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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA MÉTODO RÁPIDO PARA A DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS E MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL POR LC-MS/MS TESE DE DOUTORADO Osmar Damian Prestes Santa Maria - RS, Brasil 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA MTODO RPIDO PARA A DETERMINAO SIMULTNEA DE RESDUOS DE AGROTXICOS E MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL POR LC-MS/MS TESE DE DOUTORADO Osmar Damian Prestes Santa Maria - RS, Brasil 2011 MTODO RPIDO PARA A DETERMINAO SIMULTNEA DE RESDUOS DE AGROTXICOS E MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL POR LC-MS/MS por Osmar Damian Prestes Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qumica, rea de Concentrao em Qumica Analtica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obteno do grau de DOUTOR EM QUMICA Orientador: Prof. Dr. Renato Zanella Santa Maria - RS, Brasil 2011 Universidade Federal de Santa Maria Centro de Cincias Naturais e Exatas Programa de Ps-Graduao em Qumica A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado MTODO RPIDO PARA A DETERMINAO SIMULTNEA DE RESDUOS DE AGROTXICOS E MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL POR LC-MS/MS elaborada por Osmar Damian Prestes como requisito parcial para a obteno do grau de Doutor em Qumica Comisso Examinadora ______________________________________ Prof. Dr. Renato Zanella (Orientador, UFSM) __________________________________________ Profa. Dra. Carol Hollingworth Collins (UNICAMP) __________________________________________________ Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (UNICAMP) __________________________________________________ Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime (co-orientadora, UFSM) ______________________________ Prof. Dr. Roger Wagner (UFSM) Santa Maria, 03 de maro de 2011 DEDICATRIA Nossa vida um caminho cheio de incertezas, as quais ningum capaz de prever,por isso mais importante do que as coisasque se tem na vida quem temos na vida. Dedico este trabalhoa todas as pessoas importantes e que fizeram a diferena na minha vida. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Renato Zanella agradeo a orientao neste trabalho, o apoio, o incentivoeaamizade,sempresedispondoemajudarincondicionalmente, propiciando um ambiente de trabalho favorvel para discusso e anlise de idias e resultados.Profa.Dra.MarthaBohrerAdaime,co-orientadoradestetrabalho,aquem no tive dificuldades em admirar, pela simplicidade aolado de destacada sabedoria e principalmente pela forma como trabalha essas virtudes.AoscolegasdoLARP,emespecialaLucila,Giovana,Dbora,Juliana, Danieli, Daniela, Guilherme, Felipe e Fbio agradeo por ter conhecido todos vocs, pela troca de idias, experincias e pela convivncia.CarolineFriggipelaamizade,trocadeidiasconstanteeporsua colaborao em todas as etapas deste trabalho. MrciaBotegapelaconvivncia,pelaparceriainigualvel,pela cumplicidadeefortevnculoquesecriou,pelaslongasconversaserisadas.Voc tornaram os obstculos mais amenos e as conquistas mais saborosas e divertidas. Profa.Dra.AntniaGarridoFrenicheaoProf.Dr.RobertoRomerodo Grupo de Qumica Analtica de Contaminantes da Universidad de Almeria/Espanha, pelaamizade,ensinamentoseacolhidaemseugrupodepesquisa.Eaosamigos Rocio, Maribel, Nieves, Maria, Padilla. Muchas Gracias! AoProf.Dr.EdneiPrimel,Prof.Dr.RogerWagnereaoDr.UbiratanFlores pelas valiosas sugestes e comentrios no exame de qualificao. Aos membros da bancaProfa. Dra.Carol H. Collins, Profa. Dra.Isabel C. S. F. Jardim e Prof. Dr. Roger Wagner pelas excelentes contribuies e comentrios na banca examinadora da defesa desta tese. Aosmeusantigosprofessoresquemeensinaramcomprazerededicao parte do que sei. AoAdemireValria,funcionriosdaPPGQ,pelagentileza,simpatiae ateno no atendimento das suas tarefas. A minha famlia, em especial a minha me que, assumindo responsabilidades depaiemedesdemuitocedo,ensinou-meacultivarosprincpiosevaloresde honra,verdadeefora.Emvocsempreencontreiomelhorexemplodesacrifcio, dedicao e disposio sem limites. Por isso, lhe dedico este trabalho. todososdemaisfamiliareseamigos,eacadaumquedealgumaforma torceu por mim e assim ajudou-me a fortalecer e concretizar este sonho. AoCNPqeCAPESpeloauxliofinanceiroepelapossibilidadederealizaro Estgio de Doutorado na Universidad de Almeria/Espanha. ADeus,quetantomeajudou,dando-mesade,pacincia,entendimentoe dirigindomeuscaminhos,muitasvezescolocandopessoasespeciaisemminha vida. RESUMO Tese de Doutorado Programa de Ps-Graduao em Qumica Universidade Federal de Santa Maria MTODO RPIDO PARA A DETERMINAO SIMULTNEA DE RESDUOS DE AGROTXICOS E MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL POR LC-MS/MS

AUTOR: OSMAR DAMIAN PRESTES ORIENTADOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA Data e Local da Defesa: 03 de maro de 2011, Santa Maria. Atualmente, uma das maiores barreiras comerciais que o Brasil tem encontrado para acomercializaodeseusprodutosdacadeiadoagronegcioafaltadeinformaes sobre a presena de resduos em alimentos produzidos no pas. Devido a complexidade das matrizesdeorigemanimaledasbaixasconcentraesdosagrotxicosemedicamentos veterinriospresentes,humagrandenecessidadededesenvolvimentodemtodos analticos eficientes e confiveis para a identificao e quantificao dos resduos. Nesteestudoavaliou-seafaixadelinearidadedascurvasanalticas(8nveisde concentraoe6injeescada),limitededeteco(LOD),limitedequantificao(LOQ), efeito matriz, bem como preciso e exatido, em termos de percentual de recuperao, para 91agrotxicose9medicamentosveterinriosanalisadosevalidadospelomtodo QuEChERS e Cromatografia Lquida Acoplada Espectrometria de Massas Sequencial em amostras de carne, fgado, rim, leite e ovo. Para isso, efetuou-se a fortificao dos alimentos previamentehomogeinizados,comsoluescontendoos100compostos,em3nveisde fortificao(10,25e50gkg-1),6rplicasparacadanvel,eaplicou-seomtodode extrao.AextraopelomtodoQuEChERSmodificadoconsistiunapesagemde10,0 g damatriz(paraleite10mL),10mLdeacetonitrilacontendo1%(v/v)decidoacticoe procedeu-seaagitaomanualevigorosa,porcercade1min.Acrescentou-se4,0gde sulfatodemagnsioanidroe1,7gdeacetatodesdioanidro,repetindo-seaagitao. Foram,posteriormente,centrifugadospor8min(3500rpm),aps4mLdeextratoforam transferidos para outro tubo contendo 600 mg de sulfato de magnsio anidro e 500 mg C18, repetindoaagitaoeacentrifugao.Oextratofoidiludo(1:1)nafasemvel,eem seguida analisado por LC-MS/MS. As curvas analticas, preparadas no solvente e nos extratos das matrizes avaliadas, apresentaram linearidade adequada entre 1,0 e 250,0 g L-1, com valores de coeficiente de determinao maiores que 0,995. O mtodo apresentou valores de recuperao satisfatrios entre 70 e 120% e (RSD 20%) para cerca de 85% dos compostos em todas as matrizes nos nveis de 10, 25 e 50 g kg-1 (para leite g L-1). Em geral, o mtodo apresentou valor de LOQm de 10 g kg-1 (g L-1).Portanto,concluiu-sequeomtodopropostopodeseraplicadodeformaeficiente para a determinao de resduos de agrotxicos e medicamentos veterinrios nas diferentes matrizes avaliadas, sem a necessida de alterao do mtodo desenvolvido foi eficiente para aextraoeclean-updosextratosdecarne,fgado,rim,leiteeovo,umavezque apresentoudesempenhosatisfatrioemambasasmatrizes,dependendodatcnicade deteco utilizada. Palavras-chave: QuEChERS, LC-MS/MS, agrotxicos, medicamentos veterinrios ABSTRACT Doctoral Thesis Programa de Ps-Graduao em Qumica Universidade Federal de Santa Maria RAPID SIMULTANEOUS DETERMINATION METHOD FOR PESTICIDES AND VETERINARY DRUGS RESIDUES IN FOOD OF ANIMAL ORIGIN BY LC-MS/MS AUTHOR: OSMARDAMIAN PRESTES ADVISOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA Date and Place: March 3rd, 2011, Santa Maria. Currently, one of highest trade barriers that Brazil has found for the marketing oftheirproductsfromtheagribusinesschainisthelackofinformationsonthe presence of residues in foods produced in the country. Due to the complexity of the matricesofanimaloriginandthelowconcentrationsofpesticidesandveterinary drugspresent,thereisagreatneedtodevelopefficientandreliableanalytical methods for identification and quantification of residues. Inthisstudyweevaluatedthelinearityrangeofstandardcurves(eight concentrationlevelsandsixinjectionseach),limitofdetection(LOD),limitof quantification(LOQ),matrixeffectandtheprecisionandaccuracy,intermsof percent recovery for 91 pesticides and 9 veterinary drugsanalyzed and validated by theQuEChERSmethodandLiquidChromatographycoupledwithTandemMass Spectrometry in meat, liver, kidney, milk and egg samples. For this, we performed the fortificationofpreviouslyhomogenisedsampleswithsolutionscontaining100 compounds in three fortification levels (10, 25 and 50g kg-1), 6 replicates for each level,andappliedthemethodextraction.ThemodifiedQuEChERSextraction methodconsistweighing10gofthematrix(10mLformilk),10mLofacetonitrile containing1%ofacetic acid(v/v) and shake handly and vigorously for about 1min. After,4gofanhydrousmagnesiumsulfateand1.7ganhydroussodiumacetate, repeatingtheagitation.Aftercentrifugationfor8min(3500rpm),4mLofextract were transferred to another tube containing 600 mg of anhydrous magnesium sulfate and500mgC18,repeatingtheagitationandcentrifugation.Theextractwasdiluted (1:1)inthemobilephase,andthenanalyzedbyLC-MS/MS.Analyticalcurves prepared in solvent and in all matrix extracts, showed adequate linearity between 1.0 and250.0gL-1,withdeterminationcoefficientsgreaterthan0.995.Themethod showedsatisfactoryrecoveryvaluesbetween70and120%(RSD20%)toabout 85% of the compounds in all matrices at levels 10, 25 and 50 g kg-1 (for milk g L-1). Ingeneral,themethodpresentedLOQmvalueof10gkg-1 (gL-1).Therefore,we concluded that theproposed method can be applied efficiently for the determination of pesticide and veterinary drugs residues in the different evaluated matrices without any modification of the method. Keywords: QuEChERS, LC-MS/MS, pesticides, veterinary drugs LISTA DE FIGURAS Figura 1 -Representaodasetapasdasprincipaisversesdomtodo QuEChERS (A) original, (B) acetato e (C) citrato........................ 37 Figura 2 -Representao esquemtica do ensaio 1 (mtodo QuEChERS acetato)paraanlisederesduosdeagrotxicose medicamentos veterinrios em amostras de origem animal....... 63 Figura 3 -Representao esquemtica do ensaio 2 (mtodo QuEChERS citrato)paraanlisederesduosdeagrotxicose medicamentos veterinrios em amostras de origem animal....... 64 Figura 4 -Representao esquemtica do ensaio3 (mtodo QuEChERS modificado)paraanlisederesduosdeagrotxicose medicamentos veterinrios em amostras de origem animal....... 65 Figura 5 -CromatogramastotaisobtidosporLC-MS/MSaapartirde soluo analtica (25 g L-1) preparada em A) acetonitrila e nos extratosbranco,obtidospelomtodoQuEChERS modificado, em B) carne, C) fgado, D) rim, E) leite e F) ovo..... 76 Figura 6 -CromatogramaobtidoporLC-MS/MSmodoMRM,parauma soluoanaltica(25gL-1)preparadoemextratodeleite branco. Em destaque a visualizao dos sinais individuais de algunscompostoscomasrespectivastransiesde fortificao................................................................................... 77 Figura 7 -Representaodapraticidadedeoperaodomtodo QuEChERS.................................................................................. 79 Figura 8 -RepresentaodomtodoQuEChERSmodificadoutilizado paraextraodosagrotxicosemedicamentosveterinrios nas amostras de carne, fgado, rim, leite e ovo........................... 81 Figura 9 -Percentualdeagrotxicosemedicamentosveterinriosem carne,queapresentamfaixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoerecuperao extrados com o mtodo QuEChERS modificado....................... 89 Figura 10 -Percentualdeagrotxicosemedicamentosveterinriosem fgado,queapresentamfaixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoerecuperao extrados com o mtodo QuEChERS modificado....................... 92 Figura 11 -Percentualdeagrotxicosemedicamentosveterinriosem rim,queapresentamfaixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoerecuperao extrados com o mtodo QuEChERS modificado....................... 95 Figura 12 -Percentualdeagrotxicosemedicamentosveterinriosem leite,queapresentamfaixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoerecuperao extrados com o mtodo QuEChERS modificado....................... 98 Figura 13 -Percentualdeagrotxicosemedicamentosveterinriosem ovo,queapresentamfaixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoerecuperao extrados com o mtodo QuEChERS modificado....................... 101 Figura 14 -Estrutura dos compostos cidos analisados...............................102 LISTA DE TABELAS Tabela 1 -Ordemcronolgicadosprincipaismtodosdeanlisede resduos de agrotxicos em alimentos.......................................... 33 Tabela 2 -Informaesdospadresanalticosslidosdeagrotxicosemedicamentos veterinrios utilizados........................................... 57 Tabela 3 -Gradiente utilizado para eluio dos compostos............................61 Tabela 4 -Condies empregadas no sistema cromatogrfico LC-MS/MS..71 Tabela 5 -Agrotxicos e medicamentos veterinrios quantificados por LC-MS/MSmodoESI(+/-)emododeaquisioMRM,tempode reteno,onsprecursores,onsprodutoseenergiadecoliso para as duas transies monitoradas........................................... 73 Tabela 6 -Percentualdecompostosqueapresentaramrecuperaes mdias (70-120%) e RSD ( 20%) obtidos para os trs ensaios de extrao................................................................................... 80 Tabela 7 -Coeficientes de determinao (r2) das curvas analticas, obtidos paraosagrotxicosemedicamentosveterinriosanalisados porLC-MS/MS,apartirdassoluesde1,0;5,0:10,0;25,0; 50,0; 100,0; 200,0 e 250,0 g L-1.................................................. 82 Tabela 8 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedo mtododeextraodeagrotxicosemedicamentos veterinrios em carne.................................................................... 87 Tabela 9 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedo mtododeextraodeagrotxicosemedicamentos veterinrios em fgado................................................................... 90 Tabela 10 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedo mtododeextraodeagrotxicosemedicamentos veterinrios em rim........................................................................ 93 Tabela 11 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedo mtododeextraodeagrotxicosemedicamentos veterinrios em leite...................................................................... 96 Tabela 12 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedo mtododeextraodeagrotxicosemedicamentos veterinrios em ovo....................................................................... 99 Tabela 13 -PercentuaisderecuperaoeRSDparaapreciso intermediria do mtodo QuEChERS modificado......................... 104 Tabela 14 -Avaliaodoefeitomatrizpercentualdosagrotxicose medicamentosveterinriosanalisadosporLC-MS/MSmodoEI positivo,apartirdesoluespreparadasemacetonitrilaenos extratos das matrizes avaliadas.......................................................... 109 LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ABIEC Associao Brasileira das Indstrias Exportadoras de Carne ANVISA - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria AOAC - Association of Official Analytical Chemists APCI - Ionizao Qumica a Presso Atmosfrica, do ingls Atmospheric Pressure Chemical Ionization API - Ionizao a Presso Atmosfrica, do ingls Atmospheric Pressure Ionization APPI-FotoionizaoaPressoAtmosfrica,doinglsAtmosphericPressure Photoionization ASE Extrao Acelerada por Solvente, do ingls Accelerated Solvent Extraction BCPC British Crop Protection Council C18 - Slica modificada com hidrocarboneto linear C18, octadecilsilano CAD Dissociao Ativada por Coliso, do inglsCI Ionizao Qumica, do ingls Chemical Ionization CID Dissociao Induzida por Coliso, do ingls Collisionally Activated Dissociation DAD - Deteco por Arranjo de Diodos, do ingls Diode Array Detection D-SPE - extrao em fase slida dispersiva, do ingls Dispersive Solid Phase Extraction EI Ionizao Eletrnica, do ingls Electron Ionization EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria ESI - Ionizao por Eletronebulizao, do ingls Electrospray Ionization ESI(-) - Ionizao por Eletronebulizao no modo negativo, do ingls Electrospray Ionization Negative Mode ESI (+) - Ionizao por Eletronebulizao no modo positivo, do ingls Electrospray Ionization Positive Mode EUA Estados Unidos FAO-OrganizaodasNaesUnidasparaaAlimentaoeAgricultura,doinglsFood and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration FVO Food and Veterinary Office GARP - Grupo de Analistas de Resduos de Agrotxicos GC - Cromatografia Gasosa, do ingls Gas Chromatography GC-ECD-CromatografiaGasosacomDetecoporCapturadeEltrons,doinglsGas Chromatography with Electron Capture Detection GC-MS-CromatografiaGasosaacopladaEspectrometriadeMassas,doinglsGas Chromatography coupled to Mass Spectrometry GC-MS/MS-CromatografiaGasosaacopladaEspectrometriadeMassasSequencial,do ingls Gas Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry GC-NPD-CromatografiaGasosacomDetecoNitrognioeFsforo,doinglsGas Chromatography Nitrogen Phosphorus Detection GPC Cromatografia por Permeao em Gel, do ingls Gel Permeation Chromatography IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica ICH - Conferncia Internacional sobre Harmonizao, do ingls International Conference on Harmonisation INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial ISOOrganizaoInternacionalparaPadronizao,doinglsInternationalStandard Organization IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry JECFA Joint Expert Committee on Food Additives LARP - Laboratrio de Anlise de Resduos de Agrotxicos LC - Cromatografia Lquida, do ingls Liquid Chromatography LC-MS-CromatografiaLquidaacopladaEspectrometriadeMassas,doinglsLiquid Chromatography Mass Spectrometry LC-MS/MS-CromatografiaLquidaacopladaEspectrometriadeMassasSequencial,do ingls Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry LLE - Extrao Lquido-Lquido, do ingls Liquid-Liquid Extraction LMR - Limite Mximo de Resduos LOD - Limite de Deteco, do ingls Limit of Detection LODi - Limite de Deteco do instrumento, do ingls Limit of Detection of Instrument LODm - Limite de Deteco do mtodo, do ingls Limit of Detection of Method LOQ - Limite de Quantificao, do ingls Limit of Quantification LOQi- Limite de Quantificao do Instrumento, do ingls Limit of Quantification of Instrument LOQm - Limite de Quantificao do mtodo, do ingls Limit of Quantification of Method LVI Injetor de Grande Volume, do ingls Large Volume Injection MAE Extrao Assistida por Microondas, do ingls Microwave Assisted ExtractionMAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento MeCN Acetonitrila MRM - Monitoramento de reaes mltiplas, do ingls Multiple Reactions Monitoring MS - Espectrometria de Massas, do ingls Mass Spectrometry MSPD Disperso da Matriz em Fase Slida, do ingls Matrix Solid Phase Dispersion n nmero de replicatas n.q. no quantificado OMC Organizao Mundial do Comrcio OMS Organizao Mundial da Sade PCI Ionizao Qumica Positiva, do ingls Positive Chemical Ionization pH - Potencial hidrogeninico PLE Extrao com Lquido Pressurizado, do ingls Pressurized Liquid Extraction PNCRC Plano Nacional de Resduos e Contaminantes de Origem Animal PSA - Amina primria secundria, do ingls Primary Secondary Amine PTVTemperaturaProgramadadeVaporizao,doinglsProgrammedTemperature Vaporized QuEChERS-Rpido,fcil,econmico,robustoeseguro,doinglsQuick,Easy,Cheap, Rugged and Safe r2 - coeficiente de determinao rpm - rotaes por minuto RSD - Desvio Padro Relativo, do ingls Relative Standard Deviation RSDpi - Desvio Padro Relativo para Preciso Intermediria RSDr - Desvio Padro Relativo para Repetitividade SANCO - Directorate General for Health and Consumer Affairs SBSE Extrao sortiva em barra de agitao, ingls Stir Bar Sorptive Extraction SFE Extrao por Fluido Supercrtico, do ingls Supercritical Fluid Extraction SIM - Monitoramento do on Selecionado, do ingls Selected Ion Monitoring SIM Monitoramento do on Selecionado, do ingls Single Ion Monitoring SPE - Extrao em Fase Slida, do ingls Solid Phase Extraction SPME Microextrao em fase slida, do ingls Solid Phase Micro Extraction tR - tempo de reteno UE Unio Europia UFSM Universidade Federal de Santa Maria UV - Ultravioleta v/v - Volume por volume SUMRIO 1INTRODUO.........................................................................................19 2REVISO BIBLIOGRFICA....................................................................21 2.1 A importncia do agronegcio para o Brasil......................................21 2.1.1 O setor da carne bovina no Brasil........................................................22 2.1.2 O setor do leite bovino no Brasil..........................................................23 2.1.3 A avicultura no Brasil............................................................................24 2.2 Agrotxicos............................................................................................25 2.3 Medicamentos Veterinrios..................................................................27 2.4 Resduos e contaminantes em alimentos...........................................29 2.5Programasdemonitoramentoderesduosecontaminantesem alimentos no Brasil..................................................................................... 30 2.6Mtodosmultirresduoparadeterminaodeagrotxicose medicamentos veterinrios em alimentos................................................ 31 2.6.1 Mtodo QuEChERS.............................................................................35 2.6.1.1 Mtodo QuEChERS original..............................................................36 2.6.1.2 Modificaes do mtodo QuEChERS...............................................39 2.6.1.3. Versatilidade e praticidade do mtodo QuEChERS.........................41 2.6.1.4. Limitaes do mtodo QuEChERS..................................................42 2.7Tcnicascromatogrficasparaadeterminaodeagrotxicose medicamentos veterinrios em alimentos................................................ 43 2.7.1 Cromatografia Gasosa acoplada Espectrometria de Massas..........43 2.7.2 Cromatografia Lquida acoplada Espectrometria de Massas...........45 2.7.2.1 Fontes de ionizao utilizadas no acoplamento LC-MS.................... 45 2.7.2.1.1 Ionizao por eletrobebulizao.....................................................46 2.7.2.1.2 Ionizao qumica a presso atmosfrica......................................47 2.7.2.1.3 Fotoionizao a presso atmosfrica.............................................47 2.7.2.2 Dissociao Induzida por Coliso (CID)............................................48 2.8 Validao de Mtodos Analticos.........................................................49 2.8.1 Seletividade..........................................................................................50 2.8.2 Linearidade e Curva Analtica..............................................................51 2.8.3 Limite de Deteco (LOD) e de Quantificao (LOQ)..........................52 2.8.4 Exatido................................................................................................52 2.8.5 Preciso................................................................................................53 3MATERIAIS E MTODOS........................................................................54 3.1 Intrumentao........................................................................................54 3.2 Reagentes, solventes e materiais utilizados......................................55 3.3 Processamento das amostras..............................................................55 3.4 Preparo das solues analticas..........................................................56 3.5OtimizaodosistemacromatogrficoLC-MS/MSpara determinaosimultneaderesduosdeagrotxicose medicamentos veterinrios em amostras de origem animal.................. 60 3.5.1 Escolha da fase mvel.........................................................................61 3.5.2 Condies do sistema de deteco......................................................61 3.6OtimizaodomtodoQuEChERSparaanlisesimultneade agrotxicosemmedicamentosveterinriosemamostrasdeorigem animal........................................................................................................... 62 3.6.1 Ensaio 1................................................................................................62 3.6.2 Ensaio 2................................................................................................63 3.6.3 Ensaio 3................................................................................................64 3.7ValidaodomtodoQuEChERSmodificadoparaanlisede resduosdeagrotxicosemedicamentosveterinriosemalimentos de origem animal......................................................................................... 66 3.7.1 Seletividade..........................................................................................66 3.7.2 Determinao da Linearidade das Curvas Analticas...........................66 3.7.3DeterminaodaEstimativadoLODeLOQdoinstrumentoedo mtodo QuEChERS modificado.................................................................... 66 3.7.4EnsaiosdefortificaoutilizandoomtodoQuEChERSmodificadopara avaliao da exatido............................................................................ 67 3.7.5 Preciso (repetitividade e preciso intermediria)...............................69 3.7.6 Avaliao do efeito matriz....................................................................69 3.8 Aplicao do mtodo...............................................................................70 4 RESULTADOS E DISCUSSES...............................................................71 4.1OtimizaodosistemacromatogrficoLC-MS/MSpara determinaoderesduosdeagrotxicosemedicamentos veterinrios em alimentos de origem animal............................................ 71 4.2 Condies de Anlise por LC-MS/MS..................................................72 4.3 Mtodo de extrao QuEChERS modificado otimizado....................78 4.3.1 Avaliao dos procedimentos de extrao...........................................78 4.4 Mtodo de extrao otimizado.............................................................80 4.5 Validao do mtodo QuEChERS modificado....................................81 4.5.1 Seletividade..........................................................................................82 4.5.2 Curva analtica e linearidade................................................................82 4.5.3DeterminaodaestimativadoLODeLOQdoinstrumentoedo mtodo........................................................................................................... 85 4.5.4 Ensaio de fortificao para avaliao da exatido do mtodo............86 4.5.5 Preciso (repetitividade e preciso intermediria)...............................103 4.5.6 Efeito matriz em LC-MS/MS.................................................................108 4.6 Aplicao do mtodo............................................................................113 5 CONCLUSES..........................................................................................114 TRATAMENTO DOS RESDUOS GERADOS.............................................116 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS..........................................117 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................118 19 1 INTRODUO Ocenriomundialdaproduodealimentosrevelaograndeinteresseda sociedade quanto inocuidade do produto final a ser consumido. Os acontecimentos envolvendoacontaminaodealimentos,comofoiocasodebenzenonaguae emsucosdefrutas,nitrofuranosemcarnedefrango,cloranfenicolnomel,entre outros,hmuitotmdespertadoaatenodoconsumidor(WHO,2010).Este quadrotemforadoospasesaestabeleceremnormaslegislativasrgidasvisando garantir o consumo de alimentos seguros por parte da populao. Quando se fala em resduos e contaminantes em alimentos, faz-se referncia a uma grande variedade de substncias. H muito tempo a agropecuria lana mo deartifciosenvolvendoaplicaodeagrotxicosemedicamentosveterinrios durante o processo de produo. Essas substncias podem permanecer no alimento na formaoriginalou, ainda,comosubprodutosou metablitos,quandodegradados ou biotransformados.Atualmente,umadasmaioresbarreirascomerciaisqueoBrasiltem encontrado para a comercializao de seus produtosda cadeia do agronegcio a faltadedadoscientficossobreapresenaderesduosecontaminantesem alimentosproduzidosnopas.Deacordocomorelatriodamissode representantesdaUniaoEuropia(UE)realizadanoBrasilemmarode2008, vrias foram as observaes, ajustes e/ou implementaes propostos, a fim de que oBrasiltenhaumaharmonizaonoseuplanodecontrolederesduose contaminantesemprodutosdeorigemanimal(FVO,2010).Asmodificaes, propostasvisamsuprirasexignciasdosprincipaisparceiroscomerciaisdopas (EUA e UE), alm disponibilizar ao mercado interno produtos de qualidade. Entre as solicitaes e/ou recomendaes presentes no relatrio pode-se citar: 1)necessidadederecursoshumanosqualificados,paraageraoe reproduo de conhecimentos em anlise qumica na rea de resduos e contaminantes em alimentos; 2)necessidade de implementao de mtodos analticos que representem o estado da arte em anlise de resduos e contaminantes em alimentos; 3)acreditao e validao dos mtodos de anlise utilizados, a fim de obter resultados reconhecidos por organismos internacionais; 20 4)aumentodonmerodecompostosaseremanalisadosemalimentosde origem animal. ConsiderandoaimportnciadoagronegcioparaaeconomiadoBrasil,do usodeagrotxicosemedicamentosveterinriosparaocontroledepragase doenas, bem como a consequente possibilidade destes contaminarem os alimentos eohomem,osobjetivosdestetrabalhoforam:(i)otimizarevalidarummtodode extrao(baseadonosfundamentosdomtodoQuEChERS)paradeterminao simultneaderesduosdeagrotxicosemedicamentosveterinriosutilizando Cromatografia Lquida acoplada Espectrometria de Massas em Srie (LC-MS/MS); (ii)demonstraraaplicabilidadedomtodootimizadonadeterminaoderesduos deagrotxicosemedicamentosveterinriosemalimentosdeorigemanimal(carne bovina, fgado bovino, rim bovino, leite bovino e ovo).Esteestudotorna-serelevantedevidoexistnciadepoucostrabalhos cientficossobreaextraosimultneaderesduosdediferentesclasses.Alm disso, este trabalho contribuir para o desenvolvimento de mtodo analtico validado empregandotcnicasmodernasdeextraoedeterminaoderesduosde agrotxicos e medicamentos veterinrios por LC-MS/MS. Por este motivo, monitorar aspossveiscontaminaesemamostrasdealimentostornou-seumassuntode extremarelevncia,devidoaoriscoqueestescompostosoferecemsade humana, alm da persistncia no meio ambiente e tendncia de bioacumulao. 21 2 REVISO BIBLIOGRFICA 2.1 A importncia do agronegcio para o Brasil Oagronegcio,entendidocomoasomadossetoresprodutivoscomosde processamento do produto final e os de fabricao de insumos, responde por 26,4% doProdutoInternoBruto(PIB)doBrasil,almdeserresponsvelpor39%dos empregos gerados no pas (MAPA, 2010).AhistriarevelaqueoBrasildesdeasuacolonizaocaracteriza-secomoum pas agroexportador. De acordo com dados do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento(MAPA),asexportaesdoagrogegciocresceram2,5vezesnos ltimosdezanoserenderamUS$76,4bilhesdedlaresem2010.Estevalor 18%maiordoqueoregistradoem2009(US$64,7bilhes)esuperaemUS$4,6 bilhesorecordeanterior,conquistadoem2008,deUS$71,8bilhes.Asimportaesaumentaram35,2%,passandodeUS$9,9bilhes,em2009,para US$ 13,4 bilhes em 2010. Com isso, a balana comercial do agronegcio registrou supervit de R$ 63 bilhes no ano passado (MAPA, 2010). Osnveistecnolgicosalcanadospelosprodutoresruraisbrasileirosatingiram patamares expressivos que podem ser mensurados pelo aumento da produtividade nocampo. Issoexplica,porexemplo, o fatodeoBrasilterconseguidodobrarsua produoagropecuria.Estedesempenhonocamposfoipossveldevidoa investimentosempesquisa,novastecnologiaseutilizaodeinsumos(sementes, adubos, agrotxicos e medicamentos veterinrios) de primeira linha disponveis para o setor (GUANZIROLI, 2008). AmelhoriadacompetitividadedaagriculturaeproduoanimalnoBrasil, sobretudonosltimosdezanoseoprprioempenhodogovernoedainiciativa privadaemestimularedivulgaroprodutoagropecuriobrasileironoexteriortem proporcionadooaumentodasexportaes.Paraaumentaraparticipaodos produtosagrcolasbrasileirosnomercadointernacional,almdotrabalho promocionaldesenvolvidoemconjuntocomainiciativaprivada,ogovernotem atuadojuntoaOrganizaoMundialdoComrcio(OMC)nosentidodaeliminao das barreiras comerciais nos pases importadores (GUANZIROLI, 2008). 22 ParaaOrganizaodasNaesUnidasparaAgriculturaeAlimentao(Food and Agriculture Organization, FAO), com a atual taxa de crescimento da populao mundial haver a necessidade de dobrar a produo de alimentos a cada 50 anos. O Brasil um dos poucos pases com elevado potencial para suprir este aumento de demanda. Entre as vantagens que o pas apresenta pode-se citar: elevada oferta de reasagriculturveiscomsolo,relevoeclimafavorveis,avanorecenteem pesquisasenodesenvolvimentodevariedadesadaptadasaoscultivosregionaise consolidao do binmio de explorao lavoura-pecuria (FAO, 2010).Oagronegciobrasileiroaltamentecompetitivoedemonstraelevadograu de crescimento, porm necessita da adoo de procedimentos mais eficazes para a manuteno da qualidade, visto que a segurana alimentar e qualidade dos produtos em grande parte advm das barreiras tcnicas aplicadas pelos pases importadores dos produtos agropecurios brasileiros. Este fato est mudando prticas e tambm a populao brasileira est se tornando cada vez mais exigente (LOURENO, 2010). SegundolevantamentorealizadopeloMAPA,omercadointernoterumfortecrescimento.Haver,assim,umaduplapressosobreoaumentodaproduo nacional, o crescimento do mercado interno e as exportaes do pas (MAPA, 2010). 2.1.1 O setor da carne bovina no Brasil SegundoaAssociaoBrasileiradasIndstriasExportadorasdeCarne (ABIEC), o Brasil tem um rebanho bovino de cerca de 190 milhes de cabeas, em contnuocrescimentoetemapresentadoavanosnosndicesdeprodutividade.O custo de produo do bovino brasileiro se situa dentre os mais baixos do mundo, o quetrazumagrandevantagemcompetitiva.Abovinoculturadecorterepresentaa maiorfatiadoagronegciobrasileiro,gerandofaturamentodemaisdeR$50 bilhes/ano e cerca de 7,5 milhes de empregos (ABIEC, 2010).O setor de carnes no Brasil modificou-se radicalmente nas ltimas dcadas. A pecuriabovina,apesardeaindanoincorporartorapidamenteasnovas tecnologias de produo e gesto, tem evoludo significativamente, com aumento da produtividadedorebanhoemodernizaodemuitasempresasrurais.Estes avanosforamresultadosdemudanasnomercadoconsumidordealimentose mudanas da prpria economia (OLIVEIRA et al., 2003).23 ApecuriabovinadoBrasilvembatendorecordesconsecutivosde exportao e, em 2010, foram exportadas 1,864 milho de toneladas, resultando em US$4,795bilhes.AsprevisesdaAssessoriadeGestoEstratgicadoMAPA que o Brasil amplie nos prximos anos a participao no mercado mundial de carne bovina.OBrasildeveconsolidaralideranamundialnasexportaesdecarne bovina em volume e em receita (MAPA, 2010). Apesardosbonsindicadoreseconmicos,acarnebovinabrasileiratem enfrentadoumasriederestriessanitriasemalgunsdosprincipaismercados importadoresEstadosUnidos(EUA)eUnioEuropia(EU).Estima-sequeopas deixou de exportar at US$ 2 bilhes em carne bovina at o fim de 2010. Somente com os entraves impostos pela UE, o "prejuzo" acumulado desde 2008 calculado em US$ 1 bilho (MAPA, 2010).Entreosmesesdemaioedezembrode2010,omercadoamericano embargoutodaaexportaodecarneindustrializadaprovenientedoBrasil.Neste perodooBrasildeixoudeexportar33,8miltoneladas decarneindustrializada(U$ 76,34 milhes) devido a presena de resduos de medicamentos veterinrios acima dos valores permitidos (ABIEC, 2010). A soluo dos problemas da pecuria brasileira passa, necessariamente, pela organizao da cadeia produtiva e por melhorias profundas nas prticas de manejo aplicadaspelosetorprodutivo.Oconjuntodeagentesquecompeacadeia produtivadacarneapresentagrandeheterogeneidade:depecuaristasaltamente capitalizadosapequenosprodutores,defrigorficoscomaltopadrotecnolgico, capazesdeatenderaumaexigentedemandaexterna,aabatedourosque preenchem requisitos mnimos da legislao sanitria (ABIEC, 2010). 2.1.2 O setor do leite bovino no Brasil Aimportnciaqueaatividadeleiteiraadquiriunopasincontestvel,tanto nodesempenhoeconmicocomonageraodeempregospermanentes.A produobrasileira,em2009,foide29,1bilhesdelitros,gerandoumvalorbruto superioraR$15bilhes(IBGE,2010).Osetorprimrioenvolvecercadecinco milhes de pessoas, considerando, tambm, os 1,3 milhes de produtores de leite. 24 Duas caractersticas so marcantes na pecuria de leite brasileira: a primeira queaproduoocorreemtodooterritrionacional.Existeinformaode produodeleiteem554microrregies,das558consideradaspeloInstituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE). A segunda caracterstica que noh umpadrodeproduo.Aheterogeneidadedossistemasdeproduomuito grande e ocorre em todas as unidades da federao. Existe desde propriedades de subsistncia,semtcnicaeproduodiriamenorquedezlitros,atprodutores comparveisaosmaiscompetitivosdomundo,comtecnologiasavanadase produo diria superior a 60 mil litros (EMBRAPA, 2008; CNA, 2010). OBrasilsempreatuounomercadointernacionalcomoumdosmaiores importadores de leite. Porm, a partir do crescimento da produo e dos ganhos na produtividade,opaspassouaserexportadordeleite,umaviradacomercial importante, que poder trazer uma srie de benefcios para diversos elos da cadeia produtiva,almdeconsolidaraposiodopasnomercadointernacionalde produtos lcteos (PONCHIO et al., 2005). 2.1.3 A avicultura no Brasil NoBrasil,aaviculturaempregamaisde4,5milhesdepessoas,diretae indiretamente, e responde por quase 1,5% do PIB nacional. A importncia social da aviculturanoBrasilseverificatambmpelapresenamacianointeriordopas, principalmentenosestadosdoSuleSudeste.Emmuitascidadesaproduode frangos a principal atividade econmica (BRAZILIAN CHICKEN, 2010). Em 2009 a produo brasileira atingiu a marca de 10,9 milhes de toneladas, garantindoaoBrasilumaposioentreostrsmaioresprodutoresmundiaisde carnedefrango,juntamentecomEUAeChina.Dessetotal,cercade65% permanecemnomercadointerno,oquecomprovaaforadessaindstriaparao pas.OconsumopercapitadecarnedeavesnoBrasilestemaproximadamente 39quilosporano.Nasexportaes,oBrasilmantm,desde2004,aposiode maiorexportadormundial,tendoterminado2009comamarcade3,6milhesde toneladas embarcadas para mais de 150 pases (IBGE, 2010). Visandoatenderscrescentesexignciasdosimportadores,asempresas exportadorasbrasileirasdosetorpassaramainvestiremmelhorianagentica,em 25 novas tecnologias e emprocessos que aumentassem a eficincia de toda a cadeia produtiva. O alto nvel tecnolgico alcanado pela avicultura nacional, notadamente adecorte,colocouaatividadeemposioprivilegiadaemrelaoaoutras atividadespecuriasdesenvolvidasnoBrasil,comnveldeprodutividade internacional.Em2009,ostrsprincipaispasesprodutoresdefrangonomundo, EUA,ChinaeBrasil,responderampor54%daproduomundial(BRAZILIAN CHICKEN, 2010). DeacordocomosdadosdaPesquisaPecuriaMunicipal,realizadapelo IBGE,em2009,oEstadodeSoPaulofoioprincipalprodutordeovosnoBrasil (860,9 milhes de dzias), seguido por Minas Gerais, Paran e Rio Grande do Sul. A produo brasileira de ovos em 2009 foi de 3,3 bilhes de dzias. O crescimento da produoedaqualidadedesteprodutohabilitamoBrasilparaummercado gigantescodeovosesub-produtosdeovosfrescoseprocessados. Osetor produtivo de ovos brasileiros est voltado para o mercado externo e dever atendersdiretivasdaUEedeoutrosprovveispasescompradoresdoproduto.Trata-se deumapadronizaoparagranja,fbricasderao,entrepostos,indstriasde conserva de ovos, entre outros elos da produo (IBGE, 2010). 2.2 Agrotxicos Pesticida,segundooCodexAlimentariustodaequalquersubstncia utilizadacomopropsitodeprevenir,destruir,atrair,repeliroucontrolarqualquer peste,incluindoespciesindesejveisdeplantas,insetosouanimais,duranteas etapasdeproduo,armazenamento,transporte,distribuioeprocessamentodo alimentoouraoanimal(ouquesejafornecidoaosanimaisparacontrolede ectoparasitas).Otermoincluisubstnciasutilizadascomoreguladorasdo crescimentodasplantas,desfolhantes,dessecantes,ouinibidoresdebrotos,e substncias aplicadas tanto antes como aps a colheita, para proteger a mesma da deteriorao durante o armazenamento e transporte (FAO, 2005).NoBrasil(2002),oDecreton4.074regulamentaaLein7802/1989e estabelece que os defensivos agrcolas, ou agrotxicos, so produtos e agentes de processosfsicos,qumicosoubiolgicos,destinadosaousonossetoresde produo,noarmazenamentoebeneficiamentodeprodutosagrcolas,nas 26 pastagens, na proteo de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas edeambientesurbanos,hdricoseindustriais,cujafinalidadesejaalterara composiodafloraoudafauna,afimdepreserv-lasdaaodanosadeseres vivosconsideradosnocivos,bemcomoassubstnciasdeprodutosempregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento. Observa-se uma diferena importante entre as duas definies j que aquela efetuadapelaFAOcontemplasubstnciasquepossamviraseremutilizadasno apenasdiretamenteduranteoplantio,masemtodasasetapasdocultivo propriamente dito e tambm aps a colheita, como nas etapas de armazenamento, transporte, distribuio e processamento do alimento. Os agrotxicos esto sendo largamente utilizados desde a metade do sculo XX.DeacordocomosdadosdoBritishCropProtectionCouncil(BCPC), aproximadamente 860 substncias ativas so comercializadas como agrotxicos nos maisvariadostiposdeformulaes.Estassubstnciasestodivididasemmaisde 100classes,sendobenzoilurias,carbamatos,organofosforados,organoclorados, piretrides, sulfonilurias e triazinas os grupos mais importantes (BCPC, 2010). Ascaractersticasfsico-qumicasdosagrotxicossoconsideravelmente diferentes,umavezquepodemapresentarcartercido,bsicoeneutro.Estes compostospodemconteremsuaestrutura:halogneos,fsforo,enxofreou nitrognio,heterotomosquepossuemumagranderelevncianomtodode detecodestescompostos.Umgrandenmerodeagrotxicosmuitovoltil, outrosno,eestagrandediversidadecausasriosproblemasnodesenvolvimento de um mtodo universal para anlise de resduos destes compostos. Ousodeagrotxicosparaaproteodasmaisdiferentesculturaspermitiu umaumentonovolumedeproduo,porm,oaparecimentoderesduosdestas substnciasnosalimentos,atualmente,umadasprincipaispreocupaesde sadepblica.Sendoassim,programasinternacionaisparaocontrolelegalde agrotxicosestoestabelecidosparapreveniracontaminaodegneros alimentcios. Portanto, o controle de resduos de agrotxicos em alimentos um dos mais importantes aspectos de segurana alimentar. Oempregodeagrotxicosnaagriculturatemseusbenefcioseconmicos, uma vez que asseguram o controle e o combate de pragas e doenas, protegendo a qualidadedaproduo.Poroutrolado,os consumidores destesprodutosagrcolas podemestarexpostosaosagrotxicos,devidoapresenasdestesnosalimentos. 27 Entre os efeitos nocivos causados ao homem, por estas substncias, pode-se citar: diversostiposdecncer,danosaosistemanervosocentral,problemasnosistema reprodutivo e locomotor, deficincia mental, entre outros. Autilizaodeagrotxicoscontribuiparao aumentonaproduo,pormh umapreocupaocrescentecomseusefeitosadversosnoambiente,taiscomo contaminao dos recursos hdricos, impactos em organismos no alvos e na sade humana. Os agrotxicos podem apresentar diferentes rotas de degradao no meio ambienteeseremtransferidosempartesparadiferentescompartimentos ambientais.Quandoaplicadosempulverizao,osagrotxicospodemser transportadospeloventoparalocaisdistantesdosquaisforamaplicados.Quando aplicados diretamente no solo, podem ser levados pela gua de chuva ou irrigao e atingir os mananciais de guas superficiais ou as reservas subterrneas atravs da lixiviaocomagua.Emboraexistammuitaspossibilidadesparaqueos agrotxicos sejam transportados no ambiente e contaminem as fontes de gua, nem todos os produtos apresentam a mesma persistncia e mobilidade no ambiente. 2.3 Medicamentos Veterinrios AAgnciaNacionaldeVigilnciaSanitria(ANVISA)classificaos medicamentos veterinrios comotoda e qualquer substncia aplicada, em qualquer animal destinado produo de alimentos, com fins teraputicos, profilticos ou de diagnstico,ouparamodificarasfunesfisiolgicas,decomportamentooucomo promotor de crescimento (ANVISA, 2010). Napecuriamoderna,osmedicamentosveterinriostmsidoamplamente utilizadoseadministradoscomoaditivosemguaounosalimentosdosanimais destinadosaoconsumohumano,comointuitodepreveniroaparecimentode doenas.Almdisso,agentespromotoresdocrescimentosoaplicadospara estimular o crescimento dos animais, o que considerado uma prtica excessiva no uso desses medicamentos (STOLKER & BRINKMAN, 2005). evidentequehbenefciosimportantesparaospecuaristasaousarestas substncias,geralmente,ousodessesmedicamentosmelhoraaabsoroea conversodosalimentoslevandoaumganhoemprotenasesaisminerais 28 estimulandoocrescimentodosanimais.Noentanto,essassusbtnciaspodem permanecernosalimentosderivadosdosanimaistratados,levandoaresduos destes nos alimentos. Muitos destes compostos podem exercer efeitos genotxicos, carcinognicos, endcrinos,entreoutros.AagnciaFoodandDrugAdministration(FDA)eaUE exigemumseverocontrolenousodestescompostosenvolvendoaproduode alimentos.Deacordocomestesrgosreguladores,estassubstnciasso classificadasemdoisgrupos,ogrupoAcompreendeassubstnciasproibidas (estilbenos,agentesantitireideos,esterides,lactonasdocidoresorclico,beta-antagonistasenitrofuranos),eogrupoBcompreendeoutrosmedicamentos veterinrios autorizados, mas que possuem limites estabelecidos (bactericidas, anti-helmnticos,carbamatosepiretrides,sedativos,anti-inflamatriosnoesterides, organoclorados e organofosforados) (FDA, 2010; FVO, 2010). Osantibiticos,nasuamaioria,atuamcomopromotoresdocrescimentoe tm sido utilizados de forma abusiva levando principalmente ao desenvolvimento de resistncia microbiana no homem. Por outro lado, os anti-helmnticos, embora sejam usadosparaoseupropsito,notratamentodeinfecesparasitrias,tambmtm causadosriosproblemas,devidoaonocumprimentodoprazodecarnciaeda posologiaaplicadaaoanimal.Emgeral,animaisquesoalimentadoscom antibiticosganhampesomaisrpido,somenossuscetveisainfeces bacterianaseapresentammaioreficinciaalimentar(ARCURI&MANTOVANI, 2010). A maioria dos antibiticos utilizados em ruminantes no afeta o metabolismo doanimaldiretamente,eosefeitosbenficosgeralmenteestorelacionadoscom aoindiretadomedicamentoveterinrio,melhorandoascondiesdehigienedo animalouinfluenciandoadigestodosalimentos(ARCURI&MANTOVANI,2010). Almdeinibirpatgenosresponsveisporquadrosclnicosquediminuemo desempenhodoanimal,vriosantibiticosutilizadoscomoaditivosalimentaresem bovinosafetamometabolismodealimentosnormenealteramosprodutosde fermentaodegruposmicrobianosespecficosdotratogastrointestinal.A modificao da fermentaoruminalpodesercaracterizadacomooprincipalefeito dosantibiticosadicionadosalimentaodosruminantes.Destaforma,mais energiaenitrogniosodisponibilizadosparaoanimal,resultandonamelhorado desempenho e ganho de peso (ARCURI & MANTOVANI, 2010). 29 2.4 Resduos e contaminantes em alimentos DeacordocomanormaNBRISO22000otermo"seguranaalimentar" descreveaspectosrelacionadosinocuidade,ouseja,osalimentosnodevem constituirviasdeexposioaperigosquepossamcausardanossade,sejam elesagentesbiolgicos,fsicosouqumicos.Entreosperigosqumicosexistentes, destacam-se os resduos e contaminantes (SPISSO et al., 2008). AFAOdefineotermoresduocomoafraodeumasubstncia,seus metablitos,produtosdeconversooureaoeimpurezasquepermanecemno alimentoprovenientedeprodutosagrcolase/ouanimaistratadoscomestas substncias (CODEX ALIMENTARIUS, 2010).Otermocontaminantedefinidocomoqualquersubstnciaquenoseja intencionalmenteadicionadaaosalimentos.Oscontaminantespodemestar presentesnosalimentoscomoresultadodasetapasdeproduo,transformao, acondicionamento,embalagem,transporteearmazenagemdoalimento(CODEX ALIMENTARIUS, 2010). Asdeficinciasnasboasprticasparaautilizaodeagrotxicose medicamentosdeusoveterinrioincorremnoaparecimentoderesduosque,em nveis acima dos Limites Mximos de Resduos (LMR), que podem representar risco sade humana. Estes riscos esto estritamente correlacionados com o desrespeito sinstruesdeusodofabricantecontidasnabuladosagrotxicosedos medicamentosveterinrios,taiscomo:indicaodeusoparaaespciealvo, dosagem, via de administrao e perodo de carncia. As organizaes internacionais envolvidas com a sade pblica, como o Joint ExpertCommitteeonFoodAdditives(JECFA),rgodaFAO,eoFDAdosEUA, estabelecem as diretrizes para os Limites Mximos de Resduos (LMR) (DENOBILI, 2004).Estessodefinidoscomoaconcentraomximaderesduoresultantedo uso de um pesticida ou medicamento veterinrio em produtos agropecurios. O LMR a quantidade legalmente permitida, ou reconhecida, como aceitvel no alimento e estabelecidoparacadacompostoaprovadoparausoemumdeterminado alimento.OLMRsempreestcorrelacionadoIngestoDiriaAceitvel.Esta obtidaapartirdeensaiosdeexperimentaoavaliando-seatoxicidade, teratogenicidade,ecarcinogenicidadedestescompostosnointencionais 30 (DENOBILI,2004).NoBrasil,acompetnciaparaestabelecerlimitesmximosde resduosemalimentos,sejademedicamentosveterinriosoudeagrotxicos,do Ministrio da Sade atravs da ANVISA (2010). Oconhecimentodaexposiodapopulaoaestescompostosde fundamental importncia para nortear as aes de controle e monitoramento visando a proteo do consumidor. 2.5Programasdemonitoramentoderesduosecontaminantesemalimentos no Brasil O agronegcio nacional vem incorporando novas tecnologias na produo de alimentosdeorigemanimal,incluindomanejosdiferenciadosnautilizaode pastagens,alimentao,genticaenasadeanimal.Aliadoaestefato,huma preocupaocrescentecomquestesrelacionadasapresenaderesduose contaminantes em animais destinados a produo de alimentos. O Brasil possui destaque na produo agropecuria, estabelecendo-se como umdosprincipaisprodutoresdealimentosdeorigemanimaldomundo.Assim,a produoanimalnopasvemseprofissionalizandoedispondodeferramentase tecnologiasparamaximizaraproduoanimal.Paraesteintento,autilizaode medicamentosdeusoveterinrioconstituiumaimportanteferramentaparao tratamento de infeces e para aumento de produtividade. O Plano Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes em Produtos de OrigemAnimal(PNCRC),foiinstitudopelaPortarian51,de6demaiode1986, sendo sua adequao realizada pela Portaria n 527, de 15 de agosto de 1995. um programadoMAPA,quevisagarantirasadedoconsumidorpormeiodeum monitoramentodapresenaderesduosdemedicamentosveterinriose contaminantesambientaisemprodutosde origemanimal(carnes,leite,pescado,e mel)(MAPA,2010).UmdosprincipaisobjetivosdoPNCRCintegraroesforo destinado melhoria da produtividade e da qualidade destes alimentos colocados disposiodapopulaobrasileira,esecundariamente,proporcionaraopas, condiesdeseadequardopontodevistasanitrio,sregrasdocomrcio 31 internacionaldealimentos,preconizadaspelaOrganizaoMundialdoComrcio (OMC) e outros rgos como FAO e Organizao Mundial da Sade (OMS).AsprincipaismetasdoPNCRCcaminhamnosentidodaverificaodouso corretoesegurodasdrogasveterinrias,deacordocomasboasprticas veterinriasrecomendadasedastecnologiasutilizadasnosprocessosde incrementaodaproduoeprodutividadepecuria.Asaesdesteplanoesto direcionadasparaseconhecereevitaraviolaodosnveisdeseguranaoudos LMRdesubstnciascomusoautorizado,bemcomoaocorrnciadequaisquer nveis de resduos de compostos qumicos de uso proibido no pas (MAPA, 2010). Deve-seressaltaraimportnciadoPNCRCparaopas,vistoqueono cumprimento das metas anuais previstas para o controle de resduos acarreta srios problemaseembargosnasexportaesparaosprincipaisparceiroscomerciaisdo pas (UE e EUA). Em 2002a ANVISA,iniciouaimplantao doProgramaNacional deAnlise deResduosdeMedicamentosVeterinriosemAlimentosExpostosaoConsumo (PAMVet). Este visa avaliar o potencial de exposio do consumidor aos resduos de medicamentosveterinriospelaingestodealimentosdeorigem animaladquiridos no comrcio. Entre os alimentos selecionados, est priorizado o leite bovino,porm outras matrizes como carnes (frango, bovina e suna), pescado, ovo e mel, devero fazerpartedoescopomonitorado,devidoaograndeconsumodestesprodutos (ANVISA, 2010). 2.6Mtodosmultirresduosparadeterminaoderesduosdeagrotxicose medicamentos veterinrios em alimentos. Nosltimosanos,ocorreuumrpidodesenvolvimentodenovosmtodos analticosvisandodeterminaoderesduosdeagrotxicosemalimentos.Estes avanos tiveram como objetivo a substituio dos mtodos tradicionais de anlise de resduos,queapresentavamcomocaractersticasamorosidadedesuasdiversas etapas, emprego de grandes volumes de solvente, alto custo, etc. (PRESTES et al., 2009). Geralmente,acomplexidadedacomposiodosalimentos,ocasiona dificuldades para a quantificao dos agrotxicos, sendo necessria a realizao de 32 umaetapadelimpezadoextrato,apsextraocomsolvente.Essaetapa fundamental, uma vez que reduz as interferncias e o efeito matriz, alm de diminuir a necessidade de manuteno do sistema cromatogrfico. No sentido de melhorar a anlisequantitativa,esforosforamrealizadosnodesenvolvimentodenovos mtodos de extrao e limpeza (PRESTES et al., 2009). As limitaes na anlise de resduos deagrotxicos foram minimizadas aps o desenvolvimento dos mtodos multirresduo. Estes apresentam como vantagens a possibilidadedeanalisarumgrandenmerodecompostos,altospercentuaisde recuperaodosanalitos,remoodospossveisinterferentesdaamostra,boa preciso e robustez, baixo custo, rapidez, facilidade e segurana (utilizam pequenos volumesdesolventesdebaixatoxicidade). ATabela1apresentaemordem cronolgica o desenvolvimento destes mtodos.Oprimeiromtodomultirresduoparaextraodeagrotxicosfoi desenvolvidoporMillsetal.(1963),noslaboratriosdoFDA,nosEUA.Omtodo baseia-seemumaextraocomacetonitrila(MeCN),sendoutilizadobasicamente nadeterminaodecompostosorganocloradosapolaresemamostrasno-gordurosas.Aadiodeguaaoextrato,seguidadeumaetapasubsequentede partio,promovidaatravsdaadiodesolventesapolares(etrdepetrleoou hexano).Almdegua,acaresesaistambmsoremovidosdoextratonesta etapa.Odesenvolvimentoeaplicaodeagrotxicoscomcaractersticasmais polares,comoporexemplo,organofosforadoseorganonitrogenados,demandou novosmtodosdeextraomultirresduoqueenglobassemestescompostos.Em 1975,Lukeetal.desenvolveramodenominadomtododeLuke,queconsisteem uma etapa de extrao de 100 g de amostra utilizando acetona (200 mL), seguida de umapartiolquido-lquidocomsolventesapolares(terdepetrleoe diclorometano),sendoutilizados100mLdecada.Comoobjetivodeobterem-se maiorespercentuaisderecuperaoparaoscompostospolares,adicionou-se cloreto de sdio (NaCl) na fase aquosa para favorecer a transferncia destes para a fase orgnica. 33 Tabela1.Ordemcronolgicadosprincipaismtodosdeanlisederesduosde agrotxicos em alimentos DcadaMtodoExtrao e LimpezaCaractersticas 1960 Mills O mtodo baseia-se em uma extrao com acetonitrila sendo utilizado basicamente na determinao de compostos organoclorados em amostras no-gordurosas. A etapa de limpeza realizada atravs da utilizao de uma coluna de florisil. A extrao seguida por uma etapa de partio com ter de petrleo. Compostos organofosforados apresentavam baixos percentuais de recuperao quando analisados por este mtodo. Storherr Realizou-se algumas modificaoes no mtodo de Mills. A extrao realizada com acetonitrila, porm o ter de petrleo substitudo por diclorometano. A etapa de limpeza realizada com carvo ativado Este mtodo possibilitou que o mtodo de Mills fosse aplicado a compostos organoclorados e organofosforados em frutas e vegetais. 1970 Mtodo para determinar organoclorados, organofosforafos e nitrogenados Utiliza acetona na etapa de extrao. Este processo seguido de uma partiolquido-lquido utilizando diclorometano ou mistura de diclorometano e ter de petrleo, a fim de remover da gua. A etapa de limpeza realizada com carvo ativado. Luke A extrao dos agrotxicos realizada com acetona. Adiciona-se cloreto de sdio para saturar a fase aquosa, tendo como consequncia maiores valores de recuperao dos compostos polares. A etapa de limpeza, quando realizada, feita com coluna de florisil. Este o primeiro mtodo em que uma soluo de cloreto de sdio foi adicionada ao extrato para promover o efeito salting out. 1980 Esta poca foi marcada pelo desenvolvimento de mtodos que no exigiam a utilizao de grandes quantidades de solventes clorados. Estes foram substitudos por outros, por exemplo,mistura 1:1 (v/v) de cicloexano e acetato de etila. Alm disso, os solventes apolares foram substitudos por sais (Na2SO4, MgSO4, NaCl, etc), durante o processo de partio.A extrao em fase slida (SPE, do ingls Solid Phase Extraction) comeou a ser amplamente utilizada, substituindo muitos mtodos baseados na extrao lquido-lquido. A acetona continua sendo o solvente mais utilizado na etapa de extrao. Porm, h o desenvolvimento de mtodos, nos quais a etapa de extrao era realizada com acetonitrila e acetato de etila. A fim de melhorar os percentuais de recuperao dos compostos polareso sulfato de sdio (Na2SO4) foi amplamente utilizado. Alm disso, diversos procedimentos de limpeza foram desenvolvidos. atual Os avanos da qumica analtica em consonncia com o conceito sustentabilidade levaram ao desenvolvimento de vrias tcnicas alternativas de extraao como por exemplo a SFE, MAE, MSPD, SPME e ASE. 34 Krijgsman&vandeKamp(1976),comointuitodemelhorarosresultados obtidoscomomtododeLuke,propuseramaextraodeagrotxicosutilizando acetato de etila com subsequente adio de sulfato de sdio anidro,obtendo maior rapidez, simplicidade, limpeza dos extratos e melhores valores de recuperao para oscompostospolares,quandocomparadoaomtododeLuke.Aimiscibilidadedo sistemaacetatodeetila-guatornoudesnecessriaaadiodesolventes apolares.Todasestasvantagensfizeramdesteomtodooficialparaextrao multirresduodeagrotxicosemvriospaseseuropeus.Umadasdesvantagens destemtodoaquantidadedeco-extrativosapolarestaiscomo,lipdioseceras, tornandonecessriaumaetapaposteriordelimpezautilizandoCromatografiapor PermeaoemGel(GelPermeationChromatography,GPC),aumentando significativamente o tempo e o custo do preparo da amostra. Nadcadade1980,oFoodandConsumerProductSafetyAuthorityda Holanda desenvolveu em seu laboratrio o mtodo de extrao mini-Luke, o qual umaminiaturizaodomtododeextraoLukeoriginal,omitindo-seaetapade particionamento com cloreto de sdio (HIEMSTRA & KOK, 2007). O mtodo consiste naextraode15gdefrutasouvegetaisjprocessados,adicionando-seacetona (30mL)seguidadeagitaoemhomogeneizadorUltraturraxporcercade30s, sendo posteriormente adicionados ter de petrleo (30 mL) e diclorometano (30 mL), agitando-senovamenteporcercade30s.Aminiaturizaodestemtodo possibilitou a reduo da quantidade de amostra, bem como de solventes utilizados. Entretanto,valoresbaixosderecuperao(70%)para compostosdependentesdopH(porex.:pimetrozina,imazaliletiabendazol), independente da matriz utilizada (LEHOTAY, 2005b; ANASTASSIADES et al., 2007). A adio de uma etapa de tamponamento foi a primeira modificao proposta paraomtodoQuEChERS,comoobjetivodemelhorarospercentuaisde recuperao(70-120%)(MAJORS,2010).Lehotayetal. (2005b)desenvolveramo mtodoQuEChERS-acetato(Figura1B),noqualoefeitotamponante(pH4,8) promovido pela adio de acetato de sdio. Este mtodo foi adotado em 2007 como mtodooficialdaAssociationofOfficialAnalyticalChemists(AOAC)paraa determinaoderesduosdeagrotxicosemalimentos(AOAC,2007) Anastassiades et al. (2007) propuseram o mtodo QuEChERS-citrato (Figura 1 C), este utiliza uma mistura de citrato de sdio di e sesquiidratados como responsveis peloefeitotamponante(pH5,0-5,5).Em2008,oEuropeanCommitteefor Standarisation, oficializou o mtodo QuEChERS citrato como mtodo de referncia na UE (CEN, 2008). OutramodificaobastanterelevantefoiaadiodosorventeC18 (octadecilsilano), (LEHOTAY et al., 2005c) juntamente com PSA na etapa de D-SPE, para promover uma limpeza mais efetiva de algumas matrizes, em especial aquelas que contm gordura (CUNHA et al., 2007; LEHOTAY et al., 2006; LEHOTAY et al., 2010a;LEHOTAYetal.,2010b;KOESUKIWIWTetal.,2010).Acombinaodo mtodo QuEChERS com limpeza do extrato baixa temperatura, visando a reduo dos co-extrativos lipdicos, tambm foi empregada com sucesso. Porm, a adio do sorventeC18naetapadeD-SPEmaisrpidaefcil,epromoveumaremoo igualmente eficaz dos lipdios (LEHOTAY et al., 2010a). Almdestasmodificaes,areduodoteordeclorofilanosco-extrativos provenientesdeamostrascompigmentaoverde,foioutroavanoefetuadona etapadelimpeza,(ANASTASSIADESetal.,2003;ANASTASSIADESetal.,2007), obtidoatravsdaadiodeumapequenaquantidadedecarbonografitizado (CUNHAetal.,2007;LEHOTAYetal.,2006,LEHOTAYetal.,2010a).Outra modificaorealizadanaetapadelimpezafoiousodeumamaiorquantidadede PSAnaetapadeD-SPEemamostrasdecereaiscomoobjetivoderemover,de 41 formamaiseficiente,oscidosgraxosco-extrados(MARTNEZ-GALERAetal., 2008). 2.6.1.3. Versatilidade e praticidade do mtodo QuEChERS Ensaios de proficincia empregando este mtodo comprovaram sua robustez, sendoomtodotransferidocomsucessoentreoslaboratriosparticipantes (MARTNEZ-GALERA et al., 2008). AsmodificaesjrealizadasnomtodoQuEChERSindicamumfuturo promissornaanlisemultirresduodeagrotxicosemalimentoseoutrosprodutos agrcolas.Almdostrabalhoscitados,omtodotemsidoempregadodeforma satisfatriaquandoaliadoEspectrometriadeMassas,pormnoestlimitado somente a este tipo de detector.Hernndez-Borgesetal. (2009),utilizaramomtodoQuEChERSeGC-NPD paraadeterminaode11agrotxicosembanana,comvaloresdelimitede quantificao(LOQ)nafaixade0,01a0,14mgkg-1,percentuaisderecuperao entre67e118%eRSD 20%.Dos9medicamentosveterinriosanalisados,somenteocomposto salinomicinanoapresentoupercentuaisderecuperaoeRSDconsiderados satisfatrios. Figura9. Percentual deagrotxicos e medicamentos veterinrios em carne, que apresentaram faixas de recuperao de 120%, aps ensaios de fortificao e recuperao, extrados com mtodo QuEChERS modificado.020406080100Compostos (%)Pesticidas10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)020406080100Compostos (%)Medicamentos Veterinrios10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)90 Tabela 9. Percentuais de recuperao e RSD para a repetitividade do mtodo de extrao de agrotxicos e medicamentos veterinrios em fgado Compostos Nveis de Fortificao (g kg-1) LOQm

(g kg-1) 102550 rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%) 2,4 D64,014,043,914,031,114,3n.q. 2,4,5 T47,75,840,818,420,00,3n.q. 3-OH Carbofuran89,04,297,33,589,00,110 atrazina73,514,082,56,093,31,010 azinfos etilico88,113,0100,40,598,72,810 azinfos metilico71,319,0100,90,393,11,910 azoxistrobina75,49,292,210,286,62,510 bentazona83,11,594,416,893,01,410 bispiribaque93,82,275,73,552,55,910 bitertanol95,81,673,812,782,54,210 boscalida80,912,098,92,195,33,010 bromoconazole81,13,585,51,482,43,610 buprofezina92,08,580,09,070,10,110 carbaril75,612,786,66,984,83,010 carbendazina96,45,198,42,183,11,510 carbofurano89,35,1101,49,493,42,410 carboxim85,22,395,06,583,90,510 cianizina84,514,490,81,990,40,910 clomazone88,09,094,412,884,80,310 cloranfenicol108,82,8100,11,986,90,710 clorimurom88,36,980,614,478,43,310 clorpirifos etilico83,916,790,022,5110,80,210 clorpirifos metil75,74,285,724,478,66,010 clorprofam75,310,1103,10,297,11,310 deltametrina79,94,881,53,072,99,110 diazinona91,62,881,80,979,60,110 diclofluanida64,89,943,814,451,419,8n.q. difenoconazole89,77,786,63,580,50,110 dimetoato87,75,297,59,489,81,110 epoxiconazole72,310,398,40,198,83,710 etiona80,15,881,021,379,93,310 fempropatrina93,18,585,51,870,910,610 fempropimorfe50,50,693,97,473,010,225 fenarimol79,49,5111,710,093,50,610 fentiona84,04,383,012,986,46,510 fipronil104,50,798,76,989,11,410 fluquiconazole75,418104,35,872,514,410 fluroxipir45,05,466,919,023,77,1n.q. flutalonil80,910,7104,510,696,73,910 imazalil107,14,587,611,978,91,510 imidacloprido108,517,179,28,491,82,210 91 iprovalicarbe76,48,9105,77,4103,64,210 linurom70,79,498,510,990,15,610 malationa74,09,5100,82,090,34,410 mecarbam79,05,6110,88,298,72,610 mepronil72,811,4101,211,592,31,010 metaconazole99,74,689,44,282,10,210 metalaxil88,70,885,97,087,11,610 metamidofos75,02,377,37,976,93,210 metiocarbe sulfona78,53,680,33,589,41,210 metiocarbe sulfoxido85,82,9102,115,787,63,710 metsulfurom metilico81,32,177,52,382,21,510 mevinfos73,211,085,82,889,20,610 miclobutanil74,312,0112,219,896,34,410 monesina83,14,366,04,474,25,410 monocrotofos84,78,976,817,383,72,910 monolinurom81,14,192,11,484,56,710 oxamil87,12,290,12,1103,90,710 paraoxon86,03,599,99,593,61,510 pendimetalina86,03,193,015,585,53,410 piraclostrobina95,611,297,37,285,63,310 pirazofos100,24,891,83,485,01,210 piridaben77,12,080,95,472,52,610 piridafetiona80,312,0113,711,894,83,010 piridato61,719,066,81,076,04,850 pirimetanil70,53,274,20,979,610,410 pirimicarbe97,37,492,66,684,02,310 pirimifos metilico83,08,281,21,085,91,210 procloraz84,60,784,34,080,20,810 profenofos74,83,078,07,475,31,110 profoxidim76,72,487,45,375,20,210 propargito75,913,083,01,477,12,210 propiconazole86,24,891,53,082,71,310 propizamida87,910,3107,65,189,20,310 propoxur80,22,8101,07,491,30,610 quinclorac65,012,023,710,750,15,2n.q. quinoxifeno86,72,086,42,379,12,710 robenidina85,71,979,70,181,31,210 salbutamol76,78,075,77,980,05,010 salinomicina55,110,053,50,947,34,2n.q. simazina75,08,678,313,588,50,810 sulfadimetoxina88,24,5119,414,093,91,210 sulfametazina98,50,289,81,290,61,910 sulfatiazol89,51,889,02,497,20,410 tebuconazole88,52,390,810,789,10,910 terbufos78,32,686,43,176,21,710 terbutilazina73,211,793,910,285,10,910 tetraconazole76,010,7115,41,5105,93,610 92 tiacloprido76,07,490,22,387,20,810 tiametoxam94,213,694,70,692,24,110 tidicarbe55,81,950,63,858,814,0n.q. tolclofos95,15,2103,613,8102,62,310 triadimefom74,53,1113,19,293,01,610 triadimenol78,310,7100,711,0100,25,310 triazofos88,28,3109,58,599,62,310 triclorfom92,218,493,66,293,51,110 trifloxistrobina87,25,293,91,088,11,010 triflumizole81,117,580,51,378,34,210 trimetroprima76,54,871,07,0684,50,610 vamidationa107,71,787,90,587,90,710 * n= 6 (6 extraes x 1 injeo de cada extrato) n.q.= no quantificado com confiana nos nveis de fortificao avaliados ATabela9,mostraque84%dosagrotxicosavaliadosnamatrizfgado apresentaram percentuais de recuperao entre 70-120% (RSD 20%) e LOQm de 10gkg-1(Figura10).Poroutrolado,oscompostosfempropimorfeepiridatoe apresentram LOQm de 25 e 50 g kg-1, respectivamente. Os agrotxicos 2,4D, 2,4,5 T,fluroxipir,quincloracetiodicarbe,noforamquantificadoscomsegurananos nveisdefortificaoavaliados,umavezqueapresentaramvaloresmdiosde recuperao fora da faixa permitida para anlise de resduos (70-120%) e/ou valores de RSD > 20%. Dos 9 medicamentos veterinrios analisados, somente o composto salinomicinanoapresentoupercentuaisderecuperaoeRSDconsiderados satisfatrios. Figura 10. Percentual de agrotxicos e medicamentos veterinrios em fgado, que apresentaram faixas de recuperao de 120%, aps ensaios de fortificao e recuperao, extrados com mtodo QuEChERS modificado. 020406080100Compostos (%)Medicamentos Veterinrios10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)020406080100Compocstos (%)Pesticidas10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)93 Tabela10.PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedomtodode extrao de agrotxicos e medicamentos veterinrios em rim Compostos Nveis de Fortificao (g L-1) LOQm

(g L-1) 102550 rec (%)RSD (%) rec (%)RSD (%) rec (%)RSD (%) 12,4 D- - - n.q. 22,4,5 T28,212,029,415,149,03,1n.q. 33-OH Carbofuran84,513,791,37,690,510,610 4atrazina90,83,683,65,088,66,410 5azinfos etilico107,06,3112,711,288,78,610 6azinfos metilico70,07,096,17,592,34,510 7azoxistrobina95,13,089,43,289,65,410 8bentazona79,33,274,39,082,411,110 9bispiribaque70,319,873,016,277,08,210 10bitertanol95,611,596,49,282,15,010 11boscalida100,610,282,32,293,27,010 12bromoconazole83,28,482,97,182,67,010 13buprofezina84,712,476,05,676,77,610 14carbaril86,418,492,31,293,36,710 15carbendazina100,212,7101,813,5100,610,510 16carbofurano94,52,193,25,788,93,710 17carboxim88,12,985,13,385,65,210 18cianizina91,814,686,87,5106,18,710 19clomazone86,24,680,64,583,96,210 20cloranfenicol94,78,996,61,692,913,910 21clorimurom87,04,880,66,999,518,410 22clorpirifos etilico92,310,598,813,9106,810,610 23clorpirifos metil90,314,583,513,279,716,310 24clorprofam96,016,6106,85,5103,213,910 25deltametrina81,87,777,66,679,95,010 26diazinona87,37,680,86,089,77,010 27diclofluanida60,718,056,214,162,018,0n.q. 28difenoconazole96,910,088,74,692,113,610 29dimetoato88,75,888,96,885,25,310 30epoxiconazole91,610,5103,83,790,57,110 31etiona85,84,476,09,672,314,910 32fempropatrina91,84,182,04,982,04,310 33fempropimorfe67,411,677,69,075,016,825 34fenarimol92,513,096,17,585,411,610 35fentiona88,712,170,910,387,310,410 36fipronil102,35,596,94,297,07,010 37fluquiconazole90,013,0108,211,180,18,610 38fluroxipir- - - n.q. 39flutalonil92,63,691,25,492,54,610 40imazalil73,37,379,16,481,35,210 94 41imidacloprido93,32,880,610,088,57,410 42iprovalicarbe87,15,2105,56,088,73,010 43linurom70,813,082,98,484,97,110 44malationa93,27,3103,18,790,48,610 45mecarbam87,416,0109,95,787,47,110 46mepronil89,16,0110,34,194,47,210 47metaconazole100,62,885,96,683,37,610 48metalaxil92,32,891,92,688,46,710 49metamidofos74,96,377,25,778,612,910 50metiocarbe sulfona89,918,678,618,173,512,810 51metiocarbe sulfoxido87,05,088,75,887,38,710 52metsulfurom metilico79,92,876,27,778,210,710 53mevinfos75,39,685,63,077,714,610 54miclobutanil99,48,7114,37,095,612,710 55monesina70,05,473,07,276,03,710 56monocrotofos84,45,170,02,683,07,510 57monolinurom89,64,187,47,575,018,910 58oxamil91,96,187,54,596,57,410 59paraoxon88,47,498,210,590,33,810 60pendimetalina85,32,986,13,888,27,610 61piraclostrobina87,84,790,03,384,37,410 62pirazofos102,26,595,73,193,35,810 63piridaben73,64,375,08,475,34,410 64piridafetiona92,14,4119,22,893,36,210 65piridato55,74,359,95,559,913,4n.q 66pirimetanil78,34,381,26,780,213,810 67pirimicarbe89,07,786,64,785,811,210 68pirimifos metilico84,76,982,65,682,44,310 69procloraz84,66,683,72,580,15,210 70profenofos82,912,475,96,378,810,710 71profoxidim85,65,579,65,579,35,510 72propargito82,711,484,43,174,417,910 73propiconazole85,911,888,43,986,610,810 74propizamida96,96,5114,36,587,33,310 75propoxur93,56,991,15,792,08,010 76quinclorac- - - n.q. 77quinoxifeno70,313,975,06,876,79,910 78robenidina70,514,973,57,370,913,610 79salbutamol87,018,092,016,079,012,010 80salinomicina43,813,254,74,254,815,6n.q. 81simazina84,67,370,01,490,117,210 82sulfadimetoxina106,34,590,74,084,816,510 83sulfametazina92,17,187,33,987,58,210 84sulfatiazol90,06,979,05,287,87,810 85tebuconazole78,413,088,910,787,417,210 86terbufos76,111,085,69,476,314,810 87terbutilazina85,23,086,36,082,16,310 95 88tetraconazole107,66,6107,58,288,813,910 89tiacloprido88,83,685,43,986,39,710 90tiametoxam87,92,688,06,184,36,710 91tidicarbe56,94,053,519,286,63,950 92tolclofos91,77,298,210,492,816,010 93triadimefom84,313,1118,81,793,98,610 94triadimenol94,07,0105,68,286,113,410 95triazofos99,39,1117,85,489,913,010 96triclorfom102,05,788,910,791,310,510 97trifloxistrobina90,610,090,85,186,15,810 98triflumizole90,86,380,64,975,814,910 99trimetroprima93,013,472,77,182,96,610 100vamidationa92,29,988,41,892,47,310 * n= 6 (6 extraes x 1 injeo de cada extrato) n.q.= no quantificado com confiana nos nveis de fortificao avaliados ATabela10apresentaosresultadosdasrecuperaesmdias(n=6) percentuaiseoRSD%paraos100compostosqueforamfortificadosemrimnos nveisde10,25e50gkg-1.Cercade80%dosagrotxicosapresentaram percentuaisderecuperaoentre70-120%evaloresdeRSD20%(LOQmde10 g kg-1). Os compostos fempropimorfe e tiodicarbe apresentaram LOQm de 25 e 50 g kg-1, respectivamente. Um total de 89% dos medicamentos veterinrios avaliados apresentou a faixa de 70-120% de recuperao e RSD 20% (LOQm de 10 g kg-1) (Figura11).Osagrotxicosdiclofluanida,2,4,5T,fluroxipir,quinclorac,2,4D, piridato e o medicamento veterinrio salinomicina, no foram quantificados. Figura11. Percentual deagrotxicos e medicamentos veterinrios em rim, que apresentaram faixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoe recuperao, extrados com mtodo QuEChERS modificado. 020406080100Compostos (%)Medicamentos Veterinrios10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)020406080100Compocstos (%)Pesticidas10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)96 Tabela 11. Percentuais de recuperao e RSD para a repetitividade do mtodo de extrao de agrotxicos e medicamentos veterinrios em leite nCompostos Nveis de Fortificao (g L-1) LOQm

(g L-1) 102550 rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%) 12,4 D22,016,046,015,050,011,1n.q. 22,4,5 T81,715,588,410,380,66,210 33-OH Carbofuran83,317,7100,112,382,95,010 4atrazina90,815,796,913,982,31,610 5azinfos etilico87,315,294,014,2109,45,810 6azinfos metilico81,514,288,78,682,84,810 7azoxistrobina76,512,985,315,783,41,110 8bentazona90,115,096,28,9103,314,810 9bispiribaque89,018,896,113,883,66,410 10bitertanol89,514,692,98,089,96,310 11boscalida100,611,8104,612,1103,59,010 12bromoconazole74,413,187,613,873,84,010 13buprofezina73,715,880,319,971,03,110 14carbaril77,910,2102,618,778,93,410 15carbendazina74,619,397,414,479,01,610 16carbofurano90,113,6106,415,384,32,210 17carboxim79,019,298,28,082,43,710 18cianizina82,014,1102,712,284,83,610 19clomazone85,516,6101,315,885,52,210 20cloranfenicol93,517,296,814,977,23,010 21clorimurom98,213,283,716,0100,99,310 22clorpirifos etilico96,09,099,62,698,711,410 23clorpirifos metil87,46,490,05,193,39,410 24clorprofam98,715,179,13,484,33,710 25deltametrina61,213,086,516,674,34,125 26diazinona79,719,086,613,577,52,910 27diclofluanida46,55,530,79,749,856,3n.q. 28difenoconazole73,312,388,918,377,92,810 29dimetoato86,612,8101,110,385,03,010 30epoxiconazole101,812,0105,713,996,211,210 31etiona74,01,6102,510,379,61,910 32fempropatrina68,910,691,714,477,73,125 33fempropimorfe104,22,0102,28,495,21,810 34fenarimol98,514,996,716,887,87,510 35fentiona78,814,090,915,285,65,610 36fipronil79,610,384,814,983,81,710 37fluquiconazole118,91,3106,913,398,819,110 38fluroxipir42,513,044,319,08,015,7n.q. 39flutalonil99,63,999,413,897,611,610 40imazalil72,117,891,213,775,65,910 41imidacloprido94,619,296,56,680,44,510 97 42iprovalicarbe82,44,189,315,588,17,810 43linurom92,014,9104,419,781,84,010 44malationa98,012,3107,26,9104,86,010 45mecarbam77,15,597,019,990,04,410 46mepronil87,36,783,013,085,15,610 47metaconazole85,716,991,319,573,46,410 48metalaxil77,19,195,710,984,01,310 49metamidofos87,017,8101,213,972,32,810 50metiocarbe sulfona102,413,592,910,7104,07,810 51metiocarbe sulfoxido99,514,7101,96,698,09,510 52metsulfurom metilico79,011,896,417,182,63,210 53mevinfos85,116,897,56,680,24,510 54miclobutanil103,49,297,44,587,719,210 55monesina71,011,678,114,879,02,710 56monocrotofos82,214,598,85,381,92,510 57monolinurom83,213,7100,419,685,83,610 58oxamil91,812,2106,57,389,53,010 59paraoxon108,15,6110,18,0101,813,010 60pendimetalina77,610,591,115,082,32,310 61piraclostrobina92,113,8101,514,895,26,310 62pirazofos78,114,585,014,380,02,010 63piridaben60,67,194,014,671,41,725 64piridafetiona95,215,196,913,583,69,310 65piridato58,06,063,515,768,03,1n.q. 66pirimetanil80,317,199,717,178,33,810 67pirimicarbe85,818,8105,818,076,93,110 68pirimifos metilico72,18,584,215,478,22,310 69procloraz70,612,792,119,679,13,110 70profenofos74,55,389,519,978,34,710 71profoxidim93,318,389,517,778,22,310 72propargito78,319,999,311,080,92,710 73propiconazole84,916,687,718,976,42,310 74propizamida88,415,894,917,891,79,610 75propoxur85,615,3104,412,881,44,010 76quinclorac40,020,767,016,556,03,1n.q. 77quinoxifeno62,411,880,811,775,73,525 78robenidina74,318,480,616,674,71,810 79salbutamol84,818,586,013,087,010,010 80salinomicina55,69,456,218,058,43,0n.q. 81simazina75,95,2100,613,686,14,010 82sulfadimetoxina105,812,0108,24,7104,62,610 83sulfametazina98,214,799,99,781,51,310 84sulfatiazol92,117,299,814,081,41,310 85tebuconazole86,18,188,914,877,85,910 86terbufos70,713,183,316,376,42,210 87terbutilazina88,619,0105,014,487,07,410 88tetraconazole98,011,787,616,584,610,510 98 89tiacloprido82,518,6101,210,283,32,010 90tiametoxam99,012,4102,79,181,32,810 91tidicarbe79,216,7102,217,480,84,510 92tolclofos106,69,8111,913,674,48,610 93triadimefom81,65,7106,36,093,08,810 94triadimenol103,26,192,711,384,00,710 95triazofos90,414,2101,214,586,26,710 96triclorfom83,610,7109,011,082,95,310 97trifloxistrobina76,612,8104,413,581,23,610 98triflumizole70,09,2105,712,875,22,410 99trimetroprima84,212,994,012,577,71,710 100vamidationa88,214,197,19,984,51,510 * n= 6 (6 extraes x 1 injeo de cada extrato) n.q.= no quantificado com confiana nos nveis de fortificao avaliados Observou-sequenamatrizleiteoscompostossalinomicina,quinclorac, fluroxipir,diclofluanidae2,4Dnopuderamserquantificadosemfunode apresentaremvalorespercentuaisderecuperaomenoresque70%.Poroutro lado,83%dosagrotxicose89%dosmedicamentosveterinriosapresentaram valoresdeLOQmde10gL-1,istosignificaqueapresentarampercentuaisde recuperao e RSD% considerados satisfatrios neste nvel de fortificao 70-120% de recuperao e RSD 20% (Figura 12). Figura 12. Percentual de agrotxicos e medicamentos veterinrios em leite, que apresentaram faixasderecuperaode120%,apsensaiosdefortificaoe recuperao, extrados com mtodo QuEChERS modificado. 020406080100Compostos (%)Medicamentos Veterinrios10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)020406080100Compostos (%)Pesticidas10 (g kg-1)25 (g kg-1)50 (g kg-1)99 Tabela12.PercentuaisderecuperaoeRSDparaarepetitividadedomtodode extrao de agrotxicos e medicamentos veterinrios em ovo nCompostos Nveis de Fortificao (g L-1) LOQm

(g kg-1) 102550 rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%)rec (%)RSD (%) 12,4 D20,513,023,612,025,015,0n.q. 22,4,5 T32,513,043,014,748,07,2n.q. 33-OH Carbofuran108,76,0102,92,289,71,810 4atrazina106,06,895,92,588,54,610 5azinfos etilico113,24,197,36,098,91,710 6azinfos metilico109,95,8101,62,488,26,610 7azoxistrobina100,915,5105,65,583,15,910 8bentazona105,68,190,14,589,44,610 9bispiribaque83,75,786,06,183,08,310 10bitertanol109,56,697,25,679,97,010 11boscalida111,55,796,46,791,84,310 12bromoconazole95,65,388,73,381,42,610 13buprofezina79,66,870,53,470,01,110 14carbaril111,34,797,24,286,84,310 15carbendazina104,01,793,62,281,91,810 16carbofurano106,14,998,63,992,02,610 17carboxim94,45,592,82,284,52,310 18cianizina107,96,8104,83,388,93,110 19clomazone106,25,294,63,583,81,910 20cloranfenicol115,53,293,13,887,42,410 21clorimurom106,85,386,73,979,63,710 22clorpirifos etilico102,113,099,64,3108,43,510 23clorpirifos metil109,16,179,714,175,89,310 24clorprofam98,315,493,27,593,05,010 25deltametrina88,74,876,04,271,05,510 26diazinona101,46,288,22,580,52,010 27diclofluanida33,02,027,03,021,04,0n.q. 28difenoconazole114,43,695,92,279,92,310 29dimetoato108,93,697,02,888,62,510 30epoxiconazole106,28,6101,95,898,82,510 31etiona104,14,884,72,878,33,310 32fempropatrina95,28,875,22,671,45,710 33fempropimorfe85,55,890,82,873,08,510 34fenarimol99,816,484,94,296,04,410 35fentiona103,34,893,14,382,65,210 36fipronil110,74,6102,92,088,42,010 37fluquiconazole101,910,9109,06,994,47,710 38fluroxipir39,819,025,115,038,010,7n.q. 39flutalonil117,21,6106,72,894,93,010 40imazalil94,65,784,34,676,24,310 41imidacloprido110,55,8102,04,190,63,210 100 42iprovalicarbe107,19,690,917,6101,92,810 43linurom111,85,792,74,988,84,010 44malationa109,58,9100,81,792,33,710 45mecarbam114,34,8100,04,096,72,510 46mepronil107,89,6102,21,591,80,810 47metaconazole114,21,794,04,079,84,310 48metalaxil112,26,5104,22,587,21,310 49metamidofos92,47,585,62,976,83,310 50metiocarbe sulfona108,19,0100,94,786,54,010 51metiocarbe sulfoxido111,66,198,64,487,12,110 52metsulfurom metilico104,92,989,13,882,02,110 53mevinfos112,44,594,14,687,83,310 54miclobutanil112,53,7104,24,893,53,810 55monesina101,64,679,35,273,44,410 56monocrotofos109,12,396,12,883,51,810 57monolinurom110,56,394,45,384,75,410 58oxamil108,59,099,23,398,98,810 59paraoxon114,51,9105,12,992,31,810 60pendimetalina108,53,993,11,884,52,410 61piraclostrobina113,32,796,93,484,93,010 62pirazofos106,37,6100,63,986,82,210 63piridaben79,75,275,02,974,02,110 64piridafetiona106,86,9102,92,592,83,710 65piridato67,15,148,14,245,94,7n.q. 66pirimetanil94,98,183,12,278,06,010 67pirimicarbe106,57,795,24,883,53,710 68pirimifos metilico98,04,586,43,284,22,910 69procloraz107,86,391,42,880,10,710 70profenofos92,58,282,42,074,82,010 71profoxidim86,44,976,02,576,12,910 72propargito105,04,381,13,576,31,510 73propiconazole111,07,291,65,583,22,810 74propizamida110,46,495,45,789,35,910 75propoxur114,54,496,22,390,61,910 76quinclorac30,011,020,86,219,66,3n.q. 77quinoxifeno64,05,060,63,958,23,1n.q. 78robenidina88,813,679,24,980,64,810 79salbutamol76,010,078,09,074,09,010 80salinomicina69,09,154,66,846,75,9n.q. 81simazina97,010,697,611,086,82,110 82sulfadimetoxina109,95,896,61,493,41,710 83sulfametazina112,94,099,55,392,22,810 84sulfatiazol105,33,494,54,193,56,410 85tebuconazole109,76,396,24,087,33,310 86terbufos107,212,584,46,077,63,610 87terbutilazina109,53,083,119,284,51,110 88tetraconazole110,43,7111,55,3105,13,510 101 89tiacloprido114,02,3100,01,786,71,410 90tiametoxam112,52,9103,64,189,63,710 91tidicarbe46,017,042,02,047,018,5n.q. 92tolclofos107,64,6102,67,2104,05,710 93triadimefom111,87,895,43,089,93,610 94triadimenol111,74,494,46,498,94,210 95triazofos117,40,9100,83,697,52,610 96triclorfom109,55,099,14,592,15,110 97trifloxistrobina109,79,8100,52,586,31,910 98triflumizole102,54,288,72,378,43,710 99trimetroprima93,710,190,22,784,43,810 100vamidationa111,53,198,92,386,81,610 n= 6 (6 extraes x 1 injeo de cada extrato) ATabela12apresentaosresultadosdospercentuaisderecuperaoe RSD% obtidos aps fortificao (10, 25 e 50 g kg-1) em amostras branco de ovo.

Resultadossimilaresforamobtidosquandosecomparamosdadosobtidosna amostra ovo com as demais matrizes. Nos trs nveis avaliados, 91% dos compostos apresentram percentuais de recuperao na faixa de 70-120% e RSD 20% (Figura 13).Observa-sequeoscompostosdiclofluanida,fluroxipir,tiodicarbe,quinclorac, salinomicina,quinoxifeno,2,4,5Te2,4D,tambmapresentaramproblemasde quantificaonaamostraovo,emfunodeseubaixopercentualderecuperao (