Felix, S.P.

1

1.1 - INTRODUÇÃO

1.1 - Mamona: Aspectos gerais

A mamona é uma euphorbiacea, cuja origem é dada ora sendo asiática, ora

africana e, até mesmo, como planta nativa da América. Esta planta foi introduzida

em quase todo o mundo, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. No

Brasil a mamona é conhecida desde a era colonial quando dela se extraía o óleo

para lubrificar as engrenagens dos inúmeros engenhos de cana. Ela está largamente

difundida por todo o Brasil, não havendo praticamente terreno baldio, mata ou

lavoura abandonada onde não cresça (FORNAZIERI, 1986).

A mamona (Figura 1) se classifica da seguinte forma (disponível em: < http:

//www.ncbi.nih.gov/ > Acesso em: 25/03/07).

Figura 1 - Mamona. (www.paraíba.pb.gov.br/)

Super Reino: Eucaryota

Reino: Viridiplantae

Filo: Streptophyta

Superdivisão: Spermatophyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopside

Subclasse: Rosidae

Ordem: Malpighiales

Família: Euphorbiacea

Subfamília: Acalyphoideae

Tribo: Acalypheae

Gênero: Ricinus

Espécie: Ricinus communis

Felix, S.P.

2

1.2 - Importância Econômica

Da mamona aproveita-se tudo: as folhas servem de alimento para uma

espécie do bicho da seda; a haste, além de celulose própria para a fabricação de

papel, fornece matéria-prima para a produção de tecidos grosseiros; além dos

principais produtos derivados da semente da mamona que são o óleo e a torta

residual da extração do óleo. As fábricas de óleo de mamona atualmente existentes

industrializam toda a produção, obtendo-se como subproduto, a torta de mamona

(FORNAZIERI, 1986).

1.2.1 - Óleo de mamona

O óleo extraído das sementes de mamona possui um mercado internacional

crescente, garantido por mais de 700 diferentes aplicações que incluem desde uso

medicinal em cosméticos até a substituição ao petróleo na fabricação de plásticos e

lubrificantes. O produto também é utilizado na fabricação de tintas e isolantes, na

produção de fibra ótica, vidro à prova de balas e próteses ósseas. Além disso, é

indispensável para impedir o congelamento de combustíveis e lubrificantes de

aviões e foguetes espaciais quando atingem baixíssimas temperaturas. Além destas

aplicações, o óleo de mamona é empregado para produção de corantes, anilinas,

desinfetantes, germicidas, colas e aderentes, base para fungicidas e inseticidas,

tintas de impressão e vernizes. O óleo de mamona transformado em plástico, sob a

ação de reatores nucleares, adquire a resistência do aço, mantendo a leveza da

matéria plástica. Uma das aplicações de grande valor econômico do óleo de

mamona é na fabricação do nylon e da matéria plástica empregada na fabricação de

espumas plásticas, onde o óleo de mamona confere ao material texturas variáveis,

desde a macia e esponjosa até a dura e rígida (FORNAZIERI, 1986). Atualmente, no

Brasil, as sementes de mamona estão sendo cogitadas como uma das principais

fontes para a produção de Biodiesel.

1.2.1.1 - Biodiesel

O Biodiesel é um combustível renovável, biodegradável, não corrosivo e

ambientalmente correto, sucedâneo ao óleo diesel mineral. Possui um grande apelo

ambiental, por ser obtido de fontes naturais renováveis, tais como óleos vegetais

(por exemplo, girassol, nabo forrageiro, algodão, mamona, soja e canola) e gordura

Felix, S.P.

3

animal, mas mais especialmente por diminuir as emissões de gases poluentes

durante a combustão quando comparado aos combustíveis fósseis (PIRES et al.,

2004).

Alguns pesquisadores admitem que o óleo de mamona é o melhor para

produzir biodiesel, por ser o único solúvel em álcool (necessário para o processo de

produção), e não necessitar de calor, reduzindo dessa maneira o gasto de energia

que requerem outros óleos vegetais para sua transformação em combustível

(PARENTE, 2004).

A utilização do biodiesel já havia sido proposta em 1986 por Fornazieri. O

biodiesel substitui total ou parcialmente o óleo diesel de petróleo em motores

ciclodiesel automotivos (de caminhões, tratores, caminhonetes, automóveis, etc) ou

estacionários (geradores de eletricidade, ou calor, entre outros), podendo ser usado

puro ou misturado ao diesel em diversas proporções. No Brasil, a Lei nº 11.097, de

13 de janeiro de 2005, introduz o biodiesel na matriz energética brasileira,

estabelecendo a obrigatoriedade da adição de um percentual mínimo de biodiesel ao

óleo diesel comercializado ao consumidor, em qualquer parte do território nacional.

Esse percentual obrigatório será de 5% em oito anos após a publicação da referida

lei, havendo um percentual obrigatório intermediário de 2% em três anos após a

publicação da mesma (disponível em: < http: //www.biodiesel.org.br/ > Acesso em:

15/01/07).

O Brasil, país que possui excelentes condições edafo-climáticas, tem

potencial de abastecer com biodiesel o consumo mundial, podendo substituir em

60% o óleo diesel de petróleo, levando em consideração que 1.000 kg de óleo

vegetal produz 1000 litros de biodiesel, sendo que, 1000 kg de mamona produzem

470 kg de óleo vegetal (PARENTE, 2004). Em conseqüência disso, o Governo

Federal lançou em 2004 o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel

(PNPB) que é um programa interministerial que objetiva a implementação de forma

sustentável, tanto técnica, como economicamente, a produção e uso do Biodiesel no

Brasil.

A área plantada necessária para atender ao percentual de mistura de 2%, de

biodiesel ao diesel de petróleo é estimada em 1,5 milhões de hectares, o que

equivale a 1% dos 150 milhões de hectares plantados e disponíveis para agricultura

no Brasil. As regras permitem a produção a partir de diferentes oleaginosas e rotas

tecnológicas, possibilitando a participação do agronegócio e da agricultura familiar

Felix, S.P.

4

(disponível em: < http: //www.biodiesel.org.br/ > Acesso em: 15/01/07). Contudo,

discussões a respeito do biodiesel têm procurado priorizar oleaginosas que

propiciem maior emprego de mão-de-obra, e inserir regiões que estejam à margem

do processo de desenvolvimento econômico. Nesse contexto, a cultura da mamona

vem despertando maior interesse, tanto por parte do programa nacional como do

programa baiano à medida que a região do semi-árido nordestino apresenta-se com

maior potencial para a implementação dos programas (PIRES et al., 2004).

Então, as vantagens econômicas e ambientais, o cultivo da mamona e a

produção industrial de biodiesel a partir desta, ou seja, as cadeias produtivas do

biodiesel, têm grande potencial de geração de empregos, promovendo, dessa forma,

a inclusão social, especialmente quando se considera o amplo potencial produtivo

da agricultura familiar predominante nestas regiões (disponível em: < http:

//www.biodiesel.org.br/ > Acesso em: 15/01/07).

1.2.2 - Torta de mamona

A torta residual da extração do óleo de mamoneira tem sido utilizada como

um co-produto também amparado pelo Programa Nacional de Produção e Uso de

Biodiesel, pois é produzido na proporção aproximada de 1,2 toneladas para cada

tonelada de óleo extraído (AZEVEDO & LIMA, 2001).

O seu principal uso é como adubo orgânico, apresentando potencial

fertilizante. Nestas condições a torta de mamona apresenta elevadíssima

porcentagem de matéria orgânica e riqueza dos macroelementos. A adição de torta

de mamona ao solo, com dosagens variando de acordo com a cultura e o tipo de

solo, e rico ou não em nutrientes, além de suprir as necessidades nutricionais das

plantas aumenta o pH , reduzindo a acidez total, elevando o conteúdo de carbono e

promovendo melhoria geral na parte física do mesmo. A utilização da torta no solo,

além de reduzir os nematóides e elevar o poder tampão e a capacidade de troca de

cátions do solo, tem propriedade de reduzir a densidade aparente do ambiente em

todos os tipos de solos, o que interfere positivamente no crescimento e no

desenvolvimento radicular, com renovação mais rápida e adequada do oxigênio.

Apesar de apresentar alto teor de proteínas, não se recomenda o uso da torta

para ração, pois é tóxica devido à presença da proteína ricina, e do complexo

alergênico, denominado nas décadas passadas de CB-1A (Castor Bean Allergen)

que é uma mistura de proteínas de baixo peso molecular (YOULE & HUANG, 1978).

Felix, S.P.

5

Atualmente sabe-se que o complexo alergênico CB-1A representa cerca de 12,5%

do peso da torta, como determinado pelo teste de precipitação de antígenos

diluídos. Este complexo é formado por cerca de 20 isoformas de proteínas com

massa molecular entre 10 e 14 kDa, sendo pertencentes à classe das albuminas 2S

(MACHADO et al., 2003). Duas isoformas alergênicas, Ric c 1 e Ric c 3 já se

encontram seqüenciadas com características biológicas bem determinadas

(MACHADO & SILVA, 1992; SILVA JR. et al., 1996).

Para o aproveitamento da torta deve se ter cuidado com o método usado no

processo industrial de detoxificação e de desalerginização, para não afetar a

qualidade final da torta ou farelo. Existem diversos métodos para alcançar a

detoxificação, como por exemplo: o cozimento por uma ou duas horas, ou ferver por

curtos períodos de tempo uma mistura de torta moída e água, com mudança da

água após cada fervura. Este é um processo caro e as usinas de óleo preferem

vender a torta apenas como fertilizante.

A presença de proteínas alergênicas em sementes de mamona já é

conhecida há muitos anos, no entanto, os tratamentos que são aplicados hoje para a

torta de mamona se referem à detoxificação, mas são ineficientes para a

desalerginização da torta (ANANDAN et al., 2005). Não há estudos que avaliem os

problemas provocados pela manipulação inadequada da torta.

1.3 - Alérgenos de Plantas

O termo alérgeno é utilizado para descrever duas ou três propriedades

moleculares distintas: i) a propriedade para sensibilizar (isto é, induzir a produção de

anticorpos de alta afinidade, particularmente da classe IgE, pelo sistema imune); ii) a

propriedade de se ligar aos anticorpos IgE; iii) e ainda a propriedade para ativar uma

reação alérgica (isto é, desencadear sintomas alergênicos em uma pessoa

sensibilizada) (AALBERSE, 2000). Alérgenos de plantas em geral, são proteínas de

defesa da planta, que permitem a ela resistir aos estresses bióticos e abióticos.

Muitos tecidos de plantas, que são consumidos por humanos, contêm milhares

destas proteínas alergênicas. Aproximadamente 0,5% da população dos Estados

Unidos é afetada por vários estágios da alergia alimentar mediada por IgE

específicas para alérgenos de plantas (BREITENEDER & RADAUER, 2004).

Felix, S.P.

6

Os alérgenos de plantas são classificados dentro de famílias e superfamílias,

baseados em sua estrutura e função. Elas são agrupadas dentro de uma mesma

família se possuirem 30% (ou mais) de resíduos de aminoácidos idênticos ou ainda,

se tiverem baixa homologia, mas apresentarem função e estrutura tridimensional

similares sugerindo uma origem evolucionária comum (BREITENEDER &

RADAUER, 2004). Adicionalmente tornou-se evidente que o nível de exposição e as

propriedades do alérgeno em si são importantes para a determinação do potencial

alergênico (BREITENEDER & MILLS, 2005).

Os alérgenos de origem vegetal, mais abundantes, pertencem às

superfamílias Cupin e Prolamina. As albuminas 2S pertencem à família das

prolaminas. Existem também outros alérgenos pertencentes aos grupos das

“proteínas relacionadas à patogênese” e Profilinas (BREITENEDER & RADAUER,

2004).

1.3.1 - Superfamília Cupin:

As proteínas da superfamília Cupin são funcionalmente diversas.

Compartilham um domínio estrutural beta-barril, responsável pelo nome da família

(do latin cupa, barril). Domínios simples de cupin apresentam um domínio

conservado, já bicupins apresentam dois domínios. Bicupins incluem as globulinas,

que são proteínas de reserva de sementes, além de serem o componente majoritário

da nossa dieta. Com base no coeficiente de sedimentação, as globulinas são

divididas em duas famílias: Vicilinas 7S e Legumininas 11S (DUNWELL et al., 1998).

Essas proteínas são alérgenos potenciais encontrados em plantas, como

amendoim, soja, lentilha, noz, avelã e algodão (BREITENEDER & RADAUER, 2004).

1.3.2 - Superfamília Prolamina:

A existência dessa família é baseada na presença de um esqueleto

conservado de oito resíduos de cisteína. Todas as proteínas dessa superfamília são

de baixo peso molecular, além de serem ricas em cisteínas, apresentarem estrutura

tridimensional semelhante rica em α-hélice, e serem estáveis ao tratamento térmico

e a proteólise (BREITENEDER & MILLS, 2005). Compreende três grupos principais

de alérgenos de plantas: proteínas transportadoras de lipídeos não específicos

(nsLTPs) , inibidores de alfa amilase/tripsina de sementes de cereais, prolamina de

cereais e albuminas 2S (BREITENEDER & RADAUER, 2004).

Felix, S.P.

7

1.3.2.1 - Albuminas 2S

É o principal grupo de proteínas de reserva presente nas dicotiledôneas, além

de serem os principais alérgenos da mamona. Apresentam massa molecular de

10.000 - 14.000 Da, altos teores de arginina, serina e glutamina. Sabe-se que

algumas delas são inibidores de proteases, outras são inibidores de α-amilases, e

algumas podem ainda apresentar propriedades alergênicas (MACHADO & SILVA,

1992). Apresentam uma distribuição característica de oito cisteínas em um padrão

conservado de pontes de enxofre e geralmente são compostas de 2 cadeias

polipeptídicas diferentes de 3 a 5 e de 8 a 10 kDa ligadas por duas pontes dissulfeto.

Elas ainda apresentam duas ligações intracadeias, o que as tornam proteínas muito

estáveis e compactas (PANTOJA-UCEDA et al., 2004).

As albuminas 2S são sintetizadas em tempos específicos durante o

desenvolvimento da semente e depositadas dentro dos vacúolos (corpúsculos

protéicos) durante o desenvolvimento da semente, para então serem degradadas

durante a germinação, dando suporte ao crescimento da semente (REGENTE & LA

CANAL, 2001). Elas são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso, como um

precursor protéico de alto peso molecular. Posteriormente este precursor é clivado

proteoliticamente, gerando a perda de um peptídeo ligante e de outros pequenos

peptídeos (SHEWRY et al., 1995). A glicosilação dessas proteínas pode ocorrer

durante a síntese protéica e os carboidratos incorporados são, em sua maioria,

manose e glicosamina (BEWLEY & BLACK, 1994).

Acreditava-se que as albuminas 2S fossem inativas metabolicamente, mas

atualmente, devido à sua capacidade inibidora de proteinases, às propriedades

alergênicas (MACHADO & SILVA JR, 1992), e à ação antifúngica (AGGIZIO et al.,

2003), acredita-se que elas estejam envolvidas em funções de defesa constitutivas

da planta (REGENTE & LA CANAL, 2001).

As propriedades alergênicas das albuminas 2S são resistentes à

desnaturação térmica e química, podendo, mesmo, após os tratamentos de

desnaturação, redução e alquilação, desencadear alergia por contato, bem como por

inalação (VIEIRA, 2002).

Historicamente, sempre houve tentativas de isolar e identificar os alérgenos

de Ricinus communis. Em 1943, Spies e Coulson isolaram da semente de mamona

uma fração proteica de baixo peso molecular, estável ao calor, que foi denominada

Felix, S.P.

8

CB-1A. Em 1977, Li e colaboradores isolaram e caracterizaram uma proteína das

sementes de Ricinus communis de baixo peso molecular com alto “teor” de

glutamina e um espectro não comum de UV que mostrou propriedades similares

àquelas do alérgeno de Ricinus communis. Em 1978, Youle e Huang concluíram que

CB-1A era a albumina 2S de reserva caracterizada por Li e colaboradores em 1997.

Em 1982, Sharief e Li seqüenciaram uma proteína das sementes de Ricinus

communis (Ric c 1), de coeficiente de sedimentação 2S, constituída de duas

subunidades unidas por pontes de enxofre. A menor contendo 34 aminoácidos (Ric c

1 leve) com massa molecular aparente de 4 kDa e a subunidade maior composta de

61 aminoácidos (Ric c 1 pesada) com massa molecular de 7 kDa.

Machado e Silva em 1992 isolaram e seqüenciaram uma segunda albumina

2S diferente da apresentada por Sharief e Li, denominada de Ric c 3, tendo peso

molecular em torno de 11 kDa, presente no mesmo precursor (29 kDa) de Ric c 1

(Figura 2). A estrutura primária documentada corresponde aos resíduos de 18 - 49

(cadeia leve) e 66 - 130 (cadeia pesada) do precursor protéico. De forma similar, a

albumina 2S descrita por Sharief e Li (1982) corresponde aos resíduos 136 - 169

(cadeia leve) e 173 - 237 (cadeia pesada). A segunda albumina 2S apresenta

resíduos conservados de cisteína nas duas cadeias o que é uma característica típica

das albuminas 2S (SILVA JR. et al., 1996).

Felix, S.P.

9

Erro!

Erro!

Figura 2 - Esquema do processamento do precursor das isoformas Ric c 3 e Ric c 1. Em A)

Precursor intacto com Peptídeo sinal em bege, pontes de enxofre em amarelo, Ric c 3 e Ric

c 1 respectivamente em vermelho (cadeias leves) e em marrom (cadeias pesadas),

peptídeos de ligação em azul; em B) Perda do peptídeo sinal; em C) Perda dos peptídeos

de ligação com conseqüente separação das duas isoformas.

Machado e colaboradores em 2003 forneceram dados bioquímicos e

imunológicos para a presença de pelo menos nove frações diferentes de albumina

2S. Essas nove frações apresentam uma composição similar de aminoácidos, com

alta quantidade de glutamina, além da similaridade na sequência N-terminal, sendo

que sete dessas proteínas apresentaram potencial alergênico.

Em 2004, Mayerhoffer caracterizou um epitopo, cuja seqüência peptídica está

presente também em outros alérgenos. Felix em 2006 caracterizou cinco epitopos

alergênicos nas isoformas de albumina 2S, Ric c 1 e Ric c 3, de mamona, capazes

de promover a desgranulação de mastócitos. Esses epitopos foram caracterizados

utilizando peptídeos sintéticos, os quais foram produzidos com base nas seqüências

das cadeias leves e pesadas de Ric c 1 e de Ric c 3, as principais isoformas de

albumina 2S de Ricinus communis. Estes peptídeos foram sintetizados pelo método

de fase sólida pela pesquisadora Maria Aparecida Juliano da Universidade Federal

A B A B

C

Felix, S.P.

10

de São Paulo - Departamento de Biofísica. As seqüências dos peptídeos, bem como

suas localizações nas isoformas Ric c 1 e Ric c 3 são apresentadas na figura 3.

Já foi observado também que muitos alérgenos de nozes e sementes são

albuminas 2S, por exemplo, Ber e 1 da castanha do Maranhão (Bertholletia excelsa),

Jur r 1 de noz (Juglans regia), Ses i 2 de algodão (BREITENEDER & RADAUER,

2004) e SFA-8 de girassol (Helianthus annuus) sendo que este último possui

estrutura tridimensional muito semelhante a Ric c 3 de Ricinus communis

(PANTOJA-UCEDA et al., 2004).

RIC c 3 cadeia leve: 35 resíduos; P1- Resíduos 1 a 15 e P2- Resíduos 16 a 31.

ESKGEREGSSSQQCRQEVQRKDLSSCERYLRQSSS

RIC c 3 cadeia pesada: 65 resíduos; P4- Resíduos 20 a 39 e P5- Resíduos 40 a 54.

QQQESQQLQQCCNQVKQVRDECQCEAIKYIAEDQIQQGQLHGEESERVAQRAGE

IVSSCGVRCMR

RIC c 1 cadeia leve: 34 resíduos; P3- Resíduos 11 a 24.

PSQQGCRGQIQEQQNLRQCQEYIKQQVSGQGPRR

RIC c 1 cadeia pesada: 64 resíduos; P0-Resíduos 22 a 40

QERSLRGCCDHLKQMQSQCRCEGLRQAIEQQQSQGQLQGQDVFEAFRTAANLPS

MCGVSPTSRF

Figura 3 - Seqüências dos peptídeos sintéticos e suas localizações nas isoformas Ric c 1 e Ric c 3.

P2 P1

P5 P4

P3

P0

Felix, S.P.

11

1.4 - Aeroalérgenos

A asma é uma manifestação de hipersensibilidade imediata e de reações de

fase tardia no pulmão que afeta 5-30 % das crianças e 2-30 % de adultos. Já a rinite,

uma manifestação alérgica mais comum do trato respiratório superior afeta 40 % da

população. Muitos estudos têm mostrado que essas doenças coexistem em 98,9%

dos casos (GIOULEKAS et al., 2004). Uma das causas da rinite e da asma é a

inalação de aeroalérgenos (proteínas alergênicas presentes no ar).

O pólen de diversas oleaginosas amplamente utilizadas na agricultura, como

girassol, soja, milho e mamona, é rico em proteínas alergênicas. Assim, a alergia

desencadeada por pólens, é um problema que pode afetar grande parte das

populações que residem próximo ao plantio destas oleaginosas, bem como do

trabalhador que manipula tais sementes (THORPE et al., 1988).

1.5 - Hipersensibilidade

O Brasil, apesar de ser um dos maiores produtores de mamona da atualidade,

não dispõe de estudos detalhados sobre casos de hipersensibilidade causados por

albumina 2S desta semente. Com o intuito de gerar conhecimentos nesta área,

estudos comparativos das propriedades químicas e biológicas relacionadas ao

processo de hipersensibilidade desencadeado por albuminas 2S, vêm sendo

realizados em nosso laboratório (VIEIRA, 2002; MAYERHOFFER, 2002;

MAYERHOFFER, 2004; FELIX, 2006).

Os distúrbios causados pelas respostas imunes anormais são chamados de

reações de hipersensibilidade. Quatro tipos são descritos (tipos I, II, III, IV). (ROITT,

1998).

A hipersensibilidade imediata é causada pelos anticorpos IgE e pelos

mastócitos, também chamada de hipersensibilidade do tipo I. Os anticorpos não-IgE

poderão causar lesões recrutando e ativando as células inflamatórias e interferindo

nas funções celulares normais. Alguns desses anticorpos são específicos para os

antígenos de células particulares ou da matriz extracelular e são encontrados

ligados a estas células ou tecidos, ou livres na circulação; as doenças induzidas por

esses anticorpos são classificadas como distúrbios de hipersensibilidade do tipo II.

Outros anticorpos podem formar complexos imunes na circulação, e os complexos

Felix, S.P.

12

são subseqüentemente depositados, principalmente nos vasos sanguíneos, e

causam lesão. As doenças causadas por estes complexos imunes são classificadas

como hipersensibilidade do tipo III. Finalmente, a lesão tecidual pode ser devida aos

linfócitos T que ativam mecanismos efetores da reação de hipersensibilidade tardia

(DTH) ou lisam diretamente células-alvo; esses estados são classificados como

distúrbios de hipersensibilidade do tipo IV (ROITT et al., 1998). O processo de

alergia envolve reações imunes humorais (do tipo I) e mediadas por células (do tipo

IV).

1.5.1 - Hipersensibilidade imediata (Tipo I)

A indução de uma resposta imune aos antígenos estranhos requer a

cooperação entre as células apresentadoras de antígenos (APC), as populações de

linfócitos T e linfócitos B. Inicialmente as APCs (macrófagos ou células dendríticas)

internalizam os antígenos. Estes sofrem clivagem proteolítica e os fragmentos

peptídicos gerados são expostos nas membranas externas da APC em associação

com moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC II). Os linfócitos

T auxiliares (Th1 e/ou Th2) reconhecem esses epitopos expostos e uma vez

ativados promovem uma mudança de classe de imunoglobulinas nas células B

através de citocinas, iniciando a resposta imunológica. A ativação de clones de

células Th2, específicos para alérgenos, é essencial para o desenvolvimento de

doenças atópicas (ABBAS, 2003). Diferente de células Th1, as células Th2 ativadas

por contato com APCs, produzem quantidades relativamente grandes de

interleucinas 4 (IL-4) e 5 (IL-5) que induz o “switching” dos anticorpos IgM para

produção de anticorpos IgE. Os anticorpos IgE, liberados pelos plasmócitos, se

associam aos receptores específicos (FcεRI) na superfície dos mastócitos

encontrados no tecido, e basófilos circulantes no sangue (LICHTENSTEIN, 1993).

Essa é a primeira sensibilização. Com uma subseqüente exposição ao mesmo

antígeno (segunda sensibilização), ocorrerá uma ligação cruzada entre segmentos

específicos do antígeno (epitopos que ligam IgE) com as moléculas de IgE pré-

ligadas nos mastócitos e basófilos, ativando os mensageiros intracelulares (ABBAS,

2003). Cascatas envolvendo enzimas tirosina quinase, fosfolipase C, proteína

quinase C e influxo de íons Ca2+ induzem a desgranulação dos mastócitos. Dentre

as substâncias liberadas, responsáveis por muitos sintomas alérgicos da

Felix, S.P.

13

hipersensibilidade imediata (Figura 4), encontram-se agentes quimiotáticos,

ativadores inflamatórios e espasmógenos (LICHTENSTEIN, 1993).

Como conseqüência tem-se rápida exsudação vascular de plasma,

vasodilatação, broncoconstrição e mais tarde inflamação. Os infiltrados inflamatórios

dessa reação de fase tardia são enriquecidos em eosinófilos, basófilos e células

Th2. Casos extremos de hipersensibilidade imediata podem resultar da anafilaxia e

da asma brônquica, podendo levar ao óbito (ABBAS, 2003).

A síntese de IgE é regulada pela herança, exposição ao antígeno e citocinas

secretadas por células T. Sendo assim, os indivíduos atópicos (predispostos a

hipersensibilidade imediata) têm mais IgE no sangue do que os não atópicos.

A hipersensibilidade imediata se apresenta de diversas formas nos vários

órgãos envolvendo diferentes mediadores e células-alvo (ROITT et al., 1998). Em

vários casos pode ocorrer reação cruzada, que acontece quando dois ou mais

antígenos possuem partes de sua estrutura primária (epitopos contínuos) e/ou

terciária (epitopos comformacionais) com características similares.

Felix, S.P.

14

Figura 4 - Esquema de deflagração de alergia: Num primeiro contato com o antígeno, o

organismo do indivíduo atópico vai produzir grandes quantidades de IgE, que vão se ligar à

superfície dos mastócitos através do receptor FcεRI. Nos contatos subseqüentes, o antígeno

se liga às moléculas de IgE pré-ligada nos mastócitos levando a ativação destas células.

Ilustração disponível em: <evunix.uevora.pt/2002/imuno2_alergias.htm> Acesso em:

25/07/06.

Felix, S.P.

15

1.5.1.1 - Epitopos

A seqüência de aminoácidos reconhecida pela molécula de anticorpo é muito

menor que a macromolécula imunogênica. Por isso, a ligação do anticorpo ocorre

somente numa porção específica do antígeno. Esta região é chamada de epitopo ou

determinante antigênico. Os antígenos podem ter múltiplos epitopos e cada um pode

se ligar a uma molécula de anticorpo (ABBAS, 2003).

Em proteínas, os epitopos contínuos são formados por aminoácidos

adjacentes. Já os epitopos conformacionais são formados pelos resíduos de

aminoácidos que não estão em seqüência, porém tornam-se espacialmente

justapostos na proteína enovelada. Os epitopos contínuos são mantidos após uma

desnaturação, contudo, os epitopos conformacionais são perdidos (ABBAS, 2003).

Vieira em 2002 observou que ambas as isoformas isoladas do “pool” de

albuminas 2S, Ric c 1 e Ric c 3, mesmo após serem submetidas à desnaturação,

são capazes de desencadear a desgranulação de mastócitos, indicando a presença

de epitopos contínuos nas duas isoformas. Mayerhoffer em 2004 verificou que após

a clivagem enzimática dessas isoformas, dois peptídeos presentes na cadeia

pesada de Ric c 3, induziram uma resposta significativa quanto a desgranulação dos

mastócitos. Neste mesmo trabalho, Mayerhoffer caracterizou um epitopo linear, cuja

seqüência peptídica está presente também em outros alérgenos. Felix em 2006

caracterizou cinco epitopos lineares alergênicos nas isoformas de albumina 2S, Ric

c 1 e Ric c 3, de mamona. Na seqüência de todos os peptídeos identificados por

Felix em 2006 e Mayerhoffer em 2004 era possível observar a presença de pelo

menos dois resíduos de aminoácidos dicarboxílicos. Esta característica nos fez

acreditar que os grupamentos carboxílicos laterais destas cadeias fossem

importantes na interação com as IgE.

1.6 - Mastócitos

Os mastócitos são células derivadas da medula óssea, que residem no tecido

conjuntivo, em todo corpo. Porém, são localizados predominantemente nas

proximidades dos vasos sanguíneos e nervos, abaixo dos epitélios e mucosas,

estando presentes também em órgãos linfóides. São caracterizados pela extrema

abundância de grânulos, os quais preenchem todo o citoplasma a ponto de,

freqüentemente, impedir a visibilidade do núcleo (DA SILVA & MOTA, 2003). Esses

grânulos são constituídos principalmente por glicoproteínas e coram-se

Felix, S.P.

16

metacromaticamente devido ao seu conteúdo em proteoglicanos, destacando-se

facilmente em cortes corados por azul de toluidina (JUNQUEIRA & CARNEIRO,

1995). Na maioria das espécies, os mastócitos são extremamente ricos em

histamina e heparina, e, no rato e no camundongo, são, além disso, ricos em

serotonina (DA SILVA & MOTA, 2003).

Os mastócitos expressam em sua superfície grande número de receptores Fc

de alta afinidade para IgE (FcεRI). Em conseqüência, a superfície de cada célula

mostra-se recoberta por moléculas de IgE, derivadas de linfócitos que foram

absorvidas da circulação, que atuam como receptores para antígenos específicos. A

ativação dos mastócitos se dá pela ligação cruzada das moléculas do receptor

FcεRI, causada pela ligação de antígenos multivalentes às moléculas IgE ligada ao

receptor (ABBAS, 2003). Essa ativação resulta em três respostas biológicas:

secreção dos conteúdos pré-formados dos grânulos; síntese e secreção de

mediadores lipídicos; e secreção de citocinas. As funções efetoras dos mastócitos

são mediadas por estas moléculas solúveis liberadas das células sob ativação.

Essas moléculas podem ser divididas em mediadores pré-formados, que incluem as

aminas biogênicas, ou vasoativas e as macromoléculas dos grânulos, e os

mediadores recém-sintetizados, que incluem mediadores derivados de lipídeos e

citocinas. Nos mastócitos humanos o único mediador da classe das aminas

biogênicas presentes em quantidades significantes é a histamina (ABBAS, 2003). Os

mais importantes mediadores lipídicos são produtos do metabolismo do ácido

araquidônico, tais como prostaglandina D2; leucotrienos, especialmente o

leucotrieno C4 (LTC4); e o fator ativador de plaquetas (PAF) (BOYCE, 2003).

Histamina, prostaglandina D2 e leucotrieno C4 contribuem para a modulação

da mucosa pela indução de edema e da secreção de muco e, no caso de asma,

broncoconstrição. Mastócitos também secretam citocinas pró-inflamatórias incluindo,

IL-4, IL-5 e IL-13, que regulam a síntese de IgE e o desenvolvimento de inflamação

eosinofílica (BRADDING,1999).

Os mastócitos são historicamente conhecidos pelos seus envolvimentos na

hipersensibilidade do tipo 1, mas possuem funções protetoras e homeostáticas. Eles

reconhecem diretamente os produtos de infecções bacterianas através de várias

proteínas receptoras na superfície, liberando proteases, citocinas e mediadores que

recrutam neutrófilos, limitando o alcance da infecção bacteriana e facilitando o

reparo do tecido (BOYCE, 2003).

Felix, S.P.

17

1.7 - Imunoterapia

Para amenizar os sintomas da hipersensibilidade imediata, os pesquisadores

têm procurado investir na imunoterapia. Stephen e colaboradores em 2004

exploraram o fato de que a resposta a um determinado antígeno é dirigida por Th1

ou Th2, dependendo da rota e dose do antígeno, além da natureza de apresentação

deste. Sendo assim, tem sido empregado o uso de adjuvantes (MPL, nucleotídeos

derivados de bactérias), que induzem resposta Th1 ao invés de resposta Th2 que

favorecem o “switching” de classe de IgE para IgG. Esta estratégia é apresentada na

patente americana de número US 6.610.297 B1. Uma outra abordagem similar foi

apresentada na patente internacional PCT WO 2004/019978 A1. Neste caso, ácido

nucléico recombinante induz também imunidade tipo Th1 e inibe a produção de IgE.

Essas estratégias apresentam uma vantagem, pelo fato de o efeito persistir por

aproximadamente três anos após o término do tratamento (Stephen et al., 2004).

Outra terapia é a hipossensibilização, onde extratos preparados diretamente

das fontes de alérgenos são injetados por via subcutânea nos pacientes em

quantidades pequenas, porém crescentes, em intervalos determinados de tempo.

Como resultado, os níveis de IgE específica diminuem e os de IgG aumentam

muitas vezes. Entretanto, este tipo de tratamento apresenta um ponto fraco. O

extrato injetado contém, além do alérgeno conhecido, outros potenciais alérgenos e

componentes não alergênicos. Assim, tem se observado que indivíduos atópicos são

freqüentemente co-sensibilizados contra diferentes alérgenos durante a

hipossensibilização (STEPHEN et al., 2004). Extratos de alérgenos hidrolisados

também têm sido utilizados para induzir um estado de anergia de célula T específica

e tolerância imunológica em seres humanos alérgicos, terapia esta apresentada na

patente PI 9714899-7 A.

Anticorpos anti-IgE omalizumab, que são anticorpos monoclonais humanizados

estão sendo utilizados como bloqueadores da resposta aos antígenos. O bloqueio

consiste na ligação do omalizumab com a região constante de IgE (Cε3), que

normalmente se ligaria no receptor FcεRI do mastócito. Com isso, não ocorrerá a

hipersensibilização tipo I (SOLÈR, 2002). Com esse efeito terapêutico, o nível de IgE

tem sido reduzido no soro, além de diminuir a chance de uma nova síntese de IgE.

No entanto, os sintomas reaparecem em poucas semanas depois do término do

Felix, S.P.

18

tratamento (SOLÈR, 2002).

Outra abordagem imunoterápica é mediada pela coagregação inibitória do

receptor FcγRIIb com alta afinidade ao receptor de IgE, FcεRI. Com o aumento do

nível de IgG, este se liga no seu receptor, induzindo a fosforilação do receptor de

IgE, inibindo assim o sinal que seria desencadeado por ele (DAERON et al., 1995).

Considerando que o conhecimento das estruturas dos alérgenos concomitante

com a elucidação dos epitopos alergênicos é um passo fundamental para o

tratamento imunoterápico, diversos grupos têm se envolvido neste desafio utilizando

várias estratégias metodológicas. Muitas delas envolvem ensaios que avaliam

unicamente a capacidade das IgE de se ligarem a um determinado peptídeo. A

estratégia empregada por Mayerhoffer em 2004 e por Felix em 2006 foi baseada em

um procedimento que avaliava a interação IgE-epitopo de uma forma mais funcional,

uma vez que estava centrada na visualização dos mastócitos desgranulados após a

primeira sensibilização com soro total anti-albuminas 2S, produzidos em ratos, e

após a segunda sensibilização com alérgenos de Ricinus communis. Os trabalhos

produzidos por Mayerhoffer e Felix foram criticados por terem sido realizados em

ratos uma vez que, nestes animais, a resposta alérgica poderia ser tanto mediada

por IgE como por IgG2a. Neste sentido, neste projeto procuramos qualificar esta

resposta, desenvolver novas estratégias para quantificar o processo de

desgranulação dos mastócitos, e realizar alguns experimentos para avaliar se estes

epitopos também são reconhecidos por IgE humana.

Felix, S.P.

19

2 - OBJETIVOS

• Otimizar procedimento para quantificar a desgranulação de mastócitos por

dosagem da histamina liberada dos grânulos;

• Investigar se a desgranulação de mastócitos de ratos provocada por albumina

2S de Ricinus communis é mediada por IgE ou por uma subclasse de IgG;

• Investigar se IgE presente em soro de indivíduos atópicos reconhecem os

epitopos de albumina 2S de Ricinus communis, previamente identificados em

ratos;

• Avaliar quais aminoácidos dos epitopos alergênicos poderiam estar

envolvidos na ligação com a imunoglobulina E;

• Testar a eficiência de aminoácidos livres no bloqueio da ligação entre

imunoglobulina E e epitopos alergênicos;

• Avaliar a existência de reações cruzadas entre alérgenos de fontes

alimentares e albuminas 2S de Ricinus communis;

• Avaliar a existência de reações cruzadas entre aeroalérgenos e albuminas 2S

de Ricinus communis;

• Avaliar a eficiência dos bloqueadores químicos como protetores de reações

cruzadas entre alérgenos de Ricinus communis e de alérgenos de fontes

alimentares e inalantes.

Felix, S.P.

20

3 - METODOLOGIA

3.1 - Obtenção de albumina 2S:

Utilizamos as albuminas 2S isoladas das sementes de Ricinus communis,

cultivar IAC226, já disponíveis no laboratório, as quais foram extraídas pela

metodologia descrita por Thorpe e colaboradores em 1988, segundo as adaptações

propostas por Marcondes de Souza em 1997.

3.2 - Obtenção de soro anti-albumina 2S de rato:

O “pool” de soro anti-albuminas 2S foi produzido na Universidade Federal

Fluminense, em colaboração com o Dr. Maurício Verícimo. Para tanto, 10 ratos R/A

tor, bons produtores de IgE, foram imunizados por injeção intraperitoneal de 0,5 mL

de salina contendo 0,01 mg de CB-1A (conjunto de albumina 2S obtidos da

variedade de mamona Amarelo de Irecê) e 5,0 mg de hidróxido de alumínio. Um

mês após a 1ª imunização, os animais receberam uma dose reforço de antígeno.

Nesta etapa, a mesma quantidade do antígeno foi misturada com 2,5 mg de

hidróxido de alumínio. Os animais foram sangrados, por punção cardíaca, 7 dias

após o reforço, sendo que volumes de soro iguais de cada animal foram recolhidos,

reunidos e guardados em alíquotas de 100 µL.

3.3 - Avaliação da alergenicidade:

Para analisar as propriedades alergênicas empregamos ensaio de

desgranulação de mastócito obtido de lavado peritoneal de rato.

3.3.1 - Obtenção dos mastócitos de rato:

Ratos Wistar (não imunizados), de aproximadamente 250 g cada foram

empregados como fonte de mastócitos. Os ratos foram sacrificados por asfixia em

CO2 e a cavidade peritoneal foi lavada com 20 mL de DMEM contendo 12 U/mL de

heparina. O lavado foi retirado da cavidade peritoneal com auxílio de pipeta Pasteur

após incisão no peritônio do animal.

Felix, S.P.

21

O lavado peritoneal do rato (cerca de 15 mL) foi colocado em placa de Petri

por 30 minutos a 37oC para separar mastócitos de macrófagos. Após esse tempo,

2/3 do meio de cultura foi retirado cuidadosamente da superfície com auxílio de

pipeta Pasteur e descartado. O líquido remanescente (cerca de 4-5 mL) contendo os

mastócitos foi transferido para um tubo Falcon de 50 mL. A suspensão final de

células foi dividida em alíquotas de 100 µL.

3.3.2 - Ensaios de desgranulação:

Avaliamos a ativação dos mastócitos mediada ou não por imunoglobulinas. As

alíquotas de 100 µL da preparação enriquecida em mastócitos foram submetidas ao

tratamento com 1 µL de soro total anti-albumina 2S e com 10 µL da amostra a ser

testada (10 µg/mL). A mistura era incubada por 1 hora a 37o C. Nos controles de

ativação inespecífica, o soro era omitido do ensaio.

Para a avaliação da desgranulação, uma alíquota de 10 µL era utilizada para

a contagem de mastócitos por microscopia ótica, o remanescente era reservado

para a dosagem de histamina.

3.3.2.1 - Avaliação do percentual de desgranulação por microscopia ótica:

A contagem diferencial das células íntegras e coradas foi feita em câmara de

Neubauer, nos quatro quadrantes, através da observação em microscópio óptico

Zeiss Axioplan. Para tanto, 5 µL da suspensão de células, após os diversos tipos de

incubação foram misturadas durante 15 min com 5 µL de solução aquosa contendo

0,1% de azul de toluidina, 10% de formaldeído e 1% de ácido acético, pH 2,8 para

evidenciar a desgranulação.

Como controle negativo de sensibilização induzida, mastócitos sem

tratamento prévio foram também incubados com o corante nas condições citadas e

foram observados ao microscópio ótico. A contagem destas células, íntegras e

desgranuladas, permitiu uma avaliação do procedimento de obtenção.

Foram utilizados três ratos para cada análise. Cada experimento foi feito em

duplicata, onde eram empregados mastócitos do mesmo animal.

3.3.2.2 - Dosagem de histamina:

Para esta dosagem empregamos um processo de cromatografia de troca

catiônica, seguido por derivatização pós-coluna, onde a histamina reagiu com OPA,

Felix, S.P.

22

produzindo um composto fluorescente. Vários gradientes de eluição foram testados

e o processo utilizado baseou-se na eluição isocrática empregando-se NaOH 0,2M

como eluente. Uma curva padrão foi feita empregando-se de 1pmol a 1 nmol de

histamina fornecida pela r-Biopharm.

Os 90 µL remanescentes da suspensão de células foram centrifugados à

4000 g por 10 minutos e 20 µL do sobrenadante foram utilizados para a dosagem da

histamina liberada, por processos cromatográficos. O restante da amostra (70 µL) foi

sonicado por 30 segundos para rompimento da membrana dos mastócitos. Uma

alíquota de 20 µL da amostra sonicada foi também analisada por cromatografia para

dosagem da histamina. O processo de sonicação provocava o rompimento de

praticamente todas as células e os valores da quantificação de histamina eram

tomados como 100%.

Uma planilha de valores foi montada no programa excel. Nesta os valores de

histamina liberada pelos alérgenos, pelo processo de sonicação e o número de

células eram considerados. A partir destas informações a porcentagem de histamina

liberada era calculada.

A histamina foi dosada após separação dos componentes do meio reacional

(DMEM) por cromatografia de troca catiônica, empregando um sistema HPLC.

A eluição da histamina retida foi feita com NaOH 0,2 M empregando um fluxo

de 0,6 mL/min. A detecção foi feita por derivatização pós coluna, utilizando o

reagente o-phthaldialdeido *. Inicialmente o eluato era neutralizado com a solução A

e depois reagia com a solução B. Utilizamos um detector de fluorescência da

Shimatzu, modelo RF 535, onde a excitação era feita a 375 nm e a emissão lida a

460 nm.

* preparo de reagente o-phthaldialdeído (OPA):

- Solução A:

Preparo de 1L do tampão com a seguinte composição química:

40,7 g de Na2CO3 (0,384M); 13,6 g de H3BO3 (0,216M); 18,8 g de K2SO4

(0,108M)

Os reagentes foram dissolvidos em água até um volume final de 1L. Ficando

o pH da solução próximo a 10, sem ajuste necessário.

Felix, S.P.

23

- Solução B – OPA 0,08%:

400 mg de OPA foi dissolvido em 7 mL de etanol e em seguida foi adicionado

1 mL de 2-mercaptoetanol. O volume foi ajustado a 500 mL com a solução A.

3.4 - Separação das imunoglobulinas E das imunoglobulinas G de rato por

cromatografia de afinidade em batelada:

Para investigar se a desgranulação de mastócitos de ratos provocada por

albumina 2S de Ricinus communis é mediada por IgE ou por uma subclasse de IgG

foi feito cromatografia de afinidade em batelada, a fim de separar essas duas

classes de imunoglobulinas para analisá-las posteriormente, por ensaios de

desgranulação.

Para isso, aproximadamente 100 µL de proteína G acoplada a Sepharose

(Gibco BRL EUA) foram colocados em um eppendorf. A resina (proteína G acoplada

a Sepharose) foi lavada cinco vezes com 100µL de tampão NaHCO3 0,2M com NaCl

0,5M pH 8,3 (tampão de equilíbrio). Um volume de 30µL de soro total anti-albumina

2S de rato R/A tor foi misturado com a resina já lavada. A essa mistura foram

adicionados 50µL de tampão de equilíbrio e, em seguida, a mistura foi incubada por

16 horas sob agitação a 4ºC.

Após a incubação, o sobrenadante (teoricamente com IgE purificadas) foi

retirado e estocado a 4ºC para análises posteriores (ensaios de “dot blotting” e

desgranulação de mastócitos). Depois da retirada do sobrenadante, a resina foi

lavada dez vezes com 100µL do tampão de equilíbrio, para retirar o resto do material

não ligado.

A IgG, associada a proteína G acoplada a Sepharose, foi eluída usando

100µL de uma solução 0,5M de ácido acético pH 3,0-2,5. Como a solução de ácido

acético é muito agressiva, foi necessário transferir a fração de IgG eluída

imediatamente para uma solução neutralizante de 1M TRIS-HCl pH 9,0. Após a

neutralização, a solução foi estocada a 4ºC para análises posteriores (“dot blotting” e

desgranulação de mastócitos).

Para estocar a resina, esta foi lavada três vezes com 100µL do ácido acético

1 M pH 2,5, seguido de três lavagens com 100µL de tampão de equilíbrio, uma vez

com 100µL de Guanidina 4-6M por 30-60 minutos a 4ºC e, finalmente colocada em

100µL de etanol 20%.

Felix, S.P.

24

3.4.1 - Comprovação da ausência de IgG no sobrenadante:

Para avaliar a eficiência da precipitação em retirar as subclasses de

imunoglobulina G, o sobrenadante foi analisado por “dot blotting”, empregando como

anticorpo secundário o anti-IgG2a de rato produzido em cabra (Serotec).

A membrana de nitrocelulose foi dividida em quadrados de 2 cm e colocada

em uma placa de 24 poços. Posteriormente, cada membrana foi umedecida em

tampão fosfato de sódio 0,1 M contendo NaCl 0,5 M pH 7,6 (PBS) e deixada secar a

temperatura ambiente. Cerca de 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina

2S e 10µL de Tampão NaHCO3 0,2M pH 8,3 contendo NaCl 0,5M pH 8,3 (tampão

utilizado durante a precipitação, presente na Fração IgE) foram aplicados sobre as

membranas. Após a secagem das amostras nas membranas, estas foram

mergulhadas em tampão bloqueador (PBS + Leite em pó Molico 2%) e mantidas

nesta solução por uma hora. Posteriormente, cada membrana foi incubada com 1µL

do sobrenadante da cromatografia de afinidade em batelada diluído em 200 µL do

tampão de bloqueio por um período de duas horas a temperatura ambiente. Em

seguida, as membranas foram lavadas cinco vezes com PBS por uma hora, e

incubadas com anticorpo anti-IgG2a de rato complexado a peroxidase (1:2000 em

tampão bloqueador) por uma hora. A revelação foi feita utilizando uma mistura

contendo 5 mg de DAB dissolvidos em 4,9 mL de água ultrapura, 300µL de imidazol

0,1M, 100µL de tampão Tris-HCl 2M ( pH 7,5) e 5µL de peróxido de hidrogênio 30%.

Como controles, foram utilizados 10µL de água destilada (controle negativo) e

10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina 2S (controle positivo), só que

nessas amostras o anticorpo primário foi o soro total anti-albumina 2S (1:800),

produzido em rato R/A tor (antes da separação por cromatografia de afinidade em

batelada).

3.4.2 - Comprovação da presença de IgG na fração ligada:

Para comprovação da presença de IgG na fração associada à resina de

Sepharose, a qual foi eluída com ácido acético, foi também feito um ensaio de “dot

blotting” conforme descrito no item 3.4.1. Neste caso, 1 µL da fração eluída foi

dissolvida em 100µL do tampão bloqueador como anticorpo primário. Controles

adicionais utilizando a solução de eluição e o tampão de neutralização foram

incluídos.

Felix, S.P.

25

3.4.3 - Análise da desgranulação dos mastócitos de rato, sensibilizados pelas

frações enriquecidas em IgE ou enriquecidas em IgG, utilizando albumina 2S e

seus peptídeos:

Para analisar a desgranulação de mastócitos de rato, sensibilizados pelas

frações enriquecidas em IgE (FE) e fração enriquecida em IgG (FG), utilizando

albumina 2S e seus peptídeos (P0, P1, P2, P3, P4, P5), os mastócitos de rato,

obtidos por sedimentação em placa de Petri, foram tratados com:

a) 5 µL de FE e 10 µL da solução estoque de albumina 2S (10 µg/mL);

b) 10 µL de FG e 10 µL da solução estoque de albumina 2S (10 µg/mL);

c) 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos peptídeos sintéticos

(avaliação da desgranulação não mediada por imunoglobulinas);

d) 1 µL soro total anti-albumina 2S e 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de cada

um dos peptídeos sintéticos;

e) 5 µL de FE e 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos peptídeos

sintéticos;

f) 10 µL de FG e 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos peptídeos

sintéticos.

Como controle positivo, a fração enriquecida em mastócitos (100 µL) foi

tratada com 1 µL de soro total anti-albuminas 2S e com 10 µL da solução estoque de

albuminas 2S (10 µg/mL).

A determinação do percentual de desgranulação foi feita por microscopia

ótica, como descrito no item 3.3.2.

3.5 - Obtenção de IgE humana:

Soro de indivíduos atópicos (com níveis de IgE elevados) foi utilizado como

fonte de IgE humano.

Estes soros foram coletados no Laboratório de Côrreas, localizado na cidade

de Petrópolis-RJ, para controle de saúde de indivíduos atópicos. O soro excedente,

após análises, foi cedido pelo Laboratório de Côrreas. A dosagem de IgE nestes

soros foi feita pelo método de quimiluminescência e aqueles que apresentavam

Felix, S.P.

26

valores de IgE total acima de 140 KU/L, valor máximo de referência para adultos

não atópicos, foram utilizados. Para efeito de inviolabilidade à intimidade, os nomes

dos indivíduos foram omitidos. O Laboratório de Corrêas participa do controle de

qualidade da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas.

Os soros destes indivíduos foram investigados quanto à sua capacidade de

reconhecimento de albuminas 2S de Ricinus communis pela técnica de “dot blotting”

descrita no item 3.4.1. Neste caso membranas de nitrocelulose foram incubadas

com 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina 2S, e após o bloqueio, com 1

µL de soro de cada paciente diluído em 50 µL de tampão de bloqueio. O anticorpo

secundário utilizado foi o anti-IgE humano complexado a biotina (1:2000). Para

revelação empregamos o sistema peroxidase complexada a streptavidina (1:1000).

3.5.1 - Identificação de epitopos alergênicos de albumina 2S de R. communis,

por “dot blotting”, utilizando soro do indivíduo atópico:

Para identificação de epitopos alergênicos de albumina 2S de R. communis

foi feito “dot blotting” conforme descrito no item 3.4.1. Os antígenos utilizados foram

10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina 2S, de Ric c 1 e de Ric c 3 e de

peptídeos sintéticos. Como anticorpo primário usamos o soro do indivíduo atópico

que reconheceu, com maior intensidade, as albuminas 2S de R. communis na

diluição (1:50) e como secundário utilizamos o anticorpo anti-IgE humano

complexado a biotina (1:2000). Para revelação empregamos o sistema peroxidase

complexada a streptavidina (1:1000).

3.5.2 - Separação das imunoglobulinas E e das imunoglobulinas G de humano,

por cromatografia de afinidade em batelada:

A separação das imunoglobulinas E das imunoglobulinas G humanas por

cromatografia de afinidade em batelada, foi feita conforme descrito no item 3.4,

porém o soro utilizado foi o soro contendo IgE do indivíduo atópico, reativo à

albumina 2S de R. communis.

3.5.2.1 - Comprovação da presença de IgE no sobrenadante:

Para comprovação da presença de IgE no sobrenadante foi feito “dot blotting”

conforme descrito no item 3.4.1, porém além dos antígenos descritos, foi também

utilizado 10µL de tampão contendo ácido acético 1M pH 2,5, ácido acético 0,5M pH

Felix, S.P.

27

2,5 e TRIS-HCl pH 9,0 (tampão utilizado durante a precipitação, presente na fração

IgG); como anticorpo primário foi utilizado 1µL da fração eluída, dissolvida em 18 µL

do tampão bloqueador ou 1µL do sobrenadante dissolvido em 25µL do tampão

bloqueador, cada um em uma membrana contento albumina 2S de R. communis. Já

o anticorpo secundário utilizado foi o anticorpo anti-IgE humano complexado a

biotina (1:2000). Para revelação empregamos o sistema peroxidase complexada a

streptavidina (1:1000).

Como controles, foram utilizados 10µL de água destilada (controle negativo) e

10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina 2S (controle positivo), sendo que

nessas amostras o anticorpo primário foi o soro total anti-albumina 2S do indivíduo

atópico mais reativo à albumina 2S de R. communis (antes da separação por

cromatografia de afinidade em batelada) (1:50).

3.6 - Determinação dos aminoácidos envolvidos na interação IgE/epitopo:

3.6.1 – Empregando IgE de ratos

Como descrito anteriormente, na seqüência de todos os peptídeos

identificados por Felix em 2006 e Mayerhoffer em 2004, era possível observar a

presença de pelo menos dois resíduos de aminoácidos dicarboxílicos. Esta

característica nos fez acreditar que os grupamentos carboxílicos laterais destas

cadeias fossem importantes na interação com as IgE. Assim, como estratégia para

investigar quais aminoácidos dos epitopos alergênicos poderiam se ligar às IgE,

mastócitos sensibilizados com soro total anti-albuminas 2S foram incubados com

uma mistura dos aminoácidos livres, presentes em cada peptídeo sintético, mas

sempre omitindo o ácido aspártico e o ácido glutâmico. O princípio básico desta

estratégia seria que os aminoácidos livres, importantes para o reconhecimento pelas

IgE, se ligariam a estas imunoglobulinas, mas não de forma cruzada e, desta

maneira, impediriam o reconhecimento dos alérgenos pelas IgE.

Tanto para albumina 2S como para os peptídeos sintéticos, a mistura de

aminoácidos foi preparada da seguinte forma: cada um dos aminoácidos livres (10

µL da solução estoque de 10 µg/mL), correspondentes à seqüência de aminoácidos

de cada peptídeo, exceto ácido glutâmico (Glu) e ácido aspártico (Asp). O ácido

glutâmico e o ácido aspártico, nas mesmas concentrações, foram utilizados

individualmente e separadamente da mistura de aminoácidos.

Felix, S.P.

28

Inicialmente alíquotas de 100 µL dos mastócitos de rato obtidos através de

sedimentação em placa de Petri, foram incubados com 1 µL de soro total anti-

albumina 2S.

Após a incubação com o soro anti-albumina 2S, os mastócitos, teoricamente

contendo IgEs ligadas, foram tratados com 10 µL da mistura de aminoácidos, ou

ácido glutâmico, ou ácido aspártico, por 5 minutos. Este meio foi então incubado

com cada uma das frações alergênicas.

- No ensaio para albumina 2S: 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de albumina

2S foram adicionados em cada solução de mastócitos (com IgEs ligadas) contendo

cada mistura específica de aminoácidos baseada na seqüência da albumina 2S, Asp

e Glu, separadamente.

- No ensaio para peptídeos sintéticos: 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de

cada um dos seis peptídeos sintéticos foram adicionados em cada solução de

mastócitos (com IgEs ligadas) contendo cada mistura específica de aminoácidos

baseada na seqüência de cada peptídeo sintético, Asp e Glu, separadamente;

Em todos os ensaios, os controles positivos (mastócitos tratados com soro total

anti-albuminas 2S na presença de albuminas 2S), os controles negativos (mastócitos

sem tratamento) e, a detecção do percentual de desgranulação por microscopia

ótica, foram feitos como descrito no item 3.3.2.

A suspensão de células remanescente (a que não foi corada - 90 µL) foi

utilizada para dosagem de histamina, conforme descrito a seguir no item 3.3.2.2.

3.6.2 - Investigação da capacidade ligante de aminoácidos livres na porção Fab

da IgE humana:

A investigação da capacidade ligante de aminoácidos livres (considerados

agentes bloqueadores de IgE ligadas em células de ratos), na porção Fab da IgE

humana foi feita através dos experimentos de ELISA. Inicialmente o soro contendo

IgE, do indivíduo atópico mais reativo à albumina 2S de R. communis, foi utilizado

como anticorpo primário na diluição (1:50). Este, foi tratado, na proporção de 1:10,

com a solução estoque (10 µg/mL) de ácido aspártico ou ácido glutâmico, por 5

minutos.

A placa de ELISA foi sensibilizada com 20 µg de cada uma das amostras

(albumina 2S, cadeia leve de Ric c 1, cadeia pesada de Ric c 1, cadeia leve de Ric c

3, cadeia pesada de Ric c 3 e cada um dos seis peptídeos sintéticos) diluídas em

Felix, S.P.

29

100 µL de tampão carbonato/bicarbonato 0,05M, pH 9,6, durante 18 horas, a 4ºC.

Após esse tempo, a placa foi lavada duas vezes com PBS contendo 0,05% de

Tween 20 (300 µL/poço durante 1 hora). Em seguida, foram adicionados 300 µL de

tampão bloqueador (gelatina 1% em PBS contendo Tween), permanecendo na placa

por 1 hora à temperatura ambiente. Após esse tempo de bloqueio, a placa foi

novamente lavada com PBS contendo Tween 0,05% (300 µL/poço durante 1 hora), e

foram adicionados 50 µL/poço do soro do indivíduo atópico reativo à albumina 2S,

previamente tratado (diluído 1:50 em tampão bloqueador), durante 1 hora à

temperatura ambiente. Posteriormente, a placa foi novamente lavada com PBS

contendo Tween, por três vezes de 5 minutos e, em seguida, foi incubada com o

anticorpo anti-IgE de humano complexado a biotina (diluído 1:2000 em tampão

bloqueador), por 45 minutos à temperatura ambiente. A placa foi lavada com PBS

contendo Tween, por três vezes de 5 minutos. Para revelação empregamos o

sistema peroxidase complexada a streptavidina (diluído 1:1000 em tampão

bloqueador) por 30 minutos. Posteriormente, a placa foi lavada 3 vezes com PBS

contendo Tween 0,05%. Em seguida, a revelação foi feita com 50 µL da solução de

revelação (10 mg de OPD; 10 µL de H2O2 30%; 6,5 mL de ácido cítrico 0,1 M; 7,0 mL

de fosfato de sódio 0,2 M e 9,0 mL de H2O destilada). A reação foi interrompida

adicionando 50 µL de H2SO4 por poço. A leitura da placa foi realizada a 492 nm.

Como controle positivo foram utilizadas cada uma das amostras com o soro

do indivíduo atópico reativo à albumina 2S sem o tratamento descrito anteriormente

(sem os aminoácidos bloqueadores), e como controles negativos foram utilizados

albumina 2S sem o anticorpo primário e água destilada.

3.7 - Avaliação da resposta cruzada entre albumina 2S e alérgenos alimentares

e inalantes (aeroalérgenos) padronizados pelo método descrito por Bradford,

através da desgranulação de mastócitos de rato:

A resposta dos mastócitos de rato foi avaliada com os diversos tipos de

substâncias alergênicas (alérgenos alimentares e alérgenos inalantes). A

determinação foi realizada por contagem dos mastócitos íntegros e desgranulados.

Nos diversos ensaios utilizamos como fonte de IgE o soro de rato (RA/tor) imunizado

contra o “pool” de albumina 2S.

Felix, S.P.

30

3.7.1 - Resposta a partir da desgranulação mediada por alérgenos alimentares

do Kit de teste da FDA Allergenic LTDA:

A padronização das concentrações das proteínas presentes nos extratos

alergênicos (produzidos pela FDA Allergenic LTDA) foi feita pelo método descrito por

Bradford em 1976, onde a curva-padrão foi feita utilizando ovalbumina (OVA).

Os alérgenos presentes no kit de alimentos da FDA Allergenic LTDA são das

seguintes fontes: aves, camarão, carne bovina, carne suína, clara, tomate, gema,

leite, peixes, arroz, glúten, morango, milho, trigo, soja, pimenta, abacaxi, cacau, caju,

amendoim, laranja, limão.

Assim, os mastócitos obtidos através de sedimentação em placa de Petri,

foram tratados: a) Com 10 µl da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos

extratos de alérgenos alimentares; b) Com 1µL soro anti-albumina 2S e com 10 µL

da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos extratos dos alérgenos alimentares.

Controles positivos (mastócitos tratados com soro anti-albuminas 2S na

presença de albuminas 2S), negativos (mastócitos sem tratamento) e a detecção do

percentual de desgranulação, por microscopia ótica, foram feitos como descrito no

item 3.3.2.

3.7.2 - Resposta a partir da desgranulação mediada por alérgenos inalantes da

bateria de alérgenos do Kit de teste da FDA Allergenic LTDA:

Os alérgenos que compõe este kit de inalantes da FDA Allergenic LTDA são

extratos das fontes listadas a seguir: poeira domiciliar, ácaros, fungos do ar, lã,

gramíneas, flores, tabaco, epitélio de gato, epitélio de cão, epitélio de eqüino, epitélio

bovino, epitélio mix, penas mix, algodão, crina, capim, linho, macela, barata, pireto,

seda, taboa.

Assim, os mastócitos obtidos através de sedimentação em placa de Petri,

foram tratados: a) Com 10 µl da solução estoque (10 µg/mL) de cada um dos

extratos de aeroalérgenos que o teor de proteínas também foi padronizado por

Bradford; b) Com 1µL soro anti-albumina 2S e com 10 µL da solução estoque (10

µg/mL) de cada um dos extratos dos alérgenos inalantes.

Controles positivos (mastócitos tratados com soro anti-albuminas 2S na

presença de albuminas 2S), negativos (mastócitos sem tratamento) e a detecção do

percentual de desgranulação, por microscopia ótica, foram feitos como descrito no

item 3.3.2.

Felix, S.P.

31

3.8 - Avaliação da possibilidade de uso de aminoácidos dicarboxilícos como

bloqueadores para a resposta cruzada de alérgenos alimentares e inalantes:

Nestes ensaios empregamos um procedimento similar ao descrito no item 3.6.1.

Para tanto, os mastócitos foram sensibilizados com soro total anti-albuminas 2S, e

incubados com Asp e Glu, separadamente. Posteriormente a esta suspensão, 10 µL

da solução estoque (10 µg/mL) de cada alérgeno, que apresentou resposta cruzada

com albumina 2S de R. communis , foram adicionados.

Em todos os ensaios, os controles positivos (mastócitos tratados com soro total

anti-albuminas 2S na presença de albuminas 2S), os controles negativos (mastócitos

sem tratamento) e, a detecção do percentual de desgranulação por microscopia

ótica, foram feitos como descrito no item 3.3.2.

Felix, S.P.

32

4 - RESULTADOS

4.1 - Avaliação da atividade alergênica.

A atividade alergênica foi investigada por ensaios de ativação dos mastócitos,

onde a desgranulação foi desencadeada por albumina 2S e foi avaliada por

visualização e contagem das células íntegras e desgranuladas no microscópio ótico

e/ou por quantificação da histamina liberada. As figuras 5A e 5B mostram mastócitos

sem qualquer tratamento para ativação e a figura 5C e 5D mastócitos sensibilizados

por soro e albuminas 2S de R. communis.

Figura 5 - Mastócitos íntegros (A/B) e mastócitos desgranulados (C/D), ambos corados por

azul de toluidina. Aumento de 400X.

A B

C D

Felix, S.P.

33

Após contagem dos mastócitos íntegros e desgranulados, observamos que a

fração enriquecida com os mastócitos (controle negativo) apresentou cerca de 30%

de desgranulação, tanto na ausência, como na presença de soro total, indicando que

este percentual de desgranulação é inerente ao processo empregado para o

isolamento dos mastócitos ou reflete as condições fisiológicas do animal.

Valores similares foram encontrados quando albumina 2S foi incubada com

os mastócitos na ausência de soro total. No entanto, quando os mastócitos foram

sensibilizados com o soro total e albumina 2S foi adicionada, observamos uma

desgranulação de cerca de 70% das células (Tabela I). Substâncias que induziam

desgranulação acima de 50% foram consideradas potencialmente alergênicas.

Tabela I - Avaliação do percentual de desgranulação de mastócitos de

rato, mediada por albumina 2S.

Amostras

% de desgranulação

na ausência de soro

total (±±±± D.P)

% de desgranulação

na presença de soro

total (±±±± D.P)

Controle

negativo

27,6 (± 1,2)

30,0 (± 1,0)

Albumina 2S

(ct+)

34,6 (± 1,3)

70,0 (± 1,0)

Em todos os ensaios, após a visualização e contagem no microscópio ótico,

uma alíquota era retirada para quantificação de histamina.

Para dosagem de histamina, empregamos inicialmente um processo de

cromatografia de troca iônica, onde o material era fixado em uma coluna Shim-pack

– amino –Li da Shimadzu, normalmente utilizada para a separação de componentes

de fluídos fisiológicos. O material ligado era eluído por dois tampões (Tampão citrato

- ácido perclórico pH 3,2 e citrato - ácido bórico, pH 10,0) e posteriormente por

NaOH 0,2M. A histamina era eluída com cerca de 5 minutos de lavagem com este

último eluente. Este processo durava cerca de 150 minutos. Baseado nesta

observação, otimizamos processos cromatográficos, onde ajustamos um método

isocrático, de 10 minutos, onde somente NaOH 0,2 M, fluxo 0,6 mL por minuto foi

Felix, S.P.

34

empregada como um eluente. Nesta nova condição, os vários componentes do meio

DMEM utilizado nos ensaios de desgranulação eram eluídos logo no início do

processo, separando-se da histamina. O método mostrou-se linear para

concentrações entre 1pmol e 125 pmols de histamina.

A figura 6A mostra a sobreposição dos cromatogramas da histamina 12,5

pmols com histamina 125 pmols preparados em 20 µL de DMEM. A figura 6B mostra

uma ampliação da sobreposição destes cromatogramas Podemos observar que há

uma boa resolução entre os componentes do DMEM e a Histamina.

Figura 6 - (A) Perfil cromatográfico da histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols. A

linha azul delimita o DMEM; (B) Ampliação da sobreposição do perfil cromatográfico da

histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols.

A

B

Felix, S.P.

35

A figura 7 mostra a sobreposição dos cromatogramas da histamina 1 pmol

com histamina 12,5 pmols. Mostra ainda, que há uma boa resolução, mesmo em

quantidades pequenas de histamina.

Figura 7 - Sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 1 pmol com histamina 12,5

pmols.

Felix, S.P.

36

Para avaliar o percentual de liberação de histamina, foi necessário,

inicialmente, ajustarmos uma metodologia para romper os mastócitos a fim de liberar

completamente o conteúdo de histamina contido nos grânulos. Tempos gradativos

de exposição ao ultrassom (10 a 60 segundos) foram empregados, sendo observado

que 30 segundos era a condição mais adequada para liberação total de histamina.

Como controle do processo de sonicação, uma solução contendo 125 pmol de

histamina por mL de DMEM foi submetida ao processo de sonicação por 30

segundos. Uma alíquota de 10 µL desta solução foi submetida ao processo

cromatográfico. A figura 8 mostra que o processo não foi destrutivo para histamina

neste período.

Após as devidas padronizações para a quantificação da histamina, os ensaios

de desgranulação foram conduzidos. As células foram observadas por microscopia

ótica e 20µL do sobrenadante foi fracionado por cromatografia de troca iônica para

quantificação da histamina liberada. O volume remanescente era sonicado, por 30

segundos, e uma alíquota de 20µL era novamente submetida ao fracionamento

cromatográfico para quantificação da histamina total.

Figura 8 - Efeito da sonicação na integridade da histamina. Sobreposição do perfil

cromatográfico de histamina (padrão) com histamina sonicada (total).

Felix, S.P.

37

A figura 9 mostra a sobreposição dos cromatogramas obtidos (histamina

liberada) para mastócitos incubados com albumina 2S na ausência de soro e

quando mastócitos sensibilizados com soro de ratos foram incubados com

albuminas 2S. No experimento com albumina em presença de soro, podemos

observar a liberação de histamina correspondente a desgranulação de mastócitos.

Figura 9 - Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato. Tratamento

com albumina com soro e albumina sem soro.

Felix, S.P.

38

A figura 10 mostra a sobreposição de cromatogramas obtidos para a

quantificação de histamina liberada e para histamina total (suspensão de células

sonicada) após ativação dos mastócitos na presença de soro anti-albumina 2S e

albumina 2S.

Figura 10 - Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato. Tratamento

com albumina com soro antes (rosa), e após a sonicação (histamina total) (preto).

Felix, S.P.

39

Para a determinação do percentual de histamina liberado, associou-se os

valores quantificados pelo método cromatográfico, com o número de células

empregadas em cada ensaio, correlacionando esses valores com o total de

histamina liberado após o processo de sonicação (Tabela II). Podemos observar que

durante o processo de isolamento dos mastócitos ocorre cerca de 30 % de

desgranulação, o que implica na detecção de 2% de Histamina. Quando as células

são sensibilizadas com albuminas 2S, ocorre cerca de 70 % de desgranulação e o

percentual de liberação de histamina aumenta 64%.

Tabela II – Porcentagem de desgranulação de mastócitos e determinação da histamina liberada dos

grânulos.

Amostra (%) de desgranulação

Nº de

Células

contadas

(∑∑∑∑)

Células

em 20uL

Histamina

liberada

(pmols)

Histamina

total

detectada

(pmols)

(%)

liberação

específica

de

histamina

Controle

negativo 30,0 100 500,0 0,2 10,6 2

Albumina

2S 34,6 62 310,0 0,27 9,4 3

Albumina

2S + Soro 70,0 54 270,0 1,5 3,5

64

Felix, S.P.

40

Na tabela III são apresentados os dados referentes ao percentual de

desgranulação dos mastócitos na presença de peptídeos sintéticos baseados nas

seqüências das duas principais isoformas de albumina 2S de R. communis.

Podemos observar que o peptídeo 0 (P0) apresentou o maior percentual de

desgranulação (74%) e, portanto provocou uma maior liberação de histamina (80%).

O percentual de histamina liberada após incubação dos peptídeos diretamente com

os mastócitos (na ausência de soro) foi menor que 2%.

Tabela III - Avaliação do percentual de desgranulação e do percentual de liberação de

histamina, mediado pelo reconhecimento de albumina 2S ou de peptídeos sintéticos.

Amostras

% de

desgranulação

na ausência de

soro total (±±±± D.P)

% de desgranulação

na presença de soro

total (±±±± D.P)

% de liberação de

histamina na presença

de soro total

Controle

negativo

27,6 (± 1,2) 30,0 (± 1,0) 2

Albumina 2S

(ct +)

34,6 (± 1,3) 70,0 (± 1,0) 64

P0 33,8 (± 1,2) 74,0 (± 0,9) 80

P1 34,8 (± 0,8) 64,0 (± 0,4) 58

P2 25,8 (± 1,2) 70,0 (± 0,5) 64

P3 35,1 (± 0,2) 65,0 (± 0,7) 58

P4 31,3 (± 0,4) 67,0 (± 0,5) 60

P5 27,7 (± 0,7) 54,0 (± 0,2) 56

Felix, S.P.

41

4.2 - Avaliação da separação das imunoglobulinas IgE e IgG, por cromatografia

de afinidade em batelada.

• Análise do sobrenadante (depletado de IgG)

A comprovação da ausência de IgG, no sobrenadante obtido após

cromatografia de afinidade em batelada foi feita por imunodetecção (”dot blotting”),

utilizando como anticorpo secundário anti-IgG2a de rato complexado a peroxidase

(1:2000) (Figura 11). Esta figura mostra que o “pool” de albumina 2S foi reconhecido

pela IgG presente no soro antes da precipitação (dot A2). Porém, quando o

sobrenadante obtido após a precipitação foi utilizado como fonte de anticorpo

primário, tanto o tampão NaHCO3 0,2M pH 8.3 com NaCl 0,5M pH 8.3) (dot A3)

como a albumina 2S (dot A4) reagiram negativamente, indicando que as IgG foram

retiradas pelo processo de precipitação.

Figura 11 - “dot blotting” comprovando a ausência de IgG, no sobrenadante obtido após

cromatografia de afinidade em batelada, utilizando soro de rato: (A1) controle negativo

(água destilada) com anticorpo total anti-albumina 2S rato; (A2) Controle positivo (albumina

2S) com anticorpo total anti-albumina 2S rato; (A3) Tampão NaHCO3 0,2M pH 8.3 com NaCl

0,5M pH 8.3; (A4) albumina 2S com o sobrenadante como anticorpo primário.

1 2 3 4

A

Felix, S.P.

42

• Análise da fração ligada (fração IgG)

Inicialmente, o material ligado a proteína G acoplada a Sepharose, foi eluído

como descrito no item 3.4. A comprovação da presença de IgG, na fração eluída foi

feita por imunodetecção (“dot blotting”), utilizando o anticorpo secundário anti-IgG2a

de rato complexado a peroxidase (1:2000) (Figura 12).

Neste caso, as membranas foram previamente incubadas com tampão ou

com o “pool” de albuminas 2S.

Como mostrado na figura 12, o soro total (dot 2) e a fração eluída (fontes do

anticorpo primário, IgG) (dot 4) reconheceram as albuminas 2S, indicando que as

IgG ficaram ligadas na resina durante o processo de precipitação.

Figura 12 - “dot blotting” comprovando a presença de IgG, na fração eluída, obtida após

cromatografia de afinidade em batelada, utilizando soro de rato: (A1) controle negativo

(água destilada) com anticorpo total anti-albumina 2S rato; (A2) Controle positivo (albumina

2S) com anticorpo total anti-albumina 2S rato; (A3) Tampão contendo ácido acético 1M pH

2.5 com ácido acético 0,5M pH 2.5 com TRIS-HCl pH 9.0; (A4) albumina 2S com a fração

eluída como anticorpo primário.

O soro utilizado nos experimentos descritos, foi coletado de ratos R/A tor

reconhecidos como bons produtores de IgE. Assim, após os ensaios descritos

acima, denominamos o sobrenadante livre de IgG, como fração enriquecida em IgE

(FE) e o material eluído como fração enriquecida em IgG (FG).

1 2 3 4

A

Felix, S.P.

43

4.3 - Quantificação da desgranulação dos mastócitos de rato, sensibilizados

por FE e por FG.

Como já descrito na literatura, ratos podem produzir IgG2a e IgE que

poderiam se associar aos mastócitos e assim poderiam ser mediadores na interação

com os epitopos de albuminas 2S. Para verificarmos que classe de imunoglobulina

estaria envolvida neste processo, os mastócitos foram sensibilizados ou com soro

total, ou com FE ou com FG.

A tabela IV mostra o percentual de desgranulação de mastócitos promovido

pela albumina 2S e pelos diversos peptídeos sintéticos (P0, P1, P2, P3, P4 e P5)

nas diferentes situações. Podemos observar que a albumina 2S e os diferentes

peptídeos sintéticos, promoveram a desgranulação dos mastócitos quando estes

foram previamente incubados com o soro total, fonte de subclasses de IgG e de IgE,

e com a fração enriquecida em IgE (FE), indicando que somente as IgE estão

envolvidas neste processo.

Tabela IV - Percentual de desgranulação dos mastócitos desencadeada por albumina 2S e

peptídeos sintéticos, utilizando soro total, FE e FG.

Amostras #

% de

desgranulação

na presença de

soro total (±±±± D.P)

% de

desgranulação na

presença de FE

(±±±± D.P)

% de

desgranulação na

presença de FG

(±±±± D.P)

Controle negativo 30,0 (± 1,0) 30,0 (± 1,0) 30,0 (± 1,0)

Albumina 2S (ct +) 70,0 (± 1,0) 78,7 (± 1,6) 38,8 (± 1,7)

P0 74,0 (± 0,9) 75,0 (± 0,5) 33,1 (± 1,8)

P1 64,0 (± 0,4) 69,9 (± 1,7) 38,4 (± 0,1)

P2 70,0 (± 0,5) 67,9 (± 1,1) 39,0 (± 0,65)

P3 65,0 (± 0,7) 65,7 (± 0,3) 39,4 (± 0,3)

P4 67,0 (± 0,5) 67,2 (± 0,6) 38,4 (± 0,9)

P5 54,0 (± 0,2) 64,4 (± 0,6) 36,0 (± 0,8) # Os tampões que foram usados na precipitação foram testados e não desgranularam as células, não sendo

preciso retirá-los das soluções das imunoglobulinas purificadas.

- Tampão NaHCO3 0,2M com NaCl 0,5M ( presente na FE): 32% (± 1,9) de desgranulação;

- Tampão ácido acético 1M com ácido acético 0,5M com TRIS-HCl (presente na FG): 39,1% (± 1,9) de

desgranulação.

Felix, S.P.

44

4.4 - Investigação da capacidade de reconhecimento de albuminas 2S de

Ricinus communis, utilizando soro de indivíduos atópicos, pela técnica de “dot

blotting”.

Para investigação da capacidade de reconhecimento de albuminas 2S de

Ricinus communis, foi utilizado o soro de indivíduos atópicos que apresentavam

valores de IgE total acima de 140 KU/L, valor máximo de referência para adultos

não atópicos. Como controle negativo foi utilizado soro de um indivíduo não atópico.

Como a dosagem de IgE, feita por quimioluminescência no laboratório de

origem não era específica para IgE anti-albumina 2S de R. communis, realizamos

ensaios de “dot blotting” para determinarmos os melhores reatores. Como mostrado

na tabela V, somente os soros dos indivíduos 2 e 3 reconheceram as albumina 2S

de R. communis. O soro do indivíduo 3 foi utilizado nas análises posteriores por

apresentar um maior título para as albuminas 2S.

Felix, S.P.

45

4.5 - Identificação de epitopos alergênicos de albumina 2S de R. communis,

por “dot blotting”, utilizando soro do indivíduo atópico selecionado.

Como mencionado anteriormente, as duas principais isoformas de albuminas

2S de R. communis são Ric c 1 e Ric c 3. Cada uma destas proteínas é constituída

de duas cadeias polipeptídicas. As isoformas separadas das cadeias, já estavam

disponíveis em nosso laboratório, as quais foram empregadas nos ensaios de

reconhecimento pelo soro do indivíduo atópico selecionado. Como podemos verificar

na figura 13, ambas as isoformas foram reconhecidas (linha A) com intensidade

equivalente àquela do reconhecimento do “pool” de albuminas 2S. Na linha B,

observamos que as cadeias desnaturadas e alquiladas também foram reconhecidas

por este soro, indicando a presença de epitopos contínuos. Observamos ainda, na

figura 13, linha C que os epitopos reconhecidos por soro de ratos imunizados foram

também reconhecidos pelo soro do indivíduo atópico.

Felix, S.P.

46

Figura13 - “dot blotting” utilizando peptídeos sintéticos, Ric c 1 e Ric c 3 (os principais

alérgenos de R. communis): (A1) controle negativo (água destilada) com o soro do indíviduo

selecionado; (A2) albumina 2S sem soro; (A3) Quimiotripsina + soro; (A4) albumina 2S

(controle positivo) + soro; (A5) Ric c 1 + soro; (A6) Ric c 3 + soro; (B1) Cadeia leve de Ric c

1 + soro; (B2) Cadeia pesada de Ric c 1 + soro; (B3) Cadeia leve de Ric c 3 + soro; (B4)

Cadeia pesada de Ric c 3 + soro; (C1) P0 + soro; (C2) P1 + soro; (C3) P2 + soro; (C4) P3 +

soro; (C5) P4 + soro ; (C6) P5 + soro.

1 2 3 4 5 6

A B C

Felix, S.P.

47

4.6 - Avaliação da presença das imunoglobulinas E no sobrenadante, obtido

após a cromatografia de afinidade em batelada, utilizando soro do indivíduo

atópico.

A literatura não apresenta relatos de que a ativação dos mastócitos, em

humanos, possa ser mediada por IgG. Mesmo assim, adotamos um procedimento

de separação de IgG de IgE, similar ao que aplicamos para o soro de ratos.

A avaliação do reconhecimento das albuminas 2S foi então testada na

presença das frações isoladas, FE ou FG. A figura 14 mostra que o “pool” de

albumina 2S foi reconhecido tanto pelo soro total do índividuo atópico selecionado

(dot A2), quanto pela FE (dot A3), mas não pela FG (dot A4).

Figura 14 - “dot blotting” comprovando a presença de IgE, no sobrenadante obtido após

cromatografia de afinidade em batelada, utilizando soro do indivíduo atópico selecionado:

(A1) controle negativo (água destilada) com soro total; (A2) Controle positivo (albumina 2S)

com soro total; (A3) albumina 2S com FE como anticorpo primário; (A4) albumina 2S com

FG como anticorpo primário; (A5) Tampão contendo ácido acético 1M pH 2.5, ácido acético

0,5M, pH 2,5 e TRIS-HCl pH 9,0; (A6) Tampão NaHCO3 0,2M pH 8,3 contendo NaCl 0,5M

pH 8,3.

Felix, S.P.

48

4.7 - Identificação da natureza química dos aminoácidos, presentes nos

diferentes epitopos, envolvidos na interação com a IgE.

Nestes ensaios, os mastócitos sensibilizados com soro total de ratos foram

incubados com aminoácidos livres, a fim de avaliar a ocupação dos sítios das IgE

que poderiam ser responsáveis pelo reconhecimento de epitopos alergênicos.

Como foi proposto por Felix em 2006 que o grupamento γ carboxílico do ácido

glutâmico e/ou do ácido aspártico pudesse estar envolvido na ligação com as IgEs

ligadas nos mastócitos, esses dois aminoácidos foram omitidos do preparo da

mistura de aminoácidos.

Na tabela VI é mostrado o percentual de desgranulação de mastócitos

promovido pela Albumina 2S e pelos diversos peptídeos sintéticos (P0, P1, P2, P3,

P4 e P5), antes e depois da incubação prévia com a mistura de aminoácidos, livres

de aminoácidos dicarboxílicos. Como podemos observar, não houve mudança

significativa nos valores de desgranulação dos mastócitos quando estes foram

previamente incubados com estes aminoácidos. Ou seja, estes aminoácidos não

ocuparam os sítios de reconhecimento das IgE destinados ao reconhecimento dos

epitopos de albumina 2S.

Felix, S.P.

49

Tabela VI - Percentual de desgranulação desencadeada por albumina 2S e peptídeos

sintéticos, antes e após o tratamento com uma mistura de possíveis bloqueadores específicos

para cada peptídeo.

Amostras

Seqüência de

aminoácidos do peptídeo

% de desgranulação

antes do tratamento

na presença de soro

total (±±±± D.P)

% de desgranulação

após o tratamento com

uma mistura específica

de aminoácidos livres

para cada peptídeo na

presença de soro total

(±±±± D.P)

Controle negativo

X 30,0 (± 1,0) 30,0 (± 1,0)

Albumina 2S

(ct +)

X

70,0 (± 1,0)

69,5 (± 0,7)

P0 EGLRQAIEQQQSQGQ 74,0 (± 0,9) 63,0 (± 0,7)

P1 ESKGEREGSSSQQCR 64,0 (± 0,4) 67,1 (± 0,4)

P2 QEVQRKDLSSCERYLR 70,0 (± 0,5) 63,5 (± 0,7)

P3 QEQQNLRQCQEYIK

65,0 (± 0,7) 65,2 (± 0,8)

P4 DECQCEAIKYIAEDQ

67,0 (± 0,5) 63,8 (± 0,8)

P5 LHGEESERVAQRAGE

54,0 (± 0,2) 63,4 (± 0,9)

Felix, S.P.

50

Para avaliar o possível envolvimento do grupamento carboxílico das cadeias

laterais do ácido glutâmico e do ácido aspártico na ligação com as IgEs ligadas nos

mastócitos, esses dois aminoácidos foram utilizados separadamente da mistura de

aminoácidos empregados no experimento anterior.

A tabela VII mostra o percentual de desgranulação de mastócitos promovido

pela Albumina 2S e pelos diversos peptídeos sintéticos (P0, P1, P2, P3, P4 e P5),

antes e depois da utilização dos aminoácidos dicarboxílicos. A albumina 2S

apresentou um percentual de desgranulação de 70% antes do tratamento, 29,7%

depois do tratamento com Glu e 36,8% depois do tratamento com Asp. Resultados

similares foram observados para os peptídeos sintéticos, o que tornou evidente o

envolvimento destes aminoácidos na ocupação dos sítios das IgE.

Tabela VII - Percentual de desgranulação desencadeada por albumina 2S e peptídeos

sintéticos, antes e após o tratamento com ácido glutâmico (Glu) ou com ácido aspártico

(Asp).

Amostras

% de

desgranulação

antes do

tratamento na

presença de soro

total (±±±± D.P)

% de

desgranulação após o

tratamento com Glu

na presença de soro

total (±±±± D.P)

% de

desgranulação após o

tratamento com Asp

na presença de soro

total (±±±± D.P)

Controle

negativo

30,0 (± 1,0)

30,0 (± 1,0)

30,0 (± 1,0)

Albumina 2S

(ct +)

70,0 (± 1,0)

29,7 (± 0,1)

36,8 (± 0,4)

P0 74,0 (± 0,9) 37,0 (± 0,6) 40,6 (± 0,6)

P1 64 (± 0,4) 37,0 (± 1,9) 39,6 (± 1,8)

P2 70 (± 0,5) 30,3 (± 1,6) 40,4 (± 0,4)

P3 65 (± 0,7) 33,8 (± 1,7) 40,3 (± 0,2)

P4 67 (± 0,5) 36,7 (± 0,6) 39,2 (± 0,2)

P5 54 (± 0,2) 38,8 (± 1,4) 41,5 (± 0,3)

Felix, S.P.

51

4.8 - Avaliação dos efeitos dos aminoácidos dicarboxílicos, no bloqueio da

desgranulação de mastócitos de rato causado por albumina 2S e peptídeos

sintéticos, por dosagem de histamina:

A figura 15 mostra o cromatograma obtido após fracionamento por

cromatografia de troca iônica do sobrenadante do ensaio de desgranulação dos

mastócitos causada pelo conjunto de Albuminas 2S. Em preto podemos observar o

teor de histamina liberado quando os mastócitos foram pré-sensibilizados com soro

total de rato. Em rosa podemos observar a liberação de histamina quando os

mastócitos, pré-sensibilizados com soro total eram pré-incubados com ácido

glutâmico. Nesta situação verificamos que o ácido glutâmico impediu a liberação de

histamina.

Figura 15 - Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato. Tratamento

com albumina 2S com soro e albumina 2S com soro incubado previamente com o bloqueador

ácido glutâmico (Glu).

Felix, S.P.

52

A figura 16 mostra os cromatogramas obtidos após fracionamento por

cromatografia de troca iônica dos sobrenadantes dos ensaios de desgranulação dos

mastócitos causada pelos peptídeos sintéticos. Na figura 16 e tabela VIII, podemos

observar que o ácido glutâmico reduziu a liberação de histamina, de 80% para 52%,

quando os mastócitos foram sensibilizados pelo peptídeo P0 (16A). Por outro lado, o

ácido glutâmico reduziu significativamente a liberação de histamina quando os

outros peptídeos sintéticos foram empregados (figuras 16B a 16F), sendo que o

bloqueio foi completo para os peptídeos P3 e P5.

Felix, S.P.

53

Figura 16 - (A) Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato.

Tratamento com P0 + soro e P0 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador; (B)

Tratamento com P1 + soro e P1 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador.

B

A

Felix, S.P.

54

Figura 16 - (C) Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato.

Tratamento com P2 + soro e P2 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador; (D)

Tratamento com P3 + soro e P3 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador.

D

C

Felix, S.P.

55

Figura 16 - (E) Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato.

Tratamento com P4 + soro e P4 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador; (F)

Tratamento com P5 + soro e P5 + soro e ácido glutâmico (Glu) como bloqueador.

F

E

Felix, S.P.

56

A tabela VIII mostra o percentual de histamina liberada pelos mastócitos

promovido pela albumina 2S e pelos diversos peptídeos sintéticos (P0, P1, P2, P3,

P4 e P5). Tanto para albumina 2S como para os peptídeos sintéticos foi utilizado

ácido glutâmico (Glu).

Tabela VIII - Percentual de liberação de histamina desencadeada por albumina 2S e peptídeos

sintéticos, antes e após o bloqueio com ácido glutâmico (Glu).

Amostras

%

de desgranulação

antes do bloqueio

na presença de

soro total (±±±± D.P)

%

de liberação de

histamina antes

do bloqueio na

presença de soro

total

%

de desgranulação

após o bloqueio

com Glu na

presença de soro

total (±±±± D.P)

% de liberação

de histamina

após o bloqueio

com Glu na

presença de soro

total

Controle

negativo

30,0 (± 1,0) 2 30,0 (± 1,0) 2

Albumina

2S (ct +)

70,0 (± 1,0) 64 29,7 (± 0,1) 6

P0 74,0 (± 0,9) 80 37,0 (± 0,6) 52

P1 64,0 (± 0,4) 58 37,0 (± 1,9) 6

P2 70,0 (± 0,5) 64 30,3 (± 1,6) 12

P3 65,0 (± 0,7) 58 33,8 (± 1,7) 4

P4 67,0 (± 0,5) 60 36,7 (± 0,6) 8

P5 54,0 (± 0,2) 56 38,8 (± 1,4) 4

Felix, S.P.

57

4.9 - Investigação da capacidade ligante de aminoácidos livres na porção Fab

da IgE humana, por ELISA.

Para avaliar se a ação bloqueadora do grupamento γ carboxílico do ácido

glutâmico estendia-se à IgE humana, foi feita a investigação da capacidade ligante

de aminoácidos livres na porção Fab da IgE humana por ELISA.

Na tabela IX são mostrados os valores obtidos quando albumina 2S, Ric c 1,

Ric c 3 e os diversos peptídeos sintéticos (P0, P1, P2, P3, P4 e P5), na presença ou

ausência do ácido glutâmico como bloqueador.

Na coluna 2 da tabela, podemos observar que tanto o “pool” de proteínas

nativas (albumina 2S) como as isoformas isoladas, Ric c 1 e Ric c 3, foram

reconhecidas pela IgE presente no soro do indivíduo atópico selecionado. Sendo

que Ric c 1 comportou-se como o mais alergênico. Entre os peptídeos, o P2

apresentou uma maior leitura. Ao analisarmos a coluna 3, podemos observar que o

ácido glutâmico provavelmente se ligou à IgE limitando a ligação dos diversos

epitopos. A eficiência de proteção foi máxima para os peptídeos P2, P3, P4, P5.

Felix, S.P.

58

Tabela IX - ELISA das amostras de albumina 2S, Ric c 1, Ric c 3, e peptídeos

sintéticos antes e depois do bloqueio com ácido glutâmico.

AMOSTRA ABS antes do

bloqueio

ABS depois do bloqueio

com Glu

Albumina 2S

com soro

0,877

0,187

Cadeia leve

Ric c 1

0,901

0,194

Cadeia leve

Ric c 3

0,461

0,204

Cadeia pesada

Ric c 1

0,452

0,193

Cadeia pesada

Ric c 3

0,464

0,211

P0

0,697

0,204

P1

0,593

0,186

P2

0,881

0,004

P3

0,662

0

P4

0,510

0

P5

0,466

0

Obs: A absorvância a 492 nm de albumina 2S sem soro antes do bloqueio foi de 0.

Felix, S.P.

59

4.10 - Avaliação da existência de reações cruzadas entre albumina 2S de

Ricinus communis e alérgenos alimentares, através da desgranulação de

mastócitos de rato.

A tabela X mostra o percentual de desgranulação de mastócitos promovidos

por alérgenos alimentares. Foram obtidos antígenos derivados de alimentos de

diversas naturezas como vegetais, frutos-do-mar, aves, bovinos e suínos. O teor

protéico das diferentes preparações comerciais de alérgenos alimentares foi

inicialmente quantificado pelo método descrito por Bradford. Após esta dosagem

foram feitas diluições correspondentes para que, em cada ensaio de desgranulação,

fossem utilizados 10 µL da solução estoque (10 µg/mL) de extrato alergênico para

100 µL de células, e 1 µL de soro anti-albumina 2S.

Admitimos a existência de reação cruzada nas situações onde observou-se

um potencial de desgranulação de mastócitos acima de 50,0 %. Dados obtidos para

camarão (53,8 %), peixes (57,6 %), glúten (56,3 %), trigo (56,0 %), soja (62,5 %),

amendoim (51,4 %) e milho (54.4 %) mostram reação cruzada com albumina 2S de

R. communis.

Quando pimenta foi utilizada como fonte, os resultados não foram conclusivos

devido à presença de pigmentos nestes extratos.

Apesar de ter havido desgranulação para o alérgeno de morango, esta não é

desencadeada por IgE, já que mesmo sem o soro anti-IgE houve a desgranulação

dos mastócitos quando este alérgeno foi incubado diretamente com as células.

A porcentagem de desgranulação sem o soro, apresentada na tabela X, prova

que a desgranulação de mastócitos foi mediada por anticorpo e não por outros

fatores.

Felix, S.P.

60

Tabela X - Percentual de desgranulação desencadeada por alérgenos alimentares.

Alimentos

% desgranulação na

ausência de soro total

(±±±± D.P)

% desgranulação na

presença de soro total

(±±±± D.P)

Controle

negativo

27,6 (± 1,2)

30,0 (± 1,0)

Albumina 2S(ct +) 34,6 (± 1,3) 70,0 (± 1,0)

Aves 29,2 (± 0,9) 38,5 (± 0,2)

Camarão 34,0 (± 0,7) 53,8 (± 0,8)

Carne Bovina 23,3 (± 0,3) 31,5 (± 0,2)

Carne Suína 29,0 (± 0,3) 40,3 (± 0,4)

Clara 29,2 (± 0,3) 40,5 (± 0,3)

Tomate 28,6 (± 0,5) 41,3 (± 0,4)

Gema 27,0 (± 0,7) 39,0 (± 0,7)

Leite 29,1 (± 0,3) 46,4 (± 0,6)

Peixes 38,8 (± 1,0) 57,6 (± 0,3)

Arroz 31,4 (± 0,4) 42,0 (± 0,7)

Glúten 43,6 (± 1,0) 56,3 (± 0,5)

Morango 52,8 (± 0,2) 53,2 (± 0,2)

Trigo 38,8 (± 0,2) 56,0 (± 0,9)

Soja 27,4 (± 0,4) 62,5 (± 0,4)

Abacaxi 35,9 (± 0,9) 43,6 (± 0,6)

Cacau 23,2 (± 0,3) 46,0 (± 0,3)

Caju 23,1 (± 1,2) 37,6 (± 0,8)

Amendoim 30,2 (± 0,3) 51,4 (± 0,3)

Laranja 29,3 (± 0,1) 37,9 (± 0,8)

Limão 30,2 (± 1,4) 36,4 (± 0,3)

Milho 34,4 (± 1,0) 54,4 (± 1,5)

Felix, S.P.

61

4.11 - Avaliação da existência de reações cruzadas entre albumina 2S de

Ricinus communis e alérgenos inalantes, através da desgranulação de

mastócitos de rato.

A tabela XI mostra o percentual de desgranulação de mastócitos promovidos

por alérgenos inalantes, cuja concentração também foi padronizada pelo método

descrito por Bradford. Os maiores níveis de desgranulação de mastócitos foram

observados para poeira domiciliar com 51,4%; fungos do ar com 51,9% e tabaco

55,0%.

Apesar de ter havido desgranulação para o alérgeno de macela, esta não é

desencadeada por IgE, já que mesmo sem o soro anti IgE houve a desgranulação

dos mastócitos quando este alérgeno foi incubado diretamente com as células.

Felix, S.P.

62

Tabela XI - Percentual de desgranulação desencadeada por alérgenos inalantes

(aeroalérgenos).

Inalantes

% desgranulação na

ausência de soro total

(±±±± D.P)

% desgranulação na

presença de soro total

(±±±± D.P)

Controle negativo 27,6 (± 1,2) 30,0 (± 1,0)

Albumina 2S (ct +) 34,6 (± 1,3) 70,0 (± 1,0)

Poeira domiciliar 36,7 (± 0,2) 51,4 (± 0,4)

Ácaros 34,9 (± 0,3) 35,4 (± 0,5)

Fungos do ar 48,7 (± 0,7) 51,9 (± 0,9)

Lã 36,2 (± 0,3) 38,0 (± 0,4)

Gramíneas 38,4 (± 0,4) 39,8 (± 0,2)

Flores 48,8 (± 0,1) 48,9 (± 0,4)

Tabaco 34,8 (± 0,2) 55,0 (± 0,9)

Epitélio de gato 35,0 (± 0,5) 41,0 (± 0,6)

Epitélio de cão 36,8 (± 0,3) 44,3 (± 0,5)

Epitélio de eqüino 31,4 (± 1,2) 34,8 (± 0,2)

Epitélio bovino 38,0 (± 0,5) 44,0 (± 0,3)

Epitélio mix 38,6 (± 0,3) 40,3 (± 0,3)

Penas mix 31,1 (± 0,2) 39,8 (± 0,9)

Algodão 30,3 (± 0,3) 35,8 (± 0,7)

Crina 36,9 (± 0,3) 40,2 (± 0,2)

Capim 38,6 (± 0,3) 40,1 (± 0,2)

Linho 32,9 (± 0,3) 41,6 (± 0,3)

Macela 58,0 (± 0,4) 65,9 (± 0,3)

Barata 32,4 (± 0,5) 36,5 (± 0,4)

Pireto 40,6 (± 0,2) 41,1 (± 0,2)

Seda 30,5 (± 0,3) 32,5 (± 0,5)

Taboa 36,8 (± 1,2) 39,6 (± 0,3)

Felix, S.P.

63

4.12 - Análise do efeito de aminoácidos dicarboxílicos como bloqueadores

utilizando diversos extratos alergênicos que reagiram cruzado com albumina

2S de Ricinus communis.

Como observamos que os ácidos dicarboxilícos estavam envolvidos na

interação entre IgE e os epitopos de albuminas 2S de R. communis, utilizamos

esses dois aminoácidos dicarboxílicos como possíveis agentes para bloquear a

resposta cruzada.

A tabela XII mostra o percentual de desgranulação de mastócitos promovido

por alérgenos alimentares e inalantes, que apresentaram reação cruzada com

albumina 2S, cujos mastócitos sensibilizados por soro anti-albumina 2S foram

previamente incubados com ácido aspártico ou glutâmico separadamente. Podemos

observar que ocorreu uma redução da resposta cruzada quando Asp e Glu foram

utilizados, sendo que a redução do percentual de desgranulação para todos os

alérgenos utilizados foi mais efetivo quando o ácido glutâmico foi empregado.

Felix, S.P.

64

Tabela XII - Percentual de desgranulação desencadeada por alérgenos alimentares e

inalantes antes e após o bloqueio com ácido glutâmico (Glu) ou com ácido aspártico (Asp).

Alérgenos alimentares

% de

desgranulação

antes do bloqueio

na presença de

soro total (±±±± D.P)

% de desgranulação

após o bloqueio com

Glu na presença de

soro total (±±±± D.P)

% de desgranulação

após o bloqueio com

Asp na presença de

soro total (±±±± D.P)

Controle

negativo

30,0 (± 1,0)

30,0 (± 1,0)

30,0 (± 1,0)

Albumina 2S

(ct +)

70,0 (± 1,0)

29,7 (± 0,1)

36,8 (± 0,4)

Camarão 53,8 (± 0,8) 40,0 (± 1,0) 41,6 (± 1,0)

Peixes 57,6 (± 0,3) 36,9 (± 0,2) 40,6 (± 0,3)

Glúten 56,3 (± 0,5) 37,5 (± 0,3) 40,6 (± 0,3)

Trigo 56,0 (± 0,9) 38,8 (± 0,5) 41,6 (± 0,2)

Soja 62,5 (± 0,4) 32,7 (± 0,3) 39,7 (± 0,3)

Amendoim 51,4 (± 0,3) 36,2 (± 0,5) 40,6 (± 0,4)

Milho 54,4 (± 1,5) 37,1 (± 0,3) 40,6 (± 0,5)

Alérgenos inalantes

Poeira

domiciliar

51,4 (± 0,4)

39,9 (± 0,7)

40,0 (± 0,2)

Fungos do ar 51,9 (± 0,9) 38,6 (± 0,1) 43,2 (± 0,5)

Tabaco 55,0 (± 0,9) 34,3 (± 0,4) 40,0 (± 0,6)

Felix, S.P.

65

5 - DISCUSSÃO

As alergias constituem um mal que afeta cerca de 25% da população mundial.

Este número está em crescimento diretamente relacionado com a toxicidade do

meio ambiente, exposição à poeira doméstica e pólen de diversas plantas

(GIOULEKAS et al., 2004). Além disto, indivíduos sensibilizados por determinada

substância alergênica podem desencadear processos alérgicos quando em contato

com outros alérgenos. O pólen e as sementes de diversas oleaginosas, como

girassol, mamona, soja e milho são ricos nestas proteínas alergênicas. Assim, a

alergia desencadeada por pólens, é um problema que pode afetar grande parte das

populações que residem próximo ao plantio destas oleaginosas, bem como do

trabalhador que manipula tais sementes (THORPE et al., 1988). Atualmente, a única

forma utilizada para selecionar os trabalhadores que manipulam a mamona é expô-

los ao contato com a planta por um curto período de tempo. Os trabalhadores que

apresentarem sintomas de alergia são considerados atópicos e são afastados do

trabalho.

No atual contexto mundial no qual se procura substituir combustíveis derivados

de petróleo pelos derivados de matéria orgânica (biodiesel, álcool) com fins de

obtenção de créditos de carbono, é de se esperar que o plantio de oleaginosas

como mamona cresça de forma exponencial, aumentando enormemente o risco de

sensibilização da população a estas substâncias alergênicas. Esta situação implica

que novas estratégias de tratamento para a alergia, visando principalmente alergias

provocadas por alérgenos de oleaginosas, sejam desenvolvidas.

A proposta desse trabalho resume-se na investigação de qual classe ou

subclasse de imunoglobulina é responsável pela alergia causada por albumina 2S

de Ricinus communis, na avaliação de se os epitopos reconhecidos por

Felix, S.P.

66

imunoglobulina de rato são também reconhecidos por IgE humana, e na confirmação

da existência de respostas cruzadas entre alérgenos de mamona e alérgenos de

outras fontes; além de investigar a ação de agentes bloqueadores de

imunoglobulina.

As albuminas 2S são encontradas em quase todos os tipos de sementes

(PASTORELLO et al., 1998). Na maioria das espécies, a albumina 2S consiste em

duas cadeias de aproximadamente 9 e 4 kDa, que são sintetizadas como um único

precursor ligado por pontes de enxofre antes do processamento vacuolar (clivagem

proteolítica) (PATRICK et al., 1996). As albuminas 2S de Ricinus communis já foram

descritas como proteínas alergênicas, quando foram relatados casos de

hipersensibilidade em populações que residiam próximo aos moinhos de

processamento de óleo de mamona (THORPE et al., 1988).

Estudos bioquímicos anteriores do nosso grupo, realizados por Mayerhoffer em

2004, confirmaram o potencial alergênico do “pool” de albuminas 2S, mais

especificamente as cadeias Ric c 1 e Ric c 3 que induziram a desgranulação dos

mastócitos de rato mesmo quando desnaturadas, além de identificar dois epitopos

presentes na cadeia pesada de Ric c 3 que induziram respostas significativas. No

entanto, a hidrólise tríptica impediu a identificação de epitopos lineares nas demais

subunidades das isoformas das albuminas 2S.

A fim de identificar quais os epitopos de albumina 2S de Ricinus communis são

alergênicos, Mayerhoffer em 2004 e Felix em 2006 analisaram a alergenicidade de

seis peptídeos sintéticos os quais foram produzidos com base nas seqüências das

cadeias leves e pesadas de Ric c 1 e de Ric c 3, as principais isoformas de albumina

2S de Ricinus communis. Quatro dos epitopos de ligação com IgE foram

identificados na proteína Ric c 1 e dois na proteína Ric c 3. A partir dessa análise foi

Felix, S.P.

67

observado que todos os seis peptídeos induziram positivamente a desgranulação

dos mastócitos de rato (MAYERHOFFER, 2004 & FELIX, 2006).

Sabe-se que a alergia causada pela albumina 2S de R. communis e outros

alérgenos se dá pela ligação do antígeno com a IgE pré-ligada nos mastócitos e

basófilos. No entanto, em ratos, nosso modelo experimental, alguns alérgenos

deflagram a alergia se ligando com a IgG2a, como mostram estudos realizados por

Dybing e colaboradores em 2004 quando ratos são sensibilizados com alguns

aeroalérgenos presentes em partículas do ar. Além disso, Jonge e colaboradores em

2007 sensibilizaram ratos da linhagem “Brown Norway” com alguns alérgenos

alimentares, e observaram expressiva resposta mediada por IgG2a.

Logo, a fim de identificar qual imunoglobulina é responsável pela alergia

causada por albumina 2S de R. communis e alérgenos de outras fontes, fizemos

uma cromatografia de afinidade em batelada com soro total de rato, para separar as

imunoglobulinas E das imunoglobulinas G, processo que foi certificado por ensaios

de “dot blotting”. Posteriormente, testes de desgranulação de mastócitos foram feitos

utilizando as imunoglobulinas separadas e, a partir dessa análise, ficou comprovado

que para as albuminas 2S de R. communis, foi a IgE a responsável por tal evento da

resposta alérgica (desgranulação de mastócitos) (TABELA IV).

Como já descrito anteriormente, Felix em 2006 identificou os epitopos de

albumina 2S de Ricinus communis que são responsáveis pela desgranulação de

mastócitos de ratos. A fim de avaliar se esses epitopos reconhecidos por IgE de rato

são também reconhecidos por IgE humana foi feito “dot bloting” (Figura 13) e ELISA

(TABELA IX). A partir dessas análises comprovamos que a IgE humana reconhece

os mesmos epitopos que a IgE de rato. Assim, acreditamos que ao aprofundarmos

os estudos nesse assunto, poderemos desenvolver novas estratégias para

prevenção e/ou tratamento de indivíduos atópicos, já que esses epitopos, que foram

Felix, S.P.

68

reconhecidos pela IgE humana, podem ser bons candidatos para o desenho de

bloqueadores de IgE que visam a redução de efeitos anafiláticos, ou para o

desenvolvimento de variantes hipoalergênicas de albumina 2S; semelhante ao que

foi proposto em 2004 na patente americana (US 2004/0115220 A1). Esta propõe um

novo tratamento baseado na utilização de epitopos de IgE, no qual, as novas

regiões apresentadas podem ser alvo para a imunoprofilaxia ou imunoterapia

passiva ou ativa. Estes peptídeos são usados no tratamento da alergia ou podem

ser usados como vacina para induzir anticorpos próprios durante a imunoprofilaxia

ou imunoterapia.

Pons e colaboradores em 2004 mostraram que devido à homologia entre

aminoácidos das proteínas alergênicas de reserva das sementes de soja com

proteínas alergênicas de amendoim, é possível utilizar a imunoterapia de indivíduos

alérgicos à soja para indivíduos alérgicos ao amendoim. Sendo assim, acredita-se

que o mesmo possa ser feito com a albumina 2S de Ricinus communis e os

alérgenos de diversas fontes alimentares e inalantes que reagiriam positivamente ao

teste de reação cruzada. Para confirmar então se a IgE anti-albumina 2S reagiria

aos alérgenos de diversas fontes alimentares e inalantes do kit FDA Allergenic LTDA

padronizados pelo método descrito por Bradford, avaliamos as respostas cruzadas

entre esses alérgenos e foi observada reação cruzada para os alérgenos: camarão,

peixe, glúten, trigo, soja, amendoim, milho, poeira domiciliar, fungos do ar e tabaco.

Não foi possível verificar se a pimenta causava reação cruzada, pois esta

apresentava aspecto turvo ao se observar em microscópio ótico impossibilitando

assim a avaliação da desgranulação dos mastócitos. No caso do alérgeno de

morango e do alérgeno de macela, apesar de ter havido desgranulação, esta não foi

desencadeada por IgE, já que mesmo sem o anti-soro houve a desgranulação dos

Felix, S.P.

69

mastócitos quando estes alérgenos foram incubados diretamente com as células

(TABELA X e XI).

Diversas abordagens imunoprofiláticas e imunoterapêuticas passivas e ativas

que interferem com o evento clássico das reações alérgicas do tipo I, o mecanismo

de liberação de histamina mediado por IgEs, têm sido investigadas. O uso de

adjuvantes que induzem resposta Th1 ao invés de resposta Th2, além do switching

de classe de IgE para IgG tem sido uma dessas abordagens. A IgG atua bloqueando

o efeito do IgE, pois quando o IgG se liga no seu receptor, ele induz fosforilação no

receptor de IgE, inibindo assim a cascata de sinalização que seria desencadeada

por ele (STEPHEN et al., 2004; DAERON et al., 1995).

Além disso, a tecnologia do DNA recombinante causou uma tremenda explosão

de conhecimento sobre doenças causadas por alérgenos. Usando esta tecnologia,

quase um repertório completo de alérgenos tem sido produzido como moléculas

recombinantes e então utilizadas em uso clínico para diagnóstico e monitoramento

de doenças alérgicas (LINHART & VALENTA, 2005).

Outras estratégias visam a prevenção da ligação da região Fc da IgE aos

receptores FcεRI dos mastócitos, ou a ligação competitiva de IgE aos receptores por

peptídeos derivados da porção constante de IgE. A patente americana US

2002/0141989 A1 propõe esta estratégia de tratamento. Contudo, nenhuma

estratégia visa o bloqueio da fração Fab das imunoglobulinas E, evitando com que o

antígeno específico se ligue e deflagre a alergia. Visto que epitopos nada mais são

do que pequenas seqüências de aminoácidos reconhecidas pela molécula de

anticorpo, com o intuito de identificar bloqueadores específicos para tal região da

IgE, utilizamos os 20 aminoácidos livres, como possíveis agentes que poderiam se

associar às IgE ligadas nos mastócitos de rato.

Felix, S.P.

70

Para isso, utilizamos soro de ratos imunizados com albumina 2S de R.

communis, onde foram empregados os 20 aminoácidos livres em combinações

diferentes, previamente à adição de albumina 2S de R. communis e peptídeos

sintéticos separadamente. A efetividade do bloqueio foi então analisada por testes

de desgranulação de mastócitos. Os ácidos dicarboxílicos foram omitidos da mistura,

já que Felix em 2006 observou que nos seis peptídeos sintéticos, produzidos a partir

da seqüência da albumina 2S de R. communis, existiam pelo menos dois resíduos

de ácidos glutâmicos alternados. Essa característica nos fez acreditar na hipótese

de que os grupamentos γ carboxílicos deste aminoácido estivessem envolvidos na

ligação com as IgEs ligadas nos mastócitos. A partir do resultado de desgranulação

de mastócitos de rato, observamos que o bloqueio da ligação entre epitopo e IgE

não foi efetivo quando a mistura de aminoácidos livres, que omitia os aminoácidos

dicarboxílicos, foi empregado. Mas quando foi utilizado os ácidos glutâmico e

aspártico separadamente, observamos o bloqueio dessa ligação entre epitopo e IgE,

com níveis de desgranulação próximos ao controle negativo.

A histamina, que é um dos principais mediadores liberados pela desgranulação

dos mastócitos durante a deflagração da alergia, foi dosada e os valores obtidos

foram correlacionados com os resultados dos ensaios de desgranulação de

mastócitos, quando o ácido glutâmico foi utilizado como bloqueador.

Nossos experimentos evidenciaram que os aminoácidos dicarboxílicos agiram

como agentes bloqueadores de IgE, ou seja, esses aminoácidos impediram que a

albumina 2S de R. communis e os peptídeos sintéticos, produzidos a partir desse

alérgeno, se ligassem as IgE pré-ligadas nos mastócitos, evitando assim a

desgranulação destes e consequentemente a liberação de histamina e uma possível

deflagração da alergia. Isso mostra que esses bloqueadores são bons candidatos

Felix, S.P.

71

para o desenvolvimento de drogas para tratamento de alergias causadas por

mamona.

Os resultados obtidos a partir do teste de desgranulação de mastócitos

mostram que esses bloqueadores também foram efetivos para os alérgenos que

reagiram cruzado com o alérgeno de mamona (TABELA XII). Em virtude desses

resultados, o tratamento baseado neste princípio, que venha a ser desenvolvido

para alérgenos de mamona será polivalente, porque poderá ser utilizado também

contra alérgenos de outras fontes.

No entanto, muitos estudos ainda precisam ser feitos até que seja desenvolvido

um medicamento a partir desses bloqueadores, pois embora o ácido glutâmico e o

ácido aspártico sejam produzidos pelo organismo naturalmente, e serem

precursores da síntese de aminoácidos e muitas outras moléculas biologicamente

importantes, são quase totalmente absorvidos, o que facilitaria sua administração via

oral (REEDS et al., 1996), eles podem apresentar possíveis limitações quanto a seu

uso. Além de serem rapidamente metabolizados, o que diminuiria sua permanência

no organismo e consequentemente sua eficácia, existem alguns dados que mostram

que excesso desses aminoácidos no organismo pode comprometer a visão (SMITH,

1990).

Sendo assim, espera-se que os dados obtidos por este trabalho contribuam,

não só para a formação do conhecimento científico relevante nesta área, mas

também para o desenvolvimento de novas abordagens quanto ao tratamento e/ou

prevenção da alergia causada por Ricinus communis e conseqüentemente das

demais fontes alergênicas.

Felix, S.P.

72

6 - CONCLUSÃO

⇒ Uma metodologia para determinação do potencial alergênico, baseada em

ativação de mastócitos, quantificada por visualização por microscopia ótica e

dosagem de histamina foi desenvolvida

⇒ A reação de hipersensibilidade provocada pelas albuminas 2S de R.

communis, em ratos, é mediada por IgE

⇒ Os epitopos alergênicos das albuminas 2S mapeados em roedores, foram

também reconhecidos por IgE humana

⇒ Indivíduos atópicos, apresentando sintomas de alergia não associadas

diretamente à mamona, apresentaram IgE que reconheceram as albuminas 2S de

R.communis

⇒ Os resíduos de aminoácidos dicarboxílicos estão envolvidos na ligação da

IgE aos epitopos alergênicos

⇒ Existe reação cruzada entre albuminas 2S de R. communis com alérgenos

de diversas fontes alimentares e inalantes

⇒ Ácido glutâmico e ácido aspártico são agentes bloqueadores de IgE, e

portanto são candidatos potenciais para o tratamento da hipersensibilidade do tipo I,

podendo ser efetivo para alergia desencadeada não só por mamona, mas também

por camarão, peixe, glúten, trigo, soja, amendoim, milho, poeira domiciliar, fungos do

ar e tabaco

Felix, S.P.

73

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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