TEMA 11

Cultivo de microorganismosanaerobios

Tema 11. Cultivo de microorganismos anaerobios

1. Microorganismos anaerobios1.1. Anaerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes1.2. Importancia de la microbiota anaerobia1.3. Enfermedades producidas por microorganismos anaerobios

2. Tipos de muestras que pueden contener microorganismos anaerobios2.1. Muestras no adecuadas para el cultivo de anaerobios

3. Recolección de muestras para recuperación de anaerobios3.1. Con aguja y jeringa3.2. Con hisopo

4. Transporte de las muestras al laboratorio5. Examen macroscópico y microscópico de las muestras6. Pruebas previas al cultivo7. Medios de cultivo para anaerobios8. Incubación de microorganismos anaerobios

8.1. Bolsas8.2. Contenedores8.3. Jarras8.4. Estufas

• Estrictos (2): crecen en atmósferas con una tensión de oxígeno inferior al 0,5%. Mueren en presencia de cantidades mayores.

• Aerotolerantes (5): pueden sobrevivir en presencia de oxígeno (hasta un 8%), pero son incapaces de utilizarlo para su metabolismo.

─ La tolerancia viene determinada por la presencia de enzimas: superoxido dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa que catalizan la conversión de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno, menos tóxico, y a oxígeno molecular.

1. Microorganismos anaerobios

1.1. Anaerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes

Anaerobios: no utilizan oxígeno en su metabolismo (el aceptor final de electroneses un compuesto diferente al oxígeno).

• Piel: Clostridium, Propionibacterium, Peptostreptococcus.

• Ojos: Propionibacterium, Clostridium.

• Nasofaringe: Peptostreptococcus,Veillonella, Propionibacterium, Prevotella,

Clostridium, Actinomyces, Eubacterium, Bacteroides, Fusobacterium.

− Boca (3-10:1).

− Surcos gingivales (100-1.000:1).

• Intestino delgado: Peptostreptococcus. Peptococcus, Lactobacillus (1:1).

• Intestino grueso: Prevotella, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Peptococcus,

Lactobacillus (100-1.000:1).

• Uretra: Bacteroides, Peptostreptococcus, Peptococcus, Lactobacillus,

Clostridium, Prevotella, Fusobacterium, Veillonella.

• Vagina: Bacteroides, Propionibacterium, Peptostreptococcus, Peptococcus,

Lactobacillus, Clostridium, Prevotella, Fusobacterium, Veillonella (5-10:1).

1.2. Importancia de la microbiota anaerobia

Abcesos en cualquier órgano

Infección periodontal

Otitis media

Sinusitis

Endocarditis, bacteriemia y septicemia

Empiema torácico

Apendicitis, peritonitis

Endometritis y salpingitis, absceso ovárico

Osteomielitis

Artritis séptica

Tétanos, gangrena gaseosa

Mionecrosis clostrídica

1.3. Enfermedades producidas por microorganismos anaerobios

• Orina– Punción suprapúbica

• Heces• Sangre, LCR y otros líquidos

orgánicos• Tracto respiratorio inferior

– Aspiración traslaríngea– Toracocentesis– Broncoscopia

• Oído– Timpanocentesis

• Cavidad oral y dientes• Aparato genital

– Masculino– Femenino

Hisopado de endocérvixBartolinitis

• Pus, exudados y quemaduras• Muestras de cirugía

2. Tipos de muestras que pueden contener microorganismos anaerobios

• Orina de chorro medio

• Esputo expectorado

• Heces (sólo para investigar Clostridium difficile), ni hisopados rectales

• Hisopado faríngeo y nasofaríngeo

• Hisopado de encías

• Hisopado vaginal

• Superficie de úlceras

2.1. Muestras no adecuadas para el cultivo de anaerobios

• Muestra de orina porpunción suprapúbica

• Muestra de orina de catéter

• Sangre

• LCR

• Otros líquidos orgánicos

• Abscesos, flemones, focospiogénicos

3. Recolección de muestras para recuperación de anaerobios

3.1. Con aguja y jeringa

3.1. Con aguja y jeringa

Hisopado de endocérvix

Hisopado de heridas, abscesos

3.2. Con hisopo

4. Transporte de las muestras al laboratorio

Sistema Scottde doble tubo

SistemaPort-A-Cult

4. Transporte de las muestras al laboratorio

SistemaVacutainer

SistemaCulturette

Examen macroscópico

• Olor fétido.• Aspecto purulento.• Tejido necrótico.• Presencia de gas.

5. Examen macroscópico y microscópico de las muestras

Examen microscópico

• Tinción de gram: muchas infecciones anaerobias pueden ser polimicrobianas.

• Tinción y observación de esporas (puede indicar Clostridium).

• Observación de ramificaciones en los extremos de las células o filamentos (puede indicar Actynomices).

• Observación células fusiformes (puede indicar Fusobacterium).

• Cromatografía de gases

6. Pruebas previas al cultivo

Agar sangre para anaerobios con L-cistina, hemina y vitamina K

• Medio no selectivo de uso general.

Agar chocolate

• Utilizado principalmente para aislarespecies de Neisseria y Haemophilus; sinembargo, se puede requerir también parael aislamiento de anaerobios exigentes.

Agar alcohol fenil etílico con sangre

• Aislamiento de anaerobios obligados Gram positivos.

7. Medios de cultivo para anaerobios

Agar Columbia con colistina y ácido nalidíxico (CNA)

• Aislamiento de anaerobios obligados Gram positivos.

Agar KVLB (kanamicina, vancomicina, sangre lacada)

• Aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos anaerobios

Caldo tioglicolato (enriquecido con L-cistina, hemina y vitamina K)

Caldo de carne picada

• Caldos de enriquecimiento que se pueden usar como suplemento de medios sólidos particularmente si la muestra escasa (se pueden añadir unas gotas de parafina líquida para mantener mejor la atmósfera anaerobia). Subcultivar en medio para anaerobios.

7. Medios de cultivo para anaerobios

8. Incubación de microorganismos anaerobios

Preincubación de los medios en anaerobiosis

8.1. Bolsas

8.2. Contenedores

8.3. Jarras

8.3. Jarras

8.4. Estufas