tese corrigida ivani jose da silva

Download Tese corrigida Ivani Jose da Silva

If you can't read please download the document

Post on 07-Jan-2017

217 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • 1

    Ivani Jose da Silva

    Avidez de IgG na Toxoplasmose: padronizao do pH c omo caotrpico para

    quantificao direta de anticorpos de baixa avidez

    Dissertao apresentada ao Instituto de Medicina Tropical de So Paulo da Universidade de So Paulo para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias

    rea de concentrao: Doenas Tropicais e Sade internacional Orientadora: Profa. Dra. Luciana Regina Meireles Jaguaribe Ekman

    So Paulo 2011

    1. 1

  • 2. 1

    3. 1

    4. 1

    5. 1

    6. 1

    7. 1

    8. 1

    9. 1

    10. 1

    11. 1

    12. 1

    13. 1

    14. 1

    15. 1

    16. 1

    17. 1

    18. 1

    Ficha catalogrfica Preparada pela Biblioteca do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo da

    Universidade de So Paulo Reproduo autorizada pelo autor

    Silva, Ivani Jos

    Avidez de IgG na toxoplasmose: padronizao do pH como caotrpico para quantificao direta de anticorpos de baixa avidez / Ivani Jos da Silva. So Paulo, 2011.

    Dissertao (Mestrado) Instituto de Medicina Tropical de So Paulo da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Doenas Tropicais e Sade Internacional Orientadora: Luciana Regina Meireles Jaguaribe Ekman

    Descritores: 1. TOXOPLASMA GONDII. 2. TOXOPLASMOSE. 3. AFINIDADE DE ANTICORPOS. 4. ELISA. 5. TCNICAS IMUNOENZIMTICAS. 6. CAOTRPICO. USP/IMTSP/BIB-01/2011.

  • Universidade de So Paulo

    Instituto de Medicina Tropical de So Paulo

    Candidato: Ivani Jose da Silva

    Titulo da Dissertao: Avidez de IgG na Toxoplasmose: padronizao do

    pH como caotrpico para quantificao direta de ant icorpos de baixa

    avidez

    Orientador: Profa. Dra. Luciana Regina Meireles Jaguaribe Ekman

    A Comisso Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertao de

    Mestrado , em sesso pblica realizada em ......./......../........, considerou

    ( ) APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A)

    Examinador(a)

    Assinatura ..................................................................................................

    Nome....................................................................................

    Instituio ............................................................................

    Examinador(b)

    Assinatura...................................................................................................

    Nome ...................................................................................

    Instituio ............................................................................

    Presidente

    Assinatura ...................................................................................................

    Nome....................................................................................

    Instituio.............................................................................

  • Aos Meus Pais Geraldo e Celita

  • AGRADECIMENTOS

    Ao Programa de Ps Graduao do Instituto de Medicina Tropical, seus funcionrios e professores pela oportunidade e conhecimento

    compartilhado.

    A Profa. Dra. Luciana Regina Meireles sempre presente em todas as etapas com ateno, esforo e compreenso na orientao deste

    trabalho.

    Ao Dr. Heitor de Andrade Junior pelo apoio, incentivo e confiana.

    A minha famlia pelo amor e apoio incondicional.

    Aos amigos e funcionrios do Laboratrio de Protozoologia do Instituto de Medicina Tropical: Roselaine, Solange, Silvia, Luciano, Marilda, Andrs, Maria Tereza, Carlos e Snia (biblioteca) pelo auxilio e companheirismo. A Dona Fran (Guardada no corao).

    As Irmzinhas e amigas (Luciana, Meca, Maria, Sonia, Samanta e Barbara ) por tornarem meus dias mais serenos, compartilhando

    tristezas e alegrias.

    As minhas amigas de infncia Jus, Lu, Carol, Raquel , Val e Laila pela compreenso e carinho.

    Aos meus amigos e companheiros de trabalho da Universidade Metodista de So Paulo, DASA e Laboratrio Raul Dias dos Santos.

    A Deus por estar em tudo e todos que amo. Muito Obrigada.

  • QUEM ASSUME ALGUMA COISA E ACREDITA,

    PORQUE J A TEM NO CORAO (John Ruskin)

  • RESUMO

    Silva IJ. Avidez de IgG na toxoplasmose: padronizao do pH como caotrpico para quantificao direta de anticorpos de baixa avidez (dissertao). So Paulo: Instituto de Medicina Tropical de So Paulo da Universidade de So Paulo; 2011.

    A toxoplasmose uma protozoose altamente prevalente que atinge pelo menos um bilho de indivduos no mundo. A infeco causada pelo Toxoplasma gondii benigna e assintomtica, mas pode causar perdas visuais ou morte em fetos e pacientes imunossuprimidos. Isto pode ser controlado com diagnstico e instituio de tratamento, mas depende da determinao de infeco ativa ou recente. O diagnstico parasitolgico complexo, demorado e s executado em poucos centros, sendo a sorologia especfica essencial no diagnstico da doena. A avidez de anticorpos IgG tem sido utilizada para determinao da infeco recente, porm os testes convencionais de avidez s permitem uma estimativa indireta destes anticorpos a partir dos anticorpos totais e os de alta avidez. A quantificao destes anticorpos de baixa avidez seria interessante devido aos altos ttulos na fase aguda da infeco ou como marcadores da atividade da doena. Padronizamos um ensaio imunoenzimtico (ELISA), utilizando o pH como agente caotrpico, para permitir a determinao e quantificao dos anticorpos de baixa avidez. Na padronizao utilizamos amostras de soro de coelhos experimentalmente infectados ou amostras do banco de material biolgico do Laboratrio de Protozoologia do IMTSP. Nossos resultados mostraram que pH 3,5 apresentou poder caotrpico semelhante a uria 6M (r2= 0,9909), e que nos soros experimentais, os anticorpos de alta avidez foram resistentes aos dois caotrpicos associados. Os anticorpos recuperados na eluio com pH 3.5 ou Uria eram semelhantes quanto a especificidade antignica por imunomarcao ou Western Blot. A neutralizao do anticorpo eludo por pH permitiu seu reensaio por ELISA aps 1 hora de renaturao, com a quantificao direta dos anticorpos de baixa avidez.. A reprodutibilidade intra e inter teste foi superior a 95%, embora com resultados piores para o pH 3,5. Uma vez padronizada a reao, foram analisadas 150 amostras de soros humanos com sorologia e avidez conhecidas, composta por grande maioria de soros de alta avidez. As medidas de avidez por porcentagem mostraram um resultado errtico, atribudo ao uso de grande maioria de anticorpos de alta avidez, embora a medida dos anticorpos recuperados mantivesse correlao com estimativa a partir da medida indireta (r2= 0.48). Esta abordagem permite a determinao direta dos anticorpos de baixa avidez, que so os anticorpos inicialmente produzidos em um desafio antignico. Nosso ensaio semelhante ao imunolgico, j que a apresentao de antgenos por exossomos cidos de clulas dendrticas foliculares no centro germinativo parece ser o sistema de seleo de clones produtores de anticorpos de alta avidez. As perspectivas futuras de uso da medida dos anticorpos de baixa avidez na toxoplasmose so imensas, desde a relao com a gravidade da doena, pela sua quantidade, ou da presena de infeco recente, principalmente em infeco congnita ou e em imunossuprimidos, ou a reatividade da doena crnica, como na toxoplasmose ocular. Descritores: Toxoplasma gondii. Toxoplasmose. Afinidade de Anticorpos. ELISA.Tcnicas imunoenzimticas. Caotrpico.

  • ABSTRACT

    Silva IJ. IgG avidity in toxoplasmosis: standardization of pH as chaotrope for low avidity antibodies direct quantification (dissertation). So Paulo: Instituto de Medicina Tropical de So Paulo da Universidade de So Paulo; 2011.

    Toxoplasmosis is a highly prevalent protozoosis, affecting at least one billion people worldwide. The infection caused by Toxoplasma gondii is asymptomatic and benign but it can cause visual losses in addition to death in fetuses and immunocompromised patients. The agent can be controlled by early diagnosis and treatment, but this therapy depends on the determination of active or recent infection. The parasitological diagnosis is complex, time consuming and only performed in few centers, so specific serology is essential for diagnosis. The IgG avidity tests has been used to determine recent infection, but avidity conventional tests only provide an indirect estimate of low avidity antibodies from the total and high avidity antibodies. The quantification of low avidity antibodies would be interesting due to high titers in the acute phase of infection or as markers of disease activity. Using reversible chaotrope such as pH, we standardized an enzyme immunoassay (ELISA) to allow the determination and quantification of low avidity antibodies. For standardization we used serum samples from experimentally infected rabbits or samples of biological material bank of the Laboratory of Protozoology, IMTSP. Our results showed that pH 3.5 is a chaotrope similar to 6M urea (r2 = 0.9909) in avidity ELISA, and high avidity antibodies had similar resistance to two associated chaotrope in experimental sera. The antibodies recovered on elution with pH 3.5 or urea had similar antigen specificity by immunostaining or Western blot. The neutralizing antibody eluted by pH allowed retest by ELISA after 1 hour of refolding, with direct quantification of antibodies of low avidity. The reproducibility inter and intra test were above 95%, but with worse results for pH 3.5. After standardization, we analyzed 150 samples of human sera with known serology and avidity, compos