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THOMAS CARDOSO CHAGAS NETO

Caracterização microbiológica e epidemiologia molecular de Enterococcus spp.

isolados de infecções da corrente sanguínea de pacientes do Projeto SCOPE Brasil

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo - Escola Paulista de Medicina para

obtenção do título de Doutor em Ciências.

São Paulo

2015

ii




Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do

título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos

Pignatari

Coorientadora: Dra. Mirian Silva do Carmo

Rodrigues

Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro

fornecido pela Fundação de Amparo a Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP).

São Paulo

2015

iii

CHAGAS-NETO, Thomas Cardoso

Caracterização microbiológica e epidemiologia molecular de Enterococcus spp. isolados de isolados de infecções da corrente sanguínea do Projeto SCOPE Brasil. Thomas Cardoso

Chagas-Neto - São Paulo, 2015. xxv, 153.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.

Título em inglês: Microbiology characterization and molecular epidemiology of Enterococcus spp. isolated from bloodstream infections in the Brazilian SCOPE Project.

1. Enterococcus spp., 2. Enterococcus faecalis, 3. Enterococcus faecium, 4. ERV, 5. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos, 6. Tipagem molecular, 7. Infecção de corrente sanguínea, 8. Epidemiologia, 9. MALDI-TOF MS, 10. Hemocultura, 11. Espectrometria de massa, 12. Resistência bacteriana.

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Profa. Dra. Maria Tereza Zanella

Coordenador do curso de Pós-graduação:

Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

Chefe da Disciplina de Infectologia:

Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato

São Paulo

2015

v




BANCA EXAMINADORA: Presidente: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari Professor Titular e Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Titulares: Profa Dra Ilana Lopes Baratella da Cunha Camargo Professora Assistente, Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo (USP) Profa. Dra. Angela Maria Silva Professora Associada III da Universidade Federal de Sergipe (UFS) Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado Infectologista, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Dra. Cecília Vieira Franco de Godoy Carvalhaes Infectologista e Coordenadora Médica do Setor de Microbiologia do Laboratório Central, Hospital São Paulo, Departamento de Patologia Clínica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Suplentes: Dra. Luci Correa Infectologista, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP)

vi

Épígrafe

“Não sei se a vida é curta ou longa para nós, mas sei que nada do

que vivemos tem sentido, se não tocarmos o coração das pessoas.

Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve,

palavra que conforta, silencio que respeita, alegria que contagia,

lágrima que corre, olhar que acaricia, desejo que sacia, amor que

promove.

E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá sentido à vida.

É o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais,

mas que seja intensa, verdadeira, pura enquanto durar.

Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”.

Cora Coralina

vii

SUMÁRIO

Dedicatória.......................................................................................................... ix

Agradecimentos................................................................................................... x

Lista de siglas e abreviaturas................................................................................ xvi

Lista de tabelas................................................................................................... xviii

Lista de quadros.................................................................................................. xx

Lista de figuras.................................................................................................... xxi

Resumo.............................................................................................................. xxiv

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 26

2. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................... 31

2.1 Caracterização do agente etiológico.................................................. 32

2.2 Epidemiologia das infecções causadas por Enterococcus spp.......... 33

2.3 Histórico da resistência de Enterococcus spp. à vancomicina........... 35

2.4 Importância da tipagem molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina........................................................................................... 38

3. OBJETIVOS.............................................................................................. 42

3.1 Objetivo Geral................................................................................... 43

3.2 Objetivos Específicos....................................................................... 43

4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 44

4.1 Desenho do estudo.......................................................................... 45

4.2 Seleção das amostras...................................................................... 46

4.3 Critérios de Inclusão das amostras.................................................. 47

4.4 Identificação dos isolados clínicos................................................... 48

4.4.1 Avaliação da pureza e viabilidade das amostras................................. 48

4.4.2 Re-identificação bacteriana por método fenotípico.............................. 48

4.4.3 Identificação por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz / Matrix Associated Laser Desorption-Ionization –

Time of Flight (MALDI-TOF MS) ................................................................ 49

4.4.3.1 Identificação das espécies de Enterococcus por Vitek MS®

(BioMérieux®)....................................................................................... 50

4.4.3.2 Identificação das espécies de Enterococcus por Microflex LT®

MALDI-TOF BioTyper (Bruker Daltonics).................................................. 51

4.4.4 Identificação molecular..................................................................... 53

4.4.4.1 Multiplex PCR para identificação de espécies e genes van.............. 53

4.4.4.2 Extração do DNA genômico.......................................................... 53

4.4.4.3 Reação da PCR........................................................................... 54

4.5 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos.............................. 55

4.5.1Microdiluição em caldo automatizada pelo sistema Phoenix®................ 56

viii

4.5.2 Etest®.............................................................................................. 57

4.6 Tipagem Molecular............................................................................. 58

4.6.1 Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (Pulsed Field Gel

Electrophoresis - PFGE) ........................................................................... 58

4.6.2 Tipagem molecular por sequenciamento de múltiplos locus (Multilocus

Sequence Typing - MLST) ........................................................................ 60

4.6.2.1 Extração do DNA genômico por Qiamp DNA mini kit....................... 61

4.6.2.2 Análise do eBURST..................................................................... 65

4.6.3 Tipagem por espectrometria de massas............................................. 65

4.6.3.1 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento Vitek

MS®....................................................................................................... 65

4.6.3.2 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento

Microflex LT® BioTyper®.......................................................................... 66

4.7 Análise estatística............................................................................... 69

5. RESULTADOS......................................................................................... 71

5.1 Análise bacterianas............................................................................ 72

5.2 Análise dos dados epidemiológicos................................................... 72

5.3 Análise dos dados microbiológicos.................................................... 75

5.3.1 Identificação dos isolados e concordância entre o Phoenix®, o Vitek

MS® e 0 Microflex LT® com a identificação molecular.................................. 75

5.3.2 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos pelos métodos de

microdiluição em caldo automatizado (Phoenix®) e Etest®........................... 77

5.3.3 Detecção do mecanismo de resistência à vancomicina....................... 80

5.3.4 Tipagem molecular das amostras de ERV.......................................... 81

5.3.4.1 Gel Electrophoresis - PFGE) e sequenciamento de múltiplos loci

(Multilocus Sequence Typing - MLST)………............................................ 81

5.3.4.2 Análise do eBURST obtido por sequenciamento de múltiplos loci

(Multilocus Sequence Typing - MLST)…….……....................................... 86

5.3.4.3 Tipagem por espectrometria de massas………….......................... 89

5.3.4.3.1 Tipagem de Enterococcus spp. por Vitek MS®……............…… 89

5.3.4.3.2 Tipagem de Enterococcus spp. por Microflex LT®…..............… 91

5.4 Avaliação dos dados epidemiológicos após a caracterização microbiológica dos isolados…………………………………….....………… 107

6. DISCUSSÃO............................................................................................. 112

7. CONCLUSÕES......................................................................................... 134

8. ANEXOS................................................................................................... 137

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 139

ix

Dedicatória À minha mãe,

Almerinda Sá, a minha fonte de inspiração, por representar para mim um

grande exemplo de vida, superação e por fazer o bem por onde anda. E

também por me mostrar que eu posso ir muito mais longe depois de pensar

que não se pode mais.

Aos meus irmãos,

Sobretudo, Adilene Sá e Ana de Lourdes Sá, que foram o grande alicerce

de mais um sonho realizado e que estiveram presentes nos momentos mais

importantes da minha vida.

À minha tia,

Ada, meu porto seguro, meu oráculo, uma das mães que Deus me deu. Por

todos os conselhos sempre bem aplicados e por estar sempre presente na

minha vida.

À minha grande amiga e sobrinha,

Anne Caroline, meu grande orgulho, por me inspirar em sorrir e me dar força

para comungar a vida.

À família mais especial de todas, a minha família Sá,

Pela minha formação moral e educacional, por acreditarem na minha vida,

mesmo quando os médicos não acreditavam mais e por fazer tudo,

exatamento tudo parecer possível, quando acreditamos Numa Força Maior.

Às meus grandes amigos e irmãos de coração,

André Coelho, Clara Fonseca, Domingos Parra, Isabella Neto, Leila

Magalhães, Rodrigo Merlin, Thaís Teles e Tony Pedroso, pela amizade,

cuidado, carinho e por compartilharem momentos decisivos na trajetória do

meu doutorado. E por segurar a minha mão no momento que minhas pernas

tremeram e me ajudarem a continuar a minha caminhada.

x

Agradecimentos Especiais

Meu agradecimento mais profundo não poderia deixar de ser a todos os

pacientes que foram incluídos neste estudo, que nos ensinaram a diagnosticar e

com isso aliviar os sintomas das doenças. E quando a medicina não foi suficiente, a

humanização sem dúvida entrou na posologia certa para que o melhor possível

fosse feito. Sobretudo, aqueles que não resistiram a doença, que isso não tenha

sido em vão, que toda a nossa persistência em pesquisar formas de diagnósticos e

tratamentos precoces tenha sido bem explorada com essa experiência permitindo

salvar mais vidas no futuro. A todos vocês que mesmo em suas moléstias,

transformaram a nossa vida corrida, em doce rotina por fazer ciência e tentar salvar

vidas, a minha sincera gratidão.

xi

Agradecimentos

Desafio maior do que elaborar esta tese, foi simplificar meus agradecimentos

em poucas páginas a todas as pessoas que fizeram parte dessa minha trajetória na

UNIFESP.

Agradeço a Deus, pela dádiva da vida, num corpo que me presenteou com

momentos de grande aprendizado, pela cura do câncer que me proporcionou o

impulso para contribuir de forma especial espalhando pelo mundo “o Amor através

da Ciência e a Alegria através do Sorriso”. E ainda por me presentear com uma

família maravilhosa e amigos que me confundem os laços de sangue com os

espirituais.

Ao Hospital do Câncer de São Paulo, ao GRAACC e a toda sua equipe e

todos Hospitais do mundo, sobretudo aqueles que tratam dos seus pacientes com

amor e com a alegria de acreditar que a vida vale a pena, em cada uma de suas

formas. Que mesmo com dificuldades, limitações, multilações, o amor tudo vence,

mesmo na ciência que cada vez mais se percebe a importância da intervenção de

um plano superior, onde “a ciência sem a espiritualidade é manca, a espiritualidade

sem a ciência é cega”.

Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por me aceitar no seu

laboratório, confiar no meu potencial e me permitir voar na minha imaginação

científica, além da sua disponibilidade, compreensão, atenção, pela grande

oportunidade de evolução profissional que me foi concedida para aprender

Microbiologia de ponta, com profissionais exemplares e por me mostrar o tipo de

profissional que pretendo ser.

À Profa Dra Antônia Machado, por abrir as portas da “Microbiologia”, por

acreditar em mim, sobretudo no maior desafio da minha vida (montar um laboratório

de Microbiologia em Angola), por enviar um “menino” para África, que retornou

homem e capaz de enfrentar muitas diversidades profissionais e pessoais, graças a

confiança em mim depositada durante aquele grande desafio. Obrigado também por

xii

todos os conselhos e além de tudo pela grande amizade, te-la como líder me faz

acreditar que o mundo ainda tem jeito e me dá força para lutar e enfrentar os

desafios com honestidade, determinação e prudência.

À Eliete Frigatto, a quem tenho a honra de chamar de amiga, por me receber

aos 22 anos de idade no Laboratório Central, sentando ao meu lado e me ensinando

praticamente tudo que sei sobre Microbiologia Clínica, obrigado por me ensinar tanto

sobre microbiologia e sobre a vida. E também por me ensinar o que é amor

incondicional, acredito que nunca conseguirei ser um ser humano tão evoluído assim

como você. Mas ter a sua amizade é uma graça divina. Obrigado por fazer parte da

parte mais bonita da história da mina vida, sem você nada disso teria sido possível.

À Dra Cecília Godoy, pelo grande apoio, persistência e paciência para me

ensinar o que se tornou uma grande paixão na minha vida “MALDI-TOF MS”. E

também por segurar a minha mão em momentos muito importantes da minha vida e

não me deixar cair.

À Profa Dra Ana Gales, por me acolher no seu laboratório e permitir que eu

desenvolvesse os meus experimentos, onde sempre fui recebido com muito

respeito.

À Profa Dra Miriam S. do Carmo e ao Dr André Mario Doi, por acreditarem

neste trabalho, que parecia impossível e me ajudarem a torna-lo realidade. Pela

amizade, carinho, cuidado e por todas as palavras de encorajamento nos momentos

difíceis.

Às minhas amigas Luciana Barros de Santana e Jussimara Monteiro, que

sempre me incentivaram na minha carreira acadêmica.

À Drª. Ângela Maria da Silva, responsável por despertar meu interesse em

fazer carreira acadêmica na UNIFESP.

Ao meu cunhado/irmão Adenilson Oliveira Barroso, pelo apoio oferecido na

minha chegada em São Paulo, permitindo que eu iniciasse essa aventura

microbiológica.

xiii

À Lisete Liviero, que me acolheu desde o primeiro dia que me viu no

Laboratório Central como filho postiço, e que sempre me encheu de energias

positivas para vencer todos os obstáculos.

À Leila Paula de Almeida, que mesmo “desconfiada e assustada com minha

presença, conseguiu perceber que o retirante nordestino não era assaltante (nunca

irei esquecer, sorrio sempre que lembro e não poderia deixar de compartilhar isso),

abriu a porta da UNIFESP e ouviu minha longa história”.

Aos meus amigos Raquel Girardello e Rodrigo Cayô por compartilhar os

seus conhecimentos nos momentos críticos da minha tese com atenção, dedicação

e comprometimento.

À Rosana Capecce, pelo carinho e cuidado nos momentos decisivos da

minha tese, por todo apoio na burocracia desse trabalho.

Ao Henri Berghs, que na “prorrogação do segundo tempo” apareceu como

um anjo da guarda e me permitiu usar as ferramentas que fizeram uma grande

diferença no meu trabalho e provavelmente na saúde pública, sem o seu apoio esse

trabalho não teria sido tão especial.

A todos os colegas dos Laboratórios LEMC/ALERTA: Adriana Pereira de

Matos, Ana Carolina Ramos da Silva, Ana Paula Streling de Oliveira, André

Mario Doi, André Coelho, Bruno Cruz Boettger, Carlos R. V. Kiffer, Clara R. L.

Fonseca, Dandara Cassu Corsi, Elke Kreuscher Gumpl, Fernanda Matsiko

Inoue, Fernanda Rodrigues da Costa, Flávia Silva Palomo, Graziela Braun,

Jhonatha Rodrigo Cordeiro de Moura, Juliane de Mello Fonseca, Karen de

Castro Bauab, Kátia Daliria Lorenzete, Katya da Silva Patekoski, Lorena

Cristina Corrêa Fehlberg, Loren Paschoal, Lucimila Luchesi, Lygia Schandert,

Marco Antonio Zonta, Marina Francisco Visconde, Marcus Vinícius Gaspari,

Milene Quiles, Mirian Silva do Carmo, Paulo José Martins Bispo, Rafael Affini

Martins, Rodrigo Cayô da Silva, Roberta Cristina Cabral Mingrone, Talita

Trevizani Rocchetti, Talita Barone Carneiro, Thaís Freitas Teles Rezende, Thais

Avila Fernandes Catan, Vinícius Gomes de Sales Oliveira, Vinicius de Oliveira

xiv

Alves e Willames Marcos Brasileiro da Silva Martins que compartilharam comigo

toda a trajetória da minha tese, esse trabalho só foi possível graças a cada um de

vocês.

À minha família do Laboratório Central, em especial: Ana Caroline Toti,

Ana Paula Toledo, Ademir de Medeiros, Agda Vinagre, Celeste de Cássia, Cida

Gomes, Clara L. Fonseca, Clarice Yumi Matsumoto, Clayde Barquetta, Cynthea

Carolina, Daniela Anjos, Eliete Frigatto, Eloá Roventini Andrade, Elza Silva,

Erivan José P. Tavares, Euza Costa, Fernando Pereira Pinto, Flávia Silva

Palomo, Ivete, Karen Bauab, Katiane Santin, Laide Silva, Lisete Livieiro, Luiza

Reis, Márcia Pozo Pereira, Marina Falopa, Mirela Baretta, Regina Gangi, Regina

Corrêa, Sandra Ferraz Bonifácio, Sueli Maldjan, Sueli Dias, Tânia Guimarães,

Vanessa Corrêa Fanchini, Viviane Almeida Gouveia, Vivian Pereira da Mota,

Viviane Santos Amaral e a todos que mesmo não citados me apoiaram, ouviram

meus desabafos e compreenderam a minha ausência, sem vocês tudo isso teria

sido mais difícil.

Ao Departamento de Biofísica da UNIFESP, ao Prof. Dr. Luiz Juliano Neto

e Profa. Dra. Maria Juliano, pela colaboração e apoio aos nossos estudos. À toda

equipe, especialmente, ao Diego Magno Assis e Lilian, pelos auxílios e dedicação

a mim dispensados.

À minha amiga/cunhada Heloísa Santiago, por me adotar como filho, pelos

conselhos sempre bem aplicados e por nutir meu espírito com bastante força e

alegria.

As minhas amigas Flávia Palomo, Eloá Roventtini e Viviane Gouveia por

compreender minha ausência e me substituir sempre que precisei nas atividades do

Laboratório Central e por todas as palvras de incentivo.

Aos meus grandes amigos de todas as horas Magnus Silva e Eduardo

Interaminense, por todo o apoio nos momentos difíceis. Pelas críticas construtivas

e pela grande amizade.

xv

À Cynthea Carolina por todas as palavras de apoio, sempre muito bem

colocadas e que me deram ainda mais alegria para continuar.

À Andrea Ramos por todo apoio oferecido durante a finalização desta tese,

pela disposição em resolver toda burocracia sempre com alegria.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação

acadêmica e me ajudaram a vencer mais uma etapa importante da minha vida.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

auxilio financeiro concedidos para a viabilizacao deste trabalho.

Muito obrigado!

xvi

Lista de siglas e abreviaturas

adk Adenilato kinase AM Ampicilina aro Shikimato desidrogenase AST Antimicrobial susceptibility testing ATCC American Type Culture Colection ATP Adenosina tri-fosfato atpA ATP sintetase de cadeia alfa bpm Batimentos por minuto cels Células CIM Concentração inibitória mínima CLSI Clinical Laboratory Standards Institute cols. Colônias ºC Celsius Da Daltons ddl D-alanina/D-alanina ligase DF Distrito Federal DNA Ácido desoxiribonucleico DO Densidade ótica DP Daptomicina EDTA Ácido etilenodiamino tetra- acético EFM Enterococcus faecium EFMRV Enterococcus faecium resistente à vancomicina EFMSV Enterococcus faecium sensível à vancomicina EFS Enterococcus faecalis EFSRV Enterococcus faecalis resistente à vancomicina EFSSV Enterococcus faecalis sensível à vancomicina ERV Enterococcus spp. resistente à vancomicina ESV Enterococcus spp. sensível à vancomicina g Grama gdh Glicose-6-fosfato-desidrogenase gki Glicose kinase GMS Gentamicina-sinergismo GO Goiás GRAACC Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer gyd Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase HCCA Ácido α-ciano-4-hidroxinâmico ICS Infecção de corrente sanguínea ID Identificação IOP Instituto de Oncologia Pediátrica

IPCSL Infecção de corrente sanguínea primária confirmada laboratorialmente

irpm Incursões respiratórias em um minuto K Potássio Kb Kilobases kV Kilovolts LEMC Laboratório Especial de Microbiologia Clínica LZ Linezolida

xvii

M Molar m/z Massa/número de carga de íons mA Miliampère

MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight - Mass Spectrometry

min Minutos mL Mililitro MLST Multilocus Sequence Typing mM Milimolar mm3 Milímetro cúbico MO Medula óssea NaCL Cloreto de sódio ng Nanograma nm Nanômetro NPP Nutrição parenteral prolongada pb Pares de bases PCR Protein Chain Reaction – Reação da polimerase em cadeia

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis - Gel de Eletroforese em Campo Pulsado

PMIC Positive minimum inhibitory concentration pmol Picomole pstS Cassete transportador de ATP fosfato ligase purk Fosforibosil-aminoimazol carboxilase rpm Rotações por minuto SCoN Staphylococcus coagulase Negativo SDQ Somas dos quadrados dos desvios seg Segundos sin Sinergismo SIRS Síndrome da resposta inflamatória sistêmica

SCOPE Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance

SP São Paulo ST Sequence typing STS Estreptomicina-sinergismo TBE Tris borato EDTA TSB Tripticase Soy Broth = Caldo tríptico de soja Tx Transplante UFC Unidades formadoras de colônia UHCA Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis UPGMA Unweighted Pair-Groups Method Using Arithmetic Averages UTI Unidades de Terapia Intensiva VC Vancomicina X2 Chi-quadrado xpt Xantina fosforibosil transferase yiqL Acetil-CoA acetiltransferase µL Microlitros µM Micromolar

xviii

Lista de Tabelas Tabela 1. Dados nacionais dos 10 principais patógenos isolados ICS em estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados bacterianos brasileiros..................................................................................................... 28

Tabela 2. Centros médicos participantes do Projeto SCOPE Brasil e que enviaram amostras de Enterococcus spp.................................................... 48

Tabela 3. Pontos de corte de sensibilidade aos antimicrobianos estabelecidos para Enterococcus spp. pelo CLSI, documento M100-S25 segundo tabelas 2D e 3I............................................................................... 57

Tabela 4. Intervalo das concentrações utilizadas por cada metodologia de teste de sensibilidade aos antimicrobiano e pontos de corte esperados para cepas padrão ATCC de acordo com o documento M100-S25, CLSI 2015.............................................................................................................. 59

Tabela 5. Critérios de concordância segundo os valores Kappa................. 69

Tabela 6. Dados demográficos dos pacientes e dos principais fatores de risco geralmente associados ao desenvolvimento de ICS por Enterococcus spp. apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil............................................................................................... 75

Tabela 7. Concordância entre as identificações dos isolados de E. faecalis e E. faecium, incluídas no Projeto SCOPE Brasil, obtidas pelos métodos Phoenix®, Vitek MS®, Microflex LT® com relação ao método de referência (PCR)........................................................................................... 76

Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, obtido pelo sistema Phoenix®, dos 144 isolados de Enterococcus spp. incluídas no Projeto SCOPE Brasil............................................................................................... 78

Tabela 9. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados de E. faecalis e E. faecium, incluídos no Projeto SCOPE Brasil, e que apresentaram resistência à vancomicina pelas metodologias, Phoenix® e Etest®............................................................................................................ 78

Tabela 10. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV com as principais doenças de base e fatores geralmente associados a ICS e que foram apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.............. 108

Tabela 11. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com o sexo dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.............................................. 109

xix

Tabela 12. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com a idade dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil..............................................

109

Tabela 13. Relação dos isolados de EFSRV, EFSSV. EFMRV e EFMSV em relação ao desfecho clínico nos episódios de ICS dos pacientes do Projeto SCOPE Brasil................................................................................... 109

Tabela 14. Incongruências nas identificações dos isolados de Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, pelos sistemas Phoenix e Vitek MS® em relação a PCR, e a sensibilidade à ampicilina e vancomicina.................................................................................................. 138

xx

Lista de Quadros

Quadro 1. Correlação do valor do score com a confiança na identificação de gênero e espécie, segundo recomendações do manual do programa BioTyper MALDI 3.0..................................................................................... 54

Quadro 2. Oligonucleotídeos utilizados para determinação dos genes van e confirmação da identificação de E. faecalis e E. faecium adaptado de Dutka-Malen et al. (1995)............................................................................. 54

Quadro 3. Oligonucleotídeos utilizados para realização de MLST de E. faecalis e E. faecium.................................................................................... 63

Quadro 4. Condições de ciclagem para a reação de MLST para E. faecalis e E. faecium.................................................................................... 64

Quadro 5. Distribuição das amostras de Enterococcus spp. isoladas de ICS de pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil de acordo com o centro médico e região geográfica onde foram isoladas.............................. 73

xxi

Lista de Figuras

Figura 1. Etapa da transpeptidação: formação das ligações cruzadas nas cadeias peptídicas................................................................................. 37

Figura 2. Ligação entre a vancomicina e a porção terminal D-Ala-D-Ala do peptidoglicano.......................................................................................... 38

Figura 3. Fluxograma dos ensaios laboratoriais realizados com os isolados de Enterococcus spp. incluídos no Projeto SCOPE Brasil............. 47

Figura 4. Distribuição das espécies de Enterococcus isolados de ICS do Projeto SCOPE e identificadas por PCR e MALDI-TOF MS........................ 76

Figura 5. Regressão linear das CIMs de linezolida (A) e daptomicina (B), para os 35 isolados de EFSRV e EFMRV, obtidas por Etest® e microdiluição em caldo sistema Phoenix®. As áreas azuis indicam as CIMs dentro da categoria Sensível, de acordo com os pontos de corte estabelecido pelo CLSI M100-S25............................................................... 80

Figura 6. Distribuição dos 144 isolados de Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, de acordo com a espécie e a resistência à vancomicina.................................................................................................. 81

Figura 7. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFSRV, contendo o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos....................................... 83

Figura 8. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFMRV, contendo o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos....................................... 85

Figura 9. eBURST de E. faecalis baseado nos STs totais representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecalis MLST, incluíndo os STs dos isolados de EFSRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST (http://efaecalis.mlst.net )........................... 87

Figura 10. eBURST de E. faecium baseado nos STs representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecium MLST, incluíndo os STs dos isolados de EFMRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST(http://efaecium.mlst.net)................................................... 88

Figura 11. Dendrograma dos espectros de massas dos 35 ERV, obtido pelo Vitek MS®, incluindo a tipagem por PFGE e MLST (A- E. faecalis e B- E. faecium)............................................................................................... 90

Figura 12. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtidos através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos e tipagem por PFGE e MLST......................................................... 92

xxii

Figura 13. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtidos através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 30 picos e B com 50 picos picos e tipagem por PFGE e MLST................................................ 93

Figura 14. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV, obtidos pelo programa BioTyper 3.1 OC........................................ 94

Figura 15. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) do espectro de massas dos 20 isolados de EFMRV obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos e tipagem por PFGE e MLST......................................................... 96

Figura 16. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) do espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV obtidos através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 30 picos e B com 50 picos e tipagem por PFGE e MLST......................................................... 97

Figura 17. “Pseudogel” dos espectro de massas dos 20 isolados de EFMRV, obtidos pelo programa BioTyper 3.1 OC........................................ 98

Figura 18. Dendrograma do tipo UPGMA obtido através do programa BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®...................................................... 100

Figura 19. Dendrograma UPGMA obtido através do programa BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®...................................................... 101

Figura 20. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®...................................................... 102

Figura 21. “Pseudogel” dos espectro de massas analisados no MALDI-TOFMicroflex LT® dos 15 isolados de EFSRV, obtidos pelo programa BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciado com os através da intensidade na cor verde de cada massa.............................................................................................. 103

Figura 22. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®...................................................... 104

Figura 23. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®, obtidos pelo programa BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciado com os através da intensidade na cor verde de cada massa.............................................................................................. 105

xxiii

Figura 24. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 baseado apenas nos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex................................................................................................. 106

Figura 25. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®, obtido pelo programa BioNumerics 7.5................................................. 107

Figura 26. Distribuição geográfica do número de isolados de EFSRV e EFMRV enviados de acordo com o Centro médico participante.................. 110

Figura 27. Distribuição geográfica dos STs de EFSRV e EFMRV encontrados no estudo de acordo com o Centro médico participante.......... 111

xxiv

Resumo

Introdução: Infecções de corrente sanguínea (ICS) por Enterococcus spp., especialmente quando relacionadas com isolados resistentes à vancomicina, apresentam altas taxas de morbidade e terapia antimicrobiana limitada. Objetivos: Caracterizar o perfil epidemiológico e molecular de Enterococcus spp. isolados de hemoculturas de pacientes com ICS participantes do programa SCOPE Brasil. Material e Métodos: Entre junho de 2007 e dezembro de 2011, 144 cepas de Enterococcus spp. foram isoladas a partir do primeiro episódio de ICS hospitalar de pacientes de 12 centros médicos de quatro regiões brasileiras. Todas as 144 amostras foram re-identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® e a identificação final das espécies foi confirmada por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz - matrix associated laser desorption-ionization - time of flight (MALDI-TOF MS) (Bruker Microflex, Vitek MS® BMX) e reação da polimerase em cadeia (PCR) (oligonucleotídeos, ddlE.faecalis, ddlE.faecium). Além disso, os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade aos antimicrobianos pelo sistema Phoenix® e para aqueles que apresentaram resistência à vancomicina, foram submetidos ao Etest® para confirmação das CIMs de daptomicina, linezolida, teicoplanina e vancomicina. O mecanismo de resistência a vancomicina foi confirmado por PCR para os genes vanA e vanB e a tipagem por gel de eletroforese em campo pulsado - pulsed field gel electrophoresis (PFGE) foram feitas para os isolados resistentes à vancomicina. A tipagem pela técnica de sequenciamento de múltiplos loci - multilocus sequence typing MLST foi realizada para 22 isolados selecionados com base nos perfis de PFGE. Avaliou-se a aplicabilidade da técnica de MALDI-TOF MS para tipagem de Enterococcuss spp. comparando os dendrogramas do tipo UHCA e UPGMA com o algoritimo de Ward. Resultados: A espécie mais prevalente foi o E. faecalis com 110 isolados, seguidos por E. faecium com 33 isolados e apenas um E. durans. Todos os 35 isolados resistentes à vancomicina apresentaram o gene vanA, dos quais 15 da espécies E. faecalis (EFSRV) e 20 da E. faecium (EFMRV). De acordo com a PFGE foram encontrados dois padrões (B e C), que prevalecem entre EFSRV entre EFMRV foi observado um maior polimorfismo e três grupos, sendo padrão A, o predominante. MLST evidenciou em E. faecalis os STs 9; 103; 525 e 526. Enquanto em E. faecium STs encontrados foram 18, 412, 478 e 896. Conclusões: E. faecalis foi a espécie mais prevalente. Neoplasias foram as doenças de base mais encontradas. ST526 foi o mais encontrado entre os EFSRV e o ST412 o mais prevalente entre os EFMRV. A tipagem com os espectros produzidos no Microflex LT® e analisados no BioNumerics 7.5 apresentou uma boa concordância com o MLST para E. faecalis, quando utilizado o algoritmo de Ward desconsiderando a intensidade dos espectros. Mesmo utilizando Ward para E. faecium não houve boa correlação com o MLST.

xxv

Abstract

Introduction: Bloodstream infection (BSI) caused by Enterococcus spp. particulally related to vancomycin-resistant isolates, present high rates of morbi-mortality and limited antimicrobial therapy. Objective: To characterize the epidemiological and molecular profile of Enterococcus spp. isolates from patients of SCOPE Brazilian program followed with BSI from June 2007 to December 2011. Methods: we enrolled 144 strains of Enterococcus spp. isolated from the first hospital episode of BSI of patients admited to 12 hospital from four Brazillian regions . All these 144 isolates were reviewed by the automated system BD PhoenixTM and their final species identification was confirmed by Matrix Associated Laser Desorption-Ionization – Time of Flight (MALDI-TOF) (Bruker Microflex, VitekMS BMX) and PCR (ddlE.faecalis, ddlE.faecium). In addition, the isolates were submited to antimicrobial susceptibility testing by PhoenixBD. Those isolates resistant to vancomycin were also examined using EtestTM to confirm the minimum inhibitory concentration (MIC) for daptomycin, linezolid, vancomycin and teicoplanin. The mechanism of resistance to vancomycin was confirmed by using vanA and vanB gene PCR and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to typing. We performed multilocus sequence typing (MLST) in 22 isolates that were selected based on PFGE profiles. We further evaluated the applicability of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) technology for Enterococcus spp. typing comparing the dendrograms obtained by UHCA, UPGMA and Ward algoritm. Results: The most prevalent species was E. faecalis (110 isolates), followed by E. faecium (33 isolates) and only one E. durans. All 35 vancomycin resistant isolates (15 E. faecalis, EFSRV and 20 E. faecium, EFMRV) carried vanA gene. According with PFGE analysis, we found the patterns B and C as more prevalent in EFSRV. Among the EFMRV isolates we observed a greater polymorphism (patterns A, B, and C) among all three groups, being predominant the pattern A. We evidenced by MLST the sequence types (STs) 9; 103; 525, and 526 in E. faecalis, whereas 18, 412, 478 and 896 in E. faecium. Conclusions: E. faecalis was the most prevalent specie. Cancer was the most frequent underlying disease on the course of BSI. ST526 and ST412 were the most frequent among EFSRV and EFMRV isolates respectively. EFSRV typing by using Microflex LTTM and BioNumerics 7.5 program correlated with MLST results when Ward's algorithm was applied not taking into account the intensity of the spectra. However, we do not observe the same correlation among EFMRV isolates.

Introdução

26

1. INTRODUÇÃO

Introdução

27

Infecção da corrente sanguínea (ICS) é uma das principais causas de

mortalidade sobretudo em pacientes hospitalizados, frequentemente está associada

a um aumento na taxa de morbi-mortalidade. Além disso, representa uma das mais

significativas complicações durante o processo infeccioso, o que torna a

hemocultura um exame de importante valor preditivo de infecção (Araújo, 2012).

Atualmente, apesar do grande avanço tecnológico ocorrido nos últimos anos,

o procedimento mais utilizado para o diagnóstico etiológico de ICS requer a cultura

em meio líquido, continuamente monitorizada, seguida da pesquisa direta pela

coloração de Gram e subcultivo para a realização de testes fenotípicos de

identificação, automatizados, ou não, seguido do teste de sensibilidade aos

antimicrobianos. Esse processo geralmente necessita de 3 a 5 dias (Bizzini et al.,

2011).

O gênero Enterococcus tem emergido como um dos mais importantes

microrganismos multirresistentes nosocomiais, podendo ocasionar uma grande

variedade de infecções incluindo as ICSs. Estudos multicêntricos internacionais

apontam Enterococcus spp. variando entre o segundo e o oitavo agente mais

isolado de ICS (Magil et al., 2014; Billington et al., 2014; Biavasco et al., 2007;

Martínez-Ordriozola et al., 2007; Tsai et al. 2005; Wisplinghoff et al., 2004). Em

estudos nacionais Enterococcus spp. foi o oitavo microrganismo mais prevalente nas

ICS (ANVISA 2014; Gales et al., 2012; Marra et al., 2011) (Tabela 1).

Introdução

28

Tabela 1. Dados nacionais dos 10 principais patógenos isolados de ICS em estudos de vigilância

epidemiológica que incluem isolados bacterianos brasileiros.

Estudo de Vigilância Brazilian SCOPE SENTRY ANVISA

Referência Marra et al., 2011 Gales et al., 2012 ANVISA, 2014

Período Jun/2007- Mar/2010 2005-2008 Jan a Dez/2012

Critério

1º episódio de ICS confirmado

20 primeiros isolados consecutivos do mês

ICS em UTI

1 único isolado por paciente

Nº de centros médicos 16 4 908

UF participantes 8 4 27

Total de isolados 2.447 3.807 19.009

10 principais patógenos % (posição)

S. aureus 15,4 20,2 16,5

SCoN 13,8 14,5 19,9

Klebsiella spp. 13,2 12,1 12,4

E. coli - 12 5,9

Acinetobacter spp. 12,5 9,1 11,4

P. aeruginosa 8,9 8,7 8,9

Enterobacter spp. 6,1 6,1 4,9

Candida spp. 5,6 - 6,3

Enterococcus spp. 4,5 (8º) 5 (8º) 5,8 (8º)

Serratia spp. 3,5 3,3 2,9

S. maltophilia - 1,9 -

Proteus spp. 1,6 - -

Embora não sejam considerados patógenos primários, o sucesso de

Enterococcus spp. em sobrepujar os mecanismos de defesa do hospedeiro e

ocasionar ICS pode ser explicado devido a sua grande versatilidade na aquisição de

elementos genéticos codificadores de fatores de virulência incluindo mecanismos de

resistência aos antimicrobianos (Higuita & Huycke, 2014; Leavis et al., 2007).

Entre os principais mecanismos de resistência em Enterococcus destacam-se

os genes vanA/B localizados em plasmídeos, resposávies por mutações no alvo da

vancomicina, resultado na resistência aos glicopeptídios (Short et al. 2014; Whang et

al. 2013). Esse fato representa um grande problema de saúde pública em todo

mundo em virtude da limitação terapêutica, proporcionando o aumento da taxa de

morbi-mortalidade (Short et al. 2014; Whang et al. 2013).

A identificação precoce da espécie de Enterococcus causadora da ICS é de

fundamental importância, uma vez que esses patógenos apresentam peculiaridades

de virulência, e sobretudo em relação ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos,

impondo a necessidade de uma antibioticoterapia direcionada (Arias & Murray,

2012). A antibioticoterapia empírica administrada para pacientes apresentando

sintomas de ICS e com fatores de riscos para Cocos Gram-positivos, sobretudo em

hospitais com altos índices de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina, pode

Introdução

29

utilizar uma combinação de antimicrobianos incluindo usualmente a vancomicina (Liu

et al., 2011).

O aumento frequente de isolados de Enterococcus spp. resistentes à

vancomicina (ERV), tem chamando a atenção em várias casuísticas por todo o

mundo, levando a falha terapêutica empírica (Billington et al., 2014; Arias & Murray,

2012). Deste modo, a detecção precoce de Enterococcus faecalis e Enterococcus

faecium, sobretudo aqueles apresentando resistência à vancomicina é crucial para o

melhor manejo do paciente e controle do uso de antimicrobianos, permitindo

direcionamento no tratamento e consequentemente maiores chances de sucesso

terapêutico, diminuindo morbi-mortalidade, além da implementação de barreiras para

controle da disseminação dos isolados resistentes à vancomicina no ambiente

hospitalar (Billington et al., 2014; Sood, et al., 2008; Martínez-Ordriozola et al., 2007;

DiazGranados & Jernigan, 2005).

Além disso, a confirmação da concentração inibitória mínima (CIM) da

vancomicina e confirmação do mecanismo de resistência, geralmente vanA e menos

frequentemente vanB, é de fundamental importância, considerando que esses

mecanismos são plasmidiais e apresentam transferência horizontal (d’Azevedo et

al., 2009; Arias et al., 2009; Toye et al., 1997).

As infecções por Enterococcus eram consideradas de fonte endógena da

microbiota normal do paciente e sem destaque entre as infecções graves em

humanos. Essa perspectiva se modificou de forma significativa, quando os

Enterococcus spp. passaram a ser considerados como um dos principais

microrganismos isolados de infeções hospitalares. Além disso, a emergência e a

disseminação de isolados de Enterococcus spp. multirresistentes e as evidências de

aquisição desse microrganismo por fonte exógena tem gerado a necessidade de

tipagem dos isolados para auxiliar no controle de infecção e estudos

epidemiológicos em várias instituições médicas (Teixeira & Melquior, 2013).

Os métodos utilizados para a investigação epidemiológica dos ERV devem

ser capazes de subsidiar informações para o controle da disseminação desses

microrganismos em diferentes ambientes e entre pacientes (Teixeira & Melquior,

2013; d’Azevedo et al., 2009; Arias et al., 2009; Toye et al., 1997).

A utilização de ferramentas moleculares para laboratórios clínicos, sobretudo

Introdução

30

no Brasil, ainda parece distante, isso porque as técnicas envolvendo a análise do

DNA, mesmo a PCR convencional exigem infraestrutura adequada, necessitanto de

equipamentos específicos e material de consumo de alto custo. As técnicas de

tipagem molecular mais utilizadas para epidemiologia de isolados multirresistentes

são gel de eletroforese em campo pulsado-pulsed field gel electrophoresis (PFGE) e

sequenciamento de múltiplos loci - multilocus sequence typing (MLST). A primeira é

bastante laboriosa e demorada, necessitando de pelo menos cinco a sete dias para

liberação do resultado (Bedendo & Pignatari, 2000; Tenover et al., 1997; Tenover et

al., 1995). O segundo requer um sequenciador e a utilização de reagentes também

de alto custo, impossibilitando a implantação nos laboratórios de rotina, limitando-se

aos laboratórios de pesquisa (Ruiz-Garbajosa et al., 2006; Homan et al., 2002).

Uma possível alternativa mais barata seria a utilização da espectrometria de

massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDITOF-MS). Essa

representaria um grande avanço, sobretudo pela possibilidade de diagnóstico

precoce da espécie de Enterococcus spp. e de vários outros microrganismos,

podendo até mesmo identificar o microrganismo diretamente do frasco de

hemocultura positivo (Chen et al., 2013).

Entretanto, a utilização dessa ferramenta para tipagem de microrganismos

ainda não está bem estabelecida (Lash et al., 2014). A padronização de um

protocolo utilizando a técnica de MALDI-TOF MS poderia otimizar de forma

significativa o diagnóstico do agente infeccioso pela tipagem do mesmo, em tempo

reduzido e realizado num mesmo ensaio laboratorial. Uma vez com estrutura

montada, os equipamentos de MALDI-TOF MS disponíveis no mercado necessitam

apenas de reagentes rotineiros utilizados para realização do ensaio, passando a ser

de baixo custo, inclusive, podendo ser produzidos in house (Patel et al., 2015; Lash

et al., 2014; Carbonnelle et al., 2011).

Existem poucas informações disponíveis sobre as características das ICSs

por Enterococcus spp. nos hospitais brasileiros. Deste modo, um estudo

multicêntrico incluindo isolados de diferentes regiões do Brasil é de grande

importância, identificando as espécies mais prevalentes, bem como suas

peculiaridades de sensibilidade aos antimicrobianos e a disseminação clonal dos

isolados resistentes à vancomicina.

Revisão da Literatura

31

2. REVISÃO DA LITERATURA


32

2.1 Caracterização do agente etiológico

Espécies de Enterococcus estão amplamente distribuídas na natureza,

podendo ser encontradas no solo, plantas, água, alimentos e em animais, incluindo

mamíferos, aves, insetos e répteis. Em humanos habitam predominantemente o

trato gastrointestinal (Lebreton, Willems & Gilmore, 2014). Esses microrganismos

são cocos Gram-positivos podendo se apresentar de forma isolada, aos pares ou em

cadeias curtas. Esses não apresentam catalase e costumam crescer em

temperaturas entre 10 a 45ºC. São anaeróbios facultativos e a maioria das espécies

cresce em meios de cultura líquidos contendo 6,5% de NaCl, sendo também são

capazes de hidrolisar esculina em presença de 40% de sais biliares, além de

produzirem pirrolidonil arilaminidase (Teixeira et al., 2007).

O gênero Enterococcus pertencente a família Enterococcaceae onde são

conhecidas atualmente 44 espécies (Higuita & Huycke, 2014; Ludwig, Schleifer, &

Whitman, 2009). As espécies mais frequentemente associadas às infecções em

humanos são E. faecalis e E. faecium. Outras espécies, tais como E. casseliflavus,

E. durans, E. hirae e E. gallinarum são também encontradas em amostras clínicas,

no entanto, em menor frequência (Higuita & Huycke, 2014; Hidron et al., 2008;

Biviasco et al., 2007; Teixeira et al., 2007).

A resistência a vancomicina entre isolados de Enterococcus spp. é um grande

problema também no laboratório clínico, uma vez que espécies raramente

associadas com infecções em humanos como, E. casseliflavus, E. gallinarum e E.

flavescens podem apresentar resistência aos glicopepitídios, devido a presença dos

genes vanC1/C2 e C3. Entretanto, esses genes estão localizados no cromossomo e

não apresentam um grande impacto epidemiológico na dispersão da resistência no

ambiente hospitalar (Fard et al., 2014; Clark et al., 1998, Dutka-Malen et al., 1995).

Diferentemente dos gêneros Streptococcus spp. e Staphylococcus spp., os

Enterococcus spp. não produzem um conjunto de toxinas pró-inflamatórias

potentes, entretanto, apresentam uma grande versatilidade em adquirir genes,

muitas vezes codificadores de fatores de virulência, incluindo resistência aos

antimicrobianos. Entre os principais fatores de virulência encontrados em

Enterococcus spp. estão: adesina, substância de agregação, superóxido

extracelular, metaloendopeptidase, citolisina, hialuronidade e proteína de superfície


33

de Enterococcus, que contribui na formação do biofilme e colonização de cateter

(Arias & Murray, 2012; Top, Willems & Bonten, 2008; Leavis et al., 2006; Willems et

al., 2005). Todos esses fatores associados proporcionam um cenário favorável na

adaptação desse microrganismo no ambiente hospitalar (Top, Willems & Bonten,

2008).

Deste modo, embora não sejam considerados patógenos primários,

eventualmente, estas bactérias conseguem sobrepujar os mecanismos de defesa do

hospedeiro, podendo ocasionar uma grande variedade de infecções em humanos,

incluindo as ICSs (Park et al. 2009; Singh et al. 2009).

Enterococcus spp. resistente à vancomicina (ERV) tem crescido

consideravelmente como causa de infecção invasiva em pacientes hospitalizados,

sobretudo em unidades de tratamento intensivo (UTI) e em pacientes oncológicos

(Reale et al., 2009; Teixeira & Facklam 2003; Franz et al., 1999) diminuindo às

opções terapêuticas disponíveis e, consequentemente, contribuindo para aumento

da morbi-mortalidade. Deste modo, a detecção precoce de pacientes infectados por

ERV é fundamental para adequado manejo do paciente infectado, bem como para o

controle da disseminação desse patógeno no ambiente hospitalar (Deplano et al.

2007; Reale et al., 2009).

2.2 Epidemiologia das infecções causadas por Enterococcus spp.

Embora saibamos que Enterococcus spp. pode causar infecção humana na

comunidade e no hospital, esses microrganismos somente começaram a ser

reconhecidos como causas comuns de infecções hospitalares no final de 1970,

passando então de simples bactérias de baixa patogenicidade para serem

consideradas a segunda ou terceira causa mais comum de infecção nosocomial.

Essa evolução adaptativa impôs um dos principais desafios terapêuticos da

atualidade, especialmente quando associados com ICS (Biavasco et al., 2007; Tsai

et al., 2005; Wisplinghoff et al., 2004).

Estudos internacionais mais recentes apontam que Enterococcus spp. esteve

entre o terceiro e quinto isolado mais frequente entre as ICS (Billington et al., 2014;

Magil et al., 2014). Já os estudos brasileiros apontam Enterococcus spp. como o

oitavo microrganismo mais isolado das ICS (ANVISA, 2014; Gales et l., 2012; Marra


34

et al., 2011).

Ao longo dos anos, a proporção de infecções enterocócicas provocadas pela

espécie E. faecalis em relação às demais chega aproximadamente a 10:1 (Teixeira

et al, 2007). Entretanto, nos últimos anos, o que se percebe é um declínio nessa

taxa para 3:1 (Higuita & Huycke, 2014; Mundi et al. 2000). Embora E. faecalis

continue sendo a espécie mais predominante em infecções clínicas, isolados de E.

faecium vêm aumentando gradativamente, provavelmente devido ao maior número

de fatores de virulência e aos maiores índices de resistência aos antibióticos

ampicilina, gentamicina e estreptomicina e principalmente a resistência à

vancomicina, mais comuns nessa espécie (Billström et al., 2007; Edwards, 2000).

O espectro de infecções que podem ser causadas por Enterococcus spp.

inclui as infecções do trato urinário, infecções de feridas, principalmente as

cirúrgicas, assim como as úlceras de decúbito, infecções de pele em queimados, e

ICS (Tan, et al., 2010; Carvalho, et al., 2008; Malani et al. 2002). Também podem

causar endocardite, infecções pélvicas e intra-abdominais e, mais raramente,

infecções no trato respiratório, sistema nervoso central, otite, sinusite, artrite séptica

e endoftalmite (Werner, et al., 2008; Teixeira et al., 2007).

A patogênese das infecções enterocócicas ainda é pouco compreendida. No

entanto, estudos epidemiológicos demonstram a existência da relação entre alguns

clones específicos com a ocorrência de surtos hospitalares, sugerindo também um

subconjunto de linhagens virulentas como responsáveis por infecções de proporções

epidêmicas (Ochoa et al., 2013; Damani et al., 2010; Panesso et al., 2010; Leavis et

al., 2006).

Entre os principais fatores associados aquisição de ICS por Enterococcus

spp. os mais relatados são: pacientes imunocomprometidos, neoplasias, pacientes

internados com tempo de hospitalização prolongado, uso de cateter venoso em

posição central, presença de cateter vesical e utilização de antibioticoterapia de

amplo espectro (Billington et al. 2014; Gudiol et al., 2013; Ghanem et al. 2007;

Martínez-Odriozola et al. 2007; Wisplinghoff et al. 2004).

Apesar de alguns estudos multicêntricos revelarem controvérsias quanto a

resistência de Enterococcus spp. à vancomicina ser um preditor de mortalidade em

ICS, a grande maioria desses estudos relatam que o prognóstico é reservado,

sobretudo, devido as limitações terapêuticas podendo dificultar a evolução clínica do

paciente, e aumentar o índice de mortalidade. No entanto, essa relação pode variar


35

de acordo com a população de pacientes estudada e está diretamente condicionada

a condição de base do paciente (Billington et al. 2014; Hayakawa et al., 2014). De

acordo com dados do CDC, entre os 20.000 casos de infecções por ERV

nosocomiais, houve 1.300 mortes atribuídas somente no ano de 2013, esses dados

não incluem apenas ICS.

De acordo com a literatura, a resistência à vancomicina pode variar de acordo

com a espécie. Considerando as duas espécies mais associadas à infecções em

humanos, E. faecium destaca-se com maior índice de resistência à vancomicina,

chegando até 78% de resistência, de acordo com os dados reportados por Adam e

colabordores (2011), podendo variar conforme a região geográfica e os critérios de

cada estudo. Dados do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) apontam

que 77% dos E. faecium foram resistentes à vancomicina (EFMRV) no ano de 2013

nos Estados Unidos/ Já no estudo de Mira e colaboradores (2014), na Sérvia, essa

resistência ocorreu em cerca de 54% dos E. faecium. Dados nacionais baseados no

Boletim informativo da ANVISA (2014) 48,9% foram EFMRV. Entre os E. faecalis

resistentes à vancomicina (EFSRV) os índices são menores.

2.3 Histórico da resistência de Enterococcus spp. à vancomicina

A vancomicina é um antimicrobiano bactericida que foi isolado pelo grupo de

Eli Lilly em 1956, a partir da fermentação do fungo Amycolatopsis orientalis

(relacionado à Nocardia) encontrado em amostras de solo coletado no interior das

selvas de Bornéu (Levine, 2006).

Com o nome de origem inglesa “to vanquish” (aniquilar, destruir, vencer),

vancomicina tornou-se quase uma lenda devido ao seu excelente desempenho

frente a cepas de S. aureus resistentes à oxacilina. Possui atividade contra cocos

Gram-positivos, C. difficile e Corynebacterium spp., contudo, não possui atividade

contra bactérias Gram-negativas e micobactérias (Silveira et al., 2006).

Sua disponibilidade para uso clínico ocorreu em 1958, após aprovação pelo

Food and Drug Administration (FDA). Nessa mesma época, outros agentes anti-

estafilococos (tetraciclinas, cefalosporinas, eritromicina e meticilina) passaram a

serem utilizados, recebendo maior aceitação do que a vancomicina devido a sua

nefrotoxicidade e ototoxicidade, levando a vancomicina a ser relegado para a

posição de uma droga de última instância (Silveira et al., 2006; Griffith, 1981).


36

A vancomicina age impedindo a síntese da parede celular bacteriana, através

da ligação na porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em

precursores de peptidoglicano, interferindo na etapa de transpeptidação (Silveira et

al., 2006; Eggert et al., 2011) (Figura 1).

Fonte: Eggert et al. (2011).

Figura 1. Etapa da transpeptidação: formação das ligações cruzadas nas cadeias peptídicas.

O peptidoglicano (heteropolissacarídeo, tendo na sua constituição os

monossacarídeos ácido N-acetilmurâmico - NAM e N-acetilglucosamina - NAG) é

responsável pela rigidez e forma da parede celular bacteriana (Eggert et al., 2011).

Especificamente, a vancomicina impede a incorporação do ácido N-acetilmurâmico e

do N-acetilglucosamina, que são subunidades constituintes da matriz do

peptidoglicano, principal componente estrutural da parede celular das bactérias

Gram-positivas (McComas et al., 2003).

Com a sua característica hidrofílica, a molécula de vancomicina forma

ligações através de seus átomos de hidrogênio com as interações do terminal D-Ala-

D-Ala ligadas aos peptídeos NAM e NAG. Esses pontos de ligação formados (cinco)

previnem a junção entre as subunidades do peptidoglicano (Figura 2) (Silveira et al.,

2006; McComas et al., 2003).

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=%C3%81cido_N-acetilmur%C3%A2mico&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=N-acetilglucosamina&action=edit&redlink=1


37

Fonte: Silveira et al, (2006).

Figura 2. Ligação entre a vancomicina e a porção terminal D-Ala-D-Ala do peptidoglicano.

A consolidação da vancomicina como um antimicrobiano importante frente a

bactérias Gram-positivas multirresistentes, trouxe um período de certa tranqüilidade

nos programas de investigação e desenvolvimento de novos agentes

antimicrobianos pelas empresas farmacêuticas. Entretanto, com o surgimento das

primeiras cepas de ERV na década de 1970 e a emergência da sua disseminação

no ambiente hospitalar, lançou desafios para o tratamento de infecções causadas

por esses microrganismos nos últimos anos, levando a necessidade da busca de

novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et

al., 2006).

Entre os antimicrobianos lançados nos últimos anos pelas indústrias

farmacêuticas para o combate de microrganismos multiresistentes, alguns já foram

aprovados pelo FDA como opção terapêutica para os enterococos multiresistentes.

Entre os recentes antimicrobianos introduzidos na prática clínica nos últimos anos

estão: linezolida (oxazolidinonas); daptomicina (lipopeptídeos cíclicos) e tigeciclina

(glicilciclinas). Apesar dos altos custos, podem ser alternativas terapêuticas diante

de ERV. Entretanto, esses medicamentos apresentam certas limitações para o uso e

a resistência em alguns já foi relatada, por exemplo, E. faecalis são intrinsecamente

resistentes a Quinupristina/dalfopristina (Werner et al., 2008).


38

2.4 Importância da tipagem molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina

A tipagem molecular de ERV é uma ferramenta importante para vigilância

epidemiológica, caracterização de surtos, diagnóstico, tratamento e manuseio dos

pacientes que apresentam infecções por microrganismos multirresistentes,

sobretudo quando relacionadas à infecções nosocomiais em pacientes debilitados

(Arias & Murray 2012).

O emprego de métodos moleculares nos últimos anos tem substituído

progressivamente ensaios fenotípicos para tipagem de estirpes bacterianas.

Entretanto, a tipagem de ERV geralmente é uma ferramenta subutilizada, isso

porque a grande maioria dos centros que apresentam ERV como patógeno

problema no hospital não apresentam infraestrutura suficiente como salas

adequadas, equipamentos e insumos para realização dessas técnicas e ensaios

moleculares, geralmente ficando restrito aos laboratórios de pesquisa.

Entre as técnicas moleculares de tipagem utilizada na análise de surtos de

infecções e na avaliação da disseminação de cepas multirresistentes no ambiente

hospitalar, ou mesmo entre diferentes hospitais, utiliza-se principalmente a técnica

de PFGE, ainda considerada “padrao ouro” para análise desse tipo de estudo. MLST

é técnica mais utilizada para estudos epidemiológicos globais (D’Azevedo et al.,

2008; Titze-de-Almeida et al., 2004).

PFGE é uma técnica em que as moléculas de DNA são digeridas por

endonucleases de restrição (Barbier et al., 1996; Gordillo et al., 1993) gerando

produtos de ácidos nucleicos de tamanhos diversos. O polimorfismo do tamanho dos

fragmentos de restrição é então usado para discriminar estirpes bacterianas,

podendo trazer respostas importantes quanto ao grau de similaridade entre os

isolados avaliados (Jayarão, Dore & Oliver, 1992; Miranda, et al., 1991).

Embora PFGE seja considerado o "padrão ouro" para tipagem de

Enterococcus spp. (Morrison et al., 1997, Olive & Bean, 1999), seu uso é limitado

por ser demorado e laborioso (da Silva, et al. 2012; Bebendo & Pignatari, 2002;

Miranda, et al., 1991). Além disso, a técnica de PFGE apresenta algumas limitações

consideráveis, como por exemplo: o padrão de macrorrestrição encontrado pode

variar de acordo com a diferença no tempo de isolamento das amostras analisadas,

do tipo de enzima de restrição utilizada no ensaio e também do tipo de análise


39

interpretativa dos resultados, requer um técnico treinado e podendo não discriminar

isolados bacterianos não relacionados (Vitali, Gherardi & Petrelli, 2015; Hedberg et

al., 2001).

Sabe-se também que os resultados do padrão de macrorrestrição podem

apresentar variação de leitura interobservador. Algumas bandas de mesmo

tamanho podem se sobrepor e dificultar a análise. A mudança em um sítio de

restrição pode significar mais do que uma mutação e algumas cepas podem não ser

adequadamente discriminadas por essa técnica. Todos esses fatos dificultam a

construção de um banco de dados com o padrão de bandas obtidas pela

macrorrestrição, o que é praticamente inviável e não parece ser uma proposta do

método seguro. Sugere-se que a técnica de PFGE seja utilizada como uma triagem

na avaliação de surtos, porém não devendo ser utilizada para análise filogenética

(Vitali, Gherardi & Petrelli, 2015; CDC 2013,Hedberg et al., 2001).

Mesmo com todas essas limitações, a tipagem por PFGE pode trazer

respostas importantes e caracterizar isolados clonais num ambiente hospitalar,

sobretudo para análises pontuais, análises de surtos e em número limitado de

isolados. Além disso, pode-se também classificar como clonais, isolados

considerados pertencentes a grupos moleculares diferentes pela técnica de MLST,

assim como classificar como diferentes, espécimes pertencentes ao mesmo

Sequence Typing (ST) obtido por MLST (da Silva et al. 2012; Bebendo & Pignatari,

2002).

Outra técnica utilizada para tipagem de Enterococcus spp. é a MLST que

realiza o sequenciamento de genes conservados (HouseKeeping genes) - avaliando

as mutações ocorridas nas sequências dos nucleotídeos (Top, Willems & Bonten,

2008). A técnica de MLST é baseada em diferenças alélicas em sete genes

conservados e é a análise atualmente preferida para avaliação de relação clonal

podendo ser aplicada para microrganismos de vários gêneros. Entretanto, para o

gênero Enterococcus, o método está padronizado apenas para as espécies E.

faecalis e E. faecium (Arias & Murray, 2012; Top, Willems & Bonten, 2008).

O objetivo dessa técnica é proporcionar um sistema de tipagem preciso e

altamente discriminativo que pode ser utilizado para diferenciar vários

microrganismos, sobretudo isolados multirresistentes (Arias & Murray, 2012; Willems

et al., 2012; Top, Willems & Bonten, 2008; Willems et al., 2005).

Essa técnica necessita da utilização de um sequenciador e também requer

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gherardi%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25862054



40

uma infraestrutura especializada. A análise dos dados deve ser realizada em um

programa de análise de sequencias de nucleotídeos, por um profissional habilitado,

frente as sequencias consensos submetidas no site www.mlst.net, que contem o

banco de dados das sequencias depositadas dos sete alelos dos microrganismos

em questão. Esse método de bioinformática permite gerar um número para cada

alelo e, em seguida, um conjunto com o número dos sete alelos são submetidos no

mesmo site para verificar o número do Sequence Typing/Número da sequencia (ST)

(Top, Willems & Bonten, 2008).

Também é possível a construção de uma árvore filogenética com relação aos

números de loci variantes a partir do primeiro isolado padrão depositado nesse

banco de dados, essa análise se chama e-Burst, posicionando o ST encontrado em

comparação com todos os STs depositados mundialmente no banco, permitindo

avaliar a origem clonal (Top, Willems & Bonten, 2008).

A maioria dos STs encontrados entre isolados E. faecalis, de origem

hospitalar, estão normalmente relacionados aos dois complexos clonais mais

importantes nessa espécie, CC2 e CC9 (van Schaik & Willems, 2010; Ruiz-

Garbajosa et al., 2006). O aumento da frequência de isolamento de E. faecium em

todo o mundo é devido à presença de uma subpopulação policlonal (geralmente

pertencentes ao complexo clonal 17 (CC17) (Willems & van Schaik, 2009; Willems,

2005). Alguns autores sugerem que isolados de origem hospitalar geralmente estão

associados aos STs supracitados (Galloway-Pena et al., 2012; van Schaik et al.,

2010; Willems et al., 2009).

As linhagens de E. faecium, derivadas do CC17, são caracterizadas por

apresentar resistência à ampicilina e quinolonas, e à presença dos genes esp

(enterococcal surface protein), que confere facilidade de adesão em superfícies,

como cateter, e gene hyl (hialuronidase) por exemplo (da Silva et al., 2012; Freitas et

al., 2010; Willems et al., 2001).

No Brasil, estudos de tipagem de ERV por MLST de diferentes amostras

clínicas humanas evidenciam a presença dos STs 525 e 526 entre isolados de E.

faecalis resistentes à vancomicina (EFSRV) (De Almeida, et al. 2014) e ST 103,

encontrado por Merlo et al. (2015). Outros estudos envolvendo tipagem de E.

faecium resistentes à vancomicina (EFMRV) apresentam predominantemente os

STs 412 e 478, que são derivados do CC17 (Merlo et. al., 2015; da Silva et al., 2012;

Palazzo et al., 2011).


41

A utilização de sequenciamento do genoma microbiano total tem sido descrita

como uma ferramenta completa, por informar além das mutações ocorridas em

genes conservados, a presença de assinaturas moleculares presentes nos

microrganismos, como fatores de virulência e mecanismos de resistência.

Entretanto, a utilização dessa ferramenta para os laboratórios clínicos ainda

representa uma perspectiva de longo prazo, já que os equipamentos que realizam o

sequenciamento total são de alto custo, dificultando a utilização do método para uso

rotineiro. Além disso, a maior dificuldade na metodologia pode está relacionada com

a análise e interpretação dos resultados devido ao grande número de informações

geradas (MacLean, Jones & Studholme 2009).

A tipagem molecular pode fornecer informações importantes sobre a

variabilidade fenotípica de ERV, como distribuição geográfica, a patogenicidade, e

mecanismos de virulência incluindo resistência aos antimicrobianos. A tipagem de

ERV tem uma aplicação direta no estudo da dinâmica desses e sua dispersão no

ambiente hospitalar. Essa metodologia pode fornecer subsídios para compreender o

comportamento das infecções causadas por esses microrganismos, incluindo o

aumento da virulência e transmissibilidade dos isolados, a resistência a múltiplos

antimicrobianos e o melhor gerenciamento de controle do uso racional de

antimicrobianos. Além disso, essas informações permitem também adequar a

padronização dos protocolos de tratamento empíricos, sobretudo nas ICSs, através

do manejo mais individualizado dos pacientes portadores de EFSRV e ou/ EFMRV,

como a implantação de barreiras para conter a disseminação do patógeno, evitando-

se a transmissão para outros pacientes e para o ambiente hospitalar (Ochoa et al.,

2013; d'Azevedo, et al., 2009; Furtado, et al., 2005).

Objetivos

42

3. OBJETIVOS

Objetivos

43

3.1 Objetivo Geral

Caracterizar o perfil epidemiológico e molecular de Enterococcus spp.

isolados de hemoculturas de pacientes com ICS participantes do programa SCOPE

Brasil.

3.2 Objetivos Específicos

Verificar a prevalência das espécies de Enterococcus isoladas do primeiro

episódio de ICS em pacientes pertencentes ao estudo SCOPE Brasil;

Verificar a prevalência das doenças de bases e fatores associados ao

desenvolvimento de ICS E. faecium e E. faecalis, de acordo com as fichas

clínicas.

Verificar a acurácia entre os métodos de identificação fenotípica e os métodos

moleculares;

Avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os isolados de

Enterococcus spp. e a prevalência dos genes van entre os isolados de

EFSRV e EFMRV de acordo com a região geográfica;

Avaliar a tipagem molecular dos isolados de EFSRV e EFMRV pelos métodos

de PFGE e MLST;

Verificar a aplicabilidade da técnica MALDI-TOF MS para a tipagem molecular

de ERV.

Material e Métodos

44

4. MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos

45

4.1 Desenho do estudo

Este estudo é um seguimento do projeto SCOPE Brasil, que por sua vez é

uma extensão de um estudo realizado na Virginia Commonwealth University, nos

Estados Unidos, denominado de SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of

Epidemiological Importance). O estudo foi coordenado pelos Doutores Richard P.

Wenzel e Michael B. Edmond (Wisplinghoff et al. 2004), que mostraram dados

epidemiológicos sobre mais de 24.000 ICSs em 49 hospitais americanos durante um

período de sete anos.

O SCOPE Brasil foi realizado entre os anos de 2006 e 2012, com a

participação de 16 centros hospitalares pertencentes as cinco regiões brasileiras

(Norte, Nordeste, Sul, Sudeste e Centro-Oeste). Apenas 12 centros médicos

enviaram amostras de Enterococcus spp. entre os anos de 2007 e 2011, que foram

submetidas a caracterização microbiológica e molecular, cujo fluxograma dos

ensaios desenvolvidos estão demonstrados na Figura 3.

As amostras de Enterococcus spp. foram submetidas à caracterização

fenotípica, à análise macro e micromorfológica e à identificação bioquímica pelo

sistema automatizado Phoenix®. A identificação foi confirmada através da técnica de

MALDI-TOF e PCR.

O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de

microdiluição utilizando o sistema automatizado Phoenix®. As amostras resistentes à

vancomicina foram submetidas ao E-test® e PCR para detecção dos genes vanA e

vanB.

Também foi realizada nesses isolados tipagem molecular pelas técnicas de

PFGE e MLST. Também avaliamos a aplicabilidade da técnica de espectrometria de

massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDITOF-MS) para

tipagem de Enterococcus spp. O fluxograma dos ensaios realizados pode ser

visualizado na Figura 3.

Material e Métodos

46

ERV= Enterococcus spp. resistentes à vancomicina; ESV= Enterococcus spp. sensíveis à vancomicina; DP= daptomicina; LZ= linezolida; TC=teicoplanina;VC= vancomicina ID= identificação das espécies.

Figura 3. Fluxograma dos ensaios laboratoriais realizados com os isolados de Enterococcus spp. incluídos no Projeto SCOPE Brasil.

4.2 Seleção das amostras

Foram incluídas 144 amostras de Enterococcus spp. isoladas de ICS e

coletadas entre os anos de 2007 e 2011. As amostras clínicas incluídas no estudo

foram oriundas de 12 centros médicos brasileiros, pertencentes ao programa

SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance),

conforme descrito na (Tabela 2).

Material e Métodos

47

Tabela 2. Centros médicos participantes do Projeto SCOPE Brasil e que enviaram amostras de Enterococcus spp.

Nº Centros* Centro Médico Cidade/UF

1 Hospital São Paulo São Paulo/SP

2 Hospital do Rim e Hipertensão São Paulo/SP

3 Hospital Estadual de Diadema Diadema/SP

4 Instituto de Oncologia Pediátrica IOP/GRAAC São Paulo/SP

5 Hospital Nove de Julho São Paulo/SP

6 Hospital Israelita Albert Einstein São Paulo/SP

7 Santa Casa de Porto Alegre Porto Alegre/RS

9 Hospital Universitário Walter Cantídio Fortaleza/CE

10 Hospital Santa Casa do Pará Belém/PA

12 Hospital das Clínicas de Goiânia Goiânia/GO

13 Hospital de Base de Brasília Brasília/DF

15 Hospital Espanhol de Salvador Salvador/BA

*Os centros de Nº 8, 11, 14 e 16 não enviaram amostras de Enterococcus spp.

4.3 Critérios de inclusão das amostras

As ICSs hospitalares foram definidas pelo isolamento de uma ou mais

amostras de hemoculturas positivas após pelo menos 48 horas da admissão do

paciente no hospital. Foi incluída no estudo apenas uma amostra de cada

paciente, sendo esta a primeira amostra positiva caracterizada como de origem

hospitalar.

Para a inclusão no estudo, alguns critérios de síndrome da resposta

inflamatória sistêmica (SIRS) foram considerados, tais como:

Febre com temperatura corporal acima de 38oC ou hipotermia com

temperatura corporal abaixo de 36oC;

Taquicardia com frequência cardíaca acima de 90 bpm;

Taquipnéia com frequência respiratória acima de 20 irpm, ou

hipocapnéia (pressão parcial de CO2 < 32 mmHg);

Leucocitose ou leucopenia com leucócitos acima de 12.000 cels/mm3

ou abaixo de 4.000 cels/mm3, ou presença de mais de 10% de formas

jovens (bastões).

Além dos isolados clínicos, as cepas padrão American Type Culture

Collection (ATCC) de S. aureus 29213 e E. faecalis 29212, foram utilizadas para o

controle de qualidade dos ensaios laboratoriais, sobretudo, em relação aos testes de

Material e Métodos

48

sensibilidade aos antimicrobianos, conforme as recomendações do documento

M100-S25 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015).

4.4 Identificação dos isolados clínicos

4.4.1 Avaliação da pureza e viabilidade das amostras

As amostras foram recebidas em swab contendo meio de Amies com carvão

ativado, a fim de manter a viabilidade dos microrganismos durante o transporte dos

mesmos até o Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), onde as

amostras foram semeadas em ágar sangue e, em seguida subcultivadas e

incubadas a 35 ± 1 °C durante 24 horas. As amostras consideradas puras foram

armazenadas em Tripticase Soy Broth - caldo tríptico de soja (TSB) contendo 20%

de glicerol a -70°C, até serem submetidas aos testes laboratoriais. Antes de cada

ensaio laboratorial, os isolados foram submetidos a dois repiques sucessivos em

ágar sangue.

4.4.2 Re-identificação bacteriana por método fenotípico

Todos os microrganismos recebidos vieram previamente identificados pelo

centro de origem. Entretanto, todos os isolados bacterianos incluídos no estudo

foram re-identificados, para uniformizar a plataforma de identificação bioquímica de

Enterococcus spp.

Deste modo, a identificação inicial do microrganismo foi baseada nas

características macromorfológicas em ágar sangue (colônias geralmente ou α

hemolíticas; apesar da literatura relatar que algumas amostras podem apresentar

hemólise β, nenhum dos isolados incluídos neste estudo apresentaram esse tipo de

hemólise). Em seguida, com a colônia suspeita foi realizado esfregaço em lâmina

que foi corado pelo método de Gram, para avaliação das características

morfotintoriais. Todos os isolados foram submetidos à identificação bioquímica e

teste de sensibilidade através do sistema automatizado Phoenix® (Becton Dickinson

Microbiology Systems, Coceysville, Md) utilizando o painel PMIC/ID105.

Os painéis combinados do sistema Phoenix permitem realizar

simultaneamente testes de identificação e sensibilidade aos antimicrobianos. O

painel combinado compõe-se de dois lados: um lado para identificação do

microrganismo, chamado ID, com substratos desidratados para a identificação e um

Material e Métodos

49

lado para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, chamado AST, com diversas

concentrações de agentes antimicrobianos, controles de crescimento e de

fluorescência, para determinar a sensibilidade das bactérias.

O lado ID do painel PMIC/ID 105 apresenta 51 cavidades contendo diversos

testes bioquímicos convencionais, cromogênicos e fluorogênicos para determinar a

identificação do organismo. O princípio do método está relacionado à utilização e

degradação de substratos específicos como carboidratos e compostos aminados, e

consequente alteração do pH que é detectada por diversos indicadores

colorimétricos e fluorimétricos. Além disso, existem outros testes que detectam a

capacidade do microrganismo de hidrolisar, degradar, reduzir ou utilizar

determinados substratos.

Entre os substratos presentes no PMIC/ID 105, utilizados para identificação

da espécie, estão: 4mu-bd-celobiosidio, L-alanina-amc, 4mu-bd-glucosidio, L-prolina-

amc, ácido-amc L-piroglutâmico, L-fenilalanina-amc, L-triptofano-amc, 4mu-fosfato,

metionina-amc, 4mu-ad-glucosidio, arginina-amc, Glicina-prolina-amc, 4mu-bd-

glucuronidio, L-leucina-amc, 4mu-n-acetil-bdglucosaminidio, L-arginina-amc, 4mu-

fosfato (com trealose), L-histidina-amc, L-isoleucina-amc, 4mu-bd-galactosidio,

colistina, polimixina B, ácido D-glucônico, ácido 3-metil glutárico, D-fructose, ácido

iminodiacético, ácido alfa-cetoglutárico, D-manitol, 3-metiladipico, timidina, alanina-

alanina-pna, L-prolina-pna, valina-alanina-pna, pnp-ad-glucosidío, pnp-fosfato, beta-

gentiobiose, d-sucrose, maltotriose, N-acetil-glucosamina, D-trealose, D-tagatose,

maltose, dextrose, uréia, esculina, nitrocefin, metyl-alfa-dglucopiranosidio.

4.4.3 Identificação por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz / Matrix Associated Laser Desorption-Ionization – Time of Flight (MALDI-TOF MS)

A identificação do microrganismo se baseia na análise dos perfis de proteínas

detectados diretamente da colônia bacteriana (Vitek MS® BMX) ou após uma

extração prévia das proteínas ribossomais totais (Microflex LT®) que são aplicadas

num suporte de metal. Após a colônia diretamente inoculada ou o extrato proteico

secar no suporte, uma matriz específica (o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico - HCCA)

é aplicada sobre o mesmo, após secagem da matriz, a mistura é irradiada com laser.

A matriz absorve a luz do laser e ocorre a dessorção, juntamente com as

moléculas das proteínas, no processo de ganho de carga elétrica (ionização). Os

Material e Métodos

50

campos elétricos conduzem os íons para o tubo do espectrômetro de massa (tempo

de voo), que os separa de acordo com a sua relação massa/carga (m/z), e por fim, a

quantidade de cada íon é medida. A detecção é efetuada no fim do tubo de vácuo.

Os perfis de massas/carga obtidos são comparados com espectros de referência

contidos nos bancos de dados, através da criação de diversos algoritmos

pertencentes a cada sistema (Keys et al., 2004; Fenselau & Demirev, 2001; Demirev

et al., 1999 Krishnamurthy & Ross, 1996; Karas & Hillenkamp, 1988; Tanaka et al.,

1988).

O equipamento Microflex LT® MALDI-TOF adquire os espectros e o programa

BioTyper analisa no máximo 96 amostras por corrida e disponibiliza placas de metal

reutilizáveis, já o VITEK MS® analisa quatro placas descartáveis de 48 amostras

cada (172 amostras em uma única corrida), porém, devem ser analisadas de 16 em

16 ou os spots remanescentes serão inutilizados (Patel, 2013).

4.4.3.1 Identificação das espécies de Enterococcus por Vitek MS® (BioMérieux)

O sistema VITEK MS® recomenda a análise dos padrões de proteínas

detectados diretamente dos microrganismos, por isso, não foi realizada a extração

de proteínas conforme descrito anteriormente. apesar da possibilidade de analisar

até 172 amostras em uma única corrida, em cada dia do ensaio, foram analisadas

apenas 48 amostras em duplicata.

Deste modo, algumas colônias de cada microrganismo foram cuidadosamente

inoculadas diretamente no suporte descartável a fim de preencher toda a superfície

do spot, além disso, entre cada grupo de 16 amostras, foi inoculada também uma

cepa controle E. coli ATCC 25922 como calibrante. Após a secagem das amostras

e do calibrante à temperatura ambiente, adicionou-se 1 µL da matriz ácido α-ciano-4-

hidroxinâmico (HCCA 10mg/mL) (BioMérieux) sobre cada amostra. Os espectros de

massa gerados de acordo com o perfil proteico de cada amostra foram comparados

com uma série de espectros depositados no programa Saramis® (v.4.1.2) (Spectral

Archiving and Microbial Identification System, AnagnosTec, Postdam-Golm,

Alemanha, www.anagnostec.eu).

Para identificação das espécies, optamos pelo programa Saramis® que

permite identificação dos microrganismos, bem como avaliação de similaridade por

perfil proteico, diferentemente do programa Myla®, que apenas realiza a

Material e Métodos

51

identificação. Portanto, a identificação foi baseada na similaridade do espectro do

microrganismo testado com aquele de referência no banco de dados, denominado

de superespectro, que representa o espectro de picos conservados derivados de

múltiplos isolados de uma espécie ou grupo em particular. O superespectro exige

que pelo menos 75% dos picos correspondentes de uma amostra sejam

semelhantes em relação ao seu banco de dados para gerar um resultado de

identificação. O valor atribuído relaciona-se à especificidade destes para a espécie

ou gênero em questão. Estes valores de confiança variam de 0 a 100% (Patel,

2015).

Resultados acima de 90.1% são considerados confiáveis para a identificação

do gênero e da espécie; entre 80.1 – 90.0 identificação confiável para o gênero

bacteriano e, provavelmente, para a espécie; entre 75.0 e 80.0, identificação

provável somente do gênero. Os espectros foram analisados em um intervalo de

2.000 a 20.000 m/z, onde m representa a massa e z representa o número da carga

de íons Como controle da extração e da leitura das proteínas foi utilizada a cepa E.

coli DH5α como calibrante, conforme recomendação do fabricante. Além disso,

foram utilizadas como controles externos de identificação as cepas de E. faecalis

ATCC 29212, E. faecalis ATCC 51299 e E. faecium ATCC 700221 (Manual do

usuário VitekMS®; Patel et al., 2015).

4.4.3.2 Identificação das espécies de Enterococcus por Microflex LT® MALDI-TOF BioTyper (Bruker Daltonics)

Para a leitura das massas das amostras bacterianas pelo equipamento

Microflex LT®, foi realizada a extração das proteínas ribossomais pelo método de

ácido fórmico/acetonitrila conforme recomendações do manual do equipamento.

Foram selecionadas de cinco a sete colônias bacterianas, as quais foram

ressuspensas em 300 μL de água destilada estéril em tubo de polipropileno de 1,5

mL. A esta mistura, foi adicionado 900 μL de etanol absoluto (Carlo Erba, Rodano,

Milão, Itália) e centrifugado por 2 minutos a 13.000 rotações por minuto (rpm). Após

a centrifugação, todo o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em

50 μL de ácido fórmico 70% (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Após vigorosa

agitacao, 50 μL de acetonitrila pura (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) foram

adicionados e a solução foi novamente centrifugada por 2 minutos a 13.000 rpm

Material e Métodos

52

(Marko et. al, 2012). Em seguida, 1 µL do sobrenadante foi adicionado em placa de

aço inoxidável, própria para uso no equipamento.

Após a extração das proteínas ribossomais, cada amostra foi inoculada em

triplicata para a avaliação da reprodutibilidade da identificação bacteriana. Após a

secagem das amostras e do calibrante à temperatura ambiente, adicionou-se 1 µL

da matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA 10mg/mL) (Sigma Aldrich, St.

Louis, Missouri, EUA) sobre cada amostra.

O Microflex LT® MALDI-TOF BioTyper analisa no máximo 96 amostras por

corrida e disponibiliza placas de metal reutilizáveis. Deste modo, cada placa

continha 31 amostras em triplicata além do calibrante (em um spot). Posteriormente,

a placa foi introduzida no espectrômetro de massas Microflex LT® MALDI-TOF

BioTyper (Bruker Daltonics, Alemanha). Esse equipamento encontra-se alocado no

Departamento de Biofísica da UNIFESP. Os espectros de massa gerados de acordo

com o perfil proteico de cada amostra foram obtidos através do programa

FlexControl versão 3.3 em seguida os dados foram importados e comparados com

uma série de espectros depositados no banco de dados do programa BioTyper

MALDI OC 3.1 (Bruker Daltonics, Alemanha) para que a identificação da espécie

bacteriana fosse realizada.

Os critérios de identificação bacteriana utilizados são aqueles especificados

pelo próprio fabricante: scores ≥ 2.3 foram considerados confiáveis para a

identificação do gênero e da espécie; entre 2.0 e 2.2, identificação confiável para o

gênero bacteriano e, provavelmente, para a espécie; entre 1.7 e 1.9, identificação

provável somente do gênero, enquanto scores de identificação abaixo de 1,7 foram

considerados como não confiáveis (Quadro 1). Nesse estudo os scores ≥ a 2.0 foram

considerados confiáveis para identificação de espécie (Maldi BioTyper 3.1 OC, User

Manual). Os espectros foram analisados em um intervalo de 2.000 a 20.000 m/z.

Como controle da extração e da leitura das proteínas foram utilizadas as cepas E.

faecalis ATCC 29212 e E. coli ATCC 25922.

Material e Métodos

53

Quadro 1. Correlação do valor do score com a confiança na identificação de gênero e espécie, segundo recomendações do manual do programa BioTyper MALDI 3.0.

Variação do Score

Descrição

2.300 – 3.000 Alta confiabilidade na identificação de espécie

2.000 – 2.299 Identificação do gênero confiável, identificação da espécie provável

1.700 – 1.999 Provável identificação do gênero

0.000 – 1.699 Identificação não realizada

4.4.4 Identificação molecular

4.4.4.1 Multiplex PCR para identificação de espécie e genes van

Para confirmação da identificação das espécies e dos genes van (para

amostras que apresentaram resistência para pelo menos um dos glicopeptídeos

testados), foram realizados ensaios de PCR multiplex com o DNA genômico de

todas as amostras com posterior amplificação dos genes vanA, vanB, vanC1,

vanC2-C3, ddlE.faecalis e ddlE.faecium, segundo Dutka-Malen et al. (1995) com algumas

modificações: incluímos a pesquisa do gene 16S como controle de extração. A

pesquisa dos genes vanC1 e vanC2/C3 foi realizada apenas quando a PCR não

amplificou bandas para E. faecalis ou E. faecium. Os oligonucleotídeos utilizados

estão descritos no (Quadro 2).

Quadro 2. Oligonucleotídeos utilizados para determinação dos genes van e confirmação da identificação de E. faecalis e E. faecium adaptado de Dutka-Malen et al. (1995).

Gene Tamanho do fragmento

produto de PCR

Sequências (+ 5` - 3`) Posição Conteúdo GC (%)

16S (8F/1493R)

1485 + AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 8 - 27 50

- ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT 1493 - 1473 48

ddlE. faecalis 941 + ATC AAG TAC AGT TAG TCT 98 – 116 38

- ACG ATT CAA AGC TAA CTG 1038 – 1021 39

ddlE. faecium 550 + TAG AGA CAT TGA ATA TGC C --- 37

- TCG AAT GTG CTA CAA TC --- 39

vanA 732 + GGG AAA ACG ACA ATT GC 175 – 191 53

- GTA CAA TGC GGC CGT TA 907 – 891 53

vanB 635 + ATG GGA AGC CGA TAG TC 173 – 189 53

- GAT TTC GTT CCT CGA CC 807 – 791 53

vanC-1 822 + GGT ATC AAG GAA ACC TC 246 – 272 53

- CTT CCG CCA TCA TAG CT 1067 – 1051 50

vanC-2/C-3 439 + CTC CTA CGA TTC TCT TG 455 – 486 47

- CGA GCA AGA CCT TTA AG 885 – 869 47

Material e Métodos

54

4.4.4.2 Extração do DNA genômico

O DNA genômico foi obtido pelo método de extração do fenol-clorofórmio,

utilizando Brazol® (LGC Biotecnologia Ltda.). Para tanto, 500µL do inóculo

bacteriano (ajustado à escala 1 de McFarland: cerca de 3 x 108 UFC/mL) foi

adicionado a um microtubo de 1,5mL e acrescido de 500µL de Brazol. A solução foi

homogeneizada por 5 segundos no agitador mecânico e em seguida, foram

adicionadas esferas de vidro de 0.5 mm de diâmetro. O conjunto foi submetido à

agitação por 10 minutos no desruptor de células Genie® (Scientific Industries, Inc -

EUA). Uma alíquota foi transferida para um novo tubo ao qual foram acrescentados

180 µL de clorofórmio gelado e a mistura homogeneizada por 5 segundos no

agitador. A solução foi centrifugada a 20.000 g por 12 minutos a 8oC. O

sobrenadante foi retirado, transferido para outro tubo contendo 500 µL de etanol

gelado, agitado por cerca de 5 segundos e centrifugado a 20.000g por 12 min a 8oC.

Desta vez o sobrenadante foi desprezado e ao material precipitado foram

adicionados 500 µL de etanol gelado. O tubo foi novamente centrifugado a 20.000g

por 12 min a 8oC. O sobrenadante foi desprezado e o DNA precipitado foi deixado a

secar em temperatura ambiente até que todo etanol evaporasse. Posteriormente

foram adicionados 50 µL de água ultra pura (Invitrogen®, Thermo Fisher Scientific

Inc.) e o tubo colocado a 65ºC por 30 minutos para eluição completa do DNA.

O DNA extraído, foi quantificado em espectrofotômetro (GeneQuantpro,

Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, Inglaterra) por verificação da absorbância

da Densidade Óptica (DO) em 260nm. Segundo Sambrook et al. (1989) a absorbância

igual a 1 contém uma concentração de 50 µg/mL de DNA de fita dupla. Também foi

medida a absorbância da DO em 280nm para detectar a presença de proteínas e

calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras DO260nm/DO280nm permite uma

estimativa da pureza do DNA, cujo ideal encontra-se entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de

1,6 indica grande quantidade de proteínas e contaminantes, e na sua ocorrência, a

extração foi realizada novamente.

4.4.4.3 Reação da PCR

Para cada reação da PCR foram adicionados em microtubos de 0,2 mL os

seguintes componentes: 10 µL da PCR Master Mix GoTaq® Green 2X (Promega,

Material e Métodos

55

Madison, WI, EUA): [Taq DNA polimerase 50 µg/mL em tampão com pH 8.5,

deoxinucleotídeos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 400 µM cada) e 3mM de MgCl2]; 0,5

µL de cada oligonucleotídeo a 20 µM (vanA F/R; vanB F/R; ddlE. faecalis F/R e ddlE.

faecium F/R); 1 µL do DNA extraído [1pmoL] e 5 µL de água MiliQ estéril, obtendo um

volume final de 20 µL.

As amplificações foram realizadas em um termociclador MasterCycler

gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), sob as seguintes condições: Ciclo de

desnaturação inicial de 95°C por 10 minutos, seguido de 35 ciclos a 95°C 1 minuto

(desnaturação); 50°C 1 minuto (hibridização); 72°C 1 minuto (extensão). Para o

ciclo de extensão final, foi utilizada a temperatura de 72°C por 10 minutos. O

termociclador foi programado para manter as reações a 4°C até a sua retirada do

aparelho.

O perfil dos amplicons foi analisado por separação eletroforética em gel de

agarose (Ultra Pure Agarose-Invitrogen) na concentração de 1,0% (w/v). Um grama

de agarose foi dissolvido em 100 mL da solução tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) [90

mM Tris base; 90 mM ácido bórico; 2 mM EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético

bisódico)] 0,5X, fundido em microondas e acrescido de 4 µL de brometo de etídio 0,5

µg/mL (USB Corporation, Cleveland, EUA). A separação eletroforética foi realizada

com o gel imerso no tampão de corrida (TBE 0,5X), a 120 voltz x 90 mA durante 40

minutos. Foram adicionados 10 µL de cada produto de PCR nos orifícios do gel e

para estimativa do tamanho das bandas do produto amplificado (amplicom) utilizou-

se 6 µL do marcador de peso molecular de 100 pares de base (pb) (Invitrogen,

Carlsbad, Califórnia, EUA), corridos paralelamente às amostras.

O sistema de transiluminador de luz ultravioleta associado a uma câmera

fotográfica (UVP – BioDoc – it TM System) foi utilizado para captura das imagens que

foram utilizadas para análise dos fragmentos amplificados.

4.5 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos

A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelo método de

microdiluição em caldo utilizando o sistema automatizado Phoenix® conforme

recomendações do documento M100-S25 do CLSI, além disso, a metodologia de

teste elipsométrico, Etest®, foi utilizada para avaliação das concentrações inibitórias

mínimas (CIM) de daptomicina, linezolida, teicoplanina e vancomicina, apenas para

Material e Métodos

56

os isolados que apresentaram resistência parcial ou total a quaisquer dos seguintes

antimicrobianos: glicopepitídio, linezolida e/ou daptomicina, pelo método Phoenix®.

Para controle da qualidade e confiabilidade dos resultados obtidos pelos testes de

sensibilidade, foram incluídas duas cepas conhecidas, E. faecalis ATCC 29212 e S.

aureus ATCC 25923 como microrganismos-controle, e os pontos de corte de

sensibilidade aos antimicrobianos utilizados conforme as orientações estabelecidas

pelo documento CLSI M100-S25, 2015 (Tabela 3).

Tabela 3. Pontos de corte de sensibilidade aos antimicrobianos estabelecidos para Enterococcus spp. pelo CLSI, documento M100-S25 segundo tabelas 2D e 3I.

Antimicrobianos Categoria de sensibilidade (µg/mL)

Sensível Intermediário Resistente

Ampicilina ≤ 8 --- ≥ 16

Daptomicina ≤ 4 --- ---

Gentamicina-sinergismo ≤ 500 --- > 500

Linezolida ≤ 2 4 ≥ 8

Estreptomicina-sinergismo ≤ 500 --- ≥ 1000

Teicoplanina ≤ 8 16 ≥ 32

Vancomicina ≤ 4 8 - 16 ≥ 32

Para avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos, foram avaliadas a

porcentagem de sensibilidade, e as concentrações inibitórias mínimas capazes de

inibir 50% e 90% da amostragem, respectivamente CIM50 e CIM90.

4.5.1 Microdiluição em caldo automatizada pelo sistema Phoenix®

O método Phoenix AST (Antimicrobial Susceptibility Test - teste de

sensibilidade) consiste em um teste de microdiluição em caldo. O sistema apresenta

85 cavidades contendo antimicrobianos liofilizados em um gradiente de

concentração seriada. Para realizar a determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM) utilizou-se um indicador de redox (resazurina, fornecido no kit) para

detectar o crescimento bacteriano na presença de um agente antimicrobiano. Para

determinar o crescimento bacteriano, utilizaram-se contínuas medições das

mudanças ocorridas no indicador, assim como a turbidez gerada pelo crescimento

do microrganismo.

O inóculo foi obtido através de solução salina (caldo ID Phoenix®) e ajustado

à escala 0,5 de McFarland. A inoculação é realizada com o painel inclinado e os

orifícios de inoculação (ID e AST) localizados na parte superior e os inóculos

Material e Métodos

57

específicos adicionados manualmente. O inóculo fluiu para baixo em forma de

espiral e preenche as cavidades do painel à medida que o líquido passa para a

almofada, onde o excesso é absorvido. As tampas são colocadas manualmente nos

orifícios de inoculação. Na linha divisória da tampa do painel existe uma abertura

que permite a entrada de ar, para garantir suficiente tensão de oxigênio no painel

durante a realização do teste.

Entre os antimicrobianos disponíveis no painel PMIC/ID105, avaliamos a

sensibilidade frente aos seguintes: ampicilina (AM), daptomicina (DP),

estreptomicina sinergismo (STS), gentamicina Sinergismo (GMS), linezolida (LZ) e

vancomicina (VC), os intervalos das concentrações dos antimicrobianos podem ser

visualizados na Tabela 4.

4.5.2 Etest®

O inóculo foi preparado em solução salina e ajustado à escala 0,5 de

McFarland. As placas de Müeller-Hinton cátion-ajustado foram mantidas à

temperatura ambiente por 30 minutos antes do início do ensaio. Um volume de 100

µL referente a cada inóculo foi dispensado sobre a superfície do ágar e distribuído

de forma homogênea, em quatro direções diferentes, com auxílio de zaragatoa

alginatada. A seguir, as placas foram deixadas abertas, em fluxo laminar, por 15

minutos ao menos, para absorção do inóculo pelo ágar.

As fitas de Etest® de daptomicina (suplementada com cálcio diretamente

peloo fabricante), linezolida, teicoplanina e vancomicina (com gradiente de

concentração entre 0,016 a 256 µg/mL, Tabela 4), foram aplicadas no ágar

inoculado conforme orientações do fabricante (Etest® Guide, BioMérieux, EUA). As

placas foram incubadas em estufa a 35 2º C por 24 horas. A interpretação da CIM

foi realizada considerando a intersecção entre a fita de Etest® e a zona elíptica de

inibição de crescimento bacteriano. Quando a intersecção localizou-se entre duas

numerações, foi considerada a concentração acima da intersecção.

As CIMs de daptomicina e linezolida obtidas por Etest® foram comparadas

com aquelas obtidas pelo Phoenix®, apenas para os isolados que apresentaram-se

resistentes à vancomicina pelo Phoenix®.

Material e Métodos

58

Tabela 4. Intervalo das concentrações utilizadas por cada metodologia de teste de sensibilidade aos antimicrobianos e pontos de corte esperados para cepas padrão ATCC de acordo com o documento M100-S25, CLSI 2015.

Antimicrobianos/Metodologia

Sigla Intervalo (µg/mL)

Valor esperado da CIM (µg/mL)

Phoenix®

S. aureus ATCC – 29213

E. faecalis ATCC – 29212

Ampicilina AM 0.125 – 16 0.5 – 2 0.5 – 2

Daptomicina DP 0.25 – 4 0.25 – 1 1 – 4

Gentamicina-sinergismo GMS 500 --- ≤ 500

Linezolida LZ 0.5 – 4 1 – 4 1 – 4

Estreptomicina-sinergismo STS 1000 --- ≤ 1000

Vancomicina VA 0.5 – 32 ≤ 0.5 – 2 1 – 4

E-test® Sigla

Intervalo (µg/mL)

S. aureus ATCC – 29213

E. faecalis ATCC – 29212

Daptomicina DP 0.016 - 256 0.25 - 1 1 - 4

Linezolida LZ 0.016 - 256 1 – 4 1 – 4

Teicoplanina TC 0.016 - 256 0.25 - 1 0.25 - 1

Vancomicina VC 0.016 - 256 ≤ 0.5 – 2 1 – 4

4.6 Tipagem molecular

Todos os 35 isolados ERVs, que apresentaram o gene vanA confirmado, foram

selecionados para realização da tipagem molecular pela técnica de PFGE como

triagem para a análise pelo MLST. Além disso, todos os 35 isolados também foram

submetidos à tipagem por espectrometria de massas de acordo com o perfil proteico

obtido pelos equipamentos Vitek MS® e Microflex LT®.

4.6.1 Gel de eletroforese em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE)

A análise do DNA cromossômico dos isolados de E. faecium e E. faecalis

resistentes à vancomicina foi realizada pela técnica de PFGE, que é amplamente

utilizada como método de tipagem epidemiológica, permitindo a análise de todo o

genoma da bactéria, possibilitando uma diferenciação das linhagens, muito aplicada

para análise de surtos (Homan et al. 2002).

Deste modo, o DNA cromossomal das amostras foi preparado em blocos de

agarose e clivados com a enzima endonuclease SmaI pelo método de Bannerman e

colaboradores (1995), e posteriormente submetidos à eletroforese em campo

pulsado. Tais etapas foram realizadas como se segue.

As amostras bacterianas foram subcultivadas em ágar sangue para a

obtenção de colônias puras e isoladas. Em seguida, cerca de quatro colônias de

cada amostra foram transferidas para um tubo contendo 4 mL de TSB, e incubadas

Material e Métodos

59

a 35ºC entre 18 e 24 horas até fase final de crescimento exponencial, determinado

pela DO de 0,7-0,9 em 620nm (CELM, E210D).

O caldo contendo as bactérias crescidas foi centrifugado a 15.000 rpm por 15

minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento resuspenso em 1 mL de

solução salina. A solução com as bactérias foi transferida para tubo de

microcentrífuga de 1,5 mL com peso previamente conhecido. O material foi

centrifugado a 15.000 rpm por aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante

cuidadosamente aspirado e desprezado.

Para determinar a quantidade de bactérias o tubo contendo as bactérias

precipitadas foi pesado novamente. As bactérias foram ressuspensas em solução

salina na proporção de 1:1 (peso/volume). Em novo tubo, contendo 10µL da solução

1:1 da suspensão bacteriana foram adicionados 15µL de lisostafina diluída e 300µL

de solução tampão TEM (Tris 0,1M, pH 7,5, EDTA 0,1M, NaCl 0,1M). Essa solução

foi homogeneizada e misturada com 340µL de gel de agarose de baixo ponto de

fusão a 2%. Cerca de 100µL da solução resultante foi aplicada em formas para

formação de pequenos blocos. Após gelificar, os blocos de agarose, contendo o

DNA cromossomal, foram incubados por no mínimo cinco horas em solução EC (Tris

6mM, ph 7,5; NaCl 1M; EDTA 0,01M; Brij 58 0,5%; sarcosil 0,5%; desoxicolato 0,2%

e água destilada, contendo 200µL de lisozima) à 37oC e posteriormente, incubados

em 2mL de solução ES (EDTA 0,4M, pH 9,3, Sarcosil 1%) contendo 100µL de

proteinase K (20mg/mL, Sigma - P4914) por 12 horas.

Os blocos foram lavados várias vezes em solução tampão CHEF-TE (Tris

0,1M, pH 7,5, EDTA 0,1 M, pH 7,5) e armazenados nessa solução contendo 10U da

enzima de restrição Smal para cada amostra, permitindo a digestão do cromossomo

bacteriano. A digestão foi realizada entre 12 e 18 horas a uma temperatura de 25ºC.

Após a digestão, foi realizada a eletroforese em gel de agarose a 1,2% no sistema

CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). Como padrão de peso molecular

utilizou-se DNA concatenado do bacteriófago I (New England Biolabs, Beverly,

EUA).

A eletroforese foi realizada com corrente alternada de 5 a 60 segundos,

voltagem de 6 V/cm a 13oC por 23 horas. Os géis foram corados com brometo de

etídio (0,08 µL/mL) por uma hora, descorados em água bidestilada por mais uma

hora e fotografados sob luz ultravioleta.

Material e Métodos

60

Os perfis migratórios obtidos após a fotografia do gel foram analisados

visualmente seguindo os critérios de Tenover et al. (1995), onde amostras são

consideradas idênticas (mesmo clone) quando apresentam todas as bandas iguais;

amostras com até seis bandas devem ser consideradas um subtipo de um mesmo

clone, e amostras que apresentam sete ou mais bandas discordantes serão

consideradas amostras não relacionadas epidemiologicamente (Tenover et al., 1997,

Tenover et al.,1995).

Além da análise visual, os perfis de PFGE das amostras foram submetidos ao

programa de análise de géis BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) versão

7.5. Em todas as imagens, a definição de bandas foi realizada automaticamente pelo

programa e depois conferida visualmente. O coeficiente de similaridade de Dice foi

utilizado, e os dendrogramas foram construídos utilizando o algoritmo de análise

filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method Using Arithmetic Averages)

(Sader, Hollis & Pfaller, 1995; Sneath & Sokal, 1973). Os valores de otimização e

tolerância utilizados para o conjunto de isolados foram de 0,8 e 1,0%,

respectivamente. Isolados apresentando similaridade acima de 80% entre si foram

considerados pertencentes ao mesmo grupo (Strüelens et al., 1993; McDougal et al.,

2003).

4.6.2 Tipagem molecular por sequenciamento de múltiplos loci (Multilocus Sequence Typing - MLST)

Entre os isolados de E. faecium e E. faecalis resistentes à vancomicina e

submetidos à análise do perfil eletroforético por PFGE, foram selecionadas amostras

representantes de cada perfil para tipagem molecular por MLST, em que, foi

selecionado um isolado de cada padrão de bandas diferentes, para isolados

pertencentes ao mesmo cluster, foi selecionado um isolado para clusters contendo

até quatro isolados. Para clusters apresentando cinco ou mais isolados, foram

selecionados dois isolados, considerando o maior tempo de isolamento e centros

diferentes entre os isolados.

MLST é uma técnica altamente discriminatória na caracterização de isolados

bacterianos, com base em perfis alélicos gerados pela determinação da sequência

interna de fragmentos de sete genes conservados. Para cada fragmento de gene, as

diferentes sequências são designadas como alelos distintos, e cada isolado é

definido pelo conjunto dos sete alelos, criando, assim, o perfil alélico ou tipo de

Material e Métodos

61

sequência (sequence typing - ST). Uma vez que existem muitos alelos para cada um

dos sete loci, é improvável que tenham perfis idênticos alélicos por acaso, e isolados

com o mesmo perfil de alelos podem ser considerados membros de um mesmo

clone. As principais vantagens do MLST são a capacidade de comparar os

resultados obtidos em diferentes estudos via bases de dados informatizadas na

Internet permitindo o estudo de surtos hospitalares locais, bem como comparações

globais de microrganismos, além de epidemiologia a longo prazo entre diferentes

laboratórios em todo o mundo (Andrei & Zervos, 2006).

Cada um dos sete genes sequenciados foi comparado com o banco de dados

disponível em: http://efaecalis.mlst.net/ e http://efaecium.mlst.net/, conforme a

espécie, recebendo então um número correspondente a cada alelo (gene), gerando

um total de sete números. Com base nos sete números alélicas, cada isolado foi

atribuído a um ST específico também disponível no site.

4.6.2.1 Extração do DNA genômico por Qiamp DNA mini Kit

Para ter um DNA com a pureza desejada para a realização das reações de

MLST o DNA genômico das amostras bacterianas crescidas em ágar Columbia

contendo sangue de carneiro a 5% foi extraído utilizando-se o kit Qiamp DNA mini-

kit (QIAGEN- Hamburg, Germany), conforme especificações do fabricante: em um

microtubo de 1,5mL contendo 50µL de proteinase K foram adicionados 500 µL do

inóculo bacteriano (escala 1 de McFarland, cerca de 3 x 108 UFC/mL). O material foi

homogeneizado em vórtex por cerca de 10 segundos, acrescido de 200µL do Buffer

AL, novamente homogeneizado em vórtex por 15 segundos e em seguida incubado

a 56ºC por 10 minutos, para possibilitar a ação da Proteinase K, para quebra da

parede de peptidoglicano. Após a incubação foram adicionados 500µL de etanol (96

- 100%) ao microtubo e o material foi homogeneizado no vórtex por 15 segundos.

Toda a solução foi transferida para uma coluna acoplada a um microtubo de 2 mL o

conjunto foi centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto. O material precipitado foi

descartado e a coluna, transferida para um tubo limpo, recebeu 750 µL do Buffer

AW. O conjunto foi centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto, o precipitado foi

descartado e a coluna transferida para novo microtubo limpo recebeu 750 µL do

Buffer AW2. O conjunto foi novamente centrifugado 8.000 x g por 3 minutos, o

precipitado descartado e a coluna transferida para outro microtubo limpo recebeu

Material e Métodos

62

50µL do Buffer AE para eluição do DNA. O tubo foi incubado a temperatura

ambiente 15 - 25ºC por 5 minutos, após esse tempo, o tubo foi centrifugado a 6.000

x g por 1 minuto e o DNA coletado.

O DNA extraído teve sua concentração definida por dosagem no

espectrofotômetro Nanodrop (Texas, EUA) sendo utilizado para cada reação apenas

20 ng/µL de DNA.

A tipagem molecular por MLST baseia-se no sequenciamento de sete genes

constitutivos (housekeeping) segundo os procedimentos descritos para E. faecalis

por Ruiz-Garbajosa et al. (2006). Para E. faecium foram utilizadas as

recomendações de Homan, et al. (2002). A escolha dos genes conservados

utilizados no esquema de MLST está disponível no site: http://www.mlst.net/ e os

oligonucleotídeos utilizados para amplificação por PCR dos respectivos genes de

acordo com cada espécie podem ser visualizados no Quadro 3.

Material e Métodos

63

Quadro 3. Oligonucleotídeos utilizados para realização de MLST de E. faecalis e E. faecium.

Enzima/Gene/E.faecalis Oligonucleotídeo Sequencia (5’ – 3’) Produto (pb)

Glicose-6-fosfato-desidrogenase gdh-1 GGCGCACTAAAAGATATGGT

530 gdh-2 CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA

Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase gyd-1 CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC

395 gyd-2 CATTTCGTTGTCATACCAAGC

Cassete transportador de ATP fosfato ligase

pstS-1 CGGAACAGGACTTTCGC 583

pstS-2 ATTTACATCACGTTCTACTTGC

Glicose kinase gki-1 GATTTTGTGGGAATTGGTATGG

438 gki-2 ACCATTAAAGCAAAATGATCGC

Shikimato desidrogenase aroE-1 TGGAAAACTTTACGGAGACAGC

459 aroE-2 GTCCTGTCCATTGTTCAAAAGC

Xantina fosforibosil transferase xpt-1 AAAATGATGGCCGTGTATTAGG

456 xpt-2 AACGTCACCGTTCCTTCACTTA

Acetil-CoA acetiltransferase yiqL-1 CAGCTTAAGTCAAGTAAGTGCCG

436 yiqL-2 GAATATCCCTTCTGCTTGTGCT

Enzima/Gene/E.faecium Oligonucleotídeo* Sequencia (5’ – 3’) Produto (pb)

Adenilato kinase

adk-1 TATGAACCTCATTTTAATGGG 437

adk-2 GTTGACTGCCAAACGATTTT

adk-1n GAACCTCATTTTAATGGGG 395

adk-2n TGATGTTGATAGCCAGACG

ATP sintetase de cadeia alfa

atpA-1 CGGTTCATACGGAATGGCACA 556

atpA-2 AAGTTCACGATAAGCCACGG

atpA-1n TTCAAATGGCTCATACGG 438

atpA-1n AGTTCACGATAAGCAACAGC

D-alanina/D-alanina ligase ddl-1 GAGACATTGAATATGCCTTATG

465 ddl-2 AAAAAGAAATCGCACCG

Glicose-6-fosfato-desidrogenase gdh-1 GGCGCACTAAAAGATATGGT

530 gdh-2 CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA

Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase gyd-1 CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC

395 gyd-2 CATTTCGTTGTCATACCAAGC

Fosforibosil-aminoimazol carboxilase

purK-1 GCAGATTGGCACATTGAAAGT

492 purK-2 TACATAAATCCCGCCTGTTTC

purK-1n* CAGATTGGCACATTGAAAG

purK-2n* TTCATTCACATATAGCCCG

Cassete transportador de ATP fosfato ligase

pstS-1 TTGAGCCAAGTCGAAGCTGGAG

583 pstS-2 CGTGATCACGTTCTACTTCC

pstS-1n* TTGAGCCAAGTCGAAGC

*n=oligonucleotídeos alternativos, para otimizar a reação; Fonte: http://efaecium.mlst.net; http://efaecalis.mlst.net

As reações de PCR foram realizadas em volume final de 25µL contendo 12,5

µL de Master Mix 2X, 0,5 µL dos oligonucleotídeos senso e antisenso (10pmol/µL),

0,5 µL do DNA genômico (20 ng), e 10 µL de água miliQ autoclavada. As

amplificações foram realizadas em um termociclador MasterCycler Gradient

(Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), conforme as recomendações descritas no site

www.mlst.net. As condições de ciclagem estão descritas no Quadro 4.

Material e Métodos

64

Quadro 4. Condições de ciclagem para a reação de MLST para E. faecalis e E. faecium.

Etapas E. faecalis E. faecium

Temperatura ºC Tempo Temperatura ºC Tempo *

Desnaturação inicial 94 5 min 95 15 min

Desnaturação 35

ciclos

94 30 seg 94 30 seg

Anelamento 52 30 seg 50 30 seg

Extensão 72 1 min 72 30 seg

Extensão final 72 7 min 72 5 min

*min= minutos; seg= segundos. Fonte: http://efaecium.mlst.net; http://efaecalis.mlst.net

A análise do produto de PCR para confirmação da qualidade dos amplicons

foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, preparado em TBE. Um

marcador de peso molecular de 1 Kb (Fermentas, EUA) foi utilizado como controle

do padrão de bandas. Os géis foram corados com brometo de etídio (0,08µL/mL) e

fotografados sob luz ultravioleta.

O produto de PCR foi diluído 1:10 em água destilada e as sequencias foram

determinadas utilizando o kit “ABI PRISM Big Dye Cycle Sequencing Ready

Reaction” (Perkin-Elmer, Applyed BioSystems), contendo os terminais fluorescentes

de BigDye e os oligonucleotídeos usados inicialmente na amplificação por PCR. As

reações foram realizadas utilizando-se 5 µL do produto de PCR diluído, 5 µL do

tampão de reação 5X, 1 µL de oligonucleotídeo senso ou antisenso (3,2 pmol/ µL) e

H2O destilada e autoclavada em quantidade suficiente para 20 µL. A mistura foi

submetida a uma ciclagem de 94C por 2 minutos seguida por 25 ciclos de: 96C por

10 segundos; 50C por 30 segundos e 60C por 4 minutos. Após o término da

ciclagem, o produto amplificado foi precipitado com 80μL de isopropanol 75%

(temperatura ambiente), secado a 95ºC por 30 segundos, ressuspenso em 20µL de

formamida e aplicados em sequenciador ABI 3100 (Perkin-Elmer, Applyed

Biosystem).

As sequencias resultantes da amplificação dos sete genes conservados, de

cada clone inserido na pesquisa, foram analisadas utilizando as ferramentas de

alinhamento do programa DNAStar e comparadas com aquelas depositadas no

banco de dados do site MLST de E. faecalis (http://efaecalis.mlst.net) e E. faecium

(http://efaecium.mlst.net) a fim de se obter um conjunto de sete números, um para

cada gene estudado, e este conjunto de números foi representado por outro código

(também numérico) que se chama Tipo de Sequência (Sequence Type ou ST).

Desta forma, os alelos em cada um dos sete loci definiram o perfil alélico

correspondente, para cada isolado.

Material e Métodos

65

4.6.2.2 Análise do eBURST

A análise do eBurst permite verificar a distribuição dos STs e as origens e

relações dos complexos clonais e outros grupos.

O algoritmo eBURST identifica mutuamente os grupos exclusivos de

genótipos relacionados na amostragem [normalmente um tipo de sequencia múltipla

no banco de dados - MLST e em seguida identifica o genótipo (ST)] relacionando

com cada grupo fundador. O algoritmo então prevê a descendência do genótipo

fundador previsto para os outros genótipos do grupo, demonstrando o resultado

como um diagrama radial, onde o genótipo fundador fica localizado no centro do

diagrama. Esse procedimento foi desenvolvido para utilização com os dados

produzidos por MLST (ST e seus perfis alélicos). Para verificar a relação dos STs

encontrados neste estudo, utilizamos o programa eBurst v.3 E. faecalis Database e

eBurst v.3 E. faecium, disponível em: http://eburst.mlst.net. O eBurst utiliza os

seguintes critérios: sete loci por isolado; pelo menos seis loci idênticos para

definição do grupo, pelo menos três variações de loci para definição de subgrupo.

4.6.3 Tipagem por espectrometria de massas

Para avaliação da similaridade conforme o perfil de proteínas foi realizada

uma calibração externa em ambos os equipamentos, Vitek MS® e Microflex LT®,

utilizando a amostra padrão E. coli DH5α que apresenta os valores das suas massas

moleculares de proteínas ribossomais bem definidos, a saber: 4365,4; 5096,8;

5381,4; 6241,4; 6255,4; 6316,2; 6411,6; 6856,1; 7158,8; 7274,5; 7872,1; 9742,0 e

12227,3 Da.

4.6.3.1 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDI-TOF MS), utilizando o equipamento Vitek MS®

Os espectros foram adquiridos no modo linear, com um retardamento de 104

ns e uma voltagem de aceleramento de +20 kV. Os espectros finais foram obtidos

pela soma de 20 tiros de laser acumulados por cada espectro parcial e 50 espectros

parciais produzidos por amostra, levando a um total de 1000 tiros por cada espectro

Material e Métodos

66

final. As listas dos picos foram comparadas no banco de dados Saramis®, gerando

um agrupamento estatístico baseado nas similaridades espectrais, para realização

de um dendrograma do tipo Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

(UPGMA), que evidencia o número de massas idênticas pelo Saramis.

O algoritmo UPGMA é um método de construção de árvore filogenética

baseado num agrupamento por aglomeração simples, que reflete a estrutura

presente em uma matriz de similaridade de pares (ou uma matriz de dissimilaridade).

Em cada passo, os dois aglomerados mais próximos são combinadas em um grupo.

A distância entre quaisquer dois grupos A e B é tomado como sendo a média de

todas as distâncias entre pares dos objetos " x " em A e de "y " em B , ou seja, a

distância média entre os elementos de cada conjunto (Sokal & Michener, 1958).

Os critérios utilizados foram: 0.08% de tolerância, intensidade absoluta ≥ 0,

intensidade relativa ≥ 0, 50 picos e massas entre 2.000 e 12.500 Da.

4.6.3.2 Tipagem por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser - assistida por matriz (MALDI-TOF), utilizando o equipamento Microflex LT® BioTyper®

Os espectros gerados pelo Microflex LT® foram analisados no programa

BioTyper 3.1 OC e adquiridos no modo linear, com um retardamento de 200 ns e

uma voltagem de aceleramento de +20 kV. Os espectros finais foram obtidos pela

soma de 20 tiros de laser acumulados por cada espectro parcial e 50 espectros

parciais foram produzidos por amostra, levando a um total de 1000 tiros por cada

espectro final. As listas dos picos foram comparadas no banco de dados do

BioTyper Bruker 3.1 OC, gerando um agrupamento estatístico baseado nas

similaridades espectrais.

A tipagem através do perfil proteico foi realizada por dois programas

diferentes: BioTyper 3.1 OC e BioNumerics 7.5. Para o primeiro foram avaliadas as

seguintes condições: intensidade máxima 1 (influência 1) e intensidade mínima 0,05

(influência 0,5) e o número de picos (3, 5, 10, 30 e 50 picos). Além disso, o

dendrograma obtido pelo BioTyper 3.1 OC é do tipo Unsupervised Hierarchical

Cluster Analysis (UHCA), que utiliza como estratégia para o agrupamento

hierárquico aglomerativo ou divisório além da presença e ausência do pico a

intensidade dos mesmos, demonstrando o nível de distância entre os diferentes

perfis de massas encontrados.

Material e Métodos

67

O programa BioNumerics 7.5, foi utilizado para possibilitar a comparação do

padrão de similaridade obtido pela análise dos perfis proteicos gerados pelo

Microflex LT® com o método de PFGE, devido à possibilidade de construção de

dendrograma por porcentagem de similaridade. Deste modo, os perfis proteicos

também foram analisados a partir da construção de um dendrograma utilizando o

algoritmos UPGMA e método da variância de Ward (Ward, 1963) com o objetivo de

melhor agrupar os isolados semelhantes. Para tanto, o padrão de picos obtidos no

BioTyper 3.1 OC foi convertido em txt e importados para BioNumerics 7.5.

Para ambos os algoritmos, UPGMA e Ward, foram utilizados os parâmetros

padrão do programa, onde o valor de tolerância constante foi de 0,5 e tolerância

linear de 300ppm. Além disso, utilizou-se o coeficiente de similaridade de Dice (para

otimizar a comparação com o dendrograma obtido pelo PFGE). Um coeficiente de

similaridade acima de 80% foi selecionado para definição cada grupo de isolados.

Como os dendrogramas construídos a partir dos espectros obtidos pelo método de

MALDI-TOF MS com o algoritmo UPGMA considerando a intensidade dos picos, que

é uma variável inconstante, optou-se por realizar outro tipo de algoritmo a partir dos

mesmos perfis proteicos, o algoritmo de Ward.

Esse algoritmo realiza uma análise binária verificando apenas a presença ou

ausência dos principais picos, porém não leva em consideração a intensidade dos

mesmos. Isso elimina a interferência dessa variável no agrupamento dos isolados

uma vez que ocorre interferência significativa de acordo com o inóculo bacteriano,

concentração e volume da matriz utilizada e distribuição heterogênea desses nos

spots presentes nas placas de inox.

O método de Ward (1963) apresenta bons resultados tanto para distâncias

Euclidianas quanto para outras distâncias e procura por partições que miniminizem

a perda associada a cada agrupamento. Essa perda é quantificada pela diferença

entre a soma dos erros quadráticos de cada padrão e a média da partição em que

está contido.

O agrupamento pelo método de Ward foi feito a partir das somas de

quadrados dos desvios dos espectros das massas encontradas de cada isolados e a

partir do quadrado da distância euclidiana entre todos os espectros analizados,

considerando a equação:

Material e Métodos

68

SQDii ꞌ = 1

2dii ꞌ

2 , em que: SQDiiꞌ = SQDj ii ꞌ

p

i

sendo SDQj(ii’), a soma dos quadrados dos desvios para a j-ésima variável

considerando os acessos i e i’. E,

dii ꞌ2 Yij − Yiꞌj

2

p

j=1

em que:

dii’2: quadrado da distância euclidiana entre os acessos i e i’;

p: número de caracteres avaliados;

Yij: a distância média entre caractere j para o caractere i.

A soma dos quadrados dos desvios total foi dada por:

SQDTotal =1

g dii ꞌ

2gii ꞌ

gi< ,

sendo g o número de isolados.

Nessa análise de agrupamento, identificou-se na matriz de quadrados das

distâncias euclidianas – dii’2 (ou na matriz de somas dos quadrados dos desvios –

SQDii’) o par de isolados que proporcionou menor soma dos desvios. Com esses

isolados agrupados, uma nova matriz de similaridade de dimensão inferior, foi

recalculada, considerando que:

SQD (ijklm) = 1/k d2 (ijklm)

onde k é o número de espectros dos grupos estudados, que variou em cada grupo

EFSRV/EFSSV/EFMRV e EFMSV.

d2(ijklm...) = d2

ij + d2ik + d2

il + d2im+ d2

jk + d2jl + d2

jm + d2kl ...

Como o Método de Ward (1963) baseia-se originalmente na distância

euclidiana:

𝑎 − 𝑏 2 = 𝑎𝑖 − 𝑏𝑖 2

𝑖

Material e Métodos

69

Neste estudo, utilizamos o algoritmo de Ward, no entanto, a similaridade entre

os isolados foi quantificada pelo coeficiente de Dice. Todos os cálculos foram

realizados automaticamente pelo programa BioNumerics 7.5.

Deste modo, avaliou-se a similaridade pelo padrão proteico dos isolados de

EFSRV, o mesmo foi realizado com os isolados de EFMRV. Foi gerado também um

dendrograma considerando apenas o padrão proteico produzido pelo MALDI-TOFe

um “pseudogel” referente ao padrão proteico respectivo entre os isolados de EFMRV

e EFSR. O BioNumerics 7.5 permite a construção de dendrograma considerando

mais de um método de tipagem ao mesmo tempo. Assim, foi construído um

dendrograma considerando o padrão dos espectros dos isolados de EFSRV e

EFMRV pelo MALDI-TOFe o padrão de bandas respectivo obtido no PFGE.

4.7 Análise estatística

O teste de Kappa foi utilizado para avaliar a concordância dos métodos

Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT® Bruker BioTyper com o método padrão (PCR),

na identificação das espécies dos isolados incluídos no estudo.

O teste de Kappa é um teste de concordância para 2 amostras de natureza

qualitativa (categorizadas) e deseja-se saber o grau de concordância ou

equivalência entre as 2 classificações (Pereira, 1995). Quanto maior o valor de K e

mais próximo de um melhor a concordância. O valor zero indica grau de

concordância igual ao acaso (Tabela 5).

Tabela 5. Critérios de concordância segundo os valores Kappa.

Critério Concordância

<0,001 Ruim

0,001 a 0,20 Fraca

0,21 a 0,40 Sofrível

0,41 a 0,60 Regular

0,61 a 0,80 Boa

0,81 a 0,99 Ótima

1,00 Perfeita

Para verificar a relação entre os principais fatores associados à aquisição de

ICS por EFSRV, EFSSV, EFMRV ou EFMSV entre os pacientes incluídos no estudo

Material e Métodos

70

e a relação das espécies de Enterococcus spp. e a resistência desses à

vancomicina com a condição na alta foi utilizado o teste de Chi-quadrado (X2).

O teste de X2 é indicado para verificar as diferenças nas distribuições de uma

característica categorizada (2 ou mais categorias) em função de outra também

categorizada. Esse teste mede o grau de relacionamento entre as duas

características, em amostras independentes. Em alguns casos o teste de X2 não

pode ser aplicado em função da baixa frequência observada em algumas

classificações (Siegel, 2006).

O teste de X2 deve ser utilizado quando o número de células (cruzamentos)

com frequência inferior a 5 não exceder a 20% do total de células. No caso

específico de tabelas 2 x 2, deve-se considerar o número de casos: para casuísticas

maiores ou iguais a 20 deve-se utilizar o teste X2 com correção de continuidade de

Yates. E para frequências menores que 20 deve-se utilizar o teste de Fisher (Siegel,

2006).

Quanto à relação entre os grupos EFSRV, EFSSV, EFMRV e EFMSV com a

idade dos pacientes incluídos no estudo, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis. Trata-

se de um teste não paramétrico e é indicado quando se quer comparar 3 ou mais

grupos de informações quantitativas de amostras independentes e não se deseja

assumir suposições acerca da distribuição das amostras analisadas. A interpretação

do valor de p é a mesma de outros testes estatísticos, ou seja, quando o valor de p

for ≤ 0,05, infere-se que há diferença significativa entre os grupos, para valores >

0,05 não existe relação significante (Siegel, 2006).

Resultados

71

5. RESULTADOS

Resultados

72

5.1 Amostras bacterianas

Durante o período de Junho de 2007 e Dezembro de 2011, foram incluídas

neste estudo 144 amostras de Enterococcus spp. Essas amostras foram enviadas

por 12 dos 16 centros médicos participantes do SCOPE ao centro coordenador, o

(LEMC) (Quadro 5).

Em 2008 foram enviadas o maior número de amostras n= 69, e os centros

que mais apresentaram infecções por Enterococcus spp. foram o centro 13 (34

casos), e os centos 1 e 7 (cada um com 31 casos). Duas amostras foram excluídas

deste estudo, por serem encaminhadas como sendo Enterococcus spp. entretanto,

após re-identificação, tratavam-se de outros gêneros (identificados pelo Phoenix® e

por MALDI-TOF MS, Microflex® LT e VitekMS).

5.2 Análise dos dados epidemiológicos

Quanto à distribuição de casos de infecções por Enterococcus spp. de acordo

com as regiões brasileiras, a região Sudeste apresentou o maior número de casos,

(n=68; 47,2%), seguido das regiões Centro-Oeste (n=36; 25%), Sul (n=31; 21,5%),

Nordeste (n=6; 4,2%) e Norte (n=3; 2,1%) (Quadro 5). Esse fato pode estar

relacionado com o maior número de Centros participantes do estudo estarem

localizados na região Sudeste.

Resultados

73

Quadro 5. Distribuição das amostras de Enterococcus spp. isoladas de ICS de pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil de acordo com o centro médico

e região geográfica onde foram isoladas.

Centro

Anos/Espécies Total de

isolados

Região

(n) % 2007 2008 2009 2010 2011 Total

EFS EFM EFS EFM EFS EFM EFS EFM EFS EFM EFS EFM

1 2 3 12 5 7 2

21 10 31

Sudeste

(68) 47,2%

2 1 1 4 1

1

5 3 8*

3 2

3

3

1 1 9 1 10

4 1 1 1 3 1

3 4 7

5 2

1

3 0 3

6 1

3

2 1 1

7 1 8

7 10

11 1 4 1 1 3

26 5 31 Sul

(31) 21,5%

10

1

1

1

3

3 Norte

(3) 2,1%

12

1 1

1 1 2 Centro-Oeste

(36) 25% 13

12 5 11 2 3 1

26 8 34

9

3

3

3 Nordeste

(6) 4,2% 15

2

1

3

3

Total 19 5 53 16 31 7 6 4 1 1 110 33 144

24 69 38* 10 2 143 144*

EFS = Enterococcus faecalis EFM = Enterococcus faecium * = + 1 isolado, que foi identificado como E. durans = único isolado dessa espécie no estudo foi enviado em 2009 pelo Centro 2

Resultados

74

Entre os 144 casos de ICS por Enterococcus spp., foi possível avaliar 118

fichas clínicas, já que 26 amostras foram enviadas sem os dados clínicos. Dessas

118 fichas clínicas analisadas, pode-se observar que a mediana de idade foi de 58

anos, houve um predomínio do sexo masculino 63/118 (53,4% dos casos).

Entre as doenças de bases mais frequentemente informadas nas fichas

clínicas dos pacientes portadores de ICS pelos Enterococcus spp. incluídos no

estudo, podem-se destacar: neoplasias (25,4%), doenças renais (26%), respiratórias

(15%) e cardiovasculares (13%). Quanto aos fatores associados a ICS, os mais

encontrados foram cateter venoso em posição central (78%), cateter vesical (56%),

ventilação mecânica (52%) e diálise peritoneal (20%).

Quanto à fonte da bacteremia, a grande maioria, 92/118 pacientes (78%), foi

proveniente de infecção primária associada à utilização de cateter venoso central,

seguido por trato respiratório inferior com 16/118 casos (13,5%) e trato urinário

10/118 casos (8,5%). Sobre os fatores de risco avaliados nas fichas clínicas, o mais

frequente foi cateter venoso central que ocorreu em 92/118 pacientes (78%),

seguido de internação em UTI, 62/118 pacientes (52,5%), cateter vesical em 56/118

(47,5%), e ventilação mecânica em 52/118 (44%) dos pacientes. Quanto à

mortalidade, houve 62/118 (52,5%) óbitos , dos quais 63% (n=39) dos pacientes que

estavam internados na UTI foram a óbito, contra 41,1% (n=23) que não estavam

internados na UTI (Tabela 6).

Resultados

75

Tabela 6. Dados demográficos dos pacientes e dos principais fatores de risco geralmente associados ao desenvolvimento de ICS por Enterococcus spp. apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.

Parâmetros Nº (%)

Dados demográficos dos pacientes

Idade (mediana) 58 ---

Masculino 63 53,4

Internação em UTI 62 52,5

Infecção monomicrobiana 109 92,4

Doença de base

Neoplasias 30 25,4

Renal 26 22

Respiratória 15 12,7

Cardiovascular 13 11

Trauma 11 9,3

Neurológica 10 8,5

Gastrintestinal 7 5,9

Potenciais fatores associados

Cateter venoso central 92 78

Cateter vesical 56 47,4

Ventilação mecânica 52 44,1

Diálise peritoneal 20 16,9

NPP 7 5,9

Acesso arterial 5 4,2

Neutrófilos <1000 3 2,5

Fonte de bacteremia primária 92 78

Mortalidade

UTI 39 63

Não-UTI 23 41,1

Mortalidade geral 62 52,5

5.3 Análise dos dados microbiológicos

5.3.1 Identificação dos isolados e concordância entre o Phoenix®, o Vitek MS®

e o Microflex LT® com a identificação molecular

Todas os 144 isolados encaminhados foram re-identificados pelo sistema

automatizado Phoenix®, com auxílio do Painel PMIC/ID 105. Além disso, foram

utilizadas duas plataformas de identificação por Espectrometria de Massas (MALDI-

TOF MS) como o VITEK MS® e o Microflex LT®. Todas as metodologias foram

capazes de identificar todas as amostras incluídas no estudo. Entretanto, vale

ressaltar que a identificação final foi baseada na PCR. Deste modo, analisando as

identificações obtidas pela técnica de PCR com oligonucleotídeos específicos, E.

Resultados

76

faecalis foi a espécie mais prevalente 110 amostras (76,2%) seguido de E. faecium

com 33 amostras (23,1%) e apenas uma amostra foi identificada como E. durans

(0,7%) (Figura 4). A identificação do E. durans foi obtida através do sistema

Phoenix® e confirmada pela técnica de MALDI-TOF MS.

Figura 4. Distribuição das espécies de Enterococcus isolados de ICS do Projeto SCOPE e

identificadas por PCR e MALDI-TOF MS.

As identificações fenotípica (Phoenix®) e por espectrometria de massas (Vitek

MS® e Microflex LT®) foram comparadas com a genotípica (PCR) para as espécies

E. faecalis e E. faecium (Tabela 7). Vale lembrar que a única espécie de E. durans

incluída no estudo foi identificada pelo Phoenix® e por MALDI-TOF MS, onde todas

as metodologias foram consistentes.

Tabela 7. Concordância entre as identificações dos isolados de E. faecalis e E. faecium, incluídas no Projeto SCOPE Brasil, obtidas pelos métodos Phoenix

®, Vitek MS

®, Microflex LT

® com relação ao

método de referência (PCR).

Metodologias

PCR

Total Teste de Kappa

[K] ; (p)

Resultado

E. faecalis E. faecium

N % N % N %

Phoenix®

E. faecalis 109 76,2 3 2,1 112 78,3 [0,920] ; <0.001

Concordantes E. faecium 1 0,7 30 21,0 31 21,7

Total 110 76,9 33 23,1 143 100,0

Vitek MS®

E. faecalis 108 75,5 2 1,4 110 76,9 E. faecium 2 1,4 31 21,7 33 23,1 [0,921] ; <0.001 Concordantes

Total 110 76,9 33 23,1 143 100,0

Microflex LT®

E. faecalis 110 76,9 0 0,0 110 76,9 E. faecium 0 0,0 33 23,1 33 23,1 [1,000] ; <0.001 Concordantes

Total 110 76,9 33 23,1 143 100,0

110

33

1

E. faecalis

E. faecium

E. durans

(76,4%)

(0,7%)

(22,9%)

Resultados

77

Considerando o valor de k, todos os métodos de identificação demonstraram

ótimo nível de concordância. Entretanto, o método Microflex LT® apresentou-se

superior aos outros, com uma concordância perfeita (K=1,000), onde todos os

isolados identificados apresentaram score ≥ 2.0, dos quais, 123 (85,4%) isolados

apresentaram score superior a 2.3 e apenas 21 (14,6%) isolados apresentaram

score entre 2.0 e 2.29. Entretanto, mesmo os isolados com score inferior a 2.3, a

concordância foi de 100% com a identificação molecular. Enquanto que, Phoenix® e

Vitek MS® foram considerados equivalentes e apresentaram uma concordância

ótima, com valores de k respectivamente 0,920 e 0,921.

Todos os quatro isolados que apresnetaram incongruência na identificação

pelo Phoenix® comparando com a identificação molecular pela PCR apresentaram

valores de confiança de 99%. Entre os quatro isolados com erro da identificação da

espécie identificados pelo Vitek MS®, um apresentou 88,7% e os outros três

apresentaram 99,9% de confiança. Sendo que os isolados com incongruência na

identificação por esses dois métodos (Phoenix® e Vitek MS®) tratavam-se de

isolados diferentes.

5.3.2 Avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos pelos métodos de microdiluição em caldo automatizado (Phoenix®) e Etest®

O teste de sensibilidade quantitativo foi realizado pelo sistema Phoenix® para

todos as amostras de Enterococcus spp. (n=144) e interpretados conforme os

pontos de corte estabelecidos pelo CLSI, documento M100-S25. Assim, é possível

observar na Tabela 8 abaixo, o perfil de sensibilidade, a CIM50 e CIM90 das amostras

em geral, e também distribuídas conforme as duas espécies mais prevalentes, E.

faecalis e E. faecium.

Deste modo, 100% das amostras foram sensíveis à daptomicina, como

esperado, 98,2% dos E. faecalis foram sensíveis a ampicilina, contra 6,1% dos E.

faecium. Quanto aos aminoglicosídeos, gentamicina-sinergismo e estreptomicina-

sinergismo, foi possível observar maior sensibilidade de E. faecium à gentamicina-

sin (90%) contra 57,6% de sensibilidade para os E. faecalis, enquanto que E.

faecalis apresentou maior sensibilidade à estreptomicina-sin 58,3% quando

comparado com E. faecium com 27,3 % de sensibilidade.

Em relação à linezolida, quatro amostras apresentaram resistência

intermediária pelo método Phoenix®, com CIM de 4µg/mL, sendo três E.faecalis e

Resultados

78

um E. faecium, ou seja, as sensibilidades à linezolida de E. faecalis e E. faecium

foram respectivamente de 98,2% e 97%. Apenas 39,4% (n = 13) dos E. faecium e

86,4% (n = 95) dos E. faecalis foram sensíveis à vancomicina (Tabela 8).

Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, obtido pelo sistema Phoenix®, dos 144 isolados

de Enterococcus spp. incluídas no Projeto SCOPE Brasil.

Antimicrobianos

(Phoenix®)

Enterococcus spp. (n=144)*

E. faecalis (n= 110)

E. faecium (n=33)

CIM (µg/mL)a

S (%)b

CIM (µg/mL)a

S (%)b

CIM (µg/mL)a

S (%)b

CIM50 CIM90 CIM50 CIM90 CIM50 CIM90

Ampicilina 2 >16 77,1 2 4 98,2 >16 >16 6,1

Estreptomicina SIN <500 >500 58,3 ≤1000 >1000 66,4 >1000 >1000 27,3

Gentamicina SIN <500 >500 57,6 >500 >500 47,3 ≤500 ≤500 90

Daptomicina 2 4 100 2 4 100 2 4 100

Linezolida** 2 2 97,9 2 2 98,2 2 2 97

Vancomicina 1 >32 75,7 1 >32 86,4 >32 >32 39,4

* Inclui 1 isolado de E. durans. a) CIM = concentração inibitória mínima (CIM50 e CIM90, é aquela capaz de inibir, respectivamente 50 e 90% da amostragem); b) S = porcentagem de sensibilidade. **Antes da confirmação da CIM, realizada por Etest

®.

Foi realizada a confirmação da CIM para linezolida dos quatro isolados que

apresentaram resistência intermediária com CIM de 4µg/mL pelo Phoenix®. A CIM

de linezolida obtida utilizando o Etest® foi de 2µg/mL para as quatro amostras, sendo

consideradas sensíveis. Todas as amostras que apresentaram resistência à

Vancomicina foram submetidas ao Etest® para daptomicina, linezolida, teicoplanina

e vancomicina. A Tabela 9 demonstra o perfil de sensibilidade das amostras de E.

faecalis e E. faecium que apresentaram resistência à vancomicina pelo método

Phoenix®.

Resultados

79

Tabela 9. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados de E. faecalis e E. faecium, incluídos no Projeto SCOPE Brasil, e que apresentaram resistência à vancomicina pelas metodologias, Phoenix

® e Etest

®.

Antimicrobianos

EFSRV* (n= 15)

EFMRV** (n=20)

CIM (µg/mL)a

S (%)b

CIM (µg/mL)a

S (%)b

CIM50 CIM90 CIM50 CIM90

Phoenix®

Daptomicina 2 2 100

2 4 100

Linezolida 1 2 100 2 2 100

Vancomicina >32 >32 0 >32 >32 0

Etest®

Daptomicina 0,25 0,38 100

1,5 2 100

Linezolida 1,5 2 100 2 2 100

Teicoplanina 48 >256 0 64 >256 0

Vancomicina >256 >256 0 >256 >256 0

* EFSRV = E. faecalis resistente à vancomicina; ** EFMRV= E. faecium resistente à vancomicina; a) CIM = concentração inibitória mínima (CIM50 e CIM90, é aquela capaz de inibir, respectivamente 50 e 90% da amostragem); b) S = porcentagem de sensibilidade.

Todas as 35 amostras de Enterococcus spp. (15 E. faecalis e 20 E. faecium)

que foram resistentes à vancomicina tiveram sua resistência confirmada pelo Etest®

com CIM > 256 µg/mL para vancomicina acima de 32 µg/mL para teicoplanina.

Todas as amostras foram sensíveis a daptomicina e linezolida pelo Etest®. Entre os

ERV, E. faecalis apresentou apenas 6,7% de sensibilidade à gentamicina-sin contra

100% de sensibilidade para os E. faecium. Devido a algumas discrepâncias entre as

CIMs obtidas para linezolida entre os métodos Phoenix® e Etest® o que levou a

mudança de categoria de sensibilidade de intermediário utilizando o sistema

Phoenix®, para sensível segundo o Etest®, e para verificar comparar as CIMs obtidas

para daptomicina, optou-se por avaliar a concordância entre ambos os métodos

frente a esses dois antimicrobianos. De acordo os resultados demonstrados na

Figura 5, é possível observar baixa concordância entre ambos os métodos para

ambos antimicrobianos, com diferenças de até duas diluições.

Resultados

80

Figura 5. Regressão linear das CIMs de linezolida (A) e daptomicina (B), para os 35 isolados de EFSRV e EFMRV, obtidas por Etest

® e microdiluição em caldo sistema

Phoenix®. As áreas azuis indicam as CIMs dentro da categoria Sensível, de acordo com os

pontos de corte estabelecido pelo CLSI M100-S25.

5.3.3 Detecção do mecanismo de resistência à Vancomicina

Todos os 35 isolados de ERV com CIMs confirmadas por Etest®,

apresentaram o gene vanA positivo pela técnica de PCR convencional. Ou seja,

24,3% dos isolados incluídos no estudo apresentaram o gene vanA. Dos quais,

15/110 (13,6%) foram E. faecalis e 20/33 (60,6%) foram E. faecium (Figura 6). Todas

essas amostras positivas para o gene vanA foram submetidas à tipagem molecular.

Daptomicina

Linezolida

Resultados

81

EFSSV = Enterococcus faecalis sensível à vancomicina; EFMSV = Enterococcus faecium sensível à vancomicina; EFMRV = Enterococcus faecium resistente à vancomicina; EFSRV = Enterococcus faecalis resistente à vancomicina.

Figura 6. Distribuição dos 144 isolados de Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, de acordo com a espécie e a resistência à vancomicina.

5.3.4 Tipagem Molecular das Amostras de ERV

5.3.4.1 Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE) e Sequenciamento de Múltiplos Locus (Multilocus Sequence Typing - MLST)

Foi possível realizar a tipagem de todos os 35 isolados de ERV, dos quais 15

eram E. faecalis e 20 eram E. faecium. E a análise do perfil de bandas obtido foi

realizada conforme os critérios de Tenover et al. (1995) e pelo programa

BioNumerics versão 7.5 (Applied Maths Kortrijk, Belgium).

E. faecalis. A Figura 7 demonstra o dendrograma obtido por PFGE para os

15 EFSRV após análise no BioNumerics 7.5, onde é possível observar dois

diferentes grupos, um com 94,2% de similaridade contendo sete isolados, todos

pertencentes ao centro 01. E o outro com 93,9% de similaridade contendo quatro

isolados pertencentes aos centros: 01, 02 e 03, todos localizados no estado de São

Paulo. Também é possível observar os padrões eletroforéticos analisados

(9,1%)

(24,5%)

(57,1%)

(42,9%)

Resultados

82

visualmente segundo os critérios de Tenover et al., 1995, onde foram encontrados

cinco padrões: A, B,C,D e E. O padrão C foi o mais frequente contendo sete isolados

todos pertencentes ao centro 1 e classificados como sendo do mesmo grupo pela

análise feita no BioNumerics 7.5, onde a similaridade entre todas as amostras desse

grupo foi de 94,2%, além disso, as duas amostras desse grupo que foram

submetidas ao MLST apresentaram mesmo ST (526), evidenciando uma

similaridade genética pelas duas metodologias PFGE (tanto pela análise do

BioNumerics 7.5, quanto pela análise visual segundo Tenover et al. (1995) quanto

pela técnica de MLST). Seguido do padrão B contendo quatro isolados, o padrão D

apresentou dois subtipos D1 (um isolado) e D2 (um isolado) o padrão A foi

observado em apenas um isolado.

Após a análise da técnica de PFGE, sete isolados foram selecionados para

pesquisa do ST pela técnica de MLST. Os STs encontrados foram: 09, 103, 525 e

526. É possível observar que o ST 526 foi encontrado entre isolados pertencentes a

diferentes grupos do PFGE, onde dois deles apresentaram similaridade de 43,9%

(amostras: A35797 e A51376).

Resultados

83

Figura 7. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFSRV, contendo o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.

Resultados

84

E. faecium. A Figura 8 demonstra o dendrograma obtido da mesma forma

que foi realizado para E. faecalis. O padrão de PFGE analisada pelo BioNumerics

7.5 gerou três diferentes grupos, o maior contendo 10 isolados com 82,4% de

similaridade, o segundo com quatro isolados com 83,4% e o terceiro grupo

composto por apenas dois isolados com 86,7% de similaridade. Quatro isolados não

foram agrupados em nenhum grupo. Entre os isolados de E. faecium houve uma

maior variedade no padrão de bandas na maioria dos isolados, com apenas dois

isolados com padrão de bandas idênticos (34632 e 36611). Os centros médicos que

enviaram isolados de EFMRV estão localizados em SP, GO, RS e também DF.

Quanto aos padrões eletroforéticos, foram encontrados seis padrões: A, B, C,

D, E e F. O padrão mais frequente foi o A, contendo 10 isolados e 10 subtipos,

presentes no mesmo grupo do dendrograma obtido pela análise no BioNumerics 7.5,

com 82,4% de similaridade dentro desse grupo. O padrão D foi o segundo mais

frequente com 6 isolados e 5 subtipos diferentes, já os padrões B,C, E e F foram

representados por apenas um isolado cada.

Após a análise da técnica de PFGE, 15 isolados foram selecionados para

pesquisa do ST pela técnica de MLST. E os STs encontrados foram: 18, 412, 478, e

896. Sendo o ST 412 o mais frequentemente encontrado (11 isolados, presentes nos

grupos A, D, E e F) pertencentes aos três diferentes grupos obtido pela análise no

BioNumerics 7.5 e presentes nos centros 1, 6, 7, 12 e 13. Assim como ocorrido para

E. faecalis, foi possível observar que o ST 412 foi encontrado entre isolados

pertencentes a diferentes grupos do PFGE, onde dois deles apresentaram

similaridade de 56,2% (amostras: A36790 e A46.755, p.ex.).

Resultados

85

Figura 8. Dendrograma UPGMA obtido pelo programa BioNumerics 7.5 após análise do PFGE da similaridade dos isolados de EFMRV, contendo o ST e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos

Resultados

86

5.3.4.2 Análise do eBURST obtido por Sequenciamento de Múltiplos Loci (Multilocus Sequence Typing - MLST)

Os isolados de EFSRV submetidos à técnica de MLST apresentaram quatro

diferentes STs: 9, 103, 525 e 526. O ST526 foi o mais encontrado no nosso estudo,

representado por três isolados, esse ST trata-se de um subgrupo do complexo clonal

(CC) 6. O segundo ST mais encontrado no nosso estudo foi o ST103 (presente em

dois isolados). Os STs 9 e 525 foram encontrados em apenas um isolado cada.

Entretanto, o ST9 é um complexo clonal fundador, apresentando oito (08)

subgrupos, enquanto que o ST525 é um singleton, ou seja, apresenta uma variação

muito grande quando comparados com todos os outros STs e ainda não foi

vinculado a nenhum complexo clonal, devido ao seu grau de variação nos loci (Ruiz-

Garbajosa et al., 2006). O eBURST, que contém todos os STs de E. faecalis e os

STs encontrados nesse estudo podem ser visualizados na Figura 9.

Quantos aos EFMRV, observamos também a presença de quatro STs: 18,

412, 478 e 896. No entanto, o ST412 foi o mais encontrado, presente em 11

isolados, esse ST é um subgrupo fundador derivado do maior complexo clonal de E.

faecium o CC17. O ST478 foi observado em dois isolados do nosso estudo, esse ST

é derivado do subgrupo 412. O ST18 e o ST896 foram encontrados em apenas um

isolado cada. O ST18 é um grande subgrupo fundador, contendo mais de 500 STs

derivados dele. Enquanto que ST896 é um singleton e foi classificado muito

recentemente, por isso ainda não é possível localizá-lo no eBURST contendo os STs

totais. O eBURST dos E. faecium do nosso estudo pode ser visualizado na Figura 10

abaixo.

Resultados

87

Figura 9. eBURST de E. faecalis baseado nos STs totais representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecalis MLST, incluíndo os

STs dos isolados de EFSRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST (http://efaecalis.mlst.net).

Resultados

88

Figura 10. eBURST de E. faecium baseado nos STs representados pelos isolados contidos no banco de dados on-line E. faecium MLST, incluíndo os STs

dos isolados de EFMRV do Projeto SCOPE Brasil submetidos à técnica de MLST (http://efaecium.mlst.net).

478 412

18

Resultados

89

5.3.4.3 Tipagem por Espectrometria de Massas

Neste estudo investigamos a acurácia dos equipamentos de Espectrometria

de Massas Vitek MS® e Microflex LT® para realizar a tipagem de EFSRV (n=15) e

EFMRV (n=20) e correlacionamos com a tipagem obtida pelas técnicas de PFGE e

MLST. Além disso, avaliamos a acurácia do Microflex LT® para diferenciação entre

os EFSSV de EFSRV e EFMSV de EFMRV.

5.3.4.3.1 Tipagem de Enterococcus spp. por Vitek MS®

O dendrograma obtido após análise no software Saramis® é do tipo UPGMA e

analisa o número de massas idênticas. No entanto, não foi possível realizar nenhum

correlação com os dados da similaridade obtida pela técnica de PFGE, tanto com

relação aos critérios de Tenover et al., (1995) quanto em relação aos dados obtidos

pelo BioNumerics 7.5, também não foi possível observar uma correlação com os

STs obtidos pela técnica de MLST. O perfil de similaridade de acordo com o número

de massas idênticas de EFSRV pode ser visualizado na Figura 11A, onde é possível

observar dois diferentes grupos, um contendo 11 isolados (onde cinco apresentaram

mais que 80 massas idênticas) e outro contendo quatro isolados com mais de 50

massas idênticas em cada grupo.

O dendrograma obtido com relação as massas idênticas de EFMRV não

evidencia a separação em grupos, onde todos os isolados apresentaram acima de

40 massas idênticas, apenas 9 isolados apresentaram acima de 80 massas

idênticas, como demonstrado na Figura 11B.

Resultados

90

A

B

Figura 11. Dendrograma dos espectros de massas dos 35 ERV, obtido pelo Vitek MS®,

incluindo a tipagem por PFGE e MLST (A- E. faecalis e B- E. faecium).

Resultados

91

5.3.4.3.2 Tipagem de Enterococcus spp. por Microflex LT®

A tipagem através do perfil proteico obtido pelo Microflex LT® foi realizada por

dois programa diferentes: BioTyper 3.1 OC e BioNumerics 7.5.

BioTyper 3.1 OC

Os dendrograma UHCA obtido com auxílio do programa BioTyper 3.1 OC

demonstram o nível de distância entre os perfis proteicos encontrados entre os

isolados de EFSRV (Figura 12A, 12B, 13A e 113B) e EFMRV avaliados (Figura 15A,

15B, 16A e 16B). Além disso, o programa permitiu gerar um “pseudogel” contendo

perfis proteicos apresentados em bandas, conforme as Figuras 14 e 17,

respectivamente EFSRV e EFMRV.

Para E. faecalis, é possível observar que nos quatro dendrogramas,

considerando 5, 10, 30 e 50 picos (Figuras 12A, 12B, 13A e 13B respectivamente),

as amostras foram separadas em dois diferentes grupos maiores um com distância

espectral de 0.8 e outro com 1.0 em todos os quatro dendrogramas. No entanto,

houve uma migração dos isolados de acordo com os picos, gerando padrões de

similaridade completamente diferentes, mesmo para os isolados pertencentes a

padrões idênticos de PFGE e mesmo ST. Além disso, alguns isolados foram

migrados para grupos diferentes de acordo com o número de picos, p. ex.: 34501

(pertencente ao grupo identificado em azul, no dendrograma considerando 5 picos,

Figura 12A, passou para o grupo em vermelho quando foram considerados os 10

principais picos, Figura 12B), modificando o padrão de similaridade

consideravelmente. Assim, não foi possível observar uma concordância significativa

entre a similaridade obtida com os diferentes picos com a similaridade obtida pelo

PFGE (Figura 7).

Quanto ao “pseudogel” (Figura 14), é possivel observar uma diferenca na

intensidade dos picos encontrados (representados em bandas), com algumas

características semelhantes entre alguns isolados, como um pico de cerca de

4.200Da presente em todos os isolados. Também é possível observar que os

isolados 34812 e 34501 apresentam um pico de pouco menos de 4.800 Da (com

diferença na intensidade).

Resultados

92

A

B

Figura 12. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos de proteínas e tipagem por PFGE e MLST.

Resultados

93

A

B

Figura 13. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV obtido através do programa BioTyper 3.1 OC dos isolados de EFSRV. A – com 30 picos e B com 50 picos e tipagem por PFGE e MLST.

Resultados

94

Figura 14. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV, obtido pelo programa BioTyper 3.1 OC.

Resultados

95

Entre os isolados de E. faecium, é possível observar que nos quatro

dendrogramas, considerando 5, 10, 30 e 50 picos (Figuras 15A, 15B, 16A e 16B

respectivamente), as amostras também foram separadas em dois diferentes grupos

maiores, ambos com distância espectral acima de 1.0. É possível observar também

que o isolado 34.632 migrou de grupo de similaridade quando comparado o

dendrograma considerando 5 picos (Figura 15A) com os dendrogramas

considerando 10, 30 e 50 picos (Figuras 15B, 16A e 16B respectivamente). Também

foi possível observar uma maior consistência entre as similaridades avaliadas com

10, 30 e 50 picos, mesmo existindo algumas diferenças na distância espectral de

alguns isolados quando houve a mudança do número de picos. Entretanto, assim

como os isolados de EFSRV, não é possível estabelecer uma correlação segura

com o padrão de similaridade obtido por PFGE (Figura 8). Esse resultado concorda

com a literatura em que demonstraram que o MALDI-TOF MS não é uma boa

ferramenta para se analisar similaridade genética, utilizando a análise por

dendrograma UHCA (Lash et al., 2014).

Quanto ao “pseudogel” (Figura 17), é possivel observar uma grande

diversidade no padrão de picos (dispostos em bandas) também com diferença na

intensidade dos mesmos.

Resultados

96

A

B

Figura 15. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 05 picos e B com 10 picos e tipagem por PFGE e MLST.

Resultados

97

A B

Figura 16. Dendrograma PCA do tipo Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis (UHCA) dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV obtido através do programa BioTyper 3.1 OC. A – com 30 picos e B com 50 picos e tipagem por PFGE e MLST.

Resultados

98

Figura 17. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV, obtido pelo programa BioTyper 3.1 OC.

Resultados

99

BioNumerics 7.5

Inicialmente, analisou-se o espectros dos isolados de EFSRV (Figura 18) e

EFMRV (Figura 19) utilizando o algoritmo UPGMA. No entanto, é possível observar

que isolados apresentando padrões espectrais diferentes foram considerados

idênticos. Deste modo, modificou-se o algoritmo para construção do dendrograma,

para Variação Mínima de Ward, que desconsidera a intensidade dos picos.

Para cada análise construindo dendrograma com auxílio do BioNumerics 7.5,

foi gerado um “pseudogel” de pré-processamento, evidenciando o padrão espectral

disposto em bandas, onde a intensidade das massas pode ser correlacionada com a

intensidade das bandas. Assim, foram realizadas as seguintes análises:

Avaliou-se a similaridade entre os isolados de ERV, em que, a Figura 20

demonstra o padrão de similaridade entre os isolados de EFSRV: onde é possível

observar que os isolados de nº 34501; 35797; 36525; 37072; 37292; 37660; 37792;

39453 e 51376 apresentaram mesmo padrão espectral e consequentemente 100%

de similaridade. Além disso, é possível observar que a partir dos espectros do

MALDI-TOF MS, encontramos uma boa concordância com a técnica de MLST, uma

vez que os isolados que apresentaram o mesmo ST apresentaram maior

similaridade entre si.

Os dois isolados que apresentaram ST 103 apresentaram similaridade de

80%, e todos os isolados pertencentes ao ST 526 apresentaram 100% de

similaridade, como só tivemos um isolado pertencente ao ST 9 e um pertencente ao

ST 525, não foi possível avaliar o agrupamento de outros isolados pertencentes a

esses STs. No entanto, isolados pertencentes ao padrão de PFGE B e C foram

agrupados como sendo 100% semelhantes segundo a técnica de MALDI-TOF MS.

O “pseudogel” referente aos espectros dos isolados de EFSRV pode ser visualizado

na Figura 21.

Para EFMRV (Figura 22) é possível observar que, os isolados 36611 e 37080;

32738 e 41093; 37207 e 39935; 37802 e 43274 apresentaram mesmo padrão

espectral entre si e o “pseudogel” respectivo pode ser observado na Figura 23. Vale

lembrar que, as Figuras 18, 19, 20 , 22 e 25 incluem o padrão de bandas de PFGE,

apenas para permitir uma melhor comparação entre os métodos, no entanto, apenas

os espectros de massas foram utilizados como critérios para a construção dos

dendrogramas.

Resultados

100

Figura18. Dendrograma do tipo UPGMA obtidos através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de

massas dos 15 isolados de EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®.

Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500 Análise da matriz de distância: Euclidiana Método de agrupamento: UPGMA Tolerância constante: 0,5 Tolerância linear: 300ppm

Resultados

101

Figura 19. Dendrograma UPGMA obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT

®.

Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500 Análise da matriz de distância: Euclidiana Método de agrupamento: UPGMA Tolerância constante: 0,5 Tolerância linear: 300ppm

Resultados

102

Figura 20. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®.

MALDITOF

Nº Centro Padrão ST

PFGE – EFMRV x EFSRV

Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500 Análise da matrix de distância: Euclidiana Método de clusterização: Ward Tolerância constante: 0,5 Tolerância linear: 300ppm

Resultados

103

Figura 21. “Pseudogel” dos espectros de massas analisados no MALDI-TOFMicroflex LT® dos 15 isolados de EFSRV, obtido pelo programa

BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciada através da intensidade na cor verde de cada massa.

Resultados

104

Figura 22. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 considerando apenas os espectros de massas dos 20 isolados de

EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®.

Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500 Análise da matriz de distância: Euclidiana Método de agrupamento: Ward Tolerância constante: 0,5 Tolerância linear: 300ppm

Resultados

105

Figura 23. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®,

obtido pelo programa BioNumerics 7.5. A intensidade pré-processamento do espectro de massas pode ser evidenciado com os através da intensidade na cor verde de cada massa.

Nº

Resultados

106

Com relação a acurácia do MALDI-TOF em diferenciar os isolados EFSRV de

EFMRV analisados no mesmo dendrograma construído com base no algoritmo de

Ward considerando apenas o padrão espectral, é possível observar a migração

entre os isolados de mesma espécie, com exceção de dois isolados, ambos EFMRV

(amostras: 30578 e 47347) que não apresentaram a massa de 7311.41 KDa, que

está presente em todos os outros 18 isolados de EFMRV (Figura 24). O “pseudogel”

referente aos espectros dos isolados de EFMRV e EFSRV pode ser visualizado na

Figura 25.

Figura 24. Dendrograma do tipo Ward obtido através do programa BioNumerics 7.5 baseado apenas nos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex.

EFMRV

EFSRV

Range de Massas: m/z 2.000 a 12.500 Análise da matriz de distância: Euclidiana Método de agrupamento: Ward Tolerância constante: 0,5 Tolerância linear: 300ppm

Resultados

107

Figura 25. “Pseudogel” dos espectros de massas dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 isolados

de EFMRV analisados no MALDI-TOFMicroflex LT®, obtido pelo programa BioNumerics 7.5.

5.4 Avaliação dos dados epidemiológicos após a caracterização microbiológica dos isolados

Após a realização dos ensaios laboratoriais, foi possível analisar os dados

dos pacientes das 118 fichas clínicas enviadas e avaliar alguns dados

epidemiológicos associados a espécie de Enterococcus e a sensibilidade à

vancomicina, ou seja, entre os principais fatores associados a infecções pelo

EFSRV

EFMRV

EFSRV

EFMRV

Resultados

108

microrganismo estudado, aparentemente, apenas cateter vesical apresentou um p =

0,032, que foi significativo para E. faecalis (tanto para os resistentes à vancomicina

quanto para os sensíveis). Quanto aos isolados de E. faecium observou-se o mesmo

diante de neoplasias com p = 0,048 (Tabela 10).

Tabela 10. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV,

EFMRV e EFMSV com as principais doenças de base e fatores geralmente associados a ICS e que foram apresentados pelos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.

Doenças de base/

Fatores associados

Grupo Teste de Grupo Teste de

EFSRV EFSSV χ2 (p) EFMRV EFMSV χ2 (p)

Do

en

ças d

e b

ase Diabetes mellitus 0 (0,0%) 3 (4,2%) 1 1 (5,6%) 2 (16,7%) 0,709

Gastrointestinal 0 (0,0%) 2 (2,8%) 1 4 (22,2%) 1 (8,3%) 0,617

Neoplasia 4 (28,6%) 16 (22,2%) 0,866 9 (50,0%) 1 (8,3%) 0,048*

Neurológico 2 (14,3%) 8 (11,1%) 1 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1

Trauma 0 (0,0%) 10 (13,9%) 0,304 0 (0,0%) 1 (8,3%) 0,836

Fa

tore

s a

sso

cia

do

s

Acesso arterial 0 (0,0%) 4 (5,6%) 0,834 0 (0,0%) 1 (8,3%) 0,836

Cateter periférico 3 (21,4%) 11 (15,3%) 0,861 4 (22,2%) 2 (16,7%) 1

Cateter venoso central 13 (92,9%) 55 (76,4%) 0,304 13 (72,2%) 11 (91,7%) 0,402

Cateter vesical 11 (78,6%) 31 (43,1%) 0,032* 8 (44,4%) 6 (50,0%) 1

Diálise peritoneal 0 (0,0%) 3 (4,2%) 1 0 (0,0%) 1 (8,3%) 0,836

Hemodiálise 3 (21,4%) 9 (12,5%) 0,645 2 (11,1%) 2 (16,7%) 1

Neutrófilos < 1000 0 (0,0%) 2 (2,8%) 1 2 (11,1%) 0 (0,0%) 0,654

NPP* 0 (0,0%) 5 (6,9%) 0,695 1 (5,6%) 1 (8,3%) 1

Tx MO* 0 (0,0%) 1 (1,4%) 1 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1

Tx Sólido* 0 (0,0%) 3 (4,2%) 1 0 (0,0%) 2 (16,7%) 0,296

UTI* 10 (71,4%) 36 (53,7%) 0,358 8 (47,1%) 6 (54,5%) 1

Ventilação mecânica 9 (64,3%) 27 (37,5%) 0,118 8 (44,4%) 8 (66,7%) 0,411

*NPP= nutrição parenteral prolongada; Tx= transplante; MO= medula óssea; UTI=unidade de tratamento intensivo

Nas fichas clínicas enviadas pelos centros médicos não apresentavam os

dados relacionados a tempo de internação e uso prévio de antimicrobianos, por isso,

não foi possível avaliar a relação desses fatores com nenhum dos grupos.

Para verificar se existiu relação entre os grupos (EFSRV, EFSSV, EFMRV,

EFMSV) com o sexo utilizou-se o teste de Chi-quadrado. Onde não houve relação

significante entre os sexos com nenhum grupo (Tabela 11). Além disso, não foi

observada relação significante entre a condição na alta ou óbito entre os grupos de

pacientes que apresentaram infecção por: EFSRV, ESFSV, EFMRV e EFMSV

Resultados

109

(Tabela 12). Também não houve relação significante entre os grupos e a distribuição

da idade (Tabela 13).

Tabela 11. Teste do X

2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV, EFSSV,

EFMRV e EFMSV de acordo com o sexo dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.

EFMRV EFMSV EFSRV EFSSV Total Teste de Resultado

N % N % N % N % N % χ2 (p)

Sexo F 8 40,0 5 35,7 10 66,7 40 42,1 63 43,8

Não diferentes

M 12 60,0 9 64,3 5 33,3 55 57,9 81 56,3 0,285

Total 20 100,0 14 100,0 15 100,0 95 100,0 144 100,0

A Figura 26 demonstra a distribuição geográfica, dos isolados de

Enterococcus spp. enviados pelos centros médicos incluídos no estudo,

evidenciando o número de isolados de EFSRV e EFMRV. Deste modo, é possível

observar no mapa, os estados apresentados em cor laranja representam aqueles

que enviaram amostras de ERV, sendo E. faecalis representado em verde e E.

faecium em azul. Assim, somente os centros 1,2 e 3 enviaram isolados de EFSRV. E

os centros 1,3, 4, 6, 7, 12 e 13 enviaram isolados de EFMRV. Apenas os centros 1

e 3 enviaram tanto EFSRV quanto EFMRV. Sendo que o centro 1 enviou o maior

Tabela 12. Teste do X2 para verificar a relação do desenvolvimento de ICS por EFSRV,

EFSSV, EFMRV e EFMSV de acordo com a idade dos pacientes incluídos no Projeto SCOPE Brasil.

GRUPO Teste de Resultado

EFMRV EFMSV EFSRV EFSSV Total Kruskal-Wallis (p)

Média 48,93 43,45 62,93 53,01 52,57

Mediana 61,00 45,50 63,00 59,50 58,50 0,238 Iguais

Desvio-padrão 27,09 26,16 15,87 24,45 24,45

N 19 14 15 94 142

Tabela 13. Relação dos isolados de EFSRV, EFSSV. EFMRV e EFMSV em relação ao desfecho clínico nos episódios de ICS dos pacientes do Projeto SCOPE Brasil.

Grupos/

Condição

EFMRV EFMSV EFSRV EFSSV Total Teste de

χ2 (p) Resultado

N % N % N % N % N %

Alta 6 35,3% 5 41,7% 5 35,7% 31 50,0% 47 44,8%

Óbito 11 64,7% 7 58,3% 9 64,3% 31 50,0% 58 55,2% 0,612 Iguais

Total 17 100,0% 12 100,0% 14 100,0% 62 100,0% 105 100,0%

Resultados

110

número de isolados resistentes à vancomicina, com 18 isolados dos quais 11 foram

EFSRV e 7 EFMRV. E o centro 2 enviou apenas 2 isolados de EFMRV.

A distribuição geográfica dos STs encontrados entre os isolados de EFSRV e

EFMRV submetidos a MLST pode ser visualizada na Figura 27. Onde foram

analisados ERV enviados pelos centros 1, 2, 3, 4, 6, 7, 12 e 13. Os STs encontrados

de EFSRV foram o 9, 103, 525 e 526. O Centro 1 apresentou os STs 9, 103 e 526. O

Centro 2 apenas o ST 103 e o Centro 3 apresentou os STs 525 e 526. Quanto aos

EFMRV, os STS encontrados forma 18, 412, 478 e 896. Sendo o ST 412 o mais

frequente, presente em 6 centros pertencentes a estados diferentes, 3 centros no

estado de SP (centros 1, 4 e 6), o centro 7 (RS), o centro 12 (GO) e o centro 13

(DF). O ST 478 foi encontrado apenas em dois centros: 1 e 13. O ST 18 e ST 898

apenas nos centros 4 e 3 respectivamente.

1 2 3 4 5

6

7

9 10

12

13

15

2

2

11

7

1

2 1

1

5

3

Envio de ESV

Envio de ERV

Centros participantes

EFMRV (1,3,4,6,7,12,13)

EFSRV (1,2,3)

Figura 26. Distribuição geográfica do número de isolados de EFSRV e EFMRV enviados de acordo com o Centro médico participante.

Resultados

111

1 6 5 4 3

2

7

9 10

12

13

15

Figura 27. Distribuição geográfica dos STs de EFSRV e EFMRV encontrados no estudo de acordo com o Centro médico participante.

Discussão

112

6. DISCUSSÃO

Discussão

113

A grande maioria dos Enterococcus spp., incluindo espécies que são

importantes agentes de infecção hospitalar, são membros da microbiota do trato

gastrointestinal de humanos e animais, inclusive insetos. No entanto, ao longo dos

anos, sobretudo nas duas últimas décadas, Enterococcus spp. tem emergido como

um dos principais causadores de infecções hospitalares. Vários estudos

evidenciaram que Enterococcus spp. está entre as espécies mais prevalentes

causadoras de ICSs (Magil et al., 2014; Lebreton, Willems & Gilmore, 2014; ANVISA,

2014; Marra et al., 2011; Chowdhury et al. 2009; Hidron et al. 2008; Olivier et al.

2008; Murdoch et al., 2009; Wisplinghoff et al. 2004).

Esse fato está provavelmente relacionado a alguns fatores, tais como: a maior

ocorrência de doenças degenerativas e neoplásicas, o grande número de

transplantes de órgãos realizados, a maior utilização de terapias

imunossupressoras, quimioterapia e uso de antimicrobianos de amplo espectro, bem

como a realização de maior número de procedimentos médicos invasivos,

proporcionando a translocação desses microrganismos. É importante destacar que,

geralmente, as ICSs por Enterococcus spp. estão associadas com alta mortalidade e

prognóstico reservado, sobretudo quando causadas por isolados resistentes à

vancomicina (Short et al. 2014; Whang et al. 2013).

Diante dessa problemática, estudos epidemiológicos sobre infecções

nosocomiais são ferramentas fundamentais na elucidação de questões específicas,

relacionadas a distribuição dos microrganismos mais frequentemente encontrados,

suas características de virulência e peculiaridades com relação ao perfil de

sensibilidade e os mecanismos de resistência aos antimicrobianos, além de tipagem

molecular.

Este trabalho consiste na maior casuística de ICSs por espécies de

Enterococcus num estudo multicêntrico realizado no Brasil. Neste estudo a

correlação entre o agente etiológico como causa da infecção foi muito bem

estabelecida com critérios clínicos e laboratoriais rigorosos e padronizados, evitando

a valorização de colonizantes e contaminantes. Deste modo, pudemos observar

dados consistentes e realistas sobre o panorama dessas infecções em alguns

centros brasileiros. Consequentemente, este estudo permitiu a caracterização

epidemiológica das espécies de Enterococcus spp. causadoras de ICS em 12

centros médicos brasileiros, contribuindo com a compreensão sobre: (i) distribuição

das espécies mais prevalentes e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos; (ii)

Discussão

114

confirmação da presença do gene vanA entre os isolados resistentes à vancomicina;

(iii) caracterização molecular dos isolados apresentando gene vanA por três

diferentes métodos, PFGE, MLST e MALDI-TOF MS.

Estudos semelhantes já foram realizados em outros países, onde as

conclusões obtidas e a melhor compreensão dessa problemática mundial,

proporcionaram condutas clínicas e laboratoriais mais adequadas (Warren et al.

2001; Wisplingghoff et al. 2004; Martínez-Odriozola et al. 2007; Vicent et al. 2009;

Marra et al. 2011).

Dados Epidemiológicos:

O presente estudo é uma extensão do projeto SCOPE Brasil, que foi

conduzido por Marra et. al. (2011), onde foram avaliados 2.668 casos de ICSs,

dentro os quais 104 isolados foram do gênero Enterococcus. Na casuística de nosso

trabalho, além dos 104 Enterococcus spp. incluídos no estudo acima,

acrescentaram-se mais 40 isolados de Enterococcus spp. que foram enviados pelos

diversos centros após a finalização do SCOPE Brasil. No estudo SCOPE Brasil,

Enterococcus spp. foi o oitavo microrganismo mais frequentemente isolado entre os

2.688 casos de ICS estudados. Outros dados nacionais, como o de Gales et al.

2012) (estudo SENTRY) e o boletim informativo da ANVISA (2014) concordam com

os achados por Marra et al. (2011) (que incluem as amostras do presente estudo),

onde Enterococcus spp. foi também o oitavo microrganismo mais isolado de ICS.

Nossos dados (Marra et al. 2011) nacionais da epidemiologia dos principais

microrganismos causadores de ICS são divergentes dos encontrados nos estudos

internacionais (Biavasco et al., 2007; Tsai et al., 2005), onde Enterococcus spp.

foram a segunda causa mais comum de ICS nos Estados Unidos, enquanto que os

relatos de Billington et al. (2014) no Canadá e Wisplinghoff et al. (2004) no Estados

Unidos, apontaram Enterococcus spp. como terceiro microrganismo mais isolado

das ICS avaliadas. Já no estudo espanhol conduzido por Martínez-Odriozola et al.

(2007), Enterococcus spp. foi o quinto isolado mais frequente causador de ICS. Esse

fato pode ser melhor compreendido se considerarmos que o Brasil é um país de

clima tropical e que apresenta temperaturas mais elevadas, o que pode contribuir

com o isolamento de bacilos Gram-negativos com mais frequência, modificando a

epidemiologia dos microrganismos mais isolados quando comparado com países de

Discussão

115

clima frio (Marra et al., 2011).

Recentemente, Magill et al. (2014) realizaram um estudo multicêntrico

americano incluindo 183 centros médicos e constataram que o Enterococcus spp. foi

o quinto agente mais prevalente de ICS.

Com relação aos dados demográficos dos pacientes estudados, observamos

que a mediana de idade foi de 58 anos, sendo que 53,4% dos pacientes pertenciam

ao sexo masculino e que 92,4% das hemoculturas dos pacientes que apresentaram

ficha clínica disponível (118 fichas clínicas) foram monomicrobianas. Observamos

também que 21 pacientes tinham menos que 16 anos de idade. Esses dados

diferem discretamente dos encontrados por Billington et al. 2014, onde a mediana de

idade foi de 68 anos, 66% do sexo masculino e 74% dos hemoculturas

monomicrobianas e no estudo de Martínez-Odriozola et al. 2007 no qual verificou-se

que 62,3% dos pacientes foram do sexo masculino e 80% do total de hemoculturas

foram monomicrobianas. Quanto à idade dos pacientes, nesse estudo não foi

calculada a mediana e separou-se por faixa etária, onde 38,7% dos pacientes

apresentavam entre 56 e 75 anos de idade e 34,8% apresentavam acima de 75

anos.

Com relação as doenças de base e fatores associados a ICS por

Enterococcus spp. nossos achados são muito similares aos encontrados em outros

estudos (Billington et al., 2014; Ghanem et al., 2007; Martínez-Odriozola et al., 2007;

Wisplinghoff et al., 2004). Alguns dados foram diferentes dos encontrados no nosso

estudo, como algumas doenças de bases que apresentaram uma prevalência maior

entre pacientes portadores de ICS por Enterococcus spp., por exemplo, síndrome da

imunodeficiência humana (Martínez-Odriozola et al. 2007). Provavelmente, as

divergências encontradas entre o nosso estudo com os dados descritos na literatura

podem estar relacionadas com os critérios de inclusão dos pacientes entre os

diversos estudos.

Dados microbiológicos:

No presente estudo, entre os 144 isolados de Enterococcus spp., a espécie E.

faecalis foi a mais prevalente com 76,4% (n=110), seguido de E. faecium 22,9%

(n=33) e apenas 0,7% de E. durans (apenas1 isolado).

Discussão

116

Nossos dados são semelhantes aos publicados no Boletim Informativo

(ANVISA, 2014), em que, das 662 espécies de Enterococcus identificadas, 71,9%

(476) eram E. faecalis e 28,1% (186) eram E. faecium. Prevalências semelhantes

foram encontradas por Billintong et al. (2014) num estudo canadense onde n=467,

70% eram das espécies E. faecalis e n=169, 25,4% eram E. faecium e 4,6% (n=31)

eram pertencentes a outras espécies. No estudo realizado na Sérvia E. faecalis foi

responsável por 55.05% (n=49) e E. faecium por 41.57% (n=37) das ICS (Mira et al.,

2014), em outro estudo europeu (Espanha), por Martínez-Odriozola et al. (2007), E.

faecalis e E. faecium apresentaram uma prevalência de 69,9% (n=127) e 21,9%

(n=40), respectivamente, outras espécies apresentaram 8,2% (n=15).

Em outras casuísticas, E. faecium foi mais prevalente que E. faecalis, como

por exemplo, no estudo espanhol conduzido por Gudiol et al. (2013), no qual 51,4%

(n=54) contra 36,2% (n=38), respectivamente. Entretanto, esse estudo foi realizado

em um centro de referência em câncer, o que pode ter contribuído com a mudança

na prevalência das espécies, já que aparentemente existe uma maior prevalência de

infecções por E. faecium nesse grupo de pacientes.

Quanto às plataformas utilizadas para identificação dos isolados incluídos

neste estudo, todas as três (Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT®) demonstraram

resultados concordantes com a técnica de PCR. Todas as metodologias

apresentaram 100% de concordância com a identificação do gênero Enterococcus.

Entretanto, apenas o Microflex LT® Bruker® que utiliza a técnica de espectrometria

de massas demonstrou-se 100% concordante com valor de k =1,000 e p < 0,001

para ambas espécies E. faecalis e E. faecium.

O Vitek MS® BMX identificou corretamente 97,2% (n=140) dos isolados em

nível de espécie, apresentando incongruências na identificação de quatro isolados,

onde identificou dois E. faecalis (identificado como E. faecalis pela técnica de PCR)

como sendo E. faecium (com porcentagem de confiança de 99,9% para ambos) e

identificou como sendo de E. faecalis dois isolados de E. faecium (com porcentagem

de confiança de 99,9% e o outro com 88,7%), apresentando o valor de k = 0,921 e p

< 0,001. O equipamento Phoenix® também apresentou 97,2% de concordância em

relação a identificação molecular, onde houve erro na identificação de um isolado de

E. faecalis identificado como E. faecium e três isolados de E. faecium, identificados

como E. faecalis. Todos os quatro isolados com erro na identificação pelo Phoenix®

apresentaram acima de 97% de confiança, sendo que o manual do equipamento

Discussão

117

considera que a espécie deve ser confiável com valores acima de 94% (valor de

confiança mínimo para espécie, estabelecido pelo manual do fabricante).

Na prática laboratorial, usualmente, espécies de E. faecalis são sensíveis a

ampicilina e isolados de E. faecium tendem a ser resistentes. Deste modo, todos os

isolados que apresentaram identificação incongruente pelo sistema Phoenix ou pelo

Vitek MS® apresentaram o perfil esperado frente à ampicilina, ou seja, os E. faecalis

foram sensíveis e os E. faecium resistentes à ampicilina (Merlo et al., 2015; Arias &

Murray et al., 2012) e todos os quatro isolados com inconsistência na identificação

pelo Vitek MS® apresentaram resistência à vancomicina com CIM > 256 µg/mL

(Anexo 2).

Para o único isolado de E. durans, não foi possível realizar a confirmação da

espécie através da técnica de PCR, no entanto, esse isolado teve sua identificação

concordante entre as três metodologias: Phoenix®, Vitek MS® e Microflex LT®

Bruker®.

Todos as identificações incongruentes foram repetidas no mesmo dia com a

mesma colônia, no entanto, mantiveram-se os mesmos erros de identificação.

Quanto ao Phoenix®, os erros podem ter sido gerados devido a espécimes com

variações no metabolismo enzimático de carboidratos ou aminoácidos, gerando o

biótipo inconsistente com os dados moleculares. Já o Vitek MS® recomenda realizar

o ensaio de espectrometria de massas utilizando o microrganismo direto da colônia

sem extração de proteínas, isso pode ter influenciado na identificação dos isolados.

Como o equipamento Vitek MS® ficou disponível por tempo limitado para a

realização dos experimentos deste estudo, não foi possível realizar os testes a partir

da extração de proteínas.

Nossos achados concordam com relatos anteriores (Fang et al., 2012;

Schulthess et al., 2012; van Veen et al., 2010), onde houve 100% de concordância

na identificação de E. faecalis e E. faecium, utilizando o equipamento Microflex LT®

Bruker® e muito semelhantes aos encontrados por Çekin et al. (2012) onde houve

97,8% de concordância na identificação de espécies de Enterococcus com o método

molecular de referência, utilizando o sistema Phoenix®. Resultados similares foram

obtidos nos estudos de Moon et al. (2013) e Fang et. al. (2012), que verificaram

100% de concordância na identificação de E. faecalis e E. faecium, utilizando Vitek

MS®.

Discussão

118

Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e presença do gene vanA:

Quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, optou-se por analisar o

perfil de sensibilidade do gênero, em seguida, estratificado de acordo com as

espécies E. faecalis e E. faecium, pois alguns laboratórios nacionais ainda não

conseguem realizar a identificação final da espécie utilizando os métodos de

identificação convencionais. Deste modo, ao avaliar a sensibilidade do gênero no

nosso estudo, todos os 144 isolados (100%) apresentaram sensibilidade a

daptomicina e linezolida, após confirmação das CIMs desses antimicrobianos por

Etest®. Já para ampicilina, estreptomicina-sinergismo e gentamicina-sinergismo, a

sensibilidade foi respectivamente 77,1%, 58,3% e 57,6%. Para vancomicina, a

sensibilidade do gênero foi de 75,7%.

Quando os isolados foram estratificados por espécie, verificou-se que: o único

isolado de E. durans foi sensível a todos os antimicrobianos avaliados, entre os 110

E. faecalis, 98,2% foram sensíveis à ampicilina, 66,4% a estreptomicina-sinergismo

e apenas 47,3% de sensibilidade à gentamicina-sinergismo. Entre os 33 isolados de

E. faecium observamos um baixo índice de sensibilidade aos antimicrobianos, onde

apenas 6,1% foram sensíveis a ampicilina e 27,3% foram sensíveis à

estreptomicina-sinergismo. Vale ressaltar que os nossos E. faecium apresentaram

maior sensibilidade à gentamicina-sinergismo (90%) quando comparados com os

isolados de E. faecalis (57,6%).

Quanto à vancomicina, 35/144 (24,3%) isolados foram resistentes dos quais:

60,6% (n=20/33) foram E. faecium e 13,6% (n=15/110) foram E. faecalis. Todos

esses 35 isolados apresentaram o gene vanA positivo, nenhum apresentou vanB,

concordando com estudos brasileiros, em que o gene vanA foi o único mecanismo

de resistência à vancomicina encontrado entre os Enterococcus spp. (Merlo et al.,

2015; Resende et al., 2014; da Silva et al., 2012; d`Azevedo et al., 2009; d`Azevedo

et al., 2008). Em nosso país, são raros os relatos de resistência à vancomicina

devido à presença do gene vanB entre isolados de Enterococcus spp. (Merquior et

al.2012; Cantarelli et al., 2011).

Houve uma discrepância significativa entre as CIMs obtidas pelo Phoenix®

para daptomicina e linezolida quando comparadas com as CIMs obtidas por Etest®.

Para o Phoenix houve uma tendência de CIMs maiores para ambos os

antimicrobianos, com diferença de até duas diluições. Para daptomicina todos os

Discussão

119

isolados foram considerados sensíveis por ambas as metodologias, apesar de cinco

isolados apresentarem até duas diluições acima das CIMs, quando utilizado o

Phoenix. Enquanto que, para linezolida houve mudança da categoria de

sensibilidade para dois isolados, que apresentaram resistência intermediária

segundo o Phoenix com CIM de 4 µg/mL, já para o Etest® foram considerados

sensíveis (um apresentando CIM de 1 µg/mL e o outro apresentando 2 µg/mL). Vale

ressaltar que, as amostras avaliadas com relação a sensibilidade à daptomicina,

foram enviadas numa época em que esse antimicrobiano ainda não era utilizado no

Brasil.

Ao analisar os dados sobre prevalência de ERV isolados de ICS na literatura,

é possível observar que existe uma variação na epidemiologia de acordo com a

região geográfica e critérios de inclusão no estudo (Marra et al., 2011). Na maioria

dos relatos em diversas partes do mundo, existe uma tendência entre os isolados E.

faecium de se apresentarem mais resistentes à vancomicina do que E. faecalis

(Anvisa 2014; Mira et al., 2014; Adam et al., 2011). Aparentemente, o mesmo ocorre

com relação a gentamicina-sinergismo (Mengeloglu et. al., 2011).

Deste modo, nossos achados concordam com os resultados obtidos por

Adam et al. (2011), que ao avaliar a prevalência de patógenos resistentes em mais

de 8.000 hemoculturas colhidas entre 2007 e 2009 no Canadá, em que todos os 502

isolados de Enterococcus spp. apresentaram sensibilidade a daptomicina e

linezolida. No entanto, quanto a sensibilidade à vancomicina, Adam et al. (2011)

relataram que apenas 5/479 isolados de E. faecalis (cerca de 1%) e 18/23 (78%) dos

E. faecium apresentaram-se resistentes. Sendo que, todos os 18 EFMRV

apresentaram gene vanA, quanto aos cinco EFSRV, quatro apresentaram vanB e

apenas um apresentou vanA. Enquanto que, Mira et al. (2014) encontraram 54,05%

(n=20) de resistência à vancomicina entre os isolados de E. faecium e nenhum

isolado de E. faecalis foi resistente nessa casuística. Além disso, 91,4% dos E.

faecium desse estudo foram resistentes a gentamicina-sinergismo contra 63% dos

E. faecalis.

Segundo dados relatados pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças

Infecciosas – Centers for Disease Control and Prevention (CDC) em 2013, dos

66.000 isolados de Enterococcus spp./ ano 20.000 foram resistentes à vancomicina,

dos quais, 77% dos E. faecium (n=10.000) e 9% dos E. faecalis (n=3.100). Entre os

isolados que não tiveram a espécie identificada, 40% deles (n=6.900) foram

Discussão

120

resistentes à vancomicina, entretanto, esses dados incluem amostras de sangue,

sítios cirúrgicos e trato urinário. Esse fato pode gerar dados incongruentes, devido

ao tipo de infecção e critérios de inclusão dos pacientes/isolados no estudo.

Nossos achados são muito semelhantes aos dados nacionais, sobre ERV

isolado de ICS apresentados pela ANVISA (2014), onde 19,1% (210/1098 isolados)

de todos os Enterococcus spp. foram resistentes à vancomicina. Ao estratificar

esses dados pelas espécies verificou-se que 11,3% (54/476) dos E.faecalis e 48,9%

(91/186) dos E.faecium relacionados com ICS primária confirmada laboratorialmente

(IPCSL) foram resistentes à vancomicina. A resistência à vancomicina entre os

isolados de Enterococcus spp. que não tiveram sua espécie identificada foi de

14,9% (65/436) dos isolados.

Segundo a literatura, as CIMS de daptomicina e linezolida obtidas pelo

sistema Phoenix®, geralmente apresentam uma ou mais diluições acima daquelas

obtidas pelo Etest® (Riedel et al. 2014; Davies et al. 2013). Além disso, alguns

estudos demonstraram que, os métodos comerciais comumente utilizados pelos

laboratórios de rotina de microbiologia clínica frequentemente produzem CIMs entre

1-2 log2 de diferença para daptomicina frente a isolados de Enterococcus spp., em

comparação com o método de Microdiluição em Caldo (Bryant et al. 2014; Riedel et

al., 2014; Riedel et al. 2012).

Tipagem molecular dos isolados de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina:

A tipagem molecular aplicada à microbiologia clínica permite caracterizar a

diversidade dos microrganismos de interesse médico, contribuindo para a sua

classificação e para a discriminação entre indivíduos da mesma espécie,

apresentando um grande potencial para esclarecer sobre a origem e disseminação

de uma estirpe causadora de um surto infeccioso.

A tipagem molecular dos isolados de ERV enviados de diversas parte do

Brasil realizada nesse trabalho é importante para melhor caracterizar a diversidade

das linhagens circulantes no nosso país e melhor compreender o comportamento

desses microrganismos diante de ICSs e até mesmo dar subsídios para condutas

terapêuticas.

Discussão

121

Desse modo, as amostras avaliadas no nosso estudo foram submetidas a

duas técnicas de tipagem padronizadas e utilizadas em todo o mundo: PFGE e

MLST, e uma terceira, que pode ser promissora para utilização num futuro bem

breve, MALDI-TOF MS.

Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE):

A genotipagem por PFGE foi realizada para todos os isolados de ERV. Os

perfis de macrorrestrição do DNA genômico dos 15 E. faecalis resistentes à

vancomicina, enviados por três centros médicos incluídos no estudo, analisados pelo

programa BioNumerics 7.5, revelou dois diferentes grupos “clusters”,

respectivamente com sete e quatro isolados. Todos os sete isolados pertencentes

ao mesmo grupo foram enviados pelo centro 1 e apresentaram o mesmo padrão de

PFGE (padrão C) pelos critérios de Tenover et al. (1995), provavelmente, tratam-se

do mesmo clone circulante nesse centro na época do estudo. Entre esses sete

isolados, quatro foram enviados no ano de 2008 e três no ano de 2009, cinco dos

sete pacientes apresentavam acesso central como fonte bacteriana e 5 foram a

óbito.

Quanto ao grupo formado por quatro isolados, todos com mesmo padrão de

PFGE (padrão B) e enviados por 3 centros diferentes, dois localizados na cidade de

São Paulo (Centros 1 e 2) e um em Diadema (Centro 3). Dois isolados foram

enviados no ano de 2008, um em 2009 e outro em 2011, demonstrando a

persistência desse clone circulante por pelo menos 3 anos. Quatro isolados de

EFSRV não foram agrupados em nenhum dos dois clusters (a similaridade foi

inferior a 80%).

Sobre os EFMRV, foi possível observar um maior polimorfismo no padrão de

macrorrestrição dos isolados, com uma grande variação no padrão de PFGE (19

padrões diferentes: A1-A10; B; C; D1-D5; E; F), onde três grupos apresentaram

similaridade superior a 80%. Um grupo apresentou 82,4% de similaridade (contendo

10 isolados), esse grupo é representados por isolados enviados pelos centros 01

(seis isolados) e 04 (um isolado) localizados na cidade de São Paulo e pelos centros

12 (um isolado) e 13 (dois isolados), respectivamente localizados em GO e DF. É

interessante observar que apesar da distância geográfica entre os centros, ocorre a

presença de um mesmo clone em diferentes regiões do Brasil.

Discussão

122

O segundo grupo apresentou 83,4% de similaridade (quatro isolados: três do

RS e um de SP) e o terceiro grupo apresentou 86,7% de similaridade contendo

apenas dois isolados, que foram enviados pelo mesmo centro localizado no DF.

Novamente observamos a presença do mesmo clone em regiões geográficas

distintas.

A maior prevalência de ERV (de ambas espécies, E. faecalis e E. faecium)

ocorreu entres os anos de 2008 e 2009. Esse fato, pode ser explicado devido ao

maior número de amostras enviadas pelos centros participantes durante esses dois

anos (107 dos 144 isolados incluídos, onde 28 foram ERV). Além disso, as

reformulações ocorridas no projeto SCOPE entre 2010 e 2011 podem justificar a

diminuição do número de amostras enviadas, durante esse período, pelos centros

participantes. Quanto ao maior número de ERV isolados no estado de SP, isso pode

ser melhor compreendido devido à metade dos centros (seis) estarem localizados

nesse Estado. Entre os seis centros paulistas encontram-se hospitais de alta

complexidade e Hospitais/Escola, além disso, a localização do LEMC (laboratório

para onde os isolados foram enviados) na mesma cidade pode ter contribuído com o

maior número de isolados concentrados em SP.

Nossos achados concordam com o estudo conduzido por Zanella et al. (2003)

que caracterizou o polimorfismo de 85 EFSRV e 62 EFMRV, onde também foram

encontrados cinco tipos diferentes de PFGE (A, B, C, D, E) para E. faecalis (o tipo A

apresentou oito subtipos e o tipo B dois subtipos, totalizando 15 padrões de bandas

diferentes). Para E. faecium, foram encontrados apenas três tipos (M,N,O), no

entanto, houve 18 padrões de bandas diferentes, evidenciando também um grande

polimorfismo para essa espécie. Apesar dos isolados avalizados por Zanella et al.

(2003) serem originários de diversos sítios biológicos diferentes e de apenas um

centro médico, o padrão de polimorfismo obtido foi semelhante ao nosso estudo.

Em outro estudo Brasileiro, conduzido por D`Azevedo et al. (2008) no Hospital

São Paulo, onde foram avaliados nove EFSRV e 10 EFMRV obtidos de cultura de

vigilância, foram encontrados três padrões e seis tipos (com sete padrões) de PFGE

respectivamente. O número menor de padrões de PFGE pode ser explicado por se

tratarem de poucos isolados incluídos no estudo e por serem oriundos de pacientes

internados no mesmo hospital.

Morrison et al. (1999) também evidenciaram um alto polimorfismo nos

padrões de PFGE de 30 isolados EFMRV, de diferentes pacientes, durante um

Discussão

123

período de 11 meses, encontrando 17 padrões de bandas distribuídos em quatro

grupos distintos com similaridade de 82%. Assim como, Stampone et al. (2005)

também observaram um grande polimorfismo entre oito EFSRV, bem como entre os

31 EFMRV isolados de ICS num estudo ocorrido na Itália entre os anos de 2001 e

2003.

Existem poucos estudos multicêntricos de tipagem molecular de

Enterococcus spp. por PFGE, isolados de sangue. A grande maioria dos estudos

envolve amostras isoladas de vários sítios biológicos e geralmente oriundas do

mesmo centro médico (mesmo hospital) o que pode dificultar a análise comparativa

com a literatura (o nosso estudo envolve apenas isolados de hemoculturas e

oriundos de centros médicos localizados em diferentes regiões do Brasil). O uso

limitado da técnica de PFGE pode ser explicado por ser laboriosa, de alto custo e

demorada (Bedendo & Pignatari, 2000).

Sequenciamento de Múltiplos Loci (Multilocus Sequence Typing - MLST):

No nosso estudo, encontramos quatro STs diferentes entre os E. faecalis

resistentes à vancomicina: ST9 (um isolado), S103 (dois isolados), ST525 (um

isolado) e ST526 (três isolados). Como apenas os centros médicos localizados no

estado de SP enviaram EFSRV e, além disso, o número de isolados selecionados

para realização do MLST foi de apenas sete isolados, não foi possível observar a

dispersão nacional de nenhum ST predominante.

Entre os STs de EFSRV encontrados no nosso estudo e que estão mais

relacionados com infecções nosocomiais destacam-se: o ST526, que, de acordo

com o eBurst, apresenta um locus variante (single loci variation – SLV) do complexo

clonal 2 (CC2), e o ST9 que é o próprio complexo clonal 9 (CC9) (Solheim et al.,

2011; Clewell et al. 2002). De acordo com a literatura, os complexos clonais CC2 e

CC9 apresentam quase que exclusivamente isolados de origem nosocomial

(Kawalec et al., 2007; Ruiz-Garbajosa et al., 2006; Clewell et al. 2002), outros 2

complexos clonais também relacionados com isolados hospitalares são CC28 e o

CC40 (Solheim et al., 2011; Solheim et al., 2009; Ruiz-Garbajosa et al., 2006),

entretanto nenhum dos dois últimos foram encontrados no nosso estudo.

Segundo Clewell et al. (2002), em E. faecalis, uma grande variedade de

plasmídeos conjugativos e transposons estão envolvidos na transferência genética

Discussão

124

de determinantes de resistência e de fatores de virulência, o que também pode ter

facilitado também a adaptação dos CC2 e CC9 no ambiente hospitalar. Em um

estudo brasileiro conduzido por De Almeida et al. (2014), foram analisados cinco

EFSRV, nesse estudo também foram encontrados os ST 525 e ST 526. Sendo,

quatro isolados pertencentes ao ST 525 (três isolados de sangue e um de urina) e

um ST 526 isolado de urocultura.

Entre os 15 EFMRV submetidos a tipagem por MLST no nosso estudo,

encontramos quatro STs diferentes: ST18, ST412, ST478 e ST896. Entre esses

STs, observou-se que o ST412 foi o mais prevalente, encontrado em 11 dos 17

isolados de EFMRV. A análise do eBurst nos permitiu observar que o ST412

apresenta três loci variantes do ST17 (CC17) e foi isolado de seis diferentes centros

médicos no nosso estudo: Centros 1; 4; 6; 7; 12 e 13, localizados em três estados

brasileiros, a saber: nos estado de SP (centros 1, 4 e 6), RS (centro 7) em GO

(centro 12) e no DF (centro 13) demonstrando uma disseminação significativa nas

regiões Centro-Oeste, Sudeste e Sul do Brasil. O ST478 que apresenta quatro loci

variantes do ST17 foi identificado em dois isolados do nosso estudo, um enviado

pelo centro 1 (SP) e um enviado pelo centro 13 (DF). O ST18, que apresenta dois

loci variantes do ST17 e que é um subgrupo fundador, foi observado em um isolado

do centro 4 (localizado em SP) e o ST896 em apenas um isolado do centro 3 (SP).

Todos os 11 isolados de ST412 do nosso estudo foram resistentes a

ampicilina, 8 isolados (73%) foram resistentes a estreptomicina-sinergismo, no

entanto, nenhum isolado apresentou resistência a gentamicina-sinergismo. Dos 11

pacientes que tiveram ICS por EFMRV pertencentes ao ST412 nove apresentavam

cateter venoso em posição central e tiveram esse acesso como fonte bacteriana

primária e sete foram a óbito.

No nosso estudo não foram avaliados os fatores de virulência dos isolados,

entretanto, de acordo com os dados apresentados na literatura, os isolados

pertencentes ao CC17 e seus STs variantes, geralmente apresentaram o gene esp

(enterococcal surface protein - proteína de superfície enterocócica) que contribui na

produção de biofilme (Deplano et al., 2007), esse fato provavelmente pode ter

contribuído com a colonização do cateter previamente a ICS dos isolados derivados

do CC17 avaliados no nosso estudo.

Recentemente, estudos de tipagem molecular demonstraram que a maioria

das cepas de EFMRV associadas com infecções nosocomiais, em todo o mundo,

Discussão

125

fazem parte da mesma linhagem conhecida como CC17 (Leavis et al., 2007;

Camargo, Gilmore & Darini, 2006; Klare et al., 2005; Willems et al., 2005; Willems et

al., 2001).

Supõe-se que a aquisição de sequências de inserção (IS) proporcionou ao

CC17 um aumento da plasticidade no seu genoma, facilitando sua adaptação do

mesmo no ambiente hospitalar (Leavis et al., 2007). Além disso, isolados

pertencentes ao CC17 e seus STs variantes são geralmente resistentes à ampicilina

e carreiam vários genes codificadores de fatores de virulência como a proteína

superfície enterocócica e a hialuronidase e, na maioria das vezes, a ilha de

patogenicidade putativa (Top, Willems & Bonten, 2008; Leavis et al., 2006; Willems

et al., 2005; Klare et al., 2005; Bonora et al., 2004; Leavis et al., 2004; Werner et al.,

2003; Willems et al., 2001).

Segundo Ochoa et al. (2013), Damani et al. (2010) e Panesso et al. (2010),

existem vários STs pertencentes ao complexo clonal 17, como ST16, ST17, ST18,

ST203 e ST412, que estão disseminados em todo o mundo. Dois desses STs foram

encontrados no nosso estudo ST18 e ST412. STs pertencentes ao CC17 e suas

variantes também foram encontrados em estudo conduzido por Damani et al. (2010),

que avaliaram 359 ERV, dos quais 199 isolados (55,4%) apresentaram o ST412,

onde todos foram resistentes a ampicilina, estreptomicina-sinergismo e 95% (190

isolados) foram resistentes a gentamicina-sinergismo. Na Cidade do México, Ochoa

et al. (2013) analisaram 12 EFMRV, onde seis pertenciam ao ST412, sendo dois

desses isolados de hemocultura. O ST412 foi o mais prevalente em um estudo

multicêntrico realizado na América do Sul incluindo quatro países (Colômbia,

Equador, Peru e Venezuela). Outros STs encontrados nesse estudo foram: ST17,

ST18, ST125, ST203, ST280, e ST282, todos pertencentes ao CC17 (Panesso et al.,

2010).

Os STs encontrados no nosso estudo (SCOPE Brasil) concordam com outros

estudos brasileiros que avaliaram isolados contemporâneos (isolados entre os anos

de 2007 e 2011). Em um estudo de vigilância de EFSRV e EFMRV, realizado

durante o ano de 2009, conduzido por Merlo et al. (2015) num hospital brasileiro, na

cidade de Belo Horizonte, foi observada uma prevalência do ST103 entre cinco dos

14 EFSRV estudados. Entre os EFMRV, o ST412 foi identificado em 35 dos 47

isolados estudados, sugerindo uma disseminação desses STs no hospital onde o

estudo foi realizado. Tal estudo é contemporâneo ao projeto SCOPE Brasil, o que

Discussão

126

pode justificar o isolamento de ERV com os mesmos STs em ambos.

Em outro estudo brasileiro realizado por da Silva et al. (2012) dos 53 EFMRV

isolados de diversos materiais clínicos (sendo a grande maioria oriundos de cultura

de vigilância) incluídos nesse estudo, foi realizada tipagem por MLST de 31 isolados,

onde 38.7% (n = 12) foram pertencentes ST412 e 32.3% (n = 10) ao ST478.

Palazzo e colaboradores (2011) realizaram a tipagem por MLST de 11

isolados de E. faecium isolados no ano de 2007 num hospital universitário da cidade

de Campinas, entre os quais, um isolado de hemocultura foi pertencente ao ST412 e

sete foram pertencentes ao ST478 (incluindo um isolado de hemocultura). Esse

último apresentou dois loci variantes (doble loci variation) do ST203, que por sua vez

é pertencente ao CC17.

Todos esses relatos reforçam a capacidade adaptativa dos ST412 e ST478

(ambos variantes do CC17) ao ambiente hospitalar. Os dados encontrados no nosso

estudo, somados aos relatos encontrados em outros estudos brasileiros, sugerem

uma disseminação desse ST entre vários centros médicos brasileiros. No entanto,

vale ressaltar que a maioria destes estudos foram realizados com isolados colhidos

de diversos materiais clínicos humanos, sendo a grande maioria obtida de culturas

de vigilância, aparentemente, não foi realizado nenhum estudo nacional sobre

tipagem de ERV por MLST incluindo apenas isolados de ICS durante o período do

nosso estudo.

Tipagem por Espectrometria de Massas:

MALDI-TOF MS é considerado revolucionário, devido à sua precisão na

identificação de microrganismos, velocidade e custo-efetividade em relação às

técnicas de cultura existentes (Murray, 2012; Dekker et al., 2011; Bizzini & Greub,

2010; van Veen et al., 2010; Seng et al., 2009; Carbonnelle et al., 2007).

A identificação acurada e rápida de microrganismos isolados de ICS,

juntamente com a realização de uma “Tipagem em Tempo Real por MALDI-TOF MS”

pode nos fornecer informações preciosas sobre clones que possam apresentar

fatores de virulência e resistências aos antimicrobianos mediadas por genes

cromossomais, proporcionando uma gestão dos pacientes em tempo real,

sobretudo nos casos de infecção por isolados multirresistentes que geram uma

limitação terapêutica significativa como é o caso das ICS por E. faecalis ou E.

Discussão

127

faecium resistentes à vancomicina, agilizando o uso antimicrobiano adequado e

prevenindo o uso excessivo de antibióticos empíricos e sua toxicidade.

Pensando em melhor compreender a epidemiologia de ERV isolados de ICS

no Brasil, decidimos avaliar a acurácia da técnica de MALDI-TOF MS 5para realizar

a identificação de espécies de Enterococcus e a tipagem destes num mesmo ensaio

laboratorial. Para tanto, verificamos a aplicabilidade dos equipamentos Vitek MS®

(BioMérieux) e Microflex LT® (Bruker) para realização de tipagem de EFMRV e

EFSRV através do padrão de proteínas. Além disso, verificamos a acurácia do

Microflex LT® na tipagem e diferenciação entre os isolados E. faecalis e E. faecium

de acordo com a sensibilidade à vancomicina.

Avaliamos o padrão proteico dos 15 isolados de EFSRV e dos 20 EFMRV,

obtido pelo Vitek MS® (BioMérieux) utilizando o programa Saramis®, através do

dendrograma do tipo UPGMA com o objetivo de comparar a relação do padrão de

similaridade com o método de tipagem considerado PFGE e com a tipagem por

MLST. O dendrograma gerado pelo Saramis® apresenta a similaridade de acordo

com o número de massas idênticas e não por porcentagem de similaridade ou

distância espectral (Manual do usuário Saramis®).

Vale ressaltar que, a base de cálculo utilizada para gerar o padrão de

similaridade no Saramis® é do tipo Euclidiana e também considera a intensidade dos

picos. Sendo essa, uma variável errática, não foi possível estabelecer uma relação

entre o padrão de similaridade gerado pelo Vitek MS®, tanto para os isolados de

EFSRV quanto para os isolados de EFMRV, quando comparado com a tipagem por

PFGE e MLST dos mesmos isolados.

Não foi possível gerar um dendrograma com o algoritmo Ward utilizando o

sistema Saramis®, o que poderia ter facilitado a comparação do dendrograma com

os espectros produzidos pelo Vitek MS® com o dendrograma obtido pelos outros

métodos, já que o algoritmo de Ward permite a construção de dendrograma

representando porcentagem de similaridade. Também não foi possível realizar a

importação do padrão de espectros obtidos pelo Vitek MS® para melhor avaliação

utilizando o BioNumerics 7.5, que permite gerar dendrograma desconsiderando a

intensidade dos picos.

Além disso, não encontramos nenhum estudo na literatura que utilizou o Vitek

MS® e o sistema Saramis® para tipagem de ERV. Deste modo, nós não

conseguimos comparar os nossos dados com outras experiências semelhantes para

Discussão

128

análise da similaridade.

Quanto ao Microflex LT® (Bruker) realizamos duas análises, uma pelo

programa BioTyper 3.1 OC e outra pelo BioNumerics 7.5. No primeiro programa, o

agrupamento foi realizado utilizando o padrão Euclidiano e o dendrograma do tipo

UHCA, que é o padrão disponível pelo programa BioTyper 3.1 OC. No segundo

programa, realizamos as análises por UPGMA (para facilitar a comparação com o

dendrograma também UPGMA obtido através da análise por PFGE) e pelo método

de Ward, desconsiderando a intensidade, possibilitando uma melhor reprodutividade

do método por gerar uma relação binária sobre a presença ou ausência de cada

espectro de massa, permitindo uma comparação com os métodos de tipagem que já

estão padronizados.

Apesar de ser uma técnica de fácil execução e de baixo custo, a sua

utilização para tipagem de microrganismos ainda não está muito bem padronizada,

fazendo-se necessário estabelecer alguns parâmetros. Quando utilizamos a técnica

de MALDI-TOF MS para tipagem dos Enterococcus spp. levantamos algumas

questões, que podem ter sido geradas por outros pesquisadores, por exemplo:

1 - Qual a matriz de distância, utilizada para agrupamento (“clusterização”),

pode ser a mais adequada? Acreditamos que a matriz pode depender do objetivo de

cada análise. No nosso caso, encontramos melhores resultados com o método

Euclidiano, com algumas modificações realizadas no tipo do algoritmo. É importante

lembrar que a técnica de MALDI-TOF MS utiliza as proteínas ribossomais e pode

gerar dezenas de picos, são necessários mais estudos para avaliar quais massas

devem ser utilizadas como parâmetro de tipagem e isso pode variar de acordo com

a espécie do microrganismo analisada, além da tolerância constante que deve ser

utilizada para a variação dos espectros.

2 - Qual o algoritmo de agrupamento mais adequado para cada tipo de

análise? Obtivemos melhores resultados com o algoritmo de Ward, excluindo a

intensidade dos picos, que foi possível apenas utilizando o programa BioNumerics

7.5. Sugerimos que o algoritmo para agrupamento seja realizado baseando-se

apenas nas massas, desconsiderando a “intensidade” das mesmas, que pode sofrer

influência quanto à matriz utilizada, o volume da matriz aplicado no spot, se o ensaio

foi realizado com ou sem extração de proteínas, pelo tipo de método de extração de

proteínas utilizado e pelo manipulador durante o preenchimento do spot (Croxatto, et

al 2012).

Discussão

129

3 - Qual o ponto de corte utilizado para avaliar a relação clonal entre os

isolados, seja por distância espectral, número de massas idênticas ou porcentagem

de similaridade? No nosso estudo, consideramos um coeficiente de similaridade

acima de 80% para definição de cada grupo de isolados. No entanto não existem

parâmetros na literatura para similaridade por MALDI-TOF MS e os estudos

disponíveis utilizaram algoritmos diferentes e não propuseram um coeficiente de

similaridade (Rim et al., 2015; Lash et al., 2014). Não estamos totalmente

convencidos que o coeficiente de similaridade de 80% pode responder as nossas

dúvidas sobre a relação clonal entre os isolados de Enterococcus spp. Este é um

estudo pioneiro, utilizando esse coeficiente de similaridade e o algoritmo de Ward,

no entanto, precisamos de mais estudos para deixar esses dados mais consistentes.

Nossos resultados do padrão de similaridade entre os isolados de EFSRV e

EFMRV pelo programa BioTyper 3.1 OC não permitiram estabelecer nenhum critério

de padronização do método, porque os resultados não foram reprodutíveis.

Avaliamos todos os métodos de clusterização disponíveis nesse programa e

obtivemos uma grande variação na similaridade dos isolados quando modificamos

os algoritmos.

Além disso, o tipo de dendrograma disponível no BioTyper 3.1 OC é sempre

UHCA e todos os métodos de agrupamento disponíveis realizam uma análise

multidimensional no cálculo da distância espectral correlacionando a massa e a sua

intensidade respectiva (Manual do Usuário MALDI BioTyper 3.1 OC). Ou seja, se

utilizados os espectros dos mesmos isolados em dias diferentes de ensaio, os

dendrogramas respectivos podem produzir um arranjo no padrão de similaridade

completamente diferente, dificultando a análise comparativa com os método de

tipagem conhecidos, tornando as ferramentas disponíveis pelo BioTyper 3.1 OC

para tipagem de Enterococcus spp. questionáveis ou pelo menos irreprodutíveis.

Quanto as análises realizadas no programa BioNumerics 7.5, com os

espectros importados do Microflex LT®, verificamos alguns pontos importantes para

serem discutidos:

Quando utilizamos o método de agrupamento UPGMA não tivemos uma boa

concordância com PFGE e MLST, porque alguns isolados com padrão de

bandas diferentes bem como STs diferentes, apresentaram similaridade

superior a 80% pela análise do padrão de massas, para ambas as espécies.

Isolados apresentando padrão de massas completamente diferentes foram

Discussão

130

considerados idênticos entre os isolados de E. faecalis, o que pode ter

ocorrido devido ao método de agrupamento levar em conta a intensidade das

massas e selecionar automaticamente os picos considerados principais como

parâmetro de clusterização.

Verificamos uma boa correlação entre a tipagem utilizando os espectros de

massas importados pelo Microflex LT® e as outras metodologias utilizadas

nesse estudo para tipagem dos ERV quando utilizamos o algoritmo de Ward

para construção dos dendrogramas no BioNumerics 7.5. Para EFSRV

observamos uma polarização dos isolados pertencentes a STs diferentes e

um agrupamento aos STs idênticos com similaridade superior a 80%.

Entretanto, o número de amostras utilizadas para realizar a tipagem pela

técnica de MLST no nosso estudo foi limitada, impossibilitando avaliar a

acurácia do MALDI-TOF MS para tipagem de outros STs, por exemplo o ST9

e o ST525, representados por apenas um isolado cada.

Para E. faecium a correlação entre a similaridade baseada nos espectros de

massas, mesmo utilizando o algoritmo de Ward, com PFGE e MLST não foi

muito boa. Um isolado pertencente ao ST18 e outro pertencente ao ST 412

apresentaram 96% de similaridade, além disso, o método não agrupou

isolados pertencentes ao mesmo ST. Esse fato pode ser explicado devido ao

polimorfismo encontrado entre isolados de E. faecium (Morrison et al., 1999).

No entanto, observamos a presença dos picos de massas: 4431, 6349, 7297

e 7312 em todos os isolados do ST412.

Observamos também que o pico 6349 não esteve presente no ST896.

Embora, esses dados tenham sido encontrados em um pequeno número de

isolados estudados, esses achados podem ser significativos e sugerir que a

presença dessas massas podem sugerir alguma relação com os isolados

pertencentes aos STs derivados do CC17. Para tanto, torna-se necessária a

construção de um banco de dados com vários STs diferentes bem como a

inclusão de vários indivíduos representando o mesmo ST, afim de verificar a

reprodutibilidade desses achados, além de confirmar a exclusividade desses

picos no ST412, que apresentou-se predominante entre os EFMRV no nosso

estudo.

Existem várias ferramentas que devemos melhor compreender para utilização

do MALDI-TOF MS para tipagem molecular, como por exemplo: o range de

Discussão

131

massas que deverão ser consideradas na análise; o número principal de

componentes (que avalia as características diferentes, relacionadas com

presença ou ausência de picos e intensidade); a análise do tipo Principal

Component Analysis (PCA), que realiza uma análise onde cada pico e sua

intensidade respectiva gera um dimensão diferente dentro de um gráfico de

PCA, ou seja cada pico uma dimensão, talvez esse método de análise não

apresente um poder discriminatório suficiente para realização de tipagem de

microrganismos, devido à sua falta de reprodutibilidade; a tolerância

constante que permite avaliar um range do desvio padrão das massas que

devem ser consideradas idênticas; o tipo da análise de matriz de distância (ou

seja, qual a fórmula base para cálculo da similaridade entre os isolados

analisados) e o método de clusterização.

Vale ressaltar a importância de um software que permita a personalização da

análise sobre a seleção dos picos, além de identificar os picos

discriminatórios para cada espécie.

Não conseguimos realizar a padronização de um protocolo para tipagem de

Enterococcus spp. utilizando MALDI-TOF MS, sobretudo da espécie E. faecium,

provavelmente devido ao seu grande polimorfismo que pode ser observado no

PFGE e na variedade dos STs existentes. Além disso, a profundidade analítica

filogenética que pode ser alcançada com base no proteoma avaliado no nosso

estudo é relativamente limitado, pelo menos com relação às duas espécies

analisadas.

Existem atualmente cerca de 10 trabalhos publicados sobre a utilização do

Microflex LT® para tipagem de bactérias patogênicas. (Rim et al., 2015; Lash et al.,

2014; Gherardi et al., 2014; Johansson et al., 2014; Josten et al., 2013; Mencacci et

al., 2013; Christensen et al., 2012; Wolters et al., 2011; Murray, 2010; Barbuddhe et

al., 2008).

Além disso, não existem protocolos definidos para tipagem de Enterococcus

spp., bem como da matriz e até mesmo os programas de informática ideais para

esse tipo de análise. Todos esses fatos podem resultar numa má reprodutibilidade e

comprometer o tamanho e a qualidade dos picos o que influencia diretamente no

agrupamento dos dendrogramas (Rim et al., 2015; Hamprecht et al., 2014; Lash et

al., 2014).

No entanto apenas cinco desses estudos realizaram a construção de

Discussão

132

dendrograma a partir dos espectros de massas para avaliação da similaridade dos

microrganismos analisados (Rim et al., 2015; Lash et al., 2014; Mencacci et al.,

2013; Christensen et al., 2012; Wolter et al., 2011). Apenas um trabalho foi publicado

sobre tipagem de E. faecium utilizando os espectros de massas obtidos pelo

Microflex LT® (Lash et al., 2014) relatando que a técnica de MALDI-TOF MS não

apresenta poder discriminatório para tipagem de E. faecium e S. aureus.

No estudo conduzido por Rim et al. (2015) avaliando Acinetobacter

baumannii, todos os cut-offs utilizados foram baseados em consultas com

profissionais especializados em bioestatística e esses pontos de corte foram

considerados arbitrários.

Apesar da falta de protocolos para tipagem por MALDI-TOF MS, verificamos

que o método de extração de proteínas ribossomais totais da colônia (com

acetonitrila e ácido fórmico) evidenciaram melhores escores no Microflex LT®

quando comparamos com o método direto da colônia sem a extração no Vitek MS®,

concordando com os achados de Griffin et al. (2012).

A dificuldade da correlação entre MALDI-TOF MS e os outros métodos de

tipagem pode ser explicada porque a técnica de espectrometria de massas utilizada

detecta apenas um subproteoma bacteriano bastante aleatório num range de

massas limitado (2.000-12.000 m/z) (Lash et al., 2014). Além disso, nessa

metodologia, apenas um número selecionado de proteínas é preferencialmente

ionizado, o que reduz o número possível de sinais disponíveis para caracterização

dos isolados e que a maior parte dos picos de massas e biomarcadores taxon-

específicos correspondem às proteínas ribossomais (Suarez et al., 2013).

Deve ser considerado que o nosso estudo apresenta algumas limitações, por

exemplo: apenas 22 isolados foram submetidos a técnica de MLST; não realizamos

sequenciamento do genoma completo dos nossos isolados o que poderia ter

facilitado a comparação com a análise pelo MALDI-TOF MS. Por outro lado,

sabemos que é um estudo multicêntrico pioneiro no Brasil, sobre a epidemiologia

molecular de isolados de Enterococcus spp. de ICS multicêntrico, trazendo

informações importantes sobre a distribuição dos ERV no Brasil e sobre os clones

mais prevalentes, além da utilização do MALDI-TOF MS para tipagem.

O nosso estudo pode também ser o início de uma nova proposta de tipagem,

onde o MALDI-TOF, que apresenta resultados de identificação de microrganismos

em pouco tempo, possa também, num futuro bem próximo ser utilizado para

Discussão

133

realização da tipagem de microrganismos de interesse clínico, assim como segregar

os Enterococcus spp. resistentes à vancomicina dos sensíveis e quem sabe, até

mesmo trazer informações sobre fatores de virulência e mecanismos de resistência,

proporcionando uma tipagem em tempo real” e uma gestao dos pacientes também

em “tempo real”.

Deste modo, são necessários mais estudos utilizando o MALDI-TOF MS com

o objetivo de padronizar a tipagem de microrganismos com protocolos de análise de

dendrograma reprodutíveis e que possam trazer informações importantes e

confiáveis para a prática médica. Apesar de ser um método de fácil execução,

rápido e de baixo custo-efetividade, quando comparado com os métodos de

sequenciamento e de PFGE, o poder discriminatório de MALDI-TOF MS para

tipagem de Enterococcus spp. ainda não foi totalmente explorado.

Outros estudos incluindo amostras de hemoculturas e de outros sítios e

também amostras de surtos, de diferentes centros médicos do Brasil poderão

fornecer maior diversidade molecular permitindo a construção de um banco de

dados de proteínas e de STs.

Conclusões

134

7. CONCLUSÕES

Conclusões

135

E. faecalis foi a espécie mais prevalente entre os isolados de Enterococcus

spp. de ICS.

Neoplasias foram as doenças de base mais encontradas entre os pacientes

com ICS por Enterococcus spp. Entre as doenças de bases e fatores

associados ao desenvolvimento de ICS, neoplasia foi significante para E.

faecium e cateter vesical para E. faecalis.

Tanto o método fenotípico quanto MALDI-TOF MS apresentaram boa

concordância com o método molecular para identificação das espécies de

Enterococcus isolados de ICS.

E. faecalis foram mais sensíveis a ampicilina e estreptomicina-sinergismo e E.

faecium apresentaram-se mais sensíveis a gentamicina-sinergismo. Todos os

isolados foram sensíveis a daptomicina e linezolida. Todos os isolados

resistentes à vancomicina apresentaram o gene vanA, sendo 60,6% dos E.

faecium e 13,6% dos E. faecalis.

De acordo com a tipagem por PFGE foram encontrados dois padrões (B e C)

predominantes entre os EFSRV, entre os EFMRV observou-se um maior

polimorfismo e três clusters, sendo o padrão A, o predominante. Na tipagem

por MLST o ST526 foi o mais encontrado entre os EFSRV. Para EFMRV o

ST412 foi o mais prevalente, encontrados em três regiões diferentes do

Brasil, sugerindo uma disseminação desse clone .

Vitek MS®, através do programa Saramis® e o Microflex LT® utilizando o

programa BioTyper 3.1 OC não apresentaram poder discriminatório para

tipagem dos ERV.

A tipagem com os espectros produzidos no Microflex LT® e analisados no

BioNumerics 7.5 apresentou uma boa concordância com o MLST para E.

faecalis, quando utilizado o algoritmo de Ward desconsiderando a intensidade

Conclusões

136

dos espectros. Mesmo utilizando Ward para E. faecium não houve boa

correlação com o MLST.

Anexos

137

8. ANEXOS

Anexos

138

8.1 Anexo 1

Tabela 14. Incongruências nas identificações dos isolados de Enterococcus spp., incluídos no Projeto SCOPE Brasil, pelos sistemas Phoenix e Vitek MS

® em relação a

PCR, e a sensibilidade à ampicilina e vancomicina.

Nº isolado Metodologia de Identificação CIM (µg/mL)

PCR Phoenix® AM VC

30.667 E. faecium E. faecalis >16 ≤0,5

31.925 E. faecalis E. faecium 8 ≤0,5

37.144 E. faecium E. faecalis >16 1

38.038 E. faecium E. faecalis >16 1

Nº isolado Metodologia de Identificação CIM (µg/mL)

PCR Vitek MS® AM VC

34.501 E. faecalis E. faecium 4 >256

34.632 E. faecium E. faecalis >16 >256

39.453 E. faecalis E. faecium 4 >256

41.093 E. faecium E. faecalis >16 >256

Referências Bibliográficas

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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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