tese de doutorado...muito obrigado. a todos os professores que contribuíram para a minha formação...

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-graduação em Engenharia Química

TESE DE DOUTORADO

Produção de celulases por Aspergillus fumigatus através da

fermentação em estado sólido e recuperação e purificação

por sistema micelar em duas fases aquosas

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo

NATAL/RN

FEVEREIRO/2018

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior


fermentação em estado sólido e recuperação e purificação por

extração micelar em duas fases aquosas

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como parte dos requisitos necessários para

obtenção do grau de Doutor em Engenharia

Química, sob orientação do Prof. Dr. Everaldo

Silvino dos Santos e coorientação da Profa. Dra.

Gorete Ribeiro de Macedo.

NATAL/RN

FEVEREIRO/2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Oliveira Júnior, Sérgio Dantas de.


fermentação em estado sólido e recuperação e purificação por

extração micelar em duas fases aquosas / Sérgio Dantas de

Oliveira Júnior. - 2018.

144f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós Graduação em

Engenharia Química, Natal, 2018.

Orientador: Dr. Everaldo Silvino dos Santos; Profª. Drª.

Gorete Ribeiro de Macedo.

1. Fermentação em estado sólido - Tese. 2. Enzimas celulases -

Tese. 3. Aspergillus fumigatus - Tese. I. Macedo, Everaldo

Silvino dos Santos. II. Drª. Macedo, Gorete Ribeiro de. III.

Título.

RN/UF/BCZM CDU 663.15

Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429

JÚNIOR, Sérgio Dantas de – Produção de celulases por Aspergillus fumigatus através da

fermentação em estado sólido e recuperação e purificação por sistema micelar em duas fases

aquosas. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos Químicos,

Biotecnológicos e Catálise, Natal/RN, Brasil, 2018.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo

Resumo: Ameaças à sustentabilidade decorrente do desenvolvimento industrial, a dependência

energética e a demanda exponencial pela produção de alimentos têm levado ao crescente

interesse de fontes alternativas e renováveis de energia como, por exemplo, a biomassa vegetal.

Neste cenário, a viabilização do etanol a partir de biomassa (etanol de segunda geração (2G)),

que não gere competição por terra cultivável, tais como bagaço de cana-de-açúcar, fibra coco e

o pedúnculo de caju. A hidrólise enzimática é etapa importante na produção de etanol 2G.

Entretanto, o custo de produção das celulases ainda é um gargalo no processo. Neste cenário, a

viabilização da utilização dessas biomassas neste trabalho teve como objetivo avaliar a de

produção celulases utilizando resíduos provenientes da indústria brasileira, o bagaço de cana-

de-açúcar, fibra de coco e a fibra do pedúnculo de caju, para produção de celulases por

fermentação em estado sólido (FES) através de um planejamento experimental com o

microrganismo Aspergillus fumigatus. Inicialmente, as três fibras lignocelulósicas foram

caracterizadas e usadas para se avaliar o potencial de produção de celulases por FES. Em

seguida, aplicou-se os pré-tratamentos alcalinos (NaOH e Ca(OH)2) no resíduo que apresentou

as maiores atividades celulolíticas (CMCase e FPase) produzidas e o teor de proteínas totais. O

extrato enzimático produzido foi utilizado para produção de nanocristais de celulose (NNC). A

recuperação e a purificação das celulases foi realizada usando-se o Sistema Micelar de Duas

Fases Aquosas (SMDFA) com o Triton X-114 como surfactante. Os resultados da

caracterização mostraram a seguinte composição: bagaço de cana-de-açúcar (39,25% ± 5,49 de

celulose; 25,20% ± 1,13 de hemicelulose e 18,82% ± 0,01 de lignina), fibra de coco (36,23% ±

0,09 de celulose; 27,79% ± 0,37 de hemicelulose e 30,23% ± 0,12 de lignina); e fibra do

pedúnculo de caju (21,02% ± 0,31 de celulose; 11,50% ± 1,13 de hemicelulose e 45,84% ± 1,28

de lignina). Em condições otimizadas obteve-se as atividades de FPase (0,64 UI/g) e CMCase

(4,28 UI/g) e proteínas totais de 0,28 mg/mL. A atividade de CMCase foi estável à 60 °C

apresentando atividade relativa de 70%, enquanto que FPase apresentou uma estabilidade de

30% à 50 °C. O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH apresentou teor de celulose

de 56,63% ± 0,10; teor de hemicelulose de 19,23% ± 1,69 e teor de lignina de 9,92% ± 1,19.

Os nanocristais produzidos apresentaram a melhor forma e tamanho após 48h de hidrólise, com

formato circulares. O uso do SMDFA permitiu recuperar e purificar a enzima com coeficiente

de partição (K) de 9,33 para a enzima CMCase e de 5,00 para a enzima FPase ambas à 60 °C.

O fator de purificação para CMCase foi 10,89 e para a FPase de 0,65. No presente estudo, as

condições de fermentação em estado sólido foram otimizadas para a produção de celulases por

A. fumigatus. As enzimas foram aplicadas na hidrólise enzimática para a geração de nanocristais

de celulose com êxito, e a técnica de purificação aplicada nas celulases pode ser considerada

uma alternativa promissora.

Palavras-chave: Fermentação em estado sólido. Enzimas celulases. Bagaço de cana-de-açúcar.

Aspergillus fumigatus. Nanocristais de celulose.

Abstract

Threats to sustainability stemming from industrial development, energy dependency and the

exponential demand for food production have led to the growing interest of alternative and

renewable sources of energy such as plant biomass. In this scenario, the viability of ethanol

from biomass (second generation ethanol (2G)), which does not generate competition for arable

land, such as sugarcane bagasse, coconut fiber and the cashew peduncle. Enzymatic hydrolysis

is an important step in the production of 2G ethanol. However, the producing costs of cellulases

is still a bottleneck of the process. Thus, the aim of this work was to contribute in the reduction

of cellulase production costs using residues from Brazilian industry, e.g. sugarcane bagasse,

coconut fiber and cashew peduncle fiber, for the purpose of cellulases production by solid state

fermentation (SSF) through an experimental planning using the Aspergillus fumigatus as

microorganism. Initially, the three lignocellulosic fibers were characterized and used to

measure the potential of cellulase production by SSF. Then, alkaline pre-treatments (NaOH and

Ca(OH)2) were applied to the residue that presented cellulolytic activity (CMCase and FPase)

and the total protein content. The enzymatic extract produced was used for the cellulose

nanocrystals production (NNC). Recovery and purification of the cellulases were performed

using the Two Phase Aqueous Micellar System (ATPMS). The characterization results showed

the following composition: sugarcane bagasse (39.25% ± 5.49 cellulose, 25.20% ± 1.13

hemicellulose and 18.82% ± 0.01 lignin) , coconut fiber (36.23 ± 0.09 cellulose, 27.79 ± 0.37

hemicellulose and 30.23 ± 0.12 lignin); and cashew peduncle fiber (21.02% ± 0.31 cellulose,

11.50% ± 1.13 hemicellulose and 45.84% ± 1.28 lignin). Under optimized conditions, the

activities of FPase (0.64 IU/g) and CMCase (4.28 IU/ g) and total proteins of 0.28 mg / mL

were obtained. The CMCase activity was stable at 60 °C showing a relative activity of 70%,

whereas FPase showed a stability of 30% at 50 °C. The pretreated of sugarcane bagasse using

NaOH had a cellulose content of 56.63% ± 0.10; hemicellulose content of 19.23% ± 1.69 and

lignin content of 9.92% ± 1.19. The produced of nanocrystals presented the best shape and size

after 48h of hydrolysis, with a circular shape. The use of ATPMS allowed the recovery and the

purification of the enzyme with partition coefficient (K) of 9.33 for the enzyme CMCase and

of 5.00 for the enzyme FPase both at 60 °C. The purification factor for CMCase was 10.89 and

for the FPase of 0.65. In the present study, the solid state fermentation conditions were

optimized for the production of cellulases by A. fumigatus, the enzymes were applied in the

enzymatic hydrolysis for the generation of cellulose nanocrystals successfully, and the

purification technique applied in the cellulases can be considered a promising alternative.

Keywords: Solid state fermentation. Cellulase enzymes. Sugarcane bagasse. Aspergillus

fumigatus. Cellulose nanocrystals.

À memória da minha amada mãe Maria de Lourdes Dantas de Oliveira.

DEDICATÓRIA

Às pessoas mais importantes de minha

vida: Minha Família (Mãe, Pai, Irmã e

Irmão). Pessoas que fazem a diferença,

sem as quais de nada vale o esforço de

tentar ser alguém cada dia melhor.

In Memorium de “Maria de Lourdes Dantas de Oliveira”

O verdadeiro amor da minha vida, por ela e tudo por ela, foi e será a única

pessoa que realmente valeu todo o sacrifício em lutar e conquistar todos os meus

objetivos.

Sei todavia que, não desprezando os bens terrenos, não os considerava

essenciais! Sei que amava os outros e que era infinitamente disponível! Sei que

era um sábio no seu trabalho, mas que era igualmente um poço de humildade! e

sei que não era ambicioso, e em consequência não invejava ninguém! Por

último, não lhe conhecendo milagres, garanto que as mãos operaram prodígios!

“A gratidão tem três formas: um sentimento

no coração, uma expressão em palavras e

uma dádiva em retorno.”

George Herbert

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar devo agradecer à minha família, e em especial à minha mãe (Maria de

Lourdes), meu pai (Sérgio Dantas) e irmãos (Maria Carolina e Diego Dantas) por todo apoio,

por cada salário mínimo que foi investido na minha formação, pelo suporte de família que

sempre tive, obrigado e devo tudo à vocês!

Aos integrantes do LEB pelo incentivo que me deram durante o período em que decorreu a

elaboração desta tese (Patrícia, Ana, Jaciara, Juliene, Carlos, Francinaldo, Vitor, Marcos e

Luan) pelo companheirismo de tantos dias alegres e tristes, e ao Dr Francisco Caninde em

especial, por tantos anos de amizade e ajuda, simplesmente não existiu alguém mais

comprometido que você.

As minhas amigas que eu fiz em decorrência do doutorado: Sinara e Catherine, obrigado por

cada palavra amiga e incentivo.

As minhas ics (Mariana, Fernada Vanessa e Estéfani) que colaboraram nos trabalhos

experimentais relacionadosa execução desta tese, sem vocês nada disso teria dado certo. Esta

tese é nossa!

Também manifesto o reconhecimento ao orientador e a coorientadora desta tese, Doutor

Everaldo Silvino dos Santos e Gorete Ribeiro de Macedo, por sempre estarem disponíveis para

colaborar, esclarecer e sugerir, sempre que houve necessidade.

Aos meus amigos Luciani e Pedro Brito agradeço o apoio e o trabalho desenvolvido, que nos

animou a todos a enfrentar os obstáculos que foram surgindo durante os anos do doutorado.

Não esquecendo aos colegas e amigos de Fortaleza e de Natal pela amizade mais sincera e

dedicada e que sempre foram presentes: Joelma, Glenda, Francisca, Angelinne e Tércio.

As minhas amigas Vanessa, Samia e Kirlia pela grande amizade desde o início da graduação,

muito obrigado.

A todos os professores que contribuíram para a minha formação acadêmica.

Aos professores membros da banca que fizeram parte desta avaliação Priscilla Rolin, Francisco

Caninde, Everaldo Silvino dos Santos, Gorete Ribeiro, Marcelino Viana, Michelle Vaz e

Sharline Florentino, muito obrigado por tudo.

Aos funcionários do PPGEq/UFRN: Mazinha, as meninas da limpeza e os rapazes do jardim.

A UFRN e ao CAPES pelo apoio financeiro e suporte estrutural para realização deste trabalho.

Sumário

Resumo

Abstract

Lista de figuras

Lista de tabelas

Lista de abreviaturas e siglas

Capitulo I – INTRODUÇÃO 17

Objetivos 21

Capítulo II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 22

2. Revisão Bibliográfica 23

2.1. Biomassas lignocelulósicas 23

2.1.1. Biomassas 23

2.1.2. Coco verde 23

2.1.3. Caju 24

2.1.4. Cana-de-açúcar 25

2.2. Organização dos materiais lignocelulósicos 25

2.2.1. Celulose 26

2.2.2. Hemicelulose 27

2.2.3. Lignina 27

2.3. Pré-tratamento das biomassas lignocelulósicas 28

2.3.1. Pré-tratamento ácido 28

2.3.2. Pré-tratamento alcalino 28

2.3.3. Pré-tratamento físico 29

2.3.4. Pré-tratamento físico-químico 29

2.3.5. Pré-tratamentos biológicos 30

2.4. Hidrólise enzimática e mecanismo de ação das celulases 30

2.5. Produção de nanocristais de celulose (NCC) por via enzimática 33

2.6. Fermentação em Estado sólido (FES) 34

2.6.1. Fatores que afetam a FES 35

2.6.2. Teor de água e atividade de água 36

2.6.3. pH 36

2.6.4. Temperatura 37

2.7. O fungo filamentoso Aspergillus fumigatus 38

2.7.1. Produção de celulases por Aspergillus fumigatus 39

2.8. Sistema de duas fases aquosas para purificação de biomoléculas 39

2.9. Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas (SMDFA) 39

Capítulo III – MATERIAL e MÉTODOS 44

3. Material e Métodos 45

3.1. Tratamento inicial para as fibras lignocelulósicas utilizadas 45

3.1.1. Fibra de coco 45

3.1.2. Pedúnculo de caju 45

3.1.3. Bagaço de cana-de-açúcar 46

3.2. Caracterização das fibras 48

3.2.1. Determinação dos sólidos totais 48

3.2.2. Determinação dos extrativos 48

3.2.3. Determinação dos polissacarídeos 49

3.2.3.1. Hidrólise ácida com H2SO4 (72%) 49

3.2.4. Determinação da lignina 50

3.2.4.1. Determinação da lignina insolúvel 50

3.2.4.2. Determinação do teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais 50

3.2.5. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE)

51

3.3. Determinação das atividades de água e umidade das fibras 51

3.4. Microrganismo e manutenção 52

3.4.1. Inóculo 53

3.5. Produção do extrato enzimático por FES 53

3.6. Extração do complexo enzimático celulolítico 54

3.7. Planejamento Experimental para produção de enzimas celulases utilizando

as fibras lignocelulósicas

55

3.8. Efeito do pH e da temperatura nas atividades das enzimas celulases

produzidas

57

3.9. Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar visando à produção de NCC 57

3.10. Hidrólise enzimática para produção dos NCCs 58

3.11. Produção dos NCCs 59

3.12. Análise das ligações estruturais por Espectroscopia de Infravermelho por

transformada de Fourier (FTIR)

59

3.13. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 59

3.14. Difração de Raios X (DRX) 60

3.15. Análise por Microscopia de Força Atômica (MFA) 60

3.16. Sistema micelar de duas fases aquosa (SMDFA) 61

3.16.1. Determinação do ponto de nuvem 61

3.16.2. Recuperação e purificação de celulases usando o SMDFA 62

3.17. Determinação da Atividade enzimática da FPase 63

3.18. Determinação da Atividade enzimática CMCase 63

3.19. Determinação dos açúcares redutores 64

3.20. Determinação da quantificação de proteínas pelo método de Bradford 64

3.21. Eltroforese em gel de poliacrilamida (SD-PAGE) 65

3.22. Zimograma 65

Capítulo IV – RESULTADOS e DISCUSSÃO 66

4. Resultados e Discussão 67

4.1. Caracterização das fibras lignocelulósicas in natura (coco, pedúnculo de caju

e cana-de-açúcar)

67

4.1.2. Análise morfológica das fibras in natura e da fibra de cana-de-açúcar

após fermentação 68

4.1.3. Análise da cristalinidade das fibras in natura e do bagaço de cana-de-

açúcar após fermentação

70

4.1.4. Análises do FTIR das fibras in natura e do bagaço de cana-de-açúcar após

fermentação

71

4.2. Determinação dos valores de umidade relativa em função da atividade de

água (aw) nas fibras lignocelulósicas in natura (Bagaço de cana-de-açúcar, fibra

do coco, fibra do pedúnculo de caju)

73

4.3. Produção de enzimas celulolíticas (CMCase e FPase) pelo fungo Aspergillus

fumigatus usando FES e os resíduos lignocelulósicos bagaço de cana-de-açúcar,

fibra de coco e fibra do pedúnculo de caju como substrato

75

4.4. Efeito da temperatura e do pH na estabilidade das celulases 78

4.5. Caracterização do bagaço de cana-de-açúcar após pré-tratamentos com

NaOH e Ca(OH)2 visando a produção de nanocristais de celulose (NCC)

80

4.5.1. Análise morfológica do bagaço de cana-de-açúcar in natura e após os pré-

tratamentos alcalinos

82

4.5.2. Análise da cristalinidade do bagaço de cana-de-açúcar in natura e do

bagaço de cana-de-açúcar após os pré-tratamentos alcalinos

85

4.5.3. Análise do FTIR do bagaço de cana-de-açúcar in natura e do bagaço de

cana-de-açúcar após os pré-tratamentos alcalinos

86

4.6. Avaliação da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar in natura

após pré-tratamento com NaOH (4%) na conversão de celulose em glicose

87

4.7. Produção de NCC 90

4.8. Recuperação e purificação de celulases por SMDFA 93

4.8.1. Determinação do ponto de nuvem (turvação) 94

4.8.2. Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no coeficiente

de partição, no rendimento e no fator de purificação das celulases

95

4.8.3. Influência da concentração de Triton X-114 e da concentração do extrato

enzimático no coeficiente de partição (K), no rendimento e no fator de

purificação das celulases

100

4.8.4. Influência da concentração de Triton X-114 e de sais inorgânicos no

coeficiente de partição, no rendimento e no fator de purificação das celulases

103

CAPÍTULO V – CONCLUSÕES 111

5. Conclusões 112

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 114

Lista de figuras

Figura 2.1 - Representação dos constituintes da parede celular vegetal e seus

componentes estruturais.

26

Figura 2.2 - Representação do sinergismo entre as enzimas celulases na cadeia

da celulose.

32

Figura 2.3 - Imagem de nanocristais de celulose. 33

Figura 2.4 – Ilustração de um cultivo em FES utilizando o bagaço da cana-de-

açúcar como substrato para o fungo Aspergillus fumigatus.

35

Figura 2.5 - Representação da morfologia das espécies do gênero Aspergillus. 20

Figura 2.6 - Ilustração da formação das micelas no sistema micelar de duas fases

aquosas.

40

Figura 2.7 – Ilustra de forma esquemática a estrutura do monômero de um

tensoativo, representando a porção da cabeça polar (hidrofílica), e a porção da

cauda apolar (hidrofóbica).

41

Figura 2.8 - Ilustração de um diagrama de fases. 42

Figura 3.1 - Fibras de pedúnculo de caju (A), fibra de coco verde (B) e bagaço

de cana-de-açúcar (C), com granulometria padronizada em 20 mesh.

46

Figura 3.2 - Fluxograma para as etapas usadas para obtenção das fibras das

biomassas in natura.

47

Figura 3.3 - Microrganismo utilizado no processo usando FES, o fungo

filamentoso Aspergillus fumigatus isolado da casca do coco mantido em placa de

Petri.

52

Figura 3.4 - Fungo filamentoso Aspergillus fumigatus em Erlenmeyer de 125 mL

contendo sabugo de milho para propagação dos esporos.

53

Figura 3.5 - Processo de fermentação em estado sólido nas fibras de pedúnculo

de caju (A), fibra de coco verde (B) e bagaço de cana-de-açúcar (C), com

granulometria padronizada em 20 mesh.

54

Figura 3.6 - Fluxograma para as etapas usadas na produção de celulase usando

FES.

56

Figura 3.7 – Fluxograma para obtenção dos NCC. 61

Figura 4.1 - Micrografias MEV para fibra de coco não tratada (A) 40x, (B) 100x

(C) 200x; pedúnculo de caju não tratada (D) 40x, (E) 100x, (F) 200x; bagaço de

cana-de-açúcar não tratado (G) 40x, (H) 100 x, (I) 200x; bagaço de cana-de-

açúcar fermentado (J) 40x, (K) 100x, (L) 200x.

69

Figura 4.2 - Difractogramas para as fibras lignocelulósicas in natura e o bagaço

de cana-de-açúcar fermentada: (a) bagaço de caju (b) casca de coco, (c) bagaço

de cana-de-açúcar, (d) bagaço de cana-de-açúcar fermentada.

70

Figura 4.3 - Espectro FTIR para as fibras lignocelulósicas in natura e o bagaço

de cana-de-açúcar fermentada. (a) fibra do pedúnculo de caju, (b) fibra do coco,

(c) fibra da cana-de-açúcar e (d) bagaço de cana-de-açúcar fermentada.

72

Figura 4.4 - Gráfico de Pareto dos efeitos principais e interações umidade (X1)

e pH (X2) nas respostas referente as enzimas CMCase (A), FPase (B) e Proteínas

Totais (C) quando utilizou-se bagaço de cana-de-açúcar como substrato para

FES.

77

Figura 4.5 - Gráfico de Superfície de Resposta dos efeitos principais e interações

umidade (X1) e pH (X2) nas respostas referentes as enzimas CMCase (A), FPase

(B) e Proteínas Totais (C) quando utilizou-se bagaço de cana-de-açúcar como

substrato para FES.

77

Figura 4.6 - Efeito da temperatura nas atividades das enzimas endoglucanases

(CMCase) e celulases totais (FPase) produzidas por A. fumigatus usando o

bagaço da cana-de-açúcar in natura como substrato na FES.

79

Figura 4.7 - Efeito do pH nas atividades das enzimas endoglucanases (CMCase)

e celulases totais (FPase) produzidas por A. fumigatus usando o bagaço da cana-

de-açúcar in natura como substrato na FES.

80

Figura 4.8 – Imagens da Microscopia Eletrônica de Varredura para o bagaço de

cana-de-açúcar não tratado (A) 100x, (B) 150x, (C) 200x; bagaço de cana-de-

açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 [5%] (D) 100x, (E) 150x, (F) 200x, bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 [10%] (G) 100x, (H) 150x, (I) 200x,

bagaço a de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 [20%] (J) 100x, (K) 150x,

(L) 200x, bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH [4%] (M) 100x, (N)

150x, (O) 200x.

83

Figura 4.9 - Difratogramas dos bagaços. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

com NaOH [4%] (a); Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 –

[20%] (b); Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [10%] (c);

Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [5%] (d) e Bagaço de cana-

de-açúcar in natura (e).

85

Figura 4.10 – Espectro de FTIR para as fibras. Bagaço de cana-de-açúcar in

natura (a); Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [5%] (b);

Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [10%] (c); Bagaço de cana-

de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [20%] (d) e Bagaço de cana-de-açúcar pré-

tratado com NaOH [4%] (e).

86

Figura 4.11 - Concentração de açúcares redutores (ART) produzidos na hidrólise

enzimática utilizando o bagaço de cana-de-açúcar in natura (A) e pré-tratado com

NaOH (4,0%) (B) usando os extratos comercial e não comercial. Carga

enzimática: 7,5 FPU/g de bagaço.

88

Figura 4.12 – Conversão de celulose em açúcares redutores (ART) produzidos

na hidrólise enzimática utilizando o bagaço de cana-de-açúcar in natura (A) e

pré-tratado com NaOH (4,0%) (B) usando os extratos comercial e não comercial.

Carga enzimática: 7,5 FPU/g de bagaço.

89

Figura 4.13 – Imagem de Microscopia de Força Atômica (MFA) dos nanocristais

gerados pela hidrólise enzimática. Extrato enzimático bruto produzido com a

carga enzimática de 7,5 FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar in natura no tempo

de 48 horas de hidrólise enzimática.

91

Figura 4.14 – Imagem de Microscopia de Força Atômica (MFA) dos nanocristais

gerados pela hidrólise enzimática. Extrato enzimático bruto produzido com a

carga enzimática de 7,5 FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com

NaOH (4,0%) no tempo de 48 horas de hidrólise enzimática.

92

Figura 4.15 – Evolução dos nanocristais ao longo do tempo de hidrólise. Extrato

enzimático bruto produzido com a carga enzimática de 7,5 FPU/g de bagaço pré-

tratado com NaOH (4,0%). (A) 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h e (D) 96 h.

93

Figura 4.16 –Curva de coexistência para o SMDFA usando o Triton X-114 na

presença do extrato enzimático. O extrato enzimático foi produzido por A.

fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato.

95

Figura 4.17 - Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no

rendimento de CMCase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por

A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato. O

extrato enzimático foi mantido em 40%.

97

Figura 4.18 - Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no

rendimento de FPase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por A.

fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato. O extrato

enzimático foi mantido em 40%.

97

Figura 4.19 – Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no

fator de purificação (FP) de CMCase usando SMDFA. O extrato enzimático foi

produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como

substrato. O extrato enzimático foi mantido em 40%.

99

Figura 4.20 – Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no

fator de purificação (FP) de FPase usando SMDFA. O extrato enzimático foi

produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como

substrato. O extrato enzimático foi mantido em 40%.

99

Figura 4.21 - Influência da concentração de Triton X-114 e concentração do

extrato enzimático no rendimento (R) de CMCase usando SMDFA. O extrato

enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-

açúcar como substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.

101


extrato enzimático no rendimento (R) de FPase usando SMDFA. O extrato

enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-

açúcar como substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.

101


extrato enzimático no fator de purificação (FP) da CMCase usando SMDFA. O

extrato enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de

cana-de-açúcar como substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.

102


extrato enzimático no fator de purificação (FP) da FPase usando SMDFA. O

extrato enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de

cana-de-açúcar como substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.

103

Figura 4.25 - Rendimento para a CMCase obtido durante a partição no SMDFA

usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração

do extrato bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2,

MgSO4 e MnSO4 na concentração de 5%.

106

Figura 4.26 Rendimento para a FPase obtido durante a partição no SMDFA

usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração

do extrato bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2,

MgSO4 e MnSO4 na concentração de 5%.

106

Figura 4.27 - Fator de purificação para a CMCase obtido durante a partição no

SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a

concentração do extrato bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos

NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na concentração de 5%.

108

Figura 4.28 - Fator de purificação para a FPase obtido durante a partição no

SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a

concentração do extrato bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos


108

Figura 4.29 - SDS-PAGE (linhas 1-5) e zimograma (linhas 6-10): 1,6 - Extrato

bruto, 2,6-2% riton X-114 (m/m), 3,8 - 4% Triton X-114 (m/m), 4,9 - 6% de

Triton X-114 (m/m) e 5,10 - 8% de Triton X-114 (m/m).

110

Lista de tabelas

Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os fatores de conversão de cada

componente presente no extrato hidrolisado.

51

Tabela 3.2 - Representação da matriz do planejamento experimental para os

ensaios da FES.

55

Tabela 3.3 - Codificação dos níveis e das variáveis utilizadas no planejamento

experimental.

56

Tabela 3.4 – Concentração do Ca(OH)2 utilizados nos pré-tratamentos. 58

Tabela 4.1 - Composição (% de peso seco) das fibras lignocelulósicas in natura. 67

Tabela 4.2 - Índice de cristalinidade das fibras lignocelulósicas in natura e o

bagaço de cana-de-açúcar após fermentação.

71

Tabela 4.3 - Umidade em função da atividade de água do bagaço de cana-de-

açúcar in natura.

73

Tabela 4.4 - Umidade em função atividade de água do pedúnculo de caju in

natura.

74

Tabela 4.5 - Umidade em função atividade de água do bagaço de coco verde in

natura.

74

Tabela 4.6 - Resultado do PCCR utilizando o bagaço de cana-de-açúcar como

substrato para investigar a influência da umidade (X1) e pH (X2) para as enzimas

CMCase, FPase e proteína total durante FES usando Aspergillus fumigatus.

75

Tabela 4.7 - Resultado do PCCR utilizando o bagaço do coco como substrato

para investigar a influência da umidade (X1) e pH (X2) para as enzimas CMCase,

FPase e proteína total durante FSS usando Aspergillus fumigatus.

76

Tabela 4.8 - Resultado do PCCR utilizando o pedúnculo de caju como substrato

para investigar a influência da umidade (X1) e pH (X2) para as enzimas CMCase,

FPase e proteína total durante FES usando Aspergillus fumigatus.

76

Tabela 4.9 - Composição do bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratados. 81

Tabela 4.10 - Índice de cristalinidade do bagaço de cana-de-açúcar in natura e

dos bagaços de cana-de-açúcar pré-tratados.

86

Tabela 4.11 – Coeficientes de partição médio (K) para CMCase obtidos durante

o particionamento no SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114

e alterando a temperatura de 35 a 65 °C. O extrato enzimático foi mantido em

40%.

95

Tabela 4.12 - Coeficientes de partição médio (K) para FPase obtidos durante o

particionamento no SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114 e

alterando a temperatura de 35 a 65 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40%.

96

Tabela 4.13 – Coeficiente de partição (K) para a enzima CMCase obtido durante

o particionamento no SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114

e a temperatura de 55 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40% e adicionados

os sais: NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na concentração de 5%.

104

Tabela 4.14 - Coeficiente de partição (K) para a enzima FPase obtido durante o


a temperatura de 55 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40% e adicionados

os sais: NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na concentração de 5%.

105

Lista de abreviaturas e siglas

Aw Atividade de água

abs Absorbância

ART Açúcares redutores totais

A.E Atividade enzimática

DNS ácido 3,5 – dinitro-salicílico

FSm Fermentação submersa

FES Fermentação em estado sólido

FPU Uma unidade de atividade em papel de filtro

h Hora

L litro

min Minutos

N Nitrogênio

P Fósforo

p/v Peso por volume

Pa pressão de vapor de água do substrato

Pt. Proteína

rpm Rotações por minuto

U/g Unidade de atividade por grama

v/v Volume por volume

PDA Potato Dextrose Agar

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

Capítulo I. Introdução 17

Sérgio Dantas de Oliveira Júnior Tese de Doutorado

1. Introdução

A atual sociedade convive com geração de resíduos e subprodutos provenientes

de todos os setores produtivos. Com a preocupação do meio ambiente, no final do Século

XX, a humanidade está mais consciente em relação a produção de bens e o impacto que

podem ser causados a natureza. Os setores agroindustriais e de alimentos são os principais

responsáveis por grandes quantidades de resíduos produzidos. Esses resíduos apresentam

problemas quanto a sua disposição final ocasionando danos ambientais, a perda de

matéria-prima e de nutrientes que poderiam ser utilizados para outros fins

biotecnológicos. Neste contexto os conceitos de minimização, recuperação e

bioconversão de resíduos são cada vez mais difundidos. A bioconversão dos resíduos

agrícolas apresenta um conceito com uma atenção maior, esses materiais podem ser

aproveitados e utilizados para a síntese de biomoléculas.

Os resíduos lignocelulósicos, ou seja, derivados de vegetais, são matérias primas

de baixo custo e elevada disponibilidade, principalmente no Brasil, em virtude de sua

ampla aptidão para o desenvolvimento de atividades agroindustriais. Grande parte desses

resíduos, tal como o bagaço de cana-de-açúcar é utilizado para a queima e produzir calor

e eletricidade, no entanto, essas biomassas possuem grande potencial para produção de

etanol 2G. O processo de produção de etanol de segunda geração envolve quatro etapas:

pré-tratamento do resíduo, hidrólise, fermentação e destilação.

O pré-tratamento visa à modificação da estrutura da biomassa lignocelulósica,

expondo a celulose e hemicelulose para a hidrólise, esta etapa é responsável pela

conversão dos carboidratos de cadeias longas em açúcares fermentescíveis. As biomassas

lignocelulósicas são formadas por estruturas rígidas e ordenadas, de forma que a celulose

e a hemicelulose estão interligadas à lignina que protege contra os agentes externos

(CHATUVERDI e VERMA, 2013). Com isso, as enzimas tem dificuldade em acessar o

substrato, ocasionando baixos rendimentos de açúcares na hidrólise enzimática. Dessa

forma, a etapa de pré-tratamento tem como objetivo modificar a composição da biomassa

e tornar a celulose e a hemicelulose mais acessíveis às enzimas (DIAS et al., 2009). Os

tipos pré-tratamentos físicos, químicos, fisíco-químicos e biológicos são estudados como

forma de melhorar a sacarificação enzimática da biomassa.



No processo fermentativo, os açúcares liberados na etapa de hidrólise são

convertidos em etanol, em seguida o caldo fermentado é destinado à destilação. A etapa

de hidrólise pode ser realizada por agentes químicos ou enzimáticos, mas a utilização de

enzimas apresenta vantagens, como menor gasto de energia e baixa geração de

subprodutos tóxicos. Entretanto, o processo por hidrólise enzimática apresenta um custo

elevado, os coquetéis utilizados ainda são muito caros. Portanto, é necessário e de grande

interesse o desenvolvimento de processos alternativos e de baixo custo para a produção

dessas enzimas. A busca por estratégias de produção de celulases que permitam produzir

essas enzimas a um menor custo baseia-se em sua produção por fermentação em estado

sólido (FES). A FES baseia-se no crescimento de microrganismos em materiais com

baixa atividade de água (aw) simulando, assim, o habitat natural dos microrganismos

(PANDEY et al., 2000).

Enfatiza-se que, muito embora o uso de celulases no processo de produção de

etanol 2G visa disponilizar a glicose para ser fermentada pela levedura, sua hidrólise

parcial pode fornecer um produto de maior valor agregado, como por exemplo os

nanocristais de celulose (NCC). Estes nanocristais vem sendo utilizados como reforço em

compósitos e nanocompósitos em diversas áreas (LU et al., 2010). Os nanocristais de

celulose podem ser obtidos a partir de diferentes fontes de fibras celulósicas de fonte

vegetal, neste estudo utilizou a fibra da cana-de-açúcar. As aplicações dos NNCs são

diversas, desde reforços para materiais poliméricos até incorporação em embalagens

inteligentes para alimentos.

Destaca-se também, a necessidade de se estudar, desenvolver e aprimorar as

técnicas de purificação de bioméculas de interesse industrial principalmente as que são

obtidas a partir de extratos ou caldos de fermentação. Nesse contexto, destaca-se o uso

do sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA), com a formação de agregados

micelares em condições pré-estabelecidas, originando duas fases imiscíveis (ATTWOOD

E FLORENCE, 2003).

Nesse contexto, no presente estudo teve como objetivo avaliar o aproveitamento

de três fibras lignocelulósicas para a produção de enzimas celulolíticas por fermentação

em estado-sólido (FES) utilizando o fungo filamento Aspergillus fumigatus. O melhor

bagaço de acordo com a sua constituição estrutural em valores de celulose, hemicelulose

e lignina, foi aplicado a pré-tratamentos alcalinos e submetidos à hidrólise enzimática



para a geração de nanocristais de celulose (NCC). Por sua vez, aplicou-se o SMDFA a

fim de avaliar a recuperação e a purificação das celulases. Dessa forma, buscou-se

contribuir com uma alternativa para a produção de celulases agregando-se valor aos

resíduos gerados da atividade da agroindústria.

OBJETIVOS

Objetivos 21


Objetivos:

Produzir celulases por fermentação em estado sólido (FES) utilizando o fungo

filamentoso Aspergillus fumigatus usando-se biomassas lignocelulósicas e recuperar e

purificar celulases usando o sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA).

Como objetivos específicos pode-se citar:

Caracterizar os resíduos quanto à sua composição, estrutura e morfologia;

Otimizar utilizando planejamento experimental os resíduos agroindustriais:

bagaço de cna-de-açúcar, fibra de coco e fibra do pedúnculo de caju para a

indução de celulases por FES;

Avaliar a estabalidade em diferentes pHs e temperaturas das celulases (CMCase

e FPase) produzidas;

Investigar o melhor pré-tratamento e realizar a hidrólise enzimática do bagaço

de cana-de-açúcar visando produzir nanocristais de celulose (NCC);

Receuperar e purificar as celulases produzidas por FES usando sistema micelar

de duas fases aquosas (SMDFA).

CAPÍTULO II

REVISÃO

BIBLIOGRÁFICA

Capítulo II. Revisão Bilbliográfica 23


2. Revisão Bibliográfica

Este capítulo aborda sobre os materiais lignocelulósicos utilizados, o bagaço de

cana-de-açúcar, a fibra do coco verde, e a fibra do pedúnculo de caju e, apresenta os

conceitos importantes dos processos desenvolvidos neste trabalho, abordando os

conceitos e a importância da utilização dos resíduos como fonte alternativa para o

desenvolvimento de biomoléculas e a importância do trabalho desenvolvido.

2.1. Biomassas lignocelulósicos

2.1.1. Biomassas

As biomassas lignocelulósicas compreendem os vários resíduos agrícolas como,

por exemplo, as palhas, cascas, caules, pedúnculos, folhas, resíduos de indústrias de polpa

e papel, e colheitas de verduras e hortaliças. Estes são acumulados na natureza

representando um problema ambiental, porém destaca-se que eles são ricos em fonte de

carbono e de outros componentes que são essenciais para a síntese de vários produtos e

biomoléculas de interesse para a sociedade (PITARELO, 2007; NIGAM e SINGH, 2011;

RAMOS, 2003). Destacando-se também que os resíduos agroindustriais são fontes

renováveis de biocombustíveis e outros produtos de valor agregado (MORETTI et al.,

2012).

2.1.2. Coco verde

Coco verde é o fruto do coqueiro (Cocos nucifera) que é colhido entre o 6º e 7º

mês após seu brotamento. A colheita do coco neste período proporciona um volume

máximo de água no interior do fruto, encontrando-se dissolvidos a maioria dos sais

minerais e albumina, além disso apresenta uma alta concentração de sólidos solúveis

(ASSIS et al., 2000). Por apresentar estas características, de grande importância a saúde

e valor nutricional, sua produção é destinada para o comércio de água de coco. De acordo

com Brígida (2006), apesar da produção do coco maduro ser muito superior, nos últimos

anos o coco verde vem se destacando em decorrência da grande procura pelo consumo de

água de coco em todo país.

O Brasil é o quarto maior produtor mundial de coco, com produção aproximada

de 2,8 milhões de toneladas em uma área de 257 mil hectares, com 15% desta produção

sendo destinada ao mercado do coco verde (MARTINS e JESUS Jr, 2014; SENHORAS,

2003). O crescente consumo da água de coco (100 a 350 milhões de litros/ano),

impulsionado pela inclusão de hábitos saudáveis da população brasileira, traz consigo



problemas quanto ao descarte da biomassa resultante após o seu beneficiamento com o

subproduto (cascas e fibras), que constituem 80 a 85% do peso bruto do fruto (BRITO et

al., 2004). Normalmente depositadas em lixões a céu aberto, vazadouros, encostas e

aterros sanitários e no Nordeste sendo um grande agente poluidor das praias, além de

degradarem a paisagem e produzirem mau cheiro, contribuindo para a transmissão de

doenças, transformam-se em um sério problema ambiental (BRITO et al., 2004). Destaca-

se que, apesar de orgânico, o resíduo do coco é um material de difícil decomposição,

necessitanto em média de 8 anos para a sua decomposição (CARRIJO et al., 2002).

2.1.3. Caju

O caju (Anacardium occidentale L.) é uma fruta tropical originalmente do Brasil,

seu consumo e o comércio é bastante diversificado. O seu plantio é bem distribuído em

vários países da Ásia, África e América Central, apresentando grande importância

econômica (EMBRAPA, 1999; LEITE e PAULA-PESSOA, 2002). A castanha, o

verdadeiro fruto do caju, representam 10% do peso total do produto colhido e grandes

quantidades do pedúnculo de caju hipertrofiado são deixados no campo após a remoção

da castanha (FONTES et al., 2009). O pedúnculo de caju, o pseudofruto é considerado

como um subproduto das indústrias de beneficiamento do caju, uma vez que o valor maior

é o da castanha que são consumidas em regiões específicas do Brasil (Nordeste e Norte)

(KUBO et al., 1993).

Atualmente, sabe-se que o pedúnculo de caju pode ser transformado em outros

produtos com maior valor agregado como, por exemplo, geléia, xarope e bebidas,

principalmente suco (PAIVA e BARROS, 2004; SILVA NETO, 2003). O suco de caju é

considerado um dos sucos mais consumidos no Brasil (KUBO et al., 1993). Cerca de 20%

a 25% do pseudofruto utilizado no processamento torna-se um material fibroso que é

descartado ou usado como suplemento para alimentação animal (AZEREDO et al., 2006).

No entanto, destaca-se que pesquisas relacionadas às biomassas lignocelulósicas estão

sendo desenvolvidas para utilização destas fibras em bioprocessos, explorando o uso

desse resíduo agroindustrial como fonte de minerais, carbono, fibras e carotenoides

(HARBORNE e WILLIAMS, 2000). Por exemplo, a viabilidade de diferentes processos

para recuperar carotenóides deste subproduto já foi avaliada conforme reportado por

ABREU (2001), AZEREDO et al., (2006) e LEITE e PAULA-PESSOA (2002).



2.1.4. Cana-de-açúcar

Um dos resíduos com maior interesse de utilização gerado pela agroindústria é o

bagaço de cana-de-açúcar. Este apresenta quantidades expressivas, após o beneficiamento

do açúcar. Por exemplo, este é gerado na razão de 280 kg t-1 de cana, sendo o resutado da

moagem da cana-de-açúcar, que gera fibras e o melaço (CTC, 2017).

O bagaço de cana-de-açúcar apresenta a forma de fragmentos fibrosos com

características heterogêneas, a granulometria depende do método aplicado quanto a tipo

de moagem e da variedade da espécie (ICIDCA, 1990). O resíduo gerado após o

beneficiamento deixa o material com um teor de umidade de 50%, quantidade de fibras

de 45% e teores de extraíveis de 5% (ICIDCA, 1990). O bagaço da cana-de-açúcar

apresenta uma quantidade alta de carboidratos (aproximadamente 50% de celulose e 25%

de hemicelulose), e um teor de lignina baixo, o que torna este resíduo industrial como

fonte de carbono bastante adequada para diversos bioprocessos (MARTIN et al., 2002).

Conforme destacado, a composição química do bagaço de cana-de-açúcar pode diferir em

função da variedade do tipo de cana empregada, do tipo de solo empregado no plantio,

porém a estrutura é baseada nos três polímeros: celulose, hemiceluloses e lignina (ARIN

e DEMIRBAS, 2004).

O bagaço pode ser utilizado para gerar energia ou como ração animal. O resíduo

é utilizado de diversas maneiras agregando valor a esta biomassa. Como, por exemplo, a

utilização para a produção de etanol, papel e celulose, ração animal e para a produção de

enzimas (CUNHA et al., 2005, PANDEY et al., 2000).

2.2. Organização dos materiais lignocelulósicos

Os materiais lignocelulósicos estão disponíveis em grande quantidade no Brasil e

são constituídos por polímeros de celulose, em média, 35 a 50%, de hemicelulose, 20 a

35% e de lignina, 15 a 20% (MOOD et al., 2013). A celulose é um polímero de cadeia

linear de glicose formado por repetições das unidades básicas, duas unidades de glicose,

chamadas de celobiose (ZHANG et al., 2006). A hemicelulose é um heteropolímero

formado pela repetição de vários açúcares como glicose, galactose, manose, arabinose e

xilose (BALAT et al., 2008). A lignina é um polímero complexo, com estrutura composta

por grupos aromáticos, amorfo e de alta massa molar, sendo responsável por conferir a

biomassa rigidez e resistência aos ataques externos (PEREIRA Jr et al., 2008) como



representado na Figura 2.1. Devido à sua estrutura bastante heterogênea, várias enzimas

lignocelulolíticas (celulases e hemicelulases) são utilizadas para catalisar a hidrólise

desses polímeros (UDAY et al., 2016).

Figura 2.1 - Representação dos constituintes da parede celular vegetal e seus

componentes estruturais. Fonte: O autor.

2.2.1. Celulose

A celulose é o biopolímero renovável mais disponível no globo terrestre, é uma

importante fonte de matéria-prima para os processos industriais, e seu uso está ligado à

geração de energia renovável (JOSHI e MANSFIELD, 2007; TEERI, 1997). A celulose

possui uma cadeia linear que com até 15.000 unidades de β-D-glicose unida por ligações

glicosídicas β-1,4 e por ligações de hidrogênio intramoleculares e intermoleculares,

correspondendo em média de 23% a 50% da biomassa lignocelulósica (ARANTES e

SADDLER, 2010).

As ligações intermoleculares oferecem rigidez às biomassas e as ligações

intramoleculares formam as fibrilas, essas estruturas são os constituintes das fibras de

celulose (LEE, 1997). As fibrilas são formadas por regiões com grau de cristalinidade

elevado, e por regiões amorfas. A região cristalina é resistente à tração e ao alongamento

enquanto que a região amorfa é mais flexível (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL,

2000). O grau de polimerização é responsável pelas ligações glicosídicas internas e



terminais, as quais favorecem a ação das celulases (FENGEL e WEGENER, 1989). O

índice de cristalinidade é o quanto substrato pode ser mais susceptível ação de hidrolases

podendo ser determinado através da difração de raios X (D`ALMEIDA, 1988). Estas

características, associada à presença da lignina incorporada à celulose é responsável pela

resistência para que ocorra à hidrólise, um dos desafios para a utilização das biomassas

na produção do etanol 2G (ARANTES e SADDLER, 2010).

2.2.2. Hemicelulose

A hemicelulose é um heteropolímero formado por cadeias ramificadas de

açúcares, tais como pentoses, xilose e arabinose, e hexoses, como glicose, manose e

galactose (BALAT et al., 2008). A proporção de hemicelulose presente nas biomassas é

geralmente entre 15% e 45% (KOOTSTRA et al., 2009). A quantidade, os tipos de

ligações e as ramificações são responsáveis pela complexa estrutura hemicelulósica e as

diferentes conformações que possam existir (KOOTSTRA et al., 2009).

A hemicelulose não contém regiões cristalinas e apresenta baixa massa molecular

(100-200 unidades glicosídicas), o que favorece ação na hidrólise química em condições

mais brandas. No entanto, a fermentação das pentoses ainda não é tão difundida quando

comparada os processos que envolvem a fermentação das hexoses, principalmente a

glicose (SUN e CHENG, 2005).

2.2.3. Lignina

A lignina é uma estrutura que representa, em média, 10% a 30% da composição

das biomassas (LEMOS, 2001). Esse componente dificulta o acesso à celulose durante a

hidrólise enzimática, formando uma espécie de barreira ao ataque das enzimas (LEMOS,

2001). A lignina apresenta forma tridimensional ligada por unidades de p-propilfenol,

com metoxila no anel aromático, unidas por ligações do tipo éter (JIMÉNEZ, 2009). É

formada pela polimerização de três monômeros diferentes: álcool cumárico, álcool

coniferílico e álcool sinapílico (PEREIRA Jr et al., 2008). É possível produzir diversos

produtos com base na lignina, o estudo com a lignina está ligado principalmente ao uso

desse constituinte como de fonte de energia (D’ ALMEIDA, 1988).



2.3. Pré-tratamentos das biomassas lignocelulósicas

O principal objetivo da etapa de pré-tratamento é modificar a estrutura e a

composição das biomassas lignocelulósicas visando melhorar a ação das enzimas, no

processo de hidrólise, para conversão da celulose em glicose. Nesses pré-tratamentos são

usados os processos físicos, químicos, mecânicos e biológicos e a combinação desses

(MOSIER et al., 2005; SÁNCHEZ e CARDONA, 2008; SUN e CHENG, 2002). O uso

de estratégias viáveis economicamente é de grande importância para a modificação da

estrutura das biomassas e a produção de biomoléculas de interesse para a sociedade (SUN

et al., 2004).

2.3.1. Pré-tratamento ácido

O objetivo principal do pré-tratamento ácido é remover hemicelulose (CARLI

2011). De acordo com BALAT et al. (2008), com este pré-tratamento é possível atingir

rendimentos elevados de açúcares a partir de material lignocelulósico. A desvantagem do

uso desse pré-tratamento é a formação de produtos voláteis proveniente da degradação do

carbono ocasionando uma diminuição na conversão do etanol (RUEDA, 2010).

2.3.2. Pré-tratamento alcalino

O pré-tratamento básico promove a remoção da lignina aumentando o acesso das

enzimas celulases à celulose (BALAT et al., 2008; MOOD et al., 2013). As bases

apresentam a capacidade em degradar a lignina, ocasionando um aumento dos poros na

celulose e diminuindo a cristalinidade das biomassas (ZHANG et al., 2012). O hidróxido

de sódio, o hidróxido de cálcio, a amônia e a uréia são as bases mais utilizadas. O

hidróxido de cálcio diluído é uma das mais utilizadas por apresentar um custo

relativamente barato e ser de fácil manipulação (CHANG et al., 1998). Por outro lado, o

hidróxido de sódio mostra-se muito eficiente na remoção da lignina (ZHANG et al.,

2012). No geral, os pré-tratamentos alcalinos apresentam vantagens uma vez que

necessitam de temperaturas e pressões mais baixas, minimizando as perdas dos açúcares

no processo quando comparado aos tratamentos utilizando ácidos (ZHANG et al., 2012).

Contudo, necessitam de várias horas ou até mesmo dia para que o reagente possa remover

a lignina da biomassa (BALAT et al., 2008, MOOD et al., 2013). Deve-se destacar que

assim como o pré-tratamento ácido é necessário uma etapa para neutralização da

biomassa e do hidrolisado no término do processo (MOOD et al., 2013).



2.3.3. Pré-tratamento físico

Os pré-tratamentos físicos também visam deixar a celulose mais acessível para a

ação das enzimas celulases devido às modificações na estrutura da biomassa, aumentando

assim a área superficial, ocasionam a desfibrilação e a redução do grau de polimerização

e da cristalização (ALVIRA et al., 2010). Alguns exemplos dos tipos de pré-tratamentos

físicos reportados na literatura são extrusão, moagem e uso de micro-ondas (MOOD et

al., 2013).

Na moagem usando moinho de bolas, um dos principais tipos de pré-tratamento

físico, as esferas geram o cisalhamento que é responsável pela redução do tamanho das

partículas e da cristalinidade sendo que uma das desvantagens deste processo é o alto

consumo de energia (SILVA et al., 2013). A moagem usando moinhos de discos foi

favorável ao pré-tratamento de palha de arroz, ocasionando a melhoria dos rendimentos

na hidrólise enzimática, conforme relatado por HIDENO et al. (2009).

2.3.4. Pré-tratamento físico-químico

O pré-tratamento líquido com Água Quente (LHW – Liquid Hot Water) é um tipo

de tratamento hidrotérmico que remove frações de hemicelulose. Adiciona-se água junto

à biomassa com elevadas temperaturas e pressões. A água consegue penetrar na estrutura

da biomassa devido à pressão, modificando a estrutura lignocelulósica e promovendo a

remoção da hemicelulose. A água torna-se ácida devido aos ácidos orgânicos, que são

liberados da biomassa como consequência das elevadas temperaturas, e atuando assim

como catalisador para hidrolisar a hemicelulose. Os açúcares são formados e podem ser

degradados ao mesmo tempo. Inibidores são formados como, por exemplo, furfural,

hidroximetilfurfural (HMF) e ácido acético que podem prejudicar o processo final

(MOSIER et al., 2005).

O tratamento a vapor é outro tipo de tratamento hidrotérmico na qual a biomassa

entra em contato com uma corrente de vapor de água (SILVA et al., 2013). Isso torna

possível empregar uma carga maior de biomassa no reator reduzindo o consumo de água.

Entretanto, o tratamento LHW proporciona uma maior remoção de hemicelulose e menor

formação de inibidores (SILVA et al., 2013).

Dentre os pré-tratamentos físico-químicos destaca-se a explosão a vapor. A

biomassa contendo água é submetida a elevadas pressões e aquecida durante alguns



minutos e, em seguida, sofre uma rápida descompressão. A fração líquida formada ao

final do processo é rica em açúcares da hemicelulose enquanto que a fração sólida é rica

em celulose e lignina (BALAT et al., 2008).

2.3.5. Pré-tratamentos biológicos

Uma grande variedade de microrganismos (fungos e bactérias) apresenta a

capacidade em degradar os componentes estruturais dos vegetais, com o auxílio de

enzimas hidrolíticas e oxidativas (CAMASSOLLA e DILLON, 2009; VITTI, 1988).

Os “fungos degradadores de madeira” apresentam a capacidade em degradar a

biomassa lignocelulósica com a ajuda de enzimas oxidativas, e são classificados em três

grupos: fungos de degradação branca, de degradação marrom e de degradação macia. Os

fungos de degradação branca são os que apresentam uma maior efeciência na degradação

da biomassa (DURAN e SPOSITO, 1997). Os pré-tratamentos das biomassas com o

auxílio de microrganismos que apresentam a capacidade de degradar a lignina é mais

vantajoso e uma maneira mais sustentável ao processo. Por exemplo, LI et al., (2002)

relataram a degradação de 50% da lignina nos bagaços de cana-de-açúcar. Um ponto

negativo é o tempo de contato dos microrganismos com as biomassas, desde que são

necessários dias ou até mesmo semanas. Merece destaque também a inibição microbiana

em decorrência subprodutos oriundos da degradação da lignina (LYND et al., 2002).

Outros fungos que apresentaram uma capacidade degradação do bagaço de maneira

bastante eficiente são Phanerochaete chrysosporium ME-466, Phanerochaete sordida

YK-624, Ceriporia sp. MZ-340 e Pleurotus sajor-caju PS2001 (CAMASSOLA E

DILLON, 2009).

2.4. Hidrólise enzimática e mecanismo de ação das celulases

A hidrólise enzimática utilizando biomassas é uma etapa bastante lenta, devido à

heterogeneidade do substrato (presença de lignina e hemicelulose), pois esses

componentes dificultam o acesso à celulose e, também, devido à cristalinidade da celulose

(LYND et al., 2008; PITARELLO, 2013). De acordo com Olsson e Hahn-Hargerdal

(1996), esse processo ocorre em condições mais brandas que a hidrólise ácida, com pH

em torno de 4,0 a 5,0, temperaturas entre 40 e 50 °C gerando assim maiores rendimentos.

Uma vantagem da hidrólise enzimática é que não apresenta problemas de corrosão nos



equipamentos como ocorre na hidrólise ácida. No entanto, a maior dificuldade existente

para sua aplicação em grande escala é que as enzimas (coquetéis utilizados) ainda

possuem um custo elevado.

A hidrólise enzimática da celulose é realizada através de enzimas celulases que

são altamente específicas e são produzidas por bactérias e fungos filamentosos aeróbios

e anaeróbios, mesófilos e termófilos (GOUVEIA et al., 2009; LJUNGDAHL e

ERIKSON, 1985). Entretanto, poucos são os fungos e bactérias que produzem elevados

níveis de celulases extracelulares capazes de hidrolisar a celulose cristalina (AGUIAR e

MENEZES, 2000). Destaca-se que são os fungos que são utilizados na produção de

enzimas destinadas a processos industriais (MENEZES, 1997).

As enzimas celulases responsáveis pela hidrólise das biomassas são as

endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidase (SUN e CHENG, 2002). As

endoglucanases (EC 3.2.1.4) são as enzimas que iniciam a hidrólise da molécula de

celulose. Essas enzimas atuam de maneira randômica na região amorfa da cadeia de

celulose, clivando ligações β – 1,4 na parte central da molécula e liberando diversos

oligossacarídeos com graus de polimerização bastante diferentes (DIENES et al., 2004).

Em geral, essas enzimas quando na presença de um derivado solúvel de celulose, a

carboximetilcelulose (CMC) (CASTRO, 2006; JORGENSEN e OLSSON, 2006;

JUHÁSZ et al., 2005a; MANDELS e WEBER, 1969; ONSORI et al., 2005), apresentam-

se como CMCases, sendo que a atividade das mesmas nesse substrato fornece informação

do tipo endo-enzima.

As enzimas exoglucanases ou celobiohidrolases liberam a glicose e celobiose

(dímero de glicose) (LIMA et al., 2005) das extremidades das cadeias de celulose

(CASTRO e PEREIRA Jr., 2010; LYND e ZHANG, 2002). Elas agem nas extremidades

redutoras e/ou não-redutoras da celulose, apresentando uma afinidade maior pela celulose

insolúvel (microcristalina), ocasionando a liberação da glicose e de celobiose como

produtos da hidrólise da celulose. Essas enzimas podem ser inibidas pelo seu produto de

hidrólise, caso a quantidade de glicose esteja elevada no meio (LYND et al., 2002). A

medida da atividade enzimática utilizando o papel de filtro Whatman N°1 como substrato

(FPase) determina a atividade celulósica total (GHOSE, 1987).

A β-glicosidase é uma enzima responsável pela hidrólise da celobiose em duas

moléculas de glicose. Estes monossacarídeos quando fermentados são convertidos em



etanol. A presença de celobiose no meio ocasiona um efeito inibitório na produção de

celulases (HARDIMAN et al., 2010; SCHELLER e ULSKOR, 2010).

A hidrólise das biomassas lignocelulósicas por ação enzimática é um processo

heterogêneo assim é necessário que ocorra as três etapas: (1) a adsorção da enzima sobre

a superfície do substrato (2) hidrólise da ligação glicosídica e; (3) dessorção da superfície

e retorno da enzima ao meio (PITARELLO, 2013).

O rendimento da hidrólise enzimática depende de muitos fatores tais como tipo e

concentração do substrato (LIMING e XUELIANG, 2004; MARTINS et al., 2008), pré-

tratamento aplicado à biomassa, termoestabilidade das enzimas, carga de sólidos, tempo

de reação, pH e agitação (GREGG e SADDLER, 1996; SZCZODRAK e FIEDUREK,

1996; ZHU, 2005). Em geral, a diminuição na produtividade pode estar relacionada com

inibição pelo produto, sendo que a lignina pode adsorver a enzima (GREGG e

SADDLER, 1996).

Na quantificação indireta dos complexos brutos de celulases quanto ao teor da

atividade de endoglucanases ou exoglucanases, são utilizados diferentes substratos,

porém, o sinergismo entre os três tipos de enzima impossibilita uma determinação precisa

(ZHANG et al., 2006). A Figura 2.2 representa o sinergismo que ocorre entre as três

enzimas celulases.

Figura 2.2 - Representação do sinergismo entre as enzimas celulases na cadeia da

celulose. Fonte: WATANABE e TOGUTA, 2010.



2.5. Produção de nanocristais de celulose (NCC) por via enzimática

Os NCCs foram identificados na década de 1950, por RÅNBY (1949, 1950,

1951). Nesses estudos foi descrito o processo de geração dos NNCs. O nome dado a essas

partículas foi nanocristais de celulose, nanowhiskers ou whiskers de celulose, que

consistem essencialmente em domínios cristalinos de celulose, quando agregados

apresentam formas de bastões ou agulhas rígidas, em escala nanométrica, e surge como

consequência através de mecanismos hidrolíticos (hidrólise) aos quais as fibras

celulósicas são submetidas. Através de imagens obtidas por microscopia eletrônica de

transmissão (MET) foi possível observar pela primeira vez a existência dessas

nanopartículas (MUKHERJEE et al., 1952). Fig. 2.3.

Figura 2.3 - Imagem de nanocristais de celulose. MUKHERJEE et al.,1952.

Existem vários métodos empregados para a obtenção de NCCs (HABIBI et al.,

2010; PEREIRA et al., 2014) tais como através da hidrólise enzimática ou com o auxílio

de ultrassom (FILSON et al., 2009) e através de líquidos iônicos (ISIK et al., 2014). As

características dos NNCs está diretamente relacionada as propriedades da celulose. As

características mecânicas, como por exemplo à tração, a rasgos e ao estouro, está ligado

ao índice de cristalinidade da nanoestrutura (MAZEAU e HEUX, 2003). Conforme

relatado por HABIBI et al. (2010) a importância da área superficial dos NCCs influencia

na morfologia (formato de bastões ou agulhas) e biocompatibilidade.



SIQUEIRA et al. (2010) reportaram que as condições de hidrólise com tempos

mais longos ocasiona mudanças nas propriedades dos nanocristais. Como por exemplo,

nanoestruturas com menores dimensões. Os autores também citam as aplicações desse

material, como por exemplo, na indústrias alimentícia, farmacêutica, de papel, de tintas e

cosméticos. De acordo com MOON et al. (2011) a utilização dos NNCs é de extrema

relevância a utilização de nanotecnologias renováveis com apelo sustentável, quando

comparados aos polímeros com origem dos derivados do petróleo.

2.6. Fermentação em Estado sólido (FES)

A fermentação em estado sólido (FES) ou fermentação semi-sólida (FSS) visa o

crescimento de microrganismos em meio sólido sem a presença de água livre. A umidade

necessária para o crescimento microbiano encontra-se adsorvida, ou agregada ao meio

(CANNEL e MOO YOUNG, 1980). A FES é uma alternativa adequada e de baixo custo

para produzir enzimas e biomoléculas (EL-BAKRY et al., 2015). Os estudos iniciais

utilizando a FES como técnica de cultivo de microrganismos tinha como objetivo a

produção de biomoléculas de interesse. Porém, em meados de 1940 os estudos com FES

sofreram um considerável desinteresse em decorrência da produção da penicilina por

fermentação submersa (FSm), em virtude da Segunda Guerra Mundial. Nos anos 70 o

interesse foi renovado, com estudos mais aprofundados sobre a FES, relacionados à ração

animal enriquecida com proteínas que utilizavam resíduos agroindustriais, mostrando

viabilidade e agregando valor aos resíduos utilizados.

As vantagens da FES estão relacionadas com a produção de extratos concentrados,

a utilização de biomassas como substratos, baixo consumo energético, menor uso e

descarte de água e condições de cultivo que simulam o ambiente natural dos

microrganismos, fungos em especial (COUTO e SANROMÁN, 2006; KRISHNA, 2005;

SINGHANIA et al., 2009). A utilização de resíduos lignocelulósicos (como o bagaço de

cana-de-açúcar e o farelo de trigo) é de grande importância para a diminuição do impacto

ambiental, uma vez que os mesmos servem como suportes para os microrganismos

crescerem e produzirem as biomoléculas de interesse (da COSTA et al., 2016, GOMES

et al., 2016). A Figura 2.4 ilustra o cultivo de um processo usando FES.



Embora possuindo muitas vantagens a FES apresenta alguns desafios como,

dificuldade da remoção do calor ocasionado pelo crescimento dos microrganismos;

dificuldade na agitação do sistema, pelo fato do meio ser heterogêneo, dificuldade para

determinar o crescimento microbiano e outros parâmetros de cultivo além de dificuldade

de ampliação de escala (KRISHNA, 2005).

Estudos relacionados com microrganismos que apresentam grande capacidade em

produzir complexos enzimáticos utilizando biomassas como substratos aumentaram nos

últimos anos, os fungos filamentos principalmente são os mais empregados (MORETTI

et al., 2012).

Figura 2.4 – Ilustração de um cultivo em FES utilizando o bagaço da cana-de-açúcar

como substrato para o fungo Aspergillus fumigatus. Fonte: O autor.

2.6.1. Fatores que afetam a FES

As condições a qual o processo fermentativo é submetido e são de grande

importância para avaliar os melhores parâmetros para a produção de biomoléculas alvo.

Dentre eles destacam-se, a temperatura, o pH, a umidade, a atividade de água (aw), a

quantidade de oxigênio, a concentração de nutrientes e produtos que são responsáveis

pelo o crescimento celular e a formação dos produtos.



2.6.2. Teor de água e atividade de água

A umidade do substrato é um dos parâmetros que mais influenciam a FES. O teor

de água presente nas biomassas depende do tipo de material lignocelulósico utilizado, a

biomolécula alvo e o tipo de microrganismo (NARAHARA et al., 1982). Quando a

umidade é elevada resulta na diminuição da porosidade, problemas nas trocas gasosas e

contaminação cruzada (NARAHARA et al., 1982). Por outro lado, baixos teores de

umidade ocasionam problemas no crescimento dos microrganismos (LONSANE et al.,

1985).

A quantidade água livre é um parâmetro de grande importância para FES, pois a

mesma é utilizada para a difusão dos gases, dos solutos e dos metabólitos inibitórios

(PANDEY, 2003). A quantidade de água na FES é sempre limitada e para que o processo

ocorra de maneira ideal é necessário o controle da umidade. A quantidade de umidade

presente para cada substrato permite a formação de um filme de água na superfície, isso

facilita a transferência de oxigênio e nutrientes. Os espaços que existem na matriz sólida

devem estar livres para que ocorra a difusão de oxigênio e a dissipação de calor

(DESCHAMPS et al., 1985).

A umidade para o cultivo do microrganismo em FES depende da porosidade do

substrato, ou seja, o quanto ele consegue reter água. Por isso a umidade tem que estar

relacionada com a umidade da biomassa para poder promover o crescimento do agente

fermentador (DOELLE et al.,1992). Existe um valor de umidade para cada

microrganismo associado ao substrato que não necessariamente será o melhor valor para

a excreção do produto de interesse (NARAHARA et al.1982).

Para o crescimento na FES, cada microrganismo possui uma quantidade de água

livre ideal que é necessária para as suas atividades metabólicas. Uma pequena variação

nos teores de umidade acarreta problemas no crescimento e metabolismo dos

microrganismos (ANDRADE, 1999).

2.6.3. pH

A faixa de pH para os microrganismos durante a FES possui um amplo limite de

variação (PERAZZO e NETO, 1999), podendo diferir no pH para o crescimento

microbiano e o pH para formação das biomoléculas alvo, porém, devendo-se considerar



que o pH apresenta significativos efeitos sobre os resultados de um processo

fermentativo, seja para FSm ou FES (PANDEY, 2003). Existem valores de pH mínimo,

ótimo e máximo para o crescimento e desenvolvimento de cada microrganismo, por

exemplo, as fungos preferem pH baixo (4,5 – 6,0) e as bactérias pH neutro (6,5 – 7,0)

(PERAZZO e NETO, 1999).

O controle do pH durante a FES é bastante difícil (LONSANE et al., 1985;

PANDEY, 2003; PERAZZO NETO, 1999), sendo que o monitoramento e o controle

deste parâmetro geralmente não é realizado, devido as dificuldades das técnicas aplicadas.

Uma maneira de evitar este problema é o uso de substratos com a capacidade tamponante

(DEL BIANCHI et al., 2001). O pH do meio de crescimento desempenha um papel

importante por induzir mudanças morfológicas no organismo e também para a secreção

enzimática. A variação de pH no meio durante o crescimento dos microrganismos afeta a

formação e a estabilidade do produto (PANDEY, 2003). As variações que ocorrem com

o pH dos meios em um cultivo são em decorrência às reações que ocorrem durante as

atividades metabólicas dos microrganismos. Por exemplo, os sais de amônia formados

pelo metabolismo do nitrogênio fazem com que o pH diminua durante o crescimento

celular, o íon hidrogênio é formado quando a amônia é consumida (DOELLE et al.,

2002).

2.6.4. Temperatura

Na FES há geração de calor proveniente da atividade metabólica dos

microrganismos, ou seja, é um processo exotérmico. De acordo com PINTO (2003) a

temperatura influencia na germinação dos esporos no caso dos fungos, no crescimento do

microrganismo e na formação dos produtos, durante o cultivo o calor deve ser dissipado

para não ocorrer o aumento da temperatura e com isso prejudicar o processo. Destaca-se,

também, que a temperatura afeta a produção das enzimas, sendo necessária a remoção do

calor (SATO e SUDO, 1999).

Destaca-se que durante o cultivo há o surgimento de zonas de alta e baixa

(gradientes) temperatura e de concentração de oxigênio, dentro do reator, que afetam a

produção de biomassa e os metabólitos desejáveis de maneira negativa (PALMA, 2003).



2.7. O fungo filamentoso Aspergillus fumigatus

Aspergillus é gênero mais comum entre os fungos filamentosos, sendo um dos

mais bem estudados (BENNETT, 1998). As espécies deste gênero estão presentes em

todos os lugares do planeta estando presente no ar e na água, em plantas e em animais,

sendo um dos principais responsáveis pela deterioração dos vegetais e alimentos.

Aspergillus são utilizados para a obtenção de enzimas, e outros compostos de uso

industriais. Existem algumas espécies patogênicas para o homem, para os animais e outras

que produzem toxinas. Existem atualmente 150 espécies do gênero Aspergillus, porém

somente 30 destas são bem definidas (ROSA et al., 2002).

A colônia é composta por micélio aéreo com conidióforos eretos, densamente

distribuídos sobre a superfície do meio e com a presença dos conídeos (SANTOS, 2007).

As diferenças entre as estruturas morfológicas são de grande importância para a

diferenciação e a sua classificação.

As espécies deste grupo produzem o “aspergillum” ou “cabeça aspergillar”,

formada por uma haste (estipede) asseptado a qual é responsável pelo surgimento das

células conidiogênicas (fiálides e métulas) representado na Figura 2.4. As fiálides

produzem os conídeos. A cabeça aspergillar é formada por uma vesícula, com um

conjunto de células alongadas (fiálides) de onde surgem os conídeos. A estrutura inteira,

composta pela cabeça aspergillar, a haste (ou estipede) e a célula pé, forma o conidióforo

(SANTOS, 2007).

Figura 2.5 - Representação da morfologia das espécies do gênero Aspergillus (ROSA et

al., 2002).



2.7.1. Produção de celulases por Aspergillus fumigatus

É relatado a produção de enzimas celulolíticas por Aspergillus fumigatus

utilizando o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com solução de hidróxido de cálcio a

2%, após 8 dias de fermentação em estado sólido (GUPTA & MADAMWAR, 1997).

2.8 Sistema de duas fases para purificação de biomoléculas

A purificação é uma das etapas mais importantes após a produção de

biomoléculas, dependendo do tipo de proteína, por causa da complexidade, algumas

etapas são necessárias para se obter moléculas o mais puro possível para que se possa

aplicar em segmentos médicos e alimentícios. Um dos desafios da biotecnologia é o

desenvolvimento de processos de purificação mais simples, econômicos e seguros.

O sistema de duas fases aquosas (SDFA) é uma técnica aplicada na separação e

purificação de biomoléculas. Esta técnica apresenta um meio adequado e pouco agressivo

para os materiais biológicos, pelo fato da água estar em maior quantidade no meio

(SILVA e FRANCO, 2000). As diferentes técnicas de sistemas de duas fases aquosas

proporcionam altos graus de purificação e rendimento através de uma única etapa. A

técnica de SDFA oferece uma grande vantagem em se operar em processo contínuo

reduzindo assim o custo operacional em relação aos processos convencionais (KULA,

1990).

2.9. Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas (SMDFA)

O Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas (SMDFA) é um método de extração

líquido-líquido aplicado para a separação de biomoléculas e consiste no uso moléculas de

tensoativo que, em determinadas condições, geralmente acima da Concentração Micelar

Crítica (CMC), se separam espontaneamente em duas fases imiscíveis, uma rica em

tensoativo (fase inferior) e outra pobre em tensoativo (fase superior) (ALBERTSSON et

al., 1987). A Figura 2.6 ilustra a formação do SMDFA.



Figura 2.6 – Ilustração da formação das micelas no sistema micelar de duas fases

aquosas. Fonte: O autor.

Os agentes tensoativos são moléculas anfifílicas compostas por uma porção

hidrofílica, que apresenta afinidade pela água e que é denominada de "cabeça polar", e

uma porção hidrofóbica, que não possui afinidade pela água que é denominada de "cauda

apolar", conforme ilustrado na Figura 2.7.

Os tensoativos são classificados de acordo com a carga que a cabeça apresenta,

eles são classificados em: (1) iônicos, que possuem cabeça com carga positiva ou

negativa; (2) não-iônicos, possui a cabeça polar ligadas a átomos de hidrogênio com a

água; e (c) zwitteriônicos, possuindo cabeça caracterizada por um dipolo. Dodecil sulfato

de sódio (SDS), polioxietileno p-t-octil fenol (Triton X-114) e dioctanoilfosfatidilcolina

(C8-lecitina) são exemplos de tensoativos aniônico, não iônico, e zwitteriônico,

respectivamente (ISRAELACHVILI, 1991).



Figura 2.7 – Ilustração esquemática a estrutura do monômero de um tensoativo,

representando a porção da cabeça polar (hidrofílica), e a porção da cauda apolar

(hidrofóbica). Fonte: O autor.

As moléculas com os tensoativos em meio aquoso podem se comportar de diversas

maneiras, de acordo com a concentração e características do sistema. Cada tensoativo

apresenta a sua concentração micelar crítica (CMC). As soluções com concentração de

tensoativo abaixo da CMC deslocam na interface ar-água, projetando suas caudas

apolares em direção à fase ar diminuindo o contato com a água.

A maioria dos tensoativos apresenta solubilidade mínima na fase aquosa, devido

ao caráter hidrofóbico do grupo apolar. Por outro lado, em soluções com concentrações

de tensoativos superiores à CMC, ocorre à formação de micelas, em que as caudas

hidrofóbicas se associam no interior, minimizando o contato com a água, e as cabeças

polares permanecem na periferia das micelas, aumentando o contato com a água

(CHEVALIER e ZEMB, 1990; LIU et al., 1998; TANFORD, 1980).

A formação das micelas ocorre em decorrência das forças intermoleculares, de

interações de van der Waals, eletrostáticas, estéricas, hidrofóbicas e ligações de

hidrogênio (ISRAELACHVILI, 1991; TANFORD, 1980) bem como está relacionado

com forças atrativas e repulsivas (KAMEI, 2001). O efeito hidrofóbico está ligado com a

entropia do sistema, que ocorre quando existe o contato entre as caudas apolares e as

moléculas de água (TANFORD, 1980).

Os SDMFAs são caracterizados por uma curva de coexistência separando a zona

em que não há formação da micela (região monofásica) da zona em que ocorre a formação



de micelas, havendo assim a formação de duas fases, conforme ilustrado na Figura 2.8.

Destaca-se que essa curva é dependente da temperatura e da quantidade (concentração do

tensoativo).

No processo de separação usando o SMDFA busca-se a distribuição seletiva das

moléculas-alvo entre as fases (FERNANDES et al., 2001). Essa migração é de acordo

com as características do sistema aplicado, da biomolécula e a interação existente entre o

sistema e as substâncias (ALBERTSSON et al., 1987; HASMANN et al., 2007). A

partição é quantificada pelo coeficiente de partição (K) que relaciona a concentração da

molélula alvo na fase pobre em micela com a rica em micela. A presença de condições

dos sistemas que favorece o particionamento das biomoléculas torna o sistema muito mais

eficiente, quando comparados com outras técnicas de separação (HASMANN et al.,

2007).

Os sistemas de duas fases aquosas em geral são formados pela combinação de

soluções de polímero/polímero, polímero/sal inorgânico ou sal/sal em uma concentração

próxima a crítica. A separação das fases eficiente está relacionada com o tipo de sal e é

descrita com a série de Hofmeister, ela classifica os íons presentes nos sais de acordo com

a sua capacidade de causar o efeito salting-out (ANANTHAPADMANABHAN E

GODDARD, 1987). O fenômeno de salting-out é responsável pela diminuição da

solubilidade e pela precipitação de um soluto qualquer quando é adicionado um outro

soluto (sal) à solução pelo efeito do eletrólito na solubilidade do não eletrólito.

Figura 2.8 - Ilustração de um diagrama de fases. Fonte: O autor.



Estudos relatam a aplicação do sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA)

no processo de recuperação e purificação de biomoléculas, albumina, bacteriófagos,

antibióticos, colesterol oxidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, lisozima, vitaminas

lipossolúveis, ácido glicirrízico, nisina, compostos orgânicos e outras proteínas (CHENG-

KANG e WEN-DA, 1998; BORDIER, 1981; HOLM et al., 1986; NIKAS et al., 1992;

PRYDE, 1986; RAMELMEIER et al., 1991; SANCHEZ-FERRER et al., 1994; LIU et

al., 1998; LEE e SU, 1999; SIVARS e TJERNELD, 2000; TANI et al., 1998; CHIANG,

1999.

CAPÍTULO III

MATERIAL E

MÉTODOS

Capítulo III. Material e Métodos 45


3. Material e Métodos

Este capítulo apresenta as metodologias aplicadas, os reagentes, material e os

equipamentos utilizados no presente trabalho. O trabalho experimental foi realizado no

Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade do Rio Grande do Norte

(UFRN).

3.1. Tratamento inicial para as fibras lignocelulósicos utilizadas

3.1.1. Fibra do coco

A casca e o mesocarpo fibroso foram utilizados para a obtenção da fibra da casca

de coco verde. O fruto foi coletado em um quiosque na praia de Ponta Negra - Natal (RN).

Os cocos foram selecionados e lavados. Os resíduos foram secados em estufa do tipo

bandeja a 70 °C por 72 horas, e moídos em triturador (moinho tipo Willye, TE – 680,

marca: Tecnal®), a granulometria do material foi de 20 mesh, em peneira com diâmetro

de abertura de 0,850 mm, e armazenados em sacos plásticos à temperatura ambiente. A

Figura 3.1 ilustra o aspecto do material lignocelulósico utilizado.

3.1.2. Fibra do pedúnculo de caju

O resíduo foi obtido a partir do pedúnculo de caju, adquirido de uma empresa

produtora de castanhas CIONE, localizada na cidade de Fortaleza – CE. O qual foi lavado

e esmagado para a retirada da polpa. Os frutos estavam maduros e apresentavam

coloração vermelha. Os cajus foram lavados em água corrente, o pedúnculo limpo foi

triturado e peneirado para separação do suco. O material fibroso foi lavado 15 vezes com

3,0 L de água a cada lavagem para a retirada dos açúcares (FAWOLE E ODUNFA, 2003).

O bagaço úmido foi disposto em bandejas de polietileno e levados a estufa com circulação

de ar a temperatura de 70 ºC durante 48 horas. Após a secagem o resíduo foi peneirado

para a separação das partículas maiores. E armazenados em sacos plásticos. A Figura 3.1

representa o aspecto do material.



3.1.3. Bagaço de cana-de-açúcar

O bagaço de cana-de-açúcar foi adquirido da Usina Estivas (Arês/Rio Grande do

Norte - Brasil) produtora de açúcar. Após a seleção dos bagaços, procedeu-se a

dilaceração do material com facão, que foi seguida por lavagem, secagem, moagem e

armazenamento. A secagem do bagaço da cana-de-açúcar foi realizada em estufa do tipo

bandeja a 70 °C por 48 horas, sendo que a moagem foi em triturador (moinho tipo Willye,

TE – 680, Tecnal/SP). A biomassa foi classificada em peneira de 20 mesh (Fig. 3.1), e

armazenada em sacos plásticos à temperatura ambiente.

Figura 3.1 - Fibras de pedúnculo de caju (A), fibra de coco verde (B) e bagaço de cana-

de-açúcar (C), com granulometria padronizada em 20 mesh. Fonte: O autor.



Figura 3.2 - Fluxograma das etapas de obtenção das fibras de biomassas in natura. Fonte:

O autor.

Seleção dos resíduos

Coco, pedúnculo de caju e cana-de-açúcar)

Dilaceração dos

resíduos

Lavagem

Moagem: granulometria

a 20 mesh

Secagem:

Coco: 70 °C/72 h

Cana-de-açúcar e o

pedúnculo de caju:

70 °C/48 h

Armazenamento: Saco

plástico/temperatura ambiente.



3.2. Caracterização das fibras

O teor de celulose, hemicelulose, lignina, cinzas, umidade e extraíveis foram

avaliados a partir das fibras in natura (cana-de-açúcar, coco verde e pedúnculo de caju),

principalmente objetivando a utilização destes resíduos como substratos indutores na

produção de enzimas celulolíticas por FES.

Na etapa de produção de nanocristais de celulose (NCC) utilizou-se o bagaço de

cana-de-açúcar, sendo realizado pré-tratamento com NaOH (4% m/v) e Ca(OH)2 (5, 10 e

20% m/v). A caracterização foi realizada segundo o protocolo da NREL (National

Renewable Energy Laboratório - EUA) (SLUITER et al., 2008).

3.2.1. Determinação dos sólidos totais

A metodologia aplicada foi conforme o protocolo da NREL - Determination of

Total Solids in Biomass (SLUITER et al., 2008). Em cápuslas de porcelanas, previamente

taradas, foram pesados cerca de 1,5 gramas de bagaço. A cápusula foi levada para estufa

105 °C por 24 horas. Após esse período, o material então foi colocado em dessecador

para efetuar uma nova pesagem. A umidade foi determinada em triplicata e calculada

conforme a Equação (3.1).

%𝑼 = (𝟏 −𝑴𝒔𝒆𝒄𝒂

𝑴ú𝒎𝒊𝒅𝒂) ∗ 𝟏𝟎𝟎 (3.1)

Sendo:

% U = percentual de umidade.

Mseca = massa seca obtida pela diferença entre o peso do conjunto depois da estufa e o

peso da cápsula.

Múmida = massa úmida obtida pela diferença entre o peso do conjunto antes de ser levado

para estufa e o peso da cápsula.

3.2.2. Determinação dos extrativos

Para a determinação dos extrativos utilizou-se o método adaptado da NREL -

Determination of Extractives in Biomass (SLUITER et al., 2008). Assim, foram pesados

3 g de biomassa de cada fibra e submetidos à extração em um aparelho de Soxhlet,



utilizando dois solventes em temperaturas diferentes durante 24 horas. Para cada solvente

utilizados foram o etanol (95%) a 80 °C e água a 120 °C, ambos com um volume de 70

mL.

Ao final do processo extrativo, o cartucho com o material seco foi colocado em

estufa à 100 °C até peso constante. A percentagem de extrativos foi calculada com base

na diferença de massa, conforme a Equação (3.2).

%𝑬𝒙𝒕 =𝑴𝒊− 𝑴𝒇

𝑴𝒇𝟏𝟎𝟎

Sendo:

%Ext: percentual de extrativos.

Mi: massa do cartucho e amostra inicial.

Mf: massa seca do cartucho e amostra após a extração.

3.2.3. Determinação dos polissacarídeos

3.2.3.1. Hidrólise ácida com H2SO4 (72%)

A determinação dos polissacarídeos foi de acordo com protocolo da NREL-

Determination of Structural Carbohydrates and Lignin Biomass (CROCKER et al.,

2008). Uma amostra de aproximadamente de 0,3 g (base seca) foi transferida para um

béquer de 100 mL e tratada com 3,0 mL de H2SO4 72%, sob vigorosa agitação, por 60

minutos em um banho com controle de temperatura a 30,0 ± 0,5 °C.

A reação foi interrompida com a adição de 84 mL de água deionizada, sendo a

mistura reacional transferida para frascos Erlenmeyers de 500 mL. O Erlenmeyer foi

fechado e autoclavado por 15 minutos a 1,05 atm. O frasco foi então retirado e resfriado

até a temperatura ambiente. O material hidrolisado foi separado dos sólidos por filtração,

utilizando-se papel de filtro seco e tarado. O hidrolisado foi recolhido em um béquers

para o recolhimento das frações líquidas destinas à identificação por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (CLAE), e o sólido contido no papel de filtro foi lavado com

porções de 50 mL de água destilada para a retirada dos sulfatos, em seguida foram secos

em estufa.

(3.2)



3.2.4. Determinação da lignina

3.2.4.1. Determinação da lignina insolúvel

O material retido no papel de filtro, após a hidrólise ácida, que corresponde à

lignina insolúvel, foi submetido a uma lavagem com água destilada até isenção de sulfatos

(aproximadamente 1500 mL) e seco em estufa à 50 °C. Por diferença de massa, foi

determinado o teor de lignina insolúvel e inorgânico (cinzas). Para se obter o teor de

lignina insolúvel real foi necessário se determinar as cinzas do material que ficou retido

no papel de filtro.

3.2.4.2. Determinação do teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais

Após a determinação da lignina insolúvel em meio ácido (item 3.2.4.1), o resíduo

no papel de filtro foi transferido para um cadinho de porcelana previamente tarado. A

amostra foi calcinada lentamente até 300 °C, em seguida, por mais duas horas à 800 °C,

em mufla.

Para a determinação das cinzas totais seguiu-se a metodologia proposta em NREL

- Determination of Ash in Biomass (TEMPLETON et al., 2008). Nesse caso, foi pesado

aproximadamente 2 g do bagaço em cadinho de porcelana previamente tarado. O material

foi calcinado em mufla à 300 °C e logo, em seguida, à 800 °C por duas horas. Por

diferença de peso de massa, o teor de cinzas da lignina insolúvel e das cinzas totais foi

determinado de acordo com a Equação (3.3).

%𝐜𝐢𝐧𝐳𝐚𝐬 =𝐌𝐜

𝐌𝐚𝐱𝟏𝟎𝟎

Sendo:

% cinzas = percentual em massa de cinzas.

Mc = massa de cinzas (diferença entre massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho

vazio).

Ma = massa da amostra seca (base seca).

(3.3)



3.2.5. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A determinação dos teores de celulose e de hemicelulose depende das

concentrações de carboidratos e de ácidos orgânicos presentes no hidrolisado após a

hidrólise ácida. Os fatores de conversão que foram usados para converter as massas destes

compostos em massas de celulose e hemicelulose são apresentados na Tabela 3.1.

(PITARELO, 2007)

A análise dos carboidratos e ácidos orgânicos foi realizada por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplado a um detector de índice de refração- IR

utilizando a coluna Shim-Pack SCR-101H (Shimadzu Co. Japan) com a uma temperatura

de 65 °C, e utilizada como fase móvel constituída de uma solução de ácido sulfúrico 0,005

M sob fluxo de 0,6 mL/min. O volume de injeção na coluna foi de 20 µL. As amostras

foram previamente filtradas em membranas de 0,22 µm, para remoção de possíveis

partículas insolúveis. As concentrações de cada componente foram obtidas através de

curvas de calibração que correlacionam às concentrações dos padrões preparados com as

respectivas áreas dos cromatogramas.

Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os fatores de conversão de cada componente

presente no extrato hidrolisado.

3.3. Determinação das atividades de água e umidades das fibras

Em pequenos tubos plásticos foram adicionados 1,0 grama das fibras (cana-de-

açúcar, coco e pedúnculo de caju) e aplicados diferentes volumes de água (0 µL - 1000

Componente Fator de conversão

Celobiose 0,95

Glicose 0,90

Xilose 0,88

Arabinose 0,88

Ácido Acético 0,72

HMF 1,29

Furfural 1,37



µL) para acompanhar a atividade de água, através do aparelho Aqualab (4 TE, Decagon

Devices, EUA) sendo a leitura pela célula realizada em duplicata. A umidade foi estimada

com o auxílio de cápsulas de porcelanas, previamente pesados. Nesse caso, utilizou-se

1,0 grama das fibras umidificadas da mesma forma da atividade de água. A cápsula foi

levada para estufa à 105 °C por 24 horas. Após esse período, o material foi colocado em

dessecador para efetuar uma nova pesagem. A umidade foi determinada em triplicata e

calculada conforme a Equação (3.1).

3.4. Microrganismo e manutenção

O fungo filamentoso Aspergillus fumigatus foi isolado da casca do coco verde foi

isolado por Oliveira Júnior, 2014. O agente fermentador utilizado para a produção das

enzimas celulolíticas por FES. A Figura 3.3 ilustra o aspecto morfológico do fungo.

O microrganismo Aspergillus fumigatus foi inoculado em placas contendo agar

batata dextrose (BDA) que foram incubadas a 30 ± 1°C por 7 dias em estufa.

Adicionando-se 2 mL de água esterilizada, os esporos foram extraídos do meio em placa

e usados na etapa de ativação. Logo após, foram utilizados para o primeiro repique em

meio BDA em placas de Petri durante 5 dias à 30 ºC, bem como para a realização do

segundo repique para a produção do inóculo da fermentação. Os repiquetes foram

realizados a cada 3 meses para a manutenção do microrganismo e mantidos refrigerados.

Figura 3.3 - Microrganismo utilizado no processo usando FES, o fungo filamentoso

Aspergillus fumigatus isolado da casca do coco mantido em placa de Petri em meio BDA.

Fonte: O autor.



3.4.1. Inóculo

O microrganismo (Aspergillus fumigatus) foi inoculado em placas contendo agar

batata dextrose (BDA) e incubados a 30 ± 1 °C por 5 dias. A obtenção do inóculo para a

FES foi realizada através da propagação dos esporos da cepa de Aspergillus fumigatus

em Erlenmeyers de 125 mL contendo sabugos de milho (4 g) que foram autoclavados.

Para inoculação no meio do sabugo de milho foram transferidos 1 mL da solução de

Tween 80 a 0,2% (v/v) das placas contendo os microrganismos e incubados em estufa

BOD à 30 °C por 7 dias, como representado na Figura 3.4. A contagem dos esporos foi

realizada em câmara de Neubauer, com auxílio do microscópio binocular (modelo BX

51, OLYMPUS). A concentração de esporos utilizada como inóculo foi de 1,0×106

esporos/grama de meio sólido (COELHO et al., 2001).

Figura 3.4 - Fungo filamentoso Aspergillus fumigatus em Erlenmeyer de 125 mL

contendo sabugo de milho para propagação dos esporos. Fonte: O autor.

3.5. Produção do extrato enzimático por FES

As fibras foram esterilizadas em autoclave a 121 °C durante 15 minutos. O

Aspergillus fumigatus foi inoculado conforme descrito na seção 3.4.1. A FES foi realizada

em estufa BOD a temperatura de 30 °C, utilizando 5,0 gramas de cada fibra nas condições

estabelecidas em Erlenmeyers de 250 mL, durante 120 h (5 dias), conforme ilustrado na

Figura 3.5. Nessa etapa, avaliou-se a influência do teor de umidade e do pH da solução

salina nutriente (Urbánszki et al., 2000) na FES, por meio de um planejamento composto



central rotacional 22 com 3 repetições no ponto central. As soluções nutrientes usadas são

destacadas abaixo:

Solução salina conforme Urbánszki et al. (2000): KH2PO4 (5,0 g/L); (NH4)2SO4

(5,0 g/L); MgSO4.7H2O (1,0 g/L); NaCl (1,0 g/L); FeSO4.7H2O (5,0 mg/L); MnSO4

(1,6 mg/L); ZnSO4.7H2O (3,45 mg/L) e CoCl2.6H2O (2,0 mg/L).

Tampão acetato de sódio (pH 5,0): Solução composta por 14,8 mL de solução de

ácido acético (11,55 g/L), 35,2 mL de solução de acetato de sódio (27,2 g/L) e

água destilada até atingir um volume final de 100 mL.

Figura 3.5 - Processo de fermentação em estado sólido nas fibras de pedúnculo de caju

(A), fibra de coco verde (B) e bagaço de cana-de-açúcar (C), com granulometria

padronizada em 20 mesh. Fonte: O autor.

3.6. Extração do complexo enzimático celulolítico

O extrato enzimático foi coletado dos frascos após 120 h de fermentação, em que

foram adicionados 30 mL do tampão acetato (200,0 mM, pH 5,0) ao meio fermentado

misturando-se com bastão de vidro. O fermentado foi submetido à agitação em shaker a

200 rpm à 30 °C por 30 minutos. Em seguida, o extrato foi clarificado por meio de

centrifugação a 2000 rpm durante 10 min à 4 °C e filtração, sendo armazenados a

temperatura de -18 °C em microtubos. O sobrenadante contendo o extrato enzimático foi

utilizado para análises das atividades enzimáticas (CMCase e FPase) e para determinação

de proteínas totais.



3.7. Planejamento Experimental para produção de enzimas celulases utilizando as

fibras lignocelulósicas

O planejamento composto central rotacional 22 com de 3 repetições no ponto

central e 4 pontos axiais, foi realizado a fim de avaliar a influência do teor da umidade e

o efeito do pH nas atividades enzimáticas (CMCase e FPase) e proteínas totais. A

disposição dos ensaios bem como os valores dos níveis reais e codificados dos fatores são

apresentados nas Tabelas 3.2 e 3.3, respectivamente. A análise de variância (ANOVA), a

análise de regressão e as superfícies de resposta foram realizadas para se obter uma

condição ótima para a produção do extrato enzimático bruto. Através de um modelo

polinomial de segunda ordem e da ANOVA, usando-se um nível de confiança de 95,0%

(p<0,05), foi possível obter um modelo de acordo com a Equação (Eq. 3.4).

20 i i ii i ij i jResposta X X X X (3.4)

Sendo que β0, βi, βii e βij representam a média da resposta avaliada, as constantes dos

efeitos linear e quadrático de Xi e as constantes das interações entre Xi e Xj,

respectivamente. Os experimentos foram realizados em duplicata. Todas as análises

estatísticas foram realizadas utilizando o software Statistica 7.0 (Statsoft, USA).

Tabela 3.2 - Representação da matriz do planejamento experimental para os ensaios da

FES

Ensaios Umidade pH

1 (-1) (-1)

2 (+1) (-1)

3 (-1) (+1)

4 (+1) (+1)

5* 0 0

6* 0 0

7* 0 0

8 (-α) 0

9 (+α) 0

10 0 (-α)

11 0 (+α)

*Pontos centrais



Tabela 3.3 - Codificação dos níveis e das variáveis utilizados no planejamento

experimental.

Coco verde Cana-de-açúcar Pedúnculo de caju

Níveis Umidade (%) pH Umidade (%) pH Umidade (%) pH

(-α) 65,90 2,68 31,72 2,68 55,90 2,68

(-1) 70,00 3,50 40,00 3,50 60,00 3,50

0 75,00 4,50 50,00 4,50 65,00 4,50

(+1) 80,00 5,50 60,00 5,50 70,00 5,50

(+α) 84,10 6,32 68,28 6,32 74,10 6,32

Figura 3.6 - Fluxograma para as etapas usadas na produção de celulase usando FES.

Resíduos:

Cana-de-açúcar, coco e pedúnculo de caju, granulometria a 20

mesh

Erlenmeyer de 250 mL. 106 esporos/g (A.

fumigatus), 120 h a 30 °C (BOD), 5 gramas

de cada resíduo

Centrifugação: 2000 rpm, 10 min a

4 °C.

Filtração.

Extração das enzimas: 30 mL de

tampão acetato (200 mM) pH 5,0.

Agitação de 200 rpm, 30 min a

30°C.

Sobrenadante

armazenado a -18 °C.



3.8. Efeito do pH e da temperatura nas atividades das enzimas celulases produzidas

Para avaliar o efeito do pH e da temperatura sobre as atividades das enzimas

celulases (CMCase e FPase) produzidas por FES utilizando apenas o bagaço de cana-de-

açucar como substrato, em virtude da maior atividade encontrada quando comparado aos

outros bagaços (coco e pedúnculo de caju) por FES.

Para avaliar o efeito dos tipos de pH na estabilidade das enzimas celulolíticas, a

atividade foi determinada na temperatura ótima das enzimas (50 °C) em tampões com pH

variando de 2,0 a 10,0 (0,2 M). Os tampões utilizados foram os seguintes: tampão glicina-

HCl 2,0 e 3,0; tampão acetato de sódio para pH 4,0 e 5,0; tampão fosfato de sódio para

pH 6,0 a 8,0 e tampão glicina-NaOH para pH 9,0 e 10,0. Um volume de 0,5 mL da solução

enzimática foi misturada com 0,5 mL de cada tampão especificado, e o volume reacional

foi mantido por 25 °C durante 1 h. E em seguida determinou-se as atividades da CMCase

e FPase.

O efeito da temperatura nas atividades das enzimas foi avaliado nas temperaturas

entre 30 °C a 70 °C, o pH utilizado foi o ótimo das enzimas (5,0). Um volume de 2,0 mL

da solução enzimática foi mantido nas temperaturas durante 1 h. E em seguida

determinou-se as atividades da CMCase e FPase.

3.9. Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar visando à produção de NCC

Objetivando a produção dos NCCs efetuou-se os pré-tratamentos alcalinos ao

bagaço de cana-de-açúcar. Cada uma das soluções de NaOH ou de Ca(OH)2 foram

aplicadas separadamente sobre as amostras do bagaço de cana-de-açúcar. Para o NaOH

utilizou-se uma concentração de 4% (m/v) com 5% de teor de sólidos, 12,5 g bagaço/250

mL da solução NaOH.

Para o Ca(OH)2 foram utilizadas as concentrações de 5, 10 e 20% (m/m), de acordo

com a Tabela 3.4 A cada pré-tratamento utilizando o Ca(OH)2 o bagaço foi autoclavado

a 121°C por 1h e para o pré-tratamento com NaOH o bagaço foi autoclavado a 121°C por

30 minutos. As biomassas foram submetidas à agitação de 100 rpm durante 15 min a cada

lavagem, filtradas e lavadas com água destilada sucessivamente até o pH neutro. Em

seguida, foram secas a 60 ºC para a sua utilização e caracterizações finais. Para facilitar



o acesso das enzimas celulolíticas nas frações de celulose e hemicelulose, o bagaço foi

submetido aos seguintes tratamentos (condições):

Tratamento (1) – Bagaço sem tratamento (controle);

Tratamento (2) – Bagaço tratado com solução de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2 -

5%);


10%);


20%);

Tratamento (5) – Bagaço tratado com solução de hidróxido de sódio (NaOH -

4%).

Tabela 3.4 - Concentrações do Ca(OH)2 utilizados nos pré-tratamentos.

Ca(OH)2 (%) Ca(OH)2 (g) m do bagaço (g) m de água (g)

5 0,15 3 39,85

10 0,3 3 39,7

20 0,6 3 39,4

3.10. Hidrólise enzimática para produção dos NCCs

As fibras de cana-de-açúcar in natura e pré-tratadas foram submetidas à hidrólise

enzimática em duplicata, utilizando uma concentração de 5,0% de biomassa seca. Essa

baixa carga de sólidos foi empregada com objetivo de eliminar problemas de transferência

de massa que poderiam prejudicar a eficiência da hidrólise. Os experimentos de hidrólise

foram realizados a 50 °C e pH 4,8. A agitação foi de 200 rpm e o tempo total de hidrólise

foi de 96 horas, utilizando uma massa de 0,2 gramas com um volume de 40 mL, sendo

que o tampão citrato (200 mM) foi usado para regular o pH do meio. A azida de sódio

(concentração de 0,01% (p/v)) foi adicionada para inibir o crescimento de

microrganismos e evitar contaminações.

A carga enzimática utilizada para ambos os coquetéis foi de 7,5 FPU (Filter Paper

Unit) por grama de biomassa, destacando-se que nessa etapa foi empregada a enzima

comercial de Trichoderma reesi (Cellulase from Trichoderma ressei ATCC 26921 Sima

Aldrich) e o extrato celulolítico bruto produzido pelo Aspergillus fumigatus como

descrito na seção 3.5. A concentração de açúcar no meio reacional foi medida ao longo

do tempo de reação. Para isso, foram retiradas alíquotas em 0, 24, 48, 96, e 72 horas que

foram imediatamente aquecidas em água fervente durante 10 minutos para inativar as



enzimas e finalizar a reação. Em seguida, as alíquotas foram centrifugadas e no

sobrenadante foram realizadas a leitura dos açúcares redutores totais, carboidratos e

ácidos orgânicos por CLAE. A hidrólise enzimática foi avaliada pelo teor de açúcares

redutores no hidrolisado ao longo de 96 horas, a conversão da celulose foi medida em

função da glicose.

3.11. Produção dos NCCs

As suspensões coloidais de NCCs em água deionizada foram preparadas a partir

da hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado com NaOH, após a etapa

de hidrólise enzimática como descrito no item 3.10. Após a hidrólise parcial as amostras

foram lavadas com água deionizada sucessivas vezes para solubilizar açúcares, enzimas

e outras proteínas, ou componentes solúveis. Em seguida, o líquido resultante da solução

foi centrifugado (Tubos cônicos de plástico de 15 mL) a 15000 rpm por 5 min e depois

dialisado, usando membrana de diálise (Sigma- aldrich) por 24 h até o pH da solução ficar

neutro. Em seguida, os nanocristais foram analisados por microscopia de força atômica

(MFA), conforme item 3.15.

Assim, acompanhou-se a produção dos NCCs durante o processo de hidrólise

enzimática até 96 h, no intervalo de 24 h, 48 h e 72 h.

3.12. Análise das ligações estruturais por Espectroscopia de Infravermelho por

transformada de Fourier (FTIR)

A análise FTIR foi utilizada para detectar a presença dos principais grupos

orgânicos constituintes das fibras lignocelulósicas. A análise do FTIR utilizou espectros

de absorção, a faixa espectral foi 400 - 4000 cm-1 usando o equipamento Shimadzu, IR

Tracer 100, (Perkin Elmer, EUA).

3.13. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

As amostras das fibras in natura, da fibra do bagaço de cana-de-açúcar fermentado

e as fibras de cana-de-açúcar pré-tratadas foram previamente secas em estufa (umidade

inferior a 10%) e analisadas no microscópio eletrônico de varredura (Phillips XL -



30ESEM, USA), utilizando um feixe de elétrons de 15 kV. As micrografias eletrônicas

foram tiradas com ampliações 40x, 100x e 200x.

3.14. Difração de Raios X (DRX)

A cristalinidade das fibras lignocelulósicas foram avaliadas através da

espectroscopia de DRX (XRD-6000, Shimadzu, Japão), Kα de cobre de radiação, 30.0

kV de tensão e 15 mA de corrente eléctrica, com uma taxa de 2.0 graus por minuto para

uma varredura contínua 2θ com intervalo de 4.0 - 70.0°.

O índice de cristalinidade (IC) das fibras foi calculado de acordo SEGAL et al.,

(1959). Usando a Equação (3.5):

%IC = [(I002 - Iam) /I002] × 100 (3.5)

O I002 é a intensidade de difração do pico de 22.5 ° e Iam é a intensidade da linha

de base que representa o pico de 18 °.

3.15. Análise por Microscopia de Força Atômica (MFA)

As análises da MFA caracterizam a superfície dos materiais em escala atômica.

As análises da MFA foram obtidas nas condições de temperatura e umidade ambiental,

pelo equipamento modelo SPM9700 (Shimadzu, Japão), com a resolução de X, Y, com

0,2 nm e Z com 0,01 nm com componente tubo piezoeletrônico.

As amostras após a hidrólise enzimáticas foram lavadas, repetitivamente, e uma

alíquota do sobrenadante foi gotejada em lâminas de vidro, com o objetivo de verificar a

forma, o diâmetro e o tamanho dos nanocristais gerados.

As análises descritas nos itens 3.12; 3.13; 3.14 e 3.15 foram conduzidas no

Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais, Departamento de Engenharia de

Materiais – DEMat, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).



Figura 3.7 – Fluxograma para obtenção dos NCC.

3.16. Sistema micelar de duas fases aquosa (SMDFA)

3.16.1. Determinação do ponto de nuvem

O ponto de nuvem para o SMDFA foi determinado pela identificação visual, isto

é, observando-se o momento de turvação inicial do sistema, conforme proposto por

WATANABE e TANAKA (1978). O método consiste na identificação visual, para uma

certa temperatura, em que uma solução de surfactante com uma concentração conhecida

inicia a turvação. As misturas foram adicionadas a tubos cônicos e transferidas para banho

Resíduo:

Cana-de-açúcar: granulometria de 20 mesh

in natura e pré-tratada.

Hidrólise enzimática (0, 24, 48, 72 e 96 h)

Erlenmeyer de 125 mL, m = 0,2 g e v = 40 mL; carga

enzimática dos extratos = 7,5 FPU/g. Agitação de 200

rpm a 50 °C e com pH = 4,8.

Fração líquida

Reação paralisada: banho

quente/10 min

Centrifugação: 12000 rpm/30 °C/

10 min/3x.

Açúcares e ác. Orgânicos por

CLAE. Análise dos NCC –

MFA.



de água. Nesse estudo, a temperatura foi incrementada em 0,1 °C a cada 20 min, iniciou-

se com 19 °C até 25 °C.

3.16.2. Recuperação e purificação de celulases usando o SMDFA

As enzimas celulolíticas produzidas como descrito na seção 3.5 foram recuperadas

e purificadas utilizando um SMDFA composto por Triton X-114 em diferentes

concentrações (2, 4, 6 e 8% (m/m)). Foi investigada a influência da temperatura (35, 40,

45, 50, 55, 60 e 65 °C), concentração de extrato (20, 40, 60 e 80%) e sais inorgânicos

(NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4) todos a 5,0% (m/m) na partição das enzimas

celulolíticas utilizando SMDFA. O pH do sistema foi mantido no valor de 5,0. Para a

formação do SMDFA, uma quantidade dada de Triton X-114, extrato enzimático e sal

foram adicionados ao tubo de centrifugação (15 mL) até uma massa final de 5,0 g. Água

deionizada foi utilizada para complementar a massa final. O tubo foi agitado durante 1,0

min e a separação das fases ocorreu após 3 horas em banho-maria para uma determinada

temperatura. O volume de fase (superior e inferior) foi medido e amostras das fases foram

tomadas para quantificação da atividade enzimática (CMCase e FPase) e proteína total, o

que permitiu o cálculo do coeficiente de partição, rendimento e o fator de purificação para

as celulases (CMCase e FPase).

O coeficiente de partição (K) para as enzimas no SMDFA foi calculado de acordo

com a Equação (3.6):

𝐾 = (As

Ai) (3.6)

sendo As a atividade enzimática na fase superior (fase pobre em micelas) e Ai a atividade

enzimática na fase inferior (fase rica em micelas), respectivamente.

O rendimento da enzima (R) para a fase superior foi obtido conforme Equação

(3.7):

𝑅 = (AsVs

AiVi) 𝑥 100 (3.7)

sendo Vs e Vi o volume da fase superior e inicial, respectivamente.

O fator de purificação (FP) foi estimado considerando a atividade específica

conforme descrito na Eq. (3.8):



𝐹𝑃 = (As/Cs

Ai/Ci) 𝑥 100 (3.8)

sendo CS e Ci a concentração de proteína total na fase superior e inicial, ou seja no caldo

fermentado, respectivamente.

3.17. Determinação da Atividade enzimática da FPase

A atividade usando papel de filtro (FPase) foi expressa em FPU/mL, e

determinada de acordo com a IUPAC (GHOSE, 1987). O método utiliza tiras de papel de

filtro (1,0 cm x 6,0 cm) como substrato e mediu-se a concentração dos açúcares redutores

liberados durante a degradação. A mistura reacional contendo o extrato enzimático (1

mL) e uma tira de papel de filtro Whatman n°1 utlizando 0,5 mL de tampão citrato de

sódio (50,0 mM, pH 4,8) e foi incubada em banho maria (TE – 184 Tecnal) a 50 °C

durante 1 hora. A reação foi interrompida pela adição do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)

e então fervida por 10 minutos em tubos de ensaios e resfriados em um banho de gelo. A

concentração dos açúcares ao final da reação foi determinada em espectrofotômetro a 540

nm, utilizando uma curva padrão de glicose.

Uma unidade de atividade em papel de filtro (FPU) corresponde a 1,0 µmol de

açúcares redutores, expresso como glicose, liberados por minuto nas condições reacionais

usadas.

3.18. Determinação da Atividade enzimática CMCase

A atividade celulolítica da endoglucanase (endo- 1,4-β-D-glucanase) foi

determinada usando carboximetilcelulose (CMC) de acordo com a metodologia de

GHOSE (1987). As amostras (0,5 mL) dos complexos celulolítcos com 0,5 mL de solução

do substrato CMC (4,0%) em tampão citrato de sódio (50,0 mM, pH 4,8)) foram

acondicionados em tubos de ensaio e incubados a 50 ºC em banho maria (Te -184 Tecnal)

por 10 minutos. Em seguida, retirou-se 1,0 mL da mistura reacional e adicionou-se 1,0

mL de DNS aos tubos para cessar a reação. Foi realizada a determinação dos açúcares

redutores. Os tubos foram colocados em banho com água fervente por 10 minutos.



A quantidade de açúcares redutores liberada foi determinada pelo método de DNS

(MILLER, 1959). Uma unidade (UI) de atividade enzimática correspondeu a 1,0 μmol de

ART liberado por minuto (expresso em glicose), nas condições do ensaio.

3.19. Determinação dos açúcares redutores

A determinação de açúcares redutores foi realizada pelo método do ácido 3,5 –

dinitrosalicílico (MILLER, 1959). Assim, adicionou-se 0,250 mL da amostra a 0,250 mL

do reagente DNS em tubos de Folin-Wu que foi deixado em um banho em água fervente

por 10 minutos. Após este tempo, resfriou-se os tubos em banho com água em

temperatura ambiente e completava-se o volume a 2,5 mL com água destilada, os quais

eram homogeneizados e feita a leitura da absorbância. A calibração do zero no aparelho

foi feita utilizando um teste em branco, em que 0,250 mL de água destilada foi usada ao

invés da amostra, seguindo o mesmo procedimento. O método foi previamente

padronizado por uma curva de calibração de glicose (0,1 a 1,0 mg/mL com intervalos de

0,1 g/L). As leituras foram realizadas a 540 nm em espectrofotômetro (Termo Spectonic,

Genesys 10 uv).

3.20. Determinação da quantificação de proteínas pelo método de Bradford

A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford

(BRADFORD, 1976). O conteúdo total de proteína foi quantificado a partir de uma curva

padrão de BSA (albumina sérica bovina). Uma solução foi usada para construção da curva

padrão, de acordo com instruções do fabricante. As soluções foram obtidas utilizando-se

albumina como padrão, em concentrações na faixa de 0,1 a 1 mg/mL com intervalos de

0,1 mg/mL. Utilizou-se 0,5 mL das amostras nas concentrações e adicionou-se 0,5 mL do

reagente de Bradford. O conteúdo de todos os tubos foi agitado, logo após a agitação em

temperatura ambiente efetuou-se a leitura de absorbância em espectrofotômetro a 595 nm.

Uma curva padrão correlacionando os valores de absorbância ao conteúdo protéico foi

utilizada para quantificação da concentração protéica.



3.21. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

A eletroforese em condições desnaturante (SDS-PAGE) foi realizada de acordo

com LAEMMLI (1970) usando 10% (m/v) de acrilamida. As bandas de proteínas foram

coradas usando nitrato de prata. Um marcador comercial (GE Healthcare, Suécia) foi

utilizado para estimar a massa molecular das proteínas.

3.22. Zimograma

O zimograma foi obtido adaptando o método proposto por TAKENAKA et al.,

(1999). Assim, as amostras (5 mL) foram dialisadas utilizando 5 L de água deionizada

durante a noite e concentrada (1,0 mg/mL) no concentrador (Centrivap, modelo 78100-

01, Labconco) sendo então submetida a uma eletroforese (PAGE) adicionado-se CMC

(0,2%) ao gel preparado com Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) durante 3 h a 4 °C.

Para observar a atividade celulolítica, o gel foi incubado sob agitação em tampão

citrato de sódio (50 mM, pH 4,8) a 50 °C durante 1 h. Em seguida, o gel foi lavado com

água destilada e depois imerso sob solução de corante vermelho congo (0,1% v/v) durante

20 minutos e lavado com NaCl 1,0 M até o aparecimento das bandas, confirmando então

a atividade celulolítica das amostras.

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

E DISCUSSÃO

Capítulo IV. Resultados e Discussão 67


4. Resultados e Discussão

4.1. Caracterização das fibras lignocelulósicas in natura (coco, pedúnculo de caju e

cana-de-açúcar)

As biomassas lignocelulósicas utilizadas no presente estudo foram a fibra da casca

do coco, bagaço da cana-de-açúcar e fibra do pedúnculo caju que são importantes recursos

renováveis. A Tabela 4.1 mostra a composição destes materiais lignocelulósicos in natura

principalmente em termos de celulose, hemiceluloses, lignina, cinzas, extraíveis e

umidade.

Tabela 4.1 - Composição (% de peso seco) das fibras lignocelulósicas in natura.

Fibras Celulose

(%)

Hemicelulose

(%)

Lignina

(%)

Cinzas

(%)

Extraíveis

(%)

Umidade

(%)

Coco 36,23 ± 0,09 23,79 ± 0,31 30,23 ± 0,12 0,86 ± 0,02 8,50 ± 0,04 8,56 ± 0,37

Cana-de-

açúcar 39,25 ± 5,49 25,20 ± 1,13 18,82 ± 0,01 3,52 ± 0,21 9,74 ± 0,21 7,52 ± 0,01

Pedúnculo

de caju 21,02 ± 0,31 11,50 ± 1,13 45,84 ± 1,28 9,50 ± 0,30 10,75 ± 0,86 1,04 ± 0,02

Pode-se observar que, exceto para o teor total de lignina e cinzas, a fibra da casca

de coco e o bagaço de cana-de-açúcar apresentaram valores bastante semelhantes para

celulose, hemicelulose, extraíveis e umidade. Tomando apenas o teor de lignina é

evidenciado o valor mais alto mostrado pela fibra da casca de coco em comparação com

o bagaço de cana-de-açúcar, o primeiro mostrando cerca de 61,0% mais de lignina do que

o último. No entanto, o teor de cinzas no bagaço de cana apresentou-se quatro vezes

superior ao valor apresentado pela fibra da casca de coco. Estes materiais lignocelulósicos

apresentaram teor de celulose superior a 30,0%, indicando assim que podem ser utilizados

para induzir a produção de celulases.

Em relação à fibra do pedúnculo de caju, pode-se observar que um perfil muito

diferente mostrado por esta biomassa em comparação com a casca de coco e o bagaço de

cana-de-açúcar. É notório o maior teor de lignina existente na fibra do pedúnculo de caju

(ROCHA et al., 2011) mostrando valores 2,3 vezes superiores ao bagaço de cana-de-

açúcar. Considerando o teor de cinzas, observou-se um valor superior a onze vezes em

comparação com a fibra da casca de coco. Além disso, o conteúdo de celulose e



hemicelulose é muito inferior ao mostrado pela fibra da casca de coco e pelo bagaço de

cana-de-açúcar, por exemplo, o teor de celulose na fibra do pedúnculo de caju é

aproximadamente 58,8% da existente na fibra da casca de coco.

Os valores obtidos para a caracterização dos resíduos lignocelulósicos não

tratados estão de acordo com a literatura (BRÍGIDA et al., 2010), por exemplo

considerando a fibra da casca de coco GONÇALVES et al. (2014) relataram os valores

de 31,60 ± 0,51, 26,33 ± 0,89, 25,02 ± 0,78, 1,67 ± 0,19, 5,44 ± 0,24, 4,34 ± 0,20 para

celulose, hemicelulose, lignina insolúvel, lignina solúvel, extraíveis e cinzas,

respectivamente. Para o bagaço de cana-de-açúcar GUILHERME et al. (2015)

encontraram os valores de 38,59 ± 3,45, 27,89 ± 2,68, 17,79 ± 0,62, 1,61 ± 0,16, 1,11 ±

1,23, 8,80 ± 0,02 para celulose, hemicelulose, lignina total, extraível orgânico, extraíveis

em água quente e cinzas, respectivamente. Considerando o pedúnculo de caju, os

resultados do presente estudo estão de acordo com os resultados mostrados por ROCHA

et al. (2014) que relataram valores para a composição em peso como 20,9 ± 2,0%, 16,3 ±

3,0% e 33,6 ± 5,3%, para celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente, bem como

com os apresentados por RODRIGUES et al. (2016) que apresentaram valores de 20,91

± 2,00, 16,33 ± 3,00, 35,78 ± 0,10, 5,64 ± 0,10, 0,88 ± 0,10 para glucano, xilano, lignina,

extrativos e cinzas, respectivamente.

4.1.2. Análise morfológica das fibras in natura e da fibra de cana-de-açúcar após

fermentação

Para observar a estrutura morfológica, principalmente em relação aos aspectos das

superfícies das fibras lignocelulósicas, explorou-se a microscopia eletrônica de varredura

(MEV). A Figura 4.1 mostra as micrografias para os três resíduos lignocelulósicos não

tratados utilizados, bem como para o bagaço de cana-de-açúcar após a fermentação por

Aspergillus fumigatus usando FES. Na Fig. 4.1 (A-C) é descrita a característica

morfológica da fibra do coco não tratada. Pode-se observar que as partículas das fibras

não tratadas apresentaram uma forma áspera e rugosa em comparação com a forma de

agulha mostrada pela fibra do pedúnculo de caju (Fig. 4.1, D-F). A Fig. 4.1 (G-I) mostra

que para o bagaço da cana-de-açúcar tem-se características heterogêneas e regulares,

enquanto que para o bagaço de cana-de-açúcar após fermentação, Fig. 4.1 (J-L), é notório



o efeito da fermentação na estrutura da fibra, levando a um material mais fragmentado

devido ao crescimento e produção de enzimas pelo fungo.

Figura 4.1 - Micrografias MEV para fibra de coco não tratada (A) 40x, (B) 100x (C)

200x; fibra de pedúnculo de caju não tratada (D) 40x, (E) 100x, (F) 200x; bagaço de de

cana-de-açúcar não tratado (G) 40x, (H) 100 x, (I) 200x; bagaço de cana-de-açúcar após

fermentação (J) 40x, (K) 100x, (L) 200x.



4.1.3. Análise da cristalinidade das fibras in natura e do bagaço de cana-de-açúcar

após fermentação

A macromolécula da celulose é o componente que confere a propriedade

mensurável de cristalinidade às fibras lignocelulósicas, quando se utiliza a técnica por

difração de raios-X (DRX). Podendo-se, assim, distinguir as formas polimórficas da

celulose (região cristalina e amorfa). Em se tratando dos resíduos avaliados as análises de

DRX mostraram se tratar da celulose do tipo I. Nesse caso, pela análise de DRX sabe-se

que o plano de reflexão 002 está relacionado à rede de anéis glicosídicos que são mais

característicos e mais densos para celulose tipo I (KLEMM et al., 2005). Além disso, as

características de picos dos planos cristalinos (002) do material lignocelulósico, como os

utilizados no presente estudo, dão uma reflexão mais intensa, isto é, são mais intensas a

22,5°. Essas características são observadas nos difratogramas mostrados na Figura 4.2.

Figura 4.2 - Difractogramas para as fibras lignocelulósicas in natura e o bagaço de cana-

de-açúcar fermentada: (a) fibra do pedúnculo de caju (b) fibra da casca de coco, (c) bagaço

de cana-de-açúcar, (d) bagaço de cana-de-açúcar após fermentação.



Destaca-se que a razão entre essas intensidades pode ser uma medida relativa do

índice de cristalinidade (IC%) como detalhado na seção de material e métodos na Eq. 3.5.

A Tabela 4.2 apresenta os resultados do cálculo para os IC% para cada material.

Tabela 4.2 - Índice de cristalinidade das fibras lignocelulósicas in natura e do bagaço

da cana-de-açúcar após fermentação.

Fibras IC%

Fibra do pedúnculo de caju 16,30

Fibra do coco 25,67

Bagaço de cana-de-açúcar 44,56

Bagaço de cana-de-açúcar após

fermentação 46,78

Conforme apresentado na Tabela 4.2 pode-se observar que IC% é influenciado

pela composição da biomassa. Além disso, o conteúdo de celulose desempenha um papel

fundamental, uma vez que as hemiceluloses e a lignina são amorfas (XU et al., 2007) e a

celulose também possui uma região amorfa. Portanto, quanto maior o teor de celulose,

maior será o IC%, como observado o teor de celulose para a fibra da cana-de-açúcar foi

de 39,25 ± 0,31. Por exemplo, pode-se observar que o IC% mais baixo foi alcançado para

a fibra do pedúnculo de caju in natura. A fibra da casca de coco mostrou um índice de

cristalinidade de 25,67%, o que reflete o maior teor de celulose.

O aumento em IC% para o bagaço de cana-de-açúcar após fermentação pode ser

devido à presença de xilanases e lacases excretadas pelos Aspergillus fumigatus durante

o processo FSS que foi capaz de hidrolisar a hemicelulose e lignina, respectivamente. De

fato, o IC% pode influenciar significativamente o crescimento do fungo, uma vez que um

maior IC% é mais difícil para o ataque de fungos devido à organização mais cristalina da

celulose remanescente.

4.1.4. Análises do FTIR das fibras in natura e do bagaço de cana-de-açúcar após

fermentação

Os dados estruturais sobre os grupos funcionais presentes nas fibras vegetais

podem ser derivadas a partir da aplicação da espectroscopia de infravermelho. No entanto,

os espectros resultantes das fibras in natura e da fibra da cana-de-açúcar fermentada



apresentaram bandas espectrais sobrepostas como observado na Figura 4.3, tornando

difícil assim uma correlação individual de cada banda com um grupo funcional específico.

Contudo os tipos de estruturas químicas e as ligações presentes nas biomassas, como por

exemplo alquenos, ésteres, anéis aromáticos, cetonas e álcoois e seu deslocamento de

absorção característico são responsáveis pelas diferentes regiões espectrais aos

componentes presentes nas fibras (KRISTENSEN et al., 2008). A existência desses

grupos funcionais nas fibras lignocelulósicas é evidenciada pela banda entre 3500 - 3200

cm-1 (OH), 1765-1715 cm-1 (C = O), 1270 cm-1 (COC) e 1050 cm-1 (COH). Portanto, os

picos ocorrendo entre 3500 e 3200 cm-1 foram observados nos espectros de todas as fibras,

uma vez que correspondem aos grupos (-OH) existentes na celulose (CHIRAYIL et al.,

2014; MANDAl e CHAKRABARTY, 2011; MONDRAGON et al., 2014). Os picos

detectados a 2920 cm-1 correspondem aos grupos funcionais C-H a partir da celulose,

hemiceluloses e lignina (De ROSA et al., 2010). Em geral, todos os espectros mostraram

concordância com os relatados em CORRALES et al. (2012).

Figura 4.3 - Espectro de FTIR para as fibras lignocelulósicas in natura e a bagaço de

cana-de-açúcar fermentado. (a) fibra do pedúnculo de caju, (b) fibra do coco, (c) bagaço

de cana-de-açúcar e (d) bagaço de cana-de-açúcar após fermentação.



4.2. Determinação dos valores de umidade relativa em função da atividade de água

(aw) nas fibras lignocelulósicas in natura (Bagaço de cana-de-açúcar, fibra do coco,

fibra do pedúnculo de caju)

Os três resíduos lignocelulósicos foram umidificados com diferentes volumes

(µL) de água destilada, para em seguida, se estimar a atividade de água e a umidade a

qual estavam submetidas. Destaca-se que ao se utilizar a FES, as fibras devem apresentar

níveis de atividade de água e umidade ideais. A adição de água ou do meio nutritivo ao

meio é importante para a obtenção das condições ótimas para o desenvolvimento da FES.

A quantidade de umidade ao substrato é um dos fatores que mais influencia o processo e

varia de acordo com o tipo de substrato.

De acordo com PANDEY (1992), níveis elevados de umidade ocasionam uma

diminuição da porosidade, dificuldade nas trocas gasosas, e aumenta o risco de

contaminação. Por outro lado, baixos níveis de umidade resultam em um crescimento

pobre e dificulta o acesso aos nutrientes. O crescimento de fungos filamentosos é

favorecido por altos valores de atividade de água (aw) presente no meio, favorecendo a

germinação dos esporos e o crescimento do micélio, por outro lado valores baixos de aw

são ideais para a esporulação (NISHIO et al., 1979).

As Tabelas 4.3; 4.4; e 4.5 apresentam os valores de umidade em função da

atividade de água dos resíduos (Bagaço de cana-de-açúcar, fibra de coco e fibra do

pedúnculo de caju) utilizados no presente estudo. Os fungos deixam de se desenvolver

quando a aw é inferior a 0,6. E se desenvolvem com valores de aw de 0,9, com

crescimento ótimo em valores de aw superior a 0,96 (RAIMBAULT, 1998).

Tabela 4.3 - Umidade em função da atividade de água para o bagaço de cana-de-açúcar

in natura.

Umidade (%) aw

7,39 0,437

10 0,531

20 0,846

30 0,9

40 0,959

50 0,973

60 0,974

70 1,000

80 1,000

90 1,000



Tabela 4.4 - Umidade em função da atividade de água para a fibra do pedúnculo de caju

in natura.

Umidade (%) aw

5,36 0,532

20 0,777

40 0,917

50 0,967

60 0,981

65 0,986

70 0,992

80 1,000

90 1,000

Tabela 4.5 - Umidade em função da atividade de água para a fibra de coco in natura.

Umidade (%) aw

9,24 0,448

20 0,544

30 0,563

40 0,845

50 0,957

60 0,969

66 0,987

70 0,991

75 0,997

80 1,000

No presente estudo para a produção de celulases usando o Aspergillus fumigatus

em FES, utilizaram-se três Planejamentos compostos centrais rotacionais, um para cada

resíduo, assim um dos fatores do planejamento foi o teor de umidade. Dessa forma,

tinham-se os níveis de umidade inicial para o bagaço de cana-de-açúcar de 40%, 50% e

60% com atividade de água de 0,959; 0,973 e 0,974. Para o pedúnculo de caju os teores

de umidade foram de 60%, 65% e 70%, e com valores de atividade água de 0,981; 0,986

e 0,992. Com relação à fibra de coco utilizaram-se valores de umidade de 70%, 75% e

80%, os teores de atividade de água foram de 0,991; 0,997 e 1,000.

De acordo com os tipos de substratos celulósicos utilizados na FES é permitdo

trabalhar com teores de umidade elevados (60 a 80%) sem a presença de água livre

(SOCCOL, 1992).



4.3. Produção de enzimas celulolíticas (CMCase e FPase) por fungo Aspergillus

fumigatus usando FES e os resíduos lignocelulósicos bagaço de cana-de-açúcar, fibra

de coco e fibra do pedúnculo de caju como substrato

No presente estudo foi investigado, por meio de três Planejamentos compostos

centrais rotacionais (PCCR) 22, o efeito do teor de umidade e do pH na produção das

enzimas celulolíticas (CMCase e FPase) e proteína total produzida ao se utilizar o

Aspergillus fumigatus e a FES usando-se como substrato os três resíduos, ou seja, a fibra

do coco, a fibra do pedúnculo de caju e o bagaço de cana-de-açúcar.

As Tabelas 4.6 - 4.8 mostram os resultados dos PCCRs obtido para o bagaço de

cana-de-açúcar, para a fibra de coco e a fibra do pedúnculo de caju, respectivamente.

Pode-se observar todos os extratos mostraram atividades CMCase e FPase, indicando que

os teores de celulose nos resíduos estudados foram adequados para a indução das

celulases.

Conforme ilustrado na Tabela 4.6, quando o bagaço de cana-de-açúcar in natura

foi utilizado, a condição no ponto central, isto é, a 50% de umidade e pH 4,5 foi a mais

favorável para a produção das celulases, em termos de atividades CMase e FPase. Neste

caso, obteve-se um valor médio de 4,18 U/g e 0,62 U/g para CMCase e FPase,

respectivamente. A concentração de proteína total foi, em média, de 0,28 mg/mL nessa

condição.

Tabela 4.6 - Resultado do PCCR utilizando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato

para investigar a influência da umidade (X1) e pH (X2) na produção das enzimas CMCase,


Ensaios X1 X2 CMCase (UI/g) FPase (UI/g) Proteína Total (mg/mL)

1 (-1) (-1) 1,27 ± 0,03 0,18 ± 0,00 0,26 ± 0,01

2 (+1) (-1) 3,62 ± 0,01 0,52 ± 0,00 0,32 ± 0,01

3 (-1) (+1) 1,23 ± 0,03 0,47 ± 0,02 0,28 ± 0,01

4 (+1) (+1) 3,48 ± 0,01 0,60 ± 0,00 0,31 ± 0,01

5* 0 0 4,16 ± 0,01 0,62 ± 0,04 0,28 ± 0,00

6* 0 0 4,18 ± 0,01 0,64 ± 0,03 0,28 ± 0,01

7* 0 0 4,20 ± 0,01 0,61 ± 0,04 0,27 ± 0,01

8 (-α) 0 3,47 ± 0,00 0,27 ± 0,01 0,18 ± 0,00

9 (+α) 0 3,28 ± 0,02 0,29 ± 0,01 0,32 ± 0,01

10 0 (-α) 3,72 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,22 ± 0,00

11 0 (+α) 3,65 ± 0,00 0,07 ± 0,01 0,30 ± 0,01

*Pontos centrais



Tabela 4.7 - Resultado do PCCR utilizando a fibra do coco como substrato para investigar

a influência da umidade (X1) e pH (X2) na produção das enzimas CMCase, FPase e

proteína total durante FES usando Aspergillus fumigatus.


1 (-1) (-1) 0,74 ± 0,00 0,05 ± 0,01 0,28 ± 0,00

2 (+1) (-1) 0,65 ± 0,00 0,11 ± 0,02 0,29 ± 0,00

3 (-1) (+1) 0,47 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,30 ± 0,00

4 (+1) (+1) 0,12 ± 0,03 0,09 ± 0,01 0,29 ± 0,01

5* 0 0 0,50 ± 0,01 0,28 ± 0,01 0,31 ± 0,00

6* 0 0 0,47 ± 0,00 0,22 ± 0,03 0,31 ± 0,01

7* 0 0 0,48 ± 0,01 0,23 ± 0,00 0,31 ± 0,02

8 (-α) 0 2,47 ± 0,01 0,19 ± 0,01 0,18 ± 0,01

9 (+α) 0 4,07 ± 0,01 0,15 ± 0,02 0,28 ± 0,00

10 0 (-α) 1,29 ± 0,01 0,25 ± 0,00 0,22 ± 0,02

11 0 (+α) 2,68 ± 0,01 0,12 ± 0,00 0,29 ± 0,00

*Pontos centrais

Tabela 4.8 - Resultado do PCCR utilizando o pedúnculo de caju como substrato para

investigar a influência da umidade (X1) e pH (X2) na produção das enzimas CMCase,



1 (-1) (-1) 0,06 ± 0,01 0,32 ± 0,00 0,16 ± 0,01

2 (+1) (-1) 0,11 ± 0,01 0,23 ± 0,01 0,12 ± 0,00

3 (-1) (+1) 1,30 ± 0,00 0,11 ± 0,00 0,15 ± 0,01

4 (+1) (+1) 0,44 ± 0,01 0,26 ± 0,00 0,15 ± 0,00

5* 0 0 0,38 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,18 ± 0,01

6* 0 0 0,39 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,16 ± 0,00

7* 0 0 0,33 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,17 ± 0,01

8 (-α) 0 0,99 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,00 ± 0,00

9 (+α) 0 0,56 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,02 ± 0,00

10 0 (-α) 0,56 ± 0,00 0,10 ± 0,01 0,03 ± 0,00

11 0 (+α) 0,64 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,00 ± 0,00

*Pontos centrais

Conforme ilustrado nas tabelas anteriores, as maiores atividades de CMCase e

FPase foram obtidas ao se utilizar o bagaço de cana-de-açúcar in natura como substrato

para a FES, sendo que a fibra de coco apresentou-se melhor que o pedúnculo de caju.

Assim, fica evidenciado a influencia do teor de lignina na FES (ver Tabela 4.1), ou seja,

o bagaço de cana-de-açúcar mostrou-se como o melhor indutor por possuir a concentração

de celulose e, principalmente, por apresentar o menor teor de lignina pois sabe-se que

essa age protegendo a biomassa, ou seja, dificultando o acesso à celulose. Assim, para a

produção de NCC usando celulases produzidas pelo fungo filamentoso Aspergillus



fumigatus por FES o bagaço de cana-de-açúcar in natura foi o resíduo lignocelulósico

escolhido.

A Figura 4.4 ilustra os diagramas de Pareto para o planejamento composto central

rotacional (PCCR) tendo como substrato o bagaço de cana-de-açúcar. Pode-se observar,

com um nível de significância de 95%, que o teor de umidade e pH, bem como suas

combinações (linear e quadrática) são importantes durante a produção de celulases

(CMCase e FPase), bem como proteína total durante FES usando Aspergillus fumigatus

e bagaço de cana-de-açúcar como substrato.

A Figura 4.5 ilustra a superfície de resposta para o PCCR usando o resíduo bagaço

de cana-de-açúcar como substrato e o fungo filamentoso Aspergillus fumigatus durante a

FES.

Figura 4.4 - Diagrama de Pareto dos efeitos principais e interações umidade (X1) e pH

(X2) nas respostas referente as enzimas CMCase (A), FPase (B) e Proteínas Totais (C)

quando utilizou-se o bagaço de cana-de-açúcar como substrato para FES.

Figura 4.5 - Superfície de resposta para CMCase (A), FPase (B) e Proteínas Totais (C)

em função dos fatores umidade (X1) e pH (X2) ao se utilizar o bagaço de cana-de-açúcar

como substrato para FES.



A Figura 4.5 confirma o ponto central é a região de máxima atividades para

CMCases e FPases. Assim, o uso de 50% de umidade e pH 4,5 foi a condição escolhida

para produzir as celulases por FES usando Aspergillus fumigatus após 120 h. Neste caso,

obtendo-se, em média, 4,18 UI/g e 0,62 UI/g para CMCase e FPase, respectivamente.

Com base na ANOVA, foram obtidos os seguintes modelos (Eq. 4.1 – 4.3) para as três

respostas, CMCase, FPase e proteína total, respectivamente:

2 2

1 1 2 2 1 24.180 0.541 0.685 0.035 0.530 0.025CMCase X X X X X X R2=0.61 (4.1)

2 21 1 2 2 1 20.623 0.063 0.104 0.048 0.212 0.053FPase X X X X X X R2=0.71 (4.2)

2 21 1 2 2 1 20.277 0.036 0.004 0.015 0.001 0.008Proteína total X X X X X X R2=0.58 (4.3)

Os resultados mostrados para a atividade enzimática (CMCase e FPase) e proteína

total foram dependentes do pH e da umidade, bem como seus efeitos de combinação, com

nível de confiança de 95% (Figura 4.4). Pode-se observar que o modelo de FPase

apresentou o maior coeficiente de determinação (R2) em comparação com CMCase e

proteína total.

RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA (2010) obtiveram atividade da CMCase de 5 UI/g no

bagaço de cana-de-açúcar quando foi pré-tratado por explosão a vapor utilizando A. niger

em 72 h de FES a 32 ºC. Esse valor está próximo ao valor encontrado no presente trabalho

que foi de 4,18 UI/g com fungo A. fumigatus utilizando bagaço de cana-de-açúcar in

natura. Destacando-se que o resíduo utilizado no presente trabalho não foi pré-tratado.

4.4. Efeito da temperatura e do pH na estabilidade das celulases

No presente estudo a estabilidade das celulases (CMCase e Fpase) produzidas por

A. fumigatus usando FES foi avaliada frente a mudanças de temperatura e pH. Nesse caso,

utilizou-se o bagaço de cana-de-açúcar como substrato avaliando-se a atividade residual

após 1 hora de incubação do extrato na condição avaliada. A Figura 4.6 mostra a atividade

relativa tanto para CMCase quanto para FPase em função das temperaturas investigadas,

mantendo-se o extrato celulolítico em pH 4,8. Pode-se observar que a atividade de

CMCase foi mais termoestável que a FPase. Por exemplo, a atividade relativa para

CMCase atingiu 72% a 60 ºC, enquanto nesta temperatura a atividade relativa para a

FPase foi menor que 10%. De fato, para a FPase a máxima estabilidade relativa foi obtida



a 50 ºC atingindo um valor de apenas 33%. O aumento de temperatura para valores

superiores a 60 ºC reduziu consideravelmente a atividade relativa para ambas as enzimas

(CAMASSOLA et al., 2004; JAGER et al., 2001; KIM et al., 2009). Destaca-se que esse

comportamento é típico das hidrolases produzidas por microrganismos mesófilos. Por

exemplo, GRIGOREVSKI-LIMA et al. (2009) relataram uma atividade máxima de

CMCase obtida a 65 ºC usando A. fumigatus que é muito próxima ao apresentado no

presente trabalho.

Figura 4.6 – Efeito da temperatura nas atividades das enzimas endoglucanases (CMCase)

e celulases totais (FPase) produzidas por A. fumigatus usando o bagaço da cana-de-açúcar

in natura como substrato para a FES.

A Figura 4.7 mostra a atividade relativa tanto para CMCase quanto para FPase em

relação à diversos pHs, mantendo-se o extrato celulolítico com a temperatura de 50 ºC.

Pode-se observar que a atividade de CMCase foi mais estável no pH 2,0, com

aproximadamente 61% de atividade relativa. Nessa condição, a FPase manteve a sua

atividade em torno de 33%. GRIGOROVSKY-LIMA et al. (2009) também relataram a

maior atividade de CMCase a pH 2,0 para o A. fumigatus. Destaca-se que no presente

estudo, a atividade FPase manteve-se em 13% da atividade máxima a pH 4,0. KANG et

al. (2004) reportaram um valor máximo de atividade de FPase a pH 7,0 quando o fungo

A. niger KK2 foi usado como produtor de celulase. Conforme já comentado, no presente

estudo, as CMCases produzidas por A. fumigatus apresentaram melhor estabilidade

comparadas a FPase. Portanto, o uso da FES para a produção de celulases mostra-se como



uma alternativa interessante, principalmente por minimizar o consumo de energia devido

à eliminação de pré-tratamento da biomassa.

Figura 4.7 – Efeito do pH nas atividades das enzimas endoglucanases (CMCase) e

celulases totais (FPase) na temperatura de 50 °C, produzidas por A. fumigatus usando o

bagaço da cana-de-açúcar in natura como substrato para a FES.

4.5. Caracterização do bagaço de cana-de-açúcar após pré-tratamentos com NaOH

e Ca(OH)2 visando a produção de nanocristais de celulose (NCC)

Nesta seção apresenta-se os resultados obtidos ao se utilizar os dois pré-

tratamentos, com NaOH e Ca(OH)2, no bagaço de cana-de-açúcar. O material foi

caracterizado para escolher o pré-tratamento da biomassa a ser submetido à hidrólise

enzimática visando a produção dos NCCs. Destaca-se que a hidrólise foi realizada

usando-se uma enzima comercial obtida a partir do fungo Trichoderma ressei (ATCC

26921) e o extrato enzimático celulolítico bruto obtido da melhor condição, conforme

apresentado no item 4.3.

O bagaço de cana-de-açúcar é constituído principalmente por celulose,

hemicelulose e a lignina. A lignina é um dos materiais mais recalcitrantes na natureza e,

com isso, dificulta o acesso das enzimas aos carboidratos, diminuindo a eficiência da

hidrólise da celulose e nos processos fermentativos (CLARCK et al., 1989). Desta forma,



foram realizados vários pré-tratamentos na fibra da cana-de-açúcar para alterar a estrutura

da fibra do resíduo, e com isso se estimar o melhor pré-tratamento, para efetuar a hidrólise

enzimática visando à produção de NCCs.

A Tabela 4.9 ilustra a composição do bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-

tratados em termos de celulose, hemiceluloses, lignina, cinzas, extraíveis e umidade.

Observou-se que para os teores de celulose, os bagaços tratados apresentaram valores

maiores do que o bagaço de cana sem tratamento, ou seja, os pré-tratamentos aumentaram

a composição de celulose, em termos relativos. O material pré-tratado com NaOH foi o

que apresentou maior teor de celulose (56,63%) e uma considerável redução no teor de

lignina, alçando 9,92%. Destaca-se que o pré-tratamento usando o Ca(OH)2 na

concentração de 20%, aumentou o teor de celulose para 49,80% e foi que melhor reduziu

o teor de lignina, atingindo 6,80. O uso de soluções alcalinas favorece preferencialmente

à remoção de lignina e, também, induz a uma redução de hemiceluloses como evidenciado

na Tabela 4.9. Assim, esses álcalis provocam modificações na composição química das

fibras, promovendo a remoções das frações de lignina e de hemicelulose, ocasionando

um aumento no teor de celulose nas fibras do bagaço de cana-de-açúcar (CARASCHI,

1997; TITA et al., 2002).

Tabela 4.9: Composição do bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratados.

Pré-tratamento Celulose

(%)

Hemicelulose

(%)

Lignina

(%)

Cinzas

(%)

Umidade

(%)

Extraíveis

(%)

In natura 35,71 ± 4,20 27,09 ± 2,92 19,74 ± 0,05 2,65 ± 0,45 5,95 ± 0,04 7,44 ± 0,06

Ca(OH)2 [5%] 37,91 ± 2,00 26,94 ± 0,23 19,61 ± 0,25 2,47 ± 0,15 6,01 ± 0,12 2,94 ± 0,53

Ca(OH)2 [10%] 47,54 ± 2,08 26,32 ± 0,90 10,92 ± 0,54 3,15 ± 0,02 6,93 ± 0,31 2,50 ± 0,43

Ca(OH)2 [20%] 49,80 ± 0,40 22,86 ± 0,68 6,80 ± 0,87 2,38 ± 1,01 5,68 ± 0,32 2,71 ± 0,22

NaOH [4%] 56,63 ± 0,10 19,23 ± 1,69 9,92 ± 1,19 2,18 ± 0,92 7,40 ± 0,14 1,34 ± 0,49

A diminuição do teor de lignina observada nos pré-tratamentos alcalinos

utilizando o Ca(OH)2, em diversas concentrações, bem como o NaOH, é explicada pela

fragmentação das ligações éster e éter do complexo lignina-carboidrato que ocasionam a

solubilização dos fragmentos de lignina de baixa massa molar (FENGEL e WEGENER,

1989). Os fragmentos de lignina se condensam devido à formação de ligações

intermoleculares entre eles, podendo causar a reprecipitação na superfície das fibras

(MCDONOUGH, 1995; SARKANEN et al., 1991).



ROLLIN et al. (2011) comentam sobre a importância do tratamento de

deslignificação tornando a celulose mais exposta ao acesso de enzima celulolíticas na

superfície de celulose. Os resultados apresentados neste trabalho mostraram a redução da

lignina e da hemicelulose, aumentando o acesso da celulose. Para que houvesse uma

melhoria na sacarificação enzimática o teor de celulose foi aumentado após os pré-

tratamentos. Portanto, a escolha do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH

apresentou os melhores resultados e foi o escolhido para a realização das hidrólises

enzimáticas e geração dos nanocristais de celulose.

Observa-se na Tabela 4.9 que para os teores cinzas e extraíveis, exceto para o teor

de cinzas ao se utilizar o Ca(OH)2 na concentração de 10%, em que houve um leve

aumento, menores valores desses componentes foram obtidos ao se utilizar os pré-

tratamentos alcalinos comparados com a biomassa in natura. Com relação à umidade,

observa-se um leve aumento ao se comparar com a biomassa in natura, exceto para o

material pré-tratado com o Ca(OH)2 na concentração de 20%.

4.5.1. Análise morfológica do bagaço de cana-de-açúcar in natura e após os pré-

tratamentos alcalinos

A fim de se evidenciar as mudanças estruturais e morfológicas ocorridas após os

pré-tratamentos aplicados ao bagaço de cana-de-açúcar, obteve-se via microscopia

eletrônica de varredura (MEV) as micrografias das amostras com aumentos de 100, 150

e 200 vezes, conforme apresentadas na Figura 4.8. O bagaço de fibra de cana-de-açúcar

não tratado (Fig. 4.8. A, B e C) apresentou uma estrutura rígida com superfície lisa,

microfibrilas intactas, sem a desfibrilação das fibras, com aspecto fibroso e medular.



Figura 4.8 – Imagens da Microscopia Eletrônica de Varredura para o bagaço de cana-de-

açúcar não tratado (A) 100x, (B) 150x, (C) 200x; bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

com Ca(OH)2 [5%] (D) 100x, (E) 150x, (F) 200x, bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

com Ca(OH)2 [10%] (G) 100x, (H) 150x, (I) 200x, bagaço a de cana-de-açúcar pré-tratado

com Ca(OH)2 [20%] (J) 100x, (K) 150x, (L) 200x, bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

com NaOH [4%] (M) 100x, (N) 150x, (O) 200x.



A superfície do bagaço da cana-de pré-tratado com Ca(OH)2 (Fig. 4.8. D – L)

ilustra a capacidade do uso dessa base em diferentes concentrações (5, 10 e 20%) na

remoção parcial da lignina e da hemicelulose. Conforme relatado por TRIANA et al.

(1990), o pré-tratamento com Ca(OH)2 apresenta a capacidade em revelar partes internas

de tecido vascular distorcido, presença de fragmentos vegetais desprendidos e a presença

de poros na estrutura das fibras após os pré-tratamentos.

Conforme Fig.4.8. (M – O) para o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar

com NaOH observou-se uma desorganização dos feixes das fibras do bagaço. Uma

hipótese para explicar esse comportamento, baseia-se na maior solubilização lignina

durante esse pré-tratamento. Essas fibras formam a medula do bagaço, constituídas por

células do parênquima e com a presença de regiões amorfas e/ou de baixa cristalinidade

da celulose (ROCHA et al. 2011).



4.5.2. Análise da cristalinidade do bagaço de cana-de-açúcar in natura e do bagaço

de cana-de-açúcar após os pré-tratamentos alcalinos

A técnica de DRX foi usada objetivando avaliar a estrutura cristalina do bagaço

da cana-de-açúcar pré-tratado com soluções alcalinas Ca(OH)2 e NaOH e não tratado e os

difratogramas são mostados na Figura 4.9.

Figura 4.9 - Difratogramas dos bagaços. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com

NaOH [4%] (a); Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [20%] (b); Bagaço

de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [10%] (c); Bagaço de cana-de-açúcar pré-

tratado com Ca(OH)2 – [5%] (d) e Bagaço de cana-de-açúcar in natura (e).

A Tabela 4.10 apresenta os resultados do IC% para o bagaço de cana-de-açúcar in

natura e após os pré-tratamentos aplicados. Pode-se observar que o material pré-tratado

com Ca(OH)2 na concentração de 5% foi que apresentou o menor valor de IC% (46,67%),

não considerando o resíduo in natura. O bagaço pré-tratado com o NaOH foi o que

apresentou o maior valor de IC% (52,99%). Este pré-tratamento aplicado ocasionou um

aumento na concentração da celulose cristalina após solubilização dos componentes

amorfos (hemicelulose e lignina) do material.



Tabela 4.10 - Índice de cristalinidade do bagaço de cana-de-açúcar in natura e dos

bagaços de cana-de-açúcar pré-tratados.

Bagaços IC%

Bagaço de cana-de-açúcar in natura 44,86

Bagaço de cana-de-açúcar com Ca(OH)2 – [5%] 46,67

Bagaço de cana-de-açúcar com Ca(OH)2 - [10%] 48,99

Bagaço de cana-de-açúcar com Ca(OH)2 – [20%] 50,78

Bagaço de cana-de-açúcar com NaOH - [4%] 52,99

O uso de pré-tratamentos alcalinos ocasiona a solubilização da lignina. Muitas

vezes estes são combinados com os pré-tratamentos ácidos, que são responsáveis pela

clivagem hidrolítica das ligações glicosídicas presentes na celulose promovendo a

remoção da hemicelulose originando, assim, a celulose cristalina (ALVIRA et al., 2010;

CAO e TAN, 2002; ZHAO et al., 2008).

4.5.3. Análise do FTIR do bagaço de cana-de-açúcar in natura e do bagaço de cana-

de-açúcar após os pré-tratamentos alcalinos

A análise por FTIR foi utilizada para avaliar a estrutura química do bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratadoa com soluções alcalinas Ca(OH)2 e NaOH e não tratada

conforme é mostado na Figura 4.10.

Figura 4.10 – Espectro de FTIR para as fibras: Bagaço de cana-de-açúcar in natura (a);

Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [5%] (b); Bagaço de cana-de-

açúcar pré-tratado com Ca(OH)2 – [10%] (c); Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com

Ca(OH)2 – [20%] (d) e Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH [4%] (e).



Conforme Fig. 4.10, observa-se que os espectros do bagaço de cana-de-açúcar in

natura quando comparados com os que utilizaram pré-tratamentos apresentou mudanças

significativas. As bandas de absorção a 3330 cm-1 (ligeiramente deslocadas para 3420

cm) e 2905 cm-1 que representam o grupo hidroxila (-OH) (KUMAR et al., 2011) e

alongamento -CH (Oh et al., 2005), respectivamente, estão presentes praticamente apenas

nos espectros para o bagaço de cana-de-açúcar in natura.

A celulose presente na fibra lignocelulósica é caracterizada pelos picos a 1425 cm-

1 e 897 cm-1 (KUO e LEE, 2009). A intensidade banda de 1425 cm-1 que representa o

movimento do grupamento -CH2 na celulose cristalina. Se uma alta porcentagem de

celulose amorfa está presente no substrato lignocelulósico evidencia-se a faixa de 897

cm-1 que caracteriza o alongamento de C-O-C (KUO e LEE, 2009).

A hemicelulose representada pela banda a 1732 cm-1 descreve o comportamento

de estiramento em grupos -CO (ZHAO et al., 2009). A lignina pode ser caracterizada

através dos picos a 1600 cm-1 (deslocados para 1645 cm-1 quando aplicados os pré-

tratamento alcalinos) e 1515 cm-1 (ADEL et al., 2010). Essas análises corraboram com os

resultados das análises físico-químicas mostrando que os pré-tratamentos alcaninos

removem a lignina, hemicelulose e também celulose, essa útlima porém em menor

intesidade.

4.6. Avaliação da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar in natura e após

pré-tratamento com NaOH (4%) na conversão de celulose em glicose

Os bagaços de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado com NaOH (4,0%) foram

submetidos aos ensaios de hidrólise enzimática com o objetivo de se avaliar a efetividade

real do extrato bruto celulolítico produzido por Aspergillus fumigatus, nas condições

encontradas na seção 4.3 deste trabalho, e um extrato comercial de Trichoderma reesi

(Celluase from Trichoderma ressei ATCC 26921) em converter celulose em glicose. A

seleção do bagaço pré-tratado com NaOH como substrato para a hidrólise enzimática foi

baseada nos resultados obtidos da caracterização, e o bagaço in natura foi usado como

controle.

A Figura 4.11 (A e B) mostra o perfil de açúcares redutores totais (ART) em

função do tempo de hidrólise, para o bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado

com NaOH (4,0%), respectivamente.



Figura 4.11 - Concentração de açúcares redutores (ART) produzidos na hidrólise

enzimática utilizando o bagaço de cana-de-açúcar in natura (A) e pré-tratado com NaOH

(4,0%) (B) usando os extratos comercial e não comercial. Carga enzimática: 7,5 FPU/g

de bagaço.

Conforme observado na Figura 4.11-A, em se tratando do bagaço de cana-de-

açúcar in natura, observa-se que a aplicação do extrato bruto apresentou desempenho

satisfatório chegando mesmo a apresentar taxa inicial de hidrólise maior que o comercial

(até 24h). Nesse caso, valores de ART próximos a 1,1 mg/mL foram obtidos para os dois

extratos após 96 h de hidrólise. Destaca-se que o extrato bruto não foi purificado, nem

teve sua composição otimizada.

Com relação ao bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH (4,0%), o valor

máximo encontrado para o ART quando se aplicou extrato bruto na hidrólise enzimática

utilizando o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado foi de 6,30 mg/mL em 96 horas, como

representado na Fig. 4.11-B. GOTTSCHALK et al. (2010) quantificaram a glicose

resultante da hidrólise enzimática utilizando complexos celulolíticos, os valores obtidos

foram de 3,0 mg/mL atingidas com a carga enzimática (10 FPU/g) usando extrato

produzido pelo A. awamori. Observa-se na Figura 4.11-B que ao se considerar o pré-

tratamento, o extrato comercial apresenta resultados bem melhores, atingindo

concentração máxima (11,59 mg/mL) de ART quase o dobro do obtido pelo extrato bruto

produzido pelo A. fumigatus (6,30 mg/mL), após 96 h de hidrólise.

A Figura 4.12 (A e B) mostra o perfil de conversão de celulose em ART em função

do tempo de hidrólise, para o bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado com

NaOH (4,0%), respectivamente.



Figura 4.12 – Conversão de celulose em açúcares redutores (ART) produzidos na

hidrólise enzimática utilizando o bagaço de cana-de-açúcar in natura (A) e pré-tratado

com NaOH (4,0%) (B) usando os extratos comercial e não comercial. Carga enzimática:

7,5 FPU/g de bagaço.

Conforme mostrado na Figura 4.12-A, considerando o bagaço de cana-de-açúcar

não tratado, observa-se, como esperado, uma menor conversão atingida após 96 h,

alcançando valores de 28,53% e 23,43% com as cargas enzimáticas de 7,5 FPU/g para o

extrato comercial e o extrato de celulases bruto (produzido neste trabalho),

respectivamente. O rendimento baixo para ambos os extratos pode estar relacionado com

a presença da lignina e da hemicelulose que dificultam o acesso das enzimas à celulose

na hidrólise da celulose.

A conversão atingida após 96 h de hidrólise, quando se utilizou o bagaço de cana-

de-açúcar pré-tratado com NaOH (4,0%), foi de 83,73% e 18,00% com as cargas

enzimáticas de 7,5 FPU/g do extrato comercial e do extrato bruto, respectivamente.

Assim, evidencia-se a importância do pré-tratamento. Destaca-se que mesmo após o pré-

tratamento o rendimento baixo para o extrato enzimático bruto (Fig. 4.12-B) pode estar

relacionado com a influência do pré-tratamento uma vez que o mesmo favoreceu a

redução da lignina e hemicelulose. A presença de enzimas acessórias no extrato

celulolítico bruto é uma hipótese para a diferença observada na conversão de celulose

quando utilizou-se o bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado, o extrato não foi

purificado e a presença de outras enzimas além das celulases poderiam estar relacionadas

com a hidrólise dos outros componentes estruturais da fibra.



4.7. Produção de NCC

A partir de uma hidrólise enzimática utilizando o bagaço da cana-de-açúcar in

natura e pré-tratado buscou-se produzir NCC, usando-se apenas o extrato enzimático

bruto produzido pelo Aspergillus fumigatus na melhor condição observada no Item 4.3.

O uso da microscopia de força atômica (MFA) permitiu a observação física exata

dessas nanoestruturas. À medida que ocorreu a varredura na frequência de oscilação da

ponta, pode-se observar vales e picos em função da morfologia dos nanocristais de

celulose gerados. A estrutura física dos NCCs é apresentada nas Figuras 4.13, 4.14 e 4.15.

Assim, acompanhou-se a produção dos NCCs durante o processo de hidrólise até 96 h,

usando-se o bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado com NaOH (4,0%).

Destacando-se que em todas as situações os NCCs observados por MFA remeteu a uma

pequena esfera, cujas dimensões estão na escala nanométrica (IBRAHIM et al., 2015).

Para obtenção dos nanocristais existem muitos fatores e técnicas para poder separar as

microfibrilas de celulose, elas estão em contato com a hemiceluloses e lignina formando

uma espécie de uma matriz que protegem a celulose (KHALIL et al., 2014).

A caracterização estrutural da cana-de-açúcar foi importante no sentido de

conhecer o material aplicado nas hidrólises, permitindo melhor compreensão dos

resultados obtidos posteriormente. O teor de lignina e de hemicelulose no bagaço da cana-

de-açúcar in natura não favoreceu a geração de nanocristais de maneira eficiente, pois os

valores de hemicelulose e de lignina foram de 27,09% e 19,74 respectivamente, esses

componentes formam uma espécie de barreira protetora o que dificulta o acesso do extrato

celulolítico à celulose.

A Figura 4.13 mostra os NCCs gerados ao se utilizar o bagaço de cana-de-açúcar

in natura para um tempo de hidrólise de 48 h.



Figura 4.13 – Imagem de Microscopia de Força Atômica (MFA) dos nanocristais gerados

pela hidrólise enzimática. Extrato enzimático bruto produzido com a carga enzimática de

7,5 FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar in natura no tempo de 48 horas de hidrólise

enzimática.

Como observado na Figura 4.13, os tamanhos e as formas dos NCCs apresentam-

se de maneira irregular e bastante heterogêneo. A hidrólise com o bagaço de cana-de-

açúcar in natura ocorreu até o tempo de 96 horas. Entretanto, apenas no tempo de 48

horas foi possível produzir os NCCs.

O teor de lignina e de hemicelulose no bagaço da cana-de-açúcar in natura não

favoreceu a geração de nanocristais de maneira eficiente, pois os valores de hemicelulose

e de lignina foram relativamente altos, de 27,09% e 19,74% respectivamente. Esses

componentes formam uma espécie de barreira protetora o que dificulta o acesso do extrato

celulolítico à celulose. Com o tempo de 24 h não foi possível identificar os NCCs e nos

tempos de 72 h e 96 h de hidrólise a geração de nanocristais não foi significativa,

provavelmente, a presença de hemicelulose e lignina que dificultaram o acesso das

enzimas presentes no extrato para hidrolisar a celulose.

A hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH

(4,0%) foi mais eficiente na geração dos NCCs, conforme mostra a Figura 4.14. A

composição do resíduo pré-tratado facilitou a ação (atividade) das enzimas. Assim, desde

que o teor de lignina foi consideravelmente reduzido houve o favorecimento para a ação

as enzimas do extrato bruto na celulose. Destaca-se que os nanocristais apresentaram

tamanhos uniformes e formatos circulares (com diâmetro médio de 89,26 nanometros).



Figura 4.14 – Imagem de Microscopia de Força Atômica (MFA) dos nanocristais gerados

pela hidrólise enzimática. Extrato enzimático bruto produzido com a carga enzimática de

7,5 FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH (4,0%) no tempo de 48

horas de hidrólise enzimática.

A Figura 4.15 mostra a evolução da formação dos NCCs nos quatro tempos de

hidrólise avaliados. Conforme já comentado, o tempo de hidrólise de 48 horas foi o que

apresentou os melhores nanocristais quanto à forma, distribuição e formato (com

diâmetros médios de 60,77 nanometros). O tempo de 24 h apresentou nanocristais com

tamanhos variados e com diâmetros de 52,43 nanometros. Os tempos de 72 horas e 96

horas mostraram NCCs com formas e tamanhos bastante heterogêneo, no tempo de 72 h

os diâmetros dos nanocristais foram de 26,6 nanometros e em 96 h não foi possível

determinar os diâmetros. Assim, pela MFA foi possível acompanhar o processo de

hidrólise da biomassa, ou seja, pode-se confirmar, além da quantificação por CLAE, a

evolução da produção dos ARTs e da redução da cadeia de celulose devido à ação das

celulases do extrato. Essas enzimas atuam na região cristalina da celulose existente no

bagaço de cana-de-açúcar, aumentando os ARTs e formando os nanocristais.



Figura 4.15 – Evolução dos nanocristais ao longo do tempo de hidrólise. Extrato

enzimático bruto produzido com a carga enzimática de 7,5 FPU/g de bagaço pré-tratado

com NaOH (4,0%). (A) 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h e (D) 96 h.

LU e HSIEH (2010) observaram nanocristais de celulose com morfologia circular

e formato alongado (agulhas). O formato globular pode está relacionado com a remoção

das regiões amorfas e dos domínios cristalinos. As celulases atuam na região amorfa da

celulose, e também no domínio cristalino, uma vez que celobiohidrolases agem nas duas

regiões (CHEN et al., 2012).

A mudança nos formatos conforme é mostrada na Figura 4.15 possivelmente estão

relacionadas à degradação dos domínios cristalinos (SILVA et al., 2009). O tempo de

hidrólise enzimática é umas das variáveis envolvidas no processo de geração dos NCCs,

pois longos tempos de reação podem degradar os domínios cristalinos da celulose,

ocasionando a diminuição no tamanho dos NCCs. No entanto, tempos curtos na hidrólise,

pode não ser suficiente para que o extrato enzimático possa hidrolisar o bagaço, mantendo

assim os domínios amorfos que existem na composição do resíduo.

A obtenção da celulose nanocristalina com formato mais esférico pode estar

relacionado também à presença de celulose com cadeia menores conectadas à ligações de

hidrogênio interfacial (LU e HSIEH, 2010).

4.8. Recuperação e purificação de celulases por SMDFA

Após a produção de celulases pelo fungo filamentoso Aspergillus fumigatus

usando FES e o bagaço de cana-de-açúcar como substrato avaliou-se o uso do SMDFA,

usando o Triton X-114, para recuperar e pufiricar essas enzimas. O extrato enzimático

usado foi aquele obtido na melhor condição do planejamento experimental, conforme

descrito no item 4.3.



4.8.1. Determinação do ponto de nuvem (turvação)

A obtenção da curva de coexistência é etapa essencial ao se utiliza o SMDFA

(NIKAS et al., 1992). A curva de coexistência delimita a fase única da região bifásica no

diagrama. A Figura 4.16 mostra a influência do extrato enzimático na curva de

coexistência para SMDFA usando o Triton X-114.

O ponto de nuvem (turvação) no SMDFA foi determinado pela identificação

visual conforme WATANABE e TANAKA (1978). Pode-se observar que a curva de

coexistência é influenciada pela concentração do extrato enzimático produzido por A.

fumigatus. Portanto, quanto a maior concentração de extrato menor a temperatura crítica

(Tc) para o SMDFA, ou seja, menor a temperatura para forma as duas fases. Além disso,

pode-se observar que a Tc mais baixa ocorreu a 20,4 °C com a concentração Triton X-

114 de 0,5 % (m/m). Sabe-se que uma solução aquosa contendo o surfactante não iónico

Triton X-114 pode sofrer alterações macroscópicas na separação de fases com o aumento

da temperatura, formando assim uma fase rica em micelas (fase inferior) e uma fase pobre

de micela (topo fase) (RAMELMEIER et al., 1991). As micelas podem alterar suas

estruturas, formas e tamanhos alterando a temperatura do sistema, a concentração de

surfactante ou adicionando sal ao sistema (LIU et al., 1996). O aumento da temperatura

provoca a desidratação do grupo de oxietileno responsável pela região de maior

polaridade na cadeia de surfactante, promovendo assim a separação de fases devido à

maior solubilidade da molécula. O ponto de turvação do sistema ocorre devido à

agregação dos monômeros do surfactante, causando assim a separação de fases (QUINA

et al., 1999).



Figura 4.16 –Curva de coexistência para o SMDFA usando o Triton X-114 na presença

do extrato enzimático. O extrato enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES

usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato.

4.8.2. Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no coeficiente


A influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no coeficiente de

partição (K) das celulases (CMCase e FPase) mantendo-se o extrato enzimático em 40%

(m/m) é mostrada nas Tabelas 4.11 e 4.12.

Tabela 4.11 – Coeficientes de partição médio (K) para CMCase obtidos durante o


alternando a temperatura de 35 a 65 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40%.

Concentração do

Triton X-114 (%)

Coeficiente de partição (K)

Temperatura (°C)

35 40 45 50 55 60 65

2 2,60 ± 0,02 1,18 ± 0,00 1,86 ± 0,14 2,65 ± 0,01 2,25 ± 0,04 3,02 ± 0,08 0,00 ± 0,00

4 3,15 ± 0,36 1,14 ± 0,08 2,17 ± 0,17 3,97 ± 0,18 5,92 ± 0,21 4,04 ± 0,04 0,00 ± 0,01

6 2,83 ± 0,23 1,81 ± 0,06 1,44 ± 0,00 4,12 ± 0,09 6,88 ± 0,28 6,41 ± 0,06 0,00 ± 0,02

8 2,12 ± 0,26 1,62 ± 0,07 2,14 ± 0,12 5,25 ± 0,01 7,27 ± 0,39 9,33 ± 0,30 0,00 ± 0,03



Tabela 4.12 - Coeficientes de partição médio (K) para FPase obtidos durante o


alternando a temperatura de 35 a 65 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40%.

Concentração do

Triton X-114 (%)


Temperatura (°C)

35 40 45 50 55 60 65

2 1,63 ± 0,03 1,17 ± 0,17 1,67 ± 0,33 1,01 ± 0,18 2,75 ± 0,25 4,50 ± 1,50 0,00 ± 0,00

4 1,00 ± 0,00 2,00 ± 0,00 1,15 ± 0,01 2,67 ± 0,33 1,01 ± 0,18 4,25 ± 0,75 0,00 ± 0,01

6 1,36 ± 0,14 1,12 ± 0,12 1,35 ± 0,25 1,23 ± 0,32 1,22 ± 0,22 5,00 ± 0,00 0,00 ± 0,02

8 1,50 ± 0,12 2,50 ± 0,50 1,14 ± 0,14 1,88 ± 0,31 1,39 ± 0,01 5,00 ± 0,38 0,00 ± 0,03

Observa-se na Tabela 4.11 que, para a CMCase, ao se utilizar uma concentração

de Triton X-114 de 8% (m/m) a uma temperatura de 60 °C, obteve-se o maior valor para

o coeficiente de partição (K) alcançando 9,33. Um comportamento semelhante foi

mostrado para a FPase (Tabela 4.12) porém apresentando valor de K igual 5,00. Dessa

forma, essas enzimas tendem a se concentrar na fase pobre em micelas.

Observa-se também que na temperatura de 65 °C o valor de K foi nulo, para ambas

as enzimas, independentemente da concentração de Triton X-114 usada. Sabe-se que as

enzimas apresentam uma temperatura ótima para atividade e que temperaturas elevadas

podem desnaturá-las. É evidente que para a temperatura de 65 °C está ocorrendo

desnaturação das enzimas.

As Figuras 4.17 e 4.18 mostram a influência da concentração de Triton X-114 e

da temperatura sobre no Rendimento (R) das celulases (CMCase e FPase) mantendo-se o

extrato enzimático a 40% (m/m).



Figura 4.17 - Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no rendimento

de CMCase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por A. fumigatus por

FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato. O extrato enzimático foi

mantido em 40%.

Figura 4.18 - Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no rendimento

de FPase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES

usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato. O extrato enzimático foi mantido em

40%.



Conforme Figura 4.17, pode-se observar que para a CMCase operando-se o

SMDFA na faixa de temperatura entre a 50 e 60 °C, rendimentos maiores que 85% são

obtidos independemente da concentração de Triton X-114 usada. CRISTINAE e

AZEVEDO (2004) relataram rendimentos superiores a 100% ao se utilizar SMDFA para

recuperar enzimas.

Com relação à FPase (Fig. 4.18), tal comportamento, ou seja, na faixa de 50 e 60

°C os rendimentos acima de 85% foram obtidos ao se utilizar o SMDFA com

concentração de Triton X-114 igual a 8% (m/m). Ainda com relação à FPase, pode-se

observar que quando a concentração de Triton X-114 é aumentada de 2% para 8% (m/m),

o rendimento para passou de 67% a 35 °C para 97,87% a 60 °C, ou seja, um aumento

46,1%. De forma semelhante ao apresentado nas Tabelas 4.11 e 4.12, na temperatura de

65 °C, para ambas CMCase e FPase, a recuperação foi nula.

Destaca-se que, muito embora a obtenção de um valor de K elevado seja

importante, uma vez que a enzima está sendo concentrada na fase pobre em micelas, deve-

se considerar também a presença de contaminantes nesta fase. Portanto, a atividade

específica desempenha um papel fundamental para avaliar se o processo de purificação

da enzima está ocorrendo. Dessa forma, as Figuras 4.19 e 4.20 mostram os fatores de

purificação (FP) para as duas classes de enzimas estudas no presente trabalho. Pode-se

observar que o processo de purificação para CMCase é favorecido quando o SMDFA é

operado a 55 °C com a concentração Triton X-114 com 8% (m/m). Neste caso, um FP de

10,89 foi atingido para a CMCase (endoglucanases). Esse valor é quase dezesseis vezes

o valor mostrado pelo sistema com a mesma concentração de Triton X-114 (8% (m/m)),

quando o extrato foi aplicado a 35 °C, conforme observado na Fig. 4.19.



Figura 4.19 – Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no fator de

purificação (FP) de CMCase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por A.



Figura 4.20 – Influência da concentração de Triton X-114 e da temperatura no fator de

purificação (FP) de FPase usando SMDFA. O extrato enzimático foi produzido por A.





Com relação à FPase (exoglicanases), ao ser utilizar a temperatura de 55 °C e uma

concentração de Triton X-114 com 8% (m/m) obteve-se o maior FP de aproximadamente,

0,7, e pode-se observar que o valor FP foi inferior a 1,0 indenpendente do SMDFA usado.

Isso mostra que essas enzimas (as exoglicanases) preferem a fase rica em micelas.

Indicando que, provavelmente, possuem maior quantidade de resíduos hidrofóbicos que

as CMCases (endoglicanases). Assim como a CMCase (endoglicanases), as FPases

(exoglucanases) também mostraram um incremento no FP com o aumento da temperatura

do sistema com a mesma concentração de Triton X-114 (8% (m/m)). Nesse caso, o

aumento no FP foi aproximadamente de 8,1 vezes, Figura 4.22.

4.8.3. Influência da concentração de Triton X-114 e da concentração do extrato

enzimático no coeficiente de partição (K), no rendimento e no fator de purificação

das celulases

A influência da concentração de Triton X-114 e da concentração do extrato

enzimático no rendimento das celulases (CMCase e FPase) mantendo-se a temperatura

em 55 °C é mostrada nas Figuras 4.21 e 4.22. Destaca-se que a temperatura de 55 °C foi

a escolhida uma vez que a mesma favoreceu o FP para ambas as enzimas (CMCase e

FPase).

A Figura 4.21 mostra que para a CMCase (endoglucanases) foram obtidos valores

de rendimento superiores a 92% independentemente da concentração de extrato bruto

utilizada no sistema. Entretanto, para a FPase o uso do extrato bruto de 20% (m/m)

reduziu drasticamente o rendimento. Neste caso, observou-se uma diminuição no

rendimento de 65% para 20%. Na mesma condição, para a CMCase a redução do

redimento foi mais suave, passando de 98,5% para 93%. Deve-se ressaltar que para a

FPase, exceto para uma concentração de extrato bruto de 20% (m/m), rendimentos

maiores que 75% são alcançados. Para essas enzimas, um incremento no extrato bruto

superior a 40% (m/m) não altera significativamente o rendimento. Assim, para essas

enzimas a concentração de extrato intermediária favorece o rendimento.



Figura 4.21 - Influência da concentração de Triton X-114 e concentração do extrato

enzimático no rendimento (R) de CMCase usando SMDFA. O extrato enzimático foi

produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato.

A temperatura foi mantida a 55 °C.


enzimático no rendimento (R) de FPase usando SMDFA. O extrato enzimático foi

produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como substrato.

A temperatura foi mantida a 55 °C.



A influência da concentração de Triton X-114 e da concentração do extrato

enzimático no FP das celulases (CMCase e FPase) mantendo-se a temperatura em 55 °C

é mostrada nas Figuras 4.23 e 4.24.

Observa-se que o FP tanto para CMCase como para FPase é muito influenciado

pelas condições do sistema. É notório, porém, que a concentração do extrato enzimático

superior a 40% (m/m) favorece o FP para estas enzimas principalmente quando a

concentração de Triton X-114 de 8% (m/m) foi usada. O FP obtido para CMCase foi

maior que o mostrado pela FPase. Para a CMCase o FP máximo foi de 10,89, enquanto

para a FPase o FP máximo foi de 0,65. Para a CMCase uma hipótese para a redução do

FP com o aumento da concentração do extrato enzimático é que aumenta-se a

probabilidade de interação enzima-micelas, favorecendo a passagem da enzima da fase

pobre para a fase rica em micelas.


enzimático no fator de purificação (FP) da CMCase usando SMDFA. O extrato

enzimático foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar

como substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.




enzimático no fator de purificação (FP) da FPase usando SMDFA. O extrato enzimático

foi produzido por A. fumigatus por FES usando o bagaço de cana-de-açúcar como

substrato. A temperatura foi mantida a 55 °C.

4.8.4. Influência da concentração de Triton X-114 e de sais inorgânicos no coeficiente


O tipo de sal e seu conteúdo desempenham um papel fundamental na partição de

biomoléculas usando o SMDFA (HARRIS et al., 1994). Portanto, neste estudo avaliou-

se a influência dos sais inorgânicos na partição das enzimas celulolíticas produzidas pelo

fungo filamentoso Aspergillus fumigatus usando SMDFA.

Nesse caso, a temperatura e a concentração do extrato bruto foram 55 °C e 40%

(m/m), respectivamente. Estes valores foram escolhidos uma vez que levaram aos

melhores resultados, para o rendimento e FP para ambas as enzimas (CMCase e FPase).

Assim, a partição das enzimas foi realizada na presença dos sais CaCl2, MgSO4, MnSO4

e NaCl com a concentração de 5%, alterando-se a concentração de Triton X-114 de 2%

(m/m) até 8% (m/m). Os valores para o coeficiente de partição (K) para a CMCase e

FPase, são mostrados na Tabela 4.13 e na Tabela 4.14, respectivamente.

Observa-se que a adição de CaCl2 favoreceu o coeficiente de partição para ambas

as enzimas, conforme observado na Tabela 4.13 e na Tabela 4.14. Por exemplo, obteve-

se um valor K igual 50 para o SMDFA contendo 2% (m/m) de Triton X-114 operando a



55 °C com extrato bruto de 40% (m/m). Considerando esse sal e a FPase, obteve-se um

coeficiente de partição igual 13,5 (Tabela 4.14). As Figuras 4.25 e 4.26 ilustram os

rendimentos obtidos para a CMCase e FPase, respectivamente, ao se adicionar os sais ao

SMDFA.

Em geral, o SMDFA apresentou rendimento maiores que 70% tanto para CMCase

quanto para FPase exceto na presença do ânion SO4-2 (Figuras 4.25 e 4.26). Deve-se

destacar que um baixo rendimento (menos de 30% independentemente da concentração

de Triton X-114) foi observado para a CMCase. O efeito do tipo de íon na partição das

enzimas torna-se evidente se comparar os rendimentos obtidos na presença de MgSO4

com os obtidos na presença de MnSO4 como mostrado na Figura 4.25. É notório que o

uso do MnSO4 favoreceu o rendimento da CMC (endoglucanases), na fase pobre em

micelas, quando comparado ao MgSO4. Assim, uma vez que o ânion é o mesmo e

sabendo-se que o íon com menor raio, maior capacidade de hidratação, é mais eficiente

em favorecer o “salting out” e desde que o raio do Mn+2 > Mg+2 há uma tendência do

primeiro favorecer a interação micela-micela, favorencendo assim a passagem das

enzimas para a fase pobre em micela, ou seja, aumentando o K, R e o FP.

Tabela 4.13 – Coeficiente de partição (K) para a enzima CMCase obtido durante o

particionamento no SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114 e a

temperatura de 55 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40% e adicionados os sais:


Concentração do

Triton X-114 (%)


Sais

NaCl CaCl2 MgSO4 MnSO4

2 5,67 ± 2,33 50,00 ± 0,17 1,76 ± 0,01 3,56 ± 0,28

4 4,75 ± 0,25 26,16 ± 0,83 3,33 ± 0,33 5,80 ± 0,31

6 12,40 ± 0,40 27,75 ± 4,25 2,76 ± 0,43 1,11 ± 0,03

8 7,19 ± 0,52 12,83 ± 1,83 2,26 ± 0,02 1,84 ± 0,77



Tabela 4.14 - Coeficiente de partição (K) para a enzima FPase obtido durante o

particionamento no SMDFA usando diferentes concentrações de Triton X-114 e a

temperatura de 55 °C. O extrato enzimático foi mantido em 40% e adicionados os sais:


Concentração do

Triton X-114

(%)


Sais

NaCl CaCl2 MgSO4 MnSO4

2 1,00 ± 0,00 2,75 ± 1,75 3,50 ± 0,50 1,24 ± 0,02

4 1,83 ± 0,17 13,50 ± 2,50 3,00 ± 0,01 3,58 ± 1,50

6 2,00 ± 0,00 6,50 ± 0,50 5,75 ± 0,25 1,21 ± 0,38

8 1,50 ± 0,50 2,50 ± 1,50 1,50 ± 0,15 1,21 ± 0,07

A adição de sais inorgânicos acarreta em mudanças nas interações intra e

intermicelares em função de forças eletrostáticas. As mudanças ocorrem no

comportamento das fases aquosas com misturas de surfactantes com carga oposta a das

proteínas/enzimas favorencendo a partição dessas biomoléculas (SANTOS et al., 2011;

SANTOS-EBINUMA et al., 2013; XU, 2012). O efeito de sais inorgânicos tais como

NaCl, Na2SO4, Li2SO4 nas propriedades das soluções do surfactante não-iônico são

baixas, as interações eletrostáticas diretas entre espécies iônicas e os surfactantes não

iônicos são relativamente fracas.

No entanto, uma grande quantidade de sal inorgânico adicionada ao sistema

prejudica as propriedades da solução influenciando as propriedades da água. Com relação

ao NaCl e CaCl2, desde que esse o ânion desse último é divalente há uma tendência deste

de favorecer o “salting out” das micelas e, também, favorecendo a partição das celulases

para a fase pobre em micelas.



Figura 4.25 - Rendimento para a CMCase obtido durante a partição no SMDFA usando

diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração do extrato bruto

de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na

concentração de 5%.

Figura 4.26 Rendimento para a FPase obtido durante a partição no SMDFA usando

diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração do extrato bruto

de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na




De acordo com NISHII et al., (2004), HATTON et al., (1987) e LIU et al., (1998)

os efeitos causados no sistema pela presença de sais é devido a força iônica que ocasiona

modificações das interações eletrostáticas do sistema, principalmente efeitos “salting

out”, por exclusão ou inclusão das moléculas nas fases dependendo da concentração de

sal incorporado ao sistema. Assim, o principal efeito do sal no sistema é alterar a força

iônica desequilibrando as forças de repulsão eletrostáticas que existem nos grupos polares

do surfactante, fazendo com que o tamanho da micela se expanda ou se retraía. Assim,

embora os sais distribuam quase uniformemente entre as fases, desde que os mesmos são

pequenos, há significativas variações no coeficiente de partição dos íons devido à

existência de uma diferença de potencial eletrostática entre as fases, influenciando o

particionamento de biomoléculas (LOPES et al., 2014; SARUBBO et al., 2000). Dessa

forma, conforme destacado por KENNEDY e CABRAl (1993), a concentração molar da

solução tamponante que é aplicada para ajustar o pH do sistema pode facilitar a separação

das fases sem a necessidade da adição de sais. Por outro lado, é conhecido que a

concentração e o tipo de sal podem influenciar a transferência de massa entre fases

(MARCOZZI et al., 1991; LESER et al.,1992).

As Figuras 4.27 e 4.28 ilustram o fator de purificação obtido para a CMCase e

FPase, respectivamente, ao se adicionar sais ao SMDFA.

Destaca-se o efeito do sal na partição de ambas as enzimas. Além disso, na

presença de NaCl e MgSO4, a CMCase (endoglucanase) tende a se particionar na fase rica

em micelas, ou seja, apresentou FP inferior a 1,0, independentemente da concentração de

Triton X-114 usado, como observado na Figura 4.26. A presença do sal não favoreceu o

FP da CMCase, principalmente devido ao “salting out”. Porém, o uso de um SMDFA

composto por Triton X-114 a 8% (m/m) operando a 55 °C com 40% (m/m) de extrato

bruto sem a presença de sal forneceu um FP de 10,89. Para a FPase (exoglucanase), a

adição de 4% (m/m) de MnSO4 fornecu um FP de aproximadamente 5,0, como pode ser

visto na Figura 4.27.



Figura 4.27 - Fator de purificação para a CMCase obtido durante a partição no SMDFA

usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração do extrato

bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na


Figura 4.28 - Fator de purificação para a FPase obtido durante a partição no SMDFA

usando diferentes concentrações de Triton X-114, mantendo-se a concentração do extrato

bruto de 40% a temperatura em 55 °C na presença dos NaCl, CaCl2, MgSO4 e MnSO4 na




A diferença que ocorre na partição das biomoléculas, ao se utilizar o SMDFA na

presença de sal, deve-se ao fato que os diferentes íons podem mostrar um comportamento

entre as fases diferentes (COSTA et al., 1998; HARRIS et al., 1994; UMAKOSHI et al.,

1996). No presente estudo, as diferenças observadas nos fatores de purificação para as

enzimas foram dependentes do tipo e da concentração de sal adicionado ao sistema. A

influência dos sais (ânions e cátions) já foi relatada por HOFMEISTER (1888). A

classificação dos ânions, em geral, é apresentada na série: CO3-2 > SO4

-2 > S2O3-2 > H2PO4

-

> OH- > F- > HCO-2 > CH3CO-2 > Cl- > Br- > NO3-> I-> ClO4

- > SCN-.

MARCUS (2009) apresenta em relação aos cátions a seguência: (CH3)4N+ >

(CH3)2NH2+ > K+~ Na+ > Cs+ > Li+ > NH4

+ > Mg2+ > Ca2+ > C(NH2)3+.

Esta sequência de íons pode sofrer variações devido a interação de íons com

macromoléculas presentes em solução. Nesse sentido, os íons da série Hofmeister são

classificados com base na sua influência sobre a estrutura da água (COLLINS e

WASHABAUGH, 1985).

A Figura 4.29 mostra a eletroforese (SDS-PAGE) e o zimograma obtido utilizando

o extrato purificado por SMDFA na melhor condição. A eletroforese foi realizada nos

extratos nas condições de 40% (m/m) de extrato bruto a 55 °C com concentração diferente

de Triton X-114 (2, 4, 6 e 8% m/m). Pode verificar-se que o extrato bruto apresentou pelo

menos quatro bandas mais intensas com massa molecular aproximadamente de 25, 33,

39, 52 e 70 kDa, respectivamente. Além disso, os extratos apresentaram atividade no gel

como é mostrado pela atividade de CMCase, como representado pela degradação do gel

incorporado com CMC (4%), as bandas são visíveis após a revelação com vermelho de

congo no zimograma. O intervalo da massa molecular das proteínas do presente estudo

está na faixa daqueles comentados por Morazava et al., (2010).



Figura 4.29 - SDS-PAGE (linhas 1-5) e zimograma (linhas 6-10): 1,6 - Extrato bruto,

2,6-2% Triton X-114 (m/m), 3,8 - 4% Triton X-114 (m/m), 4,9 - 6% de Triton X-114

(m/m) e 5,10 - 8% de Triton X-114 (m/m).

Assim, com base nos resultados mostrados pelo presente estudo a técnica

integrativa de SMDFA (ARAÚJO et al., 2016, WANDERLEY et al., 2017) (AMID et

al., 2013) foi bem sucedida para recuperar e purificar celulases.

CAPÍTULO V

CONCLUSÕES

Capítulo V. Conclusões 112


5. Conclusões

As biomassas lignocelulósicas utilizadas no presente estudo (fibra da casca do coco,

bagaço da cana-de-açúcar e fibra do pedúnculo caju) in natura apresentaram valores de

celulose, hemiceluloses, lignina, cinzas, extraíveis e umidade, o que proporcionou a

excreção de enzimas celulolíticas.

Os resultados indicaram que o bagaço de cana-de-açúcar pode ser usado como substrato

na síntese de enzimas celulolíticas com uma linhagem A. fumigatus por fermentação em

estado sólido (FES). Ao se utilizar o planejamento composto central rotacional, foi

observado que o bagaço de cana-de-açúcar in natura, na condição do ponto central, isto

é, a 50% de umidade e pH 4,5 foi a mais favorável para a produção das celulases, em

termos de atividades CMase e FPase. Neste caso, obteve-se um valor médio de 4,18 U/g

e 0,62 U/g para CMCase e FPase, respectivamente. A concentração de proteína total foi,

em média, de 0,28 mg/mL nessa condição.

Em relação à estabilidade das celulases (CMCase e Fpase) produzidas por A. fumigatus

usando FES a CMCase atingiu 72% a 60 ºC. Para a FPase a máxima estabilidade relativa

foi obtida a 50 ºC atingindo um valor de apenas 33%. A CMCase foi mais estável no pH

2,0, aproximadamente 61% de atividade relativa. Nessa condição, a FPase manteve a sua

atividade em torno de 33%.

O pré-tratamento com NaOH (4%) no bagaço de cana-de-açúcar foi o que apresentou

maior teor de celulose (56,63%) e uma considerável redução no teor de lignina, alçando

9,92%.

Após o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com NaOH (4%) observou-se uma

desorganização dos feixes das fibras do bagaço nas imagens do MEV. Uma hipótese para

explicar esse comportamento, baseia-se na maior solubilização lignina durante esse pré-

tratamento.

As hidrólises enzimáticas com o bagaço pré-tratado com o NaOH apresentaram uma

conversão de celulose em glicose de 83,72% quando utilizou-se o extrato da Trichoderma

ressei, e 18,07% quando utilizou o extrato produzido.

A hidrólise com o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH (4,0%) utilizando o

extrato produzido foi mais eficiente na geração dos NCCs no tempo de 48 h. A

composição do resíduo pré-tratado facilitou a ação (atividade) das enzimas. Assim, desde

Capítulo V. Conclusões 113


que o teor de lignina foi consideravelmente reduzido houve o favorecimento para a ação

as enzimas do extrato bruto na celulose. Destaca-se que os nanocristais apresentaram

tamanhos uniformes e formatos circulares.

O uso do SMDFA, empregando o Triton X-114, para recuperar e purificar essas enzimas

mostraram resultados promissores neste sistema. A temperatura de 55 °C foi a melhor

para a recuperação e purificação das enzimas (CMCase e FPase). Os valores de K, R e

FP de para a enzima CMCase foram de 10,81; 96,70 e 7,27 respectivamente. Já para a

enzima FPase os valores foram de 0,65; 84,70 e 1,39.

O tipo de sal e seu conteúdo desempenharam um papel fundamental na partição das

biomoléculas usando o SMDFA. O melhor sal para o particionamento da enzima CMCase

foi MnSO4 com valores de K, R e FP de 5,80; 97,02 e 3,83 respectivamente. Para a enzima

FPase o melhor sal foi MgSO4 com valores de k, R e FP de 3,59; 94,38 e 4,77.

Os resultados obtidos neste trabalho foram interessantes, foi possível concluir que a

utilização do bagaço cana-de-açúcar em todas as etapas foi bastante importante para a

excreção das enzimas celulolíticas (CMCase e FPase) por Aspergillus fumigatus e na

etapa de hidrólise enzimática responsável pela geração dos nanocristais de celulose, e a

técnica de purificação aplicada (SMDFA) ao extrato enzimático foi bem sucedida.

REFERÊNCIAS

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Referências Bibliográficas 115


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tese de doutorado...muito obrigado. a todos os professores que contribuíram para a minha formação...

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