tese elson viegas
TRANSCRIPT
UFRRJ
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
TESE
Emprego de Óleos Essenciais de Plantas Medicinais no
Controle de Aspergillus spp. em Sementes de Amendoim
(Arachis hypogaea L.)
Elson de Carvalho Viegas
2004
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
EMPREGO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS NO CONTROLE DE Aspergillus spp. EM
SEMENTES DE AMENDOIM (Arachis hypogaea L.)
ELSON DE CARVALHO VIEGAS
Sob a Orientação da Professora Claudia Antonia Vieira Rossetto
e
Co-orientação da Professora
Margarida Goréte Ferreira do Carmo
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência em Fitotecnia.
Seropédica, RJ
Dezembro de 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
ELSON DE CARVALHO VIEGAS Tese submetida ao Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência, em Fitotecnia. Tese aprovada em 13/12/2004
Claudia Antonia Vieira Rossetto (Dr) UFRRJ Orientadora
Margarida Goréte Ferreira do Carmo (Dr) UFRRJ
Paulo Cesar Rodrigues Cassino (Dr) UFRRJ
Ronoel Luiz de Oliveira Godoy (Dr) EMBRAPA
Humberto Ribeiro Bizzo (Dr) EMBRAPA
A Frei João que, juntamente com seus discípulos, nunca me deixou esmorecer, me estimulando e fortalecendo para que eu chegasse vitorioso ao final deste trabalho.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Agradeço à DEUS por me proporcionar saúde e disposição para trabalhar além de colocar em meu caminho “irmãos” que muito contribuíram para o êxito deste trabalho.
Ao Professor PAULO CESAR RODRIGUES CASSINO que foi o grande articulador da minha pós-graduação. À Professora CLAUDIA ANTONIA VIEIRA ROSSETTO que, além de minha orientadora de pesquisa, foi a paciente companheira de trabalho e cuidadosa revisora dos textos escritos. À Professora MARGARIDA GORÉTE FERREIRA DO CARMO que colocou seu laboratório a minha disposição, além de ajudar a orientar os meus estagiários durante os testes in vitro e na redação final da tese. À Dra ANNA MARIA BITTENCOURT, à época pesquisadora da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, pela preciosa colaboração na identificação dos fungos. Ao Dr BENJAMIN GILBERT, da Fundação Oswaldo Cruz, pela indicação do uso de óleos essenciais na pesquisa. À Dra DAISE LOPES, da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, que gentilmente cedeu dezessete óleos essenciais e indicou-me a primeira bibliografia a ser consultada. Ao Dr RONOEL LUIZ DE OLIVEIRA GODOY, da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, que ajudou-me a esclarecer várias questões do trabalho com a máxima cordialidade, além de incentivar-me freqüentemente na fase derradeira da tese. Ao Dr HUMBERTO RIBEIRO BIZZO, da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, que sempre me recebeu com boa vontade. Ao Dr ANTONIO CARLOS SIANI, da Fundação Oswaldo Cruz, que sugeriu incluir e cedeu o óleo essencial de Lippia sidoides e o citral. À TATIANA DE MORAES LIMA, que na qualidade de bolsista e amiga, foi incansável nas tarefas relativas ao primeiro capítulo, não se deixando abater mesmo nos momentos mais difíceis. Ao Dr OTNIEL FREITAS SILVA, da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos, sempre solícito quando precisamos. À ANDRÉA SOARES, dedicada estagiária, que muito colaborou com o sucesso deste trabalho. À LAIS PESSOA DOS SANTOS FERREIRA, estagiária que sempre esteve disposta para êxito das atividade de laboratório. À FABINA GOIS DO NASCIMENTO que, como estagiária prestimosa, nos ajudoi, sem medir esforços, na fase mais complexa da tese. À BIANCA GONÇALO MEYRELES que, durante o seu período de estágio, ajudou, com dedicação, na confecção das tabelas. Ao Engenheiro Agrônomo e companheiro JOSÉ CARLOS POLIDORO, que colaborou na realização da análise estatística e na elaboração dos gráficos. Ao Professor CARLOS DE SOUZA ABBOUD, do Departamento de Fitotecnia e Coordenador do Curso de Pós-graduação, que deu todo o apoio para realização da tese. Ao Convênio FAPUR/SMS-RJ pelo apoio concedido, através da liberação de suas bolsistas, para realização deste trabalho. A todos os bolsistas e estagiários do Laboratório de Análise de Sementes do Departamento de Fitotecnia, que demonstraram sempre amizade, companheirismo e colaboração. À todos os Professores de nossa Universidade que sempre torceram para o meu sucesso. Aos amigos leais que me mantiveram sempre fortalecido com suas orações e estímulo.
SUMÁRIO
página 1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................... 1 1.1 A Espécie ............................................................................................ 1 1.2 Colonização de Grãos por Aspergillus .............................................. 2 1.2.1 Em amendoim ..................................................................................... 2 1.2.2 Em milho ............................................................................................. 4 1.3 Micotoxinas ......................................................................................... 4 1.4 Influência de Fatores do Ambiente na Colonização e Formação
de Aflatoxinas ......................................................................................
5 1.4.1 Fungos do grupo Aspergillus flavus ................................................... 5 1.4.2 Em amendoim ..................................................................................... 6 1.5 Controle da Colonização e Subseqüente Aflatoxinas ...................... 7 1.6 Ação de Fungos na Deterioração de Sementes ................................. 8 1.7 Uso de Extratos de Plantas Medicinais para Controle ................... 9 1.7.1 De Aspergillus flavus em grãos .......................................................... 9 1.7.2 De Aspergillus flavus em sementes .................................................... 9 1.7.3 De outros fungos ................................................................................. 10 1.8 Objetivos Gerais ................................................................................. 12 1.9 Referências Bibliográficas ................................................................. 12 2 CAPÍTULO I. ISOLAMENTO DE Aspergillus spp. E PRODUÇÃO DE
AFLATOXINAS .............................................................................................
21 2.1 Resumo ................................................................................................ 22 2.2 Abstract ............................................................................................... 23 2.3 Introdução ........................................................................................... 24 2.4 Material e Métodos ............................................................................. 25
2.5 Resultados e Discussão ....................................................................... 27 2.6 Conclusões ........................................................................................... 34 2.7 Referências Bibliográficas ................................................................. 34 3 CAPÍTULO II. AVALIAÇÃO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE
PLANTAS MEDICINAIS NO DESENVOLVIMENTO DE Aspergillus spp. ...................................................................................................................
37 3.1 Resumo ................................................................................................ 38 3.2 Abstract ............................................................................................... 39 3.3 Introdução ........................................................................................... 40 3.4 Material e Métodos ............................................................................. 41 3.5 Resultados e Discussão ....................................................................... 44 3.6 Conclusões ........................................................................................... 58 3.7 Referências Bibliográficas ................................................................. 59 4 CAPÍTULO III. QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE
AMENDOIM INFLUENCIADAS PELOS PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL .......................................................................................................
62 4.1 Resumo ................................................................................................ 63 4.2 Abstract ............................................................................................... 64 4.3 Introdução ........................................................................................... 65 4.4 Material e Métodos ............................................................................. 66 4.5 Resultados e Discussão ....................................................................... 68 4.6 Conclusões ........................................................................................... 76 4.7 Referências Bibliográficas ................................................................. 76
ÍNDICE DE TABELAS
Página 1 Quadrado médio para a porcentagem de fungos em vagens e sementes de
amendoim, cultivado em área com e sem calagem provenientes de plantas colhidas com 104, 114, 124 e 134 DAS, e secas em estufa e ambiente. Avaliação na época da seca. Seropédica-RJ. 2002. ........................................
28
2 Quadrado médio para % de fungos em vagens e sementes de amendoim cultivado em solo com e sem calagem, provenientes de plantas colhidas aos 104, 114, 124 e 134 DAS e secas em estufa e ambiente. Avaliação na época das águas. Seropédica-RJ. 2002. ....................................................................
28
3 Dados médios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim provenientes de solo submetido ou não a aplicação de calcário e que foram secas em estufa e ambiente. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ. 2002. .............................................................................
29
4 Quadrado médio porcentagem de fungos em amostras de solo, cultivado com amendoim e submetido ou não a aplicação de calcário, que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época da seca. Seropédica-RJ. 2002. ......................................................................................
32
5 Quadrado médio para porcentagem de fungos em amostras de solo, cultivado com amendoim submetido ou não a aplicação de calcário, que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época das águas. Seropédica-RJ. 2002. ..........................................................................
33
6 Dados médios de fungos (UFC/g de solo) em amostras submetidas ou não a aplicação de calcário e que foram coletadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ. 2002. ....................
33
7 Dados médios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim e de UFC/g de solo. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ, 2002. ......................................................................................
33
8 Caracterização pela Cromatografia de Camada Delgada, dos isolados do grupo Aspergillus flavus, que foram identificados inicialmente em meio ADM, segundo a produção de aflatoxinas. Seropédica-RJ. 2002. .................
34
9 Outros grupos de Aspergillus identificados nos isolados das amostras de solo, de vagem e de sementes, nos períodos de seca e águas de 2001. Seropédica-RJ. 2002. ......................................................................................
34
10 Dados médios de diâmetro de halos de inibição (mm) formados pela ação de três fungicidas em diferentes concentrações sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T23-semente). Seropédica-RJ. 2002. ................................
44
11 Dados médios de diâmetros dos halos de inibição (mm) formados pela ação
do fungicida benomyl nas duas concentrações testadas sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente) em diferentes concentrações. Seropédica-RJ. 2002. ......................................................................................
45
12 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do fungicida benomyl sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente). .............................................
45
13 Dados médios de diâmetros de halos de inibição (mm) formados pela ação do fungicida benomyl sobre diferentes isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente).Seropédica-RJ. 2002. ...
45
14 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação de óleos
essenciais sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente). .........................................................................................................
46
15 Diâmetros dos halos de inibição (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente) em função da atividade de óleos essenciais de plantas medicinais (2 mg/mL de solvente), do solvente DMSO+MeOH (50% v/v) e do fungicida benomyl (0,5 mg/mL). Seropédica-RJ. 2003. ......................................................................................
47
16 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação de óleos
essenciais selecionados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida. .........................................
48
17 Halos médios obtidos pela ação de óleos essenciais com melhores resultados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida. Seropédica-RJ. 2002. ......................
48
18 Resumo da análise de variância obtida pela ação de óleos essenciais de alho e de casca de canela sobre 32 isolados do grupo Aspergillus flavus. .............
48
19 Diâmetros médios dos halos de inibição (mm) formados em isolados do
grupo Aspergillus flavus em função da atividade dos óleos essenciais de alho e de canela. Seropédica-RJ.2003. ...........................................................
49
20 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo de canela e do fungicida benomyl sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente). ....................................................
50
21 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo essencial de Lippia sidoides e do citral sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem) .....................................................
51
22 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo essencial de alho e do fungicida benomyl sobre ilsolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-sememte e T63-sememte). ....................
54
23 Avaliação da atividade do óleo essencial de casca de canela nas
concentrações de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg/mL do solvente sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), na concentração de 107 conídios/mL. Seropédica-RJ. 2003. ..............................
56
24 Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação dos óleos essenciais de alho e casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T20-semente, T24-semente, T35-vagem e T55-vagem) após 12 meses de armazenamento. .........................................................................
57
25 Diâmetros dos halos médios de inibição (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20, T24, T35 e T55), em função da atividade dos óleos essenciais de alho e casca de canela, após 12 meses de armazenamento. Seropédica-RJ.2003. ............................................................
58
26 Avaliação da atividade dos óleos essenciais de alho e de casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20. T24, T35 e T55), após 12 meses de armazenamento destes óleos. Seropédica-RJ. 2003. .......................
58 27
Avaliação comparativa em porcentagem da atividade do óleo essencial de casca de canela, sobre a ocorrência de isolados do grupo Aspergillus flavus (T18, T52, T63), avaliadas em 10/2002, e isolados (T2, T20, T24, T35, T55), avaliadas em 07/2003, após 12 meses de armazenamento do óleo essencial. Seropédica-RJ. 2003. .....................................................................................
58 28
Dados de porcentagem de fungos em sementes de amendoim, cultivar Tatu, tratadas com óleos essenciais. Seropédica-RJ. 2003. .....................................
69
29 Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas (g), submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (1° experimento). ...........................................................
69
30 Dados médios de porcentagem de plântulas normais de primeira contagem, germinação, de plântulas anormais infeccionadas (PAI) e de sementes mortas (SM), e massa seca de plântulas (g) obtidas no primeiro experimento de sementes de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. .......
70
31 Quadrado médio para os dados de germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (2° experimento). .........................
70
32 Dados médios de porcentagens de emergência, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM) e de massa seca de plântulas (g), obtidos no (2° experimento) de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. ...............................................................................................................
71
33 Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de solventes (3° experimento). .........................................
71
34 Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 3° experimento de amendoim cv. Tatu, tratadas com solventes. Seropédica-RJ. 2003. .....................................................................
72
35 Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (4° experimento). Seropédica-RJ. 2004. ...............................................................................................................
72
36 Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 4° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. ...............................................................................................................
73
37 Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (5° experimento). ......
73
38 Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 5° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. ...............................................................................................................
74
39 Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (6° experimento). ...........................................................................
74
40 Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, obtidos no 6° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. .......................................................................
75
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
1. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas vagens de amendoim, em função da época de amostragem (DAS), no cultivo da seca .
30
2. Porcentagem de Rhizopus nas vagens de amendoim em função da época de amostragem (DAS) e do procedimento de secagem, por ocasião da avaliação realizada no cultivo da seca. ............................................................
30
3. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes de amendoim, em função de época de amostragem (DAS) e procedimento de secagem, por ocasião da avaliação realizada no cultivo das águas. ................
31
4. Porcentagem de Rhizopus spp. em sementes de amendoim, em função da época de amostragem (DAS) e da calagem, por ocasião da avaliação do cultivo das águas. ...........................................................................................
31
5. Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de casca de canela e do fungicida benomyl. ..........................................................................................................
51
6. Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T24 e T35), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de Lipia sidoides. .....................................................................
52
7. Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem), em mm, em função de diferentes concentrações de citral. ...................................................................................
53
8. Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de alho e do fungicida benomyl.
55
9. Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de canela e do fungicida benomyl. ..........................................................................................................
56
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ADM meio de cultura composto de triptona (15 g); extrato de
levedura (10 g); citrato férrico (0,5 g); agar (15 g); água destilada (1000 mL)
aw água disponível para o desenvolvimento de
microrganismos BDA meio de cultura composto de batatinha sem pele (200 g);
sacarose (20 g); agar (17 g); água destilada (1000 mL) CCD cromatografia de camada delgada CYA meio de cultura composto de NaNO3 (3 g); K2HPO4 (1 g);
KCl (0,5 g); MgSO4.7H2O (0,5 g); FeSO4.7H2O (0,01 g); extrato de levedura (5 g); sacarose (30 g); agar (15 g); água destilada (1000 mL); solução de traços de metal (1 mL)
Czapek-Dox agar meio de cultura composto de NaNO3 (2 g); K2HPO4 (1 g);
MgSO4.7H2O (0,5 g); KCl (0,5 g); FeSO4 (0,01 g); sacarose (30 g); água destilada (1000 mL); solução de traços de metal (1 mL)
DMSO Dimetil sulfóxido MeOH Metanol SMKY meio de cultura composto de sacarose (20 g); sulfato de
magnésio (0,5 g); nitrato de potássio (3 g); extrato de levedura (7 g); água destilada (1000 mL)
Solução de traços de metal composta de ZnSO4.7H2O (1 g); CuSO4.5H2O (0,5 g);
água destilada (1000 mL) T isolados obtidos no cultivo da seca ufc Unidades formadoras de colônias Y isolados obtidos no cultivo das águas YES meio de cultura composto de extrato de levedura (20 g);
MgSO4.5H2O (0,5 g); sacarose (150 g); agar (20 g); água destilada (1000 mL)
RESUMO GERAL
VIEGAS, Elson de Carvalho. Emprego de Óleos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Aspergillus spp. em Sementes de Amendoim (Arachis hypogaea L.). Seropédica: UFRRJ, 2004. 78 p. (Tese de Doutorado em Fitotecnia).
O amendoim (Arachis hypogaea L.) pode ser destinado a propagação e ao
consumo. Na semeadura, os fungos, tais como Aspergillus spp., podem causar deterioração das sementes e levar a perda de germinação. Assim como, quando usado para alimentação, estes fungos podem contaminar os grãos e produzir aflatoxinas. Existem vários procedimentos para controle da colonização destes fungos, tais como, o emprego de produtos químicos, de sementes resistentes e, recentemente de produtos naturais provenientes de partes de plantas. Os objetivos do presente trabalho foram o de avaliar o desenvolvimento do grupo Aspergillus flavus e a subseqüente síntese de aflatoxinas em grãos de amendoim, provenientes de plantas que cresceram na presença ou ausência de calagem, colhidas em distintas épocas e secas em estufa e ambiente, em dois cultivos (águas e seca); avaliar, in vitro, a toxicidade de óleos essenciais de vegetais contra fungos do grupo A. flavus, isolados da cultura do amendoim; e avaliar a qualidade fisiológica das sementes de amendoim da cultivar Tatu, tratadas com fungicidas sintéticos e óleos essenciais de plantas. Pelos resultados foi constatado que a calagem não preveniu a contaminação de vagens e de sementes em ambos os cultivos. As condições de secagem em ambiente propiciaram menor incidência de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das águas e nas sementes provenientes do cultivo da seca. Dos isolados característicos do grupo A. flavus, 41 % provenientes do cultivo da seca e 47 % das águas não produziram aflatoxina. Foi constatado ainda que a maior inibição do desenvolvimento micelial de A. flavus foi obtida com o emprego dos óleos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/ml de solvente (DMSO+MeOH) e que o efeito inibitório dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial foi variável conforme o fungo (isolado) testado. Além disso, as sementes embebidas em metanol, etanol e DMSO+MeOH e suas misturas com os óleos essenciais apresentaram redução acentuada de germinação e do vigor. Já, os produtos a base de pó de alho e de canela favoreceram a germinação e o vigor das sementes e reduziram as plântulas infeccionadas. Palavras chave: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., contaminação, aflatoxina.
ABSTRACT VIEGAS, Elson de Carvalho. Medicinal plants essential oil in the Aspergillus flavus
control on the peanut seeds (Arachis hypogaea L. Seropédica: UFRRJ, 2004. 78 p. (Philosophiae Doctor).
Peanut kernels can be used as propagules or for food. When used as seeds, Aspergillus spp. can cause deterioration and loss of germination when used for consumption aflatoxin produced by these fungi may cause helath threats. There are several products to control colonization of these fungi such as chemicals, resitant seeds and morc recently natural products obtained from plants parts. The objectives of this work were: (i) to evaluete the development of fungi from the group Aspergillus flavus and aflatoxin synthesis in peanut kernels obtained from plants growing with or without lime, harvested in the different times and dried in stove or under room temperature in the rainy and dry season; (ii) to evaluate essential oils for their toxicity against fungi belonging to the A. Flavus gruoup, isolated from peanuts and (iii) to evaluate seed physiological quality of peanut cv Tatu, treated with synthetic fungicides and essential oils. Results indicated that liming did not prevent pods or kernels from fungal contamination in both seasons. When dried at room temperature a lower fungal incidence on pods grown in the rainy season and lon seeds produced in the dry season ocurred. Kernels harvested at the dry season, and dried in stove were more contaminated by the fungi, 41% of the isolates obtained from the rainy season and 47% from the rainy season did not product aflatoxins. The highest inhibition to A. Flavus mycelial development was obtained after the use of cinnamon and garlic oils. The degree of inhibition by the oils was different for each isolate. Seeds immersed in methanol, ethanol and DMSO+MeOH and their mixtures, reduced germination and seed vigor, whereas products containning garlic and cinnamon powders favored germination and seed vigor, as well as reduced the number of infected seedlings. Key words: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., contamination, aflatoxin.
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 A Espécie Muito antes dos portugueses chegarem ao Brasil em 1500, o amendoim já era conhecido e utilizado pelos índios brasileiros. Em algumas tribos ele era chamado de Mandubi ou Mandobim e em outras de Manobi (SAN MARTIN, 1985).
A primeira referência escrita sobre o amendoim, em toda a história da humanidade, foi encontrada num texto escrito em 1578 e registrada por Jean de Lery. Eram relatos de franceses que viajaram pelo Nordeste brasileiro, junto às primeiras expedições que aportaram no Novo Mundo e que mantiveram contato com os índios (SAN MARTIN, 1985). Em 1929, o botânico J. Geraldo Kulman, viajando com o Marechal Rondom pelo sertão brasileiro, conseguiu amostras de sementes de uma variedade suculenta e grande de amendoim, plantada pelos índios Nambiquaras. Estas sementes foram para a Itália e Inglaterra e daí para os Estados Unidos, onde, após melhorada e selecionada, tornou-se uma das principais variedades plantadas neste país, como também em vários países da Ásia, África e Américas. O amendoim tem grande valor econômico, como produto de consumo interno e de exportação, sendo comercializado como grão com ou sem casca, como óleo refinado e como seu farelo, que é o maior volume de exportação (SAN MARTIN, 1985). Apresenta teores elevados de óleos e proteínas e é considerado um dos alimentos humanos mais concentrado e, ao mesmo tempo, de fácil digestão (BRUCHER, 1989)
A cultura é propagada por sementes, que podem transportar e, ou, transmitir vários patógenos como Rhizopus sp., Sclerotium rolfsii Sacc., Diplodia natalensis Pole-Evans, Rhizoctonia solani Kuehn, Aspergillus flavus, A. niger, Fusarium spp. e Penicillium spp., que causam podridão de pré e pós emergência, além de Cercospora arachidicola Hori e Cercosporidium personatum (Berk. & Cust.) Deighton que causam manchas foliares (MORAES, 1980; MORAES & MARIOTTO, 1985; LIMA & ARAUJO, 1999).
A cultura do amendoim é importante para o Brasil e em especial para o Estado de São Paulo, onde, no ano agrícola de 2003/2004, foi obtida uma produção de 6.004.043 sacas de 25 kg em 58.817 ha na safra das águas e há uma previsão de safra da seca de 1.476.281 sacas de 25 kg numa área de 19.298 ha (IEA, 2004).
O amendoim, quando usado para alimentação humana e em rações denomina-se grão, sendo que há problemas de aflatoxinas pela contaminação por fungos. O homem e os animais domésticos como bovinos, suínos, eqüinos e aves consumindo doses subletais dessas toxinas por alguns dias, desenvolvem sintoma de toxidez no qual os danos ao fígado são os mais significativos (CIEGLER, 1975; HAYES, 1978).
Um dos aspectos mais importantes para se manter a qualidade sanitária de grãos de amendoim é o manejo pré-colheita, uma vez que a sua contaminação sempre foi tratada como um problema de armazenamento, sendo o próprio armazém, a fonte de inóculo (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Mais recentemente, passou-se a aceitar que os grãos podem chegar aos armazéns, apresentando-se infectados e infestados com Aspergillus spp., pois dependendo das condições climáticas e da cultivar, a colonização pelo fungo e, a subseqüente formação de aflatoxinas podem ocorrer no campo, bem antes da maturação (ANDERSON et al., 1975). Esta substância é importante quando as sementes são destinadas ao consumo como grão, por causar problemas de saúde pública (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998).
Já FERNANDEZ et al. (1997) avaliando o efeito da aplicação de calcário em áreas de cultivos de amendoim, constataram que os grãos com maior espessura do tegumento, devido ter sido proveniente de plantas que foram crescidas em áreas submetidas à calagem, podem favorecer a diminuição da incidência de Aspergillus spp. e da biossíntese de aflatoxinas, dependendo do potencial do inóculo. Além disso, quando as plantas são secas a sombra, a produção de toxinas ocorre, independente da calagem; entretanto, quando as plantas são secas no campo ou no campo seguindo-se de secagem artificial, o desenvolvimento de fungos pode ser reduzido com o aumento do conteúdo de cálcio das sementes. Também PITT et al. (1991) concluíram que o maior conteúdo de cálcio do tegumento da semente é responsável pela redução do crescimento do Aspergillus flavus em cultivo de época seca. Assim, além da época de colheita, a secagem também tem sido considerada como uma das operações críticas e que determina a viabilidade da semente do amendoim, principalmente da época das águas (NAUTIYAL & ZALA, 1991).
Extratos de plantas medicinais têm sido utilizados intensamente, nos últimos anos, em estudos farmacológicos com resultados favoráveis no controle e na cura de enfermidades, nas áreas humana e animal (APPLETON & TANSEY, 1975; AMER et al., 1980; LOURIA et al., 1989; URBINA et al., 1993; ZOHRI et al., 1995; LEDEZMA et al., 1996; SAN-BLAS et al., 1997). De forma similar, alguns trabalhos também têm sido realizados quanto a sua utilização no controle de patógenos associados às sementes (COUTINHO et al., 1999; MOURA & PESSOA, 2000; MORAIS et al., 2002; GABRIEL et al., 2002).
O extrato aquoso de Andrographis peniculata foi utilizado em diferentes dosagens para controle de Aspergillus flavus o que resultou na redução da produção de aflatoxinas em meio SMKY, tendo sido obtido com 10,0 mg/mL, redução de 42,5 a 78,6 % de produção de aflatoxinas B2 e B1 respectivamente, além de 75,1 % no crescimento do fungo (KUMAR & PRASAD, 1992). 1.2 Colonização de Grãos por Aspergillus 1.2.1. Em amendoim
Historicamente, a contaminação de grãos e outros alimentos com aflatoxinas sempre foi tratada como um problema do armazenamento, com crenças de que a fonte de inóculo seria o próprio armazém. Durante o armazenamento, o crescimento do fungo depende quase que exclusivamente da umidade do substrato, em equilíbrio com a umidade relativa do ar de 85 a 95%. A temperatura determina a velocidade de crescimento do fungo nos substratos de grãos, nozes e rações, e é considerada ótima entre 30 e 35ºC. Secando-se os produtos rapidamente e mantendo-os a baixa umidade (aw 0,75), previne-se a formação de aflatoxinas, que são particularmente importantes em milho, amendoim e algodão. Em produtos com umidade acima de aw 0,85, em armazéns, pode ocorrer a contaminação com aflatoxinas em trigo, cevada, soja, feijão e outros (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). As duas espécies mais importantes de Aspergillus, produtoras de aflatoxinas, são morfologicamente muito relacionadas, tanto que a maioria dos autores não as diferenciam. No entanto, o comportamento ecológico e biológico das duas é bem distinto. A. parasiticus parece ser bem adaptado ao ambiente terrestre, por isso é mais comum em amendoim e A. flavus, por outro lado, é mais adaptado ao ambiente aéreo e é dominante em milho, algodão, arroz e nozes. Enquanto a maioria das cepas de A. parasiticus produz todas as quatro formas de aflatoxinas, as de A. flavus só produz as aflatoxinas B1 e B2 (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). No amendoim, o inóculo aéreo tem pouca importância, porque a maior parte da infecção ocorre nos frutos subterrâneos, embora a infecção, via flor, não possa ser subestimada. A. parasiticus esporula abundantemente em restos culturais e as
populações fúngicas são mais altas nos fragmentos de matéria orgânica que no solo livre (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Na geocarposfera foram detectados 165 ufc/g de solo com restos culturais de centeio e apenas 18 ufc/g ou menos, de solo onde não havia restos da cultura de centeio (GRIFFIN & GARREN, 1976). Segundo WELLS & KREUTZER (1972), flores de amendoim inoculados com uma suspensão de conídios de A. flavus foram prontamente colonizadas pelo fungo sem dano aparente para o desenvolvimento de óvulos. Sob condições favoráveis de campo, o fungo pode colonizar flores de amendoim sem causar sintomas durante o período de florada, permanecendo saudável até a colheita.
Conídios produzidos nas anteras, formam o inóculo secundário que podem infectar outras flores. Além disto, partes das flores de amendoim, que dificultam a polinização cruzada, pois nesta cultura ocorre 98% de auto-polinização, também dificultam a contaminação do estigma. Contudo alguns insetos podem possibilitar esta contaminação. A temperatura pode influenciar na infecção da flor, sendo que solos com temperatura mais elevada favorecem a germinação de esporos pela necessidade maior também de irrigação, enquanto que solos com temperatura baixa não predispõem a esta infecção (SANDERS et al., 1984). O amendoim é uma cultura agrícola única, cuja flor é fertilizada no ambiente aéreo e, pelo alongamento do ginóforo, o embrião é empurrado para baixo da superfície do solo. Assim o fruto (geocarpo) desenvolve-se no ambiente subterrâneo, em contato com microrganismos e sujeito a sua invasão. A colonização de sementes de amendoim, no campo, também segue características básicas, similares ao milho. A infecção de sementes pode ocorrer via sistêmica, através da flor e, diretamente, via parede de frutos. Parece, contudo, que a infecção direta é a mais importante, em termos práticos. Apesar das altas populações de A. flavus encontradas em campos de amendoim e em paredes de geocarpos em desenvolvimento, a infecção de sementes e produção de aflatoxinas é relativamente baixa, a não ser em condições adversas ou quando os frutos são danificados por insetos ou apresentem rachaduras causadas por mudanças rápidas na umidade do solo (HORN et al., 1994; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Estudos mostraram que os frutos não danificados também podem estar colonizados por A. flavus e conter aflatoxinas, embora em menor quantidade, desde que se desenvolva em condições ambientais propícias (MEHAN et al., 1991). A abundante esporulação do fungo nas anteras pode estar associada aos insetos, transportando de flor a flor o inóculo (GRIFFIN & GARREN, 1976b). Os pegs aéreos de plantas de amendoim, crescidos sob condições gnotobióticas (barreira sintética), após inoculação das flores com conídios de A. flavus, foram realmente colonizados pelo fungo sem aparente danos ao desenvolvimento do embrião. O fungo isolado de superfícies dos pegs anteriormente esterilizadas com HgCl2 a 0,1% por um minuto, desenvolveu-se em todos os estágios de maturação da vagem (WELLS & KREUTZER, 1972). A invasão direta durante o desenvolvimento de frutos de amendoim por A. flavus no solo na região da geocarposfera, na fase de pré-colheita, tem sido, geralmente, aceita como o provável caminho para a eventual contaminação dos grãos com aflatoxina, após a penetração da barreira oferecida pelo pericarpo. Contudo, A. flavus pode estar presente no desenvolvimento do ovário de amendoim na extremidade do peg antes dele ser impelido para o interior do solo (DIENER et al., 1987). 1.2.2. Em milho Como muitos dos estudos realizados sobre o mecanismo de infecção e disseminação do grupo Aspergillus flavus, bem como o da produção de aflatoxinas foram realizados com a cultura do milho, é fundamental fazer algumas citações que podem ser importantes também para a cultura do amendoim.
ANDERSON et al. (1975) demonstraram que a contaminação dos grãos de milho ocorreu no campo, antes da colheita, indo depois para os armazéns infestados com A. flavus, sendo o mesmo também demonstrado por USHA et al. (1993), para arroz. No sul e sudeste dos Estados Unidos, o problema das aflatoxinas é crônico. Entretanto, no cinturão de milho do meio-oeste daquele país, a incidência de grãos com aflatoxinas é esporádica, ocorrendo só em anos em que há altas temperaturas e poucas chuvas na época de desenvolvimento destes grãos (LILLEHOJ et al., 1975; HESSELTINE & BOTHAST, 1977), o que foi também observado por JONES & DUNCAN (1979) e HOLTMEYER & WALLIN (1980, 1981), com relação à irrigação. Para estes autores, nos Estados Unidos, a concentração de conídios de Aspergillus flavus no ar, em parcelas não irrigadas, foi quase o dobro da observada em parcelas irrigadas e dos propágulos capturados, 65% mostraram ser produtores de aflatoxinas. No Brasil, de acordo com DHINGRA & COELHO NETTO (1998) não há estudos.
Sementes de milho contaminadas por A. flavus, quando semeadas, transmitem o fungo para a próxima geração. As hifas originárias de conídios presentes na superfície de sementes (ou entre os cotilédones) em germinação, invadem as plântulas em emergência, via estômatos e também pela cutícula aparentemente intacta em colonização sistêmica, porém sem causar sintomas na planta. O fungo pode ser detectado em todas as partes da planta de milho, inclusive na inflorescência e nas sementes originárias das novas plantas (MYCOCK et al., 1990, 1992).
1.3 Micotoxinas
São metabólitos secundários produzidos por alguns fungos, que são liberados ou não nos substratos nos quais eles crescem e que causam doenças (micotoxicoses) quando ingeridos em alimentos contaminados (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998).
Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Phomopsis, Pithomyces e Acremonium, produzem mais de 300 micotoxinas nos substratos que colonizam. Com relação aos grãos, as aflatoxinas, fumonisinas, zearalenona e deoxinivalenol (vomitoxina), são mais freqüentes e importantes (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Aflatoxina é um termo coletivo para um grupo de toxinas produzidas por algumas cepas de A. flavus e A. parasiticus, durante seu crescimento em substrato favorável à sua produção. Todas as formas de aflatoxinas são compostos heterocíclicos altamente oxigenados e têm um núcleo de cumarina fundida com bifurano e contém um anel pentenona ou uma lactona. As duas principais formas de aflatoxinas, B e G (blue e green), caracterizadas e visualizadas pela cor da sua fluorescência em UVP (ultravioleta próximo), são subclassificadas como B1, B2, G1 e G2, de acordo com a cor e seqüência da localização no cromatograma de camada delgada. A pequena diferença estrutural entre elas é responsável por altíssima diferença, na toxidez de cada uma, sendo aflatoxina B1 a mais tóxica e a mais comum de todas. As aflatoxinas estão classificadas entre os mais tóxicos compostos naturais, de ocorrência comum, aos quais o homem e os animais estão expostos (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Em estudos detalhados sobre dose-resposta foi observado que aflatoxina B1 é o mais potente agente carcinogênico natural conhecido, tendo sido encontrado resultados mais graves em ratos machos do que em fêmeas. Foi observado também que a aflatoxina G1 é potencialmente da mesma magnitude que B1 (WOGAN et al., 1967; BUTLER et al., 1969). Elas causam morte e outros sintomas de toxicidade quando rações ou alimentos contaminados são ingeridos por animais e humanos, respectivamente (DIENER et al., 1987). A dose única letal, por quilo de peso corporal, de aflatoxinas B1 e G1 foi de 0,73 mg e 1,18 mg para
patinhos de um dia, respectivamente, e 1,16 mg e 2,0 a 4,0 mg para ratos, respectivamente. Já as aflatoxinas B2 e G2 foram menos potentes em patinhos (1,76 mg e 2,83 mg respectivamente) além de não serem tóxicas para ratos na dosagem de 200,0 mg/kg de peso corporal. As formas B2, G1 e G2 também são carcinogênicas, mas com menor potência. Todas as aflatoxinas têm efeito carcinogênico, teratogênico, mutagênico e imunossupressor (BUTLER et al., 1969; WOGAN et al., 1971).
Estudos feitos nas Filipinas evidenciam também o aumento de câncer primário de fígado, pela ingestão de alimentos contaminados com aflatoxinas associadas ao consumo de bebidas alcoólicas (CARLBORG, 1979; BULATAO- JAYME et al., 1982). A suscetibilidade às aflatoxinas depende não só da espécie, mas também do sexo, da raça, da idade, da atividade hormonal e do estado nutricional (HAYES, 1978; CIEGLER, 1975). Em animais lactantes, parte da toxina é liberada no leite, entre 12 e 24 horas após a ingestão de alimentos contaminados e continua até 3 a 4 dias após esta ingestão, quando atinge seu máximo, se estabiliza até o 14° dia e em seguida apresenta apenas traços (POLAN et al., 1974). A aflatoxina B1, após ingerida na ração, é convertida no metabólito tóxico que vai se expressar através do leite como M1 (milk). Sua toxidez, no entanto, não se altera significativamente pois 0,02 mg de B1/kg de ração ingerida vai expressar 0,07 µg de M1 /L de leite bovino (HAYES, 1978). A maior parte das informações sobre ecologia e biologia de Aspergillus flavus e A. parasiticus e sobre os fatores determinantes da colonização de grãos e acúmulo de aflatoxinas, foi gerada no sul e sudeste dos Estados Unidos, onde os problemas de aflatoxinas é crônico (DHINGRA & COELHO NETO, 1998). A contaminação dos grãos com aflatoxinas na pré-colheita parece ser significativa nos Estados Unidos, principalmente em amendoim, milho e sementes de algodão, embora a contaminação possa ocorrer em qualquer cultura que não tenha sido seca adequadamente após a colheita (DIENER et al., 1987). A poeira durante a colheita, trilha, ensacamento, limpeza, armazenamento e processamento de grãos contaminados também pode contaminar o ser humano. As doses subletais ingeridas diariamente pelos seres humanos em várias regiões do mundo vêem fazendo vítimas silenciosamente. A falta de informação se deve, principalmente, à pobreza, indisponibilidade e despreparo de médicos, falta de laboratórios para análise de sangue, urina e alimentos e ao desinteresse das agências governamentais (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). 1.4 Influência de Fatores do Ambiente na Colonização de Grãos e Formação de Aflatoxinas 1.4.1 Fungos do grupo Aspergillus flavus A. flavus é um fungo mesofílico, com ótimo de temperatura para crescimento entre 35 e 38ºC, mínimo entre 8 e 15ºC e máximo entre 40 e 45ºC. Desde que haja presença de inóculo, em quantidade suficiente na época mais suscetível, altas temperaturas e estresse hídrico são os dois fatores primordiais para colonização e formação de aflatoxinas nos grãos em pré-colheita (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). SCHINDLER et al. (1967), testando a influência da temperatura no desenvolvimento de duas estirpes de Aspergillus flavus em meio Wort e a produção de aflatoxina, observaram que não houve produção de aflatoxina sob temperaturas de 2, 7, 41, 46 e 52ºC e concluíram que se a produção desta toxina em alimentos, rações e outros produtos é semelhante à produção em meio Wort, pode ser possível evitar contaminação de aflatoxina nestes produtos sob temperaturas seguras. Estes autores afirmaram ainda que quando são feitos estudos da influência das condições ambientais no crescimento do fungo e na produção de aflatoxinas, ocorrem divergências de resultados entre os diferentes autores e isto se deve provavelmente à variabilidade genética dos isolados
trabalhados ou ao tempo utilizado na experiência. Assim, um isolado que não produziu aflatoxina sob altas temperaturas por cinco dias, quando submetido às mesmas condições por 12 semanas produziu, o que indica que aquela aflatoxina pode ser recuperada depois de 6 semanas, pois o fungo passa a produzi-la. A descrição dos fungos deste grupo se baseou na classificação segundo SINGH et al. (1991), como se segue: Classe: Deuteromycotina; Ordem: Hyphomycetes (Moniliales); Família: Moniliaceae; Gênero: Aspergillus; Espécies: Aspergillus flavus Link [Diâmetro da colônia: 4,0 a 4,5cm; Anverso: verde-amarelado; Reverso: creme-amarelado; Cabeça: radiada, tornando-se imprecisamente colunar com o tempo (idade); Estipe: longa, verrugosa, hialina; Vesícula: em forma de abóbada, fértil na superfície inteira; Métula: presente, pequena; Fiálides: pequenas, ampuliforme; Conídio: globoso a subgloboso, usualmente rugoso, verde-amarelado; Micotoxinas: aflatoxinas B1 e B2] e Aspergillus parasiticus Speare [Diâmetro da colônia: 3,2 a 3,5cm; Anverso: verde-amarelado tornando-se verde escuro com o tempo; Reverso: creme-amarelado; Cabeça: radiada; Estipe: longa, rugosa; Vesícula: globosa, fértil na superfície inteira; Métula: poucas ou ausente; Fiálides: ampuliforme com longo, extenso pescoço; Conídio: globoso, muito rugoso, mostrando freqüentemente tecido conectivo. Esverdeado; Micotoxinas: aflatoxinas B1, B2, G1 e G2]. 1.4.2 Em amendoim A temperatura e a umidade do ar parecem ter papel independente na produção de aflatoxinas em milho, cuja infecção ocorre no ambiente aéreo. No caso do amendoim, os dois fatores agem conjuntamente. Em grãos de amendoim não danificados, nem a seca nem a alta temperatura sozinhos estimulam a colonização de grãos e, a subseqüente, acumulação de aflatoxinas (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Em condições de seca, o limite de temperatura na geocarposfera, para formação de aflatoxinas, situa-se entre 25 e 28ºC, e uma redução nesta região, de 29,6 para 25,2ºC resulta em não formação de aflatoxinas. A colonização de grãos é inversamente proporcional à maturidade dos grãos, sendo maior nos grãos cultivados em temperaturas elevadas sob condição de seca. Embora, em condição de irrigação, os grãos continuem sem o acúmulo de aflatoxinas. No campo, em condição de seca natural, temperatura do solo de 44,6ºC, tem sido encontradas entre fileiras, sem que haja formação de aflatoxinas, ainda que o fungo cresça nessa temperatura (HILL et al., 1983). O limiar para formação de aflatoxinas fica entre 30 e 40 dias de seca antes da colheita. Esses resultados corroboram com dezenas de observações de campo, onde concentrações de aflatoxinas são mais altas nos anos secos. Postula-se que, nas condições de seca, alta colonização de vagens pode estar relacionada à eliminação de competidores, como Aspergillus niger, que compete com sucesso com A. flavus em condições de altas temperatura e umidade do solo (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Outra possível influência da umidade reduzida está na diminuição no metabolismo dos grãos, aumentando sua suscetibilidade à infecção e a colonização (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Foi também associada a colonização de grãos de amendoim, nas condições de seca, à capacidade de síntese de fitoalexinas, porque estas não foram sintetizadas quando a aw caiu abaixo de 0,95 (DORNER et al., 1989). O conteúdo de água do grão parece ser o fator mais importante no controle da capacidade de produzir fitoalexinas, nos grãos imaturos de amendoim. Esse mecanismo natural de resistência à colonização é quebrado sob estresse hídrico (DIENER et al., 1987; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Outrossim PITT et al. (1991) observaram forte evidência de que A. flavus e A. parasiticus podem invadir sistematicamente plantas de amendoim pelo solo e sementes contaminadas. Plantas crescidas em solos inoculados com A. parasiticus mostraram invasão de 40 a 76% por A. flavus, em valores crescentes, das raízes até o ápice do
caule. A explicação dada foi de que provavelmente o fungo penetrou através de cicatrizes nos cotilédones pois as sementes originárias apresentaram somente 1 a 4% de invasão. 1.5. Controle da Colonização e Subseqüente Aflatoxinas
Para SCHINDLER et al. (1967), a temperatura que freqüentemente é recomendada para a secagem artificial do amendoim favorece o desenvolvimento de Aspergillus flavus. Porém esta temperatura pode não coincidir com aquela que é favorável para produção de aflatoxina. Desta forma os autores concluíram que a produção de aflatoxina não está relacionada com o crescimento de A. flavus.
Já, AZAIZEH et al. (1990) obtiveram extratos metanólicos de tegumentos e cotilédones de sementes de vinte e três genótipos de amendoim e após filtragem e secagem, diluíram o tanino existente no resíduo com água destilada em diferentes concentrações e adicionaram ao meio YES. Posteriormente, foi feita a infestação de Aspergillus parasiticus e verificaram o efeito deste tratamento sobre o crescimento micelial do fungo e a produção de aflatoxinas. Os autores concluíram que alguns destes extratos inibiram significativamente o crescimento do fungo e reduziram os níveis de aflatoxinas produzidas.
Também MEHAN et al. (1991) têm constatado que o tipo de solo pode interferir na infecção de grãos por A. flavus e na contaminação por aflatoxina .
Ainda DORNER et al. (1992), infestando solo com uma estirpe de Aspergillus parasiticus NRRL 13539 não produtora de aflatoxina e avaliando a atividade biocompetidora deste agente durante os anos de 1987, 1988 e 1989 no controle de estirpes produtoras de aflatoxina em pós colheita de amendoim, concluíram que os solos tratados não apresentaram altas populações de Aspergillus flavus e A. parasiticus e que isto foi uma importante consideração ecológica relativa para a utilização deste sistema de biocontrole.
Para MAZZANI & LAYRISSE, (1992) ensaios desenvolvidos com oito genótipos de amendoim não apresentaram resultados significativos quanto à resistência a Aspergillus flavus com relação à variação ambiental (irrigado, estresse hídrico e em condições de chuva). Já, PRADO et al. (1999), avaliando a resistência de quatro genótipos de amendoim (Tatu, VRR-247, 2117 e 2155) quanto a produção de aflatoxina B1, após inoculação com Aspergillus flavus, observaram comportamentos diferentes entre eles, sendo que o genótipo 2117 apresentou menores níveis de contaminação, sugerindo maior resistência à infecção pelo fungo e, ou à produção de aflatoxina. Os autores concluíram ainda, que além da necessidade do conhecimento dos mecanismos indutores da resistência, é necessário conhecer melhor as variações de interação genótipos x estirpes do patógeno, do seu potencial toxigênico, do processo de inoculação e das condições de cultivo e colheita.
Entretanto REDING et al. (1993), inoculando conídios de Aspergillus parasiticus, verificaram menor produção de aflatoxina em grãos de amendoim provenientes de plantas que se desenvolveram em solo que foi suplementado com gesso, em comparação às sementes provenientes de plantas provenientes do tratamento controle. Estes autores verificaram, ainda, diminuição da biomassa de fungos, a qual correlacionou-se com a diminuição da biosíntese de aflatoxina. Também, CLAVERO et al. (1994), ao inocularem grãos de amendoim com conídios de Aspergillus spp., verificaram que a produção de toxinas foi maior naquelas colhidas a partir de plantas que receberam apenas 2,00 kg/ha de cálcio e, que houve redução de 50% na produção de toxina quando a concentração de cálcio foi aumentada para 4,4 kg/ha.
Já, SANTURIO et al. (1994), avaliando, in vitro, a capacidade de adsorsão de bentonitas e aluminosilicatos à aflatoxina (utilizando aflatoxina B1 com pureza de 99%-
Sigma Chemical Company), obtiveram resultados acima de 72% com aluminosilicato de sódio e cálcio hidratado, bentonita sódica e bentonita sódica natural.
Contudo PATKAR et al. (1995), tratando grãos de arroz, sorgo e amendoim com ácido propiônico em diferentes concentrações, concluíram que esta substância pode ser alternativa para controlar fungos de armazenamento. Entretanto, quando aplicado em material a ser utilizado como semente, provoca queda de germinação com o período de estocagem.
Por outro lado, PRADO et al. (1995), trabalhando com sementes de amendoim da cultivar Tatu vermelho tratadas com sais de alumínio, ferro, zinco e níquel em diferentes concentrações, inoculadas com Aspergillus flavus NRRL 6513, incubadas por sete dias e analisadas quanto a produção de aflatoxina B1, observaram que alumínio, ferro e zinco inibiram a produção de aflatoxina B1 em todas as concentrações e que o níquel estimulou, a 4µg/g e inibiu a 1,0 e 2,0µg/g. Os autores sugeriram que a utilização de solos ou de genótipos com elevados teores de alumínio, ferro e zinco, pode contribuir para menor contaminação por aflatoxinas.
As áreas de amendoim, submetidas a irrigação abundante, apresentaram baixa infecção por A. flavus quando comparados com aquelas submetidas à estresse hídrico (NAHDI, 1996).
Finalmente, ZOVICO et al. (1999) buscando detectar a presença de aflatoxina, por seleção eletrônica pela cor, em amendoim descascado, com o objetivo de melhorar a qualidade de lotes quanto à diminuição da contaminação por aflatoxinas, avaliaram 42 lotes comerciais de 300kg sabidamente contaminados com aflatoxinas. A seleção eletrônica separou grãos considerados sadios e rejeitou os contaminados. Após amostragem e avaliação dos dois grupos, verificaram que somente em três lotes não foram detectadas aflatoxinas. Não houve assim melhora nos níveis iniciais de aflatoxinas, indicando que a distribuição das mesmas estava generalizada pois os grãos selecionados também estavam contaminados. 1.6. Ação de Fungos na Deterioração de Sementes
As sementes de amendoim durante o beneficiamento mecânico, podem sofrer ferimento, tornando estas sementes mais vulneráveis à rápida perda de viabilidade, dependendo da umidade das sementes e da temperatura de armazenamento (RAO et al., 1996). Os fungos mais comuns associados às sementes de amendoim são: Aspergillus spp., Penicillium spp, Rhyzopus spp., Fusarium spp., Macrophomina phaseolina, Botrytis cinérea, Chaetomium spp, Rizoctonia solani, Sclerotium rolfssi e Phomopsis spp. (MORAES & MARIOTO, 1985, sendo que, Aspergillus spp. e Penicillium spp. são os mais freqüentes (NAKAMURA & NISHIMURA, 1974; LIMA & ARAÚJO, 1999; USBERTI & AMARAL, 1999, VANZOLINI et al., 2000) e são os principais causadores da deteriorização de sementes de amendoim (RAO et al., 1996; LIMA & ARAÚJO 1999). Entretanto HALLOIN (1975) e TANAKA & CORRÊA (1981), estudando a influência de Aspergillus flavus, A.niger e Rhizopus spp. na deterioração de sementes de algodão, inoculadas com estes fungos, observaram que Aspergillus spp. reduz a germinação e o vigor destas sementes mais rápido que Rhyzopus spp., sendo que este último também afeta as sementes durante o processo de germinação. Os fungos de maior incidência são Aspergillus spp., Penicillium spp. e Rhizopus spp. (FERNANDEZ et al., 1997; USBERTI & AMARAL, 1999). Espécies de Aspergillus dos grupos Aspergillus flavus e Aspergillus niger, tem causado decréscimo de germinação, devido à deterioração das sementes (McLEAN et al., 1984) e, assim como Penicillium spp., tem promovido lesões nas plântulas, levando ao menor desenvolvimento desta (BACKMAN & HAMMOND, 1976; ITO et al., 1992).). LIMA
& ARAÚJO (1999) constataram que Rhizopus spp. causa tombamento de pré e de pós-emergência. Estes fungos podem contaminar e infectar as sementes de amendoim no campo (ROSSETTO et al., 2003).
1.7. Uso de Extratos de Plantas Medicinais para Controle 1.7.1. De Aspergillus flavus em grãos
A eficácia do uso de extratos de cebola (Allium cepa L.) e de alho (Allium sativum L.) além de eugenol foi testada por BILGRAMI et al. (1992) em grãos de milho contra a produção de aflatoxina por A. flavus. Estes autores verificaram redução do crescimento micelial em até 61,94% com extrato de alho, e redução da produção de aflatoxina em até 60,44% devido ao extrato de cebola e de 60,35% pelo eugenol, acompanhando a redução do crescimento micelial do fungo..
Para PASTER et al., (1995) os grãos de trigo tratados por 24 horas com os óleos essenciais de orégano (Origanum vulgare L.) e tomilho (Thymus vulgaris L.) apresentaram inibição no crescimento de Aspergillus spp. com 2,0 µL/litro e 4,0 µL/litro, respectivamente. Entretanto, ao ser mantida a exposição dos grãos aos óleos por mais de 24 horas, houve redução na capacidade germinativa proporcional ao tempo de exposição, o que inviabiliza sua utilização em sementes nestas condições. 1.7.2. De Aspergillus flavus em sementes Foi conseguido por BANSAL & SOBTI (1990) resultado promisssor com o uso de extrato de folha de neem (Azadirachta indica A. Juss) no controle de Aspergillus niger e A. flavus em sementes de amendoim, não diferindo dos resultados obtidos com thiran e mancozeb, além de favorecerem a germinação e a sanidade de plântulas e reduzir a porcentagem de sementes deterioradas.
Foi verificado por FERRACINI et al. (1990) que extratos de ambrósia (Chenopodium ambrosioides L.), Cimaba cedron P., aruba (Simarouba amara Aubl.), quássia (Quassia spp.), Pterocaulon balansae e cinamomo (Melia azedarach L.) inibiram, in vitro, os fungos Fusarium solani f. sp. phaseoli, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfisii, e que a incorporação de folhas de C. ambrosioides no solo promoveu o controle do tombamento de plântulas de feijoeiro causado por R. solani.
Já MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a atividade fungitóxica de uma série de óleos essenciais, extraídos por meio de hidrodestilação de folhas de capim limão [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.], erva de São João (Ageratum conizoides L.), limão Tahiti [Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle], junípero comum (Juniperus communis L.), cânhamo-agrimônia (Eupatorium cannabium L.), alfavacão [Hyptis suaveloens (L.) Poit], hortelã comum (Mentha viridis L.), pinheiro (Pinus spp.) e alpinia (Alpinia carinata Val), de talos de insenso frances (Boswellia serrata Roxb.), de cascas de tangerina (Citrus reticulata Blanco) e laranaja (Citrus sinensis Osbeck), de rizoma de açafrão (Curcuma longa L.), e de raiz de vetiver [Vetiveria zizanioides (L.) Nash], sobre Aspergillus flavus. Para os autores, C. citratus apresentou atividade positiva à Concentração Máxima de Inibição (CMI) de 3.000 ppm. A técnica utilizada foi a de discos de micélio, em meio BDA. Em testes de fitotoxicidade do citral, substância presente em maior concentração no óleo essencial de C. citratus, não foi observado efeito sobre a germinação de sementes e crescimento das plântulas de trigo e arroz. Estes autores testaram ainda a atividade fungitóxica do citral sobre várias espécies de Penicillium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus e Botrytis, nas concentrações de 500ppm (hipotóxica), de 1000ppm (tóxica) e de 1500ppm (hipertóxica) e concluíram que houve total inibição de crescimento fúngico somente com a concentração hipertóxica. Entretanto para Aspergillus parasiticus, a concentração hipotóxica promoveu total inibição do fungo.
Foi verificado por ADEGOKE & ODESOLA (1996) que sementes de feijão e de milho tratadas com óleo essencial ou com o pó do capim limão e armazenadas por 10 dias, não apresentaram deterioração física, alteração no odor e na coloração, assim como crescimento de Aspergillus flavus, enquanto o mesmo não foi observado na amostra controle (não tratadas).
Para MONTES-BELMONT & CARVAJAL, 1998) os óleos essenciais de onze plantas foram estudados para controle de A. flavus em milho, tendo sido alcançada a inibição total de desenvolvimento do fungo por canela (Cinnamomum zelanicum Breyn.), hortelã (Mentha piperita L.), manjericão (Ocimum basilicum L.), orégano (Origanum vulgare L.), Teloxys ambrosioides, cravo da Índia [Syzygium aromaticum (L.) Norril.] e tomilho (Thymus vulgaris L.), além de não haver efeito fitotóxico na germinação e desenvolvimento das plântulas. 1.7.3 – De outros fungos
Através de experimento in vitro, BOLKAN & RIBEIRO (1981) conseguiram redução do crescimento micelial de 66,9, 76,3 e 37,6% em Rhizoctonia solani Kuhn, em Fusarium moniliforme var. subglutinans Wr. & Reink e em Cylindrocladium clavatum Rodges & May, respectivamente, usando extrato de bulbo de alho (Allium sativum L.) a 5.000 ppm.
Foram conduzidos por CHALFOUN & CARVALHO (1987) dois ensaios com extrato de bulbo de alho, obtido por trituração, prensagem e filtração, e com óleo industrial de bulbo de alho (Allium sativum L.), obtido por prensagem a frio com óleo de soja, para controle de Gibberella zeae (Schw.), de Alternaria zinniae Pape e de Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. Os autores verificaram a eficiência do extrato e do óleo industrial de alho no controle destes fungos, variando de 85 – 100% de inibição.
Também BASTOS (1992) obteve completa inibição do crescimento micelial de Crinipellis peniciosa e de Phytophthora palmivora em meio BDA acrescido de 10.000ppm de extrato de bulbo de alho (A. sativum L.). Também BARROS et al. (1995), utilizando extrato de bulbo de alho (A. sativum L.) acrescido ao meio BDA, observaram redução significativa no crescimento micelial dos fungos Curvularia spp. e Alternaria spp., embora não tenha afetado a germinação dos conídios destes fungos. Além disto, BASTOS (1997), utilizando o óleo de folhas de aperta-ruão (Piper aduncum L.) extraído por destilação a vapor e posteriormente suspenso em água destilada, obteve 100% de inibição na germinação dos basidiósporos do fungo e total inibição do crescimento micelial de Crinipellis perniciosa.
Porém WILSON et al. (1997), avaliando a atividade fungitóxica dos extratos de 347 plantas, obtidos por fragmentação dos tecidos e coleta e filtragem do fluído liberado, e de 49 óleos essenciais obtidos por destilação ou escarificação, concluíram que 13 extratos mostraram altos níveis de atividade antifúngica sobre Botrytis cinérea, predominando entre eles os das plantas dos gêneros Allium e Capsicum. Dos óleos essenciais, Cymbopogon martini, Thymus zygis, Cinnamomum zeilanicum Breyn. e Eugenia caryophyllata, demonstraram a maior atividade antifúngica sobre aquele fungo. Os constituintes mais freqüentes nestes óleos essenciais que mostraram alta atividade antifúngica foram: �-mirceno, �-pineno, �-pineno e cânfora.
Foi observado por RIBEIRO & BEDENDO (1999) efeito inibitório no crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporiodes, cultivado em meio BDA, através de extratos aquosos de alho (Alluim sativum L.), hortelã (Mentha piperita L.), mamona (Ricinus communis L.) e pimenta (Capsicum sp.) nas concentrações a partir de 200 ppm, sendo que o extrato de alho inibiu significativamente o crescimento de micélio porém não reduziu a produção de esporos. Por outro lado, os demais extratos promoveram redução do desenvolvimento de micélio e da esporulação do patógeno.
O extrato bruto e sumo de algumas plantas medicinais foi testado por FEITOSA et al. (2000) sobre fungos cultivados em meio BDA, obtiveram 85% de eficiência sobre Cladosporium gloeosporioides com o sumo de babosa (Aloe vera L.) a 15%. Também a aplicação de tintura de juá (Ziziphus joazeiro Mart) a 20% reduziu em 62% o crescimento de Lasiodiplodia theobromae e a de extrato bruto de moringa (Moringa oleifera Lam.) reduziu em 87% o crescimento de Macrophomina phaseolina.
Experimento conducido por FRANZENER et al. (2000), em meio BDA acrescido de extratos aquoso e alcoólico, permitiu que estes autores observassem reduções de 9 a 39% e de 45 a 76% no crescimento micelial de Bipolaris sorokiniana em presença dos extratos, tanto aquoso quanto alcoólico, de cânfora (Artemísia camphorata Vill.) e de ginseng brasileiro [Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen], respectivamente, sendo que o extrato aquoso de A. camphorata a 10% inibiu completamente a esporulação do fungo. Além disso, também houve indução para a síntese de fitoalexinas.
Porém MORAIS (2000), avaliando a ação, in vitro, de 45 extratos de plantas sobre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, obteve apenas atividade fungistática de óleo de copaíba (Copaifera spp.) e de óleo de sucupira (Pterodon ermaginatus Vogel).
Entretanto PEREIRA et al. (2000) obtiveram inibição de 100% na germinação de conídios de Colletotrichum gloeosporiodes e de Fusarium oxysporum f.sp. cubensis utilizando extratos alcoólicos de abiu, cajú e pau-de-balsa. Estes mesmos autores conseguiram redução significativa no crescimento micelial de Sclerotium rolfsii cultivado em meio BDA, com o emprego de extrato aquoso de carambola, de morototó e de ingá-vermelho, assim como redução na produção de escleródios com sororoca, breu-branco e seringueira.
Assim também DINIZ et al. (2000) obtiveram inibição do crescimento de Sclerotinia minor, cultivado em meio de aveia, com aplicação de óleos de tomilho (Thymus vulgaris L.), de estragão (Artemísia draconculus ), de manjericão roxo (Ocimum basilicum L.), de manjerona (Origanum majorana L.) e de menta citrata (Menta piperita var. citrata).
Ao ser estudado por NICOMEDES JUNIOR et al. (2000), o efeito fungitóxico do extrato bruto de alho (A. sativum L.) sobre o crescimento micelial de Fusarium oxysporum, de Rhizoctonia solani e de Sclerotium rolfsii, cultivados em meio BDA, os autores observaram inibição significativa do crescimento micelial destes fungos, sendo que os halos produzidos na concentração de 50% para F. oxysporum e S. rolfsii foi superior ao do fungicida. Posteriormente, os autores trataram plantas de tomateiro, conduzidas em vasos, previamente inoculados com Fusarium sp. e Sclerotium sp. e observaram significativo aumento da massa de folhas frescas e dos teores de aminoácidos livres, açúcares livres e amônio nas folhas.
Também KE-QIANG & BRUGGEN (2001) obtiveram in vitro inibição total na germinação de esporângios e zooporos de Phytophthora infestans com a utilização de extratos de bulbos de alho (Allium sativum L.), cortados em pequenos pedaços, macerado em água, filtrado a vácuo e preparado em diferentes concentrações, não diferindo da ação do fungicida convencional.
Assim como SOUZA et al. (2002) constataram que os extratos metanólicos (2,5% p/v) de erva-cidreira [Lippia alba (Mill) N.E. Brown] e de funcho (Foeniculum vulgare Mill) apresentaram diminuição significativa no crescimento micelial dos fungos Sclerotium sp.e Fusarium sp. (efeito fungistático) cultivados em meio BDA.
1.8 Objetivos Gerais
a) Avaliar o desenvolvimento de fungos e espécies do grupo Aspergillus flavus e a subseqüente biosíntese de aflatoxina em grãos de amendoim, provenientes de plantas
que cresceram na presença ou ausência de calagem, que foram colhidas em distintas épocas e secas em estufa e ambiente, em dois cultivos (águas e da seca);
b) Analisar a ação de óleos essenciais de plantas medicinais sobre espécies do grupo Aspergillus flavus isolados do grão, da vagem e do solo;
c) Verificar a qualidade das sementes de amendoim submetidas ao tratamento com óleos essenciais e pós provenientes de plantas medicinais.
1.9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADEGOKE, G.O. & ODESOLA, B.A. Storage of maize and cowpea and inhibition of microbial agentes of biodeterioration using the powder and essential oil of lemon grass (Cymbopogon citratus). International Biodeterioration and Biodegradation, Essex, v. 37, n.1/2, p. 81-84, 1996. AMER, M.; TAHA, M.; TOSSON, Z. The effect of aqueous garlic extract on the growth of dermatophytes. International Journal of Dermatology, Filadelfia, v. 19, p. 285-287, 1980. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. AZAIZEH, H.A.; PETTIT, R.E.; SARR, B.A.; PHILLIPS, T.D. Effect of peanut tannin extracts on growth of Aspergillus parasiticus and aflatoxin production. Mycopathologia, Dordrecht, v. 110, p. 125-132, 1990. BACKMAN, P.A. & HAMMOND, J.M. Germination losses associated with delayed application of seed treatment fungicides after peanut shelling. Plant Disease Reporter, Beltsville, v. 60, n. 1, p. 1-3, 1976. BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Na economic remedy for the control of two species of Aspergillus on groundnut. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 43, p. 451-452, 1990. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, L.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinação de conídios de Curvularia spp. e Alternaria spp. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BASTOS, C.N. Inibição do crescimento micelial e germinação de esporos de Crinipellis perniciosa e Phytophthora palmivora por extrato de bulbo de alho (Allium sativum). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 17, n. 4, p. 454-456, 1992. BASTOS, C.N. Efeito do óleo de Piper aduncum sobre Crinipellis perniciosa e outros fungos fitopatogênicos. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 22, n. 3, p. 441-446, set. 1997.
BILGRAMI, K.S.; SINHA, K.K. & SINHA, A.K. Inhibition of aflatoxin production & growth of Aspergillus flavus by eugenol & onion & garlic extracts. Indian Journal Medical Research, Nova Delhi, v. 96, p. 171-175, 1992. BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; HILL, R.A Effect of geocarposphere temperature on pre-harvest colonization of drought-stressed peanut by Aspergillus flavus and subsequent aflatoxin contamination. Mycopathologia, Dordrecht, v. 85, p. 69-74, 1984. BOLKAN, H.A. & RIBEIRO, W.R.C. Efeito de extrato de alho em Cylindrocladium clavatum, Fusarium moniliforme var. subglutinans e Rhyzoctonia solani. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 6, n. 3, p. 566, out. 1981. BRÜCHER, H. Useful plants of neotropical origin and their wild relatives. London: Springer-Verlag, 1989. BULATAO-JAYME, J.; ALMERO, E.M.; CASTRO, M.C.; JARDELEZA, M.T.R.; SALAMAT, L.A. A case-control dietary study of primary liver cancer risk from aflatoxin exposure. International Journal of Epidemiology, Oxford, v. 11, n. 2, p. 112-119, 1982. BUTLER, W.H.; GREENBLATT, M.; LIJINSKY, W. Carcinogenesis in rats by aflatoxins B1, G1 and B2. Cancer Research, Baltimore, v. 29, p. 2206-2211, 1969. CARLBORG, F.W. Cancer, mathematical models and aflatoxin. Food and Cosmetics Toxicology, Oxford, v. 17, p. 159-166, 1979. CHALFOUN, S.M. & CARVALHO, V.D. de. Efeito do extrato de óleo industrial de alho sobre o desenvolvimento de fungos. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 12, n. 3, p. 234-235, 1987. CIEGLER, A. Mycotoxins: occurrence, chemistry, biological activity. Lloydia, Cincinnati, v. 38, n. 1, p. 21-35, 1975. CLAVERO, M.R.S.; HARRISON, M.A.; HUNG, Y-C. Aspergillus parasiticus NRRL 2667 growth and aflatoxin synthesis as affected by calcium content and initial spore load in single peanuts. Journal of Food Protection, v. 57, n. 5, p. 415-418, 1994. COUTINHO, W.M.; ARAÚJO, E.; MAGALHÃES, F.H.L. Efeitos de extratos de plantas anacardiáceas e dos fungicidas químicos benomyl e captan sobre a micoflora e qualidade fisiológica de sementes de feijoeiro. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.23, n. 3, p. 560-568, 1999. DHINGRA, O.D. & COELHO NETTO.R.A. Micotoxinas em grãos. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 6, p. 49-101, 1998. DIENER, U.L.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; PAYNE, G.A; LEE, L.S.; KLICH, M.A Epidemilogy of aflatoxin formation by Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 25, p. 249-270, 1987.
DINIZ, S.P.S.S.; BONZANINI, F.; BONZANINI, R.; GUIMARÃES, R.M.L.; BUENO, M.A.S. Ocorrência do fungo Esclerotinia em raízes de estévia (Stevia reabaudiana, Bert.) e controle por óleos vegetais. In: Congresso Brasileiro de Fitopatologia, 33, 2000,Belém, Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 25, suplemento, p. 369, ago. 2000. DORNER, J.W.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; BLANKENSHIP, P.D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia, Dordrecht, v. 105, p. 117-128, 1989. DORNER, J.W.; COLE, R.J.; BLANKENSHIP, P.D. Use of a biocompetitive agent to control preharvest aflatoxin in drought stressed peanuts. Journal of Food Protection, Ames, v. 55, n. 11, p. 888-892, 1992. FEITOSA, V.S.; PESSOA, M.N.G.; ALMEIDA, J.L.; SILVA, M.G.V. Efeito da tintura, extrato bruto e sumo de plantas medicinais sobre o crescimento micelial de Coletotrichum gloeosporioides, Lasiodiplodia theobromae e Macrophomina phaseolina “in vitro”. In: Congresso Brasileiro de Fitopatologia, XXXIII, 2000, Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, suplemento, p. 374, ago. 2000. FERNANDEZ, E.M.; ROSOLEM, C.A.; MARINGONI, A.C.; OLIVEIRA, D.M.T. Fungus incidence on peanut grains as affected by drying method and Ca nutrition. Field Crops Research, Amsterdam, v. 52, n. 1, p. 9-15, 1997. FERRACINI, V.L.; MELO, I.S.; FRIGHETO, R.T.S. Influência de Chenopodium ambrosioides L. no crescimento micelial e germinação de escleródios de Sclerotium rolfsii. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 15, n. 2, p. 176, 1990. FRANZENER, G.; VIGO, S.C.; STANGARLIN, J.R.; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.; CRUZ, M.E.S.; FURLAN NETTO, C. Atividades fungitóxica e elicitora de fitoalexinas no extrato aquoso e tintura vegetal de plantas medicinais. In: Congresso Brasileiro de Fitopatologia, XXXIII, 2000, Belém, Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, suplemento, p. 374, ago. 2000. GABRIEL, A.J.A.; LIMA, M.F.F.; SOUZA, M.A.A.; SOUZA, S.R. Germinação de sementes de alface e de duas ervas invasoras com a aplicação de um novo análogo do estrigol, sintetizado a partir do safrol. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 20, n. 4, p. 544-546, 2002. GRIFFIN, G.J. & GARREN, K.H. Colonization of rye green manure and peanut fruit debris by Aspergillus flavus and Aspergillus niger group in field soils. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 32, n. 1, p. 28-32, jul. 1976. HALLOIN, J.M. Postharvest infection of cottonseed by Rhizopus arrhizus, Aspergillus niger and Aspergillus flavus. Phytopathology, Saint Paul, v. 65, n. 11, p. 1229-1232, 1975. HAYES, A.W. Biological activities of mycotoxins. Mycopathologia, Dordrecht, v. 65, p. 29-41, 1978. HESSELTINE, C.W. & BOTHAST, R.J. Mold development in ears or corn from tasseling to harvest. Mycologia, Lawrence, v. 69, p. 328-340, 1977.
HILL, R.A; BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H. Effects of soil moisture and temperature on preharvest invasion of peanuts by the Aspergillus flavus group and subsequent aflatoxin development. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 45, n. 2, p. 628-633, 1983. HOLTMEYER, M.G. & WALLIN, J.R. Identification of aflatoxin-producing atmospheric isolates of Aspergillus flavus. Phytopathology, Saint Paul, v. 70, n. 4, p. 325-327, 1980. HOLTMEYER, M.G. & WALLIN, J.R. Incidence and distribution of airborne spores of Aspergillus flavus in Missouri. Plant Disease, Saint Paul, v. 65, n. 1, p. 58-60, jan. 1981. HORN, B.W.; DORNER, J.W.; GREENE, R.L.; BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J. Effect of Aspergillus parasiticus soil inoculum on invasion of peanut seeds. Mycopathologia, Dordrecht, v. 125, n. 3, p. 179-191, 1994. INSTITUTO DE ECONOMIA AGRÍCOLA, São Paulo, Previsões e Estimativas das Safras Agrícolas por Região, 4º Levantamento, Abril de 2004. Disponível em: http://www.iea.sp.gov.br. Acesso em: 28 jun. 2004. ITO, M.F.; BRACCHI, L.M.A.; MARINGONI, A.C.; MENTEN, J.O.M. Comparação de métodos para detecção de Aspergillus sp. e Penicillium sp. em sementes de amendoim (Arachis hypogaea L.). Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 18, n. 3, p. 262-268, 1992. JONES, R.K. & DUNCAN, H.E. Airborne populations of Aspergillus flavus in irrigated and non-irrigated field corn. Phytopathology, Saint Paul, v. 69, p. 528, 1979. KE-QIANG, CAO & BRUGGEN, H.C. van. Inhibitory efficacy of several plant extracts and plant products on Phytophthora infestans. Journal of Agricultural University of Hebei, Baoding, v. 24, n. 2, p. 90-96, abr. 2001. KUMAR, S. & PRASAD, G. Efficacy of medicinal plant (Andrographis peniculata) extract on aflatoxin production and growth of Aspergillus flavus. Letters in Applied Microbiology, Oxon, v. 15, p. 131-132, 1992. LEDEZMA, E.; SOUSA, L. de; JORQUERA, A.; SANCHEZ, J.; LANDER, A.; RODRIGUEZ, E.; JAIN, M.K.; APITZ-CASTRO, R. Efficacy of ajoene, na organosulphur derived from garlic, in the short-term therapy of tinea pedis. Mycoses, Berlim, v. 39, p. 393-395, 1996. LIMA, E.F. & ARAÚJO, A.E. Fungos causadores de tombamento, transportados e transmitidos através da semente do amendoim. Revista de Oleaginosas e Fibrosas, Campina Grande, v.3, n. 2, p. 71-76, 1999. LILLEHOJ, E.B.; KWOLEK, W.F.; VANDEGRAFT, E.E.; ZUBER, M.S.; CALVERT, O.H.; WIDSTROM, N.; FUTRELL, M.C.; BOCKHOLT, A.J. Aflatoxin production in Aspergillus flavus inoculated eras of corn grown at diverse locations. Crop Science, Madison, v. 15, p. 267-270, 1975.
LOURIA, D.B.; LAVENHAR, M.; KAMINSKI. T.; ENG, H.K. Garlic (Allim sativum) in the treatment of experimental cryptococcosis. Journal of Medical and Veterinary Mycology, Oxforshire, v. 27, p. 253-256, 1989. MAZZANI,C. & LAYRISSE, A. Resistência de campo de genótipos de maní (Arachis hypogaea L.) a la infeccioón de sus semillas por Aspergillus spp. Phytopathologia Mediterranea, Bologna, v. 31, p. 96-102, 1992. McLEAN, M.; DINI, M.; BERJAK, K. Contribution to the characterization of the seed storage fungi: Aspergillus versicolor and Aspergillus wentii. Seed Science & Technology, Zurich, v. 12, n. 2, p. 437-446, 1984. MEHAN, V.K.; MAYEE, C.D.; JAYANTHI, S.; McDONALD, D. Preharvest seed infection by Aspergillus flavus group fungi and subsequent aflatoxin contamination in groundnuts in relation to soil types. Plant and Soil, Dordrecht, v. 136, n. 2, p. 239-248, 1991. MISHRA, D. & DUBEY, N.K. Evaluation of some essential oils for their toxicity against fungi causing deterioration of stored food commodities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 60, n. 4, p. 1101-1105, 1994. MONTES-BELMONT, R. & CARVAJAL, M. Control of Aspergillus flavus in maize with plant essential oils and their components. Journal of Food Protection, Ames, v.61, n. 5, p. 616-619, 1998. MORAES, S.A. de. Podridão do colo de plantas de amendoim (Arachis hypogaea L.) causada por Aspergillus niger VAN TIEGH. Ecossistema, São Paulo, v.5, n.1, p. 115-123, ago. 1980. MORAES, S.A. de & MARIOTTO, P.R. Diagnóstico da patologia de sementes de amendoim no Brasil. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 7, n.1, p. 41-43, 1985. MORAIS, L.A.S. de. Atividade antimicrobiana de extratos de algumas plantas medicinais sobre fitopatógenos do tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.). 2000. 109 p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia). Curso de Pós Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. MOURA, J.S. & PESSOA, M..N.G. Controle de Aspergillus sp. associado a sementes de algodão (Gossypium hirsuntum L.) no Estado do Ceará. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, suplemento, p. 398, 2000. MYCOCK, D.J.; RIJKENBERG, F.H.J.; BERJAK, P. Infection of maize seedlings by Aspergillus flavus var. colmnaris var. nov. Seed Science and Technology, Zurich, v. 18, p. 693-701, 1990. MYCOCK, D.J.; RIJKENBERG, F.H.J.; BERJAK, P. Systemic transmission of Aspergillus flavus var. colmnaris from one maize seed generation to the next. Seed Science and Technology, Zurich, v. 20, p. 1-13, 1992. NAHDI, S. Drought stress and preharvest seed invasion of selected groundnut genotypes by Aspergillus flavus and aflatoxin contamination. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 49, n. 1, p. 52-56, 1996.
NAKAMURA, K. & NISHIMURA, A.M. Fungos associados a má germinação de sementes de amendoim (Arachis hipogaea L.). Científica, São Paulo, v. 2, n. 2, p. 257, 1974. NAUTIYAL, P.C. & ZALA, P.V. Effect of drying methods on seed viability and seedling vigour in Spanish groundnut (Arachis hypogaea L.). Seed Science and Techinology, Zurich, v. 19, p. 451-459, 1991. NICOMEDES JÚNIOR, J.; SOUZA, S.R.; SOUZA, M.A.A. Inibição do crescimento micelial de Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Fitopatologia Brasileira, v.25, suplemento, p. 400, 2000. PASTER, N.; MENASHEROV, M.; RAVID, U.; JUVEN, B. Antifungal activity of oregano and thyme essential oils applied as fumigants against fungi attacking stored grain. Journal of Food Protection, Ames, v. 58, n. 1, p. 81-85, 1995. PATKAR, K.L.; USHA, C.M.; SHETTY, H.S.; PASTER, N.; KENNEDY, R.; LACEY, J. Effect of propionic acid on the incidence of storage fungi in stored rice, sorghum and groundnut under tropical conditions. Tropical Science, London, v. 35, p. 40-48, 1995. PEREIRA, G.M.; NUNES, M.AL.; TEIXEIRA, R.V.R. Efeito in vitro de extratos alcoólicos de plantas na germinação de conídios de Colletotrichum gloespoioides e Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Fitopatologia Brasileira, v.25, suplemento, p. 407, 2000. PITT, J.I.; DYER, S.K.; McCAMMON, S. Systemic invasion of developing peanut plants by Aspergillus flavus. Letters in Applied Microbiology, Oxon, v.13, p. 16-20, 199l. POLAN, C.E.; HAYES, J.R.; CAMPBELL, T.C. Consumption and fate of aflatoxin B1 by lactating cows. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 22, n. 4, p. 635-638, 1974. PRADO, G.; ALVAREZ LEITE, E.M.; MARTINS VIEIRA, M.B.; DE OLIVEIRA, M.S. Influência de metais na produção de aflatoxina B1 em amendoim (Arachis hypogaea L.). Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 15, n. 3, p. 294-297, 1995. PRADO, G.; OLIVEIRA, M.S.; GAZZINELLI-MADEIRA, J.E.C.; GODOY, I.J.; CORRÊA, B.; JUNQUEIRA, R.G.; FERREIRA, S.O. Resistência de quatro genótipos de amendoim à produção de aflatoxina B1 após inoculação com Aspergillus flavus Link. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 19, n. 1, 9 p., 1999. RAO, V.V.R.; REDDY, M.S.; RAO, K.C. Effect of fungicidal treatment on the viability of groundnut (Arachis hypogaea L.) seed in storage. Seed Research, Nova Delhi, v. 24, n. 1, p. 66-68, 1996. REDING, C.L.C.; HARRISON, M.A.; KVIEN, C.K. Aspergillus parasiticus growth and aflatoxin synthesis on Florunner peanuts grown in gypsum-supplemented soil. Journal of Food Protection, Ames, v. 56, n. 7, p.593-594, 1993.
RIBEIRO, L.F. & BEDENDO, I.P. Efeito inibitório de extratos vegetais sobre Colletotrichum gloeosporioides – agente causal da podridão de frutos de mamoeiro. Scientia Agrícola, Piracicaba, v. 56, n.1 (suplemento), 8 p., 1999. ROSSETTO, C.A.V.; VIEGAS, E.C.; LIMA, T. de M. Contaminação fúngica do amendoim em função das doses de calcário e épocas de amostragem. Bragantia, Campinas, v. 62, n. 3, p. 437-445, 2003. SAN-BLAS, G.; URBINA, J.A.; MARCHÁN, E.; CONTRERAS, L.M.; SORAIS, F.; SAN-BLAS, F. Inhibition of Paracoccidioides brasiliensis by ajoene is associated with blockade of phosphatidylcholine biosynthesis. Microbiology, Nova York, v. 143, p. 1583-1586, 1997. SANDERS, T.H.; BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; HILL, R.A. Effect of soil temperature and drought on peanut pod and stem temperatures relative to Aspergillus flavus invasion and aflatoxin contamination. Mycopathologia, Dordrecht, v. 86, p. 51-54, 1984. SAN MARTIN, P. Amendoim – uma planta da história no futuro brasileiro. São Paulo: Ícone Ed. Ltda., 1995. 68 p. (Coleção Brasil Agrícola – Série Principais Produtos). SANTURIO, J.M.; MALLMANN, C.A.; BALDISSERA, M.A.; EWALD, C.; HEER, A. Níveis de adsorção de aflatoxina B1 in vitro de aluminosilicatos e bentonitas comercializados no Brasil. In: Congresso Latino-Americano de Micotoxicologia, 1, 1994, Rio de Janeiro. Anais. Rio de Janeiro: Imprensa Universitária-UFRRJ, 1994. v. 1. p. 10-12. SCHINDLER, A.F.; PALMER, J.G.; EISENBERG, W.V. Aflatoxin production by Aspergillus flavus as related to various temperatures. Applied Microbiology, Washington, v. 15, n. 5, p. 1006-1009, 1967. SINGH, K.; FRISVAD, J.C.; THRANE, U.L.F.; MATHUR, S.B. An illustrated manual on identification of some seed-borne Aspergilli, Fusaria, Penicillia and their mycotoxins. Demark (hellerup): Danish Governmente Institute of Seed Pathology for Developing Countries, 1991. 133p. SOUZA, M.A.A.; BORGES, R.S.O.S.; STARK, M.L.M.; SOUZA, S.R. Efeito de estratos aquosos, metanólicos e etanólicos de plantas medicinais sobre a germinação de sementes de alface e sobre o desenvolvimento micelial de fungos fitopatogênicos de interesse agrícola. Revista Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro: Série Ciências da Vida, Seropédica, v. 22, n. 2, p. 181-185, 2002. (Suplemento). TANAKA, M.A. & CORRÊA, M.U. Influência de Aspergillus e Penicillium no armazenamento de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 6, n. 3, p. 451-456, 1981. URBINA, J.A; MARCHAN, E.; LAZARDI, K.; VISBAL, G.; APITZ-CASTRO, R.; GIL, F.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M.M.; PIRAS.R. Inhibition of phosphatidylcholine biosíntesis and cell proliferation in Trypanosoma cruzi by ajoene, an antiplatelet compound isolated from garlic. Biochemical Pharmacology, Oxford, v. 45, n. 12, p. 2381-2387, 1993.
USBERTI, R. & AMARAL, H.M. Fungicide dressing timing, seed size, seed origen and fungal incidence effects on groundnut (Arachis hypogaea L.) storability. Seed Science and Technology, Zurich, v. 24, n. 2, p. 699-706, 1999. USHA, C.M.; PATKAR,K.L.; SHETTY, H.S.; KENNEDY, R.; LACEY, J. Fungal colonization and mycotoxin contamination of developing rice grain. Mycological Research, Cambridge, v.97, n. 7, p. 795-798, 1993. VANZOLINI, S.; TORRES, R.M.; PANIZZI, R.C. Efeito do tamanho, da densidade e do tratamento fungicida sobre a qualidade das sementes de amendoim. Revista Ceres, Viçosa, v. 47, n. 274, p. 603-612, 2000. WELLS, T.R. & KREUTZER, W.A. Aerial invasion of peanut flower tissues by Aspergillus flavus under gnotobiotic conditions. Phytopathology, Saint Paul, v. 62, p. 797, 1972. WILSON, C.L.; SOLAR, J.M.; El-GHAOUTH, A.; WISNIEWSKI, M.E. Rapid evaluation of plant extracts and essential Oils for antifungal activity against Botrytis cinerea. Plant Disease, Saint Paul, v. 81, n. 2, p. 204-210, 1997. WOGAN, G.N.; EDWARDS, G.S.; NEWBERNE, P.M. Dose-response characteristics of aflatoxin B1 carcinogenesis in the rat. Cancer Research, Baltimore, v. 27, Part. I, p. 2370-2376, 1967. WOGAN, G.N.; EDWARDS, G.S.; NEWBERNE, P.M. Structure-activity relationships in toxicity and carcinogenicity of aflatoxins and analogs. Cancer Research, Baltimore, v. 31, p. 1936-1942, 1971. ZOHRI, A-N.; ABDEL-GAWAD, K.; SABER, S. Antibacterial, antidermatophytic and antitoxigenic activities of onion (Allium cepa L.) oil. Microbiological Research, Jena, v. 150, n. 2, p. 167-172, 1995. ZOVICO, C.; FONSECA, H.; CALORI-COMINGUES, M.A.; GLÓRIA, E.M.; BORGUINI, R.G.; SILVEIRA, V.P.; PIEDADE, S.; BARBIN, D. Seleção eletrônica pela cor na descontaminação de amendoim contaminado com aflatoxinas. Scientia Agrícola, Piracicaba, v. 56, n. 2, 8 p., 1999.
2 CAPÍTULO I
ISOLAMENTO DE Aspergillus spp. E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO DE AFLATOXINAS
2.1 RESUMO
O amendoim é uma cultura importante tanto para a alimentação humana quanto animal, principalmente pelo teor de proteínas, além do uso industrial para extração de óleo. Em seus grãos ocorre com freqüência a contaminação por aflatoxinas, altamente cancerígenas, que são produzidas por fungos do grupo Aspergillus flavus. Associando estes conhecimentos e pela descoberta de que a infestação destes fungos podem ter origem já no campo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o desenvolvimento destes fungos em amostras de solo, vagens e sementes, em função da calagem, da secagem e dos momentos de amostragem. Amostras foram feitas num Planossolo durante as 1a e 2a safras de 2001 (cultivo da seca e das águas) e avaliadas no Laboratório de Análise de Sementes da UFRRJ, quanto ao potencial de inóculo do solo e qualidade sanitária das vagens e sementes. Foi feita a detecção de aflatoxinas nos isolados de Aspergillus flavus, previamente identificados em meio ADM e inoculados em meio YES, através da leitura em Cromatografia de Camada Delgada (CCD). A calagem não interferiu na população de fungos do grupo A. flavus no solo e não preveniu sua contaminação nas vagens e sementes de amendoim, provenientes dos cultivos das águas e da seca. As condições de secagem em ambiente propiciaram menor incidência de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das águas e nas sementes provenientes do cultivo da seca. Foi constatado que dos isolados característicos do grupo A. flavus, 41 % proveniente do cultivo da seca e 47 % das águas não produziram aflatoxinas. Palavras chaves: amostragem, calagem, secagem.
2.2 ABSTRACT
Peanut is an important crop for human and animal consumption due to its high contents in proteins and oil seed contamination by aflatoxins, a highly cancerous group of substance, produced by fungi belonging to the Aspergillus flavus group is frequent. Considering that infestation of these fungi may start in the field, the objective of this work was to evaluate the development these fungi in pods, kernels and soil samples obtained from plants grown with or without lime, harvested in different times and heat-dried in stove or under room temperature in the dry or rainy season. Populations fungi in soil samples or associated to the kernels and pods, and aflatoxin production potential were evaluated at each harvest. There was no effect of liming on the population of A. Flavus group in the soil samples as well as on pods and seeds grown in the rainy or dry season. Drying conditions under room temperature favores a small fungal incidence of in pods obtained from the rainy season and in seeds from the dry season. . 41% of the isolates obtained from the rainy season and 47% from the rainy season did not produce aflotoxins. Key words: harvest time, lime, drying conditions.
2.3 INTRODUÇÃO
A qualidade sanitária da semente de amendoim inicia-se com um manejo adequado pré-colheita, pois dependendo das condições climáticas e da cultivar, a contaminação, a colonização pelo fungo e a subseqüente formação de aflatoxinas podem ocorrer no campo, bem antes da maturação (ANDERSON et al., 1975).
A avaliação feita por FERNANDEZ et al. (1997) após a aplicação de calcário em cultivos de amendoim, permitiu que fosse constatado que sementes com tegumento mais espesso, devido ter sido proveniente de plantas que foram submetidas à calagem, podem favorecer a diminuição da incidência de Aspergillus spp. e da biossíntese de aflatoxinas, dependendo do potencial do inóculo. Além disso, constataram que a forma de secagem associada à calagem pode reduzir o desenvolvimento do fungo.
A temperatura e a umidade do ar parecem ter papel independente na produção de aflatoxinas em milho, cuja infecção ocorre no ambiente aéreo. No caso do amendoim, os dois fatores agem conjuntamente. Em grãos de amendoim não danificados, nem a seca nem a alta temperatura sozinhos favorecem a infecção de grãos e o subseqüente acumulo de aflatoxinas (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984). Em condições de seca, o limite de temperatura na geocarposfera, para formação de aflatoxinas, situa-se entre 25 e 28ºC, e uma redução nesta região, de 29,6 para 25,2ºC resulta em não formação de aflatoxinas.
A colonização de grãos é inversamente proporcional à maturidade dos grãos, sendo maior nos grãos cultivados em temperaturas elevadas sob condição de seca. Embora tenha sido observado que mesmo sob condição de irrigação, os grãos continuem sem o acúmulo de aflatoxinas. No campo, em condição de seca natural, temperatura do solo de 44,6ºC, tem sido encontradas entre fileiras, sem que haja formação de aflatoxinas, ainda que o fungo cresça nessa temperatura (HILL et al., 1983).
O limiar para formação de aflatoxinas fica entre 30 e 40 dias de seca antes da colheita. Esses resultados corroboram com dezenas de observações de campo, onde concentrações de aflatoxinas são mais altas nos anos secos. Postula-se que, nas condições de seca, alta colonização de vagens pode estar relacionada à eliminação de competidores, como Aspergillus niger, que compete com sucesso com A. flavus em condições de altas temperatura e umidade do solo (HILL et al., 1983; BLANKENSHIP et al., 1984.
Outra possível influência da umidade reduzida está na diminuição no metabolismo dos grãos, aumentando sua suscetibilidade à infecção e a colonização (DHINGRA & COELHO NETTO, 1998). Foi também associada a colonização de grãos de amendoim, nas condições de seca, à capacidade de biosíntese de fitoalexinas, porque estas não foram biossintetizadas quando a aw caiu abaixo de 0,95 (DORNER et al., 1989). O conteúdo de água do grão parece ser o fator mais importante no controle da capacidade de produzir fitoalexinas, nos grãos imaturos de amendoim. Esse mecanismo natural de resistência à colonização é quebrado sob estresse hídrico (DIENER et al., 1987; DHINGRA & COELHO NETTO, 1998).
O objetivo do presente capítulo foi avaliar o desenvolvimento de fungos do grupo Aspergillus flavus e a subseqüente biossíntese de aflatoxinas, em amostras de solo, vagem e sementes de amendoim, em função da calagem, da secagem e momentos de amostragem, bem como o de isolar estes fungos para posteriores experimentos.
2.4 MATERIAL E MÉTODOS 2.4.1 Obtenção das amostras
No Laboratório de Análise de Sementes, em 2002, foram analisadas as amostras de solo, vagem e sementes, coletadas no campo, nos experimentos conduzidos com
amendoim cv. Botutatú (ZANOTTO, 1993), produzido na 1a e 2a safra de 2001 (cultivo da seca – abril a agosto/2001 e cultivo das águas – outubro 2001 a janeiro de 2002), num Planassolo, segundo RAMOS et al. (1973).
No campo, o delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso em parcela subsubdividida, com quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos por ausência (0,0 t/ha) e presença de calcário dolomítico (23,5% de CaO e 21,5% de Mg0 e 80% de PRNT, que foi aplicado em dezembro de 2000, na concentração de 1,8 t/ha, para elevar a saturação por bases a 70%), por quatro épocas de amostragem (a partir de 104o dia após a semeadura - DAS) e, por dois procedimentos de secagem das vagens (em estufa a 30oC e em ambiente, sem controle de temperatura e umidade relativa do ar). As parcelas (presença e ausência de calcário) foram constituídas por cinco linhas, espaçadas de 0,6 m entre si, com 20 m de comprimento, divididas em quatro subparcelas (épocas de amostragem) de 5 m de comprimento e subdivididas em duas subsubparcelas (procedimento de secagem) de 2,5 m. Foi considerada como área útil na colheita as três linhas centrais de cada subsubparcela, desprezando-se 0,5 m de cada extremidade, compreendendo uma área de 4,5 m2. 2.4.2 Avaliação da quantidade de inóculo do solo
Em cada amostragem, o solo foi coletado junto às raízes e frutos de 10 plantas de amendoim, de cada uma das subparcelas. Em seguida, foi colocado para secar ao ambiente por 24 horas. Para a avaliação do teor de água, após a secagem, foram pesadas 5 amostras de 10 g, seguindo a metodologia de EMBRAPA (1997).
Para isolamento dos fungos existentes no solo, utilizou-se o meio BDA acrescido de 60 g de NaCl diluídos em 20 mL de água destilada (BERJAK, 1984), que foi submetido à esterilização em autoclave por 20 minutos a 120ºC e suplementado com 1,0 mL de antibiótico (estreptomicina + sulfato de neomicina), após o meio ter esfriado.
Uma amostra de 5 g de solo seco foi suspendida em 15 mL de água esterilizada contida em Erlenmeyer, seguida de agitação por 15 minutos. Desta suspensão foi retirada uma alíquota de 0,5 mL seguindo o processo de diluição em série 1:10 até a diluição de 10-4. De cada diluição, foram tomadas alíquotas de 0,1 mL que foram distribuídas em três placas de Petri (10 cm x 15 mm) contendo o meio BDA+NaCl (6%)+antibiótico (0,03%). As placas foram acondicionadas em germinador regulado para 20°C e 12 horas de luz por sete dias. Ao final deste período foi feita a identificação e a contagem das colônias e a repicagem daquelas identificadas como sendo do grupo Aspergillus flavus para tubos de ensaio contendo o mesmo meio.
2.4.3 Avaliação da qualidade sanitária das vagens e das sementes
Por subsubparcela, as vagens foram divididas em duas amostras de 30 vagens, sendo que uma delas foi tratada com solução comercial de hipoclorito de sódio (HClO) a 2%, por três minutos.
A amostra tratada com HClO e a não tratada foram utilizadas para a avaliação da presença de fungos na superfície das vagens e das sementes, respectivamente. Em
ambos os casos a preparação das placas e seu acondicionamento seguiram o procedimento anterior. Para o primeiro caso, cinco fragmentos, tomados ao acaso, foram distribuídos por placa e para o segundo, da amostra tratada com hipoclorito de sódio, 10 sementes foram distribuídas por placa. A avaliação foi efetuada após o período de incubação através da observação das sementes e dos fragmentos do pericarpo do fruto sob microscópio binocular, sendo feita a contagem de colônias. Cada repetição foi representada por quatro placas (no caso dos fragmentos) e cinco placas (no caso das sementes).
As colônias de Aspergillus spp. foram isoladas e repicadas de forma semelhante ao anterior. 2.4.4 Isolamento e identificação
Para a confirmação da identificação dos isolados de Aspergillus spp., que foram provenientes de amostras de solo, vagem e semente que estavam mantidos em tubos de ensaio e, para a posterior caracterização do grupo Aspergillus flavus, foi utilizado o meio ADM, conforme BOTHAST & FENNELL (1974). A identificação dos isolados pertencentes ao grupo Aspergillus flavus foi realizada com base na pigmentação alaranjada, produzida pelo fungo e observada no verso das placas. A caracterização e identificação das outras espécies do gênero Aspergillus foi realizada com base na taxonomia usada por PITT & HOCKING (1997). Para isto, foi utilizado o meio CYA e confirmada através de SINGH et al. (1991). A identificação de outros fungos, tais como, Rhizopus spp., foi baseada em AGRIOS (1997).
2.4.5 Detecção de aflatoxinas produzidas pelos isolados do grupo Aspergillus flavus
Primeiramente, os isolados caracterizados como sendo do grupo A. flavus, e mantidos nos tubos de reserva, foram transferidos para outros tubos contendo meio BDA a fim de que todos tivessem a mesma idade. Após sete dias, estes foram armazenados em óleo mineral e mantidos em câmara fria situada no Laboratório de Análise de Sementes da UFRRJ. O óleo mineral utilizado foi autoclavado (120ºC/20 min e 24 horas após 120ºC/20 min) e seco (170ºC/2 horas) na estufa, 15 dias antes de ser utilizado.
Por ocasião da avaliação da síntese de aflatoxina, os isolados de grupo Aspergillus flavus, foram repicados das culturas com sete dias de crescimento em tubos com BDA, para placas de Petri (10cm x 15mm) contendo meio YES e incubados por três dias a 25ºC.
Para determinar o potencial dos isolados obtidos produzem aflatoxinas foram utilizadas duas técnicas. Na de extração rápida, fragmentos de cultura fúngica foram retirados diretamente das placas de Petri com meio YES através de uma alça de platina e macerados em cerca de 2 mL de clorofórmio. Em seguida, com auxílio de pipeta de Pasteur, foi retirada uma alíquota aproximada de 5 µL para aplicação direta em pontos previamente marcados e identificados nas placas de sílica-gel (20x20 cm x 0,25 mm). Nestas placas, também foram aplicados o padrão de aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), nas concentrações de 5 µL e de 10 µL (Merck 5628). As placas foram mantidas por 15 minutos em câmara de saturação com a fase móvel (clorofórmio:acetona - 9:1). As toxinas foram identificadas por sua fluorescência em luz ultravioleta de ondas longas (364 nm) e por comparação das amostras com relação as toxinas padrões.
A determinação pelo método do carimbo foi realizada através de discos de micélio retirados das colônias dos diferentes isolados, por meio de um sacador de rolhas de metal de 0,5 cm de diâmetro, colocados diretamente nos pontos previamente marcados na placa de CCD e ali mantidos até que se formasse um círculo úmido, quando então foram retirados. Os padrões foram aplicados e a leitura foi realizada da mesma forma que no método de extração anterior.
Estas duas últimas etapas foram desenvolvidas no Laboratório de Micologia da EMBRAPA Agroindústria de Alimentos.
2.4.6 Procedimento estatístico
Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da variância e normalidade. Quando não foi observada a
homogeneidade e normalidade, os dados foram transformados em arcseno x / 100 ,
em 5,0+x , e em log (x) e submetidos a análise de variância. As médias foram
comparadas pelo Teste de Tukey, a 5% de probabilidade ou submetidas ao ajuste por regressão polinominal. A seleção da função que melhor ajustou os dados foi feita com base no coeficiente de determinação. Nas Tabelas estão apresentados os dados originais, sem transformação.
2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Não houve interação significativa entre épocas de amostragem, calagem e secagem para os fungos do grupo Aspergillus flavus bem como para Rhyzopus spp. nas duas épocas de cultivo. No entanto, houve interação entre secagem e calagem para Rhyzopus spp. nas sementes produzidas na época da seca, assim como entre época de amostragem e secagem para fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes do cultivo das águas (Tabelas 1 e 2). No cultivo das águas, as vagens e as sementes de amendoim, obtidas de plantas crescidas em área com calagem, apresentaram menor contaminação por Rhyzopus spp., independente da secagem (Tabela 3). No entanto, no cultivo da seca, as sementes que foram provenientes de plantas crescidas em área onde foi aplicado calcário, apresentaram menor contaminação por estes fungos, quando secas em ambiente, do que em estufa. Além disso, as vagens secas em ambiente, apresentaram menor contaminação por estes fungos, quando provenientes do tratamento com calagem (Tabela 3). Em relação aos fungos do grupo Aspergillus flavus, não houve diferença quanto à contaminação das vagens e das sementes provenientes de plantas crescidas em área com ou sem calagem, em ambos cultivos (Tabela 3). No entanto, PITT et al. (1991), e FERNANDEZ et al. (1997) constataram que as sementes provenientes de áreas que receberam o calcário apresentaram menor contaminação por Aspergillus spp. do que as não submetidas à calagem. As vagens de amendoim produzidas no cultivo das águas, quando foram secas em ambiente, apresentaram maior contaminação por fungos do grupo Aspergillus flavus (Tabela 3), provavelmente devido a esta secagem ter sido mais lenta do que a em estufa, favorecendo o crescimento do fungo. Já, as sementes produzidas no cultivo da seca, quando foram secas em estufa, apresentaram maior contaminação pelos fungos do grupo A. flavus (Tabela 3), provavelmente devido ao aparelho estar regulado para 30 ºC, temperatura mais próxima daquela considerada como ótima para o desenvolvimento destes fungos (35-38 ºC), conforme DHINGRA & COELHO NETTO (1998).
Tabela 1. Quadrado médio para a porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim, cultivado em área com e sem calagem provenientes de plantas colhidas com 104, 114, 124 e 134 DAS, e secas em estufa e ambiente. Avaliação na época da seca. Seropédica-RJ. 2002.
Grupo Aspergillus flavus Rhyzopus spp. Fontes de Variação GL
Vagem Semente Vagem Semente Calagem (Cal.) 1 0,0243ns 0,0109ns 0,1025ns 0,1372* Erro (A) 3 0,0216 0,0135 0,0467 0,0187 Época (Ép.) 3 0,1746** 0,0161ns 0,2487** 0,0605ns Ép.XCal. 3 0,0045ns 0,0003ns 0,0499ns 0,0394ns Erro (B) 18 0,0283 0,0130 0,0463 0,0495 Secagem (Sec.) 1 0,0206ns 0,0755* 0,8946** 0,1133* Séc.Xép. 3 0,0212ns 0,0369ns 0,1402ns 0,0199ns Séc.XCal. 1 0,0085ns 0,00003ns 0,0750ns 0,1718* Sec.XÉp.XCal. 3 0,0024ns 0,0035ns 0 0484ns 0,0407ns Resíduo 24 0,0296 0,0167 0,0537 0,0235 C.V. (%) 144,63 21,57 80,263 151,65 ns = não significativo; ** significativo a 1 %; * significativo a 5 % Tabela 2. Quadrado médio para porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim cultivado em solo com e sem calagem, provenientes de plantas colhidas aos 104, 114, 124 e 134 DAS e secas em estufa e ambiente. Avaliação na época das águas. Seropédica-RJ. 2002.
Grupo Aspergillus flavus Rhyzopus spp. Fontes de Variação
GL Vagem Semente Vagem Semente
Calagem 1 0,0001ns 0,0075ns 9,5712** 0,0737* Erro (A) 3 0,0569 0,0314 0,2301 0,0150 Época (Ép.) 3 0,0628ns 0,0366ns 0,7926ns 0,0470** Ép.XCal. 3 0,0522ns 0,0550ns 1,4463ns 0,0322* Erro (B) 18 0,0725 0,0287 1,4007 0,0084 Secagem (Sec.) 1 0,6705** 0,1057ns 1,0635ns 0,0060ns Sec.XÉp. 3 0,0263ns 0,1526* 3,4958ns 0,0214ns Sec.XCal. 1 0,0242ns 0,0377ns 1,8057ns 0,0002ns Sec.XÉp.XCal. 3 0,0602ns 0,0079ns 1,3213ns 0,0034ns Resíduo 24 0,0342 0,0331 1,5557 0,0136 C.V. (%) 42,457 107,71 132,49 173,44 ns = não significativo; ** significativo a 1 %; * significativo a 5 %
Tabela 3. Dados médios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim provenientes de solo submetido ou não a aplicação de calcário e da secagem em estufa e ambiente. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ. 2002.
Águas
Seca
Aspergillus flavus Rhyzopus spp.
Aspergillus flavus Rhyzopus spp.
Semente
Tratam.
Vagem Semente
Vagem Semente
Vagem Semente
Vagem Ambiente Estufa
C/calagem 37,0A 6,8A 11,1B 0,9B 7,8A 1,5A* 22,5A 1,3Bb 3,3Aa S/calagem 36,4A 5,4A 26,6A 3,6A 10,8A 2,4A 36,7A 12,5Aa 3,1Ba Ambiente 25,8b 4,5a 16,2a 1,8a 11,2a 0,7b 41,0a - - Estufa 47,6a 7,7a 21,4a 2,8a 7,4a 3,1a 16,0b - - C.V.(%) 42,45 107,71 132,49 173,44 144,63 21,57 80,26 151,65
*Médias seguidas das mesmas letras (maiúsculas para aplicação de calcário, minúsculas para secagem) não diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.
Avaliando a porcentagem de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo da seca, em função da época de amostragem (DAS) (Figura 1), foi constatado aumento da contaminação até 114 DAS. Apartir de 124 DAS, houve uma redução acentuada, provavelmente em função da ocorrência de precipitação pluvial no período que antecedeu esta amostragem, favorecendo o desenvolvimento de organismos competidores, como constatado por HILL et al. (1983) e por BLANKENSHIP et al. (1984). A contaminação de Rhyzopus spp. nas vagens provenientes do período da seca, principalmente, após a secagem em estufa, acentuadamente diminuiu com o decorrer das coletas (Figura 2). Entretanto, foi verificado que a precipitação pluvial ocorrida no período anterior ao de coleta aos 124 DAS, favoreceu a colonização do fungo, principalmente nas vagens secas em ambiente, já que estas apresentavam maior teor de água devido ao processo de secagem ter sido mais lento. Quando foi avaliada a presença de fungos do grupo A. flavus nas sementes de amendoim, provenientes do cultivo das águas, após a secagem em estufa, foi verificada redução acentuada da contaminação por estes fungos (Figura 3). PAYNE et al. (1986) verificaram maior contaminação por este fungo em grãos de milho em área com irrigação, onde o alto teor de água das espigas favoreceu a referida contaminação.
Com relação à presença de Rhyzopus spp. em sementes de amendoim, obtidas de plantas sem calagem e provenientes do cultivo das águas, foi verificado redução acentuada da contaminação a partir de 104 DAS. Além disso houve menor contaminação naquelas oriundas da área tratada, aos 134 DAS (Figura 4). Para FERNANDEZ et al. (1997), as sementes com maior teor de cálcio, fornecido pela calagem do solo, são mais resistentes à penetração deste fungo, assim como de Aspergillus spp. e Penicillium spp., devido ao espessamento das três camadas do tegumento (exotesta, mesotesta e endotesta) da semente (FERNANDEZ et al., 2000).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
104 114 124 134
Colheita (DAS)
%
♦y = -0,0838x2 + 19,924x - 1165,9 R2 = 1 Figura 1. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas vagens de amendoim , em função da época de amostragem (DAS), no cultivo da seca .
-10
0
10
20
30
40
50
60
104 114 124 134
Colheita (DAS)
%
♦ y (ambiente) y = -0,0915x2 + 21,173x - 1171,7 R2 = 0,9844 � y (estufa) y = 0,033x2 - 8,762x + 587,34 R2 = 0,4055 Figura 2. Porcentagem de Rhizopus nas vagens de amendoim em função da época de amostragem (DAS) e do procedimento de secagem, por ocasião da avaliação realizada no cultivo da seca.
0
2
4
6
8
10
12
14
104 114 124 134
Colheita (DAS)
%
♦y (estufa) = 0,0013x2 - 0,5705x + 57,807 R2 = 0,6534 � y (ambiente) = 0,02x2 - 4,38x + 240 R2 = 0,98 Figura 3. Porcentagem de fungos do grupo Aspergillus flavus nas sementes de amendoim, em função de época de amostragem (DAS) e procedimento de secagem, por ocasião da avaliação realizada no cultivo das águas.
-2
0
2
4
6
8
10
12
104 114 124 134
Colheita (DAS)
%
♦y (sem calagem) = 0,026x2 - 6,418x + 395,96 R2 = 0,9674 � y (com calagem)= -0,0118x2 + 2,7375x - 155,33 R2 = 0,2724 Figura 4 – Porcentagem de Rhizopus spp. em sementes de amendoim, em função da época de amostragem (DAS) e da calagem, por ocasião da avaliação do cultivo das águas. Não houve interação significativa entre época de amostragem e calagem para a população de A. flavus e A. terreus no solo, no cultivo da seca. No entanto, no cultivo
das águas houve efeito da calagem sobre a população de A. terreus no solo e de época de amostragem para a população dos fungos do grupo A. flavus (Tabelas 4 e 5).
A população de fungos do grupo A. flavus no solo, no cultivo das águas, não diferiu em função da calagem (Tabela 6). Já, quando foi avaliada a população de A. terreus no solo, foi observado aumento desta na área que recebeu calcário, em relação à que não recebeu. No entanto, no cultivo da seca, não houve diferença entre os tratamentos para a população deste fungo. Quando foi avaliada a população fúngica, considerando a época de cultivo, foi observado que a incidência de fungos do grupo A. flavus nas vagens e a população destes fungos no solo, foi maior no cultivo das águas do que no da seca, enquanto a incidência de Rhyzopus spp. nas vagens e nas sementes não diferiu entre as épocas de cultivo, o mesmo ocorrendo com a população de A. terreus no solo (Tabela 7). Avaliando os 143 isolados obtidos de amostras do solo, de vagem e da semente de amendoim, que apresentaram características do grupo A. flavus, determinado em meio ADM, aproximadamente 18 % que foram provenientes do cultivo da seca e 8 % provenientes do período das águas, são Aspergillus parasiticus, enquanto, aproximadamente 41 % provenientes do período da seca e 45 % proveniente do período das águas, tanto podem ser A. flavus quanto A. parasiticus, pois, segundo DHINGRA & COELHO NETTO (1998), A. parasiticus produz os quatro tipos de aflatoxinas, enquanto A. flavus só produz B1 e B2. Foi constatado também, neste grupo, que aproximadamente, 41 % de isolados provenientes do período da seca e 47 % do período das águas, não produziram aflatoxinas (Tabela 8). Estes resultados também foram obtidos por FARIAS et al. (2000) em milho após colheita no estado do Paraná, evidenciando a variabilidade entre cepas de fungos do grupo A. flavus, quanto ao potencial de biossíntese de micotoxinas. Entre os outros grupos de Aspergillus, que foram isolados, nos dois cultivos, em amostras de solo, vagens e sementes, 18 % pertencem ao grupo A. terreus, 21 % ao grupo A. glaucus, 11 % ao grupo A. niger e 13 % não foram identificados (Tabela 9). Tabela 4. Quadrado médio para fungos (UFC/g) em amostras de solo, cultivado com amendoim e submetido ou não a aplicação de calcário, após as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época da seca. Seropédica-RJ. 2002. Fontes de Variação
GL Grupo Aspergillus flavus Grupo Aspergillus terreus
Calagem 1 3,4775ns 3,1933ns Erro (A) 3 2,1699 2,2618 Época 3 7,2537ns 5,2409ns CalagemXÉpoca 3 0,4958ns 4,7499ns Resíduo 18 3,0313 4,4212 C.V. (%) 44,54 73,64 ns = não significativo Tabela 5. Quadrado médio para fungos (UFC/g) em amostras de solo, cultivado com amendoim submetido ou não a aplicação de calcário, após as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época das águas. Seropédica-RJ. 2002.
Fontes de Variação GL Aspergillus flavus Aspergillus terreus Calagem 1 1,0388ns 4,6808** Erro (A) 3 4,0496 0,2986 Época 3 18,6076** 0,6818ns CalagemXÉpoca 3 5,0814ns 0,4164ns Resíduo 18 2,6319 1,8386 C.V. (%) 25,88 32,34 ns = não significativo; ** significativo a 1 % Tabela 6. Dados médios de fungos (UFC/g de solo) em amostras submetidas ou não a aplicação de calcário, após as coletas terem sido realizadas aos 104, 114, 124 e 134 DAS. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ. 2002.
Águas Seca Tratamento Aspergillus
flavus Aspergillus
terreus
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Com calagem
38750A* 271500A 191500A 406875A
Sem calagem
37041A 13875B 149000A 212750A
C.V. (%) 25,88 32,34 44,54 73,64 *Médias seguidas das mesmas letras, na coluna, não diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.
Tabela 7. Dados médios de porcentagem de fungos em vagens e sementes de amendoim, e, de UFC de fungos/g de amostra de solo. Avaliação na época das águas e da seca. Seropédica-RJ. 2002.
Aspergillus flavus Rhyzopus spp. Solo Tratamento
Vagem Semente Vagem Semente
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Época das águas
36,7A* 6,1A 18,8A 2,3A 42.750A 46.375A
Época da seca
8,5B 1,9A 28,5A 5,1A 17.270B 22.687A
C.V. (%) 62,74 140,05 148,41 180,85 38,54 49,86 *Medias seguidas das mesmas letras, na coluna, não diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade, pelo teste de Tukey.
Tabela 8. Caracterização pela Cromatografia de Camada Delgada, dos isolados do grupo Aspergillus flavus, que foram identificados inicialmente em meio ADM, segundo a produção de aflatoxinas. Seropédica-RJ. 2002.
Tipos de aflatoxinas Período Negativo B1 B1+B2 B1+B2+G1 B1+G1 B1+B2+G1+G2 B1+G1+G2 TOTAL
Seca 23 13 10 2 3 1 4 56 Águas 41 14 25 - 1 5 1 87 Total 64 27 35 2 4 6 5 143 Tabela 9. Outros grupos de Aspergillus identificados nos isolados das amostras de solo, de vagem e de sementes, obtidas nos períodos de seca e águas de 2001. Seropédica-RJ. 2002.
Grupo Período Aspergillus
terreus Aspergillus
glaucus Aspergillus
niger Aspergillus
spp. TOTAL
Seca 5 1 7 8 21 Águas 13 20 4 5 42 Total 18 21 11 13 63
2.6 CONCLUSÕES
1. A calagem não interferiu na população de fungos do grupo Aspergillus flavus no solo e não preveniu sua contaminação nas vagens e sementes do amendoim, provenientes dos cultivos das águas e da seca.
2. As condições de secagem em ambiente propiciaram menor incidência de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo das águas e nas sementes provenientes do cultivo da seca.
3. Nas colheitas efetuadas aos 114 e 124 DAS, houve maior incidência de fungos do grupo A. flavus nas vagens provenientes do cultivo da seca.
4. Dos isolados característicos do grupo A. flavus, 41 % provenientes do cultivo da seca e 47 % das águas não produziram aflatoxina
2.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGRIOS, G.N. Plant Pathology, 4 ed., San Diego: Academic Press, 1997. 635p. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. BERJAK, P. Report of the seed storage committee working group on the effects of storage fungi on seed viability. 1980-1983. Seed Science and Technology, Zurich, v. 12, p. 233-253, 1984. BOTHAST, R.J.; FENNELL, D.I. A medium for rapid identification and enumeration of Aspergillus flavus and related organisms. Mycologia, Lawrence, v. 66, n. 3, p. 365-369, 1974. BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; HILL, R.A Effect of geocarposphere temperature on pre-harvest colonization of drought-stressed peanut by Aspergillus flavus and subsequent aflatoxin contamination. Mycopathologia, Dordrecht, v. 85, p. 69-74, 1984. DHINGRA, O.D. & COELHO NETTO.R.A. Micotoxinas em grãos. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 6, p. 49-101, 1998.
DIENER, U.L.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; PAYNE, G.A; LEE, L.S.; KLICH, M.A Epidemilogy of aflatoxin formation by Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 25, p. 249-270, 1987. DORNER, J.W.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H.; BLANKENSHIP, P.D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia, Dordrecht, v. 105, p. 117-128, 1989. EMBRAPA/CNPS. Manual de Métodos de Análise de Solo. 2 ed. Rio de Janeiro: CNPS, 1997. 212p. FARIAS, A.X.; ROBBS, C.F.; BITTENCOURT, A.M.; ANDERSEN, P.M.; CORRÊA, T.B.S. Contaminação endógena por Aspergillus spp. em milho pós-colheita no Estado do Paraná. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 35, n. 3, p. 617-621, 2000. FERNANDEZ, E.M.; ROSOLEM, C.A.; MARINGONI, A.C.; OLIVEIRA, D.M.T. Fungus incidence on peanut grains as affected by drying method and Ca nutrition. Field Crops Research, Amsterdam, v. 52, n. 1, p. 9-15, 1997. FERNANDEZ, E.M.; ROSOLEM, C.A.; OLIVEIRA, D.M.T. Peanut seed tegument is affected by liming and drying method. Seed Science and Technology, Zurich, v. 27, p. 185-192, 2000. HILL, R.A; BLANKENSHIP, P.D.; COLE, R.J.; SANDERS, T.H. Effects of soil moisture and temperature on preharvest invasion of peanuts by the Aspergillus flavus group and subsequent aflatoxin development. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 45, n. 2, p. 628-633, 1983. PAYNE, G.A.; CASSEL, D.K.; ADKINS, C.R. Reduction of aflatoxin contamination in corn by irrigation and tillage. Phytopathology, Saint Paul, v. 76, n. 7, p. 679-684, 1986. PITT, J.I.; DYER, S.K.; McCAMMON, S. Systemic invasion of developing peanut plants by Aspergillus flavus. Letters in Applied Microbiology, Oxon, v.13, p. 16-20, 199l. PITT, J.L.; HOCKING, A.D. Fungi and food spoilage. London: Blackie Academic & Professional, 1997. 175p. RAMOS, D.P.; CASTRO, A.F.; CAMARGO, M.N. Levantamento detalhado de solos da área da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 8, n. 6, p. 1-27, 1973. SINGH, K.; FRISVAD, J.C.; THRANE, U.L.F.; MATHUR, S.B. An illustrated manual on identification of some seed-borne Aspergilli, Fusaria, Penicillia and their mycotoxins. Demark (hellerup): Danish Governmente Institute of Seed Pathology for Developing Countries, 1991. 133p. ZANOTTO, M.D. Botutatu: nova cultivar de amendoim (Arachis hypogaea L.). Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 28, n. 9, p. 1101-1102, set. 1993.
3 CAPÍTULO II.
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS NO DESENVOLVIMENTO DE Aspergillus spp.
3.1 RESUMO
Diante da propriedade inibitória de óleos essenciais vegetais sobre o desenvolvimento miceliano de fungos e da importância de espécies do grupo Aspergillus flavus, que apresentam potencial para biossíntese de aflatoxinas, o presente capítulo teve como objetivo avaliar, in vitro, a toxicidade de óleos essenciais de vegetais contra fungos do grupo A. flavus, isolados da cultura do amendoim. Primeiramente, foi avaliada a toxicidade de dezessete óleos essenciais vegetais no desenvolvimento micelial de dois isolados do grupo A. flavus, em comparação ao fungicida sintético benomyl e ao solvente utilizado. Posteriormente, foi avaliada a toxicidade de 37 isolados do grupo A. flavus, durante 12 meses, com o emprego dos óleos de casca de canela (Cinnamomum zeilanicum Breyn.) e de bulbilho de alho (Allium sativum L.). A maior inibição do desenvolvimento miceliano de A. flavus foi obtida com o emprego dos óleos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/ml de solvente (DMSO+MeOH). O efeito inibitório dos óleos essenciais sobre o crescimento miceliano foi variável conforme o isolado testado. Palavras chaves: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., óleos essenciais, fungicida.
3.2 ABSTRACT Considering the inhibitory property of plant essential oils on the development of fungi, and theimportance of the group Aspergillus flavus with potential for aflatoxin synthesis, this research was conceived to evaluate the effect of essential oils against fungi belonging to the A. flavus group , isolated from peanut crop. The effect of 17 essential oils against two isolates A. flavus-like fungi were tested, in comparison to the synthetic fungicide benomyl.Then the effect of Cinnamomum zeilanicum Breyn. and Allium sativum L. oils were tested in 37 fungi isolates, for 12 months. The highest inhibition on the development of A. flavus was found when cinnamon and garlic essential oils were applied, at the 2,0 mg oil /ml of DMSO: methanol. The essential oils growth inhibitory effects varied with fungi isolate. Key words: Cinnamomum zeilanicum Breyn., Allium sativum L., essential oils, fungicide
3.3 INTRODUÇÃO
Extratos de plantas medicinais têm sido utilizados intensamente nos últimos anos em estudos farmacológicos com resultados favoráveis no controle ou na cura de enfermidades, de homens e animais (APPLETON & TANSEY, 1975; LOURIA et al., 1989; URBINA et al., 1993; LEDEZMA et al., 1996; ZOHR et al., 1995; SAN-BLAS et al., 1997). Ainda, trabalhos têm sido realizados visando a sua utilização no controle de patógenos associados aos grãos, indicando um futuro promissor nesta área (KISHORE et al., 1983; BANKOLE & ADEBANJO, 1995; BELÉM et al., 1996).
Em relação ao controle de Aspergillus, DUBE et al. (1989) trabalharam com óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum L.), obtido por hidrodestilação através do aparelho de Clevenger, que foi distribuído em placas de Petri com meio Czapek-Dox agar e acetona e que recebeu posteriormente discos de 5 mm de culturas puras de Aspergillus flavus e de A. parasiticus. Os autores constataram completa inibição de crescimento miceliano dos fungos com 1,5 mL/L (ação fungistática) e atividade fungicida total com 6,0 mL/L. A toxicidade de inibição do micélio de 100 % promovida pelo óleo foi conseguida com até 300 dias de estocagem desse óleo.
Já DWIVEDI et al. (1991) trabalhando com óleos essenciais de folhas e sementes de algumas plantas, obtidos por hidrodestilação através do aparelho de Clevenger, observaram que o óleo de sementes de cenoura (Daucus carota L.) a 3.000 µg/L inibiu totalmente o crescimento de A. flavus.
Também BILGRAMI et al. (1992) constataram eficácia do uso de eugenol e de extratos de cebola (Allium cepa L.) e alho (Allium sativum L.) na redução da produção de aflatoxina por A. flavus, com a inibição de crescimento micelial.
Assim como MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a atividade fungitóxica de uma série de óleos essenciais, extraídos por meio de hidrodestilação de folhas de capim-limão [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.], erva-de-São João (Ageratum conizoides L.), lima-da-Pérsia (Citrus aurantifolia Swing), junípero (Juniperus communis L.), cânhamo-amargo (Eupatorium cannabium L.), alfavacão [Hyptis suaveloens (L.) Poit.], hortelã (Mentha viridis L.), pinheiro (Pinus spp.) e “galangal” (Alpinia carinata), de talos de incenso-indiano (Boswellia serrata), de cascas de tangerina (Citrus reticulata Blanaco) e laranja-doce (Citrus sinensis Osbeck), de rizoma de açafrão (Curcuma longa L.), e de raiz de “vetiver” (Vetiveria zizanioides), sobre Aspergillus flavus. Para os autores, C. citratus apresentou atividade positiva à 3.000 ppm, empregando a técnica de discos de micélio, em meio BDA. Estes autores testaram ainda a atividade fungitóxica do citral sobre várias espécies de Penicillium, de Alternaria, de Fusarium,de Aspergillus e de Botrytis, nas concentrações de 500 ppm (hipotóxica), de 1.000 ppm (tóxica) e de 1.500 ppm (hipertóxica) e concluíram que houve total inibição de crescimento fúngico somente com a concentração hipertóxica. Entretanto, para Aspergillus parasiticus, a concentração hipotóxica promoveu total inibição do fungo.
Contudo MAHMOUD (1994), estudando o efeito dos constituintes químicos de 20 óleos essenciais sobre o crescimento de Aspergillus flavus e a produção de aflatoxinas, observaram que citral, citronelal e eugenol impediram o crescimento do fungo e a formação de aflatoxina até os oito dias de incubação. Entretanto, após 15 dias, houve incremento na produção da toxinas, sendo maior que o controle.
Foi verificado por MISHRA et al. (1995) que A. flavus, A. niger e Fusarium oxysporum, isolados de sementes armazenadas de Cicer arietinum e guandu [Cajanos cajan (L.) Millsp.], quando submetidos a ação do óleo essencial de rizomas de Nardostachys jatamansi DC e cultivado em meio Czapek-Dox agar, apresentaram inibição total do crescimento micelial (100%) na concentração de 1,0x103 �L/L, demonstrando atividade fungistática.
Também, RAHMAN et al. (1999) conseguiram inibição de A. flavus, cultivado em meio Sabouraud, dextrose, agar (DAS), com a aplicação de óleos essenciais, solubilizados em DMSO, de Cuminum cyminum (66,7%) e de Elettaria cardamomum (58,1%).
Já MOURA & PESSOA (2000), utilizando tintura de alecrim pimenta (Lippia sidoides Cham.), obtiveram resultado de 72% de eficiência contra o crescimento micelial, in vitro, de Aspergillus sp., isolado de sementes de algodão.
Além disso, ALBUQUERQUE et al. (2002), utilizando óleo essencial de alecrim da chapada (Lippia gracillis H.B.K.) misturado ao meio BDA, observaram inibição do crescimento micelial de Aspergillus sp., de Geotrichum sp. e de Penicillium sp., capturados do ar em laboratório de cultura de tecidos.
O objetivo do presente capítulo foi avaliar a ação de óleos essenciais de plantas sobre o crescimento de Aspergillus sp., isolado de amostras de vagens e de sementes de amendoim, e de amostras de solo cultivado com amendoim.
3.4 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos nos Laboratórios de Análise de Sementes e de Patologia de Sementes, da UFRRJ, em 2003. Utilizaram-se óleos essenciais de partes de diversas plantas, extraídos pelo método do arraste do vapor utilizando-se o aparelho Clevenger, e cedidos pela EMBRAPA Agroindústria de Alimentos. As amostras foram armazenadas em freezer, no período de 1986 a 2001.
As espécies vegetais de onde foram extraídos os óleos essenciais estão assim relacionadas: Zingiber officinale Rox. (gengibre), Salvia officinalis L. (sálvia), Pimenta officinalis Lindl. (pimenta da Jamaica), Piper nigrum L. (pimenta do Reino), Laurus nobilis L. (louro), Myristica fragrans Boutt. (noz moscada), Origanum vulgare L (orégano), Allium sativum L. (alho), Thymus vulgaris L. (tomilho), Cinnamomum zeilanicum Nees (canela), Cymbopogon ciatratus (DC) Stapf. (capim limão), Foeniculum vulgare Mill (funcho), Eugenia caryophyllata Thumb. (cravo da Índia), Origanum majorana L. (manjerona) e Rosmarinus officinalis L. (alecrim).
Para avaliação da toxicidade dos óleos essenciais foram testados a sua ação contra diferentes isolados do grupo A. flavus, obtidos de sementes de amendoim produzidas na época da seca de 2001, e preservados em óleo mineral por seis meses, em condições de câmara fria.
Foram selecionados, conforme mencionado no capítulo I, apenas os isolados que apresentaram potencial para biossíntese de aflatoxina, identificados através da técnica de cromatografia de camada delgada. Para preparo do inóculo, os isolados primeiramente foram cultivados em meio BDA por sete dias, à 20 °C e sob 12 horas de luz. A partir das culturas, foi efetuada a suspensão dos conídios em água esterilizada e em seguida as respectivas suspensões foram submetidas à diluição em série até a concentração de 107 conídios/mL. 3.4.1 Seleção do padrão fungicida e do solvente dos óleos essenciais
Antes de se proceder à avaliação dos óleos essenciais foi realizado um ensaio para seleção do padrão a ser usado como testemunha. Para tanto, foram avaliados três fungicidas comerciais, benomyl e chlorothalonyl (0,2 g de p.a/20 mL de água destilada) e thiran (1,0 g/20 mL de água destilada). A partir das concentrações iniciais, foram efetuadas as diluições, em série 1:10, até se atingir a diluição 10-5. Em seguida cada amostra e suas respectivas diluições foram autoclavadas por 20 minutos à temperatura de 120 oC.
Para avaliar a sensibilidade dos isolados aos fungicidas e determinar a concentração ideal para os testes in vitro utilizou-se a técnica de escavação em placa, conforme Morais (2000). Para tanto foram preparadas placas de Petri (15 cm x 15 mm) contendo meio BDA nas quais foram distribuídos uniformemente 300 µL de suspensão de conídios (107 conídios/mL) do isolado T23 do grupo A. flavus, visando a formação de um filme denso de micélio. Logo após a distribuição da suspensão de conídios, foram feitos seis orifícios eqüidistantes no meio, através de um sacador de metal de 7 mm de diâmetro. Nos diferentes orifícios foram adicionados 100 µL de suspensão dos diferentes fungicidas e respectivas diluições, em um total de três repetições por amostra. As placas foram acondicionadas em câmara de crescimento regulada para 20 °C e 12 horas de luz por sete dias. Após este período, foram feitas as medições dos halos de inibição formados com auxílio de uma régua milimetrada.
Para confirmar a concentração ideal de fungicida, foi efetuado um novo ensaio quando foram testadas duas concentrações de benomyl, 0,5 mg/mL e 0,05 mg/mL. Neste ensaio foi utilizada a mesma metodologia anteriormente descrita, porém com o isolado T52 e cinco concentrações diferentes de suspensão de conídios, 103 a 107 conídios/mL. Em seguida, foi repetido o mesmo procedimento, porém utilizando quatro isolados do grupo A. flavus ( T23, T41, T52 e T63).
A fim de selecionar um solvente para a solubilização dos óleos essenciais que fosse inócuo para os fungos a serem testados foram comparados quatro tratamentos: DMSO (100 %), Metanol (100 %), DMSO:Metanol (80:20 %), e DMSO:Metanol (50:50 %). Para isto foi utilizada a mesma metologia descrita para os testes com os fungicidas e os isolados do grupo A. flavus (T52 e T63).
3.4.2 Avaliação dos óleos essenciais quanto à sua toxicidade a Aspergillus flavus
Inicialmente, foi avaliada a toxicidade de 17 óleos essenciais, extraídos das diferentes espécies vegetais anteriormente descritas. Foi utilizado o método de escavação em placa (Morais, 2000) e os isolados T52 e T63 do grupo A. flavus e o mesmo procedimento descrito no item 3.4.1. A concentração dos diferentes óleos essenciais foi ajustada para 2 mg/mL de solvente. Como testemunhas, foram utilizados dois tratamentos, o solvente empregado na solubilização dos óleos essenciais, DMSO+MeOH (50 % v/v), e o fungicida benomyl (0,5 mg/mL de água destilada), definidos conforme item 3.4.1. O preparo das placas de Petri e demais procedimentos foram semelhantes ao item 3.4.1.
A partir dos resultados obtidos no primeiro ensaio, foi realizado um segundo ensaio quando foram testados somente os óleos essenciais que proporcionaram halos de inibição maior que 7,0 mm contra pelo menos um dos isolados inicialmente testados. Foi utilizado somente o isolado T52 e a mesma metodologia anteriormente descrita, método de escavação em placa, concentração de 2 mg de óleo por mL de solvente, e as testemunhas compostas pelos dois tratamentos, DMSO+MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL de água destilada). Após incubação por sete dias a 20 oC e 12 horas de luz, foi realizada a medição dos halos de inibição formados.
A partir do segundo ensaio, foram selecionados dois óleos essenciais, o de casca de canela e o de bulbilhos de alho, que foram testados quanto à sua toxicidade contra 32 diferentes isolados do grupo A. flavus. Os isolados utilizados foram obtidos a partir de solo, vagem e semente de amendoim cultivado na época das águas de 2001. Para isto, foi utilizado o mesmo procedimento anteriormente descrito.
3.4.3. Determinação da curva de resposta de Aspergillus flavus a diferentes doses de óleos essenciais e de citral
A fim de determinar a concentração de óleo essencial capaz de produzir halo de inibição maior ou igual a 12 mm foram feitos quatro ensaios com diferentes substâncias, óleo essencial de casca de canela, de Lippia sidoides e de bulbilho de alho, além do citral.
Inicialmente foram testadas diferentes concentrações do óleo essencial de casca de canela (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de óleo/mL de solvente) além de duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Foram utilizados os isolados T18, T52 e T63 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos. Neste ensaio, foi avaliada ainda, se a ação do óleo essencial era fungicida ou fungistática. Para tanto, foram retiradas a partir da periferia e do centro de cada halo de inibição, três amostras de cada, com o auxílio de um estilete flambado. Estas amostras foram transferidas para placas de Petri contendo o meio BDA e em seguida acondicionadas em câmara de crescimento, regulada para 20 oC e 12 horas de luz, por sete dias. Após este período foi realizada observação visual para a presença ou não de crescimento fúngico.
Em seguida, foram testadas diferentes concentrações do óleo essencial de L. sidoides e de citral (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de óleo/mL de solvente) além de duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Foram utilizados os isolados T2, T24 e T35 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos.
Posteriormente foram testadas diferentes concentrações dos óleos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho (2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg de óleo/mL de solvente), além das duas testemunhas, DMSO + MeOH (50 % v/v) e benomyl (0,5 mg/mL). Neste ensaio, foram utilizados os isolados T18, T52 e T63 do grupo A. flavus e os mesmos procedimentos anteriormente descritos.
3.4.4. Avaliação da toxicidade de óleo essencial de casca de canela e de bulbilho de alho após 12 meses de armazenamento.
A fim de se verificar a manutenção das propriedades antifúngicas com o
armazenamento, foi avaliada a toxicidade de óleos essenciais de cascas de canela e de bulbilhos de alho armazenados durante 12 meses à temperatura de 0 a -3 oC. Para tanto, foi realizado novo ensaio seguindo a mesma metodologia descrita nos itens 3.4.1 e 3.4.2., e os isolados T2, T20, T24, T35 e T55 do grupo A. flavus.
Neste ensaio, foi avaliada ainda, se a ação dos óleos essenciais era fungicida ou fungistática. Para tanto, foram retiradas a partir da periferia e do centro de cada halo de inibição, três amostras de cada, com o auxílio de um estilete flambado. Estas amostras foram transferidas para placas de Petri contendo o meio BDA e em seguida acondicionadas em câmara de crescimento, regulada para 20 oC e 12 horas de luz, por sete dias. Após este período foi realizada observação visual para a presença ou não de crescimento fúngico. 3.4.3 Procedimento estatístico
Foi adotado para todas as análises o delineamento inteiramente casualizado com três repetições.
Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da variância e normalidade. Quando não foi observada a
homogeneidade e a normalidade os dados foram transformados em arcseno ( x / 100 ),
em 5,0+x , ou em log (x) e submetidos a análise de variância. As médias foram
comparadas pelo Teste de Tukey e de Scott-Knott, a 5 % de probabilidade ou submetidos ao ajuste por regressão polinominal. A seleção da função que melhor ajustou os dados foi feita com base no coeficiente de determinação r2. Nas Tabelas estão apresentados os dados originais, sem transformação.
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.5.1 Seleção do padrão fungicida e do solvente dos óleos essenciais Na avaliação da seleção do padrão antifúngico foi considerado o halo mínimo de inibição de 12 mm de diâmetro, de acordo com GUNATILAKA et al. (1994). Assim foram obtidos melhores resultados com benomyl a partir da concentração de 0,05 mg/mL, ou seja, um halo de 16,8 mm de diâmetro (Tabela 10). Tabela 10. Dados médios de diâmetro de halos de inibição (mm) formados pela ação de três fungicidas em diferentes concentrações sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T23-semente). Seropédica-RJ. 2002.
Fungicidas Concentração (mg/mL)
Benomyl Chlorothalonyl Thiran
5.10-1 18,7 10,0 10,7 5.10-2 16,8 9,7 0,0 5.10-3 0,0 6,8 0,0 5.10-4 0,0 0,0 0,0 5.10-5 0,0 0,0 0,0
Na avaliação da eficiência do fungicida selecionado, empregando outro isolado do grupo A. flavus, foi constatado que este apresentou-se mais sensível ao benomyl, também, na concentração de 0,05 mg/mL, mesmo em sua concentração (UFC) mais elevada (103 conídios/mL), ou seja, um halo de 27,2 mm de diâmetro (Tabela 11).
Tabela 11. Dados médios de diâmetros dos halos de inibição (mm) formados pela ação do fungicida benomyl nas duas concentrações testadas sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente) em diferentes concentrações. Seropédica-RJ. 2002.
Fungo Fungicida benomyl Conídios/mL 0,5 mg/mL 0,05 mg/mL
103 32,7 27,2 104 34,3 23,3 105 35,2 28,8 106 28,4 23,1 107 26,8
23,8
Na avaliação da eficiência do padrão selecionado, empregando outros dois isolados, comparados aos isolados anteriores, foi constatado que não houve diferença significativa entre os diâmetros dos halos formados e que há possibilidade do emprego da concentração de 0,05 mg/mL, já que os diâmetros dos halos formados nas culturas dos diferentes isolados, não diferiram do apresentado na diluição 0,5 mg/mL e foi sempre acima de 12 mm (Tabelas 12 e 13). Tabela 12. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do fungicida benomyl sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente). Fontes de Variação GL QM Isolado (I) 3 7,8194ns Diluição (D) 1 18,3750ns I x D 3 4,3750ns Resíduo 16 9,1667ns C.V. (%) 11,48 ns = não significativo Tabela 13. Dados médios de diâmetros de halos de inibição (mm) formados pela ação do fungicida benomyl sobre diferentes isolados do grupo Aspergillus flavus (T23-semente, T41-solo, T52-semente e T63-semente).Seropédica-RJ. 2002.
Isolados Concentração
(mg/mL) T23 T41 T52 T63 Média 5.10-1 29,0 26,0 29,0 25,0 27,0a* 5.10-2
27,0 25,0
25,0
24,0 25,0a
Média 28,0A 25,0A 27,0A 24,0A *Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, a 5 % de probabilidade.
Na avaliação da toxicidade dos solventes em diferentes combinações sobre dois isolados do grupo A. flavus foi constatado que em ambos isolados não houve formação de halo, indicando que os solventes empregados não foram tóxicos aos fungos avaliados. No entanto, foi selecionada a combinação DMSO + MeOH (50% v/v), considerando que a mesma também foi utilizada por MORAIS (2000), sem apresentar atividade tóxica para Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. 3.5.2 Avaliação dos óleos essenciais quanto à toxicidade à Aspergillus flavus Pela Tabela 14 pode-se verificar que não houve interação entre os óleos essenciais e os isolados do grupo A. flavus. Já pela Tabela 18 fica constatado que houve interação entre os melhores óleos essenciais selecionados anteriormente e os isolados do grupo A. flavus.
Na seleção dos óleos essenciais com poder fungitóxico, verificou-se que os óleos essenciais de casca de canela e bulbilho de alho, apresentaram maior halo de inibição e por isto, os demais testes foram realizados com os mesmos (Tabelas 15, 16 e 17). Quando foi avaliada a eficiência de inibição do crescimento micelial dos isolados do grupo A. flavus, obtidos de amostras de sementes da cultura do amendoim no cultivo da seca (T52 e T63), através da medição do diâmetro do halo de inibição, foi constatado que estes fungos tiveram o seu desenvolvimento micelial reduzido pelos óleos essenciais de bulbilho de alho e de casca de canela, porém compreendendo valores menores quando comparados com aqueles obtidos pelo fungicida benomyl. Nas
condições em que foram realizados os presentes ensaios, os óleos essenciais extraídos de pimenta do Reino, louro, noz moscada, orégano, tomilho, funcho, cravo da Índia, manjerona e alecrim não apresentaram nenhuma atividade sobre os dois isolados testados, caracterizado pela ausência de inibição do fungo (Tabela 15).
Além disso, quando foi realizada a segunda avaliação da toxicidade dos óleos essenciais selecionados anteriormente, foram confirmados os resultados relacionados a inibição do crescimento do isolado T52 (Tabela 17), podendo inferir que os óleos essenciais de alho e de canela contêm princípio fungicida, como também constatado por BOLKAN et al. (1981), avaliando a toxicidade de extrato de alho sobre Fusarium moniliforme e Rhizoctonia solani. Além disso, o efeito tóxico do alho e da canela sobre o crescimento de fungos fitopatogênicos também tem sido demonstrado em outros trabalhos. Com o emprego de óleo essencial de alho, CHALFOUN & CARVALHO (1987) constataram inibição do crescimento micelial de Gibberella seae (Schwl.), Alternaria zinniae Pape e Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. Já, com o uso de extrato de alho, foi constatada toxicidade contra Aspergillus flavus (BILGRAMI et al., 1992), Crinipellis perniciosa, Phytophthora palmivora (BASTOS, 1992), Curvularia spp., Alternaria spp. (BARROS et al., 1995) e Colletotrichum gloeosporioides (RIBEIRO & BEDENDO, 1999).
Tabela 14. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação de óleos essenciais sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente). Fontes de Variação GL QM Substâncias (S) 9 13,5843** Fungos (F) 1 2,9048ns S x F 9 2,0233ns Resíduo 40 1,0222 C.V. (%) 46,412 ns = não significativo; ** significativo a 1 % Tabela 15. Diâmetros dos halos de inibição (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente e T63-semente) em função da atividade de óleos essenciais de plantas medicinais (2 mg/mL de solvente), do solvente DMSO+MeOH (50% v/v) e do fungicida benomyl (0,5 mg/mL). Seropédica-RJ. 2003.
Nome Vulgar Nome Científico Parte utilizada T52 T63
Gengibre Zingiber officinale Rizoma 3,7bc* 3,3bc Sálvia Salviia officinalis Folha 11,7b 0,0c Pimenta da Jamaica
Pimenta officinalis Fruto 3,3c 0,0c
Pimenta do Reino Piper nigrum Fruto 0,0c 0,0c Louro Laurus nobilis Folha 0,0c 0,0c Noz moscada Myristica fragans Fruto 0,0c 0,0c
Orégano Origanum vulgare Folha 0,0c 0,0c Pimenta da Jamaica
Pimenta officinalis Folha 3,7c 0,0c
Alho Allium sativum Bulbilho 4,3bc 11,7bc Tomilho Thymus vulgaris Folha 0,0c 0,0c Canela Cinnamomum zeilanicum Folha 7,3bc 5,0bc Capim limão Cymbopogon citratus Folha 3,7c 0,0c Canela Cinnamomum zeilanicum Casca 10,3bc 13,0b Funcho Foeniculum vulgare Fruto 0,0c 0,0c Cravo da Índia Eugenia caryophyllata Folha 0,0c 0,0c Manjerona Origanum majorana Folha 0,0c 0,0c Alecrim Rosmarinus officinalis Folha 0,0c 0,0c Solvente - - 0,0c 0,0c Benomyl - - 35,0a 20,3a *Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5 % de probabilidade.
Tabela 16. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação de óleos essenciais selecionados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida.
Fontes de Variação GL QM Substâncias 5 24,1762** Resíduo 30 1,1124 C.V. (%) 37,050 ns = não significativo; ** significativo a 1 %
Tabela 17. Halos médios obtidos pela ação de óleos essenciais com melhores resultados sobre isolado do grupo Aspergillus flavus (T52-semente), comparados ao solvente e ao fungicida. Seropédica-RJ. 2002.
Produto Dosagem (mg/ml) Média
Sálvia 2,0 5,2cd*
Alho 2,0 8,8bc
Folha de canela 2,0 4,0cd
Casca de canela 2,0 13,3b
DMSO+MeOH (50% v/v) 1,0 0,0d
Benomyl 0,5 40,0a
*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5 % de probabilidade
Pela Tabela 18 pode ser observado que houve diferença significativa de ação dos óleos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela sobre 32 diferentes isolados do grupo A. flavus. Tabela 18. Resumo da análise de variância obtida pela ação de óleos essenciais de alho e de casca de canela sobre 32 isolados do grupo Aspergillus flavus. Fontes de Variação GL QM Substância 1 0,01405** Isolado 31 0,00030** S x I 31 0,00017** Resíduo 128 0,000016 C.V. (%) 2,1367 ** significativo a 1 %
Tabela 19. Diâmetros médios dos halos de inibição (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus em função da atividade dos óleos essenciais de alho e de canela. Seropédica-RJ.2003.
Óleo Essencial Isolados Origem Alho Canela
Y27 Semente 12,0Bc* 22,0Aa Y82 Semente 12,0Bc 20,0Aa Y62 Solo 10,0Bd 20,0Aa
Y75 Vagem 9,0Bd 20,0Aa Y11 Solo 7,0Be 20,0Aa Y5 Solo 13,0Bb 19,0Aa Y48 Vagem 12,0Bc 18,0Ab Y10 Solo 12,0Bc 17,0Ab Y19 Solo 12,0Bc 17,0Ab Y8 Solo 11,0Bc 17,0Ab Y43 Semente 10,0Bd 17,0Ab Y36 Vagem 10,0Bd 17,0Ab Y100 Vagem 15,0Aa 16,0Ab Y67 Solo 12,0Bc 15,0Ac Y29 Semente 11,0Bc 15,0Ac Y52 Semente 11,0Bc 15,0Ac Y59 Solo 11,0Bc 15,0Ac Y13 Solo 10,0Bd 15,0Ac Y113 Solo 10,0Bd 15,0Ac Y12 Solo 10,0Bd 15,0Ac Y54 Vagem 10,0Bd 15,0Ac Y128 Semente 7,0Be 15,0Ac Y66 Solo 12,0Bc 14,0Ac Y88 Vagem 10,0Bd 14,0Ac Y50 Vagem 10,0Bd 13,0Ac Y65 Solo 10,0Bd 13,0Ac Y111 Solo 12,0Ac 12,0Ad Y80 Semente 12,0Ac 12,0Ad Y73 Vagem 11,0Ac 11,0Ad Y99 Semente 10,0Ad 10,0Ae Y104 Solo 10,0Ad 10,0Ae Y130 Semente 7,0Be 10,0Ae *Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5 % de probabilidade, pelo teste de Scott-Knott
Foi observado, em geral, maior toxicidade do óleo essencial de casca de canela que do de bulbilhos de alho, expresso pelos significativamente maiores halos de inibição promovido pelo primeiro em relação ao segundo para a maioria dos isolados testados. Foi observado, ainda, resposta diferencial dos isolados quanto à sensibilidade aos dois óleos essenciais testados, detectada pelo teste de Scott-Knott (Tabela 19). O óleo essencial de alho proporcionou halos de inibição que variaram entre 7,0 e 15,0 mm, sendo, porém maior que 12,0 mm, considerado por GUNATILAKA et al. (1994), como ideal para testes in vitro, para 34 % dos isolados. Já o óleo essencial de canela proporcionou halos de inibição entre 10,0 e 22,0 mm, porém com halos maiores que 12,0 mm para 87 % dos isolados testados. Também, WILSON et al. (1997) constataram que o extrato do gênero Allium e o óleo essencial de C. zeilanicum demonstraram a maior atividade antifúngica sobre B. cinérea, em relação aos demais extratos e óleos essenciais testados.
3.5.3 Determinação da curva de resposta de Aspergillus flavus a diferentes doses de óleos essenciais e de citral
Pela Tabela 20 pode-se verificar que houve interação significativa entre os
isolados e substâncias, assim como entre isolados e a dose do óleo essencial. Houve aumento do diâmetro do halo com o aumento da dose testada, nos isolados T52 e T63, o entanto para o isolado T18, a partir de 8 mg/mL de solvente houve redução no diâmetro dos halos. Além disso, o isolado T63 foi o mais sensível à ação do óleo (Figura 5). Tabela 20. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo de canela e do fungicida benomyl sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente). Fontes de Variação GL QM Substância 1 533,3360** Isolado 2 158,7960** Dose 5 98,5070** Linear r-sqrt = 1 373,3730** Quadrático 1 115,1120** cúbico 1 0,3860ns Independente 2 1,8320ns Isolado x Substância 2 43,6850** Isolado x Dose 10 12,8190** Resíduo 42 0,9841 C.V. (%) ns = não significativo; ** significativo a 1%
Concentração do óleo (mg/ml)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Diâ
me
tro
do
hal
o (
mm
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
ISOLADO T18 Y = 14,7 + 2,75**X -0,183**X2 R2 = 0,85*
ISOLADO T 52 Y = 10,5 +2,87**X -0,124**X2 R2 = 0,99**
ISOLADO T 63 Y = 16,3 +2,84**X -0,132**X2 R2 = 0,99**
Benomyl Isolado T 18
Benomyl Isolado T 52
Benomyl Isolado T 63
Figura 5 – Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de casca de canela e do fungicida benomyl. Pela Tabela 21, pode ser verificado que não houve interação entre o óleo essencial de Lippia sidoides e citral e os isolados de A. flavus testados. Avaliando a ação do óleo essencial de Lippia sidoides, em doses crescentes, sobre diferentes isolados do grupo A. flavus, foram observadas variações no comportamento de cada isolado mas todos em torno de uma faixa compreendida entre 5 e 35mm (Figura 6). Também, quando foi avaliada a ação do citral, foi constatado que a resposta a esta substância pelos diferentes isolados foi semelhante ao óleo essencial de Lippia sidoides (Figura 7). Tabela 21. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo essencial de Lippia sidoides e do citral sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem) Fontes de Variação GL QM
Substância 1 996,1481ns
Isolado 2 12,5093**
Dose 5 158,3315ns
Substância x Isolado 2 37,3981ns
Substância x Dose 5 148,2370ns
Isolado x Dose 10 95,8398ns
Substância x Isolado x Dose 10 84,5120ns
Resíduo 72 1,7083ns
C.V. (%) 6,33 ns = não significativo; ** significativo a 1%
2 4 6 8 10 12
Diâ
metr
o do h
alo
(m
m)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Isolado T 2Isolado T 24Isolado T 35
Óleo de Lippia sidoides
Concentração do Óleo (mg/ml) Figura 6 – Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T24 e T35), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de Lipia sidoides.
2 4 6 8 10 12
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Óleo de Citral
Diâ
me
tro
do h
alo
(m
m)
Concentração do Óleo (mg/ml)
Isolado T 2Isolado T 24Isolado T 35
Figura 7 –Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T24-semente e T35-vagem), em mm, em função de diferentes concentrações de citral. Pela Tabela 22 foi constatado que houve interação entre isolado e substância, não ocorrendo entre isolado e dose. Quando foi avaliada a curva de resposta dos isolados de A. flavus a diferentes doses do óleo essencial de alho, foi verificado que não houve resposta diferenciada dos isolados às diferentes doses e, registrando-se um halo médio próximo a 10 mm de diâmetro (Figura 8). Este resultado sugere que o óleo de alho, após longo tempo de armazenamento, pode ter sua característica fungicida reduzida (pois os isolados foram diferentes). Já, ao avaliar a ação do óleo de canela, foi constatado que as diferentes doses não alteraram as respostas dos isolados, tendo-se porém observado uma maior sensibiolidade o isolado T63 (Figura 9), constatada pelo maior halo de inibição formado (ao redor de 15,0 mm). Ao se comparar as Figuras 5 e 9 fica constatado que a diferença de ação do óleo de canela sobre os mesmos isolados deve estar relacionada ao tempo de armazenamento deste óleo ou a diferenças de comportamento dos isolados. Isto ainda pode justificar a baixa atividade fungicida do óleo de canela, avaliada nos isolamentos realizados a partir dos halos formados pela ação deste óleo sobre os isolados (Tabela 23). Tabela 22. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação do óleo essencial de alho e do fungicida benomyl sobre ilsolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-sememte e T63-sememte). Fontes de Variação GL QM
Substância 2 4970,5110** Isolado 2 257,1340** Dose 5 1,2180ns Isolado x Substância 4 91,7990** Isolado x Dose 10 0,8410ns Substância x Dose 5 2,4240ns Isolado x Substância x Dose 10 0,2700ns Resíduo 129 2,0412 C.V. (%) ns = não significativo; ** significativo a 1 %
Concentração do Óleo (mg/ml)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Diâ
metr
o d
o h
alo
(m
m)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Isolado T 52Isolado T 18Isolado T 63Benomyl isolado T52 Benomyl isolado T18Benomyl isolado T63
Óleo de Alho
Figura 8 – Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de alho e do fungicida benomyl.
Concentração do Óleo (mg/ml)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Diâ
me
tro
do
ha
lo (
mm
)
Óleo de CanelaIsolado T 52Isolado T 18Isolado T 63Benomyl isolado T52 Benomyl isolado T18Benomyl isolado T63
Figura 9 – Diâmetro de halo de inibição formado em isolados do grupo Aspergillus flavus (T52-semente, T18-semente e T63-semente), em mm, em função de diferentes concentrações de óleo essencial de canela e do fungicida benomyl. Tabela 23. Avaliação da atividade do óleo essencial de casca de canela nas concentrações de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mg/mL do solvente sobre fungos do grupo Aspergillus flavus (T18-semente, T52-semente e T63-semente), na concentração de 107 conídios/mL. Seropédica-RJ. 2003. Extrato T18 T52 T63
(mg) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 2 + + + + + - - - + - - - 4 - - - - - - - - + - - - 6 - - - - - - - - - - - - 8 - - - - - - - - - - - - 10 - - - - - - - - - - - - 12 - - - - - - - - - - - -
+ crescimento fúngico; - não houve crescimento fúngico 3.5.4 Avaliação da toxicidade de óleo essencial de casca de canela e de bulbilho de alho após 12 meses de armazenamento
Pela Tabela 24 pode ser verificado que após 12 meses de armazenamento dos óleos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela, ainda houve interação significativa entre a ação destes óleos e os isolados do grupo A. flavus.
Após 12 meses de armazenamento dos óleos essenciais, foi constatado maior diâmetro dos halos de inibição do desenvolvimento micelial dos fungos do grupo A. flavus isolados da cultura do amendoim do cultivo da seca, de amostras de solo (T2), de sementes (T20) e do pericarpo dos frutos (T55), quando foi empregado o óleo de casca de canela do que o de bulbilho de alho (Tabela 25). Além disso, quando foi aplicado o óleo de casca de canela foi observado maior diâmetro de halo na cultura dos fungos do grupo A. flavus, isolado de solo (T2). Já, quando foi empregado o óleo de alho, não foi constatada diferença estatística entre os halos formados nas culturas dos fungos. Quando foi realizado o isolamento, foi observado que dos pontos retirados próximos ao centro dos halos, somente não houve crescimento de fungo do grupo A. flavus, isolado de amostras de solo (T2) quando foi empregado o óleo de casca de canela. Para os demais, houve crescimento micelial dos fungos, isolados da cultura do amendoim no cultivo da seca, inclusive nos pontos periféricos dos halos (Tabela 26). Estes resultados demonstram que nas condições em que os experimentos foram conduzidos, os extratos podem estar perdendo sua validade como fungicida após 12 meses de armazenamento, embora os isolados tenham sido diferentes (Tabela 27). Ou ainda, que não houve redução da produção de conídios, com o emprego dos óleos essenciais, como constatado por RIBEIRO & BEDENDO (1999). Para MISHRA & DUBEY (1994), o potencial antifúngico por longa duração facilita o isolamento futuro dos componentes dos óleos. Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que a maior inibição relativa in vitro do desenvolvimento micelial de A. flavus foi obtida com o emprego dos óleos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho, na dose de 2,0 mg/mL de solvente (DMSO+MeOH), podendo ser apontado como alternativa potencial no controle destes fungos. O efeito inibitório dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial foi variável conforme o fungo testado. Tabela 24. Resumo da análise de variância para os dados obtidos pela ação dos óleos essenciais de alho e casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2-solo, T20-semente, T24-semente, T35-vagem e T55-vagem) após 12 meses de armazenamento. Fontes de Variação GL QM
Isolado 4 0,3494ns Substância 1 8,1640** I x S 4 0,7819* Resíduo 30 0,2313 C.V. (%) 13,865 ns = não significativo; * significativo a 5 %; ** significativo a 1 %
Tabela 25. Diâmetros dos halos médios de inibição (mm) formados em isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20, T24, T35 e T55), em função da atividade dos óleos essenciais de alho e casca de canela, após 12 meses de armazenamento. Seropédica-RJ.2003.
Culturas Origem Óleo de alho Óleo de casca de canela T2 solo 8,0Ba* 20,0Aa T20 semente 8,3Ba 15,8Aab T24 semente 9,5Aa 9,5Ab T35 vagem 12,0Aa 14,6Aab T55 vagem 8,0Ba 15,0Aab
*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5 % de probabilidade
Tabela 26. Avaliação da atividade dos óleos essenciais de alho e de casca de canela sobre isolados do grupo Aspergillus flavus (T2, T20. T24, T35 e T55), após 12 meses de armazenamento destes óleos. Seropédica-RJ. 2003.
Óleo de alho Óleo de casca de canela Isolados Centro halo Periferia halo Centro halo Periferia halo
T2 fungistático fungistático fungicida fungistático T20 fungistático fungistático fungistático fungistático T24 fungistático fungistático fungistático fungistático T35 fungistático fungistático fungistático fungistático T55 fungistático fungistático fungistático fungistático
Tabela 27. Avaliação comparativa em porcentagem da atividade do óleo essencial de casca de canela, sobre a ocorrência de isolados do grupo Aspergillus flavus (T18, T52, T63), avaliadas em 10/2002, e isolados (T2, T20, T24, T35, T55), avaliadas em 07/2003, após 12 meses de armazenamento do óleo essencial. Seropédica-RJ. 2003.
Culturas Local de isolamento
T18 T52 T63 T2 T20 T24 T35 T55
Centro do halo 58 17 8 0 100 100 100 100 Periferia do halo 100 100 100 100 100 100 100 100 3.6 CONCLUSÕES
1. A maior inibição do desenvolvimento miceliano de Aspergillus flavus foi obtida com o emprego dos óleos essenciais de casca de canela e de bulbilho de alho.
2. O efeito inibitório dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial foi variável
conforme o isolado testado.
3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBUQUERQUE, C. de C.; CÂMARA, T.R.; MENEZES, M.; SILVA, S.I.; CARVALHO, J.S.B.; ULISSES, C. Avaliação da ação antifúngica dos óleos essenciais de Lippia gracillis e Lippia thymoides. In: Congresso Nacional de Botânica, 53, Reunião Nordestina de Botânica, 25, 2002, Recife. Resumos. Recife-PE: UFRP/UFP, 2002. p. 39. ANDERSON, H.W.; NEHRING, E.W.; WICHSER, W.R. Aflatoxin contamination of corn in the field. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 23, n. 4, p. 775-782, 1975. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. BANKOLE, S.A. & ADEBANJO, A. Inhibition of growth of some plant pathogenic fungi using some Nigerian plants. International Journal of Tropical Plant Deseases, Nova Delhi, v. 13, n. 1, p. 91-95, 1995. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, L.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinação de conídios de Curvularia spp. e Alternaria spp. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BASTOS, C.N. Inibição do crescimento micelial e germinação de esporos de Crinipellis perniciosa e Phytophthora palmivora por extrato de bulbo de alho (Allium sativum). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 17, n. 4, p. 454-456, 1992. BELÉM, L.F.; ARAÚJO, E.; LIMA, E.O. Estudo da atividade in vitro de produtos vegetais contra fungos de armazenamento isolados de sementes de Vigna unguiculata, Zea mays e Arachis hipogaea. In: Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 14, 1996, Florianópolis. Resumos. Florianópolis-SC: UFSC, 1996. p. 32.
BILGRAMI, K.S.; SINHA, K.K. & SINHA, A.K. Inhibition of aflatoxin production & growth of Aspergillus flavus by eugenol & onion & garlic extracts. Indian Journal Medical Research, Nova Delhi, v. 96, p. 171-175, 1992. BOLKAN, H.A. & RIBEIRO, W.R.C. Efeito de extrato de alho em Cylindrocladium clavatum, Fusarium moniliforme var. subglutinans e Rhyzoctonia solani. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 6, n. 3, p. 566, 1981. CHALFOUN, S.M. & CARVALHO, V.D. de. Efeito do extrato de óleo industrial de alho sobre o desenvolvimento de fungos. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 12, n. 3, p. 234-235, 1987. DHINGRA, O.D. & COELHO NETTO.R.A. Micotoxinas em grãos. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 6, p. 49-101, 1998.
DUBE, S.; UPADHYAY, P.D.; TRIPATHI, S.C. Antifungal, physicochemical, and insect-repelling activity of the essential oil of Ocimum basilicum. Canadian Journal of Botany (Journal Canadien de Botanique), Vancouver, v. 67, n. 7, p. 2085-2087, 1989. DWIVEDI, S.K.; DWIVEDI, S.K.; PANDEY, V.N.; DUBEY, N.K. Effect of essential oils of some higher plants on Aspergillus flavus Link. Infesting stored seeds of guar [Cyamopsis tetragonoloba L. (Taub.)]. Flavour and Fragrance Journal, Sussex, v. 6, n. 4, p. 295-297, 1991. FERNANDEZ, E.M.; ROSOLEM, C.A.; MARINGONI, A.C.; OLIVEIRA, D.M.T. Fungus incidence on peanut grains as affected by drying method and Ca nutrition. Field Crops Research, Amsterdam, v. 52, p. 9-15, 1997. GUNATLAKA, A.A.; KINGSTON, D.G.I.; JOHNSON, R.K. Mechanisms based isolation and estructures of some anticancer active natural products. Pure and Applied Chemistry, v. 66, p. 2219, 1994. INSTITUTO DE ECONOMIA AGRÍCOLA, São Paulo, Previsões e Estimativas das Safras Agrícolas por Região, 4º Levantamento, Abril de 2004. Disponível em:. Acesso em: 28 jun. 2004. KISHORE, N.; DUBEY, N.K.; SRIVASTAVA, O.P.; SINGH, S.K. Volatile fungitoxicity in some higher plants as evaluated against Rhizoctonia solani and some other fungi. Indian Phytopathology, Saint Paul, v. 36, n. 4, p. 724-726, 1983. LEDEZMA, E.; SOUSA, L. de; JORQUERA, A.; SANCHEZ, J.; LANDER, A.; RODRIGUEZ, E.; JAIN, M.K.; APITZ-CASTRO, R. Efficacy of ajoene, na organosulphur derived from garlic, in the short-term therapy of tinea pedis. Mycoses, Berlim, v. 39, p. 393-395, 1996. LOURIA, D.B.; LAVENHAR, M.; KAMINSKI. T.; ENG, H.K. Garlic (Allim sativum) in the treatment of experimental cryptococcosis. Journal of Medical and Veterinary Mycology, Oxfordshire, v. 27, p. 253-256, 1989.
MAHMOUD, A-L.E. Antifungal action and antiaflatoxigenic properties of some essential oil constituents. Letters in Applied Microbiology, Oxon, v. 19, n. 2, p. 110-113, 1994. MISHRA, D.; CHATURVEDI, R.V.; TRIPATHI, S.C. The fungitoxic effect of the esse tial oil of the herb Nardostachys jatamansi DC. Tropical Agriculture (Trinidad), Surey, v. 72, n. 1, p. 48-52, 1995. MISHRA, D. & DUBEY, N.K. Evaluation of some essential oils for their toxicity against fungi causing deterioration of stored food commodities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 60, n. 4, p. 1101-1105, 1994. MORAIS, L.A.S. de. Atividade antimicrobiana de extratos de algumas plantas medicinais sobre fitopatógenos do tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.). 2000. 109 p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia). Curso de Pós Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. MOURA, J.S. & PESSOA, M..N.G. Controle de Aspergillus sp. associado a sementes de algodão (Gossypium hirsuntum L.) no Estado do Ceará. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, suplemento, p. 398, 2000. RAHMAN, A.-ur-; CHOUDHARY, M.I.; FAROOQ, A; AHMED, A.; IQBAL, Z.; DEMIRCI, B.; DEMIRCI, F.; BASER, K.H.C. Antifungal activities and essential oil constituents of some spices from Pakistan. Third International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry (ECSOC-3), , September 1-30, 1999. RIBEIRO, L.F. & BEDENDO, I.P. Efeito inibitório de extratos vegetais sobre Colletotrichum gloeosporioides – agente causal da podridão de frutos de mamoeiro. Scientia Agrícola, Piracicaba, v. 56, n.1 (suplemento), 8 p., 1999. SAN-BLAS, G.; URBINA, J.A.; MARCHÁN, E.; CONTRERAS, L.M.; SORAIS, F.; SAN-BLAS, F. Inhibition of Paracoccidioides brasiliensis by ajoene is associated with blockade of phosphatidylcholine biosynthesis. Microbiology, New York, v. 143, p. 1583-1586, 1997. SAN MARTIN, P. Amendoim – uma planta da história no futuro brasileiro. São Paulo: Ícone Ed. Ltda., 1985. 68 p. (Coleção Brasil Agrícola – Série Principais Produtos). URBINA, J.A; MARCHAN, E.; LAZARDI, K.; VISBAL, G.; APITZ-CASTRO, R.; GIL, F.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M.M.; PIRAS.R. Inhibition of phosphatidylcholine biosíntesis and cell proliferation in Trypanosoma cruzi by ajoene, an antiplatelet compound isolated from garlic. Biochemical Pharmacology, Oxford, v. 45, n. 12, p. 2381-2387, 1993. WILSON, C.L.; SOLAR, J.M.; El-GHAOUTH, A.; WISNIEWSKI, M.E. Rapid evaluation of plant extracts and essential Oils for antifungal activity against Botrytis cinerea. Plant Disease, Saint Paul, v. 81, n. 2, p. 204-210, 1997. ZOHRI, A-N.; ABDEL-GAWAD, K.; SABER, S. Antibacterial, antidermatophytic and antitoxigenic activities of onion (Allium cepa L.) oil. Microbiological Research, Jena, v. 150, n. 2, p. 167-172, 1995.
4 CAPÍTLO III
QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE AMENDOIM INFLUENCIADAS PELOS PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL
4.1 RESUMO
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade fisiológica das sementes de amendoim da cultivar Tatu, tratadas com fungicidas sintéticos e óleos essenciais de plantas. Utilizou-se os fungicidas captan e benomyl além dos óleos essenciais de bulbilho de alho e casca de canela, dissolvidos em solventes orgânicos, bem como estes produtos naturais na forma de pó e o óleo essencial do capim limão. Foi verificado que as sementes embebidas em metanol, etanol e DMSO+MeOH apresentaram redução acentuada da germinação e do vigor.Os produtos a base de pó de alho e de canela e o fungicida captan favoreceram a germinação e o vigor das sementes e reduziram as plântulas infeccionadas. Palavras chaves: tratamento de sementes, fungicidas, óleos essenciais, germinação, vigor.
4.2 ABSTRACT
Physiological quality of peanut seeds as influenced by plant essential oils.
The objective of this work was to evaluate the effects of the synthetic fungicide and essential oils on the physiological quality of peanut (Arachis hypogaea L.) seeds cv. Tatu, that were stored for 12 months in drought chamber. There were comparator of the synthetic fungicide (captan and benomyl) and the garlic (Allium sativa L.) and the cinnamon (Cinnamomun zeilanicum Breyn.) essential oil, that were dissolved in the solvents and the powder products. It can conclude by the result that the seeds that were embebed in methanol, ethanol and DMSO+MeOH shawed reductuor the peanut seeds germination and vigour. The garlic and cinnamon powder and captan favored the peanut seeds germination and the vigor, as promoted the infected seedlings reduction.
Key words: seed treatment, fungicides, essential oils, germination, vigor.
4.3 INTRODUÇÃO
OS DANOS DECORRENTES DA ASSOCIAÇÃO DE PATÓGENOS COM SEMENTES NÃO SE LIMITAM APENAS A PERDAS DIRETAS DE POPULAÇÕES DE PLANTAS NO CAMPO. PARA GRANDE NÚMERO DE DOENÇAS DE NATUREZA DEVASTADORA, AS SEMENTES PORTADORAS DE SEUS AGENTES CAUSAIS CONSTITUEM-SE A ÚNICA FORMA DE DISSEMINAÇÃO E DE PERPETUAÇÃO NA NATUREZA. DENTRE OS AGENTES PATOGÊNICOS QUE PODEM ASSOCIAR-SE ÀS SEMENTES DE PLANTAS, OS FUNGOS FORMAM O MAIOR GRUPO (MACHADO, 2000).
EM SEMENTES DE AMENDOIM, O TRATAMENTO QUÍMICO CONSTITUI UMA MANEIRA EFICIENTE NO CONTROLE DE INÚMEROS PATÓGENOS PRESENTES NA SEMENTE E NO SOLO (MORAES & MARIOTTO, 1985; BANSAL & SOBTI, 1988; RAO ET AL., 1996; VANZOLINI ET AL., 2000). OS PRODUTOS THIRAN, CAPTAN, CHLORONEB, CARBOXIN, CAPTAFOL E BENOMYL, APLICADOS EM FORMULAÇÕES E DOSAGENS DIVERSAS, REDUZIRAM DE FORMA VARIÁVEL E EFICIENTE A INCIDÊNCIA DE FUNGOS NESTAS SEMENTES (MORAES & MARIOTTO, 1985). ALÉM DISSO, A APLICAÇÃO DE FUNGICIDAS SINTÉTICOS RESULTOU TAMBÉM NA ELEVAÇÃO DA GERMINAÇÃO, CONFORME FOI VERIFICADO PARA OS PRODUTOS CAPTAN, CARBENDAZIN E CAPTAFOL (TANAKA & CORRÊA, 1981; RAO ET AL., 1996).
NO ENTANTO, TAMBÉM TÊM SIDO CONDUZIDAS PESQUISAS COM RESULTADOS PROMISSORES EMPREGANDO PRODUTOS NATURAIS PARA CONTROLE DE PATÓGENOS ASSOCIADOS ÀS SEMENTES (MORAES & MARIOTTO, 1985). ASSIM SENDO, BANSAL & SOBTI (1990) OBTIVERAM RESULTADOS FAVORÁVEIS NO CONTROLE DE ASPERGILLUS NIGER E A. FLAVUS EM SEMENTES DE AMENDOIM, COM O USO DE EXTRATO DE FOLHA DE NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS), NÃO DIFERINDO DOS OBTIDOS COM OS FUNGICIDAS THIRAN E DITHANE M-45, ALÉM DE AUMENTAR A GERMINAÇÃO E REDUZIR A PORCENTAGEM DE SEMENTES DETERIORADAS.
Foi verificado por FERRACINI et al. (1990) que extratos de erva-de-Santa Maria (Chenopodium ambrosioides L.), Cimaba cedron, simaruba (Simarouba amara Aube.), quássia (Quassia spp.), Pterocaulon balansae e cinamomo (Melia azedarach L.), inibiram, in vitro, os fungos Fusarium solani f. sp. phaseoli, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfsii. Além disso, a incorporação de folhas de C. ambrosioides no solo promoveu o controle do tombamento de plântulas de feijoeiro causado por R. solani.
Após a verificação, in vitro, da eficiência do óleo essencial de capim limão [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.] no controle (100 %) de Aspergillus flavus, MISHRA & DUBEY (1994) avaliaram a fitotoxicidade do citral, componente presente em maior concentração no óleo essencial do capim limão. Para estes autores, não houve efeito deste na germinação de sementes e no crescimento das plântulas de trigo e arroz.
Grãos de trigo tratados por 24 horas com os óleos essenciais de orégano (Origanum vulgare L.) (2,0 µL/litro) e de tomilho (Thymus vulgaris L.) (4,0 µL/litro) apresentaram inibição do crescimento de Aspergillus spp. (PASTER et al., 1995). Estes mesmos autores verificaram, entretanto, que períodos superiores a 24 horas, proporcionaram redução da capacidade germinativa, quando foi avaliada ação no material a ser utilizado como semente. Também em sementes de feijão e de milho tratadas com óleo essencial ou com o pó do capim limão [Cymbopogon citratus (DC) Stapf.] e armazenados por 10 dias, ADEGOKE & ODESOLA (1996) observaram que estas sementes não apresentaram deterioração física, alteração no odor e na coloração, assim como crescimento de Aspergillus flavus, enquanto o mesmo não foi observado na amostra controle (não tratadas).
Os óleos essenciais de onze plantas foram estudados para controle de A. flavus em milho, tendo sido alcançada a inibição total de desenvolvimento do fungo por canela (Cinnamomum zeilanicum Breyn.), hortelã pimenta (Mentha piperita L.), manjericão (Ocimum basilicum L.), orégano (Origanum vulgare L.), Teloxys ambrosioides, cravo da Índia [Syzygium aromaticum (l.) Nerril.] e tomilho (Thymus vulgaris L.), além de não haver efeito fitotóxico na germinação e desenvolvimento das plântulas (MONTES-BELMONT & CARVAJAL, 1998).
Também COUTINHO et al. (1999) verificaram que extratos hidroalcoólicos de cascas secas de cajueiro (Anacardium occidentale L.) e de aroeira (Astronium urundeuva Engl.) utilizados no tratamento de sementes de feijão carioca, exerceram um controle parcial dos fungos encontrados. Entretanto, para Aspergillus flavus, o extrato de aroeira promoveu acima de 90 % de controle. Todavia, interferiram negativamente no processo de germinação das sementes, provavelmente, pela ação do solvente etanol, conforme verificado por PURCHIO & MUCHOVEJ (1990).
Foi observada por MORAIS (2000) atividade fungistática de óleo de copaíba (Copaifera spp.) e de óleo de sucupira (Pterodon ermaginatus Vogel) sobre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, ao tratar sementes de tomate, sem causar efeito tóxico às mesmas.
Já, GABRIEL et al. (2002), usando um novo análogo do estrigol, derivado do safrol, constataram que além de não afetar a germinação de sementes de alface, ainda estimulou a germinação das invasoras corriola [Ipomoea grandifolia (Dammer) O' Don – sinônimo de I. triloba L.] e picão preto (Bidens pilosa L.), demonstrando potencial para seu uso no estímulo à germinação precoce das invasoras antes do plantio.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade fisiológica das sementes de amendoim, da cultivar Tatu, tratadas com óleos essenciais de bulbilho de alho e de casca de canela com comprovada ação fungistática, comparado com fungicidas sintéticos e o pó das mesmas partes destas plantas.
4.4 MATERIAL E MÉTODOS Foram conduzidos seis experimentos no Laboratório de Análise de Sementes da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, em 2003, utilizando sementes de amendoim do cultivar Tatu, fornecidas pela COPLANA, situada no município de Guaíba/SP.
Primeiramente, testou-se o efeito dos óleos de canela e de alho sobre a germinação e o vigor das sementes de amendoim. Para tanto, as sementes foram imersas ou não em óleos essenciais de bulbilho de alho (2 mg/mL de solvente) e de casca de canela (2 mg/mL de solvente) e em água destilada. Em seguida, amostras de 25 sementes foram distribuídas em caixas plásticas tipo gerbox, sobre três folhas de papel germitest umedecidas com água destilada e esterilizadas. A incubação foi realizada a 25 0C por 7 dias, sob 12 horas de luz.
Para testar o efeito dos tratamentos a base de óleo mineral extraído de alho e de canela e diluído em solvente (DMSO+MeOH 50 % v/v) sobre a germinação e o vigor das sementes de amendoim, realizou-se o primeiro experimento. Foram comparados captan (3 kg de p.a./kg de sementes) e benomyl diluído em água (0,2 g/20 mL) e benomyl diluído em solvente (0,2 g/20 mL) e óleo essencial de alho e óleo essencial de casca de canela, ambos em duas doses (1 e 2 mg/mL de solvente), além de duas testemunhas com embebição em água destilada e em solvente (DMSO + MeOH – 50 % v/v). O procedimento de embebição foi realizado por cinco minutos, usando 20 mL de cada solução ou água destilada para cada lote de 25 sementes. Em seguida, estas sementes foram submetidas ao teste de germinação, em substrato de papel. Para isto, subamostras de 25 sementes foram distribuídas sobre três folhas de papel germitest umedecido com água destilada e esterilizada no volume de 2,5 vezes o peso do substrato. Após a confecção dos rolos, estes foram mantidos a 25 0C. As avaliações foram realizadas após 5 e 10 dias da instalação, com base em BRASIL (1992). Das plântulas normais foram removidos os cotilédones, e em seguida estas foram colocadas para secar por 24 horas, a 80 0C, com base em NAKAGAWA (1999). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições.
Para verificar as causas de queda de germinação, realizou-se o segundo experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: óleos essenciais de alho e de casca de canela (2 mg/mL de solvente), duas testemunhas com embebição em água destilada e em solvente (DMSO + MeOH – 50 % v/v) e uma testemunha sem embebição. O procedimento de embebição foi realizado conforme anterior. Em seguida, estas sementes foram submetidas ao teste de germinação, em substrato de areia. Para isto, subamostras de 10 sementes foram distribuídas em caixas plásticas contendo areia, umedecidas com 17 mL de água/100 g de areia. As caixas foram mantidas em ambiente com temperatura de 25±3 0C. A avaliação foi realizada aos 10 dias após a instalação. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento anterior. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições.
Para verificar a influência dos solventes sobre a baixa germinação e o desempenho das plântulas, realizou-se o terceiro experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: embebição em solução comercial de hipoclorito de sódio (2 % por 3 minutos) e secas por 24 horas, sendo que posteriormente, as não tratadas com hipoclorito, foram submetidas a embebição em DMSO+MeOH (50 % v/v), metanol (25 % de MeOH+75 % de água estéril), etanol (25 % de etanol + 75 % de água estéril) e em água destilada e, uma testemunha sem embebição. O procedimento de embebição foi realizado conforme anterior. Estas sementes foram distribuídas em rolos de papel germitest, que foram mantidos em germinador a 250C. As avaliações foram realizadas aos 5 e 10 dias após a instalação. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento anterior.
Para verificar a eficiência dos princípios ativos encontrados no bulbilho de alho e na casca de canela numa forma alternativa ao óleo sobre a germinação e o vigor, realizou-se o quarto experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: solução comercial de hipoclorito de sódio (2 % por 3 minutos), pó de alho (0,15 g/100 sementes), pó de casca de canela (0,15 g/100 sementes), óleo essencial de alho (2 mg/mL do solvente) e óleo essencial de casca de canela (2 mg/mL do solvente). O solvente dos óleos essenciais foi o DMSO+MeOH 50 % v/v. O procedimento de embebição foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram instaladas em caixas plásticas tipo gerbox, contendo papel germitest, previamente esterilizadas, que foram mantidas a 25 0C. As avaliações foram realizadas aos 5 e 10 dias após a instalação. Os demais procedimentos foram semelhantes ao experimento 1.
Para verificar a possível vantagem da associação do hipoclorito de sódio aos pós de alho e canela, realizou-se o quinto experimento, no qual as sementes foram
submetidas aos seguintes tratamentos: embebição com hipoclorito de sódio (2 % por 3 minutos) e secagem por três horas, sendo que as sementes tratadas com hipoclorito foram submetidas a aplicação de pó de alho (0,15 g/100 de sementes), pó de casca de canela (0,15 g/100 sementes) e pó de capim-limão (0,15 g/100 sementes). Também foi realizado o tratamento com captan (0,15 g/100 sementes) e uma testemunha sem tratamento. O procedimento de embebição foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram distribuídas em rolos de papel germitest, previamente esterilizados, que foram mantidos em germinador a 25 0C. As avaliações foram realizadas aos 5 e 10 dias após a instalação.
Para verificar a eficiência do tratamento com pó, por ser o mais prático para o produtor, realizou-se o sexto experimento, no qual as sementes foram submetidas aos seguintes tratamentos: embebição com hipoclorito de sódio (2 % por 3 minutos), e secagem por 24 horas, sendo que as sementes tratadas ou não previamente com hipoclorito de sódio, foram submetidas a aplicação de pó de alho (0,15 g/100 sementes), pó de casca de canela (0,15 g/100 sementes) e pó de capim-limão (0,15 g/100 sementes). Também, foi realizado o tratamento com captan (0,15 g/100 sementes e uma testemunha sem tratamento). O procedimento de embebição foi realizado conforme anterior. Posteriormente, as sementes foram distribuídas em rolos de papel germitest, previamente esterilizados, que foram mantidos em germinador a 25 0C. As avaliações foram realizadas aos 5 e 10 dias após a instalação.
Os dados foram submetidos aos testes de Cochran e Bartlet e de Lilliefors para a homogeneidade da variância e normalidade. Quando não foi observada a
homogeneidade e normalidade, os dados foram transformados em arcseno x / 100 e submetidos a análise de variância. As medias foram comparadas pelo Teste de Tukey, a 5 % de probabilidade. Nas tabelas estão apresentados os dados originais, sem transformação.
4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste de sanidade de sementes de amendoim, quando foi empregado o óleo essencial de alho, foi verificado aumento da contaminação por Rhyzopus spp. e Penicillium spp., provavelmente, devido a intensa liberação de exsudatos das sementes provocada pela ação do solvente, enquanto houve redução da contaminação por fungos do grupo Aspergillus flavus (Tabela 28). Em testes realizados in vitro foi constatado que os óleos essenciais não promoveram ação inibidora ou restritiva no crescimento de Rhyzopus spp. e de Penicillium spp. Observação semelhante foi feita por APLETON & TANSEY (1975) para Penicillium spp., quando conseguiram, no máximo, crescimento dos fungos tratados com extrato aquoso de bulbos frescos de alho, igual ao controle. Pelas Tabelas 29, 31 e 33 pode ser verificado que houve diferença significativa entre os tratamentos químicos. Ao ser verificado que o benomyl e os óleos essenciais de alho e canela dissolvidos em solvente (DMSO+MeOH) provocaram redução acentuada na germinação bem como aumento significativo de plantas anormais infeccionadas (Tabela 30), instalou-se o segundo experimento para avaliar o efeito deste solvente sobre o desempenho das sementes, sendo que na avaliação do mesmo, foi constatado que a testemunha e o tratamento somente com água esterilizada foram superiores àqueles em que o solvente estava presente (Tabela 32). Quando foi aplicado o fungicida captan às sementes de amendoim, foi constatado maior germinação, menor porcentagem de plântulas anormais infeccionadas, principalmente, por fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus e maior vigor avaliado pela porcentagem de plântulas normais na primeira contagem e pela massa de plântulas (Tabela 30), embora não tenha diferido do benomyl. Além disso,
houve redução da germinação com o uso de óleos essenciais de alho e de canela. No entanto, quando as sementes de amendoim foram tratadas com extrato aquoso de folhas de nim (Azadirachta indica L.), BANSAL & SOBTI (1990) verificaram redução de fungos do gênero Aspergillus, principalmente, os do grupo A.flavus, sem causar danos à germinação. De acordo com LIMA & ARAÚJ0 (1999), sementes de amendoim infectadas principalmente por Aspegillus flavus têm sua qualidade fisiológica reduzida mais rapidamente do que outras espécies. Além disso, este fungo, assim como Rhizopus spp. e Penicillium spp. são considerados típicos de armazenamento (NEERGAARD, 1979) e, freqüente nas sementes desta espécie (VANZOLINI et al., 2000). Na avaliação da emergência em areia (Tabela 32), quando as sementes foram tratadas com óleo de canela e de alho, solubilizados em DMSO+MeOH, também foi verificado que houve redução da porcentagem de emergência e aumento da porcentagem de plântulas anormais infeccionadas, sendo que estes valores foram menores que os constatados na avaliação da germinação, em substrato de papel (Tabela 30), provavelmente, devido a limitação dos fungos ao tegumento das sementes, por ocasião da emergência das plântulas. Além disso, na avaliação in vitro, com o emprego de extrato aquoso de bulbilho de alho, foi constatada redução significativa no crescimento micelial de Curvularia spp. e Alternaria spp. (BARROS et al., 1995) e de Colletotrichum gloeospoioides (RIBEIRO & BEDENDO, 1999), embora não tenha afetado a produção de conídios.
Tabela 28. Dados de porcentagem de fungos em sementes de amendoim, cultivar Tatu, tratadas com óleos essenciais. Seropédica-RJ. 2003.
Óleos essenciais
Fungos Alho Casca de canela
Testemunha
Rhyzopus spp. 21 4 3
Penicillium spp. 37 44 8 Grupo Aspergillus flavus 6 14 28 Tabela 29. Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas (g), submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (1° experimento). Fontes de Variação
G.L.
PN-PC Germinação PAI SM Massa
plântula Tratamentos 8 20,0278** 24,7077** 2353,0000** 3,3706* 0,010513**
Resíduo 27 67435,9 1,5812 198,0741 1,1229 0,001946
C.V. (%) 28,42 25,73 21,43 63,35 41,37 *- significativo a 5 % de probabilidade; **- significativo a 1 %
Tabela 30. Dados médios de porcentagem de plântulas normais de primeira contagem, germinação, de plântulas anormais infeccionadas (PAI) e de sementes mortas (SM), e massa seca de plântulas (g) obtidas no primeiro experimento de sementes de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003.
Tratamentos PN-PC Germinação PAI SM Massa/plântula
Embebida em água esterilizada
10,0ab* 51,0bc 46,0bc 2,0b 0,183a
Alho (1 mg/mL solv.)
9,0ab 9,0de 89,0a 2,0b 0,051b
Alho (2 mg/mL solv.)
13,0ab 25,0bcd 73,0ab 2,0b 0,121ab
Canela (1 mg/mL solv.)
5,0ab 8,0de 80,0a 12,0a 0,036b
Canela (2 mg/mL solv.)
1,0b 2,0e 92,0a 6,0b 0,047b
Benomyl (0,2 g/20mL água)
22,0a 53,0ab 44,0bc 2,0b 0,131ab
Benomyl (0,2 g/20mL solv.)
6,0ab 26,0bcd 65,0ab 9,0b 0,131ab
Captan (3 g/kg semente)
22,0a 78,0a 20,0c 0,0b 0,156a
Solvente (DMSO+MeOH)
6,0ab 18,0cd 82,0a 0,0b 0,117ab
C.V. (%) 28,42 25,73 21,43 63,35 41,37 *Médias seguidas por letras iguais, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Tabela 31. Quadrado médio para os dados de germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (2° experimento). Fontes de Variação
G.L. Germinação PAI SM Massa/plântula
Tratamentos 5 1863,120** 1889,596** 14,7282* 0,0176** Resíduo 44 225,1387 232,4812 2,7212 0,004238 C.V. (%) 24,360 40,984 69,26 31,504 *- Significativo a 5 % de probabilidade; **- significativo a 1 %
Tabela 32. Dados médios de porcentagens de emergência, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM) e de massa seca de plântulas (g), obtidos no (2° experimento) de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003.
Tratamento Emergência PAI SM Massa/plântula
Não embebida em água
77,0a* 17,0c 6,0b 0,215ab
Embebida em água esterilizada
63,0ab 29,0bc 8,0b 0,197ab
Alho (2mg/ml solvente)
47,0c 50,0a 3,0b 0,187b
Canela (2mg/ml solvente)
49,0bc 47,0b 4,0b 0,272a
Solvente (DMSO+MeOH)
47,0c 30,0bc 23,0a 0,141b
C.V. (%) 24,36 40,98 69,26 31,50 * Médias seguidas por letras iguais, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Tabela 33. Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de solventes (3° experimento). Fontes de Variação
G.L. PN-PC Germinação PAI SM
Tratamentos 5 132,6417** 2829,467** 2378,8000** 6429,867** Resíduo 18 16,7083 471,7778 461,5556 119,111 C.V. (%) 74,887 77,114 58,860 30,888 **- significativo a 1 % de probabilidade Sementes que foram embebidas em metanol e em DMSO+MeOH apresentaram redução acentuada da germinação e do vigor, avaliado pela porcentagem de plântulas normais na primeira contagem, assim como as sementes que foram embebidas em etanol não germinaram (Tabela 34). Estes resultados permitem inferir que a redução da germinação das sementes embebidas em óleos (Tabelas 30 e 32), provavelmente, foi devido ao solvente utilizado. PURCHIO & MUCHOVEJ (1990), avaliando a ação do etanol como veículo dos fungicidas benomyl e captan no tratamento de sementes de trigo, constataram que esse solvente prejudicou a germinação das sementes desta
espécie. Também, COUTINHO et al. (1999) verificaram que os extratos vegetais hidroalcoólicos de cascas de cajueiro (Anacardium occidentale L.) e de aroeira (Astronium urundeuva Engl.), quando aplicados em mistura ao benomyl e captan, reduziram a ocorrência de Aspergillus flavus, porém com redução da germinação das sementes, possivelmente, em função destes extratos terem sido solubilizados em etanol, conforme explicação anterior.
Considerando que as sementes utilizadas (testemunha) apresentavam-se contaminadas (Tabela 34), optou-se por tratar as mesmas com solução comercial de hipoclorito de sódio, sendo que pelos resultados foi constatado que não houve diferença significativa entre os tratamentos (Tabela 36). Tabela 34. Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 3° experimento de amendoim cv. Tatu, tratadas com solventes. Seropédica-RJ. 2003. Tratamentos PN-PC Germinação PAI SM
DMSO+MeOH 22,0bc* 38,0ab 37,0ab 25,0c
Methanol 2,0c 2,0b 26,0b 71,0b
Etanol 0,0c 0,0b 2,0b 96,0a
Hipoclorito 44,0ab 53,0a 42,0ab 5,0c
Embebida em água
55,0a 62,0a 35,0ab 3,0c
Testemunha 8,0bc 14,0ab 77,0a 9,0c
C.V. (%) 74,88 77,11 58,86 30,88 *Medias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Tabela 35. Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas naturais (4° experimento). Seropédica-RJ. 2004. Fontes de Variação
G.L. PN-PC Germinação PAI SM
Tratamentos 4 13,8000ns 369,2000ns 344,0000ns 44,8000ns Resíduo 15 14,1167 322,6667 287,7333 62,9333 C.V. (%) 35,954 36,216 58,492 73,454 ns- não significativo
Tabela 36. Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 4° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. Tratamentos PN-PC Germinação PAI SM
Hipoclorito 34,0a* 41,0a 42,0a 9,0a
Pó de alho 42,0a 45,0a 31,0a 11,0a
Pó de canela 54,0a 66,0a 22,0a 7,0a
Óleo de alho + solvente
40,0a 48,0a 28,0a 16,0a
Óleo de canela + solvente
39,0a 48,0a 19,0a 11,0a
C.V. (%) 35,95 5 6,22 58,49 73,45 *Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Devido ao prejuízo causado pelos solventes na germinação de sementes de amendoim, foi avaliado o emprego dos produtos na forma de pó (Tabela 37). Sendo que as sementes tratadas com os produtos na forma de pó (canela, alho e capim limão) não diferiram do fungicida captan (Tabela 38), quanto à germinação e plântulas anormais infeccionadas. Tabela 37. Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas, submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (5° experimento). Fontes de Variação
G.L. PN-PC Germinação PAI SM
Tratamentos 5 33,0417ns 882,2667** 447,4667** 64,6667ns Resíduo 18 13,5417 66,0000 28,0000 60,2222 C.V. (%) 21,594 9,928 61,056 245,062 ns- não significativo; **- significativo a 1 % de probabilidade
Tabela 38. Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI) e sementes mortas (SM), obtidos no 5° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. Tratamentos PN-PC Germinação PAI SM
Testemunha 63,0a* 66,0b 25,0a 6,0a
Hipoclorito (H)
49,0a 60,0b 19,0a 10,0a
Captan 65,0a 95,0a 0,0b 0,0a
H+pó de canela
79,0a 91,0a 2,0b 0,0a
H+pó de alho 76,0a 89,0a 4,0b 2,0a
H+pó de capim-limão
77,0a 90,0a 2,0b 1,0a
C.V. (%) 21,59 9,92 61,05 245,06 *Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Além disso, na Tabela 39 pode ser constatado que somente não houve diferença entre os tratamentos para sementes mortas. Tabela 39. Quadrado médio para os dados de plântulas normais de primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, submetidas ao uso de fungicidas sintéticos e naturais (6° experimento). Fontes de Variação
G.L. PN-PC Germinação PAI SM Massa/Plântula
Tratamentos 8 98,98** 113,88** 79,34** 3,62ns 1,02** Resíduo 27 12,48 12,49 10,53 1,25 0,12 C.V. (%) 22,87 21,89 48,289 96,18 39,209 ns- não significativo; **- significativo a 1 % de probabilidade O emprego de produtos em pó (canela e alho) e de captan favoreceu a germinação e o vigor das sementes de amendoim, avaliados pelos testes de primeira contagem e de massa seca das plântulas normais, assim como propiciou diminuição da porcentagem de plântulas anormais infeccionadas (Tabela 40). Assim, considerando-se 70% como valor mínimo de germinação aceitável para a semeadura do amendoim e o estabelecimento adequado de plantas no campo (BRASIL, 1999), verificou-se que estas sementes poderiam ser comercializadas, após a aplicação destes produtos, assim como também constatado por VANZOLINI et al. (2000), que verificaram comportamento semelhante com o uso de captan. Além disso, ADEGOKE & ODESOLA (1996),
avaliando a ação de óleo e de pó de capim limão, não observaram efeito favorável do uso de pó de capim limão (Cymbopogon citratus) no controle da deterioração das sementes de milho e de caupi. No entanto, os autores sugerem que seja avaliada a possibilidade de utilização destes produtos, em maiores doses ou no procedimento de encapsulação, devido apresentar os mesmos componentes ativos do óleo essencial. Além disso, na Tabela 40, foi verificado que o tratamento com hipoclorito de sódio propiciou redução da germinação e do vigor das sementes. No entanto, estes valores não diferiram do apresentado pelas sementes não tratadas (controle). Estes resultados podem estar relacionados à eficiência do hipoclorito de sódio no controle da eliminação de patógenos, como constatado por ARAÚJO (2004), que somente houve eliminação de fungos do grupo Aspergillus flavus, quando foi empregada uma solução comercial a 3% por dez minutos, como também podem estar relacionados ao grau de suscetibilidade das sementes de amendoim à injúria provocada pela rápida embebição das sementes por meio da imersão em água destilada. De acordo com KRAFT (1977), as alterações na permeabilidade das membranas celulares, promovidas pela embebição, podem propiciar a eliminação de substâncias para o substrato e favorecer a atividade de microrganismos, como também constatado por VERTUCCI (1989), que observaram que a eficiência da reorganização dos constituintes celular depende da velocidade de hidratação. Assim, deve haver compatibilidade entre os resultados da aplicação dos produtos para permitir o controle de patógenos e ao mesmo tempo não prejudicar ou até mesmo melhorar o desempenho das sementes, como também constatado por COUTINHO et al. (1999). Tabela 40. Dados médios de porcentagens de plântulas normais na primeira contagem, germinação, plântulas anormais infeccionadas (PAI), sementes mortas (SM) e massa seca de plântulas, obtidos no 6° experimento de amendoim cv. Tatu. Seropédica-RJ. 2003. Tratamentos PN-PC Germinação PAI SM Massa Seca (g)
Testemunha 66,0bc* 68,0abc 22,0cd 7,0a 0,184bc
Hipoclorito (H)
57,0bc 60,0c 28,0bcd 8,0a 0,216ab
H.+ pó de canela
38,0d 42,0d 42,0ab 10,0a 0,188bc
H.+ pó de alho
64,0b 66,0c 21,0cd 8,0a 0,188bc
Pó de canela 83,0a 83,0ab 14,0cd 3,0a 0,244ab
Pó de alho 89,0a 89,0ab 11,0d 0,0a 0,240ab
Captan 80,0a 93,0a 2,0d 0,0a 0,300a
H.+ pó de capim-limão
35,0d 35,0e 56,0a 5,0a 0,080d
Pó de capim-limão
44,0cd 44,0d 46,0ab 1,0a 0,148bcd
C.V. (%) 22,87 21,89 48,28 96,18 39,20 *Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
4.6 CONCLUSÕES
1. As sementes embebidas em solventes orgânicos apresentaram redução
acentuada da germinação e do vigor.
2. Os produtos a base de pó de alho e de canela favoreceram a germinação e o vigor das sementes e reduziram a porcentagem de plântulas infeccionadas.
4.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS centralizar
ADEGOKE, G.O. & ODESOLA, B.A. Storage of maize and cowpea and inhibition of microbial agents of biodeterioration using the powder and essential oil of lemon grass (Cymbopogon citratus). International Biodeterioration & Biodegradation, Essex, v. 37, n. 1/2, p. 81-84, 1996. APPLETON, J.A. & TANSEY, M.R. Inhibition of growth of zoopathogenic fungi by garlic extract. Mycologia, Lawrence, v.67, p. 882-885, 1975. ARAÚJO, A.E.S. Avaliação da qualidade sanitária e fisiológica em sementes de amendoim (Arachis hypogaea L.), 2004, 64p. (dissertação-Mestrado CPGF/UFRRJ). BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Control of Aspergillus flavus associated with groundnut seeds. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 41, n. 4, p. 643-644, 1988. BANSAL, R.K. & SOBTI, A.K. Na economic remedy for the control of two species of Aspergillus on groundnut. Indian Phytopathology, Nova Delhi, v. 43, p. 451-452, 1990. BARROS, S.T.; OLIVEIRA, N.T.; MAIA, C.C. Efeito do extrato de alho (Allium sativum) sobre o crescimento micelial e germinação de conídios de Curvularia spp. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 21, n. 2, p. 168-170, 1995. BRASIL, Ministério da Agricultura. Regras para análise de sementes. Brasília: SNAD/DNPV/CLAV, 1992. 365 p. BRASIL, Ministério da Agricultura. Comissão Estadual de Sementes e Mudas. Padrões de sementes para safra 99/2000. Campinas: Secretaria de Agricultura do Estado de São Paulo. 1999. 1p. COUTINHO, W.M.; ARAÚJO, E.; MAGALHÃES, F.H.L. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.23, n. 3, p. 560-568, jul./set., 1999. FERRACINI, V.L.; MELO, I.S.; FRIGHETO, R.T.S. Influência de Chenopodium ambrosioides L. no crescimento micelial e germinação de escleródios de Sclerotium rolfsii. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 15, n. 2, p. 176-, 1990. GABRIEL, A.J.A.; LIMA, M.F.F.; SOUZA, M.A.A.; SOUZA, S.R. Germinação de sementes de alface e de duas ervas invasoras com a aplicação de um novo análogo do estrigol, sintetizado a partir do safrol. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 20, n. 4, p. 544-546, dezembro 2002.
KRAFT, J.M. The role of delphenidin and sugars in the resistance of peã seedlings of Fusarium root. Phytopathology, Saint Paul, v. 67, n. 10, p. 1057-1067, 1977. LIMA, E.F. & ARAÚJO, A.E. Fungos causadores de tombamento, transportados e transmitidos através da semente do amendoim. Revista de Oleagisosas e Fibrosas, Campina Grande, v.3, n. 2, p. 71-76, mai-ago. 1999. MACHADO, J. da C. Tratamento de Sementes no Controle de Doenças. Lavras: LAPS/UFLA/FAEPE, 2000. 138 p. MISHRA, A.K. & DUBEY, N.K. Evaluation of some essential oils for their toxicity against fungi causing deterioration of stored food commodities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 60, n. 4, p. 1101-1105, apr. 1994. MONTES-BELMONT, R. & CARVAJAL, M. Control of Aspergillus flavus in maize with plant essential oils and their components. Journal of Food Protection, Ames, v.61, n. 5, p. 616-619, 1998. MORAES, S.A. de & MARIOTTO, P.R. Diagnóstico da patologia de sementes de amendoim no Brasil. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, ano 7, n.1, p. 41-43, 1985. MORAIS, L.A.S. de. Atividade antimicrobiana de extratos de algumas plantas medicinais sobre fitopatógenos do tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.). 2000. 109 p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia). Curso de Pós Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. NAKAGAWA, J. Testes de vigor baseados no desempenho das plântulas. In: KRZYZANOWSKI, F.C.; VIEIRA, R.D.; FRANÇA NETO, J.B. Vigor de sementes: conceito e testes. Londrina: ABRATES. 1999. NEERGAARD, P. Seed Pathology. 2ed. London: MacMillan Press, 1979, v. 2, 1191p. PASTER, N.; MENASHEROV, M.; RAVID, U.; JUVEN, B. Antifungal activity of orégano and thyme essential oils applied as fumigants against fungi attacking stored grain. Journal of Food Protection, Ames, v. 58, n. 1, p. 81-85, jan. 1995. PURCHIO, A.F. & MUCHOVEJ, J.J. Organic solvents as vehicles of fungicides in seeds of wheat. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 15, n. 3, p. 226-228, set. 1990. RAO, V.V.R.; REDDY, M.S.; RAO, K.C. Effect of fungicidal treatment on the viability of groundnut (Arachis hypogaea L.) seed in storage. Seed Research, Nova Delhi, v. 24, n. 1, p. 66-68, 1996. RIBEIRO, L.F.; BEDENDO, I.P. Efeito inibitório de extratos vegetais sobre Colletotrichum gloeosporioides – agente causal da podridão de frutos de mamoeiro. Scientia Agrícola, Piracicaba, v. 56, n. 4, p. 1-8, 1999. TANAKA, M.A. & CORRÊA, M.U. Influência de Aspergillus e Penicillium no armazenamento de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 6, n. 3, p. 451-456, out. 1981.
VANZOLINI, S.; TORRES, R.M.; PANIZZI, R.C. Efeito do tamanho, da densidade e do tratamento fungicida sobre a qualidade das sementes de amendoim. Revista Ceres, Viçosa, v. 47, n. 274, p. 603-612, 2000. VERTUCCI, C.W. The kinectis of seed imbibition. In: CROP SCIENCE SOCIETY OF AMERICA. Seed Moisture. Madison: CSSA, 1989. p. 93-115 (CSSA. Special Publication, 14).