TEXTO 6 O CÓDIGO GENÉTICO Biologia Molecular ?· CAT CAG TCA TAC TAT CAT CAT CAT C... Biologia Molecular…

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<ul><li><p>TEXTO 6 O CDIGO GENTICO</p><p>Biol</p><p>ogia</p><p> Mol</p><p>ecul</p><p>ar</p><p>O Cdigo GenticoO Sistema de Codificao Gentica</p><p>A Natureza Trplice do CdigoA Decifrao dos Cdons</p><p>Colinearidade entre DNA e PolipeptdeoOs Cdons de PontuaoO Cdigo Gentico Quase UniversalAs Consequncias das Mutaes</p><p>As consequncias das mutaes em microorganismosAs consequncias das mutaes nos organismos pluricelulares</p><p>ExercciosParte A: Revendo Conceitos BsicosParte B: Ligando Conceitos e FatosParte C: Aplicando ConceitosParte D: Resolvendo Problemas</p></li><li><p>2Biologia Molecular Texto 6 O Cdigo Gentico</p><p>Apresentao</p><p>Se um gene uma sequncia de nucleotdeos no DNA, como essa sequncia pode determinar a ordem dos aminocidos nas protenas? At a dcada de 60, isso foi um mistrio. Nessa poca, no entanto, os bilogos conseguiram a incrvel proeza de decifrar a linguagem da vida, um dos maiores feitos da Biologia do sculo XX. So as principais etapas do trabalho cientfico que culminou com a decifrao do cdigo gentico que estudaremos nesse texto. </p><p>Essa apostila foi organizada pelos docentes do Instituto de Biocincias da USP que ministraram e ministram as disciplinas Biologia Molecular e de Microrganismos, Biologia Molecular e Fundamentos de Biologia Molecular para os cursos de Bacharelado e Licenciatura em Cincias Biolgicas. O texto foi adaptado e compilado de diversos livros didticos e materiais instrucionais.</p><p>O Cdigo Gentico</p><p>O Sistema de Codificao Gentica</p><p>Cdigo gentico o conjunto de regras que governa a relao entre a sequncia de nucleotdeos no DNA e a ordem dos aminocidos nas protenas. nessa relao que reside a essncia da expresso gnica e a decifrao do cdigo gentico foi realmente um importante marco na histria da Biologia.</p><p>Cdigo definido como um sistema de smbolos (letras, nmeros ou palavras) usado para representar um certo significado pr-estabelecido, s vezes secreto. Por exemplo, o cdigo Morse internacional constitudo por pontos, barras e espaos. Para quem no conhece o cdigo, os pontos e barras no tm o menor significado, mas conhecendo-se as regras do cdigo, os pontos e barras podem ser facilmente convertidos em frases.</p><p>O cdigo gentico permite clula converter sequncias de bases do DNA em cadeias polipeptdicas.Existem 20 diferentes aminocidos que devem ser especificados durante o processo de sntese de protenas por </p><p>algum tipo de combinao das quatro diferentes bases existentes no DNA. Quantas bases devem ser utilizadas para construir um cdigo que permita que os 20 aminocidos diferentes sejam especificados? </p><p>Se as palavras desse cdigo tivessem uma base, apenas quatro aminocidos seriam especificados. Um cdigo baseado em conjuntos de duas bases permitiria 16 combinaes diferentes. J um cdigo baseado em trincas de bases permitiria 64 combinaes distintas de bases, o que seria suficiente para determinar os 20 aminocidos. Como os sistemas celulares so geralmente econmicos, um cdigo baseado em quatro letras seria muito improvvel, pois permitiria 256 combinaes diferentes. Assim, um cdigo baseado em trincas seria a situao mais razovel. De fato, atribui-se ao fsico russo George Gamow, por volta de 1954, a proposio de que um cdigo baseado em trs bases seria o mais provvel.</p><p>Contudo, ainda fica a seguinte pergunta: Como so lidas essas trincas? Uma aps a outra ou uma mesma base pode fazer parte de trs trincas adjacentes? Nesta segunda opo diramos que o cdigo sobreposto. (Fig.1)</p><p>Em um cdigo sobreposto, cada base do DNA participaria da codificao de dois ou trs aminocidos. Este tipo de cdigo imporia severas restries sobre as sequncias de aminocidos das protenas. Assim, por exemplo, um aminocido cujo cdigo fosse CAG no poderia ser seguido por um outro cujo cdigo tivesse como primeira base um T ou um C porque, por definio, a primeira base do prximo aminocido teria que ser A ou G, dependendo da extenso da sobreposio.</p><p>Brenner foi o primeiro a propor que o cdigo no era sobreposto, isto , que cada base participaria na codi-ficao de um nico aminocido.</p><p>Tambm devemos considerar que se o cdigo fosse sobreposto, toda vez que uma base fosse alterada na mol-cula do DNA, um, dois ou trs aminocidos seriam alterados na protena mutada. A evidncia gentica, contudo, no falava a favor dessa hiptese. Em estudos sobre mutaes no vrus do mosaico do tabaco (TMV), a substituio </p></li><li><p>3Biologia Molecular Texto 6 O Cdigo Gentico</p><p>de um nico nucleotdeo no genoma viral resultava geralmente na alterao de um nico aminocido na cpsula protica do vrus, e no na alterao simultaneamente de trs aminocidos, como seria esperado se o nucleotdeo alterado fizesse parte de trs cdons ao mesmo tempo.</p><p>A Natureza Trplice do Cdigo</p><p>Embora um cdigo baseado em trincas fosse o mais adequado nos sistemas biolgicos, apresentar uma evidncia experimental de que isso era real no era uma tarefa trivial na dcada de 60. O trabalho de Benzer sobre mapeamento gentico em fagos foi crucial no desenvolvimento desses experimentos. Benzer estudava mutantes chamados rII do fago T4. Mutantes rII eram capazes de lisar E.coli de uma linhagem B, mas eram incapazes de lisar E. coli das linhagens K. Ele verificou que os fagos com mutao de ponto revertiam muito frequentemente para o tipo selvagem. Ele poderia ter pensado que este fato seria devido reverso da mutao original que resultaria novamente na sequncia de bases do tipo selvagem. Isso verdadeiro para a maioria das reverses, no entanto, mutaes reversas no constituem a nica maneira pela qual indivduos com mutaes de ponto no loco rII podem reverter ao tipo selvagem. Foi verificado que, em alguns casos, os revertidos carregavam uma segunda mutao ocorrida nas proximidades da mutao original. As duas mutaes juntas eram responsveis pela produo de um fentipo selvagem, isto , a segunda mutao suprimia o efeito da primeira e foi, por este fato, denominada mutao supressora. Os fagos que apresentavam as duas mutaes juntas foram apelidados de pseudoselvagens. Mas como Benzer deduziu que os pseudoselvagens eram geneticamente diferentes dos selvagens? Foi verificado que, do cruzamento entre fagos selvagens e pseudoselvagens, resultavam, em elevada frequncia, descendentes que exibiam o gentipo caracterstico dos mutantes rII. Observe na figura 2 abaixo como foi possvel obter mutantes rII por permutao, a partir do cruzamento entre linhagens selvagens e pseudoselvagens.</p><p>Crick e Brenner, em 1961, aproveitaram essas mutaes supressoras para provar que o cdigo gentico era realmente composto por trincas, oito anos aps a idia ter sido proposta. Eles foram capazes tambm de demonstrar que a sequncia de bases do DNA era lida a partir de um determinado ponto, trinca por trinca, de maneira no sobreposta. Isto significava que cada mensagem gentica tinha uma estrutura de leitura fixa que poderia ser alterada pela adio ou remoo de uma nica base. O polipeptdio especificado pela mensagem conteria aminocidos incorretos a partir do ponto em que a base foi adicionada ou removida. Um aspecto que deve ser ressaltado o fato destas mutaes terem sido induzidas por corantes do tipo acridina, que causam insero ou deficincia de bases na sequncia de nucleotdeos do DNA.</p><p>Figura 1. Comparao entre cdigos de trs letras sobreposto e no-sobreposto. No cdigo no-sobreposto, a protena traduzida por cdons que no compartilham nenhum nucleotdeo. J no cdigo sobreposto, cada cdon compartilha um ou mais nucleotdeos, dependendo do grau de sobreposio, com os cdons vizinhos.</p><p>Figura 2. Cruzando-se um fago pseudoselvagem com um selvagem foi possvel obter dois mutantes rII com uma nica mutao cada, FCo e FC7.</p></li><li><p>4Biologia Molecular Texto 6 O Cdigo Gentico</p><p>Crick e Brenner assumiram que se uma mutao fosse uma insero de apenas uma base no DNA da regio rII (representada por um sinal +), a sua supressora deveria ser uma deleo (representada por sinal -). Assim, se a sequncia de bases do DNA estivesse sendo lida trinca por trinca (da esquerda para a direita), comeando de um ponto determinado, a insero de uma base determina que todas as trincas direita da mutao fossem lidas de maneira diferente do original; esta seria, portanto, uma mutao do tipo mudana do quadro de leitura. Geralmente, isto resultaria num polipeptdeo no funcional. Para compreender melhor os efeitos de uma mutao que afeta o quadro de leitura, observe esta frase em ingls constituda por palavras de apenas trs letras:</p><p>THE FAT CAT ATE THE BIG RAT</p><p>Deletando C: C THE FAT ATA TET HEB IGR AT</p><p>Inserindo A: ATHE FAT ATA ATE THE BIG RAT</p><p>A insero suprime o efeito da deleo pois restaura a fase de leitura. Mas sozinha, uma insero tambm perturbaria completamente o sentido da frase:</p><p>Inserindo A: ATHE FAT CAT AAT ETH EBI GRAT</p><p>Assim, a leitura correta das trincas seria interrompida aps uma mutao (+), sendo, entretanto, restabelecida aps uma mutao (). Se a regio alterada entre as duas mutaes no for crtica, o polipeptdeo pode ser funcional.</p><p>Mutaes supressoras devem estar sempre prximas das mutaes que elas suprimem, uma vez que pouco provvel que um polipeptdeo contendo grande nmero de aminocidos alterados permanea funcional. Caso tivssemos uma segunda mutao de sinal (+), ela no teria suprimido a mutao () e no haveria reverso para o tipo selvagem.</p><p>Considere a seguinte sequncia de bases:</p><p>CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT C...</p><p>a. Note como a insero de uma base altera a sequncia:Insero de um G: G</p><p>CAT CAG TCA TCA TCA TCA TCA TC...</p><p>b. Note como a insero de uma segunda base qualquer mantm a sequncia alterada:Insero de um A: A</p><p>CAT CAG TCA TAC ATC ATC ATC ATC...</p><p>A natureza trplice do cdigo somente foi demonstrada quando foram obtidos mutantes contendo trs mutaes do tipo inseres ou trs deficincias, pois esses mutantes triplos tinham o fentipo selvagem. Este resultado s seria possvel se o cdigo fosse lido em trincas, pois somente neste caso a ordem correta da leitura seria restabelecida aps trs alteraes de mesmo sinal.</p><p>c. Note como a insero de uma terceira base qualquer restabelece a fase de leitura da sequncia original:Insero de um T: T</p><p>CAT CAG TCA TAC TAT CAT CAT CAT C...</p></li><li><p>5Biologia Molecular Texto 6 O Cdigo Gentico</p><p>Os experimentos revelaram tambm a impossibilidade de apenas 20 dos 64 cdons possveis serem usados para especificar aminocidos. Neste caso, 44 cdons no teriam sentido, isto , no corresponderiam a aminocidos. Se isso fosse verdadeiro, um destes cdons sem sentido deveria muito provavelmente aparecer entre uma insero e sua deficincia supressora, determinando a terminao da cadeia polipeptdica antes que a leitura correta fosse restabelecida. Em outras palavras, estes estudos j sugeriam que, como veremos em breve, o cdigo gentico era degenerado ou redundante.</p><p>Dizer que o cdigo gentico degenerado significa que mais de um tipo de trinca de bases pode determinar o mesmo aminocido na cadeia polipeptdica.</p><p>A Decifrao dos Cdons</p><p>Simultaneamente demonstrao da natureza trplice do cdigo gentico, os cientistas iniciaram a tarefa da decifrao dos cdons. Cdon uma trinca de bases no RNA mensageiro que especifica um aminocido.</p><p>Em 1960, a funo do RNA mensageiro na sntese de protenas foi estabelecida, mas parecia que o cdigo s poderia ser decifrado quando fosse tecnicamente vivel sequenciar todos os aminocidos das protenas e sequenciar todos os nucleotdeos de um gene, comparando-os. Entretanto, em 1961, foi dado o passo fundamental para a decifrao do cdigo. Nos quatro anos seguintes, todo o cdigo foi decifrado em um dos maiores avanos da gentica moderna.</p><p>Marshall W. Niremberg e Heinrich Matthaei demonstraram que uma molcula de RNA mensageiro poderia ser traduzida in vitro. Isso foi feito introduzindo-se um RNA sinttico com sequncias de bases conhecidas em um extrato celular que possibilitava a sntese de protenas. Os constituintes essenciais nesse sistema eram ribosso-mos, RNAts, sintetases do aminoacil-RNAts (enzimas que ligam o aminocido ao RNAt ), ATP e aminocidos. Nesse sistema isento de clulas um RNA sinttico reconhecido como um RNA mensageiro e sua sequncia de bases traduzida em um polipeptdeo.</p><p>O experimento era feito colocando-se um mesmo RNA sinttico em vinte frascos contendo o extrato celular, sendo que em cada um deles foi colocado um tipo de aminocido marcado radioativamente. Aps algum tempo verifica-se em quais dos frascos existem polipeptdeos radioativos. Por exemplo, quando o RNA sinttico usado foi um poli-U, ou seja, um RNA em que todos os nucleotdeos tinham a uracila como base, foram detectados polipeptdeos radioativos apenas no frasco onde havia sido colocada fenilanina radioativa. A concluso foi que a trinca UUU codifica para fenilalanina. Essa foi a primeira trinca identificada por Nirenberg e Mathaei.</p><p>A introduo de poli-C e poli-A produziram polipeptdeos constitudos apenas pelos aminocidos prolina e lisina, respectivamente. A sntese de poli G apresentou problemas e no pode ser testada in vitro.</p><p>Nirenberg, Mathaei e Ochoa produziram, em seguida, RNAs contendo sequncias de duas ou mais bases unidas ao acaso. Foi impossvel prever a sequncia na qual as bases se ligariam e a decifrao precisa dos cdons no pde ser completada. Por exemplo, uma sequncia ao acaso de igual nmero de bases uracila e adenina produziria oito trincas possveis: UUU, UUA, UAA, AAA, AAU, AUU, AUA, UAU em frequncias iguais. Ento, polipeptdeos contendo quantidades iguais de oito aminocidos poderiam ser produzidos neste sistema de sntese de protenas. Os autores prosseguiram com este tipo de anlise diminuindo e aumentando a quantidade de cada uma das bases na mistura, tentando observar se a frequncia dos aminocidos se alterava. Embora isto pudesse dar algumas informaes sobre os cdons desses aminocidos, no era possvel relacionar trincas particulares com os aminocidos.</p><p>Um avano significativo na decifrao do cdigo ocorreu quando Khorana desenvolveu um mtodo para sinte-tizar copolmeros com sequncia conhecida. Ele fazia isso produzindo inicialmente dinucleotdeos com ordenao conhecida, por exemplo, dinucleotdeos UG com o U na extremidade 5 e o G, na 3.</p><p>Inicialmente, a traduo de copolmeros alternativos, tais como, UGUGUGUG revelou que poli UG codificava para valina-cistena-valina-cistena. Da, pode-se concluir que os possveis cdons para valina e cistena eram UGU ou GUG, mas no era possvel ainda concluir qual correspondia a qual aminocido.</p><p>Khorana, a seguir, sintetizou polirribonucleotdeos com trinucleotdeos repetidos, tais como: UUGUUGUUGUUG, os quais codificaram para trs tipos de polipeptdeos: polileucina, policistena e polivalina.</p><p>Em 1964, Niremberg e Leder fizeram uma descoberta que possibilitou a decifrao de todos os cdons. Eles descobriram que a adio de um RNA com apenas trs nucleotdeos (um trinucleotdeo) ao sistema de sntese de protenas resultava na ligao de um tRNA (ligado ao seu aminocido especfico) aos ribossomos. Esses complexos ribossomo-aminocil-tRNA podiam ser separados da mistura de reao por meio de filtrao em filtro de nitrocelulos...</p></li></ul>