UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE NUTRIÇÃO EMÍLIA DE JESUS FERREIRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE

TERESA PALMISCIANO BEDÊ

EFEITO DO CONSUMO DE BEBIDAS RICAS EM POLIFENOIS SOBRE A FUNÇÃO E

INTEGRIDADE DO TECIDO HEPÁTICO DE RATOS ALIMENTADOS COM DIETA

HIPERLIPÍDICA

NITERÓI/RJ

2015

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE NUTRIÇÃO EMÍLIA DE JESUS FERREIRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE

TERESA PALMISCIANO BEDÊ

EFEITO DO CONSUMO DE BEBIDAS RICAS EM POLIFENOIS SOBRE A FUNÇÃO E

INTEGRIDADE DO TECIDO HEPÁTICO DE RATOS ALIMENTADOS COM DIETA

HIPERLIPÍDICA

Orientadora: Profª Dra. VILMA BLONDET DE AZEREDO

Co-orientadora: Profª Drª. GABRIELLE DE SOUZA ROCHA

NITERÓI/RJ

2015

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Curso de Mestrado do Programa de Pós-

graduação em Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal Fluminense, como

requisito para obtenção do grau de Mestre.

B399 Bedê, Teresa Palmisciano

Efeito do consumo de bebidas ricas em polifenóis sobre a

função e integridade do tecido hepático de ratos alimentados com

dieta hiperlipídica / Teresa Palmisciano Bedê; orientadoras: Vilma

Blondet de Azeredo. - Niterói, 2015.

105 f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense,

2015.

1. polifenóis 2. dieta hiperlipídica 3. fígado 4. ratos Wistar 4

I. Azeredo, Vilma Blondet de; II. EFEITO DO CONSUMO DE

BEBIDAS RICAS EM POLIFENÓIS SOBRE A FUNÇÃO E

INTEGRIDADE DO TECIDO HEPÁTICO DE RATOS

ALIMENTADOS COM DIETA HIPERLIPÍDICA

CDD 613.2

TERESA PALMISCIANO BEDÊ

EFEITO DO CONSUMO DE BEBIDAS RICAS EM POLIFENOIS SOBRE A FUNÇÃO E

INTEGRIDADE DO TECIDO HEPÁTICO DE RATOS ALIMENTADOS COM DIETA

HIPERLIPÍDICA

BANCA EXAMINADORA

Profª. Dra. Vilma Blondet de Azeredo - Orientadora

Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura

Universidade Federal Fluminense - UFF

Profa. Drª. Eliane Fialho de Oliveira

Universidade Federal do Rio de Janeiro

NITERÓI/RJ

2015

RESUMO

Introdução: A busca da população por melhor qualidade de vida contribui para os estudos

acerca de alimentos com propriedades funcionais e de prevenção de doenças. Destacam-se o

suco de uva tinto integral (SUTI) e o vinho tinto (VT) que, ricos em polifenóis, vem

demonstrando potente ação antioxidante e antinflamatória. Objetivo: Avaliar os efeitos do

consumo de SUTI, de VT e de solução de resveratrol (SR) sobre a função e integridade

hepática de ratos alimentados com dieta hiperlipídica. Materiais e Métodos: Foi realizado

ensaio biológico com 50 Rattus Novergicus Wistar Albino, fêmeas adultas, divididas em 5

grupos: controle (GC)- ração caseína + água; hiperlipídico (GH)- ração hiperlipídica + água;

vinho tinto (GV)- ração hiperlipídica + 10mL/dia de VT; suco de uva (GS)- ração

hiperlipídica + 15mL/dia de SUTI e, resveratrol (GR)- ração hiperlipidica + 15mL/dia de SR.

Durante 60 dias, ração e água foram ofertados em livre demanda e o peso corporal, o

consumo alimentar e a pressão arterial foram verificados e registrados. Ao final do estudo, os

animais foram sacrificados, amostras de sangue foram coletadas para análises bioquímicas e o

fígado foi retirado para avaliações histológicas. Para comparação das médias entre grupos foi

utilizado Anova one-way e Tukey como pós-teste, considerando um nível de significância de

5%. Resultados: A concentração de polifenóis totais (mg EAG -1

) e de trans-resveratrol

(mg/L) foi menor (p<0,05) no SUTI do que nas demais bebidas, mas a capacidade

antioxidante não diferiu entre elas. Não houve diferença no peso corporal e no consumo

alimentar dos grupos. A pressão arterial sistólica (mmHg) foi menor (p<0,05) no GS e GC. O

GH apresentou maior (p<0,05) variação de glicemia (mg/dL) e o GR foi o único que

apresentou diminuição de glicemia ao longo do estudo. A concentração (mg/dL) de colesterol

total foi menor (p<0,05) no GS do que no GC, mas não houve diferença na concentração

(mg/dL) de lipoproteína de alta densidade – HDL e, a concentração (mg/dL) de triglicerídeos

foi maior (p<0,05) no GC. Não houve diferença na concentração (U/L) de

aspartatotransaminase, mas o GS foi o único que apresentou-se dentro do intervalo de

normalidade. Todos tiveram concentração (U/L) de alaninatransaminase acima do

recomendado, mas o GS apresentou concentração numericamente menor e, a concentração de

fosfatase alcalina (U/L) do GR foi menor (p<0,05) do que o GH e GV. A concentração de

interleucina 6 (pg/mL) foi menor (p<0,05) no GS do que no GV. O peso do fígado

(g/100gPC) foi semelhante entre os grupos, mas a concentração de gordura hepática (g%) foi

menor (p<0,05) no GS e GC, e o teor de proteínas no fígado (g%) do GS foi menor (p<0,05)

do que no GV e GR. A área dos núcleos dos hepatócitos (µm²) foi menor (p<0,05) no GC do

que no GH, GV e GS, mas o IOD mostrou-se menor (p<0,05) no grupo GC, seguido pelo GS

e maior no GH e GV. Conclusões: O consumo de SUTI parece ser capaz de minimizar os

efeitos da dieta hiperlipídica sobre o tecido hepático. Mesmo diante do menor teor de

polifenóis, o SUTI pode ter conferido proteção sobre certos parâmetros bioquímicos

avaliados, assim como sobre o desenvolvimento de hipertensão arterial e da doença hepática

gordurosa não alcoólica, o que não foi observado com o VT e a SR.

Palavras-chave: polifenóis, dieta hiperlipídica, fígado, ratos Wistar.

ABSTRACT

Introduction: The search for people for better quality of life contributes to the studies of food

with properties functional and disease prevention. Stand out from the full red grape juice (JG)

and red wine (RW) that are rich in polyphenols, has demonstrated potent antioxidant action

and antinflammatory. Objective: To evaluate the effects of consumption of JG, RW and

resveratrol solution (SR) on liver function and integrity of mice fed high-fat diet. Materials

and Methods: This was a biological assay with 50 Rattus Novergicus Wistar Albino adult

females divided into 5 groups: control (GC) - casein diet + water; hyperlipidic (GH) - fat diet

+ water; red wine (GW) - fat diet + 10 mL of RW / day; juice (GJ) - fat diet + 15mL of JG /

day and resveratrol (GR) - fat diet + 15 mL of SR / day. During 60 days, feed and water were

offered on free demand and, body weight, food intake and blood pressure were checked and

recorded. At the end of the study, the animals were sacrificed, blood samples were collected

for biochemical analysis and the liver was removed for histological evaluation. To compare

the means between groups we used one-way ANOVA and Tukey as post-test, considering a

5% significance level. Results: The concentration of total polyphenols (mg EAG -1

) and

trans-resveratrol (mg/ L) was lower (p<0.05) in JG than the other drinks, but the antioxidant

capacity did not differ between them. There was no difference in body weight and food

consumption groups. Systolic blood pressure (mmHg) was lower (p<0.05) in the GJ and GC.

GH had higher (p<0.05) blood glucose change (mg/ dL), and GR is the only one that

decreases in blood glucose throughout the study. Concentration (mg / dL) of total cholesterol

was lower (p<0.05) in GJ than in the GC, but there was no difference in the concentration

(mg/ dL) of high-density lipoprotein - HDL and the concentration (mg/ dL) triglyceride was

higher (p<0.05) in GC. There was no difference in the concentration (U/L)

aspartatotransaminase, but the GJ was the one who introduced himself within normal range.

All had concentration (U/L) alaninatransaminase above recommended, but the GJ presented

numerically lowest concentration, and the concentration of alkaline phosphatase (U/L) of GR

was smaller (p<0.05) than GH and GW. The concentration of interleukin-6 (pg/mL) was

lower (p<0.05) in GJ than in the GW. Liver weight (g /100g body weight) was similar

between the groups, but the concentration of liver fat (g%) was lower (p<0.05) in the GJ and

GC, and the protein content in the liver (g%) GJ was lower (p <0.05) than the GW and GR.

The area of the nuclei of hepatocytes (μm²) was lower (p<0.05) in the GC than in the GH,

GW and GJ, but the IOD was lower (p <0.05) in the GC, followed by GJ and higher in GH

and GW. Conclusions: Consumption of JG seems to be able to minimize the effects of high

fat diet on liver tissue. Even with the lower polyphenol content, the JG may have conferred

protection on certain biochemical parameters, as well as on the development of hypertension

and non-alcoholic fatty liver disease, which was not observed with RW and SR.

Keywords: polyphenols, high fat diet, liver, Wistar rats.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Foto de animal contido para aferição de pressão arterial em

Plestimógrafo de cauda durante o experimento.

51

Figura 2 - Ilustração da técnica de Imprint 53

Figura 3 - Imagem da captura das fotomicrografias e delineamento dos núcleos dos

hepatócitos em microscópio Zeiss®, aumento 40x 54

Figura 4 - Concentração de polifenóis totais nas bebidas (suco de uva tinto integral,

vinho tinto e solução de resveratrol) ofertadas aos animais (em mg EAG L-1

)

58

Figura 5 - Cromatograma com a eluição do padrão de trans-resveratrol 58

Figura 6 - Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol no vinho tinto 59

Figura 7 - Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol no suco de uva

tinto integral

59

Figura 8 - Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol na solução de

resveratrol

59

Figura 9 - Concentração média de trans-resveratrol nas diferentes bebidas ofertadas

(em mg/L)

60

Figura 10 - Atividade antioxidante das bebidas ofertadas (em % SRL) 61

Figura 11 – Pressão arterial médias (sistólica e diastólica) dos animais (mmHg), ao

longo do estudo

64

Figura 12 - Concentração média de glicemia inicial, glicemia final e variação de

glicemia dos diferentes grupos (em mg/dL)

65

Figura 13 - Concentração média de colesterol total, lipoproteína de alta densidade -

HDL e triglicerídeos dos diferentes grupos (em mg/dL)

66

Figura 14 - Concentração média de Interleucina 6 (pg/mL) nos diferentes grupos,

ao final do estudo

69

Figura 15 - Fotomicrografia de fígado dos diferentes grupos, Reativo de Shiff,

aumento de 40x

70

Figura 16 - Área dos núcleos dos hepatócitos dos animais estudados (em µm²) 71

Figura 17 - Densidade óptica integrada dos núcleos dos hepatócitos dos animais

estudados

71

Figura 18 - Peso do fígado dos animais (em g/100gPC) dos diferentes

grupos, ao final do estudo 72

Figura 19 - Concentração média de proteína e gordura no fígado dos

animais (em g/100g de fígado) nos diferentes grupos, ao final do estudo

73

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 - Ingredientes utilizados para formulação das rações controle e

hiperlipídica ofertadas no experimento (g/100g ração) 45

Tabela 2 - Composição química das rações controle e hiperlipídica utilizadas no

experimento

45

Quadro 1 - Informação nutricional do suco de uva tinto integral, do vinho tinto e da

solução de resveratrol utilizados no experimento (em 100mL)

46

Tabela 3 - Medidas do de peso corporal inicial (g), peso corporal final (g) e da

variação de peso corporal nos diferentes grupos estudados

62

Tabela 4 - Consumo de ração (g /100g peso corporal/dia), consumo de bebidas

(mL/100g peso corporal/dia), consumo de resveratrol (mg/dia) e de polifenóis (mg

EAG/ dia) dos diferentes grupos, ao final do estudo

63

Tabela 5 - Concentração de aspartatotransaminase - AST (U/L),

alaninatransaminase - ALT (U/L), fosfatase alcalina (FAL), proteínas totais (g/dL) e

albumina (g/dL) dos diferentes grupos, ao final do estudo

68

Tabela 6 - Resumo das características químicas das bebidas ofertadas no estudo 87

Tabela 7 - Resumo dos parâmetros alimentares, bioquímicos e histológicos

avaliados nos animais do estudo

88

LISTA DE ABREVIATURAS

AG ácido graxo

AG´s ácidos graxos

AGL ácidos graxos livres

AIN American Institute of Nutrition

ALT alaninatransaminase

ANOVA análise da variância

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AST aspartatotransaminase

CEUA Comité de Ética no Uso de Animais

CLAE cromatografia líquida de alta eficiência

CO2 gás carbônico

CT colesterol total

DCNT doenças crônicas não-transmissíveis

DHGNA doença hepática gordurosa não-alcoólica

DNA ácido desorribonucléico

DPPH 2,2 difenil- 1- picrilhidrazil

EAG equivalente de ácido gálico

ELISA enzime-liked imuno sorbent assay

ERO´s espécies reativas de oxigênio

FAL fosfatase alcalina

GC grupo controle

GH grupo hiperlipídico

GR grupo resveratrol

GS grupo suco de uva tinto integral

GV grupo vinho tinto

HDL lipoproteína de alta densidade

ICAM-1 molécula de adesão intracelular-1

IFN-ϒ interferon gama

IL-1 interleucina 1

IL-6 interleucina 6

IOD densidade óptica integrada

kcal quilocaloria

LabNE Laboratório de Nutrição Experimental

LDL lipoproteína de baixa densidade

OD densidade óptica/ absorbância

PAD pressão arterial diastólica

PAS pressão arterial sistólica

PCR proteína C reativa

pH potencial hidrogênico

POF Pesquisa de Orçamentos Familiares

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório

SR solução de resveratrol

SUTI suco de uva tinto integral

TG triglicerídeos

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

UFF Universidade Federal Fluminense

VCAM molécula de adesão vascular

VLDL lipoproteína de densidade muito baixa

VT vinho tinto

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 15

2 OBJETIVOS 18

2.1 OBJETIVO GERAL 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19

3.1 DIETA HIPERLIPÍDICA E SUAS IMPLICAÇÕES NO

ORGANISMO

19

3.2 ALIMENTAÇÃO SAUDÁVEL E A BUSCA POR ALIMENTOS

FUNCIONAIS

20

3.3 POLIFENÓIS – COMPOSTOS BIOATIVOS PRESENTES NAS

UVAS

22

3.3.1 Resveratrol: polifenol presente nas uvas 25

3.3.1.1 Atividades biológicas do resveratrol 26

3.4 UVAS E SEUS DERIVADOS – O PODER DOS POLIFENÓIS NA

SAÚDE

28

3.4.1 Vinho e saúde 30

3.4.2 Suco de uva e saúde 34

3.5 FÍGADO E SUAS FUNÇÕES VITAIS 36

4 METODOLOGIA 42

4.1 COMITÉ DE ÉTICA 42

4.2 LOCAL E POPULAÇÃO DO ESTUDO 42

4.3 FORMAÇÃO DOS GRUPOS 43

4.4 RAÇÕES E BEBIDAS OFERTADAS 43

4.4.1 Rações: Controle e Hiperlipídica 43

4.4.2 Bebidas: água, suco de uva tinto integral, vinho tinto e solução de

resveratrol

46

4.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS BEBIDAS OFERTADAS:

SUCO DE UVA TINTO INTEGRAL, VINHO TINTO E SOLUÇÃO DE

RESVERATROL

46

4.5.1 Compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteau 46

4.5.2 Conteúdo de trans-resveratrol por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) 48

4.5.3 Capacidade antioxidante das bebidas por DPPH (2,2 difenil-1-

picrilhidrazil) 49

4.6 CUIDADO DOS ANIMAIS 50

4.6.1 Controle de peso corporal e consumo de ração e bebidas 50

4.7 PRESSÃO ARTERIAL: SISTÓLICA E DIASTÓLICA 50

4.8 COLETA DE AMOSTRAS 51

4.8.1 Análises bioquímicas 52

4.8.1.1 Glicemia 52

4.8.1.2 Colesterol Total (CT), Triglicerídeos (TG), Lipoproteína de alta

densidade (HDL – high density lipoprotein), Alanina transaminase (ALT),

Aspartato transaminase (AST)

52

4.8.1.3 Interleucina 6 53

4.8.2 Avaliações no tecido hepático 53

4.8.2.1 Determinação de fenótipos nucleares 53

4.8.2.2 Análise de imagens histológicas 54

4.8.2.3 Concentração de lipídeos no fígado 55

4.8.2.4 Concentração de proteínas no fígado 55

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS 55

5 RESULTADOS 57

5.1 CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS, TRANS-

RESVERATROL E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DAS BEBIDAS

UTILIZADAS NO EXPERIMENTO

57

5.1.1 Compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteau 57

5.1.2 Conteúdo de trans-resveratrol por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE)

58

5.1.3 Capacidade antioxidante 60

5.2 PESO CORPORAL, CONSUMO DE RAÇÃO E CONSUMO DE

BEBIDAS

61

5.2.1 Peso corporal 61

5.2.2 Consumo de ração, de água e de bebidas ricas em polifenóis 62

5.3 PRESSÃO ARTERIAL 63

5.4 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS: GLICEMIA, PERFIL LIPÍDICO,

TRIGLICERÍDEOS, MARCADORES HEPÁTICOS E IL-6 64

5.4.1 Glicemia 64

5.4.2 Perfil lipídico e triglicerídeos 65

5.4.3 Marcadores hepáticos 67

5.4.4 Interleucina 6 68

5.5 TECIDO HEPÁTICO: FENÓTIPO NUCLEAR, PESO DO ÓRGÃO,

TEOR DE PROTEÍNA E TEOR DE GORDUR A NO FÍGADO

69

5.5.1 Fenótipo nuclear dos hepatócitos 69

5.4.2 Peso do fígado, teor de proteína e teor de gordura no tecido hepático 72

6 DISCUSSÃO 74

7 CONCLUSÃO 87

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90

15

1 INTRODUÇÃO

A qualidade da dieta tem implicações importantes na saúde dos indivíduos. O padrão

atual da disponibilidade domiciliar de alimentos está diretamente relacionado com a elevada e

crescente prevalência de excesso de peso no país, e com o perfil de morbi-mortalidade da

população brasileira de maior prevalência das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT)

(LEVY et al., 2012).

Segundo a Pesquisa de Orçamentos Familiares - POF (2008-2009), nas últimas

décadas houve redução da disponibilidade de alimentos básicos tradicionais da dieta

brasileira, como o arroz e feijão, além de reduzida participação de hortaliças, excessiva

participação do açúcar e aumento do aporte proteico e de gorduras da dieta, especialmente por

meio de produtos de origem animal (IBGE, 2010).

Dietas ricas em gorduras estão associadas ao aumento de peso corporal e,

especialmente ao acúmulo de gordura visceral, o que predispõe ao desenvolvimento de

dislipidemia, estado pró-inflamatório e pró-trombótico - fatores de risco para doenças

metabólicas, como algumas injúrias hepáticas. Não só a quantidade, mas também o tipo de

ácidos graxos (AG) consumidos na dieta apresentam relação com esteatose hepática, gerando

lesão aos hepatócitos e redução da funcionalidade do órgão. Todo esse processo pode

desencadear um estado inflamatório e o possível desenvolvimento de fibrose tecidual, o que é

também promovido e/ou agravado pelo consumo abusivo de álcool (ALEGRÍA-EZQUERRA,

2008).

O fígado é o maior órgão do corpo humano e sabidamente um dos mais importantes.

Fundamental para o metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios, o fígado tem como

principal função digestiva a síntese e secreção de bile. Além disso, atua no armazenamento de

16

vitaminas e minerais, na degradação e excreção de hormônios, na biotransformação e

excreção de drogas e no auxílio à resposta imune. O tecido hepático é essencial não só para

controle e homeostase do organismo, mas também para reações metabólicas vitais à saúde que

podem ser desreguladas em processos de lesão hepática (SCHINONI, 2008).

Diante do atual cenário epidemiológico e da busca por maior qualidade de vida e o

interesse do consumidor na relação entre dieta e saúde tem aumentado substancialmente no

Brasil e no mundo. É reconhecido que a dieta balanceada pode reduzir o risco de doenças e

manter o seu estado de saúde e bem estar, juntamente com um estilo de vida saudável. Com

isso, a busca dos consumidores por alimentos que apresentem não só função nutricional, mas

também de prevenção de doenças, têm aumentado cada vez mais levando ao crescimento de

estudos acerca das propriedades funcionais dos alimentos (GRANATO et al., 2010).

Diversas pesquisas sobre antioxidantes na dieta e combinações de substâncias

protetoras nas plantas têm ajudado no desenvolvimento de processos para obtenção de

alimentos funcionais no Brasil (GRANATO et al., 2010). O objetivo de terapêuticas

preventivas tem levado profissionais da área da saúde à busca de novos compostos bioativos

capazes de promover saúde e prevenir co-morbidades. Dentre estes, destacam-se os

polifenois, cuja relação com a prevenção de doenças vem sendo amplamente discutida

(BRASIL, 2009).

Nos alimentos, diversos tipos de polifenois podem ser encontrados em fontes vegetais

como frutas, hortaliças, sementes oleaginosas e ervas aromáticas. O suco de uva tinto integral

(SUTI) e o vinho tinto (VT) são ricos em polifenóis e estudos têm demonstrado potente ação

antioxidante e anti-inflamatória dessas bebidas, principalmente associadas ao resveratrol

presente nas uvas e seus derivados (PEREIRA & CARDOSO, 2012; MIDDLETON et al.,

2000; LUCILE et al., 2007). Em paralelo, a indústria farmacêutica vem lançando no mercado

cápsulas de diferentes polifenóis (como do resveratrol), enfatizando sua ação antioxidante e

protetora contra doenças (GIEHL et al., 2007).

Apesar da grande quantidade de resultados, muitas pesquisas necessitam ainda ser

realizadas utilizando modelos in vitro e in vivo antes que venham a ser aplicadas em seres

humanos, a fim de comprovar a promoção da saúde e as propriedades descritas anteriormente,

17

correlacionadas ao resveratrol. Além disso, ainda existem várias controvérsias a respeito das

atividades biológicas do resveratrol, o que sugere um amplo campo de estudo para descobrir

os potenciais benefícios à saúde humana, também no que diz respeito à integridade e função

hepática (AGARWAL et al., 2013; DAVID, 2007).

Diante disso, estudar o efeito do consumo de bebidas ricas em polifenois sobre a

função e integridade do tecido hepático torna-se relevante já que os dados expostos na

literatura indicam benefícios destes compostos bioativos na prevenção de diversas doenças e

lesões teciduais decorrentes de uma dieta hiperlipídica.

18

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito do consumo de bebidas ricas em polifenóis sobre a função e

integridade do tecido hepático de ratos alimentados com dieta hiperlipídica.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar características químicas das bebidas ofertadas - concentração de

polifenois totais e de trans-resveratrol e a capacidade antioxidante no suco de

uva tinto integral (SUTI), vinho tinto (VT) e na solução de resveratrol (SR);

Avaliar a variação do peso corporal e o consumo alimentar dos animais;

Determinar parâmetros bioquímicos dos animais - concentração sérica de

colesterol total (CT), lipoproteína de alta densidade (HDL) e triglicerídeos

(TGL); alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST) e fosfatase

alcalina (FAL); proteínas totais e albumina; e glicemia (inicial e final);

Determinar a concentração da citocina inflamatória - interleucina-6 (IL-6);

Avaliar o peso do fígado e a concentração de proteínas e lipídeos do tecido

hepático;

Avaliar a pressão arterial nos animais - sistólica (PAS) e diastólica (PAD);

Avaliar os fenótipos nucleares do fígado;

55

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 DIETA HIPERLIPÍDICA E SUAS IMPLICAÇÕES NO ORGANISMO

A elevada prevalência de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) na população

brasileira ao longo dos anos vem sendo associada a modificações no padrão alimentar e na

prática de atividade física. As mudanças na alimentação revelaram que houve aumento na

disponibilidade e consumo de alimentos industrializados - ricos em açúcar, sódio e gordura

(principalmente saturadas e trans). Em contrapartida, houve redução do consumo de alimentos

considerados mais saudáveis, como cereais, leguminosas, frutas e verduras – ricos em

vitaminas, minerais, fibras e compostos bioativos. Com isso, tem havido maior acesso e

consumo de alimentos hipercalóricos e hiperlipídicos com baixo custo (IBGE, 2010).

Neste contexto, nas últimas décadas no Brasil, as DCNT passaram a determinar a

maioria das causas de óbito e incapacidade prematura, incluindo algumas doenças hepáticas

(BRASIL, 2008). Diversos ensaios randomizados demonstram que intervenções alimentares

adequadas podem diminuir ou prevenir significativamente o aparecimento de diversas DCNT

(ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE, 2003). A etiologia múltipla destas

doenças não permite que elas possuam causas claramente definidas. No entanto, as

investigações epidemiológicas tornaram possível identificar, dentre os diversos fatores de

risco, a alimentação e o consumo excessivo de álcool como fatores predisponentes às DCNT

(BRASIL, 2008; ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE, 2003).

A gordura dietética é importante para diversas funções no organismo, mas em excesso

pode gerar alterações na fisiologia e metabolismo dos indivíduos (MCLELLAN et al., 2007).

Aproximadamente 98% da gordura dos alimentos estão na forma de TG, formados por uma

20

molécula de glicerol esterificada a três ácidos graxos (AG´s). O AG pode ser classificado

como saturado, monoinsaturado, poli-insaturado e trans (LOTTENBERG, 2009). Os lipídeos

da dieta estão envolvidos no abastecimento e no armazenamento de energia, são precursores

da síntese de hormônios, componentes da bile e da membrana celular e, participam de

complexos sistemas de sinalização intracelular (LOTTENBERG, 2009). Além disso, os

lipídeos participam, concomitantemente, da regulação de vias metabólicas e de processos

inflamatórios. Os AG´s atuam na síntese de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos

determinando forte associação entre a ingestão de gordura dietética e a síntese de

biomarcadores inflamatórios (BAER, 2004).

Acredita-se que o excesso de gordura na alimentação, o sobrepeso e o sedentarismo

induzam a maior entrada de glicose e ácidos graxos livres (AGL) nas células, mediada pela

ação da insulina. Numa dieta hiperlipídica estabelece-se a resistência à insulina pelos

adipócitos e células musculares, no entanto, as células ß-pancreáticas e endoteliais, não

dependentes deste hormônio, receberão sobrecarga de glicose e AGL. O hiperinsulinemismo e

a hiperglicemia, resultantes da resistência à insulina, têm sido relacionados com a

hipertrigliceridemia, a elevação da concentração de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e a

disfunção endotelial - importantes indicadores de risco para as doenças metabólicas

(MCLELLAN et al., 2007; MACHADO et al., 2003; RODRIGUES et al., 2003).

A dieta hiperlipídica é capaz de modular vias de sinalização aumentando o estado de

estresse oxidativo e inflamatório e, assim, gerar danos celulares e metabólicos a diversos

tecidos. No caso de lesões no fígado, já foi bem estabelecido na literatura que a quantidade e o

tipo de gordura alimentar exercem influência direta sobre fatores de risco para doenças

hepáticas (CHARBONNEAU, 2007). No entanto, cabe ainda identificar sob quais aspectos

uma dieta rica em gorduras pode causar danos ao fígado e a outros marcadores biológicos e

verificar possíveis meios de amenizar estes efeitos.

3.2 ALIMENTAÇÃO SAUDÁVEL E A BUSCA POR ALIMENTOS FUNCIONAIS

Com tantas mudanças no padrão alimentar e epidemiológico da população mundial e

brasileira, a preocupação da sociedade ocidental com os alimentos tem aumentado de forma

21

exponencial e a busca por uma alimentação mais saudável tornou-se foco no cenário

globalizado. No interesse de minimizar os efeitos gerados pela transição nutricional e o

consequente maior consumo de dietas hipercalóricas, hiperlipídicas e pobres em compostos

bioativos, a população e o governo vem buscando alternativas, dentre elas a busca por uma

alimentação balanceada. A alimentação saudável passou a ser tópico de discussão para

estratégias governamentais e o seu incentivo tem se tornado cada vez mais intenso por parte

das políticas públicas de saúde, principalmente no Brasil (IBGE, 2010).

No entanto, para que a alimentação exerça uma ação eficiente, evitando o

desencadeamento de doenças e permitindo ao indivíduo desenvolver uma vida saudável, é

necessário que seja consumida uma alimentação equilibrada, incluindo todos os nutrientes

com qualidade e quantidade adequados (AZEREDO, 2009).

Muitos compostos encontrados nos alimentos são responsáveis por efeitos benéficos

observados em indivíduos que os consomem. Isto porque os nutrientes presentes nos

alimentos, sejam eles essenciais ou não, podem modificar processos celulares, exercendo

efeitos fisiológicos protetores ao organismo humano. Os compostos bioativos dos alimentos

não são os nutrientes clássicos, mas apresentam propriedades funcionais benéficas, além dos

efeitos tradicionais dos nutrientes, e devem ter seu consumo estimulado (DE ANGELIS,

2001).

Alimentos funcionais podem ser definidos como aqueles que desempenham funções

que vão além das funções nutricionais conhecidas por conter substâncias que atuam no

organismo modulando funções bioquímicas e/ou fisiológicas. Resultam em maior proteção à

saúde, retardando inclusive, processos patológicos que conduzam a doenças crônicas e

degenerativas. No entanto, é necessário que o consumo destes alimentos seja regular a fim de

que seus benefícios sejam alcançados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008). Alimentos que

contém uma ou mais dessas substâncias, em concentrações adequadas, são considerados

funcionais. Através do consumo destes alimentos, há a oportunidade de viabilizar a ação de

moléculas biologicamente ativas como estratégia para corrigir distúrbios metabólicos, reduzir

riscos de doenças e promover manutenção da saúde (WALZEM, 2009). Esses produtos

podem variar de nutrientes isolados, produtos de biotecnologia, suplementos dietéticos,

alimentos geneticamente construídos até alimentos processados e derivados de plantas

22

(ANJO, 2004).

Segundo BRASIL (2002), substâncias bioativas são além dos nutrientes, os não

nutrientes que possuem ação metabólica ou fisiológica específica. Além disso, a resolução

descreve que os compostos bioativos seriam: carotenóides, fitoesteróis, fosfolipídeos,

organosulfurados, probióticos, flavonoides e polifenois.

3.3 POLIFENÓIS – COMPOSTOS BIOATIVOS PRESENTES NAS UVAS

A dieta mediterrânea, rica em frutas frescas e vegetais, tem sido associada com a baixa

incidência de DCNT, principalmente devido à elevada proporção de compostos bioativos,

como vitaminas, flavonoides e polifenois, conhecidos por gerar benefícios à saúde

(BENAVENTE-GARCIA et al., 2000).

O interesse de pesquisadores em compostos fenólicos, ou polifenois, deve-se à sua

grande abundância na dieta humana, ao reconhecimento das propriedades dessas substâncias,

e ao provável papel na prevenção de várias doenças (LIU et al., 2008).

Os polifenóis apresentam estrutura caracterizada por uma ou mais hidroxilas ligadas a

um anel aromático, formando os fenois, porém podem apresentar um ou mais grupos

hidroxila e mais de um anel aromático. Geralmente são sólidos, cristalinos, tóxicos e pouco

solúveis em água. São substâncias naturais visíveis na luz ultravioleta, geralmente

encontradas em plantas, participando da pigmentação, crescimento, reprodução e resistência

das plantas às doenças. Muitas dessas substâncias são antioxidantes naturais com

propriedades terapêuticas, estando presentes em alimentos e plantas medicinais (LOPES,

2003; DOS SANTOS & BATISTA, 2007).

O termo “polifenois” denota a presença de anéis fenólicos na estrutura química do

composto. Os efeitos benéficos dos polifenóis à saúde são diversos, como por exemplo, sua

propriedade anti-inflamatória, anticarcinogênica, antiaterogênica, antitrombótica,

antimicrobiana, analgésica e vasodilatadora. Mas, principalmente, por sua capacidade

antioxidante na prevenção de reações oxidativas e na formação de radicais livres, proteção

23

contra danos ao ácido desoxirrobonucleico (DNA) das células, além da capacidade de ativar

enzimas antioxidantes e detoxificantes, e de quelar íons metálicos (CHEMIN, 2010).

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), antioxidante é a

substância capaz de retardar o aparecimento de qualquer alteração oxidativa no

alimento(BRASIL, 1997). Na química, os antioxidantes são substâncias aromáticas que

contém uma ou mais hidroxilas, podendo ser sintéticos, utilizados na indústria alimentícia, ou

naturais, como os organosulfurados, fenólicos e terpenos que estão presentes em diversos

alimentos (OLIVEIRA, 2009).

O consumo de alimentos fonte de antioxidantes pode conferir proteção contra o

estresse oxidativo, além de fornecer co-fatores para enzimas antioxidantes endógenas. Os

compostos antioxidantes protegem os sistemas metabólicos do organismo contra os efeitos

deletérios dos radicais livres em diferentes alvos celulares e, entre os compostos vegetais com

capacidade antioxidante destacam-se os fenois (DOS SANTOS & BATISTA, 2007).

Os compostos fenólicos são classificados de acordo com o número de anéis de fenol

que apresentam em sua estrutura e os elementos estruturais que ligam estes anéis uns aos

outros. Os principais grupos de fenólicos são: flavonoides, ácidos fenólicos, taninos

(hidrolisáveis e condensados), lignanas e estilbenos (D'ARCHIVIO et al., 2007). E, de

acordo com seu esqueleto de carbono, os polifenois podem ser divididos em compostos não

flavonoides (estilbenos) e compostos flavonóides (KATALINÍC et al., 2010).

Os flavonoides apresentam capacidade antioxidante por seu elevado potencial redox,

permitindo sua ação como agentes redutores, doadores de hidrogênio e supressor de oxigênio

singlete. Além disso, eles são potentes quelantes de metais (TSAO et al., 2003). Quando

consumidos regularmente, os flavonoides foram associados à redução na incidência de

doenças como o câncer e doenças cardíacas (BEECHER, 2003; LIU et al., 2008). Atualmente,

diversas pesquisas têm sido realizadas acerca dos flavonóides devido a possibilidade

preventiva da saúde através da dieta com consumo de frutas e hortaliças.

Dentre os flavonóides, destacam-se as antocianinas que são pigmentos solúveis em

água e possuem coloração variada, como vermelho, roxo ou azul, dependendo do potencial

24

hidrogeniônico (pH). Presentes em todos os tecidos vegetais, as antocianinas estão nas folhas,

caules, raízes, flores e frutas (IGNAT et al., 2011). Assim como outros compostos fenólicos,

as antocianinas podem atuar como antioxidantes, doando hidrogênio para radicais reativos,

impedindo a formação de radicais livres (IVERSEN, 1999). O potencial antioxidante das

antocianinas depende do número e arranjo dos grupos hidroxila e grau de conjugação

estrutural, bem como da presença de elétron doador e substituintes que retiram elétrons na

estrutura do anel (LAPORNIK et al., 2005). As antocianinas possuem propriedades

farmacológicas e biológicas bem conhecidas, como atividades antinflamatória e antioxidante

(KONG et al., 2003).

Os ácidos fenólicos representam cerca de um terço dos fenois presentes nos alimentos,

podendo estar nas plantas na forma livre e/ou conjugada (ROBBINS, 2003). As diferentes

formas de ácidos fenólicos são relacionadas às condições de extração e também da variação

quanto à sensibilidade à degradação (ROSS et al., 2009). Ácidos fenólicos são divididos em

dois subgrupos, os ácidos hidroxibenzóico e hidroxicinâmico. Os hidroxibenzóicos incluem o

ácido gálico, p-hidroxibenzóico, protocatecuico, vanílico e siríngico. Ácidos

hidroxicinâmicos, por outro lado, são compostos aromáticos, sendo cafeico, ferúlico, p-

cumárico e ácidos sinápicos, os representantes mais comuns (BRAVO, 1998).

Os taninos são compostos de peso molecular relativamente alto e podem ser

subdivididos em taninos hidrolisáveis e condensados (PORTER, 1989). Os taninos

condensados são representados por: proantocianidinas, flavano 3-ois(-), (-)- epicatequina e

(+)-catequina e, os taninos hidrolisáveis são derivados do ácido gálico (3,4,5

trihidroxibenzóico) (HAGERMAN, 2002). Os taninos são quelantes de íons metálicos,

potenciais agentes precipitantes de proteínas e antioxidantes biológicos que têm diversos

efeitos sobre os sistemas biológicos. No entanto, tem sido difícil desenvolver modelos que

permitam previsão de seus efeitos em qualquer sistema devido às diversas funções biológicas

e à enorme variação estrutural que os taninos podem sofrer (HAGERMAN, 2002; JOHNSON

et al., 2013).

A maior parte das lignanas presente na natureza está na forma livre. Por conta disso, a

produção de lignanas se dá pela dimerização oxidativa de duas unidades de propano-fenil,

enquanto seus derivados glicosídeos são apenas uma forma menor. O interesse em lignanas e

25

em seus derivados sintéticos cresce cada vez mais devido às potenciais aplicações em

quimioterapia e vários outros efeitos farmacológicos (SALEEM et al.,2005).

Com relação aos estilbenos uma baixa quantidade está presente na dieta humana, e o

representante principal é o resveratrol, que existe nas formas isoméricas, cis e trans,

principalmente em formas glicosiladas (DELMAS et al., 2006). A substância é produzida por

plantas em resposta a infecção por patógenos ou a uma série de condições de estresse, como:

ataque fúngico, radiação ultravioleta e escassez de nutrientes (BAVARESCO, 2002). O

resveratrol foi detectado em mais de 70 espécies de planta, incluindo sementes e frutos, como

as uvas.

3.3.1 Resveratrol: polifenol presente nas uvas

O resveratrol (3, 4´, 5 trihidroxiestilbeno) é uma fitoalexina de ocorrência natural

encontrada em diversos alimentos e bebidas oriundos de plantas (SAUTTER et al., 2005). Foi

primeiramente conhecido como o componente principal do Kojo-kon, extraído das raízes do

Polygunum cuspidatum. Na China, este vegetal é comercialmente cultivado para a produção

de resveratrol usado em suplemento dietético. Já no Japão, é utilizado no chá de Itadori, que

representa uma fonte não-alcoólica do resveratrol (DELMAS et al., 2006). Resveratrol tem

sido identificado em 72 espécies de plantas distribuídas em 31 gêneros e 12 famílias, muitas

incluídas na dieta humana, como amoras, amendoins e uvas (ACQUAVIVA et al., 2002).

As fontes mais abundantes do resveratrol são as uvas Vitis vinífera, V. Labrusca e V.

Muscadine, que são usadas na fabricação de sucos e vinhos. Nas uvas, o composto é

encontrado nas videiras, raízes, sementes e talos, mas se concentram em maior quantidade na

película do fruto, chegando a atingir 50-100µg/g (SAUTTER et al., 2005).

Na uva, o resveratrol é sintetizado na casca como resposta ao stress causado pelo

ataque fúngico (Botrytis cinerea, Plasmopora vitcula), dano mecânico ou irradiação de luz

ultravioleta. A síntese ocorre naturalmente sob duas formas isômeras: trans-resveratrol (trans-

3, 4´, 5 trihidroxiestilbeno) e cis-resveratrol (3, 4′, 5 trihidroxiestilbeno). O isômero trans-

resveratrol é convertido para cis-resveratrol na presença da luz visível, tornando-se a forma

mais estável (SAUTTER et al., 2005).

26

O glicosídeo de resveratrol pode ser absorvido pelo intestino delgado, como os

glucosídeos de flavonoides (FREMONT, 2000). Em humanos após sua absorção, é

metabolizado pelas enzimas no fígado e possui meia-vida plasmática de 8-14 minutos. A

excreção é feita pela urina (WALLE et al.,2004).

O resveratrol é rapidamente metabolizado quando administrado em ratos por via oral

e, sua concentração sanguínea atinge o pico em apenas 10 minutos após a ingestão. Estes

efeitos são observados, apesar da biodisponibilidade extremamente baixa do resveratrol e

rápida depuração na circulação. Por outro lado, metabólitos são gerados, podendo estar

presentes em maior concentração no soro, sendo desta forma importante a investigação sobre

as atividades biológicas deste composto (FORESTER & ANDREW, 2009).

3.3.1.1 Atividades biológicas do resveratrol

A descoberta e compreensão do chamado “Paradoxo Francês” foi fundamental para

acelerar as pesquisas sobre os benefícios dos polifenois à saúde humana (FRANKEL et al.,

1995). Desde então, diversas pesquisas vêm mostrando que o resveratrol pode prevenir ou

retardar a progressão de diversas doenças. O trans-resveratrol é atualmente reconhecido como

uma molécula bioativa com potenciais efeitos benéficos na saúde devido a sua vasta gama de

propriedades farmacológicas e ausência de efeitos nocivos. O resveratrol é capaz de atuar em

diferentes processos biológicos do corpo relacionados à manutenção da saúde e prevenção ou

regressão de doenças (PEARSON et al., 2008).

Conhecido por sua capacidade antinflamatória, antiproliferativa, antiangiogênica e,

principalmente, antioxidante, o resveratrol também tem sido relatado como bactericida,

fungicida e antiviral. É capaz de modular lipídios séricos e o metabolismo de lipoproteínas, é

inibidor de agregação plaquetária e agente vasodilatador (DONNELLY et al., 2004; CASTRO

& SOUZA, 2007; FREMONT, 2000). Além disso, tem sido considerado um agente

quimiopreventivo e quimiterápico, podendo ainda prevenir ou retardar doenças cardíacas,

lesões isquêmicas, diabetes e inflamações patológicas de diversos órgãos, como o hepático

(LEONARD et al., 2003). No entanto, o mecanismo pelo qual o resveratrol exerce tal gama

de efeitos benéficos ainda não é claro. Resultados de estudos lançam dúvidas sobre as

27

respostas fisiológicas e as dosagens de consumo do composto utilizadas em experimentos in

vitro e in vivo (BAUR & SINCLAIR, 2006).

Os principais órgãos alvo do resveratrol são fígado, rins, coração, ovários, pulmões e o

cérebro. Devido à alta lipossolubilidade, este composto consegue cruzar a barreira hemato-

encefálica e as membranas citoplasmáticas, e atuar como agente protetor contra lesões nestes

tecidos, principalmente por conta de seu poder antioxidante (WANG et al., 2004).

O resveratrol também tem sido descrito por atuar na redução de síntese de lipídios no

fígado de ratos, inibindo a peroxidação lipídica hepática, e por sua ação hipolipidêmica no

organismo (FREMONT, 2000; MENG et al., 2005; LADEN & PORTER, 2001). No entanto,

o papel do resveratrol no perfil lipídico sérico vem sendo alvo de discussão, uma vez que há

pesquisadores que defendam que sua administração não é capaz de alterar o perfil lipídico

sérico de animais (ZERN et al., 2003; WANG et al., 2005).

Estudos em invertebrados, mamíferos e culturas de tecidos sugerem que o resveratrol

poderia, até certo ponto, “imitar” os efeitos benéficos de dietas com restrição calórica que

apresentam relação positiva com qualidade e prolongamento de vida. Este fato tem chamado a

atenção de pesquisadores que trabalham com animais de laboratório, pois busca-se a

descoberta de uma molécula que possa atuar beneficamente e, com segurança, de forma

semelhante à restrição dietética, retardando doenças relacionadas com a idade. Ao que tudo

indica, o resveratrol é capaz de “imitar” os efeitos de uma restrição dietética em organismos

inferiores (PEARSON, et al., 2008).

Em mamíferos, uma redução da ingestão calórica de 30% a 50% em relação aos níveis

“ad libtum” de consumo pode retardar o aparecimento de doenças relacionadas com a idade,

melhorar a resistência ao estresse oxidativo e dasacelerar o declínio funcional de diversos

órgãos. Além disso, o tratamento com resveratrol aumenta a biogênese mitocondrial,

melhorando o metabolismo celular de macronutrientes e hormônios reguladores, o que é

consistente com observações de restrição calórica em animais (PEARSON, et al., 2008).

Segundo Hou (2008) o resveratrol pode proteger o organismo contra doenças metabólicas

mimetizando a condição de restrição calórica. Mas, embora o resveratrol mimetize uma

restrição calórica, não há estudos conclusivos a respeito de seu papel sobre certos fatores

28

danosos de uma dieta hipercalórica e hiperlipídica (PEARSON, et al., 2008; HOU, et al.,

2008).

As doenças hepáticas apresentam grande índice de morbidade e mortalidade no país e

no mundo. Diversos estudos destacam o resveratrol como um agente terapêutico promissor

para tratamento de doenças no fígado, sendo considerado um composto hepatoprotetor.

Segundo Wang et al. (2009) o resveratrol apresenta efeitos benéficos à doença hepática

gordurosa não alcoólica (DHGNA) por impedir o acúmulo de TG nas células hepáticas

inibindo o seu fator de transcrição (BAUR & SINCLAIR, 2010; TENNEN et al., 2012). Além

disso, o resveratrol tem mostrado efeito antinflamatório no fígado por inibir as

prostaglandinas e reduzir a atividade das ciclooxigenases e do fator de transcrição NF-kB

(SHANKAR et al., 2007). Estes mediadores inflamatórios podem ativar as células estreladas

do fígado desencadeando uma inflamação no órgão. Acredita-se que o efeito antinflamatório

do resveratrol possa contribuir para a atividade antifibrótica no fígado doente pela inibição

das células estreladas (WALLACE et al., 2008).

3.4 UVAS E SEUS DERIVADOS – O PODER DOS POLIFENÓIS NA SAÚDE

Há mais de 8.000 tipos de polifenois, sendo todos em fontes vegetais. Apresentam-se

em hortaliças (couve, couve-flor, tomate, alho, cebola, espinafre, repolho, rabanete, escarola,

mostarda, nabo, beterraba), sementes oleaginosas (castanhas, nozes, amendoins, amêndoas,

pistache, linhaça), ervas aromáticas e especiarias (alecrim, manjericão, manjerona, sálvia,

alfavaca, gengibre, canela, açafrão, cúrcuma, colorau, cravo), chocolate amargo (com mais de

65% de cacau), frutas (uvas, cereja, laranja, limão, maçã, amora, morango, caju, jabuticaba,

mirtilo, ameixa, damasco), e, em bebidas (suco de amora integral, suco de mirtilo, chá verde,

chá branco, suco de uva integral e vinho tinto) (EFRAIM, 2011).

Os polifenois são os maiores grupos de fitoquímicos e apresentam grande importância

na fisiologia e na morfologia de plantas e no organismo humano (BALASUNDRAN et al.,

2006). Nos alimentos, os fenólicos contribuem para o flavor, o amargor, a adstringência, a

cor, o odor e a estabilidade oxidativa (NACZK & SHAHIDI, 2006).

29

Os compostos fenólicos são conhecidos por sua capacidade antioxidante e a relação

entre o teor de fenólicos totais e a capacidade antioxidante do fruto é direta, ou seja, frutas

com teores mais elevados de polifenois geralmente apresentam capacidade antioxidante mais

elevada (FANG et al., 2009).

A concentração de fenólicos totais em frutas e hortaliças varia de acordo com fatores

intrínsecos e extrínsecos como gênero, espécie, cultivares agrônomos, ambiente, manuseio e

estocagem. Nas bebidas, como suco de frutas, café, chá e vinhos, o teor de polifenóis se altera

por conta da maturação do fruto, das técnicas de produção, parâmetros de fabricação, entre

outros fatores (BALASUNDRAN et al., 2006).

A Organização Mundial de Saúde recomenda que o consumo de frutas e hortaliças

seja de, no mínimo, 400g/dia. O teor de polifenois é menor em certas frutas, como banana,

lichia, manga e caqui, quando comparado ao das frutas vermelhas (mirtilos, morangos,

framboesa, amora e cranberries) e ao das uvas (WHO, 2003; FALLER & FIALHO, 2009).

As uvas são consideradas uma das maiores fontes de compostos fenólicos, entretanto a

grande variedade nas formas de cultivo do fruto resulta em uvas com diferentes

características, tanto de sabor quanto de coloração. As diferenças encontradas entre os tipos

de uva certamente estão associadas ao conteúdo e ao perfil dos polifenois presentes neste

fruto (LUCILE, et al., 2007).

Dentre as culturas de frutas no mundo, o cultivo das uvas é um dos mais importantes,

com uma produção de mais de 60 milhões de toneladas do fruto por ano (MELLO, 2012). No

Brasil, a vitivinicultura é uma importante atividade comercial das regiões sul e nordeste. O

Rio Grande do Sul é o principal estado produtor de sucos, vinhos e derivados da uva, sendo

responsável por cerca de 90% da produção nacional (IBRAVIN, 2013). Atualmente no Brasil

a área de cultivo com videiras chega a mais de 80 mil hectares, sendo além do Rio Grande do

Sul, os estados de São Paulo, Pernambuco, Paraná, Santa Catarina e Bahia os principais

produtores do fruto. A safra de 2011 atingiu 1,46 milhões de toneladas de uva, superando a

safra de 2008, mas houve uma alteração no perfil onde 57,13% passaram a ser destinados à

produção de vinhos, sucos e derivados (MELLO, 2012).

30

As uvas e seus produtos derivados, suco e vinho, apresentam grande variedade de

polifenois que se concentram em maior quantidade na casca do que na polpa do fruto. Dentre

os polifenois presentes nas uvas estão ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas e o

resveratrol (LUCILE, et al., 2007; LEIFERT & ABEYWARDENA, 2008).

Os principais compostos fenólicos presentes nas uvas são os flavonóides

(antocianinas, flavanois e flavonois), os estilbenos (resveratrol), os ácidos fenólicos

(derivados dos ácidos cinâmicos e benzóicos) e uma grande variedade de taninos. São

classificados em dois grupos: os flavonóides e não flavonoides. Os flavonoides incluem

flavan-3-ols (catequinas), flavonóis (quercetina e outros) e antocianinas. Os não flavonoides

englobam os hidroxibenzoatos (acido gálico), hidroxicinamatos e estilbenos (resveratrol)

(YANG et al, 2009).

A uva pode ser consumida como fruta ou a partir de seus derivados, servindo de

matéria-prima para a produção de vinhos e sucos. Desta forma, torna-se fundamental que se

conheça os tipos e teores dos seus compostos fenólicos, pois estes podem influenciar a

qualidade de seus produtos finais (LUCILE, et al., 2007).

3.4.1 Vinho e saúde

A fabricação de vinhos também é uma forma de aproveitamento da uva. No Brasil, a

estrutura produtiva e mercadológica do setor vinícola apresenta uma especificidade em

relação aos países tradicionais produtores de vinhos. Nestes países, são admitidos apenas

produtos originários de variedades de uvas finas - Vitis vinifera, enquanto que no Brasil são

permitidas também as variedades americanas – Vitis labrusca e Vitis bourquina – e híbridas

(PROTAS, 2006).

De acordo com a legislação brasileira, os vinhos são obtidos da fermentação alcoólica

do mosto simples de uva sã, fresca e madura, podendo ser classificados em relação à sua

classe (mesa, leve, fino, espumante, frisante, gaseificado, licoroso e composto), cor (tinto,

rosado e branco), e ao teor de açúcar presente na bebida (em nature, extra-brut, brut, seco,

meio doce, suave e doce) (BRASIL, 1988).

31

No Brasil, o consumo de vinho é considerado baixo, cerca de 2,0 litros per capta em

2005, em relação a países de tradição vinícola como Itália e França que apresentam um

consumo anual de até 54 litros per capta (MACHADO, 2007).

Há anos tem-se discutido sobre a relação entre o consumo moderado de vinho e a

menor incidência de doenças cardiovasculares. Na França o índice de mortalidade por

doenças do coração é baixo mesmo com o consumo de uma dieta rica em gordura,

principalmente de origem animal. Este fato deu início às discussões sobre a relação do vinho e

a saúde. Inicialmente, estudiosos procuravam identificar quais alimentos faziam parte da dieta

dos franceses e Renaud & Lorgeril (1992) afirmaram que a ingestão de 3 a 5 doses de vinho

ao dia levou à redução pra 49% do índice de mortalidade por doenças cardíacas. Anos mais

tarde, Teissedre (2000), um dos pioneiros nesses estudos, voltou a associar os benefícios do

consumo de vinho ao perfil de morbimortalidade da população da França.

O alto consumo de gordura saturada e a baixa incidência de doenças coronarianas nos

franceses caracteriza o fenômeno denominado “Paradoxo Francês”. Essa contradição vem

incentivando pesquisas sobre os benefícios da ingestão moderada de bebidas alcoólicas à

saúde, principalmente, do VT (NIJVELDT et al., 2001; SUN et al., 2006).

Diversos estudos demonstram que o consumo moderado e regular de VT atua como

protetor para certas doenças, reduzindo a mortalidade por doença ateroesclerótica

coronariana, úlcera péptica, diabetes, degeneração macular senil, hipertrofia prostática,

alzheimer, demência, certos tipos de câncer e doenças inflamatórias, por exemplo (de

MENEZES, 2005; SOUZA FILHO & MONFRÓI, 2005; BROWNSON et al., 2002; LUCERI

et al., 2002; RIFICI).

Os benefícios do vinho são relacionados aos seus efeitos no aumento no HDL,

capacidade antiagragação plaquetária, e efeito antioxidante, podendo tornar as partículas de

LDL menos susceptíveis à oxidação e, portanto, menos aterogênica e também ação

vasodilatadora (SOUZA FILHO & MONFRÓI, 2005).

O vinho pode ser considerado como uma matriz complexa, onde muitas substâncias

ativas têm sido identificadas (BERTELLI, 2007). Segundo a literatura, os compostos

32

presentes no vinho que lhe conferem ações benéficas são o álcool etílico e os compostos

fenólicos (SAURA-CALIXTO & DÍAZ-RUBIO, 2007; JIMÉNEZ et al., 2007).

Os compostos fenólicos são constituintes das uvas e por isso estão presentes tanto no

VT quanto no branco (JANG et al., 1997; KANNER et al., 1994; WENZEL et al., 1987). Os

polifenois são importantes para o vinho no parâmetro de qualidade, contribuindo para suas

características sensoriais, como cor, adstringência e amargor, além da relação com a

prevenção de DCNT (RIVERO-PÉREZ et al., 2008). O teor de polifenois presente nos vinhos

parece ser determinado principalmente pelo tempo de fermentação da bebida em contato com

a casca, já que os polifenois se apresentam em maior quantidade na casca e não na polpa da

fruta. Dependendo da variedade da uva, seu cultivo, técnicas de fabricação e condições gerais

do plantio, como incidência de luz solar e de pragas, a quantidade de polifenóis no VT varia

de 1000 a 3500mg/L (VRHOVESK et al., 1997; RODRIGUES, 2005; SAURA-CALIXTO &

DÍAZ-RUBIO, 2007)

No vinho, os principais polifenois presentes são os ácidos hidroxicinâmicos, como o

ácido ferúlico, os ácidos hidroxibenzoicos, como o ácido gálico, e os estilbenzenos, como o

resveratrol que pertence à classe dos não-flavonoides. Dentre os flavonoides do vinho,

destacam-se a quercetina, a miricetina, catequina, epicatequina e as antocianinas (FREMONT,

2000; SAURA-CALIXTO & DÍAZ-RUBIO, 2007).

No entanto, os teores e tipos de compostos fenólicos extraídos do vinho variam de

acordo com a influência de vários fatores da vinificação como: tempo e temperatura de

maceração, concentração de etanol do mosto-vinho, programa de remontagem, emprego de

enzimas de extração e proporção sólidos/líquidos. Os fatores externos relacionados à uva são:

genético, agronômico e tecnológico -“terroir”, interação entre clima e solo e vitícola (SOUZA

FILHO & MONFRÓI, 2005). Woraratphoka et al. (2007) reforçam que o processo

tecnológico utilizado na produção do vinho também é um fator que contribui para a

quantidade total de polifenóis no mesmo, uma vez que o tempo em que as cascas permanecem

em contato com o mosto pode aumentar ou não o conteúdo de polifenois no vinho.

Na elaboração do VT, o tipo e a quantidade de compostos fenólicos desenvolvem um

papel fundamental na qualidade do vinho. A quantidade de compostos fenólicos no VT é

33

maior (1000-4000 mg/L) do que no vinho branco (200-300 mg/L) (BRAVO, 1998). Isto

ocorre não só pela presença das antocianinas no tinto, mas também pelos processos de

fabricação da bebida. Em certos tipos de VT as uvas são esmagadas com o engaço, casca e

semente, o que gera maior quantidade de compostos fenólicos (FRANKEL, WATERHOUSE

& TEISSEDRE, 1995).

Dentre os compostos fenólicos do vinho pode-se destacar o ácido gálico, a quercetina

e o resveratrol, como compostos funcionais que podem promover saúde e inibir doenças

(ALONSO et al., 2002; GOLDFINGER, 2003; BIANCHINI & VAINIO, 2003;

FRAGOPOULOU et al., 2003).

Catequina e ácido gálico são os compostos fenólicos em maior abundância no VT, mas

a predominância pode sofrer alterações de acordo com a procedência e o tipo da uva

(JACKSON, 1994). As antocianinas, flavonois, catequinas e outros flavonoides contribuem

para as características sensoriais, particularmente cor e adstringência, além dos seus efeitos

antioxidantes e farmacológicos (CARIDI et al., 2004).

Vinhos produzidos no Japão apresentam teores médios de resveratrol de 4,37mg/L no

VT e 0,68mg/L no vinho branco (TOMERA, 1999). Já no Brasil, Souto et al. (2001)

identificaram cerca de 0,82 a 5,75mg/L (média de 2,57mg/L) de trans-resveratrol nos vinhos

tintos brasileiros.

Certos estudos apontam que o consumo moderado de álcool tem efeito protetor contra

doenças cardiovasculares por aumentar a concentração de HDL e diminuir os níveis de

fibrinogênio e a reatividade das plaquetas. Entretanto, estudos mais recentes indicam que os

benefícios estão associados aos polifenois presentes nas bebidas alcoólicas e não ao álcool

(BERTELLI, 2007; JIMÉNEZ et al., 2007).

Especificadamente em relação ao consumo de vinho, as desvantagens de seu consumo

estão na sua relação com doenças orgânicas, alcoolismo, erosão dental e alteração no humor.

Entre as doenças relacionadas ao consumo de vinho estão: refluxo gastroesofágico,

principalmente pelo vinho branco, enxaqueca, câncer gástrico, entre outros (TOMERA,

1999).

34

O consumo de bebida alcoólica não é recomendado, pois sempre envolve risco à saúde

(WHO, 2003). Doses excessivas de álcool, acima de 30 a 50g por dia, podem gerar efeitos

deletérios ao consumidor (SOUZA FILHO E MONFRÓI, 2005). Segundo WHO (2003) o

álcool seria a causa de 20% a 30% de doenças como epilepsia, câncer esofágico, câncer

hepático e cirrose do fígado (BERTELLI, 2007).

3.4.2 Suco de uva e saúde

Dentre as várias alternativas de aproveitamento da uva, a elaboração de suco cresce

cada vez mais. Devido à facilidade de elaboração, aliada às características sensoriais (cor,

odor e sabor), e ao seu valor nutricional, o suco de uva pode contribuir positivamente na dieta.

Do ponto de vista nutricional, esse produto é comparado com a própria uva, pois na sua

composição estão todos os constituintes principais, tais como: açúcares, minerais, ácidos,

vitaminas e compostos fenólicos responsáveis por sua cor e estrutura (RIZZON &

MENEGUSO, 2007).

De acordo com o Ministério da Agricultura, suco de uva é a bebida não fermentada,

oriunda do mosto simples, sulfitado ou concentrado, de uva sã, fresca e madura. O suco de

uva pode ser classificado como integral, reprocessado, concentrado e desidratado, sendo o

suco de uva integral discriminado como suco de uva na concentração natural, sem qualquer

adição de açúcar (BRASIL, 1988).

O suco de uva é considerado uma bebida distinta, tanto sob o aspecto energético

quanto nutricional e terapêutico. Trata-se de uma bebida de sabor doce e ácido ao mesmo

tempo, com baixo teor em lipídios, proteínas e cloreto de sódio. No entanto, possui

quantidade elevada de açúcares, ácidos orgânicos e sais minerais. Além disso, contém

vitaminas e é de fácil digestibilidade, sendo todos os seus constituintes facilmente absorvidos

pelo organismo humano (RIZZON & MENEGUSO, 2007).

O suco de uva produzido no Brasil possui ótimas características sensoriais, além da

relação equilibrada entre açúcares/acidez, necessárias à elaboração de um produto com alta

qualidade (SANTANA et al., 2008). O consumo de suco de uva aumentou significativamente

nos últimos anos, com destaque para 2013 onde o aumento da comercialização foi de 42,94%

35

em relação ao ano de 2012. Esse índice representa um incremento de 9,97 milhões de litros

em relação ao primeiro semestre de 2012 (IBRAVIN, 2011).

O suco de uva é uma fonte importante de polifenóis, sendo a quantidade o tipo destes

compostos semelhantes aos da uva in natura. Destacam-se miricetina, quercetina,

procianidina, catequinas, antocianinas e trans-resveratrol como os principais polifenois

presentes no suco de uva concentrado (DÁVALOS et al., 2006).

Diversas etapas do processamento do suco de uva podem interferir na quantidade total

de seus compostos fenólicos, dentre elas a extração, o tempo de contato entre o suco e as

partes sólidas da uva (casca e sementes), prensagem, tratamentos térmicos e enzimáticos,

adição de dióxido de enxofre e/ou ácido tartárico (MALACRIDA & MOTTA, 2005;

MALACRIDA & MOTTA, 2006).

Segundo o estudo de Malacrida & Motta (2005), onde foram analisadas 12 marcas de

diferentes sucos de uva tintos simples, obtidos do comércio varejista da região metropolitana

de Belo Horizonte, o teor de fenólicos totais variam entre 0,60 e 2,41 g/L nos sucos de uva

simples.

Com relação ao teor de resveratrol, o método de prensagem no processo de produção

do suco de uva exerce efeito significativo, mas a maior influência é a do cultivo do fruto. No

estudo de Sautter et al. (2005) o teor de trans-resveratrol foi analisado em onze marcas

diferentes de sucos produzidos em várias regiões do país. Dentre os sucos de uva integral e o

néctar de uva, a concentração média de resveratrol foi de 0,41mg/L (variando de 0,39-

0,44mg/L). Mas, vale dizer que as marcas de suco de uva integral apresentaram um

coeficiente de variação maior, pois segundo a legislação do Brasil o suco integral deve manter

a concentração natural da fruta.

Em sucos de uva produzidos no Brasil foram encontrados valores entre 0,19 e 0,90mg

de resveratrol.L-1

(SAUTTER et al., 2005), quantidades inferiores às relatadas por ROMERO-

PÉREZ et al. (2004) para sucos de uvas da Espanha, com teores entre 0,7 e 14,5mg.L-1

que

pode estar relacionada ao tipo de processamento empregado na elaboração do suco bem como

as variáveis relacionadas ao clima, solo, temperatura e etc.

36

Diversos estudos epidemiológicos têm apontado associação entre o consumo de

alimentos e bebidas ricos em polifenois e a prevenção de doenças. Dentre eles está o suco de

uva que apresenta efeito hipolipidêmico, inibe a síntese de lipídeos hepáticos, aumenta a

eliminação de colesterol por intermédio dos ácidos biliares, além de poder regular a expressão

do receptor de LDL e a secreção de lipoproteínas (MALACRIDA & MOTTA, 2005;

DÁVALOS et al., 2006).

Castilla et al. (2006) verificaram que a suplementação dietética com suco de uva

concentrado exerceu efeito hipolipêmico, antioxidante e antinflamatório em indivíduos

saudáveis. Um ano mais tarde, Giehl et al. (2007) afirmaram que o suco de uva mostrou ser

mais rico em flavonoides que o VT, aumentando significativamente os teores de flavonoides

no plasma. O consumo de suco de uva integral mostrou-se eficaz, inibindo a oxidação lipídica

e diminuindo o desenvolvimento da placa de ateroma, além de atuar na melhora da função

endotelial, vasodilatação, e redução de agregação plaquetária, CT, citocinas inflamatórias e

pressão arterial (CASTILLA et al., 2006; GIEHL et al., 2007).

3.5 FÍGADO E SUAS FUNÇÕES VITAIS

O fígado é o maior e mais importante órgão metabólico do corpo humano, estando

localizado no lado superior direito do abdômen. Considerado o centro de diversas reações

metabólicas que ocorrem no corpo, o fígado realiza diversas funções importantes. O fígado é

constituído principalmente por células hepáticas ou hepatócitos que têm formato poliédrico e

se agrupam por anastomose nas unidades morfológicas chamadas de lóbulos (direito e

esquerdo). A principal função digestiva do fígado é a secreção de bile que facilita o processo

de digestão e absorção de lipídeos. O fígado é fundamental também para a regulação do

metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios, armazenamento e produção de diversas

proteínas, vitaminas e minerais, e para a degradação e excreção de hormônios. Além disso, o

tecido hepático participa da transformação e excreção de drogas, da hemostasia e no auxílio à

resposta imune (MATOS, 2002; SCHINONI, 2008).

As doenças hepáticas resultam em grande impacto nutricional, independente de sua

etiologia. Isto porque o fígado é responsável por inúmeras vias bioquímicas na produção,

37

modificação e utilização de nutrientes e de outras substâncias metabolicamente importantes

(MATOS, 2002; SCHINONI, 2008).

A dieta exerce efeito direto sobre o fígado e algumas de suas funções. O aumento no

consumo de gordura em todo o mundo vem tornando necessária uma maior investigação das

consequências do alto consumo de lipídeos, especificamente, para o fígado. Além das dietas

hiperlipídicas, a presença do álcool constitui por si só um agravante por promover desvios de

vias metabólicas aumentando o consumo energético, a produção de radicais H+ e das formas

ativas do oxigênio convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial

(MATOS, 2002).

A atividade metabólica aumentada do tecido hepático faz com que o consumo de

oxigênio seja elevado, gerando consequentemente, maior produção de radicais livres, também

chamados de espécies reativas de oxigênio (ERO’s). Embora exista durante um intervalo de

tempo extremamente curto, a grande quantidade de ERO´s muitas vezes exerce efeitos tóxicos

aos tecidos. Peroxidação lipídica, oxidação de proteínas celulares e lesão dos ácidos nucléicos

são alguns desses efeitos causados pelas ERO’s que contribuem para o dano celular funcional

e a necrose tecidual. Entretanto, estudos experimentais com ratos demonstraram que a

administração de agentes antioxidantes tem conferido proteção frente à lesão através da

redução dos índices de estresse oxidativo, como o caso de alimentos ricos em polifenóis

(STUMPF et al., 2012; PEARSON et al., 2005).

O fígado e o músculo esquelético são os principais locais de estoque de glicogênio.

Em situação de hiperglicemia, o fígado atua na síntese de glicogênio, mas quando a glicemia

está baixa, o fígado utiliza o glicogênio armazenado para sintetizar glicose (glicogenólise) no

intuito de manter os níveis glicêmicos relativamente constantes. O fígado é também o órgão

mais importante para a gliconeogênese (produção de glicose a partir de aminoácidos, lipídios

ou carboidratos simples), sendo todos esses processos regulados por diversos hormônios

(KUTCHI, 1998).

Os hepatócitos são os principais locais de origem e excreção de colesterol, uma vez

que a bile é a sua única rota de excreção do colesterol presente. Os hepatócitos são

responsáveis pela síntese e secreção de lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) que

38

são convertidas em outras lipoproteínas séricas - HDL, lipoproteína de densidade

intermediária (IDL) e LDL (KUTCHI, 1998).

Com exceção das gama-globulinas, o fígado sintetiza todas as proteínas plasmáticas. O

fígado produz aminoácidos não essenciais, assim como determinadas proteínas e enzimas que

atuam no organismo. Dentre estas proteínas, destaca- se por sua importância clínica a

albumina, cuja dosagem sérica reflete a capacidade funcional hepática. Entretanto, outros

fatores também podem influenciar os valores da albumina sérica, como exercícios físicos,

tabagismo e hábitos alimentares vegetarianos (DE FEO & LUCIDI, 2002).

Embora não seja classificado como um órgão de função primariamente imunológica, o

fígado é um importante componente do sistema imune. Componentes da resposta imune inata

e adaptativa estão presentes ou são sintetizados no tecido hepático. Os hepatócitos sintetizam

componentes do complemento e proteínas de fase aguda, como a Proteína C-reativa (PCR),

cuja concentração sanguínea se eleva radicalmente quando há um processo inflamatório em

curso (MARTINS, 2001). A IL-6 se constitui como um importante marcador inflamatório,

uma vez que essa citocina está envolvida numa série de atividades imunológicas, em especial

a síntese de substâncias de fase aguda pelo fígado, envolvida na regulação metabólica da

própria PCR. A IL-6 promove a síntese hepática desse marcador, porém também a PCR tem

seu efeito aterogênico mediado em parte pela síntese de IL-6. A modulação da produção de

proteínas de fase aguda pelo fígado depende de uma ação sinérgica entre citocinas: fator de

necrose tumoral alfa (TNF-α) induz a proteólise periférica, aumentando o fluxo de

aminoácidos para o fígado; a interleucina 1 (IL-1) estimula a síntese de proteínas de fase

aguda; a IL-6 induz a liberação das proteínas de fase aguda dos hepatócitos e o interferon-

gama (IFN-γ) amplifica a resposta inflamatória (PALTRINIERI, 2007).

Além disso, o fígado, por ser um órgão altamente vascularizado, é altamente povoado

por diversas células imunes que durante processos infecciosos e inflamatórios sistêmicos

podem afetar seu funcionamento. Tais células podem lesar o órgão no contexto da resposta

imune, mesmo não sendo o tecido hepático o alvo da agressão inicial. Dessa forma, o fígado

constitui um importante sítio de regulação do sistema imune o que, de certa forma, o torna

mais suscetível e vulnerável à resposta imune (MARTINS, 2001).

39

O metabolismo de medicamentos ou substâncias nocivas ao organismo também passa

pelo tecido hepático. Diversas drogas são frequentemente convertidas a formas inativas por

reações que ocorrem nos hepatócitos. Enquanto alguns medicamentos são inativados pela

ação hepática, outros são ativados ou convertidos a produtos tóxicos pela transformação no

fígado. Através dessas transformações, as drogas tornam-se mais solúveis e são excretadas

pelos rins ou são eliminadas diretamente pela bile. Isto pode ocorrer no caso de compostos

alimentares em excesso, por exemplo uma superdosagem (KUTCHI, 1998).

Para estudar o fenótipo dos núcleos de hepatócitos, a análise morfométrica de imagens

tem sido muito utilizada, principalmente para núcleos de hepatócitos de peixes e ratos e para

células epiteliais de mama humana. A técnica fornece parâmetros de avaliação quantitativa

discreta, permitindo uma análise rápida e barata dos processos de estresse celular, além de ser

precisa na identificação tecidual. Esses parâmetros podem ser úteis por serem bons

biomarcadores morfológicos (BAXES, 1994).

O estudo morfométrico de imagens se dá a partir da quantificação de medidas de

tamanho, indicadores de forma e descrições sobre os contornos de seus elementos, que podem

variar entre células e núcleos. Assim, a análise de imagens pode fornecer parâmetros

relacionados ao núcleo, como área, perímetro, forma, volume, valores de transmitância,

absorbância, entre outros (BAXES, 1994).

Em uma análise mais minuciosa, os estudos morfométricos também possibilitam

quantificar o DNA através da densidade óptica integrada (IOD), uma vez que esse parâmetro

está relacionado com a intensidade de coloração. Segundo Smith et al. (1996), é possível

relacionar a IOD com a quantidade de DNA presente no núcleo quando este é corado com

Schiff azul (azure A). Smith et al. (1996) usou a análise de imagens como ferramenta para

estudar a poliploidia de DNA, e demonstrou a existência de agrupamentos distintos de

núcleos de hepatócitos de ratos: 2C (diplóide), 4C (tetraplóide) e 8C (octaplóide).

A reação de Feülgen é específica para DNA, o que permite realizar o estudo

morfométrico nuclear e consequentemente analisar as alterações que podem ocorrer no

material genético por ação de algum tipo de agente agressor (VIDAL & MELLO, 1987; DE

CAMPOS VIDAL et al., 1998).

40

As características de como a cromatina está organizada estão diretamente relacionadas

com atividades transcricionais dos núcleos (MELLO et al., 2003). Vários níveis de

compactação do filamento de cromatina podem ser encontrados. Elas podem se apresentar

frouxa ou compactada, granulosa ou filamentosa e com distribuição textural variada. Assim,

cromatinas mais condensadas possuem pouca ou nenhuma atividade transcricional, enquanto

cromatinas mais frouxas são encontradas em núcleos de células com alta atividade metabólica

e, consequentemente, alta atividade gênica (VIDAL, 1984). Mas a estruturação da cromatina

não está apenas relacionada com aspectos fisiológicos. Sabe-se que em processos patológicos

a cromatina tende a sofrer modificações em sua supra-organização (MELLO et al., 2003).

Sendo assim, o estudo da morfologia nuclear em um dado tecido pode refletir seu

metabolismo, sua taxa de renovação de células, seus processos de remodelação e morte

celular (VIDAL, 1984; MELLO et al., 2003).

A esteatose hepática, por exemplo, pode ter diversas etiologias, sendo uma das mais

comuns a decorrente do uso abusivo de álcool (HENZEL et al. 2004), denominada Esteatose

Hepática Alcoólica. Mas quando a esteatose não está relacionada ao consumo de álcool, mas

sim a infecções virais, alterações congênitas ou doenças autoimunes, é definida como

esteatose hepática não-alcoólica ou DHGNA. A esteatose hepática tem sido definida como

um aumento maior do que 5% do volume ou peso do fígado no conteúdo intra-hepático de

TG, ou histologicamente, quando 5% ou mais dos hepatócitos contém triglicerídeos

intracelulares (HOYUMPA et al., 1975). O acúmulo excessivo de lipídeos está, normalmente,

associado com alterações no metabolismo de glicose, AGL e de lipoproteínas, ou com algum

processo inflamatório.

Algumas enzimas são de grande utilidade em casos de comprometimento

hepatocelular e, dentre estas, as de aceitação universal são as denominadas transaminases -

transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e transaminase glutâmico-pirúvica (TGP),

atualmente conhecidas como aminotransferases - aspartatotransaminase (AST) e

alaninotransaminase (ALT), respectivamente. São enzimas de localização intracelular

(hepatócito), sendo que a ALT é encontrada exclusivamente no citoplasma e a AST em sua

maior parte (80%) nas mitocôndrias e o restante (20%) sendo evidenciado na matriz

citoplasmática (MARTINS, 2012).

41

Tradicionalmente avalia-se a função hepática através das dosagens séricas de

albumina, tempo de pró-trombina e, por vezes, de bilirrubinas. Diversas conclusões podem ser

obtidas através de análises laboratoriais. Entretanto, mesmo na presença de graves lesões

hepáticas, a função hepática, em especial as dosagens séricas dos marcadores de função

hepática, pode mostrar-se inalterada (BORGES, 1998). Dessa forma, a avaliação da função e

lesão hepáticas não deve incluir apenas essas dosagens e deve ser sempre correlacionada com

a clínica do paciente e com outros exames de imagem muitas vezes.

A aparente contradição entre os quadros clínicos graves de hepatopatias com valores

discretamente alterados e mesmo normais em relação às aminotransferases é perfeitamente

explicada ao lembrarmos que estas enzimas são sintetizadas nas células hepáticas. Assim, nos

casos mais graves de doenças hepáticas é o que observamos maior grau de necrose celular e

substituição do parênquima hepático por tecido fibroso, não havendo, pois, elemento celular

indispensável para a síntese e secreção plasmática das enzimas (MARTINS, 2012).

Para ser indicativo de agressão hepática deve haver o aumento superior a duas vezes o

valor de referência da ALT ou da bilirrubina conjugada sérica, ou o aumento combinado da

AST, fosfatase alcalina (FAL), e bilirrubina total, desde que o resultado de pelo menos uma

das dosagens seja superior a duas vezes o valor de referência (BORGES, 1998).

42

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 COMITÊ DE ÉTICA

O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de ética responsável por pesquisas em

animais de laboratório da Universidade Federal Fluminense (UFF), sob o protocolo de

pesquisa de número 00216/10 (Anexo I). Todos os animais foram manipulados de acordo com

os princípios éticos adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

(SBCAL).

4.2 LOCAL E POPULAÇÃO DO ESTUDO

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Nutrição Experimental da

Universidade Federal Fluminense (LabNE-UFF), em colaboração com o Laboratório de

Ciências Radiológicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (LCR-UERJ) e com o

Laboratório de Biotecnologia de Alimentos da UFF (LABIOTEC – UFF).

Foram utilizados 50 Rattus novergicus Wistar albino, fêmeas, adultas (90 dias)

provenientes do LabNE-UFF. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de

polipropileno em ambiente com temperatura controlada (22ºC +/- 2ºC) e iluminação adequada

(ciclo claro e escuro de 12 em 12 horas). O experimento teve duração de 60 dias. Ao final

deste período, os animais foram sacrificados em câmara de gás carbônico (CO₂) e suas

carcaças embaladas em sacos plásticos e congeladas até o seu recolhimento pela empresa

especializada em retirada de material hospitalar.

43

4.3 FORMAÇÃO DOS GRUPOS

Para a formação dos grupos os animais foram separados por sorteio. Posteriormente a

esta etapa, os animais foram pesados e seu peso corporal analisado em software estatístico,

aplicando análise de variância (ANOVA) e pós-teste (Tukey) para verificação da

homogeneidade dos grupos (em relação à massa corporal inicial).

Os animais foram divididos em cinco grupos (n=10/grupo), da seguinte forma:

1- Grupo Controle (GC) - recebeu água filtrada e ração à base de caseína balanceada em livre

demanda. A ração controle foi elaborada de acordo com as recomendações da American

Institute of Nutrition - AIN 93M que visa à manutenção das necessidades nutricionais dos

animais em idade adulta.

2- Grupo Hiperlipídico (GH) - recebeu água filtrada e ração hiperlipídica (20,6%) à base de

caseína, em livre demanda.

3- Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - recebeu SUTI (15mL/dia), água filtrada e ração

hiperlipídica (20,6%) à base de caseína, em livre demanda. Suco de uva integral Aurora®.

4- Grupo Vinho tinto (GV) - recebeu VT (10mL/dia), água filtrada ração hiperlipídica

(20,6%) à base de caseína, em livre demanda. Vinho tinto Goes Tempos®.

5-Grupo Resveratrol (GR) - recebeu 15mL/dia de uma solução de resveratrol (SR) - 1mg/L,

água filtrada e ração hiperlipídica (20,6%) à base de caseína, em livre demanda.

O volume de VT ofertado aos animais (pesando em média 0,3kg) foi proporcional ao

consumo diário descrito como moderado para um humano (120mL para homem adulto).

Considerando a concentração de polifenóis totais do VT que é relatada pela literatura, foi

determinado o volume de SUTI ofertado diariamente a fim de assemelhar a quantidade dos

polifenois nas duas bebidas. Já para a SR, foi realizada uma busca no mercado acerca das

concentrações de resveratrol que são vendidas em cápsulas para humanos (20-500mg) e, a

partir de sua média, foi estipulada a concentração da solução oferecida aos animais.

4.4 RAÇÕES E BEBIDAS OFERTADAS

4.4.1 Rações: Controle e Hiperlipídica

44

As rações controle e hiperlipídica que foram ofertadas para o consumo dos animais

durante o experimento foram preparadas de 15 em 15 dias no LabNE-UFF por integrantes do

grupo de pesquisa.

Os ingredientes foram, primeiramente, separados e pesados em balança eletrônica

(Filizola®), de precisão 0,5g. Após a pesagem, os mesmos foram despejados em batedeira

industrial (Semcohobart®) para obtenção de uma massa homogênea e consistente. A partir da

massa, foram moldados pellets que, passaram por estufa ventilada (Espectru®) a 65°C

durante 24 horas para desidratação. Após este processo, foi feito o resfriamento dos pellets em

temperatura ambiente e as rações foram conservadas sob refrigeração, em refrigerador

(Eletrolux®).

As Tabelas 1 e 2 apresentam respectivamente os ingredientes para a formulação das

rações controle e hiperlipídica e suas composições químicas.

45

Tabela 1: Ingredientes utilizados para formulação das rações controle e hiperlipídica

ofertadas no experimento (g/100g ração)

Ingredientes Ração Controle Ração Hiperlipídica

Caseína* 14,0 14,0

Amido 62,1 46,07

Óleo de soja 4,0 -

Banha de porco - 20,0

Celulose 5,0 5,0

¹Mix vitaminas 1,0 1,0

²Mix minerais 3,5 3,5

B-colina 0,25 0,25

L-cistina 0,18 0,18

Açúcar 10,0 10,0

Total 100 100

Legenda: (*) % de proteína da caseína = 92,5% proteína/100g caseína; (1)

Mix de vitaminas (mg/Kg dieta):

palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina

0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100; (2)

Mix de minerais (g/Kg dieta):

sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio 0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de

zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoniacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37,

sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.

Tabela 2: Composição química das rações controle e hiperlipídica utilizadas no experimento

Ração Controle Ração Hiperlipídica

%/100g ração kcal/100g ração %/100g ração kcal/100g ração

Carboidrato 77,1 288,4 61,07 224,28

Proteína 12,95 51,8 12,95 51,8

Lipídeo 4 36 20 180

Total 94,05 376,2 94,02 456,08

Legenda: (kcal) quilocaloricas.

46

4.4.2 Bebidas: água, suco de uva tinto integral, vinho tinto e solução de resveratrol

Das bebidas ofertadas, a água filtrada foi oriunda do próprio laboratório de

experimentação. O SUTI e o VT foram adquiridos no comércio local e a SR foi preparada no

LabNE-UFF por membros do grupo de pesquisa misturando água filtrada com açúcar refinado

(para oferecer palatabilidade à solução) e o conteúdo de 1 cápsula de resveratrol (obtida em

farmácia de manipulação de 20mg de resveratrol).

As informações nutricionais do SUTI, do VT e da SR utilizados estão descritas no

Quadro 1.

Quadro 1: Informação nutricional do suco de uva tinto integral, do vinho tinto e da solução

de resveratrol utilizados no experimento (em 100mL)

Suco de uva tinto

integral*

Vinho tinto* Solução de

resveratrol **

Carboidrato (g) 15 2,9 5,2

Proteína (g) - traços -

Lipídeo (g) - - -

Álcool (g) - 10,6 -

Valor energético

(kcal)

60 85,8 20,8

Legenda: (*) Informações nutricionais obtidas nos rótulos do suco de uva tinto integral Aurora®, do vinho tinto

Goes Tempos®; (**) Dados obtidos por cálculo do total de carboidrato ofertado na solução.

Fonte: Suco de uva tinto integral Aurora®, Vinho tinto Goes Tempos® e da Cápsula de resveratrol manipulada

pela Farmácia de Manipulação MILIGRAMA®.

4.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS BEBIDAS OFERTADAS: SUCO DE UVA

TINTO INTEGRAL, VINHO TINTO E SOLUÇÃO DE RESVERATROL

4.5.1 Compostos fenólicos totais por Folin-ciocalteau

A determinação de fenólicos totais foi feita no SUTI e no VT. Foi considerado que o

conteúdo total de polifenois na SR corresponde à concentração do resveratrol na solução, pois

47

esta bebida era composta apenas por cápsula de resveratrol, açúcar e água. A concentração de

resveratrol está descrita no item 4.5.2 a seguir.

O conteúdo de compostos fenólicos no SUTI e no VT foi determinado pelo método

colorimétrico de Folin-Ciocalteau descrito por Singleton et al. (1999). O reagente Folin-

Ciocalteau é uma solução complexa de íons poliméricos formados a partir de heteropoliácidos.

Esse reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um complexo azul (MELO, 2010).

Para a técnica, foram preparadas as soluções de extração de acetona a 70%, Folin

Ciocalteu diluído a 10%, Carbonato de sódio a 7,5%, e solução de diluição do padrão acetona

aquosa a 7%.

Para obtenção do extrato bruto foram diluídos 2g de cada amostra em solução de

acetona a 70%. A solução sofreu agitação magnética por 30 minutos e foi filtrada em papel

de filtro quantitativo. O filtrado foi diluído em 10mL de água destilada e foi depositado em

tubos de ensaio: 0,5mL para o branco da amostra e 0,5mL desta solução e para cada leitura

adicionando 2,5mL de Solução de Folin-Ciocalteau a 10%. Os tubos sofreram agitação em

vortex e foram deixados à temperatura ambiente por 2 minutos Foram adicionados 2,0mL de

Solução de carbonato de sódio a 7,5%, para agitação em vortex e banho-maria à 50ºC por 15

minutos. Para interromper a reação, os tubos foram colocados em banho de gelo, mantendo o

intervalo de tempo inicial. As leituras de absorbância foram feitas em espectrofotômetro

(Bioespectro SP 220®) a λ de 760nm, logo em seguida. Para a leitura do extrato uma alíquota

de 2mL do extrato bruto a 7% de acetona foi passada em cartucho Oasis HLB e lavada 2x

com 2mL de água destilada. O filtrado foi recolhido, o volume final foi anotado e o

procedimento para leitura foi repetido.

Uma curva padrão de ácido gálico foi determinada a partir de uma solução de 5,0mg

de ácido gálico e 20mL de Solução padrão de acetona aquosa a 7%, avolumando-se a 50mL.

A curva foi determinada nas concentrações de 0, 20, 40, 60 80 e 100mg/L de ácido gálico.

Após análises, a concentração de fenólicos totais foi expressa em mg EAG L-1

(miligramas de

equivalente de ácido gálico por litro).

48

4.5.2 Conteúdo de trans-resveratrol por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

O resveratrol existe na forma dos isômeros trans- e cis-, mas diversos estudos indicam

que o trans-resveratrol é a forma termodinamicamente mais estável e bioativa na natureza,

sendo a configuração química natural do composto que, quando exposto à luz, pode ser

convertido à cis-resveratrol (MELZOCH et al., 2000; STIVALA et al., 2001; LANZILLI et

al., 2012). Com disso, os métodos desenvolvidos para a detecção do resveratrol são

geralmente escolhidos para analisar sua forma trans.

Para análise da concentração de trans-resveratrol nas amostras do SUTI, do VT e da

SR foi utilizada a técnica de CLAE, após extração, conforme descrito por Malovaná et al.

(2001).

Todas as análises cromatográficas foram realizadas protegendo-se as amostras e o

padrão da exposição aos raios UV com intuito de evitar a isomerização do composto estudado

(todo o material de análise foi embalado em papel alumínio e devidamente tampado). O

padrão permaneceu em temperatura controlada de -20ºC.

O padrão do trans-resveratrol (Sigma-Aldrich®) foi utilizado para a construção da

curva de calibração nas seguintes concentrações: 0,016; 0,04; 0,8; 1,6; 4; 10; 20; 40; 60; 80 e

100mg/L. Cada concentração foi injetada em duplicata seguindo as condições cromatográficas

utilizadas para o teste descrito por Malovaná et al. (2001). O tempo de retenção para o padrão

de trans- resveratrol foi de 25 minutos.

Após extração, as amostras foram analisadas em triplicata, sendo injetadas no sistema

de CLAE, com eluição por gradiente. Foi utilizado o cromatógrafo líquido de alta eficiência

integrado LC-20AT (Shimadzu®), composto de três bombas, processador central CBM-20A

e misturador de gradiente a alta-pressão SIL-20AC. Utilizou-se coluna C18 Shimpack VP-

ODS (Shimadzu®) de 5μ (4.6 x 250 mm) e pré-coluna C18 Shimpack GVP-ODS 5μ (4.6 x 10

mm) de mesmo fabricante para separação, e detector de arranjo de diodos SPD-M20A para

identificação e quantificação das substâncias. O loop utilizado foi de 20μL.

O sistema de solventes usado foi composto de (A) metanol - ácido acético – água

49

(10/2/88) (v/v/v) e (B) metanol- ácido acético - água (90/2/8) (v/v/v). Os compostos foram

eluídos com gradiente de três estágios lineares: partindo de 100 a 85% de A em 15 ̍, de 85 a

50% após mais 10 ̍ e de 50 a 30% após mais 9 minutos com uma vazão total de 1.2mL.min-1

.

A pressão do sistema foi mantida em torno de 12 atmosferas.

A detecção espectrofotométrica foi efetuada na região do UV, e a quantificação foi

efetuada a 306nm no tempo de eluição de 25 minutos. A concentração de trans-resveratrol

foi expressa em mg/L (miligramas por litro).

4.5.3 Capacidade antioxidante das bebidas utilizadas por DPPH (2,2 difenil-1-

picrilhidrazil)

A capacidade antioxidante das bebidas foi avaliada utilizando-se o método do

sequestro de radicais livres do DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazil), que se baseia em um ensaio

fotométrico onde o radical livre DPPH, que apresenta coloração roxa intensa em solução

alcoólica, se reduz em presença de moléculas antioxidantes, formando o 2,2 difenil-1-

picrilhidrazil, que é incolor (BONDET et al., 1997).

O método utilizado foi adaptado de Almeida et al, (2006). Foi preparada uma solução

DPPH de concentração 0,1µM. Para o preparo do branco do DPPH, foram misturados 100μL

de DPPH com 900μL de etanol, e para o preparo das amostras foram adicionados 900μL da

solução de DPPH em 100μL de cada amostra de bebida. Em seguida, para limpar as amostras

foi utilizada centrífuga refrigerada (Sigma® 4K15) por 2 minutos a 5100rpm a 4ºC. As

leituras foram realizadas a 517nm no espectrofotômetro (Bioespectro® SP 220), sendo

realizada uma leitura imediata e uma segunda leitura após 30 minutos. A partir das

absorbâncias obtidas, a atividade antioxidante foi calculada utilizando a fórmula descrita

abaixo, sendo expressa pela porcentagem de sequestro de radicais livres DPPH (%SRL).

Legenda: absorbância da amostra (Ab amostra), absorbância do branco (Ab branco), sequestro de

radicais livres de DPPH (%SRL), 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH).

%SRL = 100 – ((Ab amostra – Ab branco)) x100

Ab branco

50

4.6 CUIDADO DOS ANIMAIS

4.6.1 Controle de peso corporal e consumo de ração e bebidas

Os animais foram pesados, semanalmente, em balança eletrônica da marca Filizola®

(de precisão 0,5g).

De segunda a sexta-feira foi feito o controle do consumo das bebidas ofertadas (água

e/ou SUTI, VT e SR) utilizando uma proveta graduada. O consumo de ração foi estimado

através da pesagem da oferta e sobra de ração por meio de balança eletrônica da marca

Filizola® (de precisão 0,5g), semanalmente. Às sextas-feiras, bebidas e rações eram ofertadas

em quantidade calculada para 3 dias (sexta, sábado e domingo) e o controle das sobras era

feito na segunda-feira de semana seguinte.

Todos os dados de peso corporal e dos consumos de ração e líquidos foram registrados

em planilhas individuais durante os dias de cuidado, até o fim do experimento. Com o registro

dos dados foi possível verificar a variação de peso dos animais ao longo do experimento e

estimar o consumo médio de ração e das bebidas de cada grupo estudado.

4.7 PRESSÃO ARTERIAL: SISTÓLICA E DIASTÓLICA

A pressão arterial de cada animal (sistólica e diastólica) foi avaliada, semanalmente,

utilizando-se o Plestimógrafo de Cauda (Insight®) e expressa em mmHg (milímetros de

mercúrio). Para isso, os animais foram manuseados, cuidadosamente, de forma a entrarem

espontaneamente no cilindro de acrílico utilizado para contenção com dimensões internas

(AxLxC) de 63x65x232mm. Posteriormente, estes foram mantidos em um aquecedor

(Insight®) a 42ºC por 10 minutos. Em seguida, foram posicionados no aparelho (Figura 1)

para a aferição da pressão três vezes, calculando-se a média e o desvio padrão da mesma

(CARBO et al., 2011).

51

Figura 1 - Foto de animal contido para aferição de pressão arterial em Plestimógrafo de cauda

durante o experimento.

4.8 COLETA DE AMOSTRAS

Ao final do experimento, todos os animais foram submetidos ao procedimento de

esfregaço vaginal para identificação da fase do ciclo estral. Esta determinação foi necessária

para que todos os animais estivessem no mesmo momento fisiológico e, assim, não houvesse

interferência hormonal nas futuras análises bioquímicas e determinações teciduais. Após esta

análise, as ratas que estavam na fase “estro” do ciclo, foram separadas e mantidas em jejum

para posterior sacrifício.

Após jejum de seis horas (6h), os animais foram devidamente anestesiados com

injeção intraperitoneal (cloridrato de xilazina associado com ketamina – solução 1:1) na

dosagem de 0,1mL/200g de peso corporal.

O sangue coletado foi aliquotado e transferido para tubos vacutainer com e sem

anticoagulante, sofrendo suave agitação. Após este processo, o sangue foi centrifugado a

3000rpm (rotações por minuto), durante 20 minutos, para obtenção do plasma e soro,

respectivamente, e aliquotado em microtubos. Estas amostras foram congeladas a -700C para

utilização posterior em determinações bioquímicas.

52

Todos os animais foram submetidos ao procedimento de laparotomia mediana. O corte

foi feito utilizando instrumentos cirúrgicos previamente lavados e higienizados com álcool

70%. A partir da laparotomia foi possível retirar o fígado de cada animal. O peso do fígado

foi imediatamente verificado em balança comercial Bioprecisa® (precisão 0,01g), sendo o

registro e a apresentação deste dado feito em peso absoluto do tecido (em gramas - g) e em

peso normalizado (em gramas de tecido hepático para cada 100g de peso corporal do animal –

g/100g PC).

4.8.1 Análises bioquímicas

4.8.1.1 Glicemia

A glicemia foi determinada a partir de um pequeno corte caudal no animal para coleta

de uma gota de sangue que foi imediatamente depositada em fitas de medição de glicemia

capilar Accu-Check Active (Roche®). As fitas foram lidas em aparelho Accu-Check Active

(Roche®). Este procedimento foi feito em todos os animais do estudo, sendo realizado no

primeiro dia de experimento e no dia de sacrifício de cada animal. Com isso, foi determinada

a variação do parâmetro por meio de cálculo de diferença (glicemia final - glicemia inicial). A

glicemia foi expressa em mg/dL (miligramas por decilitro).

4.8.1.2 Colesterol Total (CT), Triglicerídeos (TG), Lipoproteína de alta densidade (HDL

– high density lipoprotein), Alanina transaminase (ALT), Aspartato transaminase (AST),

proteínas totais e albumina

A determinação das concentrações de CT, TG, HDL, ALT, AST foi feita através do

plasma dos animais utilizando métodos colorimétricos com leitura em espectrofotômetro

automatizado da marca BioClin® BS-120 Chemistry Analizer. Foram utilizados kits

comerciais BioClin® e comprimentos de onda específicos para cada indicador bioquímico. Os

resultados de CT, TG e HDL foram expressos em mg/dL, os de ALT e AST, em U/L

(unidades por litro), e os de proteínas totais e albumina, em g/dL.

53

4.8.1.3 Interleucina 6

A concentração de interleucina 6 (IL-6) foi determinada por imunoensaio enzimático -

Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), usando kit BioClin® e a leitura feita em

leitora de microplaca Thermo Plate®. Os resutados foram expresssos em pg/mL (picograma

por mililitro).

4.8.2 Avaliações no tecido hepático

4.8.2.1 Determinação de fenótipos nucleares

Após remoção do fígado, por meio de corte com bisturi cirúrgico foi separado um

pequeno fragmento do lóbulo hepático de maior dimensão. O fragmento hepático foi lavado

em água destilada para remoção do excesso de sangue. Em seguida, foi realizada a técnica de

Decalque ou Imprint com o tecido. Desta forma o fragmento foi suavemente pressionado sob

uma lâmina histológica, no mínimo 3 vezes, fazendo “carimbos” do tecido hepático, conforme

ilustra a Figura 2 (SAPI et al., 1989).

Figura 2 - Ilustração da técnica de Imprint

As lâminas foram depositadas numa cuba juntamente com uma solução de

etanol/ácido acético (na proporção de 3:1) por 15 minutos. Em seguida, foram lavadas em

água destilada, secas em temperatura ambiente e armazenadas para posterior submissão à

Reação de Feulgen (SAPI et al., 1989).

54

Reação de Feulgen: foi realizada a hidrólise ácida com HCl 4M (molar) durante 90

minutos a 250C ± 1

0C. A hidrólise foi interrompida com HCl 0,1M gelado (podendo variar de

40C a 10

0C). As lâminas foram coradas em Reativo de Schiff, preparado de maneira rotineira,

utilizando fucsina básica e deixadas em local com ausência de luz por 40 minutos. Em

seguida, os cortes foram passados em 3 banhos de água sulfurosa com o tempo de 5 minutos

cada banho e por último lavados em água destilada. Após, as lâminas foram secas ao ar,

diafanizarão em xilol e montadas em bálsamo do Canadá (SAPI et al., 1989).

4.8.2.2 Análise de imagens histológicas

Para análise de imagem dos materiais submetidos à Reação de Feulgen foi utilizado

microscópio Zeiss® (Carl Zeiz, Alemanha), com objetiva de 40x e as imagens foram

capturadas e analisadas utilizando software ZEN® 2011. O software fornece informações

quantitativas de área nuclear (≠m2), densidade óptica (OD= absorbâncias), densidade óptica

integrada (IOD= conteúdo Feulgen - DNA), perímetro, SDtd (desvio padrão dos valores

densitométricos totais por núcleo ou variabilidade de absorbância por núcleo, que pode

indicar a variação do estado de empacotamento da cromatina).

A Figura 3 representa a imagem da tela do microscópio Zeiss® capturando uma

fotomicrografia do fígado dos animais. Nesta imagem os núcleos dos hepatócitos estão sendo

delineados para posterior análise no software. A partir destas imagens foram obtidas as

medidas de área (µm2) e IOD (Feugen DNA) dos núcleos dos hepatócitos.

Figura 3 – Imagem da captura das fotomicrografias e delineamento dos núcleos dos

hepatócitos em microscópio Zeiss®, aumento 40x

55

4.8.2.3 Concentração de lipídeos no fígado

A extração da fração lipídica do fígado foi realizada utilizando-se o restante do órgão

hepático.

Primeiramente foi determinada a umidade do tecido, pela técnica gravimétrica, que

corresponde à perda de peso sofrida pelo tecido quando submetido à elevada temperatura

(1050C). Desta forma, a água presente no tecido hepático foi removida, deixando-o pronto

para ser submetido ao adequado processo de extração de lipídeos (AOAC, 2010).

A extração da fração lipídica do tecido hepático foi feita por meio do extrator contínuo

– Sohxlet, utilizando como solvente o éter de petróleo seguindo as demais etapas da técnica

de extrato etéreo (AOAC, 2010). Por diferença dos pesos da amostra (final – inicial) foi feito

o cálculo do peso de gordura hepática.

A concentração de gordura no tecido hepático foi expressa em g% (gramas por 100g

de tecido).

4.8.2.4 Concentração de proteínas no fígado

Para determinar a fração protéica presente no tecido hepático dos animais, foi utilizado

o método de Kjeldahl que determina o nitrogênio total da amostra e posteriormente, através de

cálculos, fornece o conteúdo de proteínas utilizando o fator de conversão apropriado para

amostra de origem animal (6,25). A técnica consiste na digestão, seguida da destilação e

titulação da amostra (AOAC, 2010). A concentração de proteínas no fígado foi expressa em

g% (gramas por 100g de tecido).

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os dados foram apresentados a partir da estatística descritiva como média e desvio

padrão. Análises de comparação de médias dentro do próprio grupo (antes versus depois)

foram realizadas a partir da utilização do teste de hipóteses pareado (t-pareado). Para análises

56

de comparação de médias entre os grupos, foi utilizado ANOVA e Tukey como pós-teste.

Para tais análises foi utilizado o software GraphPad inStat e, o nível de significância

utilizado foi de 5% (p<0,05).

57

5 RESULTADOS

5.1 CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS, TRANS-RESVERATROL E

CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DAS BEBIDAS UTILIZADAS NO EXPERIMENTO

5.1.1 Compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteau

De acordo com os dados obtidos (Figura 5), a SR (117,44±0,245) apresentou maior

(p<0,05) concentração de fenólicos totais em relação ás demais bebidas; O VT (2,58±0,004)

apresentou valores intermediários e o SUTI (1,09± 0,022) foi a bebida com menor (p<0,05)

concentração de polifenois totais.

58

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os

grupos; Vinho Tinto (VT); Suco de uva tinto integral (SUTI); solução de resveratrol

(SR); miligramas de equivalentes de ácido gálico por litro (mg EAG L-1

x 104)

Figura 5 – Concentração de polifenois totais nas bebidas (suco de uva tinto integral,

vinho tinto e solução de resveratrol) ofertadas aos animais (em mg EAG L-1

)

5.1.2 Conteúdo de trans-resveratrol por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A curva padrão do trans-resvertarol e os cromatogramas obtidos por CLAE estão,

respectivamente, nas Figuras 6, 7, 8 e 9.

Legenda: Seta indica o pico de eluição do trans-resveratrol

Figura 6 – Cromatograma com a eluição do padrão de trans-resveratrol

59

Legenda: Seta indica o pico de eluição do trans-resveratrol

Figura 7 Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol no vinho tinto

Legenda: Seta indica o pico de eluição do trans-resveratrol

Figura 8- Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol no suco de uva tinto

integral

Legenda: Seta indica o pico de eluição do trans-resveratrol

Figura 9 - Cromatograma mostrando a eluição do trans-resveratrol na solução de resveratrol

60

Os resultados obtidos da concentração de trans-resveratrol nas bebidas estão descritos

na Figura 10. A concentração de resveratrol no SUTI (0,381±0,033) foi significativamente

menor do que no VT (1,323±0,262) e na SR (1,532±0,002), que foram semelhantes entre si.

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas

entre os grupos (p<0,0001); Vinho Tinto (VT); Suco de uva tinto integral (SUTI);

Solução de resveratrol (SR).

Figura 10 – Concentração média de trans-resveratrol nas diferentes bebidas ofertadas

(em mg/L)

5.1.3 Capacidade antioxidante

Os resultados obtidos de atividade antioxidante para VT (109,03±43,69), SUTI

(110,53±32,04) e SR (64,51±19,44) não diferiram estatisticamente entre si, apesar da SR ter

apresentado, numericamente, menor valor de % SRL, como mostra a Figura 11.

61

Legenda: Vinho Tinto (VT); Suco de uva tinto integral (SUTI); Solução de resveratrol

(SR); Sequestro de radicais livres (SRL).

Figura 11 – Atividade antioxidante das bebidas ofertadas (em % SRL)

5.2 PESO CORPORAL E CONSUMO ALIMENTAR

5.2.1 Peso corporal

A Tabela 3 apresenta os resultados referentes ao peso corporal dos animais (peso

inicial, peso final e variação de peso corporal), nos diferentes grupos estudados. Com relação

ao peso corporal, todos os grupos se mostraram homogêneos tanto no início (GC: 228,57±

31,05; GH: 211,63±37,07; GV: 220,24±34,21; GS: 219,68±32,59; GR: 242,80±27,85) quanto

no final (GC: 306,51±23,83; GH: 298,00±55,25; GV: 300,26±46,97; GS: 296,47±39,28; GR:

284,60±22,26) do experimento, o mesmo sendo observado na variação de peso corporal (GC:

77,93±47,75; GH: 86,37±51,79; GV: 80,02±61,28; GS: 76,79±54,15; GR: 41,80±13,92).

62

Tabela 3 – Medidas do de peso corporal inicial (g), peso corporal final (g) e da variação de

peso corporal nos diferentes grupos estudados

GC GH GV GS GR p valor

Peso corporal

inicial (g)

228,57± 31,05 211,63±37,07 220,24±34,21 219,68±32,59 242,80±27,85 0,3942

Peso corporal

final (g)

306,51±23,83 298,00±55,25 300,26±46,97 296,47±39,28 284,60±22,26 0,8864

Variação de

peso corporal (g)

77,93±47,75 86,37±51,79 80,02±61,28 76,79±54,15 41,80±13,92 0,5947

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p<0,05); Grupo

Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto

integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica +

vinho tinto, Grupo Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

5.2.2 Consumo de ração, água e bebidas ricas em polifenóis

Os dados de consumo de bebidas (água, VT, SUTI e SR) e de consumo de ração

(controle e hiperlipídica) estão apresentados na Tabela 4.

O consumo de ração (g/100gPC/dia – GC: 6,01±1,34; GH: 5,15±1,16; GV: 4,67±1,16;

GS: 4,84±1,28; GR: 5,95±0,83), o consumo de água (mL/100gPC/dia – GC: 11,22±5,71; GH:

10,06±3,38; GV: 7,23±2,07; GS: 9,58±4,47; GR: 10,24±4,68) e o valor energético total

consumido diariamente (kcal/100gPC/dia – GC: 22,59; GH: 23,48; GV: 22,96; GS: 24,31;

GR: 28,18) não apresentaram diferença estatística entre os grupos.

O consumo de bebidas ricas em polifenóis (mL/100gPC/dia) foi maior (p<0,05) no GR

(5,04±1,20) e GS (3,74±1,66) do que no GV (1,95±0,32). A ingestão diária de resveratrol

(mg/dia), através do consumo das bebidas, foi maior (p<0,05) no GR (0,2297±0,0003),

seguido pelo GV (0,1323±0,0262) e menor no GS (0,0572±0,0049) e, o consumo de

polifenóis totais (mg EAG/dia) também foi maior (p<0,05) no GR (1761,65±36,74), mas

semelhante entre o GV (25,89±0,45) e GS (16,35±3,24).

63

Tabela 4: Consumo de ração (g /100g peso corporal/dia), consumo de bebidas (mL/100g peso

corporal/dia), consumo de resveratrol (mg/dia) e de polifenóis (mg EAG/ dia) dos diferentes

grupos, ao final do estudo

GC GH GV GS GR p valor

Consumo de ração

(g/100gPC/dia)

6,01±1,34 5,15±1,16 4,67±1,16 4,84±1,28 5,95±0,83 0,0674

Consumo de água

(mL/100gPC/dia)

11,22±5,71 10,06±3,38 7,23±2,07 9,58±4,47 10,24±4,68 0,2222

Consumo de

bebidas ricas em

polifenóis

(ml/100gPC/dia)

- - 1,95±0,32a 3,74±1,66

b 5,04±1,20

b <0,0001

Consumo de

trans-resveratrol

(mg/dia)

- - 0,1323±0,0262a 0,0572±0,0049

b 0,2297±0,0003

c <0,0001

Consumo de

polifenóis (mg

EAG/dia)

- - 25,89±0,45 a 16,35±3,24

a 1761,65±36,74

b <0,05

Valor energético

total consumido

(kcal/100g PC/dia)

22,59 23,48 22,96 24,31 28,18

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p<0,05);

Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva

tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração

hiperlipídica + vinho tinto, Grupo Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol; Valor

energético total consumido equivale às quilocalorias ofertadas pela ração somadas às das bebidas.

5.3 PRESSÃO ARTERIAL

Ao longo do experimento observou-se que a PAD (mmHg) não diferiu entre os grupos

estudados (GC: 68,97±11,47; GH: 67,28±15,39; GV: 76,94±14,91; GS: 51,97±4,21; GR:

69,73±16,89). Entretanto, a PAS (mmHg) foi menor (p<0,05) no GS (117,8±10,24) do que no

GH (181,37±12,86), GV (172,55±15,24) e GR (187,62±20,68), porém, similar ao GC

(152,53±10,3). Os valores médios de PAS e PAD estão representados na Figura 12.

64

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre a

pressão arterial sistólica (PAS) dos diferentes grupos (p<0,05); pressão arterial distólica

(PAD); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração

hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva

tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo

Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Figura 12 - Pressão arterial média (mmHg) sistólica e diastólica dos animais, ao longo do

estudo

5.4 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS: GLICEMIA, PERFIL LIPÍDICO,

TRIGLICERÍDEOS, MARCADORES HEPÁTICOS, PROTEÍNAS TOTAIS,

ALBUMINA E IL-6

5.4.1 Glicemia

Com relação à variação de glicemia (mg/dL), o único grupo que apresentou

diminuição na concentração de glicose sérica foi o GR (-2,4) e o GH (21,43) foi o que

apresentou maior aumento (p<0,05) de glicemia ao longo do estudo. Os demais grupos, GC

(12,5), GV (21,43) e GS (1,43), mostraram aumento na glicemia, mas mantiveram o

parâmetro dentro do intervalo de normalidade. Os dados de glicemia inicial (mg/dL), glicemia

final (mg/dL) e variação de glicemia (mg/dL) estão na Figura 13.

65

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os

grupos (p<0,0001); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) -

ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de

uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo

Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Valor de referência (Glicemia: 50-135mg/dL - Fonte: Canadian Council on Animal Care,

1993)

Figura 13 – Concentração média de glicemia inicial, glicemia final e variação de glicemia

dos diferentes grupos (em mg/dL)

5.4.2 Perfil lipídico e triglicerídeos

A partir da análise bioquímica do sangue dos animais, foram verificados os níveis de

CT (mg/dL), HDL (mg/dL) e TG (mg/dL). Os resultados de perfil lipídico estão apresentados

na Figura 14.

Os níveis de CT (mg/dL) do GS (51,6±7,74) foram menores (p<0,05) do que do GC

(69,87±13,4), entretanto, ambos se mostraram semelhantes aos do GH (55±6,12), GV

(56±15,8) e GR (58±4,24). É importante mostrar que, embora semelhante estatisticamente

aos demais grupos que receberam a dieta hiperlipídica, o GS mostrou níveis numericamente

66

menores de CT do que o GH, GV e GR.

Embora os níveis de HDL (mg/dL) entre os grupos não tenham apresentado diferença

(GC: 35,5±16,12; GH: 32,5±10,39; GV: 35±11,31; GS: 37,6±9,28; GR: 24±1,41), vale

destacar que o GS apresentou níveis numericamente maiores de HDL em relação aos demais.

Já a concentração de TG (mg/dL) apresentou-se significativamente maior (p<0,05) no

GC (69,57±17,74) do que nos outros grupos (GH: 42±11,44; GV: 31,3±6,83; GS: 35±9,76 e

GR: 34±7,12).

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os

grupos (p<0,0011); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) -

ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de

uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo

Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol; Colesterol total (CT),

Lipoproteína de alta densidade (HDL), Triglicerídeo (TG).

Valor de referência (**Colesterol total: 46-101mg/dL;***HDL: 37-59mg/dL; **TGL: 39-

130mg/dL) - **Fonte: MELO, et al., 2012; ***Fonte: DANTAS, et al., 2006.

Figura 14 – Concentração média de colesterol total, lipoproteína de alta densidade - HDL e

triglicerídeos dos diferentes grupos (em mg/dL)

67

5.4.3 Marcadores hepáticos, proteínas totais e albumina

Os dados de aspartatotransaminase - AST (U/L), alaninatransaminase - ALT (U/L),

proteínas totais (g/dL) e albumina (g/dL) dos animais ao final do estudo estão apresentados na

Tabela 5.

Não houve diferença na concentração de AST (U/L – GC: 30,2±7,0; GH: 32,5±11,7;

GV: 33,2±4,6; GS: 27,6±4,9; GR: 32,0±8,8) entre os grupos, mas o GS e o GC foram os que

apresentaram concentração dentro do intervalo de normalidade, mostrando-se numericamente

menores em relação aos demais grupos estudados. Entretanto, a concentração de ALT (U/L)

foi maior (p<0,05) no GR (151,6±42,9) quando comparado ao GH (98,6±23,8) e ao GS

(90,9±29,6), mas ambos foram semelhantes ao GC (94,5±15,6) e ao GV (121,2±41,6). Todos

os grupos mostraram níveis de ALT acima do recomendado, no entanto, o GS foi o que

apresentou concentração numericamente menor de ALT. Já a concentração de FAL (U/L) do

GR (29,4±6,0) apresentou-se menor (p<0,05) em relação ao GH (57,8±13,2) e GV

(51,5±13,5), mas semelhante ao GC (46,9±16,2) e GS (38,3±6,1).

Embora a concentração sérica de proteínas totais (g/dL) tenha sido menor (p<0,05) no

GV (3,2±0,3) do que os outros grupos (GC: 4,0±0,3; GH: 4,2±0,1; GS: 4,2±0,2; GR: 4,3±0,1),

o mesmo não ocorreu com relação à concentração de albumina (g/dL), onde os animais do GC

(3,9±0,3) apresentaram concentração significativamente maior (p<0,05) de albumina quando

comparados aos demais animais do GH (3,1±0,2), GV (3,2±0,2), GS (3,0±0,2) e GR

(3,1±0,1), mesmo estando todos os grupos dentro dos limites de normalidade para o

parâmetro.

68

Tabela 5: concentração de aspartatotransaminase - AST (U/L), alaninatransaminase - ALT

(U/L), fosfatase alcalina (FAL), proteínas totais (g/dL) e albumina (g/dL) dos diferentes

grupos, ao final do estudo

VR GC GH GV GS GR p valor

AST (U/L) 18-30* 30,2±7,0 32,5±11,7 33,2±4,6 27,6±4,9 32,0±8,8 0,2612

ALT (U/L) 46-81* 94,5±15,6a,b

98,6±23,8a 121,2±41,6

a,b 90,9±29,6

a 151,6±42,9

b 0,0136

FAL (U/L) - 46,9±16,2a b 57,8±13,2

a 51,5±13,5

a 38,3±6,1

a b 29,4±6,0

b 0,0053

Proteínas

totais

(g/dL)

4,7-8,2* 4,0±0,3a 4,2±0,1

a 3,2±0,3

b 4,2±0,2

a 4,3±0,1

a <0,0001

Albumina

(g/dL)

2,7-5,1* 3,9±0,3a 3,1±0,2

b 3,2±0,2

b 3,0±0,2

b 3,1±0,1

b <0,0001

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p<0,05);

Valor de referência (VR); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração

hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva tinto integral, Grupo

Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de

resveratrol; Aspartato transaminase (AST), Alanina transaminase (ALT) e Fosfatase alcalina (FAL); *Fonte:

Canadian Council on Animal Care (1993), **Fonte: MELO, et al., 2012; ***Fonte: DANTAS, et al., 2006.

5.4.4 Interleucina – 6

A concentração de IL-6 (pg/mL) mostrou-se significativamente menor (p<0,05) no GS

(39,37±5,25) do que no GV (51,49±7,17), mas ambos foram semelhantes ao GC

(42,73±6,85), GH (43,42±7,1) e GR (41,13±8,5), conforme ilustra a Figura 15.

69

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre

os grupos (p<0,05); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico

(GH) - ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica

+ suco de uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto,

Grupo Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Figura 15 - Concentração média de Interleucina 6 (pg/mL) nos diferentes grupos,

ao final do estudo

5.5 TECIDO HEPÁTICO: FENÓTIPO NUCLEAR, PESO DO ÓRGÃO, TEOR DE

PROTEÍNA E TEOR DE GORDURA NO FÍGADO

5.5.1 Fenótipo nuclear dos hepatócitos

As fotomicrografias do fígado dos animais estão ilustradas na Figura 16. A partir da

análise destas imagens foram obtidos os dados de fenótipo nuclear pela verificação dos

parâmetros de área do núcleo dos hepatócitos e densidade óptica integrada (IOD),

apresentados nas Figuras 17 e 18 a seguir.

A área dos núcleos dos hepatócitos (em µm²) foi menor (p<0,05) no grupo GC

(69,01±27,53) quando comparado aos demais – GH: 90,14±27,17; GV: 89,48±23,21; e GS:

84,6±32,96 - mas semelhante ao GR (69,94±24,42). Já o valor de IOD (conteúdo Feugen-

70

DNA) foi menor (p<0,05) no grupo GC (16,29±7,4) e GR (16,66±6,9), seguido pelo GS

(27,29±11,31), e maior no GV (36,83±11,81) e GH (33,63±12,65).

Legenda: (A) Grupo Controle - ração à balanceada; (B) Grupo Hiperlipídico - ração hiperlipídica; (C) Grupo

Suco de uva tinto integral - ração hiperlipídica + suco de uva tinto integral; (D) Grupo Vinho tinto - ração

hiperlipídica + vinho tinto; (E) Grupo Resveratrol - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Figura 16 – Fotomicrografia de fígado dos diferentes grupos, Reativo de Schiff, aumento de

40x.

71

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os

grupos (p<0,05); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) -

ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de

uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo

Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Figura 17 - Área dos núcleos dos hepatócitos dos animais estudados (em µm²)

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os

grupos (p<0,05); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) -

ração hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de

uva tinto integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo

Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Figura 18 – Densidade óptica integrada dos núcleos dos hepatócitos dos animais estudados

72

5.5.2 Peso do fígado, teor de proteína e teor de gordura no tecido hepático

Com relação ao tecido hepático, os dados de peso do fígado dos animais estão

apresentados na Figura 19. Já a Figura 20 mostra os dados referentes aos teores de proteínas e

gordura no tecido hepático.

Ao final do experimento, o peso do fígado dos animais (g/100gPC) do GC (2,91±0,19)

mostrou-se maior (p<0,05) do que do GV (2,79±0,24) e do GR (2,55±0,11), mas semelhante

ao GH (2,77±0,16) e GS (2,59±0,26). Também houve diferença entre os grupos com relação

aos teores de proteína e gordura no fígado dos animais estudados. O teor de proteínas no

fígado (g%) dos animais do GS (16,81±1,7) foi menor (p<0,05) do que no GV (18,95±0,6) e

GR (18,56±0,5), mas semelhante ao GC (18±0,4) e GH (18,15±0,9). Já a concentração de

gordura hepática (g%) foi significativamente menor (p<0,05) no GS (3,34±0,23) do que no

GH (5,11±0,43), GV (4,96±0,98) e GR (4,66±1,2), mas similar ao GC (3,53±1,12).

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos

(p<0,05); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração

hiperlipídica; Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva tinto

integral, Grupo Vinho tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo Resveratrol (GR) -

ração hiperlipídica + solução de resveratrol.

Análise estatística: ANOVA one-way e Tukey para comparação de média entre os grupos.

Figura 19 - Peso do fígado dos animais (em g/100gPC) dos diferentes

grupos, ao final do estudo

73

Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos

(p<0,05); Grupo Controle (GC) - ração à balanceada; Grupo Hiperlipídico (GH) - ração hiperlipídica;

Grupo Suco de uva tinto integral (GS) - ração hiperlipídica + suco de uva tinto integral, Grupo Vinho

tinto (GV) - ração hiperlipídica + vinho tinto, Grupo Resveratrol (GR) - ração hiperlipídica + solução

de resveratrol.

Figura 20 – Concentração média de proteínas e gorduras no fígado dos animais (em g%) nos

diferentes grupos, ao final do estudo

74

6 DISCUSSÃO

O perfil nutricional e epidemiológico atual da população brasileira mostra crescente

prevalência de sobrepeso/obesidade e de DCNT, incluindo certas injúrias hepáticas (LEVY, et

al., 2012). Com isso, o uso de recursos dietéticos na prevenção e tratamento de doenças vem

ganhando destaque especial, não só no campo da pesquisa, mas também no interesse da

população (GRANATO, et al., 2010). Diante do papel da dieta na promoção da saúde busca-

se cada vez mais a relação entre a alimentação e as causas, fatores de risco e estratégias de

prevenção e intervenção das DCNT.

A uva e seus derivados apresentam diversos polifenóis capazes de intervir beneficamente

no organismo devido a suas propriedades funcionais, sendo o resveratrol o composto

destacado por muitos estudos (SAUTTER, et al., 2005; ROMERO, et al., 1999). Como fonte

destes polifenois há não só as uvas, mas também o suco de uva, o vinho tinto e, atualmente, as

cápsulas do resveratrol que ofertam o composto isolado (SAUTTER, et al., 2005). Se o

resveratrol atua como principal composto bioativo desses alimentos, vale dizer que sua

concentração varia de acordo com o tipo de fonte que é consumida (ROMERO-PÉREZ, et al.,

1999). Diante dos achados do presente trabalho foi observado que a concentração de trans-

resveratrol no SUTI (0,381mg/L) foi menor do que no VT (1,323mg/L) e na SR (1,53mg/L).

Os resultados corroboram com os achados de outros autores que verificaram uma

concentração de resveratrol em sucos de uva do Brasil entre 0,19-0,90mg/L e em vinho tinto

entre 0,82-5,75mg/L (SAUTTER, et al., 2005; ROMERO, et al., 1999).

Em nossos achados o SUTI apresentou 1090,1 mg EAG L-1

de fenólicos totais,

enquanto o VT mostrou média de 2589,4 mg EAG L-1

de polifenóis. Estes resultados

corroboram os achados da literatura que indicam uma concentração de polifenóis totais de

75

240-5084 mg EAG L-1

para sucos de uva (MALACRIDA & MOTTA , 2005); SAUTTER et

al., 2005; GURAK et al., 2008; VARGAS et al., 2008; GOLLUCKE et al., 2009; BURIN et

al., 2010; GURAK et al., 2010) e, de 1014- 3718 mg EAG L-1

para vinhos tintos do Brasil

(LINS & SARTONI, 2014; KATALINIC et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2011).

O teor de polifenois nas bebidas pode ser influenciado por diversos fatores (MAZZA,

1995; FRANKEL et al., 1998; JACKMAN et al., 1996; SAURA-CALIXTO & DÍAZ-

RUBIO, 2007). O conteúdo de fenólicos no suco difere de acordo com a variedade da uva,

maturidade da fruta, regiões e práticas de cultivo das mesmas (MAZZA, 1995). Durante a

concentração do suco podem ocorrer perdas no conteúdo de compostos fenólicos devido,

principalmente, às temperaturas elevadas que o suco é submetido durante a recuperação de

aromas e a evaporação propriamente dita. A concentração de fenólicos no suco de uva é

influenciada pelo tipo de extração e procedimentos empregados na produção do suco e pelas

reações que ocorrem durante o seu armazenamento (FRANKEL et al., 1998; JACKMAN et

al., 1996). Já com relação ao VT, dependendo da variedade da uva, de seu cultivo, das

técnicas de fabricação e das condições gerais do plantio, assim como da incidência de luz

solar e de pragas, a quantidade de polifenóis no vinho pode variar (SAURA-CALIXTO &

DÍAZ-RUBIO, 2007).

A atividade antioxidante dos sucos e vinhos possui grande influência no sabor e aroma

das bebidas, podendo variar de acordo com o clima, solo, variedade e maturidade da uva (DE

ARAÚJO, 2013). A capacidade antioxidante das bebidas ofertadas foi avaliada pelo método

de sequestro de radicais livres DPPH e os resultados demonstram que de acordo com este

método, o SUTI e o VT apresentaram capacidade antioxidante numericamente maior do que a

SR.

Em um estudo realizado por Vargas et al. (2004), foi testada a capacidade antioxidante

de oito amostras de sucos de uva roxa e branca por meio do sistema ß-caroteno/ácido

linoleico, onde foi verificado que a capacidade antioxidante dos sucos foi de 97-119%. Anos

mais tarde, Vargas et al. (2008) avaliaram a capacidade antioxidante em sucos de uva por

DPPH e encontraram valores entre 42-114%, corroborando nossos resultados. Katalinic et al.

(2004) apresentaram em seu estudo uma amostra de vinho com 82,2% de sequestro de

radicais livres, já Lins & Sartoni (2014) analisaram nove amostras de vinhos tintos produzidos

76

com diferentes uvas quanto a atividade antioxidante por DPPH, encontrando uma variação

significativa entre as amostras de 6,43% a 81,16% de sequestro de radicais livres.

A atividade antioxidante de um alimento depende não só do teor de polifenóis

presentes na matriz, mas também dos tipos de compostos, quantidade e posição de hidroxilas

e anéis aromáticos (SOUSA et al., 2004; BASTOS et al., 2007). Certos compostos fenólicos

reagem com o reagente de Folin, mas não apresentam atividade antioxidante, afirma Huang et

al. (2005). Com isso, não é certo que haja sempre boa correlação entre o conteúdo de

fenólicos totais e a atividade antioxidante de um substrato.

Segundo Gava (1998) a atividade antioxidante encontrada nos sucos de uva, justifica-

se pela presença de polifenóis na bebida ou devido à presença do conservante metabissulfito

de sódio, que atua como protetor do ácido ascórbico, caroteno e outros compostos facilmente

oxidáveis. Katalinic et al. (2004) sugeriram que grande parte da capacidade antioxidante do

vinho tinto pode ser diretamente correlacionada com a sua concentração de catequinas. Já

Minussi et al. (2003) ao testarem amostras de vinho do Brasil, do Chile, e de Portugal, além

da catequina, obtiveram uma correlação positiva entre a capacidade antioxidante do vinho e

concentrações de ácido gálico e epicatequina.

Estudos mostram que o consumo de uma dieta hiperlipídica apresenta relação com o

aumento da prevalência de obesidade no país e no mundo e que o aumento do peso corporal,

em consequência do consumo deste tipo de dieta, predispõe o indivíduo a desenvolver

diversas DCNT (WHO, 2013; PERICHART, et al., 2010). De acordo com alguns estudos, a

ingestão de dieta hiperlipídica em ratos leva ao maior ganho de peso, havendo associação

positiva entre a dieta rica em gordura e o ganho de peso corporal nos animais (DUARTE et al.

(2006); BORBA et al., 2011). No entanto, no presente estudo não foi observado

desenvolvimento de sobrepeso, uma vez que os grupos que consumiram dieta hiperlipídica

não mostraram diferença de ganho de peso em relação ao grupo que recebeu dieta balanceada.

Com relação ao consumo alimentar dos animais, ao longo do experimento não foi

observada diferença entre o consumo de água e de ração, apesar das dietas serem ofertadas de

forma “ad libitum”, mas houve uma tendência de menor consumo de ração nos grupos que

recebiam a dieta hiperlipídica. O consumo do SUTI e da SR foi maior do que o consumo de

77

VT, mas apesar da diferença encontrada no consumo das bebidas ricas em polifenóis, todos os

grupos apresentaram consumo energético semelhante.

Em relação ao consumo de ração, sugere-se que os animais sejam capazes de regular

sua ingestão a partir da quantidade energética consumida (BORBA, et al., 2011; MAHAN, et

al., 2002; WESTERPEP-PLATENGA, 2004). Estudos realizados em humanos verificaram

que a densidade energética da dieta interfere na ingestão alimentar somente em curto prazo,

enquanto que em longo prazo esses efeitos são regulados ocorrendo uma compensação

(WESTERPEP-PLATENGA, 2004). O mesmo foi observado no estudo realizado por Moura

et al. (2012) que observou menor consumo do grupo que recebia ração rica em gordura

saturada em relação ao grupo que consumia dieta balanceada. A tendência de menor consumo

alimentar pelos grupos que receberam a dieta hiperlipídica associada ao consumo de SUTI e

VT pode ser explicada também pelo fato destas bebidas serem fonte extra de energia para os

animais, aumentando sua saciedade.

O consumo do SUTI e da SR foi maior do que o consumo de VT. No entanto, devido ao

teor de polifenois totais nas bebidas, o consumo de polifenois do GR (1761mg EAG/dia) foi

maior do que os animais do GV (25,9mg EAG/dia) e GS (16,3mg EAG/dia) que apresentaram

consumo diário semelhante de fenólicos totais. Já com relação à concentração de trans-

resveratrol, o GS (0,0005715mg/dia) apresentou menor consumo diário de resveratrol,

seguido pelo GV (0,01323mg/dia) e GR (0,02295mg/dia). Levando em consideração os

demais parâmetros avaliados, sugere-se que a quantidade de polifenois e de trans-resveratrol

consumida não está diretamente relacionada aos efeitos positivos do composto no organismo

uma vez que os animais que consumiram SR, embora tenham tido maior aporte de compostos

bioativos através da bebida, não apresentaram melhores resultados fisiológicos em relação aos

demais grupos.

Alguns estudos verificaram associação entre o consumo excessivo de gordura e o

aumento de glicemia concomitante ao aumento de hormônios hiperglicemiantes, insulina e

intolerância à glicose (MAHAN, 2008; CARVALHO, et al., 2006). Em nosso trabalho, todos

os grupos apresentaram valor de glicemia dentro da normalidade, tanto no início, quanto no

final do experimento. Entretanto, vale destacar que nossos achados corroboram com a

literatura uma vez que o GH apresentou maior aumento de glicemia ao longo do estudo. Isto

78

indica uma possível associação do consumo excessivo de gordura na dieta no aumento

glicêmico desses animais quando não associado ao consumo de bebidas ricas em polifenóis.

Uma dieta hiperlipídica pode levar ao aumento de ácidos graxos livres (AGL) circulantes

(BORBA, et al., 2011). Em excesso, os AGL sofrem oxidação e são transportados na forma

de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) ou, em situações patológicas, são depositados no

fígado levando à diminuição do cleareance hepático de insulina e, assim, maior produção de

glicose pelo tecido hepático (CARVALHO, et al., 2006). Neste caso, o aumento de AGL

pode também reduzir a funcionalidade dos receptores de insulina em diversos órgãos levando

ao aumento de glicose e de insulina no sangue (PRATCHAYASAKUL, et al., 2011). Em

paralelo, os ácidos graxos (AG), embora sejam combustível importante para as células beta-

pancreáticas em estado normal, podem levar à lipotoxicidade celular aumentando a

concentração de glicose no organismo. Isto ocorre porque o excesso de AG levaria à secreção

basal aumentada de insulina e inibiria a secreção do hormônio via estímulo da glicose. Em

maior escala o aumento de AG pode também levar à morte da célula beta- por apoptose (in

vivo e in vitro), prejudicando ainda mais o metabolismo glicêmico do organismo (DONATH

& SHOELSON, 2011).

Sobrepeso, sedentarismo e maus hábitos alimentares, especialmente consumo

excessivo ou acima do ideal de ácidos graxos saturados (AGS), têm sido associados não só ao

aumento de glicemia, mas também à hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, elevação de

LDL (lipoproteína de baixa densidade) e redução de HDL (MELO, et al., 2007). O fato da

concentração de colesterol se apresentar semelhante entre o grupo que recebeu dieta

balanceada e o GH, GV e GR corrobora os achados de Borba et al. (2011) que sugere nem

sempre haver associação positiva no teor lipídico da dieta e o aumento de colesterol sérico.

Em nossos achados o GS apresentou concentração de colesterol total significativamente

menor do que o GC e foi numericamente menor do que os demais grupos que receberam dieta

hiperlipídica. Possivelmente, os compostos bioativos do suco de uva minimizaram os efeitos

da dieta no aumento de colesterol sérico nesses animais.

Diante do efeito biológico da HDL, vale dizer que qualquer redução em sua

concentração sérica, mesmo que pequena, torna-se prejudicial ao organismo já que a HDL é

responsável por transportar a molécula de colesterol da corrente sanguínea para ser

79

metabolizada no fígado (MENSINK & KATAN, 1990). Segundo a Sociedade Brasileira de

Hipertensão (2005), o maior teor de gorduras monoinsaturadas nas dietas constituídas por

banha de porco favorece ao aumento de HDL, juntamente com a redução da oferta de

carboidratos pela dieta, o que já foi considerado “defensivo” por Wolf (1996). Entretanto, de

acordo com os achados de Melo et al. (2007), a ingestão de gordura vegetal hidrogenada e

banha de porco levou à menor concentração sérica de HDL quando comparado aos grupos

que receberam dieta balanceada, com ou sem associação de erva mate. Em nosso estudo todos

os grupos se mostraram semelhantes com relação aos níveis de HDL. No entanto, o GR

apresentou valores numericamente menores da partícula – o que pode indicar efeito negativo

de uma possível superdosagem de resveratrol, pois o consumo diário do composto pela

solução foi significativamente maior nesses animais. No entanto, sugere-se que o consumo de

SUTI possa ter sido benéfico aos níveis de HDL, pois o GS apresentou valores

numericamente maiores da lipoproteína.

O desequilíbrio dietético em macronutrientes está associado a alterações metabólicas.

A dieta hiperlipídica fornece um teor elevado de gordura em detrimento da quantidade de

carboidratos ofertada numa dieta balanceada. Entretanto, os níveis de TG são mais afetados

pelo consumo glicídico do que pela ingestão de gorduras. Uma oferta de carboidratos na

alimentação, especialmente os refinados, favorece a redução dos níveis de HDL e o aumento

das concentrações de LDL e TG (SIRI & KRAUSS, 2005). Isto foi verificado por Melo et al.

(2007), onde os grupos que receberam dieta hiperlipídica apresentaram valores inferiores de

TG quando comparados ao grupo controle. Outro estudo demonstrou que, após dieta rica em

gordura por 12 semanas, os ratos tiveram aumento significativo de TG quando comparados

àqueles alimentados com uma dieta com baixo teor de gordura (LIMA, et al., 2003). Tais

achados corroboram os resultados de nosso estudo que mostram níveis maiores de TG no GC

do que nos grupos que receberam dieta hiperlipídica. Contudo, dentre os animais que

consumiram maior teor lipídico na dieta, o GH – que não consumiu nenhuma bebida fonte de

polifenóis - foi o que apresentou concentração numericamente maior de TG em relação aos

demais. Isto pode sugerir que os compostos presentes no SUTI, VT e SR podem ter

minimizado o efeito da dieta hiperlipídica sobre a concentração de TG nos animais.

Entre os indicadores de um processo inicial de lesão do fígado estão as enzimas AST,

ALT e FAL. Quando o órgão é lesado ou há necrose do tecido, essas enzimas são liberadas no

80

sangue, onde podem ser detectadas por exames de rotina (COUTO, et al., 2008). Entretanto,

concentrações aumentadas de AST podem também indicar alterações de outros órgãos, como

o coração, os músculos, o rim, e o cérebro. Já a ALT é específica de dano hepático, sendo

produzida exclusivamente pelo fígado. As concentrações séricas de ALT estão elevadas em

hepatites e icterícias e sua variação é menor que as de AST em danos cardíacos, por exemplo.

Lima et al. (2003) avaliaram a toxicidade de corantes naturais e flavonóides em coelhos

hiperlipidêmicos (adicionando 0,5% de colesterol e 0,1% de ácido cólico na dieta). Foi

verificado aumento das concentrações de AST nos animais hiperlipidêmicos controles (não

tratados) e redução da ALT e AST quando tratados com os flavonóides. Resultados

semelhantes foram encontrado por Melo et al. (2007) que observaram aumento nos níveis de

AST e ALT apenas nos animais que consumiram dieta acrescida de banha de porco sem a

ingestão concomitante de alguma fonte de flavonóides do mate, sugerindo, assim, que os

polifenóis presentes na erva mate seriam capazes de agir preventivamente ao dano hepático

gerado por dietas ricas em gordura. Nossos resultados indicam que todos os grupos

apresentaram semelhança nos níveis de AST, mas apenas o GS e GC mostraram valores

dentro da normalidade. Já para ALT, todos os grupos apresentaram concentração um pouco

acima do recomendado, indicando possível alteração na atividade hepática dos animais. No

entanto, os relatos de Lima et al. (2003) e Melo et al. (2007) corroboram nossos achados uma

vez que os animais que receberam SUTI apresentaram menores concentrações de AST e ALT,

mesmo que sem diferença estatística. Sugere-se que a ingestão do SUTI possa ter conferido

proteção ao tecido hepático dos ratos levando a menores níveis de AST e ALT nos animais

que o consumiram.

Massafera (2014) estudou os efeitos do consumo de suco de laranja em diversos

parâmetros bioquímicos e foi detectado aumento significativo da FAL sérica nos ratos

tratados com dieta hiperlipídica, independente do tipo de ingesta hídrica. Em nosso estudo,

também não ficou clara a relação entre o consumo das bebidas ricas em polifenóis e seus

efeitos na concentração de FAL. Isto porque todos os grupos apresentaram valores de FAL

abaixo da normalidade, inclusive o GC. O GH e o GV mostraram concentração

numericamente maior de FAL e o GR foi numericamente menor em relação aos demais

grupos. A menor concentração de FAL no sangue pode refletir um estado de desnutrição. Já o

aumento de FAL pode estar relacionado a várias condições patológicas, como anemia,

insuficiência renal, ou mesmo câncer, sendo necessário que se faça um diagnóstico

81

diferencial. Especificamente em relação ao fígado, uma hiperfosfatasemia é associada

diretamente à obstrução biliar de causas intra e extra hepáticas, esteatose, cirrose, colecistite,

e/ou à lesão hepatocelular (COUTO, et al., 2008; LIMA, et al., 2001). Diante dos resultados

de ALT e AST é sugerido que a dieta hiperlipídica tenha provocado lesão no fígado dos

animais que a consumiram, mas os dados de FAL não corroboraram tal associação, sendo

necessários mais estudos.

Em nossos achados, os grupos que consumiram dieta hiperlipídica (GH, GV, GS e

GR) apresentaram menor concentração de albumina quando comparados ao GC. Níveis

reduzidos de albumina no sangue refletem alteração na capacidade funcional do tecido

hepático e/ou a ocorrência de um processo inflamatório, no qual ocorre menor produção de

albumina para que haja maior síntese de proteínas pró-inflamatórias (DE FEO & LUCIDI,

2002). Diante dos resultados, acredita-se que a dieta hiperlipídica possa ter levado a uma

disfunção hepática e/ou um estado inflamatório nos animais, gerando menor síntese de

albumina pelo fígado, mesmo naqueles que consumiram uma bebida rica em polifenois.

A redução nos níveis séricos de albumina nem sempre vem acompanhada de uma

menor concentração das proteínas totais no sangue (HARIRI & TRIBAULT, 2010). Isto foi

observado em nossos resultados já que, diferente do que foi verificado nas concentrações de

albumina, o GV apresentou menor concentração de proteínas totais em relação aos demais

grupos.

Os polifenois, presentes no suco de uva e no VT, têm-se mostrado protetores ao

organismo, principalmente por sua propriedade antioxidante (RAHMAN, 2008). Capazes de

inibir vias pró-inflamatórias, os polifenois inibem a expressão de ICAM-1 (molécula de

adesão intracelular-1) e VCAM (molécula de adesão vascular), inibem a adesão de monócitos

ao endotélio, a síntese de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e IL-1 (interleucina 1) e

também a liberação de IL-6 dos monócitos (SLATER, et al., 2003). No estudo de Matos, et

al., (2012) foi possível observar valores significativamente menores de IL-6 no grupo que

recebeu dieta suplementada com resveratrol em relação ao grupo controle. Tais achados são

semelhantes aos verificados em nosso trabalho, onde uma possível ação protetora dos

polifenóis foi verificada no GS que apresentou concentrações numericamente menores de IL-

6. No entanto, o mesmo efeito não foi observado nos animais que ingeriram VT, sugerindo

82

que apenas o SUTI minimizou os efeitos da dieta hiperlipídica na expressão de proteínas pró-

inflamatórias, como a IL-6.

A análise da área dos núcleos dos hepatócitos permite ampliar as considerações. Os

núcleos variam seu volume com base na atividade de transcrição de ácidos nucléicos. O

aumento na área dos núcleos sugere maior atividade sintética por parte dos hepatócitos, maior

trabalho tecidual e, possivelmente, maior demanda energética e metabólica do fígado

(GAYOTTO & ALVES, 2001). Já a diminuição da área nuclear indica reduzida taxa de

transcrição, revelando a possibilidade de desarranjo funcional e de lesão hepática, fenômeno

compatível com processos patológicos do fígado (ALBERTS et al., 1997).

Nossos resultados indicam que os grupos que receberam dieta hiperlipídica tiveram

aumento da área dos núcleos dos hepatócitos em relação ao GC, exceto o GR que apresentou

valores semelhantes aos animais que receberam dieta balanceada. Malta et al. (2010) também

verificaram aumento na área dos núcleos dos hepatócitos dos ratos tratados com dipirona,

considerando que a droga induziu a formação de núcleos mais volumosos. O mesmo foi

observado por Muller et al. (2013), que verificaram em estudos preliminares, relação direta

entre a suplementação dietética com ácido gálico e o aumento da área dos núcleos.

Diante dos achados, sugere-se que a dieta rica em gordura pode ter afetado os núcleos

dos hepatócitos, alterando a morfologia e o metabolismo do tecido hepático. Entretanto, nos

animais do GR isto não foi observado. Vale dizer que os hepatócitos são responsáveis, por

exemplo, pela síntese de proteínas plasmáticas e de proteínas de fase aguda. Com isso, diante

do aumento da área dos núcleos, não se pode afirmar se tais alterações morfológicas foram

protetoras ou não ao fígado, já que os dados referentes à concentração de proteínas totais,

albumina e IL-6 não são conclusivas no presente trabalho.

Com relação à densidade óptica integrada (IOD), resultados semelhantes foram

observados. O GH e o GV tiveram maior valor de IOD em relação aos demais grupos. O GS

apresentou valores intermediários de IOD e o CG e GR, valores menores. A IOD é um

parâmetro de análise direta do conteúdo de DNA, uma vez que relaciona a absorbância

nuclear e sua área, sendo determinada pela absorbância da passagem de feixes de luz através

da cromatina celular (DE SOUZA, 2008).

83

No estudo de Benevenuto (2003) traíras (Hoplias malabaricus) foram divididas e

submetidas a três compostos químicos - TBT (tributil-estanho), HgCH3 (metilmercúrio) e

Pb++

(chumbo inorgânico) - para verificar se tais compostos causariam alterações na

organização estrutural da cromatina das células do fígado. Foi verificado que TBT e Pb++

levam ao aumento do IOD e que HgCH3 induz à diminuição de IOD em relação ao grupo

controle. Em situações de aumento de IOD, Griffiths, et al. (2006) sugerem que existem

mecanismos celulares que garantem o suprimento adequado dos produtos gênicos vitais para

célula e, quando esse mecanismo inclui um aumento do número de cópias gênicas na célula, é

conhecido como amplificação gênica.

A amplificação de DNA também pode estar relacionada a células neoplásicas.

Frequentemente, o DNA amplificado contém um ou um grupo de genes específicos, que por

vezes recebem o nome de genes de "resistência multidroga". Estes genes codificam ATPases

de transporte ligadas à membrana plasmática que aparentemente previnem o acúmulo

intracelular de certos compostos, bombeando-os para fora da célula como fator de proteção

(ALBERTS et al., 1997). Por outro lado, a redução nos valores de IOD pode ser indicativo de

compactação da cromatina e, consequentemente, compactação do núcleo. Isto pode ocorrer

devido à desativação de parte do DNA, pois formas mais compactadas da cromatina são

resistentes à iniciação da transcrição e da duplicação. O DNA compactado dificulta a ação de

enzimas responsáveis pela duplicação do material genético bem como a síntese de RNAs. A

compactação da cromatina pode, também, indicar um início de apoptose ou estar presente em

processos de necrose (ALBERTS et al., 1997).

Em nossos achados, a dieta hiperlipídica pode ter levado a um processo de amplificação

gênica, uma vez que os valores obtidos dos GH, GV e GS foram significativamente maiores

que dos animais do GC. Vale dizer que o GS apresentou valores intermediários de IOD em

relação aos demais grupos que consumiram a dieta rica em gordura, sugerindo a possibilidade

do SUTI ter minimizado os efeitos da dieta hiperlipídica na amplificação gênica. No entanto,

o mesmo não foi observado no GR que apresentou valores de IOD semelhantes ao GC,

podendo ter ocorrido uma compactação da cromatina, também como fator de proteção da

célula para evitar a transcrição de proteínas prejudiciais à funcionalidade do fígado.

84

O fígado é um órgão fundamental para a homeostase do organismo, apresenta elevada

taxa metabólica e está muito susceptível a qualquer tipo de agressão interna ou externa como,

por exemplo, agentes estressores da dieta, de exercícios ou doenças (GALLANI, 1995).

Estudos em ratos, comparando a ingestão de uma dieta hiperproteica e hiperlipídica (66%

banha de porco) com uma dieta balanceada observaram que o peso do fígado dos animais que

consumiram alto teor de gordura não diferiu do grupo controle (MOURA, et al., 2012;

BUCHER, et al., 2014; BORBA, et al., 2011). O que corrobora os achados do presente

estudo, uma vez que não foi observada diferença no peso do fígado dos animais, independente

do tipo de dieta consumida. Contudo, a literatura mostra que o alto consumo de ácidos graxos

saturados está relacionado a processos inflamatórios e de lipotoxicidade de certos órgãos,

dentre estes o fígado, ocasionando doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA)

(MOURA, et al., 2012; BUCHER, et al., 2014; BORBA, et al., 2011; CHARBONNEAU, et

al., 2007; DEJI, et al., 2009).

Diante do consumo de uma dieta rica em gordura, o fígado pode apresentar alterações

em sua composição (MOURA, et al., 2012; BUCHER, et al., 2014). Em nosso estudo o teor

de proteínas do fígado dos animais foi semelhante entre os grupos, resultado que corrobora o

observado na pesquisa realizada por Afonso et al. (2003) que, ao submeter ratos wistar ao

consumo de uma dieta rica em gordura, não observou diferença no teor de proteínas e de

DNA hepáticos nos animais em relação aos controles.

Apesar disso, a dieta hiperlipídica consumida ocasionou acúmulo de gordura hepática

compatível com o diagnóstico de DHGNA, exceto no grupo que consumiu o SUTI. Ainda que

o consumo alimentar da dieta hiperlipídica dos grupos que receberam SUTI e VT tenha sido

semelhante, o acúmulo de gordura hepática nos animais que consumiram o vinho tinto foi

maior. Existe controvérsia sobre o efeito do vinho tinto sobre a deposição de gordura

hepática. Um estudo mostra que os polifenois do vinho tinto são capazes de minimizar o

estresse oxidativo e a esteatose hepática em ratos alimentados com dieta hiperlipídica quando

consumido de forma moderada e diariamente (WESTERTERP, 2004). Entretanto, de acordo

com nossos resultados, o consumo de VT parece ter influenciado negativamente os benefícios

dos polifenois da bebida, o que de acordo com a literatura possa ser explicado pelo fato do

álcool poder gerar aumento de radicais livres, eliminação precoce de polifenois no sangue,

acelerando a eliminação destes compostos bioativos pelo corpo (YADAV, et al., 2009; DANI,

85

et al., 2008). O que não ocorreu diante do consumo de SUTI que parece estar associado à

inibição de síntese e deposição de gordura hepática em ratos alimentados com dieta

hiperlipídica, talvez devido ao seu conteúdo de polifenóis (BUCHER, et al., 2014; YADAV,

et al., 2009; DANI, et al., 2008).

Semelhante ao VT, a SR também não foi capaz de minimizar a deposição de gordura

no fígado dos animais estudados. Chachay et al. (2014) investigaram a administração por oito

semanas de resveratrol em humanos com DHGNA e verificaram que o composto isolado não

melhorou significativamente nenhuma característica da doença quando comparada com o

placebo, mas gerou aumento da concentração de enzimas hepáticas (AST, ALT e FAL, por

exemplo), aumentando o estresse oxidativo no fígado deste grupo. Isto ocorre, provavelmente,

porque os alimentos têm outros constituintes importantes que tornam a ação dos polifenois,

principalmente do resveratrol, mais efetiva do que quando o composto é consumido

isoladamente. Via cápsulas, o consumo de polifenois deve ser cauteloso, pois pode gerar uma

superdosagem e, no caso do resveratrol, vale dizer que as maiores dúvidas são justamente

sobre sua dose efetiva e segura e quais os efeitos de seu consumo em longo prazo

(BELTRÁN, et al., 2011).

O acúmulo de gordura no fígado predispõe o indivíduo a outros fatores de risco para

DCNT, como a hipertensão arterial sistêmica (WHO, 2013). Ratos alimentados com dieta

hiperlipídica, após 12 semanas, apresentaram aumento significativo da pressão arterial

sistólica quando comparados com aqueles alimentados com uma dieta com baixo teor de

gordura (DEJI, et al., 2009). Estes achados corroboram os resultados observados no presente

estudo, onde os animais que apresentaram maior deposição de gordura no fígado, também

apresentaram maiores valores de pressão arterial sistólica, embora não tenha sido observada

diferença na pressão diastólica entre os grupos. Entretanto, de acordo com os resultados, além

do benefício encontrado no consumo do SUTI com relação à esteatose hepática, a bebida se

mostrou protetora também em relação aos valores de pressão arterial sistólica.

Já foi referido que os compostos do suco de uva, roxa e verde, são cardioprotetores

principalmente pelo fato dos polifenois presentes na bebida apresentarem capacidade

antioxidante e antinflamatória (YADAV, et al., 2009; DANI, et al., 2008; NEMATBAKHSH,

2013). Além disso, os polifenois do SUTI evitam o aumento das concentrações de

86

lipoproteína de baixa densidade (LDL) e impedem sua oxidação, minimizam a formação de

placas de ateroma na parede das artérias, podem prevenir a agregação de plaquetas e o dano

oxidativo (PETROVSKI, et al., 2011; RODRIGUES, et al., 2012). Outro estudo mostra que o

maior benefício do suco de uva está na sua capacidade em atuar sobre o endotélio, por

aumentar a síntese de óxido-nítrico e preservar a vasodilatação endotélio-dependente devido

ao seu papel antioxidante (NEMATBAKHSH, 2013).

Em relação ao resveratrol, alguns achados mostram que o composto parece prevenir

contra disfunção endotelial pelo aumento da expressão de óxido nítrico sintase no endotélio,

além de atuar no processo redox (PETROVSKI, et al., 2011; RODRIGUES, et al., 2012). No

entanto, segundo Leifert & Abeywardena (2008) a ingestão de altas doses de resveratrol gera

picos do composto 1,5h após seu consumo, mas a excreção urinária é rápida, levando à

diminuição de 77% do polifenol em até 4h. Tais achados podem justificar o fato do consumo

da SR não ter promovido proteção nos valores de pressão arterial no presente estudo. Isto

porque a solução ofertava uma concentração do composto superior em relação ao VT e ao

SUTI. Além disso, quando o polifenol é ofertado por uma fonte alimentar, diferentemente da

solução (via cápsula), pode indicar a importância de seu consumo associado aos demais

nutrientes e a outros compostos bioativos do alimento, como no caso do SUTI. Enfatizando

que, muitas vezes, a ação de uma substância pode ser potencializada por sua associação com

outros compostos presentes na matriz do alimento e quando consumido isoladamente pode

não ter o efeito esperado.

87

7 CONCLUSÃO

Diante das alterações metabólicas ocasionadas pela dieta hiperlipídica, o consumo de

suco de uva tinto integral parece ser capaz de minimizar os efeitos da dieta sobre o tecido

hepático. Variação de glicemia, e níveis séricos de CT, HDL, AST, ALT e IL-6 apresentaram

melhores respostas fisiológicas nos animais que consumiram o SUTI, mesmo que sem

diferença estatística em algumas variáveis. Além disso, o consumo de SUTI foi capaz de

minimizar os efeitos da dieta hiperlipídica sobre o desenvolvimento da hipertensão arterial e

da doença hepática gordurosa não alcoólica.

Mesmo diante da menor concentração de polifenois, sugere-se que os benefícios

verificados com a ingestão do SUTI ocorreram pela associação dos compostos bioativos

presentes na matriz do alimento com seus demais nutrientes. O mesmo não foi observado com

o consumo de VT ou com a ingestão do polifenol resveratrol isolado (cápsulas).

Tabela 6: Resumo das características químicas das bebidas ofertadas no estudo

VT SUTI SR p valor

Polifenois totais

(mg EAG-1

x104)

2,58±0,00448a 1,09± 0,02166b 117,44±0,24497c <0,01

Trans-

resveratrol

(mg/L)

1,323±0,262a 0,381±0,033b 1,532±0,002a <0,001

Atividade

antioxidante

(%SRL)

109,03±43,69 110,53±32,04 64,51±19,44 0,05097

88

Tabela 7: Resumo dos parâmetros alimentares, bioquímicos e histológicos avaliados nos

animais do estudo

GC GH GV GS GR p valor

Peso corporal

inicial (g)

228,57± 31,05 211,63±37,07 220,24±34,21 219,68±32,59 242,80±27,85 0,3942

Peso corporal

final (g)

306,51±23,83 298,00±55,25 300,26±46,97 296,47±39,28 284,60±22,26 0,8864

Variação de peso

corporal (g)

77,93±47,75 86,37±51,79 80,02±61,28 76,79±54,15 41,80±13,92 0,5947

Consumo de

ração

(g/100gPC/dia)

6,01±1,34 5,15±1,16 4,67±1,16 4,84±1,28 5,95±0,83 0,0674

Consumo de

água

(mL/100gPC/dia)

11,22±5,71 10,06±3,38 7,23±2,07 9,58±4,47 10,24±4,68 0,2222

Consumo de

bebidas ricas em

polifenois

(ml/100gPC/dia)

- - 1,95±0,32a 3,74±1,66b 5,04±1,20b <0,0001

Consumo de

trans-resveratrol

(mg/dia)

- - 0,1323±0,0262a 0,0572±0,0049b 0,2297±0,0003c <0,0001

Consumo de

polifenois (mg

EAG/dia)

- - 25,89±0,45 a 16,35±3,24 a 1761,65±36,74 b <0,05

Valor energético

total consumido

(kcal/100g

PC/dia)

22,59 23,48 22,96 24,31 28,18 >0,05

Pressão arterial

sistólica (mmHg)

152,53±10,3a 181,37±12,86b 172,55±15,24b 117,8±10,24a 187,62±20,68b <0,001

Pressão arterial

diastólica

(mmHg)

68,97±11,47

67,28±15,39

76,94±14,91

51,97±4,21

69,73±16,89

>0,05

Variação de

Glicemia

(mg/dL)

12,5a 21,43b 1,43a 4,77a -2,4c <0,0001

Colesterol total

(mg/dL)

69,87±13,4a 55±6,12ab 56±15,87ab 51,6±7,74b 58±4,24ab 0,0338

HDL (mg/dL) 35,5±16,12 32,5±10,39 35±11,31 37,6±9,28 24±1,41 0,3537

Triglicerídeos

(mg/dL)

69,57±17,74a

42±11,44b

31,3±6,83b

35±9,76b

34±7,12b

<0,0001

89

GC GH GV GS GR p valor

AST (U/L) 30,2±7,0 32,5±11,7 33,2±4,6 27,6±4,9 32,0±8,8 0,2612

ALT (U/L)

94,5±15,6ab

98,6±23,8a

121,2±41,6ab

90,9±29,6a

151,6±42,9b

0,0136

FAL (U/L)

46,9±16,2a b

57,8±13,2a

51,5±13,5a

38,3±6,1a b

29,4±6,0b

0,0053

Proteínas totais

(g/dL)

4,0±0,3a

4,2±0,1a

3,2±0,3b

4,2±0,2a

4,3±0,1a

<0,0001

Albumina (g/dL) 3,9±0,3a 3,1±0,2b 3,2±0,2b 3,0±0,2b 3,1±0,1b <0,0001

Interleucina 6

(pg/mL)

42,73±6,85ab

43,42±7,1ab

51,49±7,17b

39,37±5,25a

41,13±8,55ab

<0,01

Área do núcleo

dos hepatócitos

(µm²)

69,01±27,53a 90,14±27,17b 89,48±23,21b 84,6±32,96b 69,94±24,42a <0,0001

Densidade óptica

integrada

(Feugen-DNA)

16,29±7,4a 33,63±12,65b 36,83±11,81b 27,29±11,31c 16,66±6,9a <0,0001

Peso do fígado

(g/100gPC)

2,91±0,19a 2,77±0,16ab 2,79±0,24b 2,59±0,26ab 2,55±0,11b 0,0191

Gordura

hepática (g%)

3,53±1,12a 5,11±0,43b 4,96±0,98b 3,34±0,23a 4,66±1,2b <0,0001

Proteína

hepática (g%)

18±0,4ab 18,15±0,9ab 18,95±0,6a 16,81±1,7b 18,56±0,5a 0,001

90

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106

ANEXO I

Certificado de Aprovação do projeto de pesquisa pelo Comité de Ética em Pesquisa

Animal da Universidade Federal Fluminense