) hasta las 192 h (7 días) posteriores a la inoculación. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En todos los organopónicos muestreados se detectó la presencia del hongo Alternaria alternata (Fries) Keissler, asociado a la mancha foliar de las hojas de lechuga (Tabla 1). Se observaron conidios de color amarillo carmelita, muciformes, oblongos u ovales, con septos principales transversales, con uno de los extremos más estrechos y tamaño promedio de 24.75±3.54 x 9.79±1.77 (µm), con 3 septos transversales y de 1 a 2 longitudinales, formando cadenas acrópetas de 5 a 7 conidios. Tabla 1. Aislados de Alternaria alternata (Fries) Keissler, a partir de manchas foliares hojas de lechuga, en organopónicos del municipio Bayamo.

Organopónico Especie de hongo

identificado Dimensiones de los conidios

(µm)

P. Pompa (A.1) A. alternata 27.54±3.52 x 9.89±1.41 La Plaza (A.2) A. alternata 23.57±4.49 x 9.92±2.01

Las Marianas (A.3) A. alternata 25.32±4.13 x 9.53±1.64 18 Plantas (A.4) A. alternata 24.98±4.29 x 9.91±1.78

MININT (A.5) A. alternata 22.34±2.31 x 9.74±2.03

x 24.75±3.54 x 9.79±1.77

Estos resultados se corresponden con lo referido por Rotem, (1994), que plantea que Alternaria alternata presenta conidios en cadena, perteneciendo al grupo Longicatenatae, a diferencia de A. porri y A. solani que producen conidios solitarios, formando parte del grupo de las Noncatenatae y son de mayor tamaño, con dimensiones de 33 - 90 x 10 - 22 (µm) y 42 - 126 x 13 - 28 (µm), respectivamente. Otros autores reportan tamaños de conidios para Alternaria alternata en Schinus molle de 18 - 45 x 6,5 - 15,5 (μm) (Castañeda y Herrera, 2011) y en la enfermedad de la pudrición del


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florete de brócoli, causados por A. alternata, Fraire et al., (2010) aislaron conidios de tamaño variable de 12 a 42 x 6.7 a 13 (μm).

El crecimiento micelial de las colonias presentó diferencias significativas (p<0.05) con respecto a la procedencia de los aislamientos, siendo los aislados correspondientes al organopónico de la Granja de producción agropecuaria del MININT y al organopónico Las Marianas, los que presentaron mayor desarrollo del micelio con 60.3 y 59.5 (mm) de diámetro de las colonias en medio de cultivo PDA. No se manifestaron diferencias significativas con respecto a la esporulación de los aislamientos de A. alternata, obteniéndose una esporulación entre 2.0 a 2.1 x 105 conidios/placa Petri (Tabla 2). Tabla 2. Esporulación y crecimiento micelial de aislados de Alternaria alternata

Aislamiento Esporulación

(conidios/Placa Petri) Crecimiento micelial (mm)

A.1 2.1 x 10 5 57.6 c

A.2 2 x 10 5 56.2 c

A.3 2 x 10 5 59.5 ab

A.4 2 x 10 5 58.4 b

A.5 2.1 x 10 5 60.3 a

58.4

Es(±) NS 1.42*

En las columnas, letras desiguales, difieren significativamente para p<0.05, según Test de Duncan

Otros autores, sitúan al medio de cultivo PDA entre los de mejores resultados para la producción de conidios de Alternaria alternata f. sp. Sphenocleae y donde se obtienen los conidios más virulentos (Masangkay et al., 2000). De forma general, las colonias de A. alternata, en el medio de cultivo PDA, se caracterizaron por ser de color gris verdoso a verde oliváceo, con textura entre lanoso y aterciopelado, con escasa exuberancia, que forma en ocasiones, anillos y con crecimiento micelial superficial (Tabla 3). Tabla 3. Caracterización morfológica de las colonias de cinco aislamientos de Alternaria alternata

Aislamiento

Color Textura Exuberanci

a

Formación de

anillos

Profundidad del

crecimiento

A.1 Verde

oliváceo Lanosa Escasa No Superficial


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A.2 Verde


A.3 Gris

verdoso Aterciopelado Escasa Si Superficial

A.4 Verde


A.5 Gris

verdoso Aterciopelado Escasa Si Superficial

Autores como Fraire et al., (2010) y Andersen et al., (2001), obtuvieron resultados similares, cuando dividieron en dos grupos las colonias de A. alternata, por el color que presentaban, ya que algunas eran de color café verdoso (AC) y otras verde olivo (AO). La inoculación con A. alternata indujo la aparición de los síntomas a las 24 h, caracterizándose por pequeños puntos cloróticos de aproximadamente 2 mm de diámetro, en la parte superior de la hoja. Entre las 72 y 96 h se desarrollaron manchas de 3 – 3.5 mm de diámetro, de color café claro en el centro de las lesiones y en los alrededores una coloración amarillenta. Después de las 96 h la coloración del centro se tornó de color carmelita oscuro y las manchas presentaban anillos concéntricos. A partir de las 144 – 168 h, las manchas comenzaron a colapsar, a menudo, en forma de tizón (Tabla 4). Tabla 4. Desarrollo de los síntomas y patogenicidad de plantas de lechuga inoculadas con A. alternata

Síntomas 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h 168 h 192 h

Presencia de puntos cloróticos

+ +

Presencia de manchas +

Desarrollo de anillos concéntricos en las

manchas +

Presencia de manchas colapsadas

+ +

Presencia de mancha en forma de tizón

+

La descripción de estos síntomas coincide con los referidos por González y Martínez (2008), en plantas de boniato, inoculadas con A. alternata. Así autores como Fraire et al., (2010) describieron síntomas y comportamientos semejantes en la enfermedad de la pudrición del florete de brócoli, causados por A. alternata y también Cova y Rodríguez (2003), observaron manifestaciones similares en el quemado foliar de la cebolla causado, también, por el mismo patógeno.


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La patogenicidad de A. alternata en plantas de lechuga se incrementó desde las 24 h hasta las 168 h, manteniendo el mismo valor hasta las 192 h. Los síntomas de la enfermedad, llegaron a extenderse en las hojas, de manera tal que llegaron a ocupar entre un 2 y un 30 (%) de la superficie de estas (Fig.1)

Figura 1. Patogenicidad de A. alternata en plantas de lechuga

La severidad de los síntomas (área de las hojas con síntomas) que provocan las diferentes especies del género Alternaria, han sido reportada por diferentes autores, en el cultivo de la habichuela con A. alternata (Dillart y Cobb, 2008), en tomate con A. solani (Vloutoglou et al., 2000) y también en papa con A. solani (Bokshi et al., 2003).

CONCLUSIONES

El agente causal identificado como responsable de la mancha foliar del cultivo de la lechuga, en organopónicos del municipio Bayamo es Alternaria alternata (Fr) Keissler.

Los aislamientos se caracterizaron por un tamaño promedio de los conidios de 24.75±3.54 x 9.79±1.77 (µm), una esporulación entre 2.0 a 2.1 x 105 (conidios/placa Petri) y un crecimiento micelial entre 56.2 y 60.3 (mm).

Las colonias de A. alternata, en el medio de cultivo PDA, se tornaron de color de gris verdoso a verde oliváceo, con textura entre lanoso y aterciopelado, con escasa exuberancia, formación de anillos y con crecimiento micelial superficial.


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Los síntomas de la enfermedad se desarrollaron a partir de las 24 - 192 (h), desde la presencia de puntos cloróticos, pasando por el desarrollo de manchas con anillos concéntricos, hasta la presencia de manchas colapsadas en forma de tizón, llegando a cubrir hasta un 30 % de la superficie de la hoja.

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