INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZNIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA, CONSERVAO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp., Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos

MARIA CLAUDIA GROSS

MANAUS-AM 2009

MARIA CLAUDIA GROSS

Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp., Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos

ORIENTADOR (A): Dra Eliana Feldberg CO-ORIENTADOR: Dr Cesar Martins

Tese apresentada ao Programa de Psgraduao do INPA como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Doutor em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva.

MANAUS-AM 2009

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FICHA CATALOGRFICA

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Gross, Maria Claudia Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp. , Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos / Maria Claudia Gross.--- Manaus : [s.n.], 2009. xxiii, 137f. : il. color. Tese (doutorado)-- INPA, Manaus, 2009 Orientador : Eliana Feldberg Co-orientador : Cesar Martins rea de concentrao : Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva 1. Acar-disco (peixe) Citogentica. 2. Symphysodon aequifasciatus. 3. Symphysodon discus. 4. Symphysodon haraldi. 5. FISH (tcnica) 6. Complexo sinaptonmico. I. Ttulo. CDD 19. ed. 597.50415

Sinopse: As trs espcies do peixe ornamental acar-disco (Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi), endmicas da bacia amaznica, foram estudadas mediante anlise de citogentica clssica (colorao convencional, deteco da heterocromatina e regies organizadoras de nuclolo) e molecular (hibridizao fluorescente in situ com sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) e anlise do complexo sinaptonmico. As anlises evidenciam a ocorrncia de rearranjos cromossmicos na evoluo das espcies, bem como mostram que elementos transponveis podem estar envolvidos com a formao da cadeia cromossmica meitica. Palavras-chave: Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus, Symphysodon haraldi, FISH, complexo sinaptonmico

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Dedico esta Tese aos meus pais Lineu e Marilda, ao meu irmo Joo Henrique e especialmente ao meu esposo Carlos Henrique Schneider.

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O homem que deseja ser cientista e cincia dedicar seu tempo e amor tem pelo menos trs certezas: a de que morrer um dia (como todo mundo), a de que no ficar rico (como quase todo mundo) e a de que se divertir muito (como pouca gente). Prof. Newton Freire-Maia

Se fosse fcil achar o caminho das pedras, tantas pedras no caminho no seria ruim. Humberto Gessinger

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A realizao deste projeto foi possvel devido: Ao Programa de Ps-graduao em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva, do INPA. Ao laboratrio de Gentica Animal do INPA, coordenao de Pesquisas em Biologia Aqutica (CPBA), onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvido, com financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais (PPIs), Fundao de Amparo Pesquisa do Amazonas (PIPT/FAPEAM N 1749/08) e convnios entre estas agncias e o Ministrio de Cincias e Tecnologia/Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq Proc. N 573976/2008-2 e MCT/CNPq/CT-Amaznia/CT-Energ 554057/2006-9). Aos laboratrios de Genmica Integrativa e de Microscopia Eletrnica, ambos sediados na Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho Botucatu, onde anlises da FISH e do complexo sinaptonmico foram realizadas, com financiamento proporcionado pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP 04/14766-6), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq 501119/2005-1) e Coordenadoria de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES, PROEQUI 1752/2008). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pela concesso da bolsa de estudo e pela taxa de bancada (processo. 141868/2006-6) durante a realizao deste trabalho.

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Agradecimentos Agradeo a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou indiretamente possibilitaram a realizao deste trabalho. minha eterna orientadora Dra. Eliana Feldberg, pelo exemplo de como age uma excelente profissional. Alm de conhecer como ningum os cicldeos neotropicais e querer compartilhar este conhecimento, ela acolhe a todos de braos abertos. Muito obrigada pelos inmeros ensinamentos, apoio, conselhos, ateno, crticas, sugestes, incentivo e amizade. Obrigada tambm por me ensinar como se comporta um orientador, sempre pronta a sanar dvidas, ensinar, ler e reler rapidamente tudo que necesssrio para o bom andamento do trabalho, sabendo dosar bom-humor e pulso-firme. Sem dvida, muito do meu crescimento profissional e pessoal devo minha me cientfica. Ao meu co-orientador Dr. Cesar Martins, que me proporcionou todo o ensinamento acerca da FISH, pela amizade, discusses, crticas, sugestes e tambm pelos momentos de descontrao. Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto por sua amizade, conselhos e incentivo, mas principalmente por seus questionamentos incessantes, que me fizeram buscar respostas a perguntas que eu nem imaginava que existissem! Aos amigos do Laboratrio de Gentica Animal do INPA: Brenda, Cac, Carlos, Eduardo, rica, Fernanda, Heidi, Leandra, Leila, Luciana, Natlia, Rodrigo, Valentim e todos os outros que j passaram por l. Obrigada pelo bate-papo (cientfico ou no), pelas crticas e sugestes, bem como pelo convvio dirio e festas. Vocs confirmaram a hiptese de que um ambiente de trabalho produtivo nada tem a ver com a competitividade interna. Sem dvida, vocs sempre faro muita falta. Um obrigado especial aos amigos Leandra, Carlos, Edu e Leilinha, que apesar de no serem admiradores natos da meiose, sempre me ajudaram na interpretao de resultados e leitura de manuscritos. Polacada, vocs so muito especiais. Aos amigos do Laboratrio de Genmica Integrativa, da UNESPBotucatu, especialmente ao Guilherme Targino Valente. Obrigada pelo acolhimento e por todos os ensinamentos. Aos meus amigos Leandra e Igor; Eduardo, Tahisa, Isabelle e Otto simplesmente por fazerem parte da minha vida e tornarem o meu dia-a-dia muito mais alegre. Resumindo, vocs fazem parte da minha famlia. Umvii

obrigado especial polaca (Leandra), que alm de amiga e cumadre, compartilhou todos os meus fracassos e conquistas cientficas desde a poca da UEPG (2000), sabendo a hora de rir ou chorar junto e sempre buscando a parte boa das situaes at nas horas ruins. Ao nico membro da equipe Caf com Leite (BADPI- mestrado 20042006) que permaneceu em Manaus. Rodrigo, meu amigo, obrigada por no ter abandonado o barco. Hercilia, Alessandra e Elci, secretrias da ps-graduao e do GCBEV. Sem vocs a nossa vida seria muito mais difcil. Agradeo tambm aos meus novos colegas da UFAM, do Instituto de Cincias Biolgicas, Departamento de Biologia, onde pretendo permanecer por uma longa data. minha sogra Edite Schneider e minhas cunhadas Silvia e Marielle. Um obrigado especial Marielle por ter me ensinado a dar os meus primeiros passos no mundo da meiose. Ao meu av, tios, tias, primos e cunhada. Especialmente tia Leila (minha segunda me), que apesar de achar que um dia eu deveria voltar para o Paran, sempre apoiou e incentivou as minhas decises, alm de fornecer muitas milhas da Varig e Tam para eu rever a famlia. Adoro vocs. Ao MSc. Carlos Henrique Schneider, pelo exemplo profissional, por ser extremamente crtico na reviso dos meus trabalhos, pela ajuda, apoio e sugestes. E ao meu esposo Carlinho, obrigada por conseguir conviver pacificamente com este clima de laboratrio-casa, por acordar bem humorado de madrugada para discutir dados que eu acho que vou esquecer at amanhecer, por aguentar meus perodos de estresse (que no so poucos), pelo companheirismo, amizade e amor incondicional. Voc imprescindvel na minha vida. Aos meus pais Lineu e Marilda Delfrate Gross e ao meu irmo Joo Henrique, que so meus exemplos de vida e me fizeram entender desde cedo o sentido da palavra Famlia. Passei os melhores dias da minha vida com vocs e, depois que vim morar longe de casa, valorizo muito mais cada momento que passamos juntos. Pai, Me e Ike, sem o apoio e incentivo de vocs eu no teria crescido pessoal e profissionalmente. Por isso esta conquista nossa! Amo vocs!

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A Deus, por s ter motivos para agradecer! Tudo valeu a pena! Como disse o cientista Louis Pasteur: "Um pouco de cincia nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima".

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RESUMO O gnero Symphysodon compreende trs espcies endmicas da bacia amaznica, conhecidas popularmente como acars-disco e muito apreciadas na aquariofilia. Dentro da famlia Cichlidae, essas espcies apresentam o maior nmero diploide j descrito, e para compreender os aspectos carioevolutivos das mesmas, anlises citogenticas clssica e molecular (utilizando sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) foram realizadas, assim como anlise do complexo sinaptonmico. Foram utilizados 22 S. aequifasciatus (14 , oito ), 37 S. discus (15 , 22 ) e 49 S. haraldi (21 , 28 ). Symphysodon aequifasciatus apresentou 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50msm+10st-a e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. Uma cadeia cromossmica multivalente, com nmero varivel de elementos e at 20 bivalentes, foi observada no diplteno/diacinese de espermatcitos e ocitos de S. aequifasciatus e S. haraldi. Em S. discus, 30 bivalentes foram detectados. Anlise do complexo sinaptonmico sugere homologia entre elementos formadores da cadeia, sendo verificada a presena de quiasmas ao longo de sua extenso. As trs espcies possuem regio organizadora de nuclolo mltipla, que variaram inter e intraespecficamente, porm nunca mais que duas marcaes foram evidenciadas por clula metafsica. Variabilidade, intra e interespecfica, tambm foi evidenciada nos stios de DNAr 18S, sendo observados de 2 a 5 por metfase: Symphysodon aequifasciatus apresentou trs padres de distribuio, enquanto S. discus e S. haraldi mostraram quatro padres. Stios de DNAr 18S tambm estiveram presentes, algumas vezes, na cadeia meitica das duas espcies portadoras. O DNAr 5S foi identificado no par 10 de S. aequifasciatus, enquanto em S. discus e S. haraldi este stio foi evidenciado no par 18. Nos cromossomos meiticos das trs espcies, os stios de DNAr 5S foram localizados em bivalentes tpicos. Com relao localizao do elemento Rex3, as trs espcies apresentaram um padro de distribuio compartimentalizada em alguns cromossomos e com sinais tnues de hibridizao na regio centromrica da maioria dos cromossomos. Tais sinais foram coincidentes com a heterocromatina na maioria das vezes. A somatria destes dados indica a ocorrncia de inmeros rearranjos cromossmicos, acmulo e movimentao de elementos repetitivos, bem como heterocromatinizao na carioevoluo do gnero Symphysodon. Ax

variabilidade dos stios de DNAr 18S pode refletir a existncia de translocaes envolvendo regies heterocromticas ricas em elementos transponveis, que teriam ocorrido independentemente em populaes/espcies ancestrais de Symphysodon. Em um dado momento estas populaes/espcies teriam formado hbridos, que formaram a cadeia cromossmica meitica para que o ajustamento sinptico entre os segmentos cromossmicos homlogos das espcies parentais ocorresse. Estes hbridos seriam o que hoje reconhecemos como S. aequifasciatus e S. haraldi, enquanto S. discus seria uma espcie pura.

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ABSTRACT The genus Symphysodon comprises three endemic species of the Amazon basin, commonly known as discus and highly prized by the aquarium trade. Within the family Cichlidae, these species have the highest diploid number described thus far. To understand the karyoevolutionary aspects of these species, classic and molecular (5S rDNA, 18S rDNA and retrotransposon Rex3) cytogenetic analyses were carried out, along with an analysis of the synaptonemal complex. Sixteen specimens of S. aequifasciatus (eight , eight ), 37 specimens of S. discus (15 , 22 ) and 43 specimens of S. haraldi (15 , 28 ) were analyzed. Symphysodon aequifasciatus had 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50m-sm+10st-a and S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. A multivalent chromosomal chain with a variable number of elements and up to 10 bivalents was found in the diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells in S. aequifasciatus and S. haraldi. Analysis of synaptonemal complex suggests homology among the elements that make up the chain, with the presence of chiasms throughout its length. In S. discus thirty bivalents were detected in the diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells. The three species have multiple nucleolus organizer regions that vary in both inter-species and intra-species terms. However, no more than two NOR sites were found per metaphasic cell. Inter-species and intra-species variability was also found for the 18S rDNA sites, with two to five sites per metaphase: Symphysodon aequifasciatus exhibited two distribution patterns, whereas S. discus and S. haraldi exhibited four patterns. 18S rDNA sites were also sometimes found in the meiotic chain of the two species. 5S rDNA was identified in pair 10 in S. aequifasciatus, whereas this site was identified in pair 18 in S. discus and S. haraldi. In the meiotic chromosomes of the three species, 5S rDNA sites were located in typical bivalents. Regarding the localization of Rex3, the three species exhibited a compartmentalized distribution pattern in some chromosomes and tenuous sites of hybridization in the centromeric region of the majority of chromosomes. Such sites most often coincided with the heterochromatin. These data indicates the occurrence of innumerous chromosome rearrangements, the accumulation and displacement of repetitive elements and heterochromatinization in the karyoevolution of the genus Symphysodon. The variability in 18S rDNA sites may reflect the existence of translocations involving heterochromatin regions rich inxii

transposable elements, which may have occurred independently in ancestral populations/species of Symphysodon. At some point, these populations/species may have formed hybrids, which formed a meiotic chromosome chain so that synaptic adjustment could occur between the homologous chromosome segments of the parent species. These hybrids may be what we recognize today as S. aequifasciatus and S. haraldi, whereas S. discus may be a pure species.

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Sumrio I. Introduo Geral ............................................................................................ 1 I.1 Consideraes sobre os acars-disco ....................................................... 1 I.2 Aspectos citogenticos dos acars-disco .................................................. 5 I.3 Complexo sinaptonmico em peixes neotropicais ..................................... 8 I.4 Citogentica molecular .............................................................................. 9 I.5 Objetivos .................................................................................................. 12 I.5.1 Geral ................................................................................................. 12 I.5.2 Especficos ........................................................................................ 12 II. Material e mtodos ..................................................................................... 13 II.1 Material ................................................................................................... 13 II.2 Mtodos .................................................................................................. 13 II.2.1 Induo de mitoses .......................................................................... 13 II.2.2 Obteno de cromossomos mitticos .............................................. 14 II.2.3 Preparao das lminas com cromossomos mitticos..................... 15 II.2.4 Obteno de cromossomos meiticos ............................................. 15 II.2.5 Deteco das regies organizadoras de nuclolos nos cromossomos mitticos e meiticos ................................................................................. 16 II.2.6 Deteco da heterocromatina constitutiva nos cromossomos mitticos e meiticos ................................................................................. 16 II.2.7 Hibridizao fluorescente in situ (FISH) ........................................... 17 II.2.8 Microespalhamento para visualizao do complexo sinaptonmico 23 II.2.9 Anlises cromossmicas .................................................................. 25 III. Resultados e discusso............................................................................ 27 III.1.Artigo 1: Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados ............................................................................................. 28 III.1.1. Introduo ...................................................................................... 30 III.1.2. Material e mtodos ......................................................................... 31 III.1.3. Resultados ..................................................................................... 33xiv

III.1.4. Discusso ....................................................................................... 40 III.2.Artigo 2: Anlise citogentica comparativa das espcies do gnero Symphysodon (Cichlidae): caractersticas cromossmicas de

retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal.......................... 46 III.2.1. Introduo ...................................................................................... 47 III. 2.2. Material e mtodos ........................................................................ 48 III.2.3. Resultados ..................................................................................... 51 III.2.4. Discusso ....................................................................................... 59 III.3.Captulo 3: Variabilidade intra e interespecfica do locus do DNAr 18S entre acars-disco Symphysodon: rearranjos cromossmicos ..................... 67 III.3.1. Introduo ...................................................................................... 68 III.3.2. Material e mtodos ......................................................................... 69 III.3.3. Resultados ..................................................................................... 72 III.3.4. Discusso ....................................................................................... 79 III.4.Captulo 4: Complexo sinaptonmico em acars-disco: cadeia

cromossmica meitica ................................................................................ 84 III.4.1 Introduo ....................................................................................... 85 III.4.2. Material e Mtodos ......................................................................... 86 III.4.3. Resultados ..................................................................................... 86 III.4.4. Discusso ....................................................................................... 90 IV. Concluses Gerais ................................................................................... 94 V. Perspectivas futuras .................................................................................. 96 V. Perspectivas futuras .................................................................................. 96 VI. Referncia bibliogrfica ........................................................................... 97

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Lista de figuras

Introduo Figura 1: Classificaes taxonmicas atualmente propostas para o gnero Symphysodon. Note que a nica espcie onde existe consenso na nomenclatura Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco Heckel. ............................................................................................................................. 3 Figura 2: Mapa de distribuio dos acars-disco na Amaznia. As cores no mapa referem-se colorao dos discos (marrom, azul e verde), com exceo do vermelho, que se trata do disco heckel. O tringulo em preto representa a cidade de Manaus, Amazonas (Modificado de Bleher, 2006). ............................... 4 Captulo 1 Figura 1 Espcies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuies geogrficas na bacia Amaznica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S. haraldi; d) Mapa geogrfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a, Tef; b, Novo Airo; c, Manacapuru. ........................................................................ 32 Figura 2 Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas colorao convencional. (a-c) Leptteno/Zigteno. (d, e) Diplteno mostrando uma cadeia cromossmica em anel (cabea de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplteno com 30 bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese mostrando uma cadeia cromossmica linear (cabea de seta) e vrios bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separao precoce de elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metfase I revelando a orientao em zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabea de seta). (l) Metfase I com bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metfase II com n=30 cromossomos (barra: 10 m)..................................................................................... 36 Figura 3 Frequncia das frmulas meiticas nas clulas em diplteno e diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrandoxvi

a barra de desvio padro e nmeros variveis de bivalentes, elementos formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma terminalizao precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia cromossmica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossmica com 19 elementos; C XVIII = cadeia cromossmica com 18 elementos; C XVII = cadeia cromossmica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossmica com 16 elementos; C XV = cadeia cromossmica com 15 elementos; U = univalentes. ........................................................................................................................................ 37 Figura 4 - Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) aps bandamento C (a-c) e impregnao por on Prata. (a-b) Diplteno mostrando blocos heterocromticos (cabea de seta) nos elementos cromossmicos formadores da cadeia e em quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplteno com banda C positiva (seta) na maioria dos bivalentes. (d-f) Ncleos interfsicos, revelando cinco, seis e quatro nuclolos (cabea de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeas de seta) em um elemento da cadeia cromossmica e em um bivalente de tamanho mediano (seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno (barra: 10 m)............................................................................................................... 38 Figura 5 - Representao esquemtica da possvel origem da cadeia cromossmica das clulas meiticas de Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi (n representa os outros pares cromossmicos envolvidos na meiose mltipla). (a) Translocaes simples e heterozigotas envolvendo pequenos segmentos de alguns pares cromossmicos. (b) Elementos cromossmicos derivados de translocaes. (c) Configurao meitica da cadeia cromossmica, causada por translocaes mltiplas e seriadas. ....................... 39 Captulo 2 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers Rex3 (a) e DNAr 5S (b) para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi). ......................................................... 53

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Figura 2 Caritipos de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b) e S. haraldi (c) submetidos a bandeamento C (barra de escala: 10 m). .................. 54 Figura 3 Localizao fsica cromossmica do retrotransposon Rex3 (stios amarelos) nos caritipos e clulas meiticas testiculares de Symphysodon aequifasciatus (a, d, e), S. discus (b, f) e S. haraldi (c, g). a-c) Caritipos. d) Metfase espermatogonial revelando marcaes pericentromricas de Rex3 em todos os cromossomos (seta); e-g) Diplteno revelando sequncias de Rex3 na cadeia cromossmica (seta) e em bivalentes (cabea de seta) (barra 10 m)............................................................................................................................ 56 Figura 4 Localizao fsica cromossmica do DNAr 5S (srios amarelos) nos caritipos e clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. discus (b, e) e S. haraldi (c, f). a-c) Caritipos. d-f) Diplteno revelando stios de DNAr 5S em bivalentes (seta). g) Metfase de Symphysodon aequifasciatus mostrando as sequncias de Rex3 (stios rseos) flanqueando os genes RNAr 5S (stios verdes). O mesmo padro foi encontrado em S. discus e S. haraldi (barra: 10 m). ............................................................................ 58 Figura 5 Idiograma comparativo de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b), S. haraldi (c); em preto a heterocromatina centromrica/pericentromrica com tnues marcaes fluorescentes de Rex3, claramente visualizada na maioria dos cromossomos; em amarelo, marcaes conspcuas mais acentuadas de Rex 3; em vermelho, os genes RNAr 5S colocalizados com heterocromatina; em rosa, sequncias desconhecidas de heterocromatina. .......................................................................................................... 63 Captulo 3 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers DNAr 18S para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi).................................................................................................. 73

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Figura 2 Caritipos em colorao convencional (a, b, c) e regies organizadoras de nuclolo reveladas por impregnao com nitrato de Prata, indicando todos os pares envolvidos (d, e, f) nas espcies Symphysodon aequifasciatus (a, d), Symphysodon discus (b, e) and Symphysodon haraldi (c, f). Somente um dos homlogos est representado porque todas as combinaes de Ag-RON envolvendo estes pares cromossmicos foram encontradas (barra = 10 m). .................................................................................... 75 Figura 3 Padres de distribuio dos stios de DNAr 18S (sinais amarelos) em cromossomos mitticos de Symphysodon aequifasciatus (a-c); S. discus (dg); S. haraldi (h-k). Caritipos (a, d, h) e em destaque (b, c, e, f, g, i, j, k) os padres variantes dos stios ribossomais DNAr 18S para cada espcie (barra = 10 m)............................................................................................................................ 77 Captulo 4 Figura 1: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. aequifasciatus impregnada com nitrato de Prata, em microscopia ptica. a) Clula paquitnica tardia; b) seu esquema evidenciando a cadeia cromossmica multivalente (seta e esquema em vermelho), 16 bivalentes em emparelhamento completo (esquema em azul), 1 bivalente com assinapse na regio terminal (cabea de seta e esquema em roxo) e bivalentes em associao centromrica temporria (estrela e esquema em verde); c) Diplteno incompleto, evidenciando quiasmas na cadeia cromossmica em anel (seta). Note que apesar do complexo sinaptonmico estar se desintegrando, os elementos laterais tambm podem ser evidenciados em algumas pores (cabea de seta). Para S. haraldi as mesmas configuraes meiticas foram encontradas (barra: 10 m). ......................................................... 88 Figura 2: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. haraldi impregnada com nitrato de Prata, em microscopia eletrnica de transmisso. a) Paquteno (1000x de aumento) com nmero de bivalentes e elementos formadores da cadeia cromossmica no determinado. Os cinetocoros (cabea de seta) e regies eletrodensas, provavelmente regies de ancoragem na membrana nuclear (seta), preservados em bivalentes tpicos, com complexo

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sinaptonmico distribudo ao longo de todo o comprimento. A regio nucleolar est evidenciada (nu). Note que ao longo de alguns elementos cromossmicos o complexo sinaptonmico apresenta colorao mais conspcua e podem estar indicando regies de heterocromatina diferenciada; b) Detalhe dos elementos laterais do complexo sinaptonmico e ndulos de recombinao (seta) ao longo da cadeia cromossmica (5750 x de aumento). Para S. aequifasciatus as mesmas configuraes meiticas foram encontradas. ......................................... 89

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Lista de tabelas

Introduo Tabela 1- Variao cariotpica descrita para as espcies de Symphysodon. ..... 6

Artigo 2 Tabela 1 Padro de disperso cromossmica dos elementos Rex3 em diferentes espcies de peixes. ......................................................................... 62 Tabela 2: Parmetros fsico-qumicos medidos nos hbitats dos acars-disco, a 1,5m de profundidade (Bleher, 2006). .............................................................. 62 Artigo 3 Tabela 1 Pares cromossmicos de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi mostrando os diferentes padres (coluna) de distribuio do DNAr 18S (A, B homlogos) e a frequncia de cada padro por espcie. ............. 78

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Lista de abreviaturas 2n Ag-RON AoRex3 Banda C BLAST Nmero diploide Regio organizadora de nuclolo argenteoflica Retroelemento da famlia Rex3 isolado de Astronotus ocellatus Tcnica de deteco da heterocromatina constitutiva Ferramenta de busca e alinhamento de sequncias (basic local

alignment research tool) C CS DNA dNTP EDTA FISH FITC II mi m-sm n NCBI NTS PBD PCR DNAr pb Cadeia cromossmica meitica Complexo sinaptonmico cido desoxirribonuclico Desoxirribonucleotdeo cido etilenodiaminotetractico Hibridizao fluorescente in situ Fluoresceina isotiocianato (fluorescein isothiocyanate) Bivalente Microcromossomo Cromossomo meta-submetacntrico Nmero haplide National Centre for Biotechnology Information Espaador no transcrito (non-transcribed spacer) Tampo fosfato dextrano (phosphate-buffered dextran) Reao em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction) DNA ribossomal Pares de bases

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Rex RNA RNAr RON SDS SSC st-a Tampo C U

Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus cido ribonuclico RNA ribossomal Regio organizadora de nuclolo Dodecil sulfato de sdio Soluo salina de citrato padro Cromossomo subtelo-acrocntrico Tampo de acoplamento (coupling) Univalente

xxiii

I. Introduo Geral I.1 Consideraes sobre os acars-disco A bacia amaznica considerada a maior bacia hidrogrfica do mundo e abriga uma das maiores ictiofaunas continentais, sendo estimada a presena de aproximadamente 3.000 espcies de peixes, dentre as quais muitas so comercializadas como peixes ornamentais (Chao, 1993; Santos & Ferreira, 1999; Chao, 2001). Um dos peixes de maior destaque na aquariofilia o acar-disco, facilmente reconhecido por sua forma discide e por seu corpo comprimido lateralmente, que apresenta um padro de barras verticais distribudas ao longo do mesmo, sendo estes peixes endmicos da bacia amaznica (Axelrod, 1978; Silva & Kotlar, 1980; Kullander, 1996). Alm disso, os indivduos possuem apenas um orifcio nasal de cada lado do focinho, boca prottil, lbios grossos, raios anteriores das nadadeiras dorsal e anal e os primeiros raios da ventral transformados em espinhos e linha lateral interrompida, caractersticas morfolgicas peculiares da famlia Cichlidae qual pertence (Paxton & Eschmeyer, 1995). Os discos so peixes onvoros, que consomem preferencialmente perifiton, detritos orgnicos, material vegetal e invertebrados aquticos pequenos. Estes peixes habitam preferencialmente lagos, florestas alagadas e igaraps de guas calmas, repletos de galhos, troncos e razes submersas. Apresentam em mdia, na idade adulta, 20 cm de comprimento e no possuem dimorfismo sexual evidente. Na natureza podem viver por aproximadamente trs anos e alcanam a maturidade reprodutiva em um ano. Os discos so monogmicos e despendem grande cuidado parental com ovos e alevinos, sendo estes alimentados por uma secreo mucosa da pele dos pais. Alm disso, so os nicos cicldeos neotropicais que formam agregaes sociais de mais de cem (100) indivduos durante os perodos de guas baixas, o que pode amenizar a predao, porm facilita o aumento da transmisso de doenas e parasitas (Ferreira et al., 1998; Bleher, 2006; Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007; Crampton, 2008).1

Os acars-discos pertencem ao gnero Symphysodon (Cichlidae, Perciformes), porm divergncias quanto taxonomia so comuns para este grupo. Este txon j foi considerado monoespecfico com subespcies, diespecfico com subespcies e atualmente compreende trs espcies, mas no existe consenso com relao nomenclatura dos grupos Figura 1 (Silva & Kotlar, 1980; Burgess, 1991; Mazerolli & Weiss, 1995; Kullander, 1996; 2003; Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Ready et al. (2006) propuseram S. discus para os indivduos conhecidos como Heckel na aquariofilia, S. aequifasciatus para os discos com colorao azul ou marrom e S. tarzoo para os indivduos verdes e provenientes da regio oeste da Amaznia. Em contrapartida, Bleher et al. (2007) propuseram que os indivduos verdes com pontos avermelhados pelo corpo, os quais so encontrados a oeste do arco do Purus, sejam chamados de S. aequifasciatus; os azuis e marrons, distribudos da foz do Amazonas at o baixo rio Ia, de S. haraldi; e os discos Heckel, encontrados nos rios Negro e Abacaxis, continuam sendo denominados de S. discus (Figura 1). Apesar da nomenclatura divergente, a distino entre as trs espcies sempre se baseia na colorao, no padro de barras verticais e pontos vermelhos ao longo do corpo, na distruio geogrfica (Figura 2) e em estudos moleculares envolvendo sequncias de DNA mitocondrial e nucleares (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Na aquariofilia, cruzamentos entre diferentes espcies/coloraes so utilizados para obteno de diferentes padres de tonalidades, cores, padro de listras e manchas ao longo do corpo. Estes indivduos hbridos alcanam valores exorbitantes na aquariofilia e, quando possvel, alguns continuam sendo utilizados como matrizes para a obteno de novos variantes (Bleher, 2006). Contudo, a reproduo dos acars-disco em cativeiro obtida com base em tentativas-erros, no considerando informaes genticas como ferramentas para seleo dos indivduos.

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Bleher et al., 2007

S. haraldi

S. aequifasciatus

Heckel S. discus

Azul

Marrom

Verde

S. aequifasciatus

S. tarzoo

Ready et al., 2006

Figura 1: Classificaes taxonmicas atualmente propostas para o gnero Symphysodon. Note que a nica espcie onde existe consenso na nomenclatura Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco Heckel.3

Figura 2: Mapa de distribuio dos acars-disco na Amaznia. As cores no mapa referem-se colorao dos discos (marrom, azul e verde), com exceo do vermelho, que se trata do disco heckel. O tringulo em preto representa a cidade de Manaus, Amazonas (Modificado de Bleher, 2006).

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I.2 Aspectos citogenticos dos acars-disco Alm de serem bastante apreciadas por aquaristas, as espcies do gnero Symphysodon tambm despertam o interesse de citogeneticistas, uma vez que as mesmas apresentam nmero diploide igual a 60 cromossomos (maior nmero diploide j encontrado para a famlia Cichlidae), sendo a maioria deles do tipo meta-submetacntricos. Estas caractersticas corroboram a posio derivada de Symphysodon nas rvores filogenticas propostas at o momento (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008). So consideradas caractersticas citogenticas basais para Cichlidae, e tambm para a ordem Perciformes, a presena de 2n=48 cromossomos acrocntricos, regies organizadoras de nuclolo (RON) simples e presentes nos maiores pares cromossmicos e blocos de heterocromatina (banda C) evidenciados na regio pericentromrica de todos os cromossomos (Thompson, 1979; Kornfield, 1984; Feldberg & Bertollo, 1985; Brum & Galetti Jr., 1997; Feldberg et al., 2003). Diferentes frmulas cariotpicas j foram descritas para as espcies de Symphysodon (tabela 1), sendo grande parte desta variabilidade cromossmica intraespecfica creditada a divergncias na conceituais em relao a microcromossomos, subjetividade medida cromossmica, padres

diferenciados de condensao de cromossomos e braos cromossmicos com constries secundrias que no se coravam com Giemsa em algumas metfases mitticas (Gross, 2006). Quanto s regies organizadoras de nuclolo, variao intra e interespecfica encontrada em Symphysodon. Nascimento (2005) descreveu que S. haraldi (originalmente descrita na publicao como S. aequifasciatus, considerando nomenclatura vigente da poca) do igarap Croata (PA) apresentava RON simples, mas no mostrou quais eram os pares portadores desta regio. Regies organizadoras de nuclolo mltiplas foram evidenciadas em S. haraldi (pares 3, 5, 10, 11, 21 e 22) do rio Manacapuru (AM), S. discus (pares 18 e 24) da regio de Barcelos (AM) e S. aequifasciatus (pares 5, 10, 11, 15, 21, 22) do lago Bauna, proximidades de Tef (Amazonas) (Mesquita et al., 2008).5

Tabela 1- Variao cariotpica descrita para as espcies de Symphysodon. Espcies S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus1 S. discus S. discus S. haraldi 2 S. haraldi Frmula cariotpica 48m-sm + 8st-a + 4mi 50m-sm + 6st-a + 4mi 44m-sm + 16st-a 58m-sm + 2st-a 52m-sm + 8st-a 54m-sm + 6st-a 50m-sm + 10st-a 56m-sm + 4st-a 52m-sm + 4st-a + 4mi Local de coleta Tef, Amazonas, Brasil Tef, Amazonas, Brasil ------Aquarista Aquarista Barcelos, Amazonas, Brasil Barcelos, Amazonas, Brasil Igarap Croata, Par, Brasil Manacapuru, Amazonas, Brasil Referncia Mesquita et al. (2008) Mesquita et al. (2008) Ohno & Atkin (1966) Thompson (1979) Takai et al. (2002) Mesquita et al. (2008) Mesquita et al. (2008) Nascimento (2005) Mesquita et al. (2008)

Abreviaturas: a, acrocntrico; m, metacntrico; mi, microcromossomo; sm, submetacntrico; st, subtelocntrico. Classificao das espcies de acordo com Bleher et al. (2007). 1Espcie descrita originalmente como Symphysodon aequifasciata axelrodi; 2espcie descrita originalmente como S. aequifasciatus.

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Com relao heterocromatina, esta sempre foi observada na regio pericentromrica de quase todos os cromossomos mitticos das trs espcies de Symphysodon, alm de blocos heterocromticos nas regies proximais de ambos os braos, ou mesmo ocupando braos cromossmicos inteiros, e muitas vezes intercalando as RONs, o que sugere um processo de heterocromatinizao e/ou acmulo de heterocromatina gradual no gnero (Takai et al., 2002; Nascimento, 2005; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008). Numa anlise meitica efetuada nas espcies Symphysodon discus e Symphysodon haraldi (originalmente descrita na publicao como S. aequifasciatus, devido nomenclatura vigente), Gross (2006) encontrou durante a prfase I, a existncia de uma cadeia cromossmica multivalente apenas em S. haraldi, enquanto S. discus no apresentou a cadeia cromossmica, estando seus cromossomos organizados em 30 bivalentes. Cadeia cromossmica, tal como a observada nas clulas profsicas I de S. haraldi, um fato inusitado para peixes, principalmente os neotropicais, sendo descrita apenas em algumas espcies de plantas, de invertebrados, como Heteropternis obscurella e de outros vertebrados, como anuros e ornitorrincos. Vrias explicaes tem sido propostas para esclarecer a origem desta configurao meitica multivalente, de acordo com o observado para cada organismo. Em gafanhotos Heteropternis obscurella parece ocorrer uma associao terminal de cromossomos no homlogos na meiose I por meio de interaes entre grandes regies terminais banda-C positivas (John & King, 1982). No mamfero ornitorrinco as cadeias cromossmicas foram evidenciadas apenas em machos, sendo formadas, provavelmente, por meio de rearranjos entre cromossomos sexuais ancestrais e autossomos (Carrel, 2004). J nos anuros Physalaemus petersi e Eleutherodactylus binotatus, a configurao multivalente observada durante a meiose I foi resultante de heterozigosidade para mltiplas translocaes recprocas (Loureno et al., 2000; Siqueira-Jr et al., 2004). A origem da cadeia cromossmica meitica de S. haraldi no foi totalmente elucidada, requerendo uma anlise de mais as detalhada espcies do de comportamento cromossmico meitico todas

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Symphysodon, incluindo S. aequifasciatus cujos dados meiticos ainda no foram descritos. I.3 Meiose e complexo sinaptonmico em peixes neotropicais Anlises meiticas mais refinadas, como a anlise do complexo sinaptonmico, tambm podem ajudar a compreender a diversidade dos organismos. O complexo sinaptonmico uma estrutura especializada e responsvel pela sinapse ou emparelhamento dos cromossomos homlogos durante a meiose, e ocorre na maioria dos organismos diploides durante o processo de formao dos gametas. Esta estrutura auxilia na compreenso dos eventos evolutivos que ocorreram na especiao dos txons, como identificao de nveis de ploidia observados pela formao de bivalente, trivalente, tetravalente, etc.; fuses cntricas e translocaes com a formao de figuras meiticas mltiplas; inverses e duplicaes com a visualizao de alas de inverso nas fases mais iniciais da prfase I (Moses et al., 1982; Zhang et al., 1992; Siqueira Jr et al., 2004). Em peixes neotropicais, o complexo sinaptonmico tem sido utilizado na anlise de cromossomos sexuais, do comportamento de cromossomos supranumerrios na meiose e na piscicultura, para se verificar os efeitos meiticos da formao de hbridos. Os primeiros resultados utilizando esta tcnica foram os de Dias (1995) e Dias et al. (1998), que analisando Astyanax scabripinnis e Prochilodus lineatus (ambos Characiformes), constataram que o nico cromossomo supranumerrio de Astyanax scabripinnis comportava-se como um univalente na meiose, enquanto os supranumerrios (zero a sete cromossomos) de Prochilodus lineatus associavam-se como bivalentes, trivalentes e tetravalentes, evidenciando uma possvel homologia entre eles. Para compreender o comportamento cromossmico de Hoplias malabaricus, que apresenta sistema sexual mltiplo (2n=36+X1X1X2X2 em fmeas e 2n=36+X1X2Y em machos), Bertollo & Mestriner (1998) analisaram a meiose e o complexo sinaptonmico dessa espcie. Por meio destas anlises, confirmou-se que nos machos os autossomos emparelhavam-se perfeitamente e que os cromossomos sexuais formavam um trivalente na meiose I e tinham uma segregao regular na anfase I e anfase II.8

O comportamento de cromossomos supranumerrios em meiose tambm foi estudado por Portela-Castro et al. (2001). Estes autores encontraram de um a dois supranumerrios em clulas somticas de machos de Moenkhausia sanctaefilomenae (Characidae), os quais nunca foram observados nas fmeas. Ao analisar o complexo sinaptonmico, verificou-se que durante a prfase I estes cromossomos apresentavam-se, na maioria das vezes, como pequenos bivalentes, o que poderia favorecer a sua transmisso e manuteno durante a evoluo cromossmica da espcie. Alm disso, a anlise do complexo sinaptonmico apresentou-se como uma boa ferramenta na piscicultura neotropical. Santos et al. (2002) utilizaram esta tcnica para demonstrar que o peixe tambacu, hbrido artificial de pacu (Piaractus mesopotamicus - macho) com tambaqui (Colossoma macropomum fmea) (Characiformes), possui uma meiose atpica, o que garante que a produo artificial destes hbridos no ocasione um processo de introgresso em relao s espcies parentais, no havendo assim o risco de extino dessas espcies. I.4 Citogentica molecular A anlise dos cromossomos mitticos e meiticos, condensados ou distendidos fundamental para a avaliao da diversidade gentica e evoluo cariotpica de um grupo, porm alguns rearranjos podem passar despercebidos quando empregadas apenas tcnicas clssicas. Para sanar este problema, a citogentica molecular surgiu para complementar os estudos por meio da identificao de sequncias de DNA especficas no cromossomo, consistindo basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA com uma seqncia de nucleotdeos complementar, situado na clula alvo (Artoni et al., 2000; Guerra, 2004). Na citogentica de peixes, a hibridizao fluorescente in situ (FISH) tem se revelado como importante ferramenta por permitir novas interpretaes da diversidade cariotpica, em particular sobre a origem de cromossomos sexuais e de supranumerrios, bem como sobre a organizao genmica de segmentos cromossmicos (Galetti Jr. & Martins, 2004).9

Com relao organizao genmica, tem sido constatado que genes de cpia nica ou de poucas cpias correspondem a uma pequena parte do genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado s regies repetitivas (Horvath et al., 2001). Eucariotos tem dois tipos de DNA altamente repetitivos: sequncias de DNA repetitivo dispersas e sequncias de DNA repetidas em tandem. As sequncias de DNA repetidas em tandem incluem os DNAs satlites e os DNAs ribossomais, enquanto as sequncias repetitivas dispersas englobam os elementos transponveis (Phillips & Reed, 1996; Martins, 2007). Estudos recentes em peixes neotropicais, como em Leporinus spp., Pimelodus spp., Serrasalmus spp., Triportheus spp. entre outros, tem utilizado a tcnica da hibridizao fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNA ribossmico 18S para compreender a organizao das regies organizadoras de nuclolo (Martins & Galetti Jr., 1999; Garcia & Moreira-Filho, 2008; Nakayama et al., 2008; Diniz et al., 2009). Este mtodo considerado mais sensvel que a impregnao por nitrato de Prata e que a Cromomicina A3 porque localiza as sequncias de DNA ribossmico nos cromossomos, ao invs de marcar as protenas nucleolares envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais como ocorre com a impregnao com nitrato de Prata (Miller et al., 1976; Pends et al., 1993a,b; Phillips & Reed, 1996). Anlise da localizao fsica cromossmica do DNAr 5S tambm tem sido utilizada em estudos evolutivos de peixes (Martins & Galetti Jr., 1999; 2000; Martins, 2007). Outra classe importante de elementos repetitivos so os elementos transponveis, que so sequncias capazes de se integrar em novas localizaes do genoma e mobilizar sequncias no-autnomas, sendo que todos os tipos conhecidos destes elementos so encontrados nos genomas dos peixes (Volff et al., 2003; Ozouf-Costaz et al., 2004). Apesar de existirem poucos estudos, envolvendo a distribuio de elementos transponveis em caritipos de peixes neotropicais at o momento, a utilizao destas sequncias no mapeamento fsico cromossmico pode proporcionar maior esclarecimento acerca do genoma das espcies, de como este genoma est organizado e como ocorreu a sua evoluo. Alm disso, este conjunto de10

informaes pode ser empregado em estudos de gentica aplicada (Martins, 2007). Anlises citogenticas sequenciais j efetuadas em Symphysodon (colorao convencional com Giemsa, bandamento C e impregnao com nitrato de Prata), tanto para cromossomos mitticos quanto meiticos, vm mostrando uma grande variabilidade intra e interespecfica tanto em relao estrutura cromossmica como em relao aos marcadores RONs e banda C (Mesquita, 2002; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008). Alm disso, a ocorrncia de uma cadeia cromossmica em clulas meiticas tem se mostrado uma caracterstica mpar entre os peixes neotropicais (Gross, 2006). Desse modo, o emprego de tcnicas de citogentica molecular como FISH, utilizando sondas de DNA ribossmico 5S e 18S e elementos retrotransponveis Rex3, so teis para auxiliar na compreenso da complexa organizao dos cromossomos nas espcies de Symphysodon. Alm disso, anlises meiticas, principalmente envolvendo complexo sinaptonmico, podem trazer informaes adicionais sobre os eventos que propiciaram a formao desta cadeia e como os cromossomos esto se emparelhando durante a meiose.

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I.5 Objetivos I.5.1 Geral Analisar os cromossomos mitticos e compreender o comportamento cromossmico meitico em populaes selvagens de Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus e Symphysodon haraldi, procurando verificar a existncia de diferenas citogenticas entre os indivduos das coloraes selvagens, ou seja, disco verde, disco azul/marrom e disco heckel, encontrados na bacia amaznica e inferir sobre eventos que propiciaram a formao da cadeia cromossmica.

I.5.2 Especficos a) Determinar o caritipo dos acars-disco selvagens, de coloraes verde, azul/marrom e heckel, para verificar se existem diferenas citogenticas entre eles. b) Caracterizar o comportamento dos cromossomos nos diversos estgios da meiose de machos e fmeas destas espcies, para cada padro de colorao. c) Estabelecer o padro de distribuio da heterocromatina constitutiva e das regies organizadoras de nuclolo (com a impregnao por Prata e FISH) nos cromossomos mitticos e meiticos. d) Analisar o complexo sinaptonmico dos cromossomos formadores da cadeia cromossmica.

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II. Material e mtodos II.1 Material Foram estudados, citogeneticamente, 22 exemplares de acars-disco verde coletados (Symphysodon aequifasciatus - 14 machos e oito fmeas), 37 discos heckel (S. discus- 15 machos e 22 fmeas) e 49 marrom/azuis d(S. haraldi - 21 machos e 28 fmeas), adotando o mais recente esquema de classificao proposto por Bleher et al. (2007). Os indivduos foram coletados no estado do Amazonas, nas proximidades de Tef, Novo Airo e Manacapuru, respectivamente. Estes peixes foram mantidos vivos no Laboratrio de Gentica Animal do Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia INPA, Coordenao de Pesquisas em Biologia Aqutica, onde foram realizadas as anlises. Para a obteno de preparaes cromossmicas foi extrado o rgo hematopoitico de todos os indivduos e as gnadas dos machos e fmeas imaturas, sendo estes exemplares numerados, registrados, fixados em formol 10% durante 24h e acondicionados posteriormente em recipientes contendo lcool 70%. Dez espcimes de cada espcie foram depositados na coleo de peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA 28584) e os outros indivduos esto depositados na coleo de peixes do Laboratrio de Gentica Animal do INPA. Todo este estudo foi efetuado com permisso do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renovveis, licena 011/2005 e licena permanente de Eliana Feldberg).

II.2 Mtodos II.2.1 Induo de mitoses Para se obter um maior nmero de clulas em metfase foi utilizada a tcnica para induo de mitoses descrita por Molina (2001), na qual o composto farmaceutico Munolan (Allergan Frumtost) foi dissolvido em gua (1 comprimido por mL de gua destilada), sendo esta soluo posteriormente injetada intraperitonialmente na regio dorso-lateral do peixe, na proporo de13

1mL para cada 100g de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento foram colocados em aqurios bem aerados por 24 horas.

II.2.2 Obteno de cromossomos mitticos Para a obteno das preparaes cromossmicas mitticas foi utilizada a poro anterior e/ou posterior do rim, que o rgo hematopoitico dos peixes, segundo a tcnica alternativa para peixes descrita por Moreira-Filho & Bertollo (1990). Os acars-disco foram anestesiados em gua contendo gelo e sacrificados em seguida. O rim foi retirado e lavado em pequenos recipientes de vidro contendo soluo hipotnica de KCl a 0,075M, sendo transferido imediatamente para outro recipiente de vidro com cerca de 10mL da soluo hipotnica, onde foi dissociado com pinas de disseco e seringa desprovida de agulha, que serviu para aspirar e expirar suavemente a suspenso para dissociao do tecido renal e consequente separao das celulas. Uma soluo aquosa de colchicina a 0,0125% foi adicionada in vitro, na proporo de 0,5mL para 15mL de KCl. A suspenso celular obtida foi mantida em estufa a 37 C por 30 minutos. Aps este tempo, o material foi ressuspendido cuidadosamente com o auxlio de uma seringa sem agulha e transferido para um tubo de centrfuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. O fixador Carnoy foi preparado na proporo 3:1 (metanol: cido actico) e 0,3mL foram adicionados suspenso celular, que foi centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm, sendo posteriormente descartado o sobrenadante. Novamente o material foi ressuspendido com o auxlio de uma pipeta Pasteur, 8mL de fixador Carnoy foram adicionados e a suspenso foi novamente centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm, sendo este procedimento repetido por mais duas vezes. Aps a ltima centrifugao e a eliminao do sobrenadante, 1,5mL de fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. Essa suspenso celular foi estocada em tubo de 1,5 ml e mantida em freezer para posterior utilizao.

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II.2.3 Preparao das lminas com cromossomos mitticos Para a preparao das lminas com cromossomos mitticos, as mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente imersas em gua destilada a 50 C, em banho-maria. Aps cinco minutos, as lminas foram retiradas da gua de forma a manter uma pelcula de gua sobre a sua superfcie, na qual foi gotejada a suspenso celular em diferentes regies. II.2.4 Obteno de cromossomos meiticos Para a obteno das preparaes cromossmicas meiticas foram utilizadas gnadas masculinas e femininas (imaturas), empregando-se a tcnica descrita por Bertollo et al. (1978), com algumas modificaes propostas por Gross (2006). Para caracterizao das diferentes fases meiticas, as gnadas no foram tratadas com soluo de colchicina. Aps o sacrifcio do peixe, os testculos e ovrios imaturos foram seccionados em fragmentos bem pequenos e colocados em soluo hipotnica de KCl a 0,075M por 30 minutos. Logo aps, o material foi transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy (3 partes de metanol: 1 parte de cido actico) recm-preparado, por 20 minutos. Aps este perodo, o fixador foi descartado, sendo este processo de fixao repetido por mais duas vezes. Em seguida, o material foi guardado em refrigerador a 4 C, em tubos de 1,5 ml com fixador Carnoy para ser processado posteriormente, ou ento fragmentos foram retirados do fixador e secos em papel de filtro para a continuao da tcnica. Aps o fragmento gonadal estar seco, este foi colocado sobre uma lmina limpa e macerado em 1mL de cido actico 50%, com o auxlio de um basto de vidro. O material foi seco sobre a lmina em uma placa aquecedora a 40 C, sendo posteriormente corado com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 10 minutos e lavado em gua de torneira e a lmina seca diretamente ao ar.

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II.2.5

Deteco

das

regies

organizadoras

de

nuclolos

nos

cromossomos mitticos e meiticos Para a caracterizao das regies organizadoras de nuclolos (RON) foi utilizada a tcnica descrita por Howell & Black (1980), que consistiu em pingar sobre a preparao cromossmica 1mL de uma soluo coloidal, obtida com 1g de gelatina comercial sem sabor dissolvida em 50mL de gua destilada e acrescida de 0,5mL de cido frmico. Em seguida, foram adicionados sobre a soluo coloidal 2mL de soluo aquosa de AgNO3 (nitrato de Prata) a 50%, agitando levemente a lmina, que foi coberta com uma lamnula. A lmina foi colocada em cmara mida, em banho-maria a 60 C, por um perodo varivel de 3 a 8 minutos, at atingir uma colorao marrom dourada, sendo ento lavada em gua destilada, permitindo que a lamnula fosse retirada naturalmente pela prpria gua. As lminas secaram diretamente ao ar, sendo posteriormente coradas com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 1 minuto, lavadas em gua de torneira e secas novamente ao ar. II.2.6 Deteco da heterocromatina constitutiva nos cromossomos mitticos e meiticos Para a caracterizao da heterocromatina constitutiva foi utilizada a tcnica de banda C descrita por Sumner (1972), com algumas modificaes. As lminas contendo as preparaes cromossmicas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 46 C, lavadas em gua destilada temperatura ambiente e secas ao ar. Em seguida, as preparaes cromossmicas mitticas foram incubadas a 46 C, em soluo de hidrxido de brio a 5%, filtrada e recm preparada, por 1minuto e 30 seguntos e as meiticas por 4 minutos e 30 segundos. A ao do hidrxido de brio foi interrompida imergindo-se rapidamente a lmina em soluo de HCl 0,2N (46 C), sendo posteriormente lavada em gua destilada. Aps secas, as lminas foram incubadas em soluo 2xSSC (cloreto de sdio 0,3M e citrato trisdico 0,03M, pH 6,8), em banho-maria a 60 C, por um perodo de 15 minutos, sendo posteriormente secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 20 minutos, lavadas em gua de torneira e secas novamente ao ar.16

II.2.7 Hibridizao fluorescente in situ (FISH)

Para a hibridizao fluorescente in situ foi utilizada a tcnica descrita por Pinkel et al. (1986), com algumas modificaes. II.2.7.1. Extrao do DNA Para extrao do DNA foi utilizado tecido muscular de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo o protocolo de Sambrook & Russell (2001), com algumas modificaes. Para tanto, foi utilizado o tampo de lise (Tris-HCl 10 mM em pH 8,0 , NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente foram acrescentados: 15 L de proteinase K (10 mg/mL) e 6 L de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente digerido. A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol e clorofrmio, lcool isoamlico e clorofrmio hidratado (500 L de cada um destes reagentes). Aps a lise, o DNA foi separado das protenas por precipitao salina juntamente com centrifugao a 14.000 rpm. A fase aquosa (sobrenadante) que contm o DNA foi separada em um novo tubo e o DNA precipitado com volume de isopropanol 100% igual ao volume da fase aquosa obtida. Em seguida a amostra foi submetida a centrifugao, o sobrenadante descartado e o tubo contendo pellet de DNA colocado para secar. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 L de gua milli-Q, dependendo da quantidade do pellet de DNA formado. Para possibilitar a anlise da quantidade e integridade do material, o DNA extrado foi quantificado por comparao com marcador de concentrao conhecida, em eletroforese padro (com tampo Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 1,5% e corado com Sybr Safe (1:10.000). A visualizao e anlise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

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II.2.7.2. Obteno das sondas via PCR e marcao por kit nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) Para a obteno das sondas do elemento retrotransponvel Rex 3 e de DNAr 5S e DNAr 18S foi utilizado o DNA genmico extrado do msculo de Symphysodon spp. A sondas foram obtidas por amplificao por Reao em Cadeia da Polimerase (PCR - Saiki et al., 1988) utilizando os primers: - Rex3 (RTX3-F3 5` CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG e RTX3-R3 5` TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al., 1999; 2001); DNAr DNAr 5S 18S (A 5-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 (IpF 5CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e e B 5IpR CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3) (Komiya & Takemura, 1979); 5CCGAGGACCTCACTAAACCA) desenhados a partir da sequncia completa do gene RNAr 18S de Ictalurus punctatus disponvel nos bancos de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (cdigo identificador da sequncia AF021880). Os ciclos de amplificao seguiram as seguintes etapas: a) Rex3: 2 minutos a 95 C (desnaturao); 35 ciclos de um minuto a 95 C, 40 segundos a 55 C, 2 minutos a 72 C (amplificao); 5 minutos a 72 C (extenso); b) 5S: 5 minutos a 94 C (desnaturao); 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 59 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 57 C e 45 segundos a 72 C; 25 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C (amplificao); 7 minutos a 72 C (extenso); c) 18S: 2 minutos a 94 C (desnaturao); 35 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 55 C, 1 minuto e 40 segundos a 72 C (amplificao); 7 minutos a 72 C (extenso). As reaes de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, para volume final de 25 L (1 L de DNA genmico; 2,5 L de Tampo 10X com cloreto de magnsio; 0,25 L de Taq DNA polimerase;

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1,5 L de dNTP (1 mM); 1,5 L de cada primer (5 mM); gua milli-Q para completar o volume). As sondas foram marcadas por biotina 14-dATP por nick translation, seguindo protocolo do fabricante (Bionick labeling system-Invitrogen). Para tanto, em um tubo de eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparado uma soluo contendo 1 L de Mix dNTP 10x; 1 L de sonda de DNA (200 ng/ L); 1 L de Mix de enzima 10x; 6 L de gua milli-Q, totalizando 9 L, para cada lmina a ser hibridizada. Esta soluo foi homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 C por 45 minutos no termociclador. Em seguida, para interromper a reao, foi adicionado 1 L de stop buffer contendo 1 L de acetato de sdio 3M. Para a precipitao da sonda marcada foram adicionados 22 L de etanol 100% gelado e deixado precipitar em freezer -70 C por duas horas. Decorrido este tempo, a sonda foi centrifugada por 15 minutos a 15.000 rpm a 4 C, o sobrenadante foi descartado com cuidado e o tubo contendo a sonda seco a temperatura ambiente. Aps seca, a sonda foi ressuspendida com 6 L de gua milli-Q. Adicionalmente, as sondas de Rex3 foram marcadas por nick translation usando digoxigenina (Roche) e usadas em hibridizaes duplas com o DNAr 5S, sendo os cromossomos contra-corados com DAPI.

II.2.7.3. Hibridizao cromossmica mittica e meitica II.2.7.3.1. Desnaturao dos cromossomos e tratamento com RNAse Lminas recm-preparadas com cromossomos foram desidratadas em lcool 70, 85 e 100% gelado, por cinco minutos cada. O DNA cromossmico das preparaes mitticas foi desnaturado por 10 segundos em formamida 70% (70 mL de formamida e 30 mL de 2xSSC), pH 7,0 a 67 C e o das preparaes meiticas por 15 segundos. Aps a desnaturao, as lminas foram novamente desidratadas em srie alcolica gelada (70, 80 e 100%, cinco minutos cada). Em seguida, as lminas foram lavadas em tampo PBS 1x (7,58 g de cloreto de sdio 1,36M; 0,993 de fosfato de sdio dibsico Na2HPO4; 0,414g de fosfato de sdio monobsico- NaH2PO4; completar para volume de 1000 mL com gua milli-Q) durante cinco minutos, em temperatura ambiente. Em seguida as19

lminas foram desidratadas em srie alcolica gelada (70, 80 e 100%, cinco minutos cada) e incubadas em 90g de RNase (3,2 L de Rnase 10 mg/mL e 796,8 L de 2xSSC), sob lamnula, a 37 C por 1 hora em cmara mida. Para interromper a degradao do RNA as lminas foram lavadas trs vezes por cinco minutos cada com 2xSSC (removendo as lamnulas antes da primeira lavagem) e uma vez em PBS 1x durante 5 minutos.

II.2.7.3.2. Desnaturao da sonda e hibridizao Para cada lmina a ser hibridizada foi adicionado, em um tubo eppendorf, 6 L da sonda, 15 L de formamida (concentrao final de 50%), 6 L de sulfato de dextrano 50% (concentrao final de 10%) e 3 L (1/10) de 20xSSC (concentrao final de 2xSSC), totalizando um volume de 30 L. A sonda foi desnaturada a 95 C por cinco minutos em termociclador e em seguida colocada imediatamente no gelo. A soluo de hibridizao foi colocada sobre uma lminula e a lmina desnaturada invertida foi colocada sobre a lamnula. Para a hibridizao as lminas permaneceram com o material voltado para baixo em cmara mida (2xSSC), a 37 C, por cerca de 12 horas. Decorrido este tempo, a lamnula foi removida e a lavagem ps-hibridizao ocorreu a 72 C em 2xSSC, pH 7,0 por 5 minutos. Em seguida as lminas foram imersas em tampo PBD, pH 7,0 (20 mL de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em p desnatado; gua destilada). Para a deteco das sondas foi aplicado em uma lamnula 4 L de FITC-Avidina conjugada 0,07% (Sigma) e 26 L de Tampo C (0,1M de bicarbonato de sdio pH 8,5 e 0,15M cloreto de sdio), sendo a lmina colocada invertida sobre a lamnula e incubada durante 30 minutos em cmara mida a 37 C. Aps isso a lamnula foi removida e as lminas lavadas trs vezes em tampo PBD a 45 C, por dois minutos cada. Em seguida, duas sries de amplificao de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em tampo PBD (1 l de antiavidina estoque em 19 l 1xPBD por lmina), sendo as lminas incubadas 10 minutos em cmara mida a 37 C. Cada tratamento com antiavidina-biotina conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampo C (4 L FITC-Avidina 0,07% e 26 L de Tampo C), com incubao por 10 minutos20

em cmara mida a 37 C. Depois de cada passo de amplificao, as lminas foram lavadas trs vezes em tampo 1xPBD a 45 C por 2 minutos cada. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de propdeo 0,2% diludo em antifade Vector (20 L de antifade e 0,7 L de iodeto de propdeo 50 g/mL) e cobertos com lamnula para proceder a anlise imediata. As anlises foram efetuadas em Microscpio Olympus Bx-51 e as metfases capturadas atravs do Programa Image PRO MC60. II.2.7.4. Caracterizao das sondas de DNA II.2.7.4.1. Construo de vetores plasmidiais recombinantes contendo fragmentos de DNA obtidos por PCR A construo de vetores plasmidiais recombinatnes contendo

fragmentos de DNA (produtos de PCR) foi realizada para a caracterizao destes segmentos de DNA, no Laboratrio Temtico de Biologia MolecularINPA. O kit de ligao pGEM-T Easy Vector System I (Promega) foi utilizado para ligao dos fragmentos de interesse ao plasmdeo pGEM-T, seguindo as especificaes do fabricante. Para tanto, para cada amostra foi adicionado em um eppendorf de 1,5 mL: 1,5 L de gua milli-Q, 5 L de Tampo, 1 L de plasmdeo, 1,5 L de produto de amplificao, 1 L de T4 DNA ligase, sendo esta soluo incubada a 4 C overnight (cerca de 12 horas).

II.2.7.4.2. Transformao As construes recombinantes obtidas foram utilizadas para a transformao de clulas competentes de Escherichia coli DH5 (cedidas pelo Dr. Spartaco Astolfi Filho - UFAM). As clulas competentes foram retiradas do freezer -70 oC e colocadas em recipiente com gelo mantido dentro do fluxo laminar para descongelar. Em um tubo de 1,5 ml contendo 50 L de bactrias competentes foram adicionados 5 L de plasmdios recombinantes, seguido de leve agitao. A mistura foi deixada no gelo por 30 minutos. Transcorrido este tempo, a amostra de transformao foi colocada em banho-maria a 37 C por um minuto e, em21

seguida, voltou ao gelo por dois minutos o que possibilitou o choque trmico e permitiu que os poros da membrana se abrissem mais e internalizassem o DNA plasmidial. Posteriormente foram adicionados e misturados com muito cuidado 950 L de meio lquido LB (peptona 1%; cloreto de sdio 0,17M; extrato de levedura 0,5%, pH 7,5), sendo a mistura incubada em um agitador (shaker) 225 rpm por uma hora para que as bactrias comeassem a recuperar a parede celular. Faltando 15 minutos para acabar a incubao, as placas com meio LB slido (peptona 1%; cloreto de sdio 0,17M; extrato de levedura 0,5%, gar 1,5%, pH 7,5) contendo 2 L de amplicilina foram retiradas da geladeira e foi adicionado 35 L de X-Gal, deixando-as semi-abertas. Ao trmino da incubao os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante foi descartado por inverso do tubo. O meio de cultura lquido restante no tubo foi utilizado ressuspender com cuidado as bactrias recombinantes que foram posteriormente adicionadas placa e espalhadas com ala de vidro flambada e frio. Aps secas, as placas foram incubadas viradas para baixo em uma estufa a 37 C overnight (cerca de 12 horas), at haver o crescimento das colnias. As colnias recombinantes apresentaram colorao branca e foram selecionadas. Cada colnia foi retirada com uma ponteira e colocada em uma soluo de PCR padro (11,7 L de gua, 5 L de dNTP, 1 L de cada primer, 2,5 L de tampo, 0,19 L de Taq), utilizando os primers universais M13 (F 5-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3; R 5CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'). Os clones recombinantes resultantes foram estocados em glicerol 70% e armazenados em freezer a -80 C.

II.2.7.4.3. Sequenciamento das sondas de DNA Para verificar se o fragmento amplificado por PCR correspondia s regies de interesse, o sequenciamento do DNA foi realizado pelo mtodo de Sanger et al. (1977), com terminadores marcados com fluorescncia. Para a realizao das reaes de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare), no qual cada dideoxinucleotdeo (terminador) marcado com fluorescena (responsvel pela22

ativao do segundo elemento) e um dos quatro tipos de rodamina, cuja fluorescncia captada pelo sequenciador automtico de DNA. As reaes de sequenciamento foram realizadas em placas de 96 poos, utilizando-se entre 150 e 300 ng do produto de PCR purificado; 5 pmol de cada primer em reaes separadas; 4 L do premix (kit) e gua mili-Q para completar o volume de 10 L. Essas reaes foram feitas em um termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, em 30 ciclos sendo: desnaturao a 95 C por 20 segundos, anelamento a 50 C por 15 segundos e extenso a 72 C por 1 minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram os mesmos utilizados para o PCR. Depois de sequenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de precipitao para a eliminao de produto no incorporado durante a reao de sequenciamento. Logo aps foi realizada a leitura automtica do fragmento no sequenciador automtico de DNA MegaBACE 1000 (GE HealthCare), nas condies de injeo e corrida recomendadas pelo fabricante. As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do sequenciador para outro computador. As sequncias geradas foram comparadas com sequncias depositadas no banco de dados pblico na Internet, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), por uma procura realizada com o programa BLAST. Este procedimento foi realizado para determinar se o fragmento sequenciado realmente correspondia ao gene de interesse. Depois de conferidas, todas as sequncias foram alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento mltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que est incluso no BioEdit v. 5,0,6 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente conferido e editado no mesmo programa.

II.2.8 Microespalhamento para visualizao do complexo sinaptonmico Para obteno do complexo sinaptonmico a partir de gnadas masculinas foi utilizada a tcnica descrita por Moses (1977), Dresser & Moses (1980), colorao por Howell & Black (1980), com algumas modificaes.

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Para tanto, as gnadas masculinas foram retiradas e lavadas em soluo de Hanks, sendo posteriormente colocadas numa placa escavada contendo a mesma soluo. Com o auxlio de duas pinas, o material foi dissociado, sendo os pedaos maiores descartados. Em seguida, o material foi macerado em uma placa escavada e ressuspedido vrias vezes com o auxlio de uma seringa sem agulha, sendo ento transferido para um tubo de centrfuga, onde foram adicionados 6 mL de soluo de Hanks. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur o material foi ressuspendido e, logo aps, centrifugado por 4-5 minutos a 800 rpm. A maior parte do sobrenadante foi descartada, deixando-se cerca de 1-1,5 vezes o volume do pellet celular. O pellet foi ressuspendido com o que restou do sobrenadante, sendo esta suspenso mantida em gelo durante o preparo das lminas. Em um suporte cncavo com parafilme aderido superfcie, foi colocado 1,5 mL de soluo de NaCl 0,5% formando uma gota arredondada, onde foi colocada 0,3 mL da suspenso celular, com o auxlio de uma pipeta Pasteur de ponta bem fina, cuidando para que esta no afundasse. Em seguida, uma lmina plastificada preparada anteriormente (utilizando soluo de plstico a 0,6% (peso/volume) diluda em clorofrmio) foi encostada sobre a superfcie da gota de NaCl 0,5% contendo a suspenso celular, sendo esta levantada paralelamente gota. A lmina foi ento imersa numa soluo fixadora de paraformaldedo 4% acrescida de 1,5 mL de dodecilsulfato de sdio (SDS) 0,3%, por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida a lmina foi transferida para numa soluo fixadora de paraformaldedo 4%, pH 8,2, por 5 minutos em temperatura ambiente. Aps seca, a lmina foi imersa na soluo de photo-floo (Kodak) 0,4%, pH 9,0, por 15 segundos em temperatura ambiente. Por ltimo, a lmina foi retirada da soluo de photo-floo, teve sua parte de trs limpa com leno de papel e deixada secar naturalmente, em ambiente livre de poeira. Aps secarem, as lminas foram impregnadas com nitrato de Prata. Para tanto, foi colocada sobre a lmina 1 mL de uma soluo coloidal reveladora (1g de gelatina em 50 mL de gua destilada com 0,5 mL de cido frmico) e 2 mL de soluo de nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, sendo a lmina coberta com lamnula e incubada em cmara mida, a 60 C, at atingir colorao marrom-dourada24

(geralmente 2-3 minutos), quando foi lavada em gua destilada, permitindo que a lamnula fosse retirada naturalmente pela prpria gua. As lminas secaram diretamente ao ar. Normalmente duas lminas por indivduo foram feitas, sendo uma destinada para anlise em microscopia ptica, objetiva de 100x e outra para a microscopia eletrnica. Para a observao em microscopia eletrnica, o plstico que recobria as lminas foi cortado com um estilete e a lmina mergulhada lentamente numa coluna de gua, com uma inclinao de 60, para o descolamento do plstico, o qual permanecia na superfcie. Com uma pina delicada, as telinhas metlicas (grids) Mash 50 foram colocadas sobre o plstico flutuante. Em seguida este plstico com as telas foi capturado com um retngulo de parafilme, o qual secou naturalmente. As telinhas contendo o material a ser analisado foram guardadas em pequenas caixas prprias, para posterior anlise em microscpio eletrnico, a qual foi feita no microscpio eletrnico Philips, do departamento de microscopia da Universidade Estadual Paulista, UNESP-Botucatu.

II.2.9 Anlises cromossmicas As preparaes mitticas e meiticas (anlises convencionais e FISH) foram analisadas em microscpio ptico e/ou fotomicroscpio de epifluorescncia Olympus Bx-51 do Laboratrio de Gentica Animal-CPBA, INPA e Olympus Bx-61 do Laboratrio de Genmica Integrativa UNESPBotucatu, em objetiva de imerso. As melhores preparaes cromossmicas foram selecionadas e tiveram sua imagem capturada. A montagem dos caritipos foi feita a partir de cromossomos metafsicos mitticos, os quais foram recortados, tentativamente emparelhados, medidos e colocados em ordem decrescente de tamanho. A relao de braos dos cromossomos mitticos foi determinada de acordo com a proposta de Levan et al. (1964). Devido dificuldade de emparelhamento cromossmico, o qual peculiar nos cicldeos, uma vez que estes apresentam tamanhos e morfologia cromossmica similar, os cromossomos foram agrupados segundo Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008), sendo consideradas trs categorias: metasubmetacntricos, subtelo-acrocntricos e microcromossomos. Foram25

considerados microcromossomos os cromossomos com tamanho pequeno (de 0,5 a 1,5 m) e que aparecem na maioria das metfases como pontos. Como os centrmeros destes cromossomos no so evidentes na maioria das metfases difcil estabelecer a morfologia cromossmica (para reviso sobre microcromossomos ver Mesquita et al., 2008). Para interpretao da meiose foram consideradas as seguintes fases: leptteno/zigteno, paquteno, diplteno, diacinese, metfase I e metfase II, dando maior nfase ao diplteno, diacinese, metfase I e metfase II. Para a anlise do complexo sinaptonmico as clulas paquitnicas e diplotnicas que apresentaram boas condies de extenso do segmento emparelhado tiveram sua imagem capturada em fotomicroscpio de epifluorescncia Olympus Bx-51 do Laboratrio de Gentica Animal-CPBA, INPA ou foram fotografadas no microscpio eletrnico Philips (Centro de Microscopia Eletrnica- UNESP-Botucatu, SP), em filme 35mm, com exposio de 2,04 segundos. Os negativos foram revelados em revelador Dektol (Kodak) diludo em gua, na proporo de 4:1, em temperatura ambiente, por 7 minutos, e fixao em fixador Kodak durante 13 minutos. As imagens foram ampliadas e reveladas em papel Kodabrome Print RC F3 (Kodak).

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III. Resultados e discusso Os resultados obtidos com a anlise citogentica das trs espcies do gnero Symphysodon e a discusso destes dados so apresentados na forma de quatro artigos cientficos, mencionado a seguir: III.1.Artigo 1 - Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados. Publicado no peridico Heredity 102: 435-441. III.2.Artigo 2: Anlise citogentica comparativa das espcies do gnero Symphysodon (Cichlidae): caractersticas cromossmicas de retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal. Enviado para publicao no peridico Cytogenetic and Genome Research, em 13/07/2009. Aceito para publicao em 24/08/09. Primeira reviso efetuada em 25/08/09. III.3.Artigo 3: Variabilidade intra e interespecfica do locus do DNAr 18S entre acars-disco Symphysodon: rearranjos cromossmicos. Enviado para publicao no peridico Journal of Fish Biology, em 09/06/2009. Aceito para publicao em 10/08/2009. Primeira reviso efetuada em 20/08/2009. III.4.Captulo 4: Complexo sinaptonmico em acars-disco: cadeia

cromossmica meitica. A ser enviado para publicao no peridico Micron.

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III.1.Artigo 1: Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados

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III.1.1. Introduo Os acars-disco, gnero Symphysodon Heckel, 1840, formam o grupo mais intrigante e distinto entre os cicldeos sulamericanos devido morfologia de seu corpo, aos padres de colorao e caractersticas cromossmicas (Kullander, 1996; Feldberg et al., 2003; Ready et al., 2006). Nos ltimos quarenta anos algumas publicaes tem indicado que Symphysodon tem o maior nmero diploide de todos os cicldeos, sendo a maioria das informaes referentes Symphysodon aequifasciatus (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al., 2002). Recentemente, Mesquita et al. (2008) demonstraram que S. discus e S. haraldi tambm apresentam um caritipo derivado. Todas as espcies do gnero Symphysodon possuem um elevado nmero diploide (2n=60), com predominncia de cromossomos meta-submetacntricos, variao morfolgica inter e intraespecfica e microcromossomos (ver Tabela 1 Introduo Geral, pgina 20). O alto nmero diploide detectado em Symphysodon j foi explicado de duas formas: como uma consequncia de poliploidizao (Thompson, 1976) e por meio de rearranjos cromossmicos, como inverses pericntricas, translocaes e fisses/fuses (Mesquita et al., 2008). As diferentes frmulas cariotpicas descritas para as diferentes espcies de acars-disco podem ter sido ocasionadas por enganos na classificao dos cromossomos, uma vez que o nvel de condensao dos cromossomos pode interferir nas anlises e a maioria dos autores no empregou a terminologia microcromossomo. Alm disso, a falta de consenso na classificao taxonmica das espcies pode tambm ter gerado erros. O caritipo das trs espcies apresenta blocos heterocromticos localizados principalmente na regio pericentromrica de todos os cromossomos e na regio proximal de braos curtos e longos de alguns pares (Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008). Com relao regio organizadora de nuclolo (RON), Takai et al. (2002) detectaram um sistema de RON simples em S. aequifasciatus, usando impregnao por nitrato de Prata. Entretanto, Mesquita et al. (2008) descreveram um sistema de RONs mltiplas em S.

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aequifasciatus (cromossomos dos pares 5, 10, 11, 15, 21 e 22), S. discus (18 e 24) e S. haraldi (3, 5, 10, 11, 21 e 22). A anlise de configuraes meiticas tem sido utilizada para confirmar a ocorrncia de poliploidizao, eventos de duplicao e rearranjos cromossmicos que ocorreram durante a evoluo de mamferos e outros grupos de vertebrados (Villena & Sapienza, 2001; Dumas & Britton-Davidian, 2002; Siqueira-Jr et al., 2004; Gallardo et al., 2006). Se poliploidizao ou rearranjos cromossmicos tiverem ocorrido, o pareamento cromossmico meitico pode ser complexo e resultar em gametas balanceados ou desbalanceados (Sharp & Rowell, 2007). Assim como em outros telesteos, o estudo de cromossomos meiticos em cicldeos neotropicais tem sido negligenciado. Os poucos relatos encontrados na literatura descrevem caractersticas notveis, como discordncia entre nmero cromossmico de clulas somticas e gonadais em Gymnogeophagus balzanii (Feldberg & Bertollo, 1984). Neste estudo foram investigados os cromossomos meiticos de espcies selvagens de Symphysodon, enfatizando a configurao da complexa cadeia cromossmica meitica que nunca havia sido encontrada em peixes. Esta informao poder contribuir para o entendimento dos rearranjos cromossmicos envolvidos na carioevoluo deste grupo de peixe.

III.1.2. Material e mtodos Os acars-disco foram coletados em seus habitats naturais na bacia Amaznica, estado do Amazonas, Brasil. Os peixes foram identificados de acordo com a taxonomia de Bleher et al. (2007), isto , S. aequifasciatus (disco verde), S. discus (discos Heckel) e S. haraldi (disco azul/marrom). Trinta e cinco machos e nove fmeas de Symphysodon spp. foram analisados neste estudo, com licena do IBAMA (11/2005): oito machos e trs fmeas de S. aequifasciatus do rio Tef; 15 machos e trs fmeas de S. discus do rio Negro (proximidades de Novo Airo) e 15 machos e trs fmeas de S. haraldi do rio Manacapuru (Figura 1). Espcimes testemunhos foram depositados na Coleo de Peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da31

Amaznia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil (INPA 28582, INPA 28583, INPA 25498).

Figura 1 Espcies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuies geogrficas na bacia Amaznica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S. haraldi; d) Mapa geogrfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a, Tef; b, Novo Airo; c, Manacapuru.

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Preparaes cromossmicas meiticas foram obtidas utilizando clulas gonadais, segundo protocolo descrito por Bertollo et al. (1978), com modificaes. Testculos e ovrios imaturos de indivduos no submetidos colchicinizao foram colocados em soluo hipotnica (KCl 0,075M) por 30 minutos e fixados em Carnoy (3 metanol : 1 cido actico) por 20 minutos; este ltimo tratamento foi repetido por trs vezes. A seguir, as gnadas foram maceradas em cido actico 50% sobre uma lmina e secas sobre uma placa de metal aquecida temperatura de 45 C. Todas as preparaes cromossmicas foram coradas com soluo de Giemsa 5% por 10 minutos. A heterocromatina constitutiva foi detectada pela tcnica de Sumner (1972) e as regies organizadoras de nuclolo foram impregnadas pelo on Prata de acordo com a tcnica de Howell & Black (1980).

III.1.3. Resultados Poucas fmeas foram analisadas devido presena de grande quantidade de vitelo nas fmeas maduras, sendo que este fator interfere na tcnica utilizada, tornando-a impraticvel. As clulas gonadais em intrfase e prfase I de machos e fmeas de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi no apresentaram regies heteropicnticas positivas que indicassem a presena de cromatina sexual (Figura 2 a, b, c). O comportamento cromossmico de algumas fases meiticas de S. aequifasciatus e S. haraldi foi similar, mas diferenas foram detectadas em S. aequifasciatus/S. haraldi e S. discus. Uma cadeia cromossmica multivalente e 20 bivalentes foram observados no diplteno de espermatcitos e ocitos de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 2 d, e) e 30 bivalentes foram detectados em S. discus (Figura 2 f). Nas trs espcies, a maioria dos bivalentes apresentou dois quiasmas terminais. A cadeia cromossmica (C) observada em clulas diplotnicas de S. aequifasciatus e S. haraldi provavelmente composta por 20 elementos, porque at 20 bivalentes (II) foram encontrados nesta fase. Embora 2n=20II+CXX (onde CXX significa cadeia cromossmica meitica composta de 20 elementos) represente o maior grau de pareamento cromossmico observado em dipltenos de S. aequifasciatus e S. haraldi, somente 2% das33

clulas analisadas apresentaram esta configurao. Nas duas espcies, a configurao mais frequente foi uma cadeia cromossmica linear com nmero varivel de elementos, assim como o nmero de bivalentes e univalentes (Figura 3). Esta variao pode ser explicada pela dinmica do ciclo de diviso celular (diplteno precoce, intermedirio e tardio). Assim, quando o nmero de elementos da cadeia e/ou bivalentes diminui, o nmero de univalentes aumenta e uma cadeia cromossmica linear pode ser detectada. Desta forma, durante a diacinese de S. aequifasciatus e S. haraldi uma cadeia cromossmica em anel e um nmero varivel de bi- e univalentes foram visveis (Figura 2 g, h). Em S. discus esta fase foi caracterizada pela ocorrncia de 30 bivalentes, alguns dos quais exibem uma separao precoce dos cromossomos (Figura 2 i). Clulas em metfase I de S. aequifasciatus e S. haraldi apresentaram a cadeia cromossmica com disposio em zigzag, indicando uma orientao alternada dos centrmeros dos cromossomos homlogos (Figura 2 j, k). Clulas em metfase I de S. discus mostraram bivalentes tpicos alinhados na placa equatorial (Figura 2 l). Clulas em metfase II das trs espcies apresentaram n=30 cromossomos, confirmando que a segregao dos cromossomos ocorreu corretamente na anfase I precedente (Figura 2 m, n, o). Clulas diplotnicas de S. aequifasciatus e S. haraldi, submetidas tcnica de banda C, mostraram a maioria dos bivalentes com dois blocos heterocromticos conspcuos, indicando que, provavelmente, estejam localizados na regio pericentromrica, enquanto que a cadeia cromossmica apresentou um nmero varivel de marcaes heterocromticas (Figuras 4 a, b). Banda C positiva foi detectada em quase todos os bivalentes diplotnicos de S. discus machos e fmeas, sendo o padro similar ao encontrado em bivalentes de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 4 c). Os ncleos interfsicos de clulas gonadais masculinas e femininas das trs espcies de Symphysodon, assim como clulas da prfase I, foram impregnados com on Prata. O ncleo interfsico, nas trs espcies, apresentou um nmero varivel de nuclolos marcados com nitrato de Prata, sendo encontradas at seis marcas em S. aequifasciatus e S. haraldi, e at quatro em S. discus (Figura 4 d, e, f). Em S. aequifasciatus e S. haraldi at34

duas RONs foram observadas em diplteno e diacinese. Em S. aequifasciatus os stios estavam em bivalentes (Figura 4 g) e em S. haraldi, um estava em um bivalente e outro na cadeia cromossmica (Figura 4 h). Clulas da prfase I tardia de S. discus apresentaram um ou dois bivalentes portando a RON (Figura 4 i).

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Figura 2 Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas colorao convencional. (a-c) Leptteno/Zigteno. (d, e) Diplteno mostrando uma cadeia cromossmica em anel (cabea de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplteno com 30 bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese mostrando uma cadeia cromossmica linear (cabea de seta) e vrios bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separao precoce de elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metfase I revelando a orientao em zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabea de seta). (l) Metfase I com bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metfase II com n=30 cromossomos (barra: 10 m).

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Figura 3 Frequncia das frmulas meiticas nas clulas em diplteno e diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrando a barra de desvio padro e nmeros variveis de bivalentes, elementos formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma terminalizao precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia cromossmica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossmica com 19 elementos; C XVIII = cadeia cromossmica com 18 elementos; C XVII = cadeia cromossmica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossmica com 16 elementos; C XV = cadeia cromossmica com 15 elementos; U = univalentes.

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Figura 4 - Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) aps bandamento C (a-c) e impregnao por on Prata. (a-b) Diplteno mostrando blocos heterocromticos (cabea de seta) nos elementos cromossmicos formadores da cadeia e em quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplteno com banda C positiva (seta) na maioria dos bivalentes. (d-f) Ncleos interfsicos, revelando cinco, seis e quatro nuclolos (cabea de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeas de seta) em um elemento da cadeia cromossmica e em um bivalente de tamanho mediano (seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno (barra: 10 m).

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Figura 5 - Representao esquemtica da possvel origem da cadeia cromossmica das clulas meiticas de Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi (n representa os outros pares cromossmicos envolvidos na meiose mltipla). (a) Translocaes simples e heterozigotas envolvendo pequenos segmentos de alguns pares cromossmicos. (b) Elementos cromossmicos derivados de translocaes. (c) Configurao meitica da cadeia cromossmica, causada por translocaes mltiplas e seriadas.39

III.1.4. Discusso Apesar da falta de consenso na nomenclatura taxonmica, atualmente aceita-se a presena de trs espcies distintas de Symphysodon, baseando-se na colorao, morfologia, caractersticas moleculares e padres de distribuio geogrfica pela bacia Amaznica (Ready