tese de biologia

8/3/2019 Tese de Biologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSEINSTITUTO DE BIOLOGIA

ISABELLA CANELLA MESQUITA

LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM

LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A

PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS

Niteri2007


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ii

ISABELLA CANELLA MESQUITA

LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM

LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A

PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS

Orientadoras

Professora Jussara Lagrota Cndido

Professora Thereza Quirico dos Santos


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iii

Dissertao submetida coordenao do curso de

ps-graduao em Neuroimunologia do Instituto de

Biologia da Universidade Federal Fluminense, como

parte dos requisitos necessrios para obteno dograu de Mestre em Neuroimunologia rea de

concentrao: Imunobiologia.

Banca examinadora:

Joseli Lannes Vieira (IOC-Fiocruz)

Mauricio Vercimo (UFF)

Elizabeth Giestal Arajo (UFF)

Vernica Figueiredo Amaral (Suplente e Revisora- UFF)


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iv

A parte experimental deste trabalho foi executada nos laboratriosde Imunopatologia e Patologia Celular do Instituto de Biologia da

Universidade Federal Fluminense (UFF) e no Laboratrio de Pesquisa em

Auto-imunidade e Imuno-regulao (Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz).


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v

FICHA CATALOGRFICA

MESQUITA, Isabella Canella

Leso muscular induzida por bupivacana em linhagens de

camundongos predispostos a perfil distinto de citocinas Niteri: UFF,2007.

102 f.

Dissertao Mestrado em Neuroimunologia

Universidade Federal Fluminense

1. leso muscular 2. inflamao 3. Msculo Esqueltico

4. citocinas


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Dedico esta tese

Deus, minha famlia, amigos, colegas detrabalho e orientadoras pelo apoio, fora,incentivo, companheirismo e amizade. Sem elesnada disso seria possvel.


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vii

AGRADECIMENTOS

A Deus por me amparar nos momentos difceis, me dar fora interior

para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e

me suprir em todas as minhas necessidades.

s minhas orientadoras e amigas Profas Jussara Lagrota-Cndido e

Thereza Qurico dos Santos, por acreditarem em mim, me mostrarem o

caminho da cincia, fazerem parte da minha vida nos momentos bons e

ruins, por serem exemplos de profissional e de mulheres as quais

sempre faro parte da minha vida.

minha famlia, a qual amo muito, pelo carinho, pacincia e incentivo.

A Dra. Joseli Lannes Vieira por sua ajuda nos momentos mais crticos,

por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento

profissional e por ser tambm um exemplo a ser seguido. Sua

participao foi fundamental para a realizao deste trabalho.

Aos amigos que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e

incentivando.

Aos meus colegas de trabalho Douglas, Rafael, Pedro e as tcnicas do

laboratrio Nina e Bartira que participaram diretamente deste trabalho e

me ajudaram em todos os momentos.


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viii

Aos meus amigos de laboratrio Paulo Emlio, Gabriele, Cristiane,

Guilherme, Fernanda e Jardel que sempre estiveram do meu lado dando

fora e apoio.

As colegas do Laboratrio de Autoimunidade da Fiocruz, Jaline,

Valeska, Karina, Andra, Luzia, Mrcia, Diego, por me receberem to

bem, me ajudarem e participarem deste trabalho.

Aos tcnicos do Biotrio Central da Fiocruz e do NAL pelo apoio tcnico

excepcional.

A Dra Andra Fontes do DUBC da Fiocruz pelo apoio e colaborao na

utilizao do citmetro de fluxo.

A todos os amigos do Instituto de Biologia pelo carinho e apoio.

A todos os colegas e professores da ps-graduao em

Neuroimunologia pelo convvio e aprendizado.


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ix

EPGRAFE

"Todo o futuro da nossa espcie, todo o governo das

sociedades, toda a prosperidade moral e material das naes

dependem da cincia, como a vida do homem depende do ar.

Ora, a cincia toda observao, toda exatido, toda verificao

experimental. Perceber os fenmenos, discernir as relaes,

comparar as analogias e as dessemelhanas, classificar as

realidades, e induzir as leis, eis a cincia; eis, portanto, o alvo quea educao deve ter em mira. Espertar na inteligncia nascente

as faculdades cujo concurso se requer nesses processos de

descobrir e assimilar a verdade."

Rui Barbosa.


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x

SUMRIO

Pgina

FICHA CATALOGRFICA...................................................................................v

DEDICATRIA.................................................................................................... vi

AGRADECIMENTOS..........................................................................................vii

EPGRAFE.......................................................................................................... ix

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xii

LISTA DE TABELAS..........................................................................................xiv

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................xv

RESUMO...........................................................................................................xvii

ABSTRACT.......................................................................................................xviii

1.0 - INTRODUO.......................................................................................... 1

1.1 - Tecido Muscular Esqueltico.....................................................................1

1.2 - Formao do Tecido Muscular.................................................................. 5

1.3 - Reparo do Tecido Muscular...................................................................... 6

1.4 - Progenitores Miognicos........................................................................... 9

1.4.1 - Clulas Satlites........................................................................................ 9

1.4.2 - Contribuio de Outras Clulas Miognicas no Reparo do Tecido

Muscular...................................................................................................13

1.5 - Participao da Inflamao no Reparo Tecidual .....................................16

1.6 - Metaloproteinases na Regenerao e Reparo de Tecido Muscular .......23

1.7 - Modelos Animais de Injuria Muscular.......................................................25

2.0 - OBJETIVOS.............................................................................................28

2.1 - Objetivo Geral..........................................................................................28

2.2 - Objetivos Especficos..............................................................................283.0 - MATERIAL E MTODOS.........................................................................29

3.1 - Animais.....................................................................................................29

3.2 - Induo da Leso.....................................................................................29

3.3 - Processamento Histolgico......................................................................30

3.4 - Imuno-histoqumica..................................................................................30

3.5 - Histomorfometria......................................................................................32

3.6 - Citometria de Fluxo..................................................................................323.7 - RT-PCR....................................................................................................33


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xi

3.7.1 - Extrao de RNA Total ........................................................................... 33

3.7.2 - Eletroforese de RNA .............................................................................. 34

3.7.3 - Transcrio Reversa de RNA e PCR...................................................... 35

3.8 - Zimografia............................................................................................... 36

3.8.1 - Preparo do Extrato Tecidual.................................................................. 36

3.8.2 - Gel para Zimografia............................................................................... 36

3.9 - Anlise Estatstica................................................................................... 37

4.0 - RESULTADOS........................................................................................ 38

4.1 - Anlise Histolgica da Leso Muscular ................................................. 38

4.2 - Alteraes no Microambiente da Leso Muscular ...................................42

4.2.1- Colorao de Picrocrius .......................................... ..............................42

4.2.2 - Atividade das Metaloproteases no Msculo Lesionado ..........................47

4.3 - Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio..... ...............................................51

4.4 - Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem.......................... .....................53

4.5 - Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico.....................62

5. - DISCUSSO........................................................................................... 64

6. - CONCLUSES....................................................................................... 72

7. - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................ 73


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LISTA DE ABREVIATURAS

ATP Adenosina tri-fosfato

ATPASE Adenosina tri-fosfatase

B10 C57BL/10

B6 C57BL/6

BHLH Basic-helix-loop-helix

Ca+ Clcio

CTX Cardiotoxina

DMD Distrofia muscular de Duchenne

DPI Dias aps inoculao

ECM Matriz extracelular

FGF Fator de crescimento de fibroblasto

GAPDH Gliceraldeido-3-fosfatase dehidrogenase

HGF fator de crescimento de hepatcito

HMGB1 Protena do tipo high mobility group box 1

IGF Fator de crescimento do tipo insulina

IL Interleucina

LAP Protena associada latncia

LPS Lipopolissacardeo

MDSC Clulas tronco derivadas de msculo

MHC Miosina de cadeia pesada

MMP Metaloprotease de matriz

MRF Fator de crescimento muscular

mRNA RNA mensageiroNK Clula natural killer

NO xido Ntrico

NTX Notexina

PCNA Antgeno nuclear de proliferao celular

PCR Reao de polimerase em cadeia

PGE2 Prostaglandina E

PPARy Receptor de ativao proliferador de peroxossoma gama


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RNAse Ribonuclease

Runx2 Fator de transcrio relacionado ao runt tipo 2

SCA-1 Antgeno de clula tronco do tipo 1

SDF Fator derivado de clula do estroma

SDS Dodecil sulfato de sdio

SP Side Population

TGF Fator de transformao do crescimento

TGF- Fator de Transformao do crescimento do tipo

TIMP Inibidor tecidual de metaloprotease

TLR Receptor do tipo toll

TNF Fator de necrose tumoral alfa

Zn2+ Zinco


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xiv

LISTA DE TABELAS

Pgina

1. Relao de anticorpos utilizados na imuno-histoquimica....................... 31

2. Relao de anticorpos utilizados na citometria de fluxo......................... 33

3. Lista de oligonucleotdeos.......................................................................35


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xv

LISTA DE FIGURAS

Pgina

1. Estrutura do msculo esqueltico.................................................... 2

2. Estrutura da fibra muscular.............................................................. 3

3. Distribuio heterognea das fibras musculares

esquelticas..................................................................................... 4

4. Estgios de regenerao do tecido muscular.................................. 9

5. Regulao molecular da regenerao do tecido muscular.............. 11

6. Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites ...... 13

7. Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao

muscular........................................................................................... 15

8. Cintica da migrao celular nas fases da leso

tecidual............................................................................................... 17

9. Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual............ 23

10. Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas

linhagens de camundongo................................................................. 40

11. Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo

Giemsa............................................................................................... 41

12. Colorao de picrosrius da leso muscular...................................... 44

13. Histomorfometria da area da leso ocupada por colgeno............... 46

14. Atividade de metaloproteinases no msculo esqueltico.................. 49

15. Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esqueltico............ 50

16. Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatorio da leso

muscular induzida por bupivacana................................................... 52

17. Celularidade dos linfonodos de axilar e braquial...... 5418. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes

nos linfonodos de drenagem em 4 dpi...............................................

49

55

19. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos t

presentes nos linfonodos de drenagem em 4dpi...... 57

20. Perfis representatives de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas

clulas TCD4+ de camundondos BALB/c.......................................... 58


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xvi

21. Anlise por citometria de fluxo de expresso dos antgenos

CD62L, CD44, CD25 nas clulas CD4+............................................ 59

22. Perfs representativos de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas

clulas CD8+ de camundongos C57BL6................ .......................... 60

23. Anlise pr citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L,

CD44, CD25 nas clulas CD8+......................................................... 61

24. Expresso de RNA mensageiro para TGF- no msculo

esqueltico

63


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xvii

RESUMO

Leses musculares so problemas freqentes na medicina esportiva e doenas

miodegenerativas. A fase inicial do processo de reparo caracterizada pela

necrose do tecido danificado e ativao da resposta inflamatria. O objetivo

deste trabalho foi analisar o reparo do tecido muscular aps a induo de leso

muscular em linhagens de camundongos com distintos padres de secreo de

citocinas. Foram includos pelo menos 3 animais em cada grupo de estudo com

padro de citocinas Th1 (C57BL/10, C57BL/6) e Th2 (BALB/c). A injria

muscular foi induzida pela inoculao de bupivacana no msculo Trceps

bachii. Os camundongos foram sacrificados aps 1, 4, 8 e 12 dias (dpi). As

linhagens com predomnio de citocinas Th1 apresentaram maior rea com

miofibras regenerando e macrfagos em 4 dpi em comparao com o

camundongo BALB/c. Os linfonodos regionais apresentaram aumento

significativo da celularidade com aumento percentual de linfcitos T CD3+CD4+

somente nos camundongos BALB/c inoculados com bupivacana. Os

camundongos BALB/c mostraram um aumento da deposio de colgeno e

menores nveis de MMP-9 associados com maior quantidade de mRNA para

TGF-1. Este estudo sugere que o perfil imunolgico do camundongo pode

influenciar o processo de remodelagem no msculo esqueltico aps

inoculao de bupivacana promovendo regenerao muscular (citocinas Th1)

ou mionecrose e deposio de colgeno (citocinas Th2).


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xviii

ABSTRACT

Muscular lesion is a frequent matter in sportive medicine and myodegenerative

diseases. Necrosis of the damaged tissue and activation of inflammatory

response characterize the initial phase of muscle repair. This work aimed to

analyze the tissue repair after induction of lesion in skeletal muscle from mouse

lineages with distinct cytokine secretion patterns. It was included at least 3 mice

per group with distinct cytokine pattern: Th1 (C57BL/10, C57BL/6) and Th2

(BALB/c). Muscular injury was performed by injection of bupivacaine (Bp) in the(T. brachii) skeletal muscle. Mice were sacrificed at 1, 4, 8 and 12 days post-

injection (dpi). Both Th1-dominant strains presented more areas with

regenerating myofibers and macrophages at 4 dpi. Regional lymph nodes

showed significant increase of cellularity and relative numbers of CD3+CD4+ in

bupivacaine-inoculated BALB/c mice compared to non-inoculated matched mice

at 4 dpi. BALB/c mice showed increased collagen expression and decrease of

MMP-9 activity associated with more mRNA for TGF-b1. This study shows that

the immune background of the mouse may affect the remodelling processes in

skeletal muscles that occur in response to bupivacaine injection promoting

muscle regeneration (Th1 cytokines) or myonecrosis and collagen deposition

(Th2 cytokines).


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1

1. INTRODUO

1.1 TECIDO MUSCULAR ESQUELTICO

O msculo estriado esqueltico responsvel pela sustentao e

movimentao corporal devido a sua capacidade de contrao e de gerar uma

fora que aplicada sobre ossos e articulaes. Na maioria das vezes essa

contrao voluntria via estmulo nervoso. O msculo esqueltico formado

por clulas cilndricas alongadas e que possuem estriaes transversais. As

clulas musculares apresentam caractersticas especficas e por isto seus

componentes receberam nomes especiais. O citoplasma chamado de

sarcoplasma, o retculo endoplsmtico de retculo sarcoplasmtico e a

membrana citoplasmtica de sarcolema. Os ncleos de uma fibra muscular

esto todos localizados na periferia da fibra em contato com o sarcolema (Kerr,

2000).

Os msculos so formados por um conjunto de clulas que se originam

da fuso de mioblastos e se organizam em feixes cilndricos e multinucleados

com at 30 cm. Cada fibra muscular revestida por uma camada de tecido

conjuntivo chamada endomsio. Tais fibras so ento agrupadas em feixes

mantidos juntos por outra camada de tecido conjuntivo, denominada perimsio.

Esse grupo revestido ou feixe de fibras denominado fascculo. Os grupos de

fascculos com feixes de fibras, cada qual com vasos sangneos e tecido

nervoso associados, so mantidos bem unidos por outra camada de tecido

conjuntivo denominada epimsio. Os fascculos circundados por epimsio, quepercorrem todo o comprimento do msculo esqueltico, so ento


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2

completamente circundados por um tecido conjuntivo denominado fscia (figura

1). A fscia um tecido conjuntivo denso e resistente que recobre todo o

msculo e, estende-se alm do msculo formando o tendo fibroso, cuja

funo fixar o msculo ao osso. Esta disposio do tecido conjuntivo mantm

a organizao das fibras musculares, permitindo que a fora de contrao seja

transmitida a outras estruturas como tendes e ligamentos e tambm influencia

na distribuio dos vasos sanguneos, linfticos e inervao (Junqueira &

Carneiro, 2004).

Figura 1: Estrutura do msculo esqueltico.

http://training.seer.cancer.gov/module_anatomy/unit4_2_muscle_structure.htm (acessado em

20/12/2006)

No interior de uma fibra muscular existe um nmero razovel de

unidades estruturais orientadas longitudinalmente chamadas de miofibrilas

formadas por filamentos de actina e miosina, as duas principais protenas

contrteis do msculo. As miofibrilas so cilndricas, com dimetro entre 1 e 2

m, podendo ser vistas ao microscpio ptico como estriaes transversais

sanguneo

Fibra muscular

fascculoendomsioepimsiotendo

ossoperimsio


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3

com faixas claras e escuras (Kerr, 2000). A banda I (isotrpica), apresenta-se

mais clara porque a luz polarizada atravessa facilmente os finos filamentos de

actina que a constituem. A banda A (anisotrpica), apresenta-se mais escura

por ser composta por actina e filamentos espessos de miosina, o que dificulta a

passagem da luz. No centro de cada banda I aparece uma linha transversal

escura, a linha Z. O sarcmero, unidade estrutural do msculo, definido como

a regio da miofibra compreendida entre as duas linhas Z. No centro de cada

banda A existe uma rea mais clara chamada de banda H, exclusivamente

constituda de miosina (figura 2). Ao microscpio eletrnico podemos ver

filamentos finos de actina que partem da linha Z at o bordo externo da banda

H (Junqueira & Carneiro, 2004).

Figura 2 Estrutura da fibra muscularwww.adesnivel.pt/treino/musculo.htm (acessado em 16/02/2007)

ncleo

Banda I

Banda A

Disco Z

Mitocndria

Miofibra

Sarcoplasma

Sarcolema

Triad

Cisterna terminalTbulo transversal

Retculosarcoplasmtico


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4

As miofibras so heterogneas no tamanho, metabolismo e funo

contrtil, o que permite uma grande variedade de funes de acordo com a

composio das fibras. Inicialmente as fibras foram classificadas como sendo

rpidas e lentas baseadas na velocidade de contrao. Esta diviso tambm

corresponde a diferenas morfolgicas, com os msculos rpidos sendo

brancos em algumas espcies como aves, e os msculos lentos de cor

vermelha. O maior contedo de mioglobina e capilares nos msculos

vermelhos contribui para a maior capacidade oxidativa dos msculos

vermelhos comparados com os brancos. Atualmente, as fibras musculares so

classificadas por trs diferentes mtodos: anlise histoqumica para ATPase,

identificao da isoforma de miosina e identificao bioqumica de enzimas

metablicas (Scott et al., 2001) ver figura 3.

Figura 3: Distribuio heterognea das fibras musculares esquelticas.

Anlise do tipo de fibra de sees transversais do msculo soleus de camundongos coradas

por hematoxilina-eosina (a), colorao metacromtica da ATPase mostrando fibras tipo I(coradas em azul) e tipo IIA (azul claro), e em (c) imuno-histoqumica usando anticorpo

monoclonal que reconhece miosina do tipo I (Bassel-Duby & Olson, 2006) .


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5

1.2 FORMAO DO TECIDO MUSCULAR

O msculo esqueltico de vertebrados formado a partir do mesoderma

paraxial, o qual se segmenta em somitos em cada lado da notocorda e do tubo

neural (Christ & Ordahl, 1995). A poro dorsal do somito originar os

msculos dos membros e do corpo, enquanto alguns msculos da cabea so

originados da poro anterior no segmentada, mesoderma paraxial e

mesoderma pr-cordal (Buckingham et al., 2003).

A miognese um processo que envolve uma cascata complexa de

eventos incluindo especificao e a diferenciao das clulas precursoras ou

mioblastos, que se fusionam para formar os miotubos primrios e secundrios

e a subseqente maturao. Todos esses eventos se do sob um controle

gentico restrito e envolve a migrao de clulas precursoras (Muntoni et al.,

2002). Genes da famlia Pax, caracterizados pela presena de um homeoboxe

um paired box, esto implicados na proliferao de vrias linhagens de

precursores (Pownall et al., 2002; Chen & Goldhamer, 2003; Charge &

Rudnicki, 2004). Pax-3 e Pax-7 possuem um papel importante durante o

desenvolvimento do msculo esqueltico (Hawke & Garry, 2001; Chen &

Goldhamer, 2003; Charge & Rudnicki, 2004). Famlias de fatores de

transcrio, como MRF (fatores regulatrios miognicos) que pertencem

superfamlia de fatores de transcrio bHLH (basic helix-loop-helix), esto

implicados na formao do msculo esqueltico (Charge & Rudnicki, 2004). A

famlia MRF consiste de MyoD (Myf-3), Myf-5, miogenina (Myf-1) e MRF4 (Myf-

6/Herculin) (Sabourin & Rudnicki, 2000). MyoD e o Myf-5 so os fatores

primrios e agem na determinao miognica, enquanto a miogenina e o MRF4

so fatores de diferenciao (Sabourin & Rudnicki, 2000). Camundongos duplo


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6

nocaute para Myf-5 e MyoD no conseguem formar msculo esqueltico

devido a ausncia de precursores de mioblastos (Rudnicki et al., 1993). Clulas

miognicas com proliferao positiva para MyoD e /ou Myf5 formam mioblastos

que proliferam e saem do ciclo celular para se tornarem micitos diferenciados.

Estes expressam as MRFs, miogenina e MRF4, e subseqentemente genes

musculares especficos como a cadeia pesada de miosina (MHC) e creatina

quinase muscular (MCK) (Charge & Rudnicki, 2004). Durante o

desenvolvimento muscular, uma populao de mioblastos no se diferencia,

permanecendo associada superfcie da fibra em desenvolvimento como

clulas satlites musculares quiescentes (Charge & Rudnicki, 2004).

1.3 REPARO DO TECIDO MUSCULAR

O msculo esqueltico de mamferos tem a capacidade de realizar

regenerao rpida e extensa em resposta a injria grave devido a defeitos

genticos e atividade fsica intensa. A regenerao muscular caracterizada

por trs fases: degenerao, reparo e remodelagem (Jarvinen et al., 2005). O

evento inicial da degenerao muscular a necrose das fibras musculares.

Esse evento iniciado geralmente pela ruptura do sarcolema resultando em

aumento da permeabilidade da miofibra. A ruptura da miofibra se reflete pelo

aumento dos nveis sricos da protena muscular creatina kinase. A

permeabilidade aumentada da fibra muscular a corantes de baixo peso

molecular como azul de Evans uma indicao da leso do sarcolema

associada a exerccios extensos e doenas degenerativas. Na leso muscular

alm de necrose, degenerao e infiltrado de clulas inflamatrias tambm

evidente o extravasamento sangneo com formao de hematoma (Charge &


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7

Rudnicki, 2004). Esse processo seguido por uma fase de reparo onde ocorre

a fagocitose do tecido lesionado, regenerao das miofibras, formao do

tecido cicatricial e revascularizao. Durante a fase seguinte, a fase de

remodelagem, ocorre contrao e reorganizao do tecido cicatricial e a

recuperao da capacidade funcional do msculo (Peng & Huard, 2004).

Na fase inicial da leso muscular geralmente ocorre ativao de clulas

mononucleares, principalmente clulas inflamatrias e clulas miognicas. No

perodo ps-leso as principais alteraes histolgicas no stio de leso so:

necrose da miofibra e aumento do nmero de clulas mononucleares de

origem no muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Estudos recentes sugerem

que fatores liberados por msculos lesionados ativam as clulas inflamatrias

residentes que em troca produzem sinais quimiotticos para as clulas

inflamatrias circulantes (Warren et al., 2004).

Aps leso muscular induzida por exerccios ou por miotoxinas, os neutrfilos

so as primeiras clulas inflamatrias a invadir o msculo lesionado, com

aumento numrico nas primeiras 6 horas. Os macrfagos se tornam o tipo

celular predominante aps 48h. Macrfagos fagocitam restos celulares e

podem afetar outros aspectos da regenerao muscular ativando clulas

miognicas (Tidball, 2005).Experimentos de marcao nuclear mostraram a contribuio das

clulas satlites como uma fonte importante de novos mioncleos na

regenerao de miofibras (revisado em Zammit et al., 2006)). Aps a fase de

proliferao miognica, as novas fibras musculares formadas, como na

miognese embrionria, sofrem diferenciao e se fusionam a fibras lesionadas

j existentes ou formam novas miofibras (figura 4A). As miofibras recm-


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8

formadas so basoflicas, apresentam calibre pequeno, nucleao central

(figura 4B) e expressam formas de MHC embrionrio. Em sees longitudinais

e em fibras isoladas a nucleao central observada em pores discretas na

rea de regenerao ou ao longo de toda a fibra sugerindo que durante a

regenerao a fuso celular no difusa, mas focal ao local da leso. Aps a

completa fuso das clulas miognicas, as fibras aumentam de tamanho e o

mioncleo se move para a periferia da fibra. Sob condies normais o msculo

regenerado no pode ser diferenciado morfologicamente nem funcionalmente

(Figura 4C) (Charge & Rudnicki, 2004).


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9

Figura 4: Estgios de regenerao do tecido muscular.

A Representao grfica dos estgios de uma cintica de regenerao incluindo ativao de

clulas satlites (2 horas aps a injria), proliferao de clulas satlites, diferenciao(caracterizado pelas miofibras centronucleadas) e maturao. B - Corte histolgico de msculo

corado por HE 5 dias aps inoculao de cardiolipina (cabea de seta - fibras

centronucleadas). Aps 2 semanas (C ) as fibras j restauraram a citoarquitetura e apresentam

nucleao perifrica (cabea de seta) (Shi & Garry, 2006)

1.4 PROGENITORES MIOGNICOS

1.4.1 Clulas Satlites:

As clulas satlites foram primeiramente descritas em 1961 por Alexander

Mauro como mioblastos adormecidos, localizados entre a lmina basal

muscular e o sarcolema da fibra muscular, que no sofreram total

desenvolvimento embrionrio e que so capazes de retomar esse programa de

miognese em resposta a uma leso muscular (Mauro, 1961). As clulas

Matura o

Diferenciao

Prolifera o

Ativao

Dias aps injria


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10

satlites ainda so encontradas em abundncia logo aps o nascimento,

correspondendo em camundongos a 30% dos ncleos musculares

sublaminares (Cardasis & Cooper, 1975; Chen & Goldhamer, 2003). Contudo,

aps o nascimento, essa proporo diminui para menos de 5% no camundongo

adulto e continua a cair lentamente aps a puberdade (Chen & Goldhamer,

2003; Charge & Rudnicki, 2004).

No msculo normal clulas satlites so normalmente quiescentes e

expressam marcadores como Pax-7+, CD34 e M-caderina (revisado em

Zammit et al., 2006). Inicialmente, achava-se que Pax-7 era essencial para

especificao de clulas satlites, porque camundongos mutantes nocaute

para Pax-7 pareciam no possuir clulas satlites porm possuam

comprometimento da regenerao muscular. Contudo clulas satlites podem

ser detectadas na ausncia de Pax-7, porm sua manuteno e proliferao

parece ser defeituosa, sugerindo que Pax-7 possua um importante papel anti-

apopttico (Relaix et al., 2006).

Clulas satlites quiescentes no expressam nveis detectveis de

nenhum dos MRFs. Aps a injria e/ou ativao, a expresso de MyoD

induzida em 12 horas, antes mesmo da expresso de PCNA (antgeno nuclear

de proliferao celular), um marcador para proliferao celular. A expresso de

miogenina ocorre tardiamente durante a fuso e diferenciao (Figura 5).

Anlise da expresso gnica de clulas satlites individuais ativadas, mostrou

inicialmente a expresso de Myf-5 ou MyoD, seguida da coexpresso desses

marcadores durante a fase proliferativa e de miogenina e MRF-4 na fase de

diferenciao terminal (Cornelison & Wold, 1997; Charge & Rudnicki, 2004).Clulas satlites que mantm a expresso de Pax e diminuem expresso de


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11

Myo-D, reconstituem o compartimento de clulas satlites (figura 5) (Zammit et

al., 2006).

Figura 5: Regulao molecular da regenerao do tecido muscular .

Durante o crescimento ps-natal e regenerao do msculo adulto, clulas satlitesquiescentes tornam-se ativadas, proliferam e se diferenciam em novas fibras musculares ouretornam ao estado de clulas satlites. Este ciclo orquestrado por fatores miognicos comoindicado. Na ausncia de Pax-7, as clulas satlites morrem. Modificado a partir deBuckingham, 2006

As clulas satlites miognicas, apesar de serem mais diferenciadas que as

clulas tronco ainda apresentam plasticidade. Experimentos in vitromostraram

a capacidade de linhagens mioblsticas expressarem em diferentes condies

de cultivo, marcadores caractersticos da diferenciao de tecido sseo e

adiposo (Runx2e PPARy, respectivamente), com diminuio da expresso de

MyoD. Isto no s mostra o seu carter plstico, mas a importncia do

microambiente para a remodelagem do tecido muscular lesionado (Chen &

Goldhamer, 2003).

Mioncleo

Fibramuscular

Lminabasal Clula satlite


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12

A ativao e regenerao do tecido muscular so influenciadas por

interaes intercelulares, com a matriz extracelular e fatores secretados. A

prpria injria muscular induz a liberao no espao extracelular (Figura 6) de

mediadores da resposta inflamatria e outras molculas biologicamente ativas.

Estudos in vitro tem evidenciado vrios fatores trficos: membros da famlia

FGF (fator de crescimento de fibroblastos), IGFs (fator de crescimento do tipo

insulina), HGF (fator de crescimento de hepatcitos, neurotrofinas e citocinas

como por exemplo TGF (fator de transformao de crescimento) e Interleucina-

6 (Hawke & Garry, 2001; Charge & Rudnicki, 2004).


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13

Figura 6- Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites (Hawke & Garry,

2001)

EGF - Fator de crescimento para endotlio, FGF - Fator de crescimento para fibroblasto, HGF Fator de crescimento de hepatcito, IGF-I - Fator de crescimento tipo insulina 1, IGF-II - Fatorde crescimento tipo insulina 2, IL-6 - Interleucina-6, LIF - Fator de inibio da migraomacrfago, NO - xido Ntrico, PDGF - Fator de crescimento derivado de plaqueta, TGF- -Fator de crescimento de transformao-.

1.4.2 Contribuio de outras clulas miognicas no reparo do tecido

muscular

Nos ltimos anos, vrios trabalhos tm mostrado que outras populaes

celulares podem participar da regenerao muscular. Os experimentos de

Ferrari e colaboradores mostraram que aps um transplante de medula ssea,clulas derivadas do doador so capazes de participar da regenerao do

MacrfagosNeutrfilosLinfcitos TPlaquetas

Resposta imune

LIFIL-6PDGFCitocinasIGF-IIGF-IIFGFTGF-

Outros fatores Neurnio motor

TestosteronaNO

NeurotransmissoresFatores neurotrficos

Vasculatura Fatores autcrinos

IGF-IIGF-IITGF-HGFFGF

EGF

PDGFIGF-IIGF-IIEGFHGF

Clulasatlite


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tecido muscular (Ferrari et al., 1998). Apesar das clulas derivadas da medula

ssea contribuir bem menos que as clulas satlites, este experimento criou

enorme interesse no potencial de diferenciao plstico e na possibilidade de

novas estratgias teraputicas. Essas populaes residem no msculo

esqueltico ou podem ser recrutadas de compartimentos no musculares em

resposta injria e regenerao (figura 7).

As SP (side population), caracterizadas pela expresso de Sca-1high e

CD45low ,constituem uma populao de clulas progenitoras residentes nos

tecidos adultos (medula ssea; msculo esqueltico). Estas clulas aumentam

em nmero aps a injria e participam na regenerao (Meeson et al., 2004).

MDSC (muscle-derived stem cells) so outra populao de clulas tronco com

potencial miognico isoladas do msculo esqueltico adulto expressando os

marcadores Sca-1 e CD34 (revisado em Shi & Garry, 2006).


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Figura 7: Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao muscular.

A maioria das clulas satlites (Pax3+/Pax7+) derivada do somito. Clulas progenitoras quetambm contribuem para o pool de clulas satlites e regenerao muscular incluem: clulas

intersticiais (muscle derived stem cells ou MDSC, SP, CD45+/Sca-1+, Sca-1+, CD34+); clulas

de medula ssea (clulas tronco hematopoticas, clulas tronco mesenquimais, clulas

progenitoras adultas multipotentes) e progenitores vasculares (Shi & Garry, 2006)

Existe evidncia experimental que progenitores associados a vasos

derivados da aorta dorsal apresentam potencial miognico e so capazes de

participar da regenerao muscular. Outros componentes vasculares como

progenitores endoteliais e pericitos tambm apresentam potencial miognico

(Shi & Garry, 2006). As MDSCs residentes no msculo esto intimamente

associadas a vasculatura, especificamente aos capilares ao redor da fibra,apesar de tambm serem encontradas sob a lmina basal das miofibras, um

Miofibra

Clula satlite

Clulasintersticiais

Progenitoresvasculares

Mioncleo

MiofibraCls de m. ssea


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stio preferencial das clulas satlites. Tanto as clulas endoteliais como 60%

das MDSCs so CD34+Sca1+ sugerindo serem subpopulaes de clulas

endoteliais. Essas clulas se diferenciariam em clulas do endotlio vascular e

fibras do msculo esqueltico aps serem implantadas no msculo (Peng &

Huard, 2004).

As clulas precursoras miognicas no somente contribuem para

regenerar miofibras no msculo lesionado, mas tambm so capazes de

reconstituir o compartimento de clulas satlites. Contudo, a freqncia muito

baixa (mesmo na injria) comparando-se com o nmero de mioblastos

derivados de clulas satlites. O aumento do recrutamento dessas clulas para

a leso atravs do aumento da expresso local de IGF-1 ou SDF-1 no

aumentou o nmero de mioncleos originados do doador (Askari et al., 2003;

Musaro et al., 2004). Por isto, importante investigar os mecanismos e sinais

envolvidos na fuso ou transdiferenciao a fim de propor novas estratgias

para aumentar a eficincia da converso de outras clulas precursoras (Long et

al., 2005).

1.5 PARTICIPAO DA INFLAMAO NO REPARO TECIDUAL

O dano tecidual inicia uma invaso rpida e seqencial de clulas

inflamatrias que persistem por dias ou meses, enquanto ocorre a regenerao

e/ou reparo do tecido (figura 8). A participao da inflamao no reparo um

fenmeno complexo e nem sempre benfico para o tecido. Mesher e Neff

propuseram que a evoluo do sistema imune de mamferos gerou interaes

celulares inflamatrias nos stios de injria proporcionando maior defesa contra

microorganismos e facilitao do reparo tecidual, embora prejudicando a


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capacidade regenerativa do tecido. A leso normalmente est associada

formao de tecido cicatricial e fibrose, sendo este fenmeno um resultado

direto das interaes inflamatrias do sistema imune e fibroblastos no stio da

injria (Mescher & Neff, 2005).

Figura 8 - Cintica da migrao celular nas fases da leso tecidual (Witte & Barbul, 1997)

Os macrfagos e neutrfilos possuem papel importante na injria, pela sua

atividade microbicida e fagoctica de modo a garantir no s a destruio deagentes infecciosos, mas promovendo a remoo de debris celulares que

possam amplificar a inflamao e atrapalhar o processo de reparo do tecido.

Entretanto, em modelos de leso muscular j foi mostrado que neutrfilos

podem promover dano muscular atravs da produo de molculas citotxicas

e citolticas (Tidball, 2005). Alm da atividade fagoctica, os macrfagos

secretam citocinas, fatores de crescimento e xido ntrico (NO), agentes que

Coagulao

Inflama o

Mi ra o/ rolifera oRemodela em

Nmero de. clulas

Fibroblastos

Linfcitos

Dias aps ferida

PlaquetasNeutrfilos

Macrfagos


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esto envolvidos em diversos processos necessrios para o reparo em

diferentes tecidos como por exemplo: pele, tecido muscular, fgado, endotlio e

pulmo (Shi et al., 1997; Cowin et al., 1998; Oliveira et al., 2000; Sandler et al.,

2003; Park & Barbul, 2004).

Citocinas e fatores de crescimento regulam a quimiotaxia e proliferao

de fibroblastos, a sntese de colgeno e a angiognese (Granstein et al., 1987;

Gillery et al., 1992; Park & Barbul, 2004). A liberao de NO regula a formao

de colgeno, a proliferao celular e a contrao da leso em modelos animais

de reparo tecidual (Hesse et al., 2001; Witte & Barbul, 2002; Park & Barbul,

2004). No msculo esqueltico j foi mostrado que macrfagos so essenciais

para desencadear o processo de regenerao aps transplante de mioblastos

(Lescaudron et al., 1999). Alm disso, meio condicionado de cultura de

macrfagos peritoneais pode aumentar a proliferao de mioblastos in vitro

bem como o nmero de clulas expressando Myo-D. Entretanto os

mecanismos envolvidos nesses processos no so claros (Tidball, 2005).

Clulas do sistema imune inato possuem mecanismos para integrar a

resposta imune e reparo tecidual, incluindo uma variedade de receptores de

superfcie como Toll (TLRs) que reconhecem todas as classes de

microorganismos invasores como tambm protenas de choque trmico que

so liberadas do tecido necrosado ou danificado. A ligao a tais receptores

ativa a sntese de citocinas que amplificam a inflamao, aumentando a

resposta a microorganismos e promovendo o reparo tecidual. Receptores Toll

foram primeiramente descritos em drosfilas controlando o padro dorso-

ventral nos embries em desenvolvimento porm TLR de vertebrados possuiefeitos alm do reconhecimento imune (Mescher & Neff, 2005), isto porque a


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via TLR de clulas imunes induz a expresso de muitos genes diretamente

envolvidos no reparo tecidual, incluindometaloproteases, citocinas e fatores

angiognicos (Li et al., 2001).

O papel dos linfcitos na inflamao e reparo tecidual complexo e

ainda pouco compreendido. No existem evidncias claras da participao

direta de linfcitos B no reparo tecidual contudo imunoglobulinas reativas

facilitam na remoo do tecido lesionado facilitando a fagocitose e/ou

citotoxicidade por macrfagos (Casadevall & Pirofski, 2003; Park & Barbul,

2004). Os linfcitos T podem participar do processo de reparo, tanto

propiciando a melhora tecidual como amplificando a leso, direcionando o

processo para uma remodelagem no funcional, que peculiar a cada tipo de

tecido (Kovacs & DiPietro, 1994; Sandler et al., 2003). Ablao do timo em

ratos aumenta a maturao de feridas e a produo de um colgeno mais

fibroso com alto grau de hidroxilao (Barbul et al., 1982). Esse efeito inibido

por enxerto de timo na cavidade peritoneal. Camundongos nude atmicos,

independentemente da linhagem de origem, produzem cicatrizes mais finas,

quase indistinguveis do tecido normal adjacente, associadas com a diminuio

de clulas T CD8+ das leses (Gawronska-Kozak et al., 2006). Neste sentido,

Morrison e colaboradores mostraram que o acmulo de colgeno intramuscular

no camundongo mdx, modelo murino de distrofia muscular, muito

influenciado pela presena de linfcitos T (Morrison et al., 2000).

A contribuio de clulas T CD4+ no reparo tecidual seria principalmente

pela secreo de citocinas. Durante a inflamao ou infeco, linfcitos T so

polarizados em clulas efetoras Th1 e Th2 com perfis distintos de produo decitocinas. As chamadas citocinas Th1 incluem IFN-, IL-2, IL-12, IL-18 e


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produzem imunidade celular por ativar clulas T citotxicas, NK e macrfagos.

Citocinas Th2, notadamente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 estimulam uma resposta

imune humoral. Vrios autores sugerem que citocinas Th1 promovem

regenerao da arquitetura do tecido normal, enquanto citocinas Th2

favorecem a ativao de fibroblastos, produo de colgeno e fibrognese

(Sime & O'Reilly, 2001; Azouz et al., 2004). Essas citocinas podem ser

produzidas tambm por outras clulas incluindo fibroblastos, macrfagos e

mastcitos (Sime & O'Reilly, 2001). A influncia do perfil de citocinas na

induo de fibrose evidente no modelo de leso heptica, onde

camundongos BALB/c com padro Th2 apresentam intensa fibrose aps leso

heptica ao contrrio dos camundongos C57BL6 com padro tpico Th1, que

apresentam menos fibrose. O envolvimento das citocinas na induo de fibrose

foi mostrado pelo tratamento destes animais com anticorpos neutralizantes

para IL-4 ou com IFN-exgeno resultando na atenuao da fibrose (Shi et al.,

1997). IFN- um potente inibidor da proliferao de fibroblastos e da sntese

de colgeno e tambm um regulador positivo da ao dos macrfagos (Shffer

& Barbul, 1998). IFN- inibe a sinalizao do TGF-1 que um estimulador de

fibrose, sendo assim, reduz a formao de fibrose e aumenta a cicatrizao.

Recentemente foi mostrado que a inoculao de IFN- reduz a fibrose e

melhora o reparo do tecido muscular no modelo de leso muscular lacerante

(Foster et al., 2003). A remodelagem tecidual associada com padro Th2 induz

um aumento na produo de colgeno por vrios mecanismos, contudo IL-13

parece ser o mediador crucial atravs da estimulao da produo de TGF-1

por macrfagos. Outro mecanismo provvel de ao de Th1 no reparo


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atravs da induo da expresso de iNOS em macrfagos, uma vez que regula

a produo de colgeno (Hesse et al., 2001).

TGF-, citocina produzida principalmente por fibroblastos, algumas

clulas epiteliais, macrfagos e linfcitos T indiscutivelmente, o regulador de

fibrose mais intensivamente estudado (Mescher & Neff, 2005). In vitro, o TGF-

um potente quimioatraente para fibroblasto que estimula a sntese de

colgeno e fibronectina (Shffer & Barbul, 1998). Existem 3 isoformas de TGF-

em mamferos TGF-1, -2 e -3. A fibrose tecidual principalmente

atribuda a isoforma 1. TGF-1 uma citocina armazenada na forma inativa,

como um homodmero que no covalentemente acoplado a uma protena

associada latncia (LAP). A ligao da citocina aos seus receptores requer a

dissociao do LAP, um processo catalisado por vrios agentes, entre eles

plasminognio, trombospondina e MMPs (metaloproteases). Alm da induo

da produo de TGF-1 latente, a IL-13 ativa TGF- ao regular a expresso de

MMPs que clivam o complexo TGF /LAP. No msculo, a cascata fibrognica

tambm iniciada por TGF-1 e recentemente foi mostrado que este induz

clulas precursoras miognicas a se diferenciarem em miofibroblastos no

msculo lesado (Li et al., 2004). Sabe-se que o TGF- inibe a diferenciao

das clulas miognicas e impede a expresso do MyoD (Tidball, 2005). O

processo de fibrose uma das etapas patolgicas mais importantes da

regenerao muscular. Acredita-se que a fibrose ocorra em resposta ao

estmulo de mediadores inflamatrios como o TGF-, que acelera a deposio

e sntese da matriz extracelular mas inibe a sua degradao (Li et al., 2004). O

aumento da expresso de TGF-1 acarreta na diferenciao de mioblastos em

clulas fibrticas mas o tratamento com decorina, um inibidor do TGF-1, evita


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esse processo (Li et al., 2004). O papel do TNF- na leso muscular e

regenerao pode variar com o tipo, a gravidade, localizao e estgio da

leso.(Tidball, 2005). J foi visto que TNF- capaz de inibir a sntese de

colgeno e fibronectina pelos fibroblastos e diminuir a proliferao das clulas

endoteliais (Shffer & Barbul, 1998). TNF- tambm aumenta a proliferao e

a agregao de mioblastos. Em contraste o TNF inibe a expresso dos fatores

de transcrio MyoD e miogenina, que regulam a atividade de genes

especficos como genes de protenas de miofilamentos, e bloqueia a sntese demRNAs de marcadores de diferenciao miognicos como -actina (Szalay et

al., 1997).

Fibroblastos e outras clulas estruturais expressam o receptor de

superfcie CD40 e so por isto capazes de receber ativao adicional por

CD40L na superfcie de linfcitos T helper, mastcitos, basfilos eosinfilos e

plaquetas. A sinalizao via CD40 em fibroblastos ativa o fator de transcrio

NF-b que em fibroblastos estimula a sntese de citocinas adicionais,

componentes da matriz extracelular (ECM) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). COX-

2 em fibroblastos induz a produo de PGE2 (protraglandina E2). PGE2 alm

de estimular vrios aspectos da inflamao como dor e febre tambm estimula

a produo de citocinas Th2 promovendo a fibrose (revisado em Mescher &

Neff, 2005) - ver Figura 9.


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Figura 9 Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual. (Sime & O'Reilly,

2001)

1.6 METALOPROTEASES NA REGENERAO E REPARO DO TECIDO

MUSCULAR

Durante a degenerao e regenerao do msculo esqueltico ocorre

uma remodelagem da ECM. Esse processo coordenado

pelasmetaloproteases (MMP) e serino-proteases endopeptidases dependentes

de ons Zn+2 e/ou Ca+2 com estrutura molecular composta por pelo menos de

trs domnios: um peptdeo sinal de aproximadamente 20 aminocidos; um pro-

peptdeo que mantm a latncia da protena por possuir uma conformao

especfica entre cistenas e um on Zn+2 contendo aproximadamente 80

aminocidos e um stio cataltico de aproximadamente 170 aminocidos

Injria e inflamao

Tipo I

Tipo II

Resoluonormal

Fibrose e acmulo de miofibroblastosDeposio de ECM

Destruio da citoarquiteturaAlterao de funo

Fibrose


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(Goldman et al., 2003).A expresso e atividade das MMPs so reguladas tanto

ao nvel de transcrio pelas citocinas e fatores de crescimento e a nvel ps-

traduo, pela secreo dessas enzimas em formas latentes (pr-pr-MMP) e

ativao de zimognios (pr-MMP) por integrinas e proteases presentes tanto

no meio extracelular como as associadas membrana celular (Lafreniere et al.,

2004). Existe um balano delicado entre a produo endgena de inibidores

teciduais TIMPs (inibidores de MMP no tecido) e a produo de MMP no

microambiente determinando a remodelagem fisiolgica ou destruio

patolgica do tecido (Nagase et al., 2006).

Existem cinco famlias demetaloproteases: as gelatinases, as

colagenases, as estromelisinas, as metaloelastases e asmetaloproteases de

membrana que so protenas integrais de membrana. Sua ativao se d em

duas etapas. Primeiramente ocorre uma clivagem inicial por ativadores como

citocinas, hormnios, fatores de crescimento e NO desestabilizando a

coordenao entre o Zn+2 e as cistenas, e em seguida ocorre uma clivagem

final geralmente por outra MMP liberando o radical amino terminal da enzima

madura (Johnson et al., 1998).

Durante o processo inflamatrio as MMPs so produzidas por quase

todas as populaes recrutadas, alm estarem aumentadas nas clulas

residentes como miofibras prximas a uma leso e em progenitores como as

clulas satlites (Kherif et al., 1999). As MMPs participam do processo

inflamatrio regulando a atividade das citocinas e quimiocinas e modulando a

sua biodisponibilidade, uma vez que estas esto aderidas a matriz extracelular

(Roach et al., 2002). Como exemplo podemos citar a MMP-2, que capaz declivar a quimiocina CCL7. A quimiocina clivada ainda capaz de se ligar aos


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seus receptores, porm perde sua capacidade quimiottica e atua como

antagonista de todas quimiocinas que se ligam aos mesmos receptores que a

CCL7. Por outro lado a MMP-8 quando cliva a quimiocina CXCL5 gera diversos

peptdeos com ao quimiottica para neutrfilos (Parks et al., 2004).

As MMP-9 (gelatinase A) e MMP-2 (gelatinase B) constituem as

principaismetaloproteases envolvidas no reparo do tecido muscular (Kherif et

al., 1999; Carmeli et al., 2004). A MMP-9 est associada com a migrao de

clulas inflamatrias e possivelmente ativao de clulas satlites, enquanto

a MMP-2 constitutiva do tecido muscular, mas est aumentada durante o

processo de regenerao muscular (Kherif et al., 1999). Em camundongos

C57BL10 com leso muscular induzida por cardiotoxina, a MMP-9 est muito

aumentada durante o auge da inflamao com predomnio de macrfagos e

neutrfilos (Kherif et al., 1999). A partir da segunda semana, os nveis de MMP-

9 diminuem e a MMP-2 atinge o mximo. A expresso de MMP-2, presente de

forma constitutiva no tecido muscular, regula a integridade e composio da

composio da ECM, e tambm a proliferao e diferenciao de mioblastos

(revisado em (Carmeli et al., 2004).A participao de MMP-2 durante a fuso

de mioblastos deve-se em parte degradao de colgeno tipo IV como

tambm outros componentes da membrana basal como a entactina (Kherif et

al., 1999).

1.7 MODELOS ANIMAIS DE INJRIA MUSCULAR

Os modelos animais de injria muscular (mecnicos, fsicos ou

qumicos) tm sido utilizados com o intuito de trazer uma melhor compreenso


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na dinmica da leso e reparo do tecido muscular (Hawke & Garry, 2001). O

modelo de leso muscular pelo esmagamento muito utilizado para estudar

fatores que influenciam a fibrose. Outros modelos tambm muito utilizados so

a denervao (Mussuni et al., 1987) e induo de leso por congelamento

(Creuzet et al., 1998). Para estudar o processo de regenerao muscular de

forma controlada e reproduzvel utilizam-se as miotoxinas, entre elas a

cardiotoxina (CTX), notexina (NTX) e bupivacana. Essas toxinas tm uma

ampla gama de atividades biolgicas, que no so completamente conhecidas.

A cardiotoxina um peptdeo extrado do veneno de cobra que induz a

desorganizao do sarcolema. NTX uma fosfatase A2 neurotxica tambm

retirado do veneno de cobra que bloqueia a transmisso neuromuscular

inibindo a liberao da acetilcolina. CTX induz uma forma bastante reproduzvel

de leso muscular, porm ainda no so conhecidos os efeitos dessa toxina

sobre os vrios tipos de clulas musculares, incluindo as miognicas

progenitoras (Charge & Rudnicki, 2004).

Bupivacana, um anestsico muito utilizado em obstetrcia, induz um

processo de regenerao muscular com etapas bem definidas de mionecrose e

inflamao seguida de regenerao do tecido muscular. Neste modelo

normalmente aps 10 dias de induo da injria ocorre estabilizao da

arquitetura tecidual (Hawke & Garry, 2001; Sandri, 2001; Charge & Rudnicki,

2004). A regenerao rpida neste modelo devido preservao das clulas

satlites, do suprimento sanguneo e da inervao (Nonaka et al., 1983). A

bupivacaina induz necrose, e em menor extenso, apoptose das miofibras pelo

aumento de clcio intracelular (Zink & Graf, 2004). As clulas satlites parecem


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mais resistentes ao lesiva da bupivacana do que as clulas musculares

maduras (Nonaka et al., 1983).

Modelos de animais de laboratrio com degenerao anormal devido a

desregulao espontnea ou artificial de genes especficos tambm so de

grande interesse. Por exemplo, o camundongo mdx comumente usado como

modelo animal da distrofia muscular de Duchenne (DMD) e como um modelo

alternativo de degenerao para estudo do reparo muscular. Esses animais

apresentam uma mutao no cromossoma X o que determina a no expresso

de distrofina, uma protena localizada internamente no sarcolema associada ao

citoesqueleto, essencial para manter a integridade da fibra muscular. Os

camundongos mdx apresentam miopatia inflamatria com ciclos de mionecrose

e regenerao do tecido muscular (De la Porte et al., 1999). Ao contrrio dos

camundongos mdx, a doena fatal nos humanos, sendo este modelo animal

muito utilizado para estudar os fatores que influenciam a regenerao do tecido

muscular. Existem ainda outros modelos com particularidades genticas, onde

se estuda a regenerao em camundongos deficientes de genes miognicos

como Pax7 e MyoD e transgnicos para fatores sistmicos com influncia no

crescimento muscular como IGF-1 (Charge & Rudnicki, 2004).


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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Analisar a influncia do microambiente no processo de regenerao muscular

em linhagens de camundongos com padro de citocinas Th1 ou Th2 utilizando

o modelo de induo de leso muscular da bupivacana.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Comparar as alteraes histolgicas na rea da leso induzidas por

bupivacana entre as linhagens de camundongos BALB/c e C57.

Analisar a expresso de colgeno na leso atravs da coloraoespecial de picrosirius

Caracterizar por imuno-histoqumica as clulas mononucleares do

infiltrado celular presente na leso.

Caracterizar por citometria de fluxo os subtipos de linfcitos nos

linfonodos de drenagem do tecido muscular lesionado

Analisar a atividade das metaloproteases MMP-2 e MMP-9 no

msculo lesionado pela tcnica de zimografia

Analisar a expresso do mRNA para citocina TGF- no msculo

lesionado atravs da tcnica de RT-PCR.


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3. MATERIAL & MTODOS

3.1 Animais

Nos experimentos foram utilizados camundongos machos isognicos na

idade de 5 a 6 semanas das linhagens C57BL10, C57BL6, BALB/c. Os animais

foram mantidos em ambiente refrigerado (20 C) e aclimatado com ciclo de

iluminao 12:12 horas, no Biotrio da Fundao Oswaldo Cruz e no Biotrio

de Patologia Celular do Instituto de Biologia da UFF. Os animais foram

mantidos em gaiolas de prolipropileno forradas com maravalha peneirada e

autoclavada recebendo rao Nuvital (Curitiba, Brasil), suplementao

alimentar (farelo de trigo e semente de girassol) e vitamnica (Vitagold), gua

filtrada ad libitum.

3.2 Induo da leso muscular

A leso muscular foi induzida nos animais saudveis pela inoculao de

34l de cloridato de bupivacana a 0,5% diludo em salina estril (Mussuni et

al., 1987) no msculo Triceps brachiide ambos os membros. A inoculao foi

realizada com seringa Hamilton de 100L acoplada a dosador mecnico. Os

grupos controle e sham foram submetidos s mesmas condies experimentais

porm inoculados com PBS. Os animais foram sacrificados com vapor de CO2

1, 4 , 8 e 12 dias aps a induo de leso. O msculo T.brachiifoi processado

adequadamente para realizao das tcnicas de histologia, imuno-


48/102

30

histoqumica, zimografia, PCR e western blot e os linfonodos braquial e axilar

para citometria de fluxo.

3.3 Processamento histolgico

Para o processamento histolgico os msculos foram fixados durante 24

horas em formol tamponado Milloning a 10% pH 7,2. Os tecidos foram

desidratados em solues com concentrao crescente de lcool etlico (70%,

80%, 90%) num perodo de 60 minutos cada, passados 3 vezes em lcool

absoluto e 3 vezes em Xilol (Reagen). A impregnao e incluso em parafina

(paraplast, Sigma, USA) foi efetuada em duas incubaes durante 1 hora a 60

C. Os msculos foram clivados e includos transversalmente com as pores

centrais do fragmento posicionadas mais externamente no bloco. Foram feitos

em mdia 10 cortes de 5m de espessura no micrtomo Spencer 820

(American Optical, EUA) aps chegar no nvel da leso muscular. Os cortes

foram colocados em lminas de microscopia desengorduradas e previamente

filmadas com soluo de glicerol-albumina (0,5%), mantidos em estufa a 37C

durante 12 horas e submetidos s coloraes histolgicas de hematoxilia-

eosina (HE), Picrosrius e Giemsa.

3.4 Imuno-histoqumica

O msculo T. brachii foi cuidadosamente removido, congelado em

nitrognio lquido e includo em OCT (Sakura, EUA). Cortes de 5 m de

espessura foram colocados em lminas desengorduradas e previamente

filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chem. Co, Mo, EUA). Aps a fixao por 10


49/102

31

minutos em acetona a -20C, os cortes foram mergulhados em soluo de

salina-fosfato tamponada (PBS pH 7,2) por 5 minutos. A inibio da peroxidase

endgena foi feita com 3% perxido de hidrognio (Merck do Brasil) por 30

minutos. Os cortes foram hidratados com PBS por 5 minutos e, posteriormente

feito o bloqueio de antgenos inespecficos incubando com PBS contendo 2%

de albumina bovina (BSA frao V, Sigma Chem. Co., EUA) durante 30

minutos a 37C. A seguir os cortes foram incubados com os anticorpos

primrios diludos em PBS (30l) por 1 hora a 37C (ver tabela 1). Aps trs

lavagens sucessivas de 5 minutos com PBS, os cortes foram incubados em

cmara mida com anticorpo secundrio apropriado diludo em PBS (30l) por

uma hora temperatura ambiente. Aps novas lavagens com tampo PBS, a

revelao da peroxidase foi feita com aminoetilcarbazol (AEC, Sigma Chem.

Co., EUA) na presena de 3% de perxido de hidrognio (Merck do Brasil).

Todos os cortes foram contra-corados suavemente com hematoxilina de Mayer

por 2 minutos e montados em meio de montagem a base de gelatina.

Tabela 1: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na imuno-histoqumica.

Anti-CD4.biotina rato Caltag 1/80

Anti-CD8.biotina rato Caltag 1/80

Anti-F4-80 rato Serotec 1/40

Anti-Mac-1.biotina rato Pharmingen 1/30

Anticorpos monoclonais Origem Fonte Diluio


50/102

32

3.5 Histomorfometria

Nas lminas com colorao para Picrosrius foi realizada a quantificao do

percentual de rea de depsito de colgeno por rea de leso com o programa

Analisys (Soft Image System, Alemanha). Foram escolhidos 3 campos

aleatrios em cada anlise.

3.6 Citometria de fluxo

Os linfonodos braquiais e axilares dos camundongos controles, sham e

inoculados foram cuidadosamente retirados e dissociados com o auxlio de

pinas finas e tamiz de nylon em meio de cultivo RPMI 1640 (Sigma Chem.

Co., EUA) contendo 2% de soro bovino fetal (Cultilab, So Paulo, Brasil). Aps

a determinao da celularidade atravs de contagem em cmara de Neubauer,

106 clulas foram incubadas com PBS contendo 10% de soro normal de

camundongo e 2% de soro bovino fetal durante 10 minutos para evitar ligaes

no especficas. A tripla marcao foi feita pela incubao das clulas com os

anticorpos monoclonais na diluio apropriada previamente determinada

(Tabela 2) durante 20 minutos a 4C. As clulas foram ento lavadas duas

vezes em PBS contendo 2% de soro bovino fetal, recolhidas em tubos efixadas em PBS contendo formol 1% e azida sdica 0,05% e analisadas num

FACScalibur (Becton Dicknson, San Diego , EUA). A regio de clulas vivas

foi determinada usando os parmetros de foward versus side scatter e foram

coletados 10000 eventos em cada amostra. Para a anlise dos dados foi

utilizado o software Winiwind verso 2,8 (Scion Corporation, EUA).


51/102

33

Tabela 2: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na citometria de fluxo.

Anticorpos monoclonais Fluorocromo Fonte Diluio

Anti-CD3 Fitc Pharmingen 1/300

Anti-B220 Fitc Pharmingen 1/400

Anti-CD4 Pe Pharmingen 1/300

Anti-CD8 Spectral red Southern 1/600

Anti-CD25 Fitc Sigma 1/5

Anti-CD62L Fitc Pharmingen 1/100

Anti-CD44 Fitc Pharmingen 1/50

3.7 RT-PCR

3.7.1 Extrao de RNA total

O RNA total foi isolado pelo mtodo de TRIzol Reagent (Invitrogen,

CA, EUA). Os msculos foram homogeneizados na proporo de 50mg de

tecido para 1000l de Trizol e centrifugados a 12.000 xg por 10 minutos a 4C

para remover o fragmento de tecido no dissolvido. Os sobrenadantes foram

congelados a -20C at o momento de uso. Aps serem descongelados, foi

adicionado 200l de uma soluo de clorofrmio/ lcool isoamlico na

proporo 24:1 (v:v) seguindo-se nova homogeneizao. Aps 10 minutos no

gelo, a mistura foi centrifugada a 12.000 xg por 15 minutos a 4C. A fase

aquosa foi coletada e transferida para outro tubo contendo o mesmo volume de

isopropanol (Merck do Brasil). As solues foram agitadas at a

homogeneizao, armazenadas a -20C por no mnimo 3 0 minutos e


52/102

34

centrifugadas novamente a 14.000 xg por 20 minutos a 4C. O pellet foi lavado

com 600l de etanol gelado a 70% e submetido nova centrifugao de 14.000

xg por 15 minutos a 4C. O RNA foi dissolvido em 15 l de H2O livre de RNAse

e estocado a -70C.

3.7.2 Eletroforese de RNA

Aps a extrao do RNA total, a sua integridade foi verificada em gel

desnaturante de agarose-formaldedo 1,2%. A amostra de RNA (5l) foi diluda

em 10l de formamida (Merck do Brasil), 4l de tampo MOPS 5X (Invitrogen,

Brasil), 1,3l de 37% formaldedo (Merck do Brasil), 1l de (1l/ml) brometo de

etdio (Sigma Chem. Co., EUA) e 1l de azul de bromofenol (Merck do Brasil),

seguido de incubao por 10 minutos a 65C. A mistu ra foi mantida no gelo at

sua aplicao no gel. A corrida de eletroforese foi feita a 75V por 1 hora em

cuba horizontal (Kodak, EUA). A integridade do RNA foi avaliada no

transiluminador de luz ultravioleta observando-se a integridade das bandas de

RNA ribossomal de 17 e 28S. A pureza e a concentrao do RNA extrado foi

determinada atravs de leitura em espectrofotmetro em comprimento de onda

260 e 280nm. Considerando-se que 1 unidade de DO260 equivale a 40 g/mL

de RNA, foi realizado o clculo da razo entre a DO em 260 e 280nm para

estimar o grau de pureza do RNA total. Somente foi utilizado RNA com a razo

entre 1,6 e 2,0.


53/102

35

3.7.3 Transcrio reversa do RNA e PCR

Foi utilizado o kit SuperScrip One-Step com Platinum Taq (Gibco-BRL

Life Tecnologies, NY, EUA), onde se realiza a produo do cDNA e o PCR

concomitantemente.Em um tubo contendo 1g de RNA foi adicionado 25 l do

Mix de reao 2x, 0,4 l de MgSO4 a 50 mM, 1 l da seqncia de

oligonucleotdeos (primer) sense, 1 l do primer anti-sense, 1 l de

RT/Platinum Taq Mix e completado o volume para 50 l de gua livre de

RNAse (RF). As amostras foram colocadas no termociclador (Amersham,

Inglaterra) a 50C por 30min para sntese do cDNA e a 94C por 2 min para

ativao da Taq e desnaturao do RNA/ cDNA. As amplificaes foram

realizadas em 30 ciclos: desnaturao 94C por 15 s , anelamento 60C por 30s

e sntese em 72C por 3 min. A extenso final foi f eita em 1 ciclo a 72C por 10

min. As amostras foram analisadas em gel de agarose 1,7% contendo 1 g/ml

de brometo de etdio e visualizadas no transiluminador, e o resultado expresso

como razo TGF-/gene constitutivo GAPDH.

. Tabela 3: Lista de oligonucleotdeos:

Sense Antisense

TGF- CAAGGAGACGGAATACAGGGCT CGCACACAGCAGTTCTTCTCTGT

GAPDH GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA TGTTAGTGGGGTCTCGCTCCTG


54/102

36

3.8 Zimografia

3.8.1 Preparo do extrato tecidual

Os msculos inoculados e controles foram coletados e imediatamente

congelados e preservados em nitrognio lquido (-165oC). Os msculos foram

pesados e homogeneizados (1/10, p/v) em tampo de extrao (100 mM Tris-

HCl, pH 7,6, 200mM NaCl, 100mM CaCl2 e 1% Triton X-100) 4oC. Aps a

centrifugao (15.000 xg), o sobrenadante foi dividido em alquotas de 100 l, e

a concentrao protica determinada utilizando-se uma curva padro de

albumina pelo mtodo de Lowry (Lowry et al., 1951). A mesma quantidade de

protena total foi usada para zimografia (60 g/poo).

3.8.2 Gel para zimografia

As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente

descrito (Heussen & Dowdle, 1980) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a

7,5% contendo gelatina do tipo A de pele suna (Sigma Chem. Co, St. Louis,

Mo. EUA) na concentrao de 2 mg/mL e os gis de entrada poliacrilamida 5%

(w/v). A eletroforese foi realizada com a concentrao de 60g de protena para

cada uma das amostras aplicadas nos gis a 165 Volts por um tempo mdio de

60 minutos (Power Pac 200 Bio-Rad, EUA). Aps a eletroforese os gis

foram lavados duas vezes em 2.5% Triton X-100 para total remoo do SDS

seguido de incubao a 37C em tampo contendo o substrato (10 mM Tris

HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl2, ZnCl2 1M ) por 24 horas. SDS o agente

responsvel pela ativao das metaloproteases mesmo na forma inativa semclivagem proteoltica (Talhouk et al., 1991). Os gis foram corados pelo


55/102

37

Coomassie blue R250 (Sigma Chem. Co, EUA) e descorados em soluo

descorante contendo 50% metanol, 10% cido actico e 40% qsp de H2O. A

atividade da gelatinase foi visualizada por bandas no marcadas em um fundo

azul representando reas de protelise no substrato de protena. As

metaloproteases so secretadas na forma latente e necessitam da clivagem do

terminal peptdico NH2 para ativao. A anlise semiquantitativa foi feita

usando o programa de anlise de imagem (Scion Program National Institutes of

Health, Image Program, EUA).

3.9 Anlise estatstica

Microsoft Excel software (Microsoft, EUA) foi usado para calcular

mdias e desvios padres. O teste t de Students foi aplicado para acessar o

nvel de significncia estatstica das amostras.


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38

4. RESULTADOS

4.1 Anlise histolgica da leso muscular

Os animais foram sacrificados 4, 8 e 12 dias aps inoculao (dpi) de

bupivacana. Os msculos Triceps brachiiforam processados e emblocados

em parafina, posteriormente foram feitos cortes de 5 m de espessura no

micrtomo manual. Como coloraes de estudo foram escolhidas o H-E poispermite evidenciar mais claramente a citoarquitetura e a nucleao da

miofibra, e o Giemsa por evidenciar mais claramente as miofibras

regenerando e o infiltrado inflamatrio. Para cada grupo foram utilizados no

mnimo 3 animais.

A anlise histolgica do msculo esqueltico dos camundongos

BALB/c sacrificados no quarto dia aps a inoculao (4dpi), mostrou

grandes reas de leso com predomnio de clulas mononucleares no

infiltrado inflamatrio, mionecrose e perda da citoarquitetura normal da

miofibra (Figura 10D). Os camundongos C57BL6 apresentaram infiltrado

inflamatrio mais intenso e menor alterao da citoarquitetura (Figura 10A).

Pela colorao de Giemsa, podemos observar um grande nmero de

miofibras regenerando evidenciadas pelo citoplasma basoflico e nucleao

central principalmente nos camundongos C57BL6. Inclusive, pode-se

evidenciar nestes animais mioblastos se fusionando para formao de

novas miofibras (Figura 11A). Em 8 dpi (Figura 10E e 11E) camundongos

BALB/c apresentaram miofibras regenerando mas ainda com reas deinfiltrado inflamatrio intenso, contudo em camundongos C57BL6 era


57/102

39

restrito. Em 12 dpi ambas as linhagens de camundongos apresentaram

miofibras regenerando com nucleao central (Figura 10C, 10F, 11C, 11F).


58/102

40

Figura 10 : Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas linhagens decamundongo

Painel com fotomicrografias da leso muscular corada por H-E em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F)dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F).Infiltrado inflamatrio (seta), clulas musculares regenerando (setas largas). dpi (dias apsinoculao)

A

Balb/cB6

4 dpi

8 dpi

12 dpi

D

B

C

A

E

F

0,05mm

0,1mm

0,1mm 0,1mm

0,1mm

0,05mm


59/102

41

Figura 11 : Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo Giemsa

Fotomicrografias da leso muscular em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F) dias aps inoculao de

bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F). Infiltrado inflamatrio(seta fina), clulas musculares regenerando (asterisco). Setas grossas indicam mioblastos comcitoplasma basoflico circundando fibras musculares.

BALB/cB6

4 dpi

8 dpi

12 dpi

0,05mm

D

B

C

0,05mm

*

A

E

F

*

*

*

0,1mm

0,1mm 0,1mm

*

*

**

0,1mm


60/102

42

4.2 Alteraes no microambiente da leso muscular

4.2.1 Colorao de picrosrius

Confirmadas as diferenas entre as leses musculares nas diferentes

linhagens passamos para um estudo mais minucioso das alteraes

observadas. Esse estudo essencial para sabermos os possveis

mecanismos contribuindo para regenerao muscular. O primeiro fator

abordado foi alterao do microambiente quanto produo de colgeno.

Este componente da matriz extracelular exerce papel importante durante o

processo de reparo, influenciando na migrao de leuccitos e no curso da

regenerao, para uma resoluo cicatricial ou mais fisiolgica. Para

visualizao do colgeno escolhemos a colorao de picrosirius que marca

em vermelho as fibras colgenas.

A leso muscular em 1dpi com bupivacana mostrou uma expresso

discreta de colgeno entre as fibras musculares tanto na linhagem C57BL6

(Figura 12A) como BALB/c (Figura 12E), porm intenso depsito de

colgeno prximo aos vasos no camundongo BALB/c (Figura 12E). Aps 4

dias de inoculao com bupivacana essa diferena era bem evidente.

Enquanto os camundongos C57BL6 (Figura 12B) apresentavam maior

regenerao, com vrias fibras com nucleao central e discreta deposio

de colgeno, os camundongos BALB/c (Figura 12F) apresentavam grandes

reas com mionecrose e aumento na deposio de colgeno em relao ao

ponto anterior.


61/102

43

Em 8 (Figuras 12C e G) e 12 dpi (Figuras 12D e 12H) no foi

encontrada diferena na expresso de colgeno entre as miofibras em duas

linhagens

A quantificao do colgeno utilizado o programa Analysis foi realizada

somente dentro das reas de leso, evitando quantificar vasos e as fcias

musculares. Os resultados apresentados na figura 13 mostram que em 1 dpi

no existe diferena na mdia da expresso de colgeno. Contudo, 4dpi aps

inoculao (Figura 13B) foi observado que o percentual da rea de leso

ocupada por colgeno no BALB/c era 5,2 vezes maior do que no camundongo

C57BL6 (p


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44

BALB/cB6

1 dpi

4 dpi

8 dpi

B

A E

F

C

D H

G

12 dpi

0,1mm 0,1mm

0,1mm 0,1mm

0,1mm 0,1mm

0,1mm 0,1mm


63/102

45

Figura 12- Colorao de picrosrius da leso muscular

Fotomicrografias de Trceps brachii coradas com picrosrius em 1 (A, E), 4 (B, F), 8 (C, G) e 12(D, H) dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C, D) e BALB/c

(E, F, G, H). As setas indicam expresso de colgeno na leso e em torno dos vasos prximosa rea de leso. Barra = 0,1 mm; dpi: dias aps inoculao.


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46

Figura 13: Histomorfometria da rea da leso ocupada por colgeno.Representao grfica da quantificao de colgeno pelo programa Analysis na leso em 1 dpi(A) e 4 dpi (B). As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foramincludos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo* p < 0,05.

0

2

4

6

8

10

12

C57BL/06 BALB/C

*

A

B

%

rea

0

2

4

6

8

10

12

C57BL/06 BALB/C


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47

4.2.2 Atividade de metaloproteases no msculo lesionado

Utilizamos a tcnica de zimografia a fim de investigar a atividade da

MMP-9 (100 kDa), pr-pr-MMP-2 (66 kDa), pro-MMP-2 (60 kDa) e a forma

ativa da MMP-2 (55kDa). Foram coletados os msculos Triceps brachii

inoculados com bupivacana de camundongos C57BL6, C57BL10 e Balb/c

aps 1, 4 e 12 dpi. Semelhantemente ao encontrado anteriormente (Kheriff,

1999), os animais controles de ambas as linhagens apresentaram atividade

da pr-pr MMP-2 (MMP-2PP) e da pr-MMP-2 e nenhuma atividade da

MMP-9. A forma ativa da MMP-2 no foi encontrada nas amostras de

msculo dos animais controles e inoculados com bupivacana, mas foi

evidenciada em amostras de msculo de camundongo distrfico mdx

utilizado como controle positivo (Figura 14A).

A atividade da MMP-9, normalmente associada com processo

inflamatrio, somente foi evidenciada nas leses musculares em 1 dpi (figura

14). Quando a atividade da MMP-9 foi comparada entre as linhagens

verificou-se que C57BL10 apresentava um aumento de 3,8 vezes em relao

ao BALB/c. A linhagem C57BL6 tambm apresentou nveis mais altos (2,5

vezes) que o BALB/c, porm esta diferena no foi significativa (figura 15A).A anlise da atividade da pro-MMP2 mostrou atividade prxima a

encontrada no grupo controle e sem diferena significativa entre as linhagens

em 1 dpi, apesar de ser encontrado nveis mais altos no camundongo

C57BL10. Aps 4 dias de inoculao da bupivacana, foi evidenciada maior

atividade da MMP-2 pro em todas as linhagens em relao a 1 dpi, apesar da

forma ativa no ter sido detectada (figura 15B). O estudo comparativo entre


66/102

48

as linhagens mostrou que os camundongos BALB/c apresentavam atividade

1,1 vez menor que C57BL10. Entretanto foi observada uma diferena

significativa entre as duas linhagens de C57, onde C57BL6 apresentava 1,6

vezes (p


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49

Figura 14- Atividade de metaloproteases no msculo esqueltico.Zimografia de msculo esqueltico de camundongos controles e aps 1 (A), 4 (B) e 12 (C) diasaps inoculao de bupivacana. B6 = C57BL6, B10 = C57BL10, BA = BALB/c, c = controle, i=inoculado com bupivacana, mdx = camundongo distrfico.

C

MMP-2 PPMMP-2 Pro

MMP 2 PPMMP 2 Pr

B6i B6i B6i B6 i B10i B10i B10i BAi BAi

Vaso

100 kDa

66 kDa60 kDa

66 kDa60 kDa

B6c B6i B10i B10i B10i BAi BAi BAc mdx

100 kDa

A

MMP 2 PPMMP 2 PrMMP 2 ativa

MMP-9

100 kDa

66 kDa

60 kDa

BBAi BAi BAi BAi B10i B10i B10i B10i B6i B6i

MMP 2 PPMMP 2 Pr


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50

Figura 15: Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esquelticoRepresentao grfica da quantificao da atividade das MMPs pelo programa Scion em 1 (A),4 (B) e 12 (C) dias aps inoculao de bupivacana. As barras representam a mdia e seurespectivo desvio padro. Coluna vinho (C57BL6), amarela (C57BL10) e lils (BALB/c). Foramincludos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo

significativo valores * p < 0,05. UA = unidade arbitrria.

0

10000

20000

30000

40000

B6 B10 Ba

MMP-2 pro

A

C

0

10000

20000

30000

40000

B6 B10 BALB/c

MMP-2 pro

*B

0

10000

20000

30000

40000

MMP9

0

10000

20000

30000

40000

MMP2pro

MMP-9 MMP-2 pro

**

UA

UA

UA


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51

4.3 Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio

As clulas presentes no infiltrado inflamatrio foram caracterizadas pela

tcnica de imuno-histoqumica. Utilizamos anticorpos monoclonais especficos

para Mac-1 para evidenciar clulas mononucleares, F4-80 para macrfagos,

CD4 e CD8 para os linfcitos T. Foram coletados os msculos Triceps brachii

de camundongosC57BL6 e BALB/c inoculado com bupivacana em 4 dpi por

ser o ponto de maior infiltrado inflamatrio. Foram realizados cortes de 5m de

espessura de msculos congelados e emblocados em substncia

criopreservante OCT.

Em 4 dias ps-inoculao no encontramos diferenas quanto aos tipos

celulares presentes no infiltrado inflamatrio entre as linhagens estudadas

(Figura 16). A grande maioria das clulas presentes no infiltrado inflamatrio

expressou intensa marcao para Mac-1, um timo marcador de inflamao,

expresso em nveis variados em vrios tipos celulares como: macrfagos,

neutrfilos e clulas dendrticas (Flotte et al, 1983, Springer et al, 1979). A

marcao foi muito similar quando utilizamos o anticorpo F4-80 que

especfico para macrfagos. Isto indica que macrfagos representam a maioria

das clulas do infiltrado inflamatrio nestes animais. Camundongos BALB/c

apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que

os camundongos C57BL6 (figura 16). Em contrapartida no observamos uma

marcao expressiva para linfcitos T, tanto CD4+ quanto CD8+. Um dado j

esperado porque esta uma fase inicial e possivelmente essas clulas ainda

no foram ativadas.


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52

Figura 16: Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatrio da leso muscular induzidapor bupivacana.Imuno-histoqumica para os antgenos Mac-1, F4-80, CD4 e CD8 na leso muscular noscamundongos C57BL6 (A) e BALB/c (B). As setas evidenciam as clulas com imunomarcaopositiva.

Mac-1

CD4

F4-80

Mac-1 F4-80

CD8

CD4 CD8

0,1mm

0,05mm0,05mm

0,1mm

0,05mm 0,05mm

A

B

0,1mm 0,1mm


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4.4 Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem

Nesta etapa decidimos investigar se mesmo em um perodo inicial da

leso muscular ocorreria alguma interferncia nos rgos linfides de

drenagem muscular. Para isso coletamos os linfonodos axilar e braquial que

fazem a drenagem do msculo Triceps brachii inoculado com bupivacana e

realizamos pela tcnica de citometria de fluxo, a marcao para linfcitos B

(B220), linfcitos T CD4+ e linfcitos T CD8+. Alm disto analisamos a

expresso dos antgenos CD62L, CD44 e CD25 nas subpopulaes de

linfcitos T.

Os camundongos C57BL6 apresentaram celularidade significativamente

maior que os camundongos C57BL10 e BALB/c (p


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54

Figura 17: Celularidade dos linfonodos axilar e braquialAs barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais porlinhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05, **p


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55

Figura 18: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes noslinfonodos de drenagem em 4 dpi.Em A mostramos um histograma com perfil representativo da marcao para B220 e CD3 numcamundongo C57BL6 inoculado com bupivacana.Os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de B220 e CD3 so mostradosnos painis B e C respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desviopadro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t deStudent sendo * p < 0,05.

CD3

0

25

50

75

100

BALB/c B6 B10

percentual

B220

0

25

50

75

100

BALB/c B6 B10

percentual

B220

0

5

10

15

20

25

30

BALB/c B6 B10

nclsx106

CD3

0

5

10

15

20

25

30

BALB/c B6 B10

*

*

BupivacanaSham

A

Controle

B

C


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Camundongos BALB/c inoculados com bupivacana (Figura 19B)

apresentaram aumento significativo (p


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Figura 19: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos T presentes noslinfonodos de drenagem em 4 dpi.A- mostra um perfil representativo da marcao para CD4 e CD8 dentro da populao total nocamundongo BALB/c inoculado (i) e controle no inoculado (c)Em B e C mostramos os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de CD4 e CD8respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As

colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e em amarelo osanimais inoculados com bupivacana.

CD4

0

20

40

60

80

100

BALB B6 B10

percentual

CD8

0

20

40

60

80

100

BALB B6 B10

percentual

A

*

CD4

0

5

10

15

20

BALB B6 B10

ndeclsx106

CD8

0

5

10

15

20

BALB B6 B10

n

clsx106

B

C

*


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Figura 20: Perfis representativos da expresso de CD44 (A), CD25 (B) e CD62L (C)nas clulas T CD4+ de camundongos BALB/c.C= controle no inoculado I = inoculado

B

C

A


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Figura 21: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L,CD44 e CD25 nas clulas CD4+.So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44

(B) e CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foramincludos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t deStudent sendo *

tese de biologia

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