terapia génica em vectores

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Terapia Génica em

vectores

Docentes: Sónia Mendo e Artur Alves; Trabalho realizado por:

Carina Félix (59903); Daniela Castelo (60909); Diana Campos

(59850); Mª Eugénia Costa (59878)

Mestrado em Biologia Aplicada (1ºano);

Fisiologia e Genética Microbiana;

Janeiro de 2010

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Introdução

O National Institutes of Health dos EUA realizou a 14 de Dezembro de

1990, o primeiro procedimento aprovado de terapia génica numa criança de

quatro anos. Ashanti DeSilva, nasceu com uma doença genética rara

denominada de imunodeficiência combinada severa, o que faz com que não

possua sistema imunitário saudável, sendo vulnerável a todos os agentes

infecciosos. As crianças com esta doença geralmente desenvolvem muitas

infecções e raramente conseguem sobreviver até à idade adulta. Ashanti, tinha

de permanecer em ambiente estéril e lutar contra doenças frequentes

recorrendo a grandes quantidades de antibiótico (Thompson, 1993).

Nesta terapia os médicos removeram os glóbulos brancos do corpo da

criança, deixando-os crescer em laboratório, sendo inserido posteriormente o

gene em falta nos mesmos. Por fim, reintroduziram-se os glóbulos brancos

geneticamente modificados na corrente sanguínea do paciente. Testes de

laboratório mostraram que a terapia fortaleceu o sistema imunitário de Ashanti,

podendo a criança fazer uma vida normal, tal como ir à escola, o que

anteriormente não poderia fazer. Esse procedimento não se tratou de uma cura

definitiva, uma vez que os glóbulos brancos tratados geneticamente só

funcionaram por alguns meses, tornando-se necessário repetir o processo

periodicamente (Thompson, 1993). Contudo, este procedimento revelou-se

pouco mais do que uma fase inicial para a expansão da terapia génica, que

inicialmente se mostrou com elevadas controvérsias (Coutts et al., 2010).

A biologia de terapia génica em humanos é muito complexa, existindo

muitas técnicas que necessitam de ser desenvolvidas e aperfeiçoadas, bem

como doenças que precisam de ser compreendidas mais profundamente, de

modo a que a terapia génica possa ser usada adequadamente. O debate

público em torno da possível utilização de material geneticamente modificado

em seres humanos tem sido igualmente complexo. Os maiores participantes no

debate sobre este tema, provieram de áreas como biologia, governo, direito,

medicina, filosofia, política e religião, trazendo cada um, diferentes visões para

a discussão (Coutts et al., 2010).

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Ao estudar a ética da terapia génica, deve-se realizar uma distinção

entre terapia nas células somáticas (não reprodutivas) e nas células de ―vírus‖

(reprodutivo) de um indivíduo. Apenas as células de vírus carregam os genes

que vão ser transmitidos para as próximas gerações. Alguns investigadores de

terapia génica, opuseram-se a qualquer forma de manipulação genética, não

importando o quão ―bem-intencionada‖ fosse. Muitos outros aprovaram o uso

de terapia de células somáticas, não se chegando, no entanto, a um acordo

relativamente à permissão do uso da terapia génica em células, que pode ter

efeitos imprevisíveis nas gerações futuras. Outros cientistas ainda

argumentaram que com uma regulamentação e garantias adequadas, a terapia

génica em células germinativas é uma extensão lógica do progresso realizado

até à data e um procedimento eticamente aceite (Coutts et al., 2010).

O que é a terapia génica?

A terapia génica consiste na utilização de técnicas de DNA

recombinante, com o objectivo de introduzir no organismo o gene não mutado

que codifica a proteína em falta no paciente ou substituir a base mutada pela

base normal. Para tal usa-se um vector, que serve para entregar os genes na

célula-alvo. Os genes podem ser inseridos em células somáticas ou em células

germinativas, apesar da linha germinal ser considerada eticamente inaceitável.

(David & Peebles, 2008).

As sequências de nucleótidos introduzidas são moléculas de cDNA de

genes normais que irão repor a funcionalidade de genes correspondentes.

Primeiramente, os genes têm de ser identificados, isolados de células normais

e clonados, sendo posteriormente necessário introduzir o gene desejado num

vector apropriado, para que ocorra o transporte do mesmo até à célula

eucariota. Por fim, o gene é introduzido nas células do paciente, processo que

se designa transfecção. A partir daqui, a mensagem do DNA é copiada e

convertida em RNA mensageiro (transcrição), seguindo posteriormente para o

ribossoma onde é convertido a proteínas (tradução). Uma proteína produzida

através de técnicas de terapia génica pode actuar intracelularmente ou

extracelularmente (figura 1). O sucesso de qualquer terapia génica é

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fortemente dependente da frequência e eficiência das etapas anteriores

(Scaduto & Wang, 2000).

A terapia génica actua assim, ao nível molecular eliminando o foco da

doença enquanto a maior parte dos fármacos cura apenas os sintomas, isto é,

a terapia génica actua ao nível do genótipo em vez de tratar simplesmente a

expressão fenotípica (Ratko et al., 2003).

Figura 1 - A terapia génica é baseada no facto de que todas as proteínas são

sintetizadas com base no código genético. Através da transferência de genes, células

geneticamente modificadas podem fabricar continuamente produtos desejados, tal

como proteínas (Adaptado de Hall& Kang, 2000).

Argumentos a favor da terapia génica

O argumento central a favor da terapia génica é que esta pode ser

usada para tratar pacientes gravemente doentes, ou para prevenir o

aparecimento de doenças complexas. O tratamento convencional falhou para

as doenças candidatas à terapia génica e, para esses pacientes, a terapia

génica é a única esperança para um futuro. Muitos cientistas comparam a

terapia genética em células somáticas a outras novas tecnologias médicas, e

argumentam que devem sempre tratar os doentes, caso seja possível. Os

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autores podem usar o termo "investigação de transferência de gene humano"

(HGTR) para enfatizar a natureza não-terapêutica actual da pesquisa genética.

(Churchill et al., 1998).

Eric Juengst resumiu os argumentos a favor e contra a terapia génica

germinal humana, em 1991: 1) a terapia génica germinal oferece uma

verdadeira cura, e não apenas o tratamento paliativo ou sintomático; 2) a

terapia génica germinal pode ser a única forma eficaz de tratar algumas

doenças genéticas; 3) impedindo a transmissão de genes de doenças, o custo

e o risco da terapia com células somáticas de várias gerações são evitados; 4)

a medicina deve responder às necessidades de saúde reprodutiva dos futuros

pais em situação de risco para a transmissão de graves doenças genéticas e 5)

a comunidade científica tem o direito de pesquisar livremente, dentro dos

limites da pesquisa humana aceitável (Juengst, 1991).

Argumentos contra a terapia génica

Um dos argumentos contra este procedimento é, se é possível distinguir

entre "bons" e "maus‖ os usos das técnicas de modificação genética (Coutts et

al., 2010). Outro argumento é a dificuldade de acompanhamento dos pacientes

a longo prazo. Os pacientes da terapia génica teriam de ser mantidos sob

vigilância durante várias décadas para monitorizar os efeitos a longo prazo da

terapia para as gerações futuras (Ledley, 1992). Existe uma preocupação com

o facto de muitos candidatos à terapia génica serem crianças muito jovens, não

sendo, talvez, capazes de entender as ramificações do tratamento através

desta terapia.

Outra desvantagem aponta para o potencial conflito de interesses,

opondo as liberdades reprodutivas e os interesses privados de um indivíduo ás

companhias de seguros, na medida em que as ultimas querem o que lhes seja

mais conveniente em termos monetários, não olhando para o que é melhor

relativamente ao indivíduo (Coutts et al., 2010).

Questões de justiça e alocação de recursos foram também levantadas:

―Num momento de tensão do sistema de saúde, será que é possível o

pagamento de uma terapia tão cara? Quem deve receber a terapia génica, se

esta está apenas disponível para a população com possibilidades financeiras?".

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―A distribuição das características biológicas desejáveis entre os diferentes

grupos sócio-económicos e étnicos tornar-se-ia muito enviesada" (Juengst et

al., 1991). Argumentos especificamente contra o desenvolvimento de linha

germinal das técnicas de terapia genética incluem: 1) experiências de terapia

génica da linha germinal envolveriam elevadas incertezas científicas, sendo

que os riscos clínicos e os efeitos a longo prazo associados a esta são

desconhecidos; 2) a terapia génica permitiria alterar características fenótipicas

associadas à doença, o que poderia agravar os problemas de discriminação

social; 3), a terapia génica da linha germinal envolve a pesquisa sobre

embriões e os efeitos nos seus descendentes, tal investigação cria

posteriormente opiniões não consensuais; 4) a terapia génica apresenta custos

elevados, não sendo rentável o suficiente para merecer prioridade social; 5) a

terapia genética de linha germinal poderia violar os direitos das gerações

subsequentes ao receber uma herança genética que tenha sido

intencionalmente alterada (Juengst, 1991). As questões éticas decorrentes de

ambas as terapias génicas, somáticas e de linha germinal, são de âmbito

internacional (Coutts et al., 2010).

É de grande importância referir que, existem uma variedade de reacções

à terapia génica, sendo também necessário elucidar a complexidade deste

assunto que permanece em debate público contínuo (Coutts et al., 2010).

Estratégias na terapia génica

As estratégias de terapia génica diferem pelo gene, veículo de entrega

(vector), célula-alvo (anatomia e fisiologia) para a transferência de genes, local

onde as células são manipuladas (em cultura de tecidos ou no interior do

hospedeiro) e pela via de administração (regional ou sistémica) (Scaduto &

Wang, 2000).

Ao escolher a estratégia de terapia génica é importante considerar a

duração desejada da produção e localização de proteínas. O processo de

transferência do gene envolve a introdução de uma sequência de ácido

nucleico numa população de células ou tecidos, resultando na transcrição e

tradução de um determinado gene. A alteração da composição genética de

uma célula-alvo, pode resultar na produção de proteínas que não afectam

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apenas o seu metabolismo, mas também o metabolismo das células vizinhas

(células não alteradas geneticamente) (Hall& Kang, 2000).

A transferência de genes é geralmente realizada através da introdução

do gene de interesse, quer directamente para as células-alvo (in vivo ou

estratégia directa) ou por remoção das células-alvo, (ex vivo ou estratégia

indirecta) seguido de alteração genética com posterior reimplante no corpo

(figura 2) (Hall & Kang, 2000).

Figura 2- Na terapia genica in vivo introduzem-se os vectores que contêm o gene

adequado directamente no órgão ou tecido alvo. A terapia génica ex vivo exige a

remoção das células do corpo, a alteração genética dessas mesmas células in vitro,

seguindo-se a reimplantação das células geneticamente modificadas no órgão ou

tecido alvo (Adaptado de Hall & Kang, 2000).

A via de administração do gene requer atenção adicional. A entrega

directa de genes para o local da doença é referida como a terapia génica local

(Hall & Kang, 2000) ou regional (Scaduto & Wang, 2000). A transferência de

genes que ocorre à distância do local da doença e usa a circulação sistémica

para fornecer células geneticamente modificadas e/ou genes é denominada de

terapia genética sistémica (Hall & Kang, 2000; Scaduto & Wang, 2000).

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Relativamente ao veículo de entrega é designado de vector. Existem

muitos vectores actualmente disponíveis, não existindo um vector ideal. Estes

podem ser virais ou não virais. Os vírus são vectores muito eficientes, dado

que a entrega e expressão do DNA são indispensáveis ao seu ciclo de vida

normal. Quando um vírus é utilizado como um vector, porções do genoma viral

são excluídos, com o objectivo de impedir a replicação, bem como criar espaço

para a inserção do DNA terapêutico. Uma das preocupações quanto ao uso de

vírus de replicação deficiente é a possibilidade deste poder recombinar com

sequências virais na célula do hospedeiro, podendo adquirir capacidade de se

replicar (Scaduto & Wang, 2000).

Vectores Virais

Para melhorar a eficiência e estabilidade da entrega de genes,

numerosos laboratórios têm vindo a avaliar vectores virais e não virais para a

transferência destes. Os vírus evoluíram até se tornarem muito eficientes na

entrega de ácidos nucleicos a tipos de células específicos, enquanto evitavam

a reacção imunitária. Se a patogenicidade de um vírus específico, tal como o

adenovírus, puder ser eliminada enquanto a sua eficiência na entrega dos

genes é mantida, o gene poderá servir para a terapia génica (El-Aneed, 2004).

Cada sistema vectorial tem os seus pontos fortes, bem como os seus pontos

fracos, o que requer mais modificações, de modo a fazer com que o vector

sirva para as aplicações gerais da terapia génica (El-Aneed, 2004).

Os vírus têm um mecanismo de replicação muito peculiar (figura 3),

começando por introduzir o seu genoma na célula hospedeira. Este material

genético vai sofrer replicação e transcrição, obtendo-se mRNA viral que será

traduzido e dará origem a proteínas virais. As novas partículas virais formam-se

e reúnem-se dentro do hospedeiro, acabando por ser expelidas para o exterior

(El-Aneed, 2004).

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Figura 3 - Replicação viral numa célula hospedeira.

Retrovírus

Os vectores retrovírus são desenvolvidos através da substituição de genes

virais vitais por genes terapêuticos. Os retrovírus (figura 4), são pequenos vírus

de RNA com DNA intermediário, que se integram no genoma da célula

hospedeira, produzindo as proteínas virais (gag, pol e env), sendo esse DNA

removido no processo de desenvolvimento dos vectores retrovirais.

É importante salientar que o uso de múltiplas entregas de genes por via

retroviral é raramente aplicado dada a sua capacidade de encapsulamento

limitada. A maior parte dos vírus infectam células em processo de divisão

activa durante a mitose (Lewis et al., 1994; Miller et al., 1990). Para além do

facto desta característica poder proteger os tecidos normais, infectando

naturalmente o tumor, todos os tumores contém células em fase de ―descanso‖,

G0, que não se estão a dividir. Estas células podem escapar à terapia. Os

lentivírus, tal como o vírus da imunodeficiência humana (VIH) e os seus

vectores podem, contudo, infectar células não proliferativas (Lewis et al., 1994;

Buchschacher et al., 2000). No entanto, o uso de lentivírus tem um

inconveniente maior tendo em conta os efeitos clínicos negativos originais

destes vírus.

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Figura 4 - Representação esquemática e imagem real de um retrovírus.

Os retrovírus contêm RNA viral e várias cópias de transcriptase reversa

(DNA polimerase). Após infectarem uma célula, a transcriptase reversa é usada

para fazer as cópias iniciais do DNA viral a partir do RNA viral. Uma vez que

após uma cadeia de DNA tenha sido sintetizada, é feita uma cadeia de DNA

complementar viral (cDNA). Estas cópias de cadeia dupla do DNA viral são

inseridas no cromossoma da célula hospedeira e a RNA polimerase da célula

hospedeira é usada para fazer RNA de vírus. Estas cadeias de RNA servem

como modelos para fazer novas cópias do RNA cromossómico viral e servem

também como mRNA. O mRNA é traduzido em proteínas virais que são usadas

para fazer o envelope do vírus. Novas partículas virais são montadas e são

libertadas. Um exemplo deste processo é ilustrado na replicação do retrovírus,

o VIH (figura 5) (Robbins & Ghivizzani, 1998).

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Figura 5 - Processo de replicação de retrovírus.

Adenovírus (Ad)

Os adenovírus (figura 6) são vírus com dupla cadeia de DNA que podem

infectar tanto células em divisão como células que não se estejam a dividir (Li

et al., 1993; Quantin et al., 1992). Os vectores adenovirais competentes

defeituosos foram gerados inicialmente, substituindo o gene viral E1 com um

gene terapêutico.

Os vectores génicos mais eficientes foram obtidos alterando mais genes

no genoma viral, tais como o gene E2. (Engelhardt et al., 1994). A remoção de

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toda a sequência codificadora do genoma viral resultou em melhores vectores

em termos de capacidade (Harrington et al., 2001).

A transfecção com adenovírus é transiente desde que o genoma de DNA

não integre permanentemente o material genético da célula hospedeira (Kelly

et al., 1994). Deste modo, a administração repetitiva de vectores adenovirais é

necessária para obter o resultado terapêutico desejado. De facto, os vectores

adenovirais foram apontados como a primeira morte na história da terapia

génica clínica. (Raper et al., 2002). Foi sugerido que elevadas doses do

complexo adenovirus/anticorpos imunes induzem uma activação

complementar, o que pode levar substancialmente a reacções inflamatórias

letais sistémicas (o que não acontece com doses moderadas).

Figura 6 - Representação esquemática e imagem real de um adenovírus.

A figura 7 corresponde a uma tradução adenoviral. O adenovírus

recombinante entra nas células através da ligação mediada por CAR (receptor

adenovírus e vírus coxsackie) e IR (receptor integrina). As partículas

adenovirais sofrem endocitose, escapam dos endossomas e entram no núcleo

através do complexo envelope nuclear com poros. O material genético do

adenovírus não é incorporado no genoma da célula hospedeira, mas assume

uma posição epicromossomal, onde ainda se pode utilizar maquinaria

transcripcional e traducional da célula hospedeira para a síntese de proteínas

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recombinantes, neste caso, a isoforma endotelial eNOS (óxido nítrico sintase)

(Robbins & Ghivizzani, 1998).

Figura 7 - Processo de replicação de adenovírus.

Vírus Herpes Simples (VHS)

A família dos vírus VHS (figura 8) infecta naturalmente humanos ao nível

dos olhos, na mucosa oral e vaginal. Durante o seu ciclo de vida, infectam as

terminações nervosas sensoriais e migram para as células do sistema nervoso,

resultando numa infecção latente (Corey et al., 1986). Os vectores VHS são

produzidos através da eliminação da sequência de algumas das proteínas

virais expressas no início da infecção, tais como ICP0, ICP4, ICP27 e ICP22

(Wu et al., 1996; Marconi et al., 1996). Estas proteínas podem desencadear a

produção de outros componentes virais essenciais. O grande genoma linear de

dupla cadeia dos vírus VHS (cerca de 150 kb), que é quase 15 e 4 vezes maior

que a do lentivírus e adenovírus, respectivamente, podem ser substituídos por

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quase 40 kb de genes estranhos, ficando entre os primeiros a nível da

capacidade dos vectores virais (Latchman et al., 2001). Esta capacidade foi

utilizada com sucesso em simultâneo com a capacidade de entrega de

múltiplos genes usando apenas um vector. Por outro lado, tanto o vírus original,

que é patológico, como o vírus modificado, podem limitar as suas aplicações

terapêuticas (El-Aneed, 2004).

Figura 8 - Representação esquemática e imagem real de um VHS.

A proteína ICP0 do vírus Herpes Simples interrompe a resposta do

interferão (IFN), tanto por obstrução da via JAK-STAT (JAK - Janus quinase;

STAT – tradutor de sinal e activador de transcrição) como por regulação

negativa directamente do nível de expressão de genes estimulados – IFN

(ISGs), sendo também o VHS US11 um inibidor da proteína cinase PKR.

Curiosamente, o HCV ICP34.5 ignora o efeito da PKR no controlo da tradução

através da recruta de proteínas celulares fosfatase 1α (PP1α) para desfosforilar

o factor 2 de iniciação, da subunidade α (eIF-2α). O VHS também codifica

derivados da adenosina (A) 2 ', 5' para bloquear a 2 ', 5'-sintetase

oligoadenilato (OAS), via RNase L (figura 9) (Robbins & Ghivizzani, 1998).

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Figura 9: Processo de replicação de VHS.

Vírus Adeno-associados (VAA)

VAAs (figura 10) são vírus de DNA de cadeia simples. Estes codificam

para duas proteínas virais, nomeadamente Rep e Cap, que são removidas dos

vectores defeituosos utilizados na terapia génica (Jain et al., 1998).

Semelhantes ao adenovírus, os VAAs podem infectar tanto células em divisão

como aquelas que não se encontram em divisão. O seu DNA, contudo, integra-

se no genoma da célula hospedeira, semelhantemente aos retrovírus. Os

vectores VAA possuem pouca toxicidade quando em wild type, não causando

quaisquer efeitos patológicos em seres humanos, integrando-se

especificamente no cromossoma 19 do genoma do ser humano (Samulski et

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al., 1991). Esta especificidade vai reduzir os riscos de mutagénese induzida

observada na transferência de genes retrovirais. Além disso, o local da

integração não codifica nenhum gene importante. A principal desvantagem

deste sistema é a necessidade de um vírus auxiliar (adenovirus ou VHS) para

produção de VAA (Buller et al., 1981). Isso pode resultar em vectores

contaminados durante a preparação. Esta desvantagem foi superada pela

indução da replicação viral através de estímulos genotóxicos, tais como choque

térmico, produtos químicos ou irradiação (Yakinoglu et al., 1988). De facto, a

tradução dos genes de VAA e efeitos anti-tumorais in vitro e in vivo foram

significativamente maiores quando combinados com UV e tratamentos de

radiação gama (Kanazawa et al., 2003). Além destas dificuldades de

replicação, a capacidade desses vectores é muito limitada (menos de 5 kb de

DNA) (Cusack et al., 2002).

Figura 10 - Representação esquemática e imagem real de um vírus adeno-associado.

A figura 11 representa a estrutura do vírus VAA wild type (a) bem como

o vector genérico baseado nos VAA (b). Em a) um genoma de DNA de cadeia

simples é envolvido por repetições palindrómicas terminais invertidas (ITRs).

As Rep ORFs (Open Reading Frame) codificam as proteínas que estão

envolvidas na replicação viral e as Cap ORFs codificam as proteínas que são

necessárias para o empacotamento viral. Os VAA integram-se no genoma

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humano, no cromossoma 19 (vermelho) e persistem na forma latente. Podem

sair desta fase apenas se a célula é co ou super-infectada com o vírus auxiliar,

tal como o adenovírus (Ad) ou o vírus do herpes simples (VHS), que

proporcionam os factores necessários para a replicação activa dos VAA.

Em b) o genoma viral é substituído por uma cassete de expressão, que

normalmente consiste em: promotor, transgene e cauda poli (pA). Para a

produção do vírus recombinante (rVAA), as proteínas Rep e Cap, bem como

elementos Ad ou VHS (Ad E1, E2 e E4orf6) têm de ser fornecidas em trans.

Exemplos de formas intracelulares do vector de entrega, que são responsáveis

pela expressão do transgene após tradução com rVAA (epissomas de dupla

cadeia circular e vectores de genomas integrados aleatoriamente) estão

representados a vermelho (Vasileva & Jessberger, 2005).

Figura 11 - Processo de replicação de vírus adeno-associados. a) Vírus wild-type e b)

Expressão de vectores recombinantes.

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Poxvírus (vacina viral)

Estes vírus (figura 12) são usados como vacinas que erradicam o vírus

da varíola em todo o mundo. São vírus de DNA de dupla cadeia que podem

infectar tanto células em divisão como células que não se encontrem em

divisão. Semelhantes ao VHS, têm um genoma grande (cerca de 186 kb)

podendo acomodar até 25 kb de sequências transgénicas (Smith et al., 1983).

A vacinação por poxvírus recombinante, que pode induzir nas células T

reacções imunológicas contra infecções e doenças malignas, teve grande

sucesso (Gomella et al., 2001). Esta estratégia pode produzir efeitos

imunológicos sinergéticos. Sabe-se ainda que é possível inserir múltiplos genes

num hospedeiro utilizando exclusivamente vacinas virais transportadoras. A

longa história no uso de vectores em vacinação, a sua baixa toxicidade e alta

capacidade para DNA exógeno, torna-os excelentes transportadores para a

inserção de genes (El-Aneed, 2004).

Figura 12 - Representação esquemática e imagem real de Poxvírus.

Na figura 13 é possível acompanhar o processo de replicação de um Poxvírus:

1 – Entrada: um virião maduro intracelular (IMV) liga-se a partículas receptoras

desconhecidas e funde-se com a membrana celular. O virião extracelular

encapsulado (EEV) liga-se a partículas receptoras desconhecidas e sofre

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endocitose na célula. 2 - Desencapsulamento inicial: a partícula viral do núcleo

(CORE), contendo o genoma viral, RNA polimerase dependente de DNA viral,

e outras enzimas é libertada para o citoplasma. 3 - Início da transcrição: genes

precoces (incluindo aqueles que codificam proteínas imunomoduladoras,

enzimas e factores de replicação e transcrição) são transcritos e traduzidos

imediatamente após a entrada de partículas do núcleo no citoplasma da célula.

4 – Translocação: a partícula viral do núcleo desloca-se para o exterior do

núcleo da célula. 5 - Desencapsulamento Secundário: o complexo

nucleoproteína viral (NP) é libertado, contendo o genoma viral. Neste ponto, o

genoma viral é replicado e ocorre a transcrição e a tradução de genes

intermediários (principalmente de codificação para factores de transcrição). 6 –

Transcrição: os genes virais (que codificam proteínas estruturais, enzimas e

factores de transcrição) são transcritos e traduzidos. 7 – Montagem:

intermediários concataméricos são resolvidos em DNA de cadeia dupla linear e

embalados com proteínas virais em viriões imaturos (IV). 8 – Libertação: os IV

amadurecem em IMVs através de um mecanismo que pode incluir a

transformação do IV através do Complexo de Golgi. Os IMVs são transportados

para a periferia da célula, onde podem ser libertados de três formas diferentes:

IMVs libertados através de lise celular, permanecendo IMVs; alternativamente,

IMVs podem ―germinar‖ até à superfície celular, ―apanhando‖ um envelope viral

da membrana plasmática. Na superfície dessas células-associadas de viriões

encapsulados (CEVS) são empurrados através de uma cauda Actina em

contacto com uma segunda célula. Por fim, o IMV pode ―germinar‖ através da

membrana plasmática ao ―apanhar‖ um envelope, tornando-se assim um

EEV(Robbins & Ghivizzani, 1998).

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Figura 13 - Processo de replicação de Poxvírus, sendo IMV – Intracellular Mature

virion; EEV – Extracellular Enveloped Virion e CEV – Cell-associated Enveloped Virion.

Alfavírus

A família dos Togavírus são vírus de RNA de cadeia simples com uma

estrutura de envelope (figura 14). O género Alphaviridae tem 26 membros,

todos com um genoma de aproximadamente 12 kb e geralmente residentes em

muitas espécies, como mosquitos, pássaros, roedores e outros mamíferos.

Alguns dos membros dos alfavírus são patogénicos nos seres humanos e têm

sido responsáveis por algumas epidemias com sintomas gripais que têm sido

descritas na África Central (Lundstrom, 2005).

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O ciclo de vida de alfavírus (figura 15) inclui a infecção através do

reconhecimento dos receptores da superfície celular como sulfato de heparina

e receptores de laminina e absorção de partículas virais, quer através de fusão

com a membrana celular quer através de endocitose. Após o lançamento de

RNA no citoplasma, ocorre a tradução das proteínas virais não estruturais,

levando à formação do complexo replicase, responsável pela alta eficiência de

replicação do RNA. As cópias de RNA subgenómico contendo os genes

estruturais (capsídeo, proteínas do envelope) são gerados (Lundstrom, 2005).

As vantagens destes vírus são a rápida produção de altos títulos (109 - 1010

partículas infecciosas/ml) de partículas que não requerem maior concentração

ou purificação. Além disso, a ampla gama de hospedeiros celulares e

expressão de altos níveis de trangenes são características positivas. A indução

de apoptose também pode ser vista como uma vantagem para aplicações em

terapia de cancro. Uma das desvantagens dos alfavírus é a expressão a curto

prazo dos transgenes, que dura, in vivo, entre 5 a 7 dias. Outra preocupação

prende-se com a citotoxicidade do hospedeiro, resultando numa paragem

programada da expressão génica endógena que pode afectar a tradução de

sinal de eventos e cinética de expressão de genes (Lundstrom, 2005).

Figura 14 - Imagem real de um Alfavírus.

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Figura 15 - Processo de replicação de Alfavírus.

No quadro seguinte encontra-se um resumo das características,

vantagens e desvantagens dos diversos tipos de vírus utilizados em terapia

génica.

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Tabela I: Comparação entre diferentes vectores virais em uso na terapia génica:

vantagens e desvantagens. (A) – Características da Partícula; (B) – Propriedades de

Terapia Génica.

Vectores não virais

O sucesso da terapia génica é extremamente dependente do

desenvolvimento do vector que consegue selectiva e eficientemente entregar

um gene às células-alvo com a mínima toxicidade (Li & Huang, 2000). A função

do vector é proteger e transportar eficazmente o material genético para o

núcleo das células alvo onde é então descodificado (expresso) a fim de

produzir a proteína terapêutica (Niidome & Huang, 2002).

Os vírus são eficientes na tradução de células, no entanto, as

preocupações de segurança sobre o uso destes, torna os vectores não virais

uma boa alternativa. Estes são particularmente adequados, no que diz respeito

à simplicidade de uso, facilidade de produção em larga escala e ausência de

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resposta imune específica (Kalil & Sant´Anna, 2004). Estes têm algumas

vantagens relativamente aos vectores virais tais como, não causarem qualquer

tipo de doença, serem pouco tóxicos, não ocorrer a recombinação de vírus

endógenos, não existirem efeitos oncogénicos e a ausência de uma resposta

imune inesperada. Actualmente, alguns sistemas não virais são aplicados em

conjunto com vectores retrovirais e adenovirais, no sentido de aumentar a

eficiência de transferência desses sistemas. Uma variedade de sistemas não

virais, podem ser utilizados para terapia génica em diferentes situações clínicas

(Li & Huang, 2000; Niidome & Huang, 2002). Os sistemas não virais são

divididos em dois grupos gerais: (1) entrega ―DNA nu‖ por um método físico,

como por exemplo eletroporação e biobalística e (2) a entrega mediada por um

transportador químico, tais como polímeros catiónicos e lípidos (Niidome &

Huang, 2002).

.

Entrega de “DNA nu”

Alguns investigadores têm explorado a injecção de DNA, sem qualquer

protecção (―DNA nu‖), no interior das células dos pacientes. A entrega de ―DNA

nu‖ parece promissora na imunização contra as doenças infecciosas, certos

tipos de cancro e na prevenção de rejeição de órgãos transplantados (Niidome

& Huang, 2002). A maneira mais simples para a administração do DNA é a

injecção directa de DNA plasmidial nu (pDNA nu) no tecido ou a injecção

sistémica (Li & Huang, 2000; Su et al., 2008). O uso de ―DNA nu‖, sem

qualquer molécula transportadora é o método mais seguro. São diversos os

locais de injecção directa, sendo que a injecção sistémica é também uma via

conveniente para a administração do gene. No entanto, devido à rápida

degradação por nucleases e à resposta do sistema mononuclear fagocitário, o

nível de expressão após a injecção de ―DNA nu‖ é geralmente limitado. Várias

abordagens físicas têm sido desenvolvidas para melhorar a eficiência da

transferência de genes através de ―DNA nu‖ (figura 16), nomeadamente a

electroporação, biobalística (gene gun), ultra-som, hidrodinâmica (alta

pressão), entre outros (Niidome & Huang, 2002; Su et al., 2008).

de 38

Figura 16: Técnicas não virais de entrega de genes. Diferentes vias de injecção de

―DNA nu‖ e estratégias de valorização (adaptado de Niidome & Huang, 2002).

A electroporação consiste na aplicação de campos eléctricos

controlados, de modo a facilitar a permeabilização da célula, sendo usada para

melhorar a captação de genes em células após a injecção de ―DNA nu‖. Além

disso, a electroporação pode atingir uma expressão de longa duração, podendo

também ser usada em vários tecidos. A pele é um dos alvos ideais, devido à

facilidade de administração (Niidome & Huang, 2002; Su et al., 2008).

A biobalística pode conseguir a entrega directa de genes nos tecidos ou

células. Consiste no bombardeamento de partículas de ouro revestidas com

DNA, permitindo a entrada directa através da membrana celular para o

citoplasma, bem como para o núcleo, ignorando o compartimento endossomal

(Li & Huang, 2000).

de 38

A técnica ultra-som pode aumentar a permeabilidade da membrana

celular para macromoléculas como o DNA plasmidial. Com efeito, o aumento

da expressão do gene foi observada pela irradiação de ondas ultra-sónicas no

tecido após a injecção de DNA. Como esta técnica é flexível e segura, a sua

utilização na entrega de genes tem uma grande vantagem no uso clínico.

Por fim a técnica hidrodinâmica da injecção consiste na aplicação de

uma injecção rápida com um grande volume de solução de ―DNA nu‖. Segundo

alguns autores, o DNA plasmidial nu é incorporado por via de receptores, por

hematócitos. A pressão tem sido proposta como o principal mecanismo

responsável pela expressão altamente eficiente no fígado. Este método de

transfecção, mediada por pressão pode ser aplicável a outros tecidos (Niidome

& Huang, 2002). Estas são algumas das técnicas utilizadas para facilitar a

entrada de ―DNA nu‖, já que a entrada deste é dificultada, devido á acção

enzimática.

Lípidos catiónicos (ex:Lipossomas)

Enquanto a expressão do gene pode ser obtida por injecção intra-tecido

directa de DNA plasmidial nu, a transferência de genes através de outras vias

de administração, tais como a injecção intratraqueal e venosa exigem, em

geral, a utilização de um vector ou veículo de entrega. Vários tipos de vectores

sintéticos têm sido desenvolvidos para a transferência de genes. Entre estes,

encontram-se os lípidos catiónicos e sistemas baseados em polímeros, tendo

sido os mais estudados até à data, observando-se que o modo de actuação in

vitro e em condições de transfecção in vivo é muito diferente. A eficiência de

transfecção in vivo de um lípido catiónico é dependente da via de

administração. Assim, a optimização de um vector deve ser individualizada de

acordo com a situação clínica. (Niidome & Huang, 2002; Su et al., 2008).

A entrega de genes baseada em lipossomas, mencionada pela primeira

vez por Felgner em 1987, é ainda uma das técnicas mais importantes para a

entrega do gene nas células. Em 1990, um grande número de lípidos catiónicos

foram desenvolvidos, tais como derivados catiónicos do colesterol e

diacilglicerol, derivados de lípidos de poliaminas entre outros.

de 38

Existem dois tipos de lipossomas, os aniónicos e os catiónicos, sendo os

últimos os mais usados na terapia génica em humanos (Robbins & Ghivizzani,

1998). Os lipossomas catiónicos são pequenas esferas de lípidos catiónicos

com capacidade de acomodar internamente grandes moléculas de DNA. Estes

condensam e retêm o DNA por interacção electrostática, permanecendo

estáveis em solução aquosa durante meses. Os lipossomas carregados

positivamente aderem à superfície celular negativa, de modo a libertar o DNA

no citoplasma das células-alvo. Posteriormente, o DNA plasmídico é então

incorporado no núcleo como um epissoma. As principais vantagens desta

técnica são: ser relativamente segura, não existirem restrições quanto ao

tamanho do DNA plasmidial ou à célula-alvo e a relativa facilidade de

preparação (Kalil & Sant´Anna, 2004; Su et al., 2008). Estas moléculas podem

ser vectores plasmídicos contendo o gene terapêutico ou simplesmente

fragmentos de DNA. Este sistema permite, por exemplo, aplicar a estratégia do

RNAantisense em que a expressão de certos genes é silenciada. Os

lipossomas não são patogénicos, podendo assim serem usados em múltiplos

tratamentos, sendo relativamente baratos e fáceis de produzir, no entanto a

eficiência de transfecção usando os lipossomas correntes é significativamente

reduzida comparativamente aos vectores virais (Robbins & Ghivizzani, 1998).

Daí a necessidade da realização de algumas alterações na sua composição, no

sentido de mimetizar os vírus e assim aumentar a sua eficiência e

especificidade (Dinçer et al, 2005). Assim, para melhorar a transfecção

realizada pelos lipossomas catiónicos, estes podem ser conjugados com

partículas virais deficientes, proteínas virais ou derivados de péptidos virais,

sendo assim capazes de romper o lisossoma e/ou aumentar o transporte de

DNA para o núcleo (Robbins & Ghivizzani, 1998).

Péptidos

Tióis Redox sensíveis foram incorporados no péptido portador do gene.

Alguns autores desenvolveram péptidos contendo um resíduo de cisteína e

uma sequência contínua de resíduos de lisina, por exemplo, Cis-Trp-Lys. Estes

péptidos podem também condensar DNA plasmidial e o grupo tiol é

de 38

espontaneamente oxidado, resultando num complexo altamente estável com

uma elevada actividade de transfecção in vitro. O cross-linking do péptido

causa elevada expressão do gene, sem aumentar a absorção de DNA pelas

células, sugerindo que a libertação intracelular do DNA (provocada pela

redução da ligação dissulfeto) desempenha um papel fundamental (Niidome &

Huang, 2002).

Polímeros catiónicos e complexos

Uma outra classe de vectores que tem sido estudada activamente são

os polímeros catiónicos. Comparando com os lípidos catiónicos, os polímeros

catiónicos são mais eficientes na condensação do DNA. Diferentes tipos de

polímeros têm sido avaliados como vectores, tais como os polímeros sintéticos

que foram também avaliados como veículos de DNA não virais. O princípio é

baseado no conceito de formação de partículas de DNA condensado, através

da formação de complexos com os polímeros catiónicos, conhecidos como

poliplexos (Su et al., 2008). A utilização de polímeros policatiónicos leva à

neutralização das cargas electrostáticas aniónicas do DNA e subsequente

condensação da estrutura de polinucleotídeos do DNA, protegendo-o contra a

digestão das nucleases. Além disso, devido às reduzidas dimensões das

moléculas, o transporte do compacto polímero-particulas de DNA é facilitado

através da matriz extracelular. Como resultado, a captação celular por

endocitose é reforçada. Muitas moléculas policatiónicas têm sido utilizadas,

incluindo a poli-L-lisina (PLL), dendrímeros polimetacrilato, poliamidoamina e

polietilenoimina (PEI) (Su et al., 2008; Li & Huang, 2000). Entre estes, PEI e

PLL são as moléculas mais comuns e importantes, usadas como vectores não

virais. PLL é um policatião bem conhecido, sendo usada na entrega de drogas.

Este tem sido também usado para condensar pDNA sob diferentes variações

de sal. Este complexo (PLL-partículas de DNA) tem como resultado a não

degradação do DNA, sendo também muito menores do que os lipoplexos. Em

geral, os PLL e os complexos PLL-DNA são utilizados para apresentarem uma

imunogenecidade reduzida (Robbins & Ghivizzani, 1998; Su et al., 2008).

de 38

De todos os polímeros catiónicos, PEI tem sido o mais comummente

utilizado para a entrega de genes. Este tem a capacidade de condensar o DNA

com uma actividade intrínseca endossomática. Complexos PEI-DNA

condensados são mais homogéneos, bem como de menor diâmetro,

comparativamente às lipospermina (lípidos catiónicos). A característica mais

proeminente do PEI é a sua densidade de carga catiónica ser extremamente

elevada. Uma vez que todo o terceiro átomo da molécula de PEI é um átomo

de azoto que pode ser protonado no pH endossomal, PEI tem a capacidade de

capturar protões que são bombeados para endolisossomas, agindo assim

como uma esponja de protões (Su et al., 2008). Este efeito é provavelmente

seguido de um fluxo passivo de cloro para dentro dos endossomas, levando a

um inchaço osmótico e à ruptura dos endossomas, permitindo assim a fuga dos

complexos PEI-DNA da endocitose. No entanto, este polímero é altamente

citotóxico. Alguns factores que influenciam a sua citotoxicidade são o peso

molecular, o tempo de incubação, a concentração dos catiões e a densidade de

grupos catiónicos. Embora os efeitos tóxicos do PEI nas células possa ser

reduzida pela conjugação com outros polímeros, tais como PEG53, essa

conjugação não é suficiente para resolver completamente o problema da

citotoxicidade (Su et al., 2008).

Vectores não virais são muito mais seguros para usar, mas menos

eficazes do que os vectores virais actuais. Assim, existe um grande interesse

no desenvolvimento desses veículos de modo a que a entrega dos genes seja

muito mais eficiente.

Aplicações e doenças

A terapia génica é tida como um possível tratamento definitivo, para

uma variedade de doenças que têm origem genética. Foram

realizados ensaios clínicos de terapia génica para doenças não malignas,

doenças causadas por um único gene, distúrbios multi-factoriais e doenças

infecciosas, dos quais se encontraram evidências de que a

terapia génica pode beneficiar pacientes que tenham doenças graves, como

de 38

imunodeficiência combinada severa, fibrose cística, doença arterial coronária,

doença arterial periférica ou hemofilia (Ratko et al., 2003).

O principal objectivo da terapia génica é uma transferência com sucesso

de material genético para tecidos celulares específicos. Dependendo

do objectivo, o sistema de entrega de genes varia de acordo com a

necessidade. Por exemplo, no tratamento de doenças relacionadas

com uma disfunção genética é necessária uma expressão prolongada

e sustentada, como na hipercolesterolemia, enquanto que um curto período de

expressão do gene é suficiente para a maioria das estratégias na terapia

génica do cancro. (El-Aneed, 2004; Lax, et al., 2001; Majhen & Ristov, 2006).

O cancro é uma das principais causas de mortalidade no mundo. Além

dos métodos clássicos como estratégias de tratamento (quimioterapia e

radioterapia) contra o cancro, são necessários novos métodos e é na terapia

génica que pode estar a solução. Embora originalmente tenha sido concebida

para o tratamento de doenças monogénicas, a terapia génica, surge

como potencial terapia contra o cancro (Majhen & Ristov, 2006).

Devido à natureza complexa do cancro, já foram utilizados muitos genes

terapêuticos para eliminar as lesões cancerosas. O desenvolvimento das

células cancerosas está associado a múltiplas alterações ao nível do

genoma. Os oncogenes e genes supressores tumorais desempenham um

papel crucial no desenvolvimento do cancro. Os genes supressores tumorais

induzem a apoptose (morte celular programada), enquanto os

oncogenes aumentam a proliferação celular. Portanto, estes dois tipos podem

ser eficazmente utilizados no tratamento do cancro (El-Aneed, 2004).

O desenvolvimento de muitos cancros é acompanhado por mudanças na

expressão de genes supressores tumorais ou oncogenes. As mutações nos

genes supressores tumorais (como o p53 ou o BRCA1) e a super expressão de

oncogenes (como o ErbB2), são as mudanças frequentes nos tumores,

podendo ser usadas como base para a terapia do gene do cancro (Ahn et al.,

2002). Em quase 12% dos testes clínicos da terapia génica do cancro os genes

de interesse introduzidos nas células-alvo são genes supressores de tumores

(Majhen & Ristov, 2006).

O recurso à terapia genética para o tratamento do cancro depende da

existência de um vector que seja responsável pelo encapsulamento e

de 38

protecção dos materiais genéticos da degradação endossomal e deve ainda

ser especificamente direccionado para o local do tumor. Ambos os vectores,

virais e não virais já foram desenvolvidos e avaliados para a inserção de genes

terapêuticos, com o objectivo de eliminar as células cancerosas (El-Aneed,

2004). Um dos vectores utilizados para a terapia genética do cancro é o

adenovírus (Ad), tendo este vindo a ser utilizado para restringir a

expressão dos genes mutantes nos tecidos tumorais (Majhen & Ristov, 2006).

A maioria dos cientistas concorda que é melhor destruir o cancro do

que corrigi-lo geneticamente. Assim, o objectivo final de muitos genes usados

na terapia genética do cancro é o de destruir as células-alvo. As estratégias da

terapia génica no cancro desenvolvidas até agora podem ser

divididas em cinco categorias: a mutação de compensação , a quimioterapia

molecular, a imunopotenciação genética, agentes oncolíticos, e a inibição da

angiogénese (Casado et al., 2001; Nieto et al., 2000).

Embora a terapia génica no tratamento do cancro, demonstre ser

promissora, ainda existem obstáculos a superar. Um dos campos onde o

progresso é necessário, sem dúvida, é no redireccionamento, a fim de criar

vectores mais eficientes e específicos para a transferência de genes. Tendo

em conta o efeito sinergético que muitas abordagens de terapia genética

relativamente ao cancro têm demonstrado com tratamentos já existentes,

como quimioterapia ou radioterapia, o ideal será a combinação

com um ou ambos os tratamentos.

Um novo marco na história da terapia génica foi criado na China,

em 2003, quando a "Genedicine" se tornou o primeiro produto do mundo na

terapia génica aprovado por uma agência governamental (Majhen & Ristov,

2006). A maioria dos estudos pré-clínicos de terapia génica para a retina usa

adenovírus associados (AAV) como vector de transferência de genes. No

entanto, os AAV têm várias limitações, incluindo a capacidade de gerar

resposta inflamatória inata, a capacidade de provocar a mutagénese

insercional em até 56% de alguns tecidos e uma capacidade limitada de

clonagem de 4,8Kb. Além disso, o AAV é conhecido por gerar resposta

imunitária em humanos. No entanto, uma classe de adenovírus referidos como

adenovírus auxiliares dependentes (HD-Ad) têm sido estudados e os

resultados mostram que estes têm a capacidade de expressar transgenes em

de 38

tecidos oculares por mais de um ano. Os vectores Hd-Ad possuem

propriedades que garantem a sua inclusão no gene da retina sendo

importantes para o tratamento de doenças degenerativas desta (Singh, 2008).

A terapia génica para a córnea pode potencialmente corrigir doenças

hereditárias que ocorrem na córnea. Os factores que facilitam a entrega dos

genes na córnea são a acessibilidade, a transparência da córnea e a

sua estabilidade ex vivo (Klausner et al., 2007). Existem estudos relativos

à inserção de genes que caracterizam a relação entre os

modos de administração intra-ocular e a localização da expressão do gene. O

desafio de conseguir a transferência de genes, através do fluxo lacrimal, com a

penetração do vector através das junções apertadas do epitélio, keva a que

sela necessário, inevitavelmente, a administração invasiva da

câmara anterior e do estroma corneano. As oportunidades no campo da terapia

génica para a córnea estão em expansão, incluindo uma variedade de doenças

da córnea que estão a ser investigadas, a implementação de vectores mais

recentes, com imunogenicidade reduzida e maior tempo de expressão do gene

(Klausner et al., 2007).

A terapia génica no sistema cardiovascular tem sido proposta para uma

variedade de doenças que vão desde a prevenção da insuficiência venosa de

enxertos à hipertensão. Esta diversidade exige o desenvolvimento de vectores

para a entrega de genes terapêuticos para diversos tipos celulares in

vivo com diferentes intervalos de tempo. Apesar de já existirem vários testes

pré-clínicos, o progresso para várias doenças nesta área é limitada

pela falta de vector para a entrega correcta e eficiente dos genes terapêuticos.

Em geral, os vectores disponíveis, incluindo os virais e os não virais, têm uma

maior propensão para a transferência de genes para o tecido não vascular do

que para as células vasculares, limitando a sua aplicação em doenças

cardiovasculares. Este problema levou ao desenvolvimento e teste de

vectores melhorados na capacidade de entrega dos genes nas

células cardiovasculares. Os vectores tradicionais virais e não virais vão

sendo manipulados e melhorados no sentido de aumentar a sua eficiência na

transferência dos genes que transportam para as células cardiovasculares e

não para outras células que não são o alvo. Prevê-se que o uso desta

de 38

tecnologia, futuramente, aumente substancialmente a eficácia da terapia génica

cardiovascular (Baker, 2004; Manninen & Yang, 2005).

Têm surgido vários estudos que demonstram o possível potencial da

terapia genica no tratamento de doenças na coluna vertebral, especialmente na

degeneração dos discos intervertebrais (DIV). O sucesso da transferência de

genes terapêuticos para as células alvo, que se encontram nos discos

intervertebrais, já foi testada em animais e a principal dificuldade para o

sucesso é tal como em muitas outras doenças, a especificidade dos vectores

(Hall & Kang 2000).

Nos últimos anos, muitas modificações têm sido desenvolvidas nos

vectores de transporte, assim como muitos outros têm surgido de modo a

optimizar a eficiência do transporte e inserção dos genes. É de

esperar que esta área de investigação em ciências da saúde cresça e se

intensifique num futuro próximo, trazendo possíveis resultados terapêuticos

revolucionários, visto que existe um enorme potencial de mercado estimado

em biliões de dólares só nos EUA (El-Aneed, 2004).

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terapia génica em vectores

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