tecnologia em sistemas biomédicos - fatecsorocaba.edu.br · plantas, como recursos importantes na...
TRANSCRIPT
FACULDADE DE TECNOLOGIA ”JOSÉ CRESPO GONZALES”
Tecnologia em Sistemas Biomédicos
LUCAS FERNANDES RÊGO DA SILVA
POTENCIAIS EFEITOS GENOTÓXICOS DE EXTRATOS DE PLANTAS
MEDICINAIS UTILIZADAS EM FITOTERAPIA
Sorocaba
FEVEREIRO/2018
LUCAS FERNANDES RÊGO DA SILVA
POTENCIAIS EFEITOS GENOTÓXICOS DE EXTRATOS DE PLANTAS
MEDICINAIS UTILIZADAS EM FITOTERAPIA
RELATÓRIO FINAL DOPROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTIFICA DA
FACULDADE DE TECNOLOGIA (FATEC)
Orientadora: Profª. Drª. Silvia Pierre Irazusta
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba – FATEC-SO
Sorocaba
FEVEREIRO/2018
RESUMO
Uma das práticas médicas mais antigas é a utilização de plantas, estas são muito importantes
na cura e tratamento de pacientes, sendo que muitas vezes estas plantas são utilizadas como
único recurso terapêutico e de cuidados básicos de saúde, em países em desenvolvimento.
O interesse pelas plantas medicinais vem aumentando tanto pela população quanto pelos
profissionais da área médica para adquirir conhecimento sobre os efeitos que essas plantas
possuem, tanto benéficos como maléficos. O ensaio do cometa realizado no presente
trabalho permite avaliar os potenciais efeitos genotóxicos sofridos por células de melanoma
murino (B16F10) e carcinoma de pulmão (3LL), após a aplicação de extratos aquosos de
janaúba e avelóz em diferentes concentrações de 25%, 50% e 100% em diferentes intervalos
de tempo sendo 22 e 48 horas para as células B16F10 e 48 e 72 horas para as células 3LL,
com a finalidade de fornecer subsídios para a utilização segura de extratos vegetais com
aplicações medicinais. Os resultados obtidos mostraram que os extratos foram genotóxicos
para as células B16F10, apresentando consistente redução de células quando comparadas
ao controle, enquanto as células 3LL apresentaram resultados pouco conclusivos.
Palavras-chave: genotoxicidade, janaúba, avelóz, cometa.
ABSTRACT
One of the oldest medical practices is the use of plants, these are very important in curing
and treating patients, and these plants are often used as the only therapeutic and basic health
care resource in developing countries. The interest in medicinal plants has been increasing
both by the population and by medical professionals, for example, knowledge about the
effects of these plants, both beneficial and harmful. The comet assay performed in the
present study allows to evaluate the potential genotoxic effects of murine melanoma
(B16F10) and breast carcinoma (3LL) cells after application of aqueous extracts of janaúba
and hazelnuts at different concentrations of 25%, 50% and 100% at different time intervals,
being 24, 48 and 72 hours, in order to provide subsidies for the safe use of plant extracts
with medicinal applications.The results showed that the extracts were genotoxic for the
B16F10 cells, presenting a consistent reduction of cells when compared to the control,
whereas 3LL cells presented little conclusive results.
Keywords: genotoxicity, Janaúba, avelóz, rehearsal comet.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Faculdade de Tecnologia de Sorocaba. .............................. Error! Bookmark not defined.
Figura 2: Campus da Fatec Sorocaba ................................................. Error! Bookmark not defined.
Figura 3: Laboratório de Ecotoxicologia ........................................... Error! Bookmark not defined.
Figura 4: Foto dos galhos da Euphorbia tirucalli ............................................................................ 12
Figura 5: Imagem da planta da janaúba .......................................................................................... 14
Figura 6: Células de melanoma crescendo dispostas em uma monocamada .................................. 23
Figura 7: Esquema de contagem celular na câmara de Neubawer .................................................. 25
Figura 8:Disposição dos extratos aquosos de 24 e 48 horas. .......................................................... 27
Figura 9:Disposição dos extratos para 48 e 72 horas ...................................................................... 28
Figura 10: Lâminas em solução de lise. .......................................................................................... 31
Figura 11: Cuba de eletroforese preparada. .................................................................................... 32
Figura 12: Gabarito do ensaio do cometa ....................................................................................... 35
Figura 13: Células B16F10 expostas aos extratos aquosos de janaúba por 24 horas. As numerações
representam os respectivos níveis de dano celular .......................................................................... 36
Figura 14: Cometas das células expostas B16F10 a extrato de janaúba por 48 horas. A esquerda
mostra os cometas no aumento de 40x, a direita cometas evidenciados com aumento de 100x.(A)
Nas células expostas a 100% pode-se perceber a presença de cometas de grau 4 destacado com os
círculo, já na concentração de 50%(B) é possível visualizar um cometa de grau 3 dentro do circulo,
na concentração de 25%(C) destacado alguns cometas de grau 2. (D) controle. ............................ 38
Figura 15:Cometa das células B16F10 expostas a extratos de janaúba por 24 horas. A esquerda
mostra os cometas no aumento de 40x, já a direita mostra os cometas evidenciados com aumento de
100x. Na concentração de 100% (A) presença de cometas de nível 3. Na concentração de 50% (B)
observa-se a presença também de cometas de grau 3 com alguns de nível 4 evidenciado pelo círculo.
Na concentração de 25% presença modesta de cometas de nível 3. A letra D demonstra o controle.
......................................................................................................................................................... 39
Figura 16: Gráficos da contagem dos cometas das lâminas de janaúba cada concentração está
dividida de 0 a 4. ............................................................................................................................. 40
Figura 17: Células 3LL expostas a Janaúba por 72 horas(cometas). A esquerda aumento de 40x e a
direita aumento de 100x. Na concentração de 100% (A) pode-se visualizar alguns dos cometas de
nível 3. Na concentração de 50 % (B) cometas de nível 3 em azul e vermelho nível 2. As
concentrações de 25% (C) apresentam predominância de cometas de nível2. Na letra D observa-se
o controle. ....................................................................................................................................... 42
Figura 18: Células 3LL expostas ao extrato de janaúba por 48 horas(cometas). A esquerda campo
com aumento de 40x e a direita aumento de 100x. Na concentração de 100(A) a direita pode-se notar
uma região com predominância de cometas nível 3. Na concentração de 50%(B) cometas de nível
3 em azul e nível 2 vermelho. No aumento de 100x da concentração de 25% é possível notar um
campo com cometas de nível 4. A letra D evidencia os controles. ................................................. 43
Figura 19: Gráfico contendo os dados das contagens dos níveis de dano das células 3LL expostas a
janaúba ............................................................................................................................................ 44
Figura 20: Células B16f10 expostas a extratos de avelóz por 48 horas (cometas). A esquerda mostra
os cometas no aumento de de 40x, já a direita mostra os cometas evidenciados no aumento de 100x.
Na lâmina de 100%(A) nota-se a presença discreta de cometa de grau 2 destacado pelo círculo. Na
concentração de 50%(B) nota-se dentro do círculo também presença de cometas de nível 2, na
imagem da direita pode notar alguns cometas de nível 3 presentes em outra parte da lâmina, por fim
na lâmina que recebeu os extratos a 25% grande presença de cometas de nível 1 também
evidenciados pelos círculos. D controle do experimento. ............................................................... 46
Figura 21: Cometas das Células B16F10 expostas a extratos de avelóz por 24 horas. A esquerda
mostra os cometas no aumento de 40x já a direita mostra os cometas evidenciados no aumento de
100x. Na lâmina de 100%(A) ocorre quase prevalência de cometas de nível 4. Na lâmina de 50%(B)
pode-se notar cometas de nível 3. Na lâmina contendo as células expostas as concentrações de
25%(C) pode-se também notar a presença de alguns cometas de nível 4 destacados pelos círculos.
(D) Controle. ................................................................................................................................... 47
Figura 22: Gráficos das contagens das células B16F10 expostas aos extratos de avelóz. ............. 48
Figura 23 Cometas das células 3LL expostas aos extratos aquosos de avelóz por 72 horas, em suas
respectivas concentrações. A esquerda aumento de 40x e a direita aumento de 100x. Os círculos
vermelhos representam cometas de nível 2, azul 3 e verde 4. D representa o controle. ................. 51
Figura 24: Cometas das células 3LL expostas a extratos aquosos de avelóz por 48 horas. A esquerda
aumento de 40x e a direita aumento de 100x. Pode-se notar na concentração de 100% predomínio
de cometas de nível 0 e cometa de nível 1 destacado pelo círculo branco. Na concentração de 50%
predomínio de cometas de nível 0 e na concentração de 25% cometas de nível 4. ........................ 52
Figura 25: Gráficos com as contagens das células 3LL expostas aos extratos de avelóz. .............. 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Estudo envolvendo avelóz...............................................................................58.
Tabelça 2 – Resultados do presente trabalho ................................................................65.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ONA- Organização das Nações Unidas.
DNA(ADN) – Ácido desoxirribonucleico.
PBS- Phosphate Buffered Saline(Tampão Fosfato Salina).
APFN –Ágar Ponto de Fusão Normal.
ABPF - Ágar Baixo Ponto de Fusão.
MTT - (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)
SUMÁRIO
1.1. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 10
1.2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 10
1.2.1. GERAL .................................................................................................................. 10
1.2.2. ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 10
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................... 11
2.1. PLANTAS MEDICINAIS ............................................................................................ 11
2.1.1. AVELÓZ ................................................................................................................ 12
2.1.2. JANAÚBA .............................................................................................................. 13
2.2. GENOTOXICIDADE ................................................................................................... 15
2.3. CULTURA CELULAR ................................................................................................ 16
2.4. ENSAIO DO COMETA ............................................................................................... 20
3. METODOLOGIA ................................................................................................................... 22
3.1. MATERIAIS CULTURA CELULAR ........................................................................ 22
3.1.1. Células B16F10 e 3LL Cultura celular ................................................................ 22
3.1.2. SOLUÇÕES ........................................................................................................... 22
3.2. METODOLOGIA CULTURA CELULAR ................................................................ 22
3.2.1. PROPAGAÇÃO CELULAR/ PASSAGEM ....................................................... 23
3.2.2. PLAQUEAMETO ................................................................................................. 24
3.2.3. APLICAÇÃO DOS EXTRATOS AQUOSOS .................................................... 26
3.3. MATERIAIS ENSAIO DO COMETA ....................................................................... 29
3.3.1. SOLUÇÕES ........................................................................................................... 29
3.4. METODOLOGIA ENSAIO DO COMETA ............................................................... 29
3.4.1. PREPARAÇÃO DA LÂMINA NO PRIMEIRO DIA ........................................... 29
3.4.2. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS NO SEGUNDO DIA ........................................ 30
3.4.3. LISE............................................................................................................................ 30
3.4.4. ELETROFORESE .................................................................................................... 31
3.4.5. COLORAÇÃO .......................................................................................................... 33
3.4.6. ANÁLISE DAS LÂMINAS ...................................................................................... 33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 34
5. CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 57
REFERÊNCIAS .............................................................................................................................. 58
OUTRAS ATIVIDADES ............................................................................................................... 72
10
1.1.JUSTIFICATIVA
As culturas celulares fornecem modelos biológicos simplificados que podem ser
utilizados para avaliar efeitos maléficos ou benéficos a partir da exposição à algum
agente. No presente trabalho será avaliado o potencial efeito genotóxico de extratos
aquosos de avelóz e janaúba, considerados importantes aliados no tratamento de
diversas doenças. A metodologia de cultura celular vem sendo amplamente aplicada nas
linhas de pesquisa da faculdade de Tecnologia de Sorocaba. O ensaio do cometa é
realizado no laboratório de Ecotoxicologia e este, permite a avaliação da genotoxicidade
de agentes diversos às células, pela observação dos padrões de corrida, frente à
aplicação de um campo elétrico. Deste modo, espera-se contribuir para o entendimento
das ações e a segurança na utilização destes extratos.
1.2.OBJETIVOS
1.2.1. GERAL
O presente trabalho tem por objetivo avaliar os possíveis efeitos genotóxicos dos
extratos aquosos de Avelóz e Janaúba em células tumorais em cultura.
1.2.2. ESPECÍFICOS
A partir de ensaios padronizados, pretendeu-se fornecer subsídios para a utilização
segura de extratos vegetais com aplicações medicinais.
Utilizar o ensaio do Cometa como ferramenta para avaliação de genotoxicidade de
extratos vegetais aplicados em cultura de células tumorais B16F10 E 3LL, sendo estas
culturas de células respectivamente de melanoma murino e carcinoma de pulmão.
11
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1.PLANTAS MEDICINAIS
Uma das práticas médicas mais antigas presentes na humanidade é a utilização de
plantas, como recursos importantes na cura e tratamento de doenças (VEIGA et al., 2004).
Muitas vezes as plantas são utilizadas como única alternativa terapêutica e de cuidados
básicos de saúde em países em desenvolvimento e, segundo a ONU, representa um
contingente que é de 70-95% da população desses países (MACIEL et al., 2002; VEIGA
et al.,2004).
Atualmente as plantas medicinais são comercializadas nas farmácias e nas lojas de
produtos naturais e a sua utilização caracteriza a fitoterapia. Sua produção pode também
ser artesanal sendo preparado de maneira empírica com base em conhecimentos
populares (VEIGA et al., 2004). A fitoterapia é uma forma de tratamento medicinal, que
se utiliza de vegetais sendo aplicados de maneira externa ou interna, na forma in natura
ou como medicamentos. (TEIXEIRA et. al 2008).
As plantas medicinais segundo Lopes et al. (2005), são todas as plantas que quando
administrada ao homem, por qualquer via ou forma, exercem alguma ação terapêutica.
Para que a planta exerça tal ação, é necessário que está possua princípios ativos que são
oriundos do seu metabolismo. Estes princípios estão mais concentrados nas flores, folhas
e raízes e em geral em menor quantidade na sementes, frutos e cascas. Os princípios
podem ser isolados para obter diferentes ações dos quais apresentam as plantas quando
usadas de maneira natural, junto com os demais compostos químicos e biológicos
(CARVALHO, 2011).
As pesquisas cientificas com emprego de plantas se iniciaram com intuito de
classificar a identidade botânica, composição química, e ação farmacológica das drogas
e vegetais, separando-as conforme suas semelhanças em relação aos efeitos. A utilização
de princípios científicos na medicina natural possibilitou a descoberta de produtos
terapêuticos, proporcionando um aumento na sobrevida das pessoas. Essas pesquisas
permitiram a descoberta de estruturas químicas envolvidas, além das modificações
12
estruturais e reprodução de estruturas quimicamente ativas (FERREIRA, 2010).O
emprego das plantas medicinais como via alternativa para cura de canceres já vem sendo
estudadas, e foram comprovadas por alguns trabalhos experimentais comprovando sua
ação antineoplasica (OLIVEIRA et al., 2014), por outro lado algumas plantas podem
possuir efeito reversos a este, produzindo resultados genotoxicos e consequentemente um
câncer (NEODINI, 2015). O interesse pelo uso das plantas medicinais vem aumentado
tanto pela população, quanto por profissionais da área médica devido a diversos fatores,
entre eles o alto grau de efeitos adversos gerados pelo uso das drogas sintéticas.
(BEZERRA, et al.,2013).
2.1.1. AVELÓZ
O avelóz (Euphorbia tirucalli Linneau) (Figura 4) é uma planta muito bem
climatizada na região nordeste do Brasil, de origem africana, que também está presente
em diversos países tropicais. Pertence à família Euphobiceae que possuí
aproximadamente 300 gêneros e cerca de 7500 espécies. Tem cerca de 2 a 6 metros de
altura, possui um arbusto com poucas folhas e é amplamente conhecida pelo seu látex
tóxico que pode ser perigoso (MACHADO, 2007; GONSALVES et al,2011;). O látex é
cáustico, e pode causar lesões à pele e em contato com os olhos, pode levar a cegueira
devido a destruição da córnea. Pode ainda causar inúmeras lesões tais como edema,
queimação e coceira em determinadas regiões do corpo. Pelo fato de ser muito cáustico
deve ser diluído, pois o uso ou aplicação do mesmo puro pode vir a causar hemorragias
(BRASIL, 2003).
Figura 1: Foto dos galhos da Euphorbia tirucalli
Fonte: mundohusqvarna.com.br
13
Apesar deste fato, esta planta vem sendo usada no tratamento de diversas doenças
proliferativas, que vão desde o câncer até doenças como a AIDS, sífilis, asma entre outras.
Segundo relatos, a espécie pode apresentar propriedades curativas para carcinomas e
epiteliomas benignos, além de possuir inúmeras outras utilidades como atuar como
antimicrobiano e ceratolítico em verrugas, quando aplicado topicamente (GALVÃO et
al., 2002; GONSALVES, 2011; ALVES et al., 2012).
2.1.2. JANAÚBA
As espécies de Himatanthus são árvores pertencentes a família Apocynaceae
(FRANÇA et al.,2011) que estão distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do planeta
dividida em cinco subfamílias com cerca de 3700 espécies (LIMA, 2005). Muitas dessas
espécies apresentam como características químicas glicosídeos cardioativos e cianogênicos,
saponinas, taninos, cumarinas, ácidos fenólicos, ciclitóis e triterpenóides (JOLY, 2002).
A família Apocynaceae possui oito espécies presentes na América do Sul e uma no
Panamá. No Brasil o gênero Himatanthus se ditribui em todo território nacional, exceto na
região Sul.
As Himatanthus são árvores que tem como características ramos lenhosos e de
crescimento semipoidal, possuindo um único ou mais ramos laterais que crescem
distalmente, os quais são reorientados para vertical para se tornar uma nova unidade de
tronco (LINHARES, 2011). A Himatanthus drasticus (Figura 5) possui folhas pecioladas,
glabras, carnosas normalmente muito grandes com grandes flores brancas e frutos que
possuem sementes que se disseminam através do vento (PLUMEL, 1991). É uma árvore
que está distribuída em regiões neotropicais sendo nativa das regiões da Guianas até a
Bahia, sendo mais incidente na floresta dos Araripe na região do Ceará com ocorrência
também no estado de Minas Gerais (PLUMEL , 1991; LINHARES, 2011).
Segundo Gonçalves (2005), seu látex é tóxico, podendo muitas vezes apresentar
reações nocivas no organismo quando ingerido em grandes doses. No Nordeste do Brasil
a utilização do látex diluído é muito comum sendo este utilizado como medicamento
14
principalmente no que se remete a doenças relacionadas com o fígado. Sua diluição é
conhecida como “Leite de Janaúba" sendo comercializado para dar suporte a renda
familiar para algumas comunidades rurais (LINHARES, 2010).
Figura 2: Imagem da planta da janaúba
Fonte:meucantinhoverde.com
Existem diversos usos registrados para essas plantas nos quais o emprego do seu
látex e casca variam desde o tratamento do câncer até o tratamento por via oral contra
vermes intestinais, febre, infertilidade feminina, úlcera gástrica e câncer e, por meio de
compressas locais, nos casos de luxação de qualquer articulação, machucados e herpes
(MATOS, 2008).
15
2.2. GENOTOXICIDADE
A genotoxicidade faz uma interface entre a toxicologia e a genética, sendo também
conhecida como toxicologia genética (SILVA et al. 2003, SILVA et al., 2007; SAMPAIO
2012). O termo genotóxico é uma expressão generalizada para expressar diferentes efeitos
letais e hereditários no material genético a nível nuclear ou externo ao núcleo celular
(WEISBURGER & WILLIAMS, 2000).
A genotoxicidade é um efeito que pode ocorrer tanto em células somáticas como
germinativas e pode ser expressa por vários tipos de danos ao DNA (aductos ao DNA, sítios
lábeis a alcális, quebras de fitas) e mutações variando de alterações cromossômicas
estruturais ou numéricas (aneoploidia e poliploidia). Esses danos podem ser causados por
agentes genotóxicos, isto é, agentes que possuem a capacidade de alterar a replicação do
DNA e a transmissão genética (SILVA et al., 2007). A permanência do dano celular
dependerá do balanço entre a eficiência dos sistemas de proteção e reparo celular (defesas
antioxidantes, reparo de base/nucleotídeo, reparo de quebra de fita dupla) e os processos
que levam à morte celular (apoptose e necrose). (KIRSCH-VOLDERS et. al, 2002;
MATEUCA et al, 2006).
Estudos de genotoxicidade são utilizados para auxiliar na detecção de compostos
que podem causar danos genéticos e potencialmente o câncer. Uma proporção
significativa de agentes químicos cancerígenos foi detectada como causadores de danos
no DNA. Diversas técnicas permitem avaliar atividades genotóxicas, dentre elas pode- se
citar o ensaio do cometa, cuja aplicação em diferentes matrizes biológicas comprovam
que este ensaio é sensível a substâncias que possuem potencial para provocar câncer e
outros tipos de danos ao DNA, não envolvidos necessariamente com o aparecimento de
uma neoplasia (ANDERSON et al., 1998; OLIVE & BANATH, 2006; JOCA 2009).
Existem, no entanto, outras substâncias cancerígenas, tais como hormônios,
alguns metais, agentes físicos inertes e produtos químicos, que podem causar câncer
através de outros mecanismos que não interação com o DNA (GUY, 2005). Essas
substâncias cancerígenas não são normalmente detectadas por meio dos testes de
genotoxicidade. Para tanto, o mais recomendado é a combinação de testes dependendo
das características do agente tóxico, bem como a utilização de vários sistemas biológicos,
16
assim como variados tipos de danos ao DNA (mutações gênicas, aberrações
cromossômicas, etc.) para melhor avaliar a genotoxidade (SILVA et al, 2004).
2.3.CULTURA CELULAR
Durante o século XIX, foram desenvolvidas por Sydney Ringer (SILVA, 2013),
soluções salinas que permitiam a sobrevivência e o atendimento das necessidades vitais
de órgãos, de modo que, estas soluções permitiam que estes órgãos sobrevivessem
isolados do organismo, lançando assim, as bases do que seria a cultura celular. Todavia,
somente em 1885 Wihelm Roux conseguiu manter algumas células de uma porção de
medula de embrião de galinha em uma solução salina aquecida por vários dias (LINDEE,
2007; MIGITA, 2012; SILVA, 2013). Já no século XX, Ross Harrison que é considerado
o pioneiro do uso de culturas celulares, começou a utilizar as primeiras culturas de tecidos
com o intuito de estudar o comportamento de células animais em um ambiente
homeostático e em situações de estresse (ALVES, 2010; SILVA, 2013). Com isto,
Harrinson em 1907 conseguiu o desenvolvimento de tecido nervoso mais especificamente
fibras de nervosas de rã cultivadas em um coágulo de sangue. Nessa época ainda havia
dúvidas sobre a dinâmica do desenvolvimento do tecido nervoso, pois apenas
visualizações microscópicas não davam informações suficientes sobre o processo e
Harrison conseguiu provar que as fibras nervosas são formadas a partir de células
nervosas, o que despertou o interesse de muitos cientistas pelo método de cultura celular,
incorporando-o em suas linhas de pesquisa (ALVES, 2010; AMARAL, 2011; MIGITA,
2013).
No ano de 1912, Alexis Carrel utilizando informações obtidas por Harrison,
desenvolveu um modelo para cultivo de cardiomiócitos de um embrião de galinha.
Descobriu com estes experimentos que era necessário realizar trocas dos nutrientes que
estavam dispostos no frasco. Feito isto, as células sobreviviam por mais tempo, logo
podiam ser cultivadas por um maior período de tempo (AMARAL, 2011).
Em 1951 foram cultivadas células de tecido tumoral humano por George Gey no
hospital John Hopkins em Baltimore nos EUA. Estas células ficaram então conhecidas
17
como linhagem Hela. As células Hela são originadas de um câncer adenocarcinoma
cervical de uma paciente chamada de Henrietta Lacks, cujo nome forma o acrônimo da
linhagem Hela. As células tumorais Hela são uma linhagem de células humanas que
podiam ser cultivadas indefinidamente o que aumentou o interesse pelo seu cultivo
(LUCEY; 2009; ALVES, 2010).
Até metade do século XX acreditava-se que todas as células cultivadas poderiam
se multiplicar indefinidamente, desde que fossem propiciados seus devidos nutrientes,
porém os pesquisadores Leonard Hayflick e Paul Moorhead, no ano de 1961, descobriram
que existia certo limite de divisão celular. Então se denominou cultura primária as células
que eram cultivadas diretamente do animal ou humano, e linhagens continuas as células
que sofreram processo de “imortalização”. As células de linhagens continuas permitiam
a obtenção de resultados mais precisos pois permitem maior reprodutibilidade que as
culturas primárias (HAYFLICK, 1965; MIGITA, 2012).
As culturas celulares primárias são obtidas através da retirada ou desagregação
mecânica ou enzimática de parte de algum tecido, e são utilizadas para estudo in vitro por
apresentarem de maneira mais fiel características genotípicas e fenotípicas do tecido de
origem. Todavia as células das culturas primárias sobrevivem pouco tempo e logo entram
em processo de apoptose. As células que conseguem proliferar a uma taxa maior e se
adaptar de maneira eficiente vão formar as linhagens continuas que ainda possuem
características originais do seu tecido, mas com a diferença de possuírem uma alta taxa
de proliferação. Algumas células podem manter características por até oitenta passagens.
Sabe-se, ainda, que as células que perdem algumas características e sofrem processos de
mutações são chamadas de células transformadas. As células podem sofrer mutações
através da utilização de vírus ou agentes químicos e físicos, como aplicação de algumas
formas de radiação. Estas células podem perder o controle do seu ciclo celular por
mutações em genes como os proto oncogêneses e os genes supressores de tumor (ALVES,
2010). Outra forma de conseguir as células transformadas é através da extração de tecidos
tumorais de indivíduos com algum tipo de neoplasia como é nos casos da célula Hela e
da célula da linhagem de câncer de melanoma murino B16F10 (ALVES, 2010, SILVA,
2013).
18
Hayflick e Moorhead (1960-1961) foram os pioneiros na utilização antibióticos nos
meios de cultura para prevenir contaminações e tal prática permitiu que a técnica fosse
mais ampla e continuamente utilizada. O cultivo celular apresentou então grandes saltos
como o cultivo de células tronco entre outros grandes avanços. Hoje, é possível ter
diversas linhagens celulares com características especificas que são obtidas a partir do
subcultivo sequencial de uma cultura primária que podem ser armazenadas em condições
estabelecidas desde que fornecidos seus substratos e feito alto controle de contaminação,
para que estas sejam utilizadas em pesquisa (HAYFLICK, 1965, MIGITA, 2012;
BARBOSA, 2015).
As culturas celulares formam um modelo biológico simplificado em relação aos
animais usualmente usados nas pesquisas, logo, o cultivo celular se tornou um recurso
valioso tanto na área biomédica com suas aplicações utilizadas em pesquisas cientificas,
como na área da biotecnologia industrial, além do cultivo celular ser uma poderosa
ferramenta usada na bioengenharia de tecidos, permitindo estudos para o
desenvolvimento e manipulação de implantes artificiais de tecidos e células que são
capazes de estimular e substituir a funcionalidade fisiológica de algumas regiões lesadas
(OLIVEIRA et al., 2010; BOROJEVIC, 2008; BARBOSA, 2015). Deste modo, uma das
grandes vantagens do uso desses modelos celulares é a formação de respostas
simplificadas para problemas com alto grau de complexidade de pesquisa biomédica
(MIGITA, 2012; FRESHNEY, 2006)
Segundo ALVES (2010) entre as áreas mais beneficiadas com emprego de culturas
celulares estão a Imunologia, Virologia, Neurobiologia e Farmacologia. Dentro do estudo
dos fármacos a cultura celular permite compreender os mecanismos de toxidade e
neurotoxidade, por meio das características das células alvo e como as mesmas reagem a
determinadas substâncias químicas. As culturas de células de linhagens neoplásicas e não
neoplásicas podem ser utilizadas em estudos pré clínicos para novas formas diagnósticas
de doenças como o câncer. Com isso, pode-se dizer que o cultivo de células in vitro
produz resultados suficientemente informativos, para estudos funcionais, bioquímicos,
farmacológicos e moleculares, os quais permitem o desenvolvimento de produtos
biológicos como anticorpos e vacinas (ALVES, 2010; FRESHNEY, 2005).
19
Uma das culturas celulares mais utilizadas para reproduzir o melanoma murino é a
linhagem celular B16 (MEZZACA, et al, 2001), sendo que algumas sub-linhagens
apresentam um alto poder metástico, além de apresentar a capacidade de serem destruídas
pelo sistema imune do hospedeiro. Esta linhagem celular (B16) foi inicialmente estudada
por Isaias J. Fidler (1973), que conseguiu diversas variantes das células B16, entre elas a
B16F10, obtida no ano de 1973, selecionando células com maior capacidade de
colonização pulmonar a partir de uma outra variante menos metastática (NICOLSON et
al., 1978). Para obtenção da célula da linhagem B16 foi necessária sua extração do
melanoma murino de um camundongo C57BL/6 que apresentava um tumor subcutâneo
primário. Essas células colhidas do então tumor, foram cultivadas em um meio de cultura
formando a primeira linhagem B16F0. Posteriormente as células obtidas da primeira
linhagem foram inoculadas por injeção intravenosa em um camundongo C57BL/6. Este
camundongo apresentou nódulos no pulmão que foram retirados e cultivado em meio de
cultura. Esta linhagem que foi desenvolvida após a primeira inoculação in vivo foi
chamada de B16F1. Novamente, as células foram inoculadas in vivo em um grupo de
animais que apresentou novos nódulos que foram retirados e cultivados formando a
linhagem B16F2. Assim procedeu-se até chegar a linhagem B16F10, que é caracterizada
pela alta agressividade e grande capacidade de gerar metástases pulmonares quando feita
uma inoculação intravenosa. Este modelo celular é muito utilizado para responder
questões básicas sobre o melanoma, sendo e também muito usadas em estudos de
imunoterápicos (SILVA et al, 2013).
Um dos tipos de linhagem celular que reproduz o câncer de pulmão in vitro é o
carcinoma de Lewis (também conhecido como células 3LL ou LLC), este tipo celular
assim como a linhagem B16F10 é oriunda dos camundongos C57BL/6 a partir de um
tumor resultante de uma implantação do carcinoma pulmonar primário de Lewis. O
carcinoma de Lewis foi descoberto em 1951 pela Dra. Margaret R. Lewis do instituto
winstar, sendo que estas linhagem receberam seu nome. Essas células são caracterizadas
por possuirem uma vantagem proliferativa que é conseguida pela expressão gênica que
evita que as células tumorais escapem de condições microambientais hostis.Estas células
podem ser úteis para pesquisa médica, no que se refere a tratamentos para certos tipos de
câncer de pulmão e também muito aplicada em outros estudos de biologia celular
(MAYO, 1972; BERTRAM & JANIK, 1980; SHARMA, et al., 1999)
20
2.4.ENSAIO DO COMETA
O Ensaio do Cometa, é um método de estudo de genotoxicidade sensível, que
avalia danos ao DNA de células individuais eucarióticas (LIAO et al., 2009) e que
possibilita quantificar quebras da fita (BELPAEME et al. 1998). A avaliação dos danos é
possível através da avaliação da quantidade de fragmentos que se afastaram do nucleióde
durante a eletroforese sendo este método também conhecido como eletroforese em gel de
célula única (LIMAN, 2013).
Para o isolamento do nucleiode as células devem ser embebidas em agarose e
depositadas sobre uma lâmina de microscópio para serem lisadas com detergente e alta
concentração de sal formando nucleiodes contendo laços de DNA superenrolados ligados à
matriz nuclear. A eletroforese em alto pH resulta em estruturas semelhantes a cometas, que
podem ser observados por microscopia de fluorescência, quando o corante for brometo de
etídio (LIMAN, 2013) ou em microscópio óptico comum, quando se utiliza a impregnação
pela prata (CERDA et al., 1997). No cometa a cabeça é a região nuclear, e a cauda os
fragmentos de DNA que realizaram migração (HARTMANN et al. 2003, HARTMANN et
al. 2004). A intensidade da cauda do cometa em relação à cabeça reflete o número de
quebras no DNA. A base provável para isso é que, os anéis contendo uma pausa perdem
seu superenrolamento (“supercoilling”) e tornam-se livres para correr em direção ao ânodo.
No método tradicional, a coloração do material é feita com brometo de etídio e
analisada por microscopia de fluorescência, tendo intensidade proporcional à quantidade de
DNA presente. Porém, essa coloração apresenta alguns fatores negativos, como ação
mutagênica do corante, curta durabilidade da coloração e necessidade de equipamentos
específicos para análise das lâminas. Por esses motivos, a coloração por prata vem sendo
utilizada como uma alternativa eficaz para o ensaio, demonstrando alta sensibilidade
quando comparada à coloração por brometo de etídio (REINHARDT- POULIN et al.,
2000), e apresentando algumas vantagens como: a análise é feita em microscópio óptico
comum, o método apresenta baixo custo, a coloração do material mantém-se estável por
período prolongado (KIZILIAN et al., 1999; NADIN et al., 2001) e há confiabilidade para
21
análise da morfologia de cometas associada aos parâmetros de análise visual (GARCÍA et
al., 2004, ANDRADE et al., 2016), possibilitando rápida obtenção de resultados.
O ensaio tem aplicações em testes de novos produtos químicos, para a
genotoxicidade, monitoramento de contaminação ambiental com genotoxinas,
biomonitorização humana e epidemiologia molecular e investigação, ensaios
fundamentais no estudo de danos e reparo do DNA (COLLINS, 2004). Qualquer tipo
celular eucariótica pode ser avaliado, animal ou vegetal, e uma característica importante
do ensaio é a de precisar de apenas pequena quantidade de células.
As pesquisas para quantificar danos de DNA em células individualizadas começaram
em 1978 com Rydberg e Johanson. Estes realizavam suas análises através de um fotômetro
e utilizavam lâminas de agarorose juntamente com as soluções de lise e neutralização, e
realizavam a coloração laranja de acridinina. Mais tarde a técnica do ensaio cometa foi
desenvolvidas principalmente por Östling e Johanson (1984), pela metodologia de
eletroforese do DNA em micro-gel, sob condições neutras; e de Singh e colaboradores
(1988), que lhe atribuíram maior sensibilidade através do uso de soluções alcalinas no
método com pH acima de 13.
Medidas como o comprimento total da “cauda” e a densidade de DNA fornecem dados
indiretos sobre o estado do DNA da amostra (BRIANEZI et al., 2009). Dois princípios têm
sido considerados, os quais determinam o padrão de formação do cometa. O primeiro é a
habilidade de migração dos fragmentos de DNA, que é uma função tanto do tamanho do
DNA quanto do número de fragmentos quebrados que se unirão a fragmentos maiores do
DNA, que podem migrar uma curta distância desde o núcleo. O outro é a extensão de
migração dos fragmentos de DNA, que inicialmente aumenta com o dano, porém, atinge
um máximo, que é definido pelas condições da eletroforese, mas não pelo tamanho dos
fragmentos (FAIRBAIRN et al., 1995).
Comparada com outras técnicas, a do cometa apresenta algumas vantagens, dentre
elas, sensibilidade em apontar baixo nível de danos no DNA, requerimento de baixo
número de células por amostras, flexibilidade, baixo custo, fácil aplicação, habilidade de
conduzir estudos utilizando pequenas porções de substâncias e tempo relativamente curto
para a realização de experimentos (TICE et al., 2000).
22
3. METODOLOGIA
Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Ecotoxicologia em parceria com
o laboratório ImunoCell da Fatec – Sorocaba. Neste trabalho duas metodologias distintas
foram empregadas, uma delas com foco no cultivo celular para obtenção das amostras e
outra, focada na realização do ensaio do Cometa para avaliar as quebras de DNA e
consequentemente, a genotoxicidade que os extratos aquosos causaram nas células
tumorais.
3.1.MATERIAIS CULTURA CELULAR
3.1.1. Células B16F10 e 3LL Cultura celular
3.1.2. SOLUÇÕES
As soluções estão dispostas na tabela de APÊNDICE (A)
3.2.METODOLOGIA CULTURA CELULAR
Para obtenção das células para realização dos ensaios do cometa, foi necessário,
primeiramente, realizar culturas celulares. Logo neste experimento utilizou-se a
metodologia já adotada no laboratório ImunoCell.
Inicialmente, escolheram-se os frascos específicos para desenvolver as culturas de
células que deveriam ser expandidas Neste caso, usaram-se as garrafas de 75 cm². Dentro
destas garrafas foi então, colocado meio de cultura completo com RPMI (Sigma Aldrish-
USA) para que ocorresse o crescimento celular.
23
3.2.1. PROPAGAÇÃO CELULAR/ PASSAGEM
O procedimento de cultura começa com a propagação, fase importante para a
manutenção celular, pois as células devem estar em número ideal para que se perpetuem.
Como as células tumorais crescem por monocamadas (figura 6), quando o número de
células está muito elevado podem ocorrer inibições por contato, acarretando na morte das
mesmas, devido a impossibilidade do seu crescimento, sendo necessário então, realizar o
processo de passagem. Segundo ALVES (2017), o número de passagens se refere a
quantidade de vezes que a cultura foi subcultivada.
Figura 3: Células de melanoma crescendo dispostas em uma monocamada
Fonte:Autor
Antes de começar a replicação deve ser realizada lavagem sistemática das mãos
utilizando sabonete antibacteriano, seguido da aplicação de álcool e a paramentação com
luvas e máscaras descartáveis. Em seguida, deve-se desinfetar todas as garrafas e reagentes
a serem utilizados com álcool 70% e então, levá-los para a capela de fluxo laminar,
previamente ligada.
Com as células dentro do fluxo laminar, retirou-se o meio completo com auxílio de
uma pipetador automático com pipeta estéril e colocou-se este meio em um tubo de fundo
cônico. Após a retirada do meio completo as garrafas foram lavadas com 10 mL de PBS
(tampão fosfato salina) estéril. Após a lavagem com PBS colocou-se 2 mL de tripsina com
24
pipeta manual com ponteira estéril.
Segundo Alves 2010, a tripsina é necessária para que as células que antes estavam
aderidas na garrafa se desprendam. A tripsina é uma enzima que hidrolisa cadeias
polipeptídicas nos radicais lisil-arginil, formando terminações de clivagem éster e amida.
Essa reação impedirá que os receptores da superfície extracelular, ligados ao citoesqueleto,
fiquem aderidos à matriz, obrigando as células a rearranjarem seu citoesqueleto, com
consequente desprendimento de células isoladas dispersas no fundo da garrafa. Entretanto,
não se deve deixar a tripsina em contato por períodos longos, a fim de impedir o excesso de
lise. Deve-se, assim, rapidamente bater na garrafa para que as células se desprendam.
Nesta etapa, verificou-se se as células estão de fato, soltas com auxílio de um
microscópio óptico invertido e logo em seguida, colocou-se novamente o meio de cultura
completo, que estava no tubo com fundo cônico, a fim de neutralizar a ação da tripsina.
Quando as células estavam finamente soltas, recolheu-se as mesmas, com auxílio de uma
pipeta e foram novamente colocadas no tubo com fundo cônico. A seguir, pipetou-se 10 mL
de PBS e adicionou-se a garrafa para suspender qualquer sobra celular existente. Este
tampão foi, na sequência, também adicionado ao tubo de fundo cônico. Este tubo foi levado
à centrifuga refrigerada por 10 minutos a 1200 rpm para que ocorresse a formação de um
pelet. Após está etapa as células podem ser utilizadas para fazer o plaqueamento ou serem
novamente colocadas para crescer em garrafas.
3.2.2. PLAQUEAMETO
O plaqueamento consiste em colocar as células para crescerem em uma nova matriz,
neste caso, uma placa com 24 poços.
Após a centrifugação do meio, o mesmo foi levado à câmara de fluxo laminar,
retirando-se do tubo de fundo cônico 20 mL de meio pelo lado oposto do pelet, para evitar
seu desprendimento junto com o líquido. Então adicionou-se novamente logo acima do pelet
25
mais 1 mL de meio completo e bateu-se levemente no tubo de fundo cônico para que as
células se desagregassem.Na sequência, iniciou-se o processo de coloração das células, para
realização da contagem do número de células que seria adicionado a cada poço da placa.
Pipetou-se 10µL de meio com células e 90µL de meio completo RPMI. Misturou-se essa
diluição de células com 20 µL de azul de Tripan dentro de um microtubo de 1,5mL
(Eppendorf). A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer, colocando-se
uma lamínula sobre seu retículo. Na câmara de Neubawer é feita a contagem sempre na
diagonal conforme demonstrado na figura 7.
Figura 4: Esquema de contagem celular na câmara de Neubawer
Fonte:Elaborado pelo autor.
A contagem pode ser feita usando, por exemplo, os quadrantes 1 e 4 ou pode ser
feita utilizando os quadrantes 2 e 3. Para realização do cálculo somam-se os valores
contados em cada quadrante, conforme mostrado na equação que exemplifica o processo
abaixo:
𝑁 = 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 1 + 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 4
Onde N representa o número total de células somadas nos quadrantes. Quando 𝑁 é
elevado a 105sabe-se o número de células por mL, ou seja 𝑁 ∗ 105 células/mL (cálculo já
1
4
2
3
26
adaptado ao desvio causado pela diluição).
A soma destes dois quadrantes deve ser multiplicado por 10 (fator de diluição).
Sabe-se ainda que cada poço da placa deve conter 1mL ou seja 1000 µL. Logo realiza-se o
cálculo descrito abaixo:
𝑄 =1000
𝑁 ∗ 10
A letra Q se refere ao volume em µL, que corresponde ao número de células
necessárias para serem colocadas em cada um dos poços da placa. Uma vez calculado o Q,
pode-se calcular a quantidade de meio completo necessário para cada poço conforme
demonstrado a seguir:
𝑀𝑒𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑡𝑜 = 1000µ𝐿 − 𝑄
Após a enumeração e colocação das células nos poços da placa, esta última é levada
para estufa a 37ºC e ajustada a 5% de CO2 por 24 horas para que as células se aderirem e
proliferarem.
3.2.3. APLICAÇÃO DOS EXTRATOS AQUOSOS
Após 24 horas as células já cresceram o suficiente formando uma monocamada no
fundo de cada poço, similar ao apresentado anteriormente na figura 6. Retirou-se as placas
com os meios de cultura da estufa e observou-as no microscópio óptico invertido com a
finalidade de observar se não haviam contaminações e se as células estavam bem aderidas,
bem como analisar se seu crescimento foi suficiente para aplicar os extratos. Caso ocorresse
27
uma contaminação as células deveriam ser descartadas. Se não houver quantidade suficiente
de células nos poços, estas devem voltar para estufa e aguardar por mais 24 horas para ter
seu crescimento totalizado.
Estando em número e condições adequadas, desinfetou-se as placas e estas foram
colocadas dentro da câmara de fluxo laminar, retirou-se 100 µ𝐿 de meio completo de cada
poço da placa e imediatamente colocou-se os extratos aquosos das plantas nas
concentrações de 100%, 50% e 25%, no volume de 100 µ𝐿. As concentrações estavam
conforme o descrito por SERAFIM (2017), utilizando 8 gotas de látex em 500mL de água
mineral na solução de 100% de avelóz e 16 gotas na solução de 100% de janaúba também
em 500 mL de água mineral. As demais concentrações eram obtidas a partir da diluição
seriada da solução de 100% de ambas as plantas. A figura 8 ilustra a forma de aplicação dos
extratos nas placas pelo período de 24 e 48 horas usada nas células B16F10. Similarmente
a figura 9 mostra como estavam distribuídos os extratos quando ocorreu aplicação de 48 e
72 horas nas células 3LL. Os controles foram preparados em outra placa na quantidade de
3 ou 4 poços. Pode ocorrer ainda variações na forma de aplicação destes extratos nas placas,
preparando-se por exemplo uma quantidade menor de poços ou incluindo o controle na
própria placa.
Figura 5:Disposição dos extratos aquosos de 24 e 48 horas na placa contendo células B16F10.
Fonte: Autor.
28
Figura 6:Disposição dos extratos para 48 e 72 horas na placa contendo as células 3LL.
Fonte: Autor.
29
3.3.MATERIAIS ENSAIO DO COMETA
3.3.1. SOLUÇÕES
Os reagentes e soluções utilizadas estão descritas no ANEXO A
3.4. METODOLOGIA ENSAIO DO COMETA
O Ensaio do Cometa foi realizado segundo a técnica de Singh, 1988, com
adaptações. Este ensaio de maneira simplificada pode ser divido em 6 etapas, sendo elas
a preparação das lâminas no primeiro dia,preparação das lâminas no segundo dia, lise,
eletroforese, coloração e análise das lâminas.
3.4.1. PREPARAÇÃO DA LÂMINA NO PRIMEIRO DIA
No primeiro dia do experimento foram selecionadas algumas lâminas, que foram
limpas com álcool absoluto, até que estivessem devidamente desengorduradas. Logo após
a limpeza das lâminas, dilui-se 100 mg de agarose ponto de fusão normal (APFN) em 20
mL de PBS com pH 7,4 (agarose 1%), deixando-se ferver no micro ondas, em potência
máxima, obedecendo intervalos de 10 segundos, por três vezes seguidas. Para impedir a
sua rápida polimerização, a solução após a fusão da agarose foi colocada em banho maria,
com temperatura aproximada de 60ºC. Enquanto o gel de agarose ainda estava líquido,
pegou-se o mesmo com auxílio de uma pipeta de Pasteur e cobriu as com uma camada de
APFN. As lâminas secaram em posição vertical por cerca de 24 horas para que a agarose
se solidificasse completamente.
30
3.4.2. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS NO SEGUNDO DIA
No segundo dia do experimento preparou-se a solução de lise para uso com pelo
menos uma hora de antecedência. Neste intervalo de tempo as amostras de células tumorais
B16F10 que foram expostas aos extratos aquosos foram coletadas, realizando-se os
procedimentos do tópico de passagem já descritos anteriormente, para obtenção do pelet,
o qual foi diluído em 500µL de meio completo.
Após este procedimento a solução de agarose de baixo ponto de fusão (ABPF) foi
diluída a 0,8% em PBS Para cada amostra, pipetou-se 30 µL da suspensão das culturas das
células tumorais tratadas com os extratos, mais 70 µL de ABPF homogeinizando com
auxílio da pipeta. Esta mistura foi colocada sobre as lâminas cobertas com a APFN e
rapidamente cobriu-se com lamínula. As lâminas assim montadas, foram levadas a
geladeira por um período de 15 a 20 minutos. Após esse período retirou-se as lamínulas
cuidadosamente a fim de evitar o descolamento das amostras.
3.4.3. LISE
Após a retirada das lamínulas, as lâminas foram submetidas à solução de lise gelada
por um período de uma hora (Figura 10). O intuito desta etapa segundo Oliveira (2015), é
expor o material genético em meio alcalino que romperá as membranas celulares.
Tendo passado uma hora retirou-se as lâminas da cuba e lavou-as com solução de
neutralização por 5 minutos. Esta fase busca limitar o processo de lise alcalina pois a
solução de neutralização possui pH 7,4 neutralizando assim a ação da solução de lise que
possuí pH 10.
31
Figura 7: Lâminas em solução de lise.
Fonte: Autor.
3.4.4. ELETROFORESE
A solução de eletroforese foi preparada previamente e colocada na geladeira até
que a mesma atingisse um temperatura próxima de 4ºC. Colocou-se a solução dentro da
cuba de eletroforese que foi então, envolvida por gelo para manter a solução gelada (Figura
11), pois se não estiver devidamente gelada pode ocorrer a desnaturação do material
genético, em decorrência da energia calorífica gerada pela corrente elétrica. Colocou-se as
lâminas dentro da cuba e deixou-as descansando por 20 minutos. Logo após a cuba foi
ligada a uma fonte de tensão e corrente elétrica, obedecendo as seguintes especificações:
• 26 V (1V/cm).
• 20 minutos.
• 300 mA.
32
Figura 8: Cuba de eletroforese preparada.
Fonte: Autor.
Após realizar todos os ajustes ligou-se a fonte e procedeu-se a corrida por 20
minutos. Como a solução de eletroforese é rica em íons ocorre a hidrólise da água
permitindo a troca de elétrons, fazendo com que o material genético percorra pela ABPF,
com velocidade e distância proporcionais aos fragmentos de material genético.
Decorrido o tempo de corrida, retirou-se a lâminas da cuba de eletroforese e lavou-
as 3 vezes de 5 minutos com solução de neutralização e duas vezes com H20 destilada
respectivamente. Esperou-se o período de 24 horas para que as lâminas estivessem
devidamente secas. As laminas foram colocadas em solução fixadora por 10 minutos e
lavadas 3 vezes com H20 destilada e levadas para estufa a 37ºC a por 1,5 h. Após estarem
totalmente secas foram novamente hidratas com H20 destilada por mais 5 minutos.
33
3.4.5. COLORAÇÃO
No momento da coloração foram usadas duas soluções previamente preparadas,
sendo elas a solução de coloração “A” e a solução de coloração “B”, as quais foram
misturadas na proporção de 53 mL e 27mL, respectivamente, dentro da cuba de coloração.
cobrindo-a com papel alumínio, para evitar exposição a luz e esperou-se por 35 minutos.
No momento da coloração é importante que as luzes do laboratório permaneçam apagadas
para evitar a oxidação da prata presente na solução de coloração “B” e para evitar quebras
adicionais de DNA, pela exposição a luz.
Após a coloração, as lâminas foram lavadas 3 vezes com H20 destilada e colocadas
por 5 minutos em solução de parada e lavadas por mais três vezes com H20 destilada As
lâminas foram deixadas secando a temperatura ambiente e depois analisadas em um
microscópio óptico
3.4.6. ANÁLISE DAS LÂMINAS
As lâminas foram analisadas com microscópio óptico, que permite a visualização
dos nucleóides com contorno circular (sem dano no DNA) ou estruturas em forma de
“cometa” (com danos no DNA). As células são classificadas em 5 categorias
correspondentes às seguintes características de danos no DNA.
0- Sem danos (<5%).
1- Baixo nível de dano (5-20%).
2- Médio nível de dano (20-40%).
3- Alto nível de dano (40-95%).
4- Dano total (>95%).
Para cada lâmina, 50 núcleos escolhidos aleatoriamente foram analisados utilizando um
microscópio óptico comum.
34
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A utilização de plantas medicinais para cura e tratamento de doenças é algo comum
nos países em desenvolvimento. Segundo dados da OMS as plantas terapêuticas são usadas
por 70 a 95% das pessoas nestes países (WHO, 2011), destas 40%, fazem tratamentos
regulares usando plantas. No Brasil não é diferente e grande parte da população faz uso de
fitoterápicos (PERON, 2008), devido à grande riqueza de plantas medicinais no país. Além
disso, no Brasil, como em países em desenvolvimento, o emprego de fitoterapia também é
atribuído à dificuldade de acesso à assistência medica e farmacêutica. Este último fato pode
levar ao uso indiscriminado de extratos sem o conhecimento necessário sobre as
propriedades e toxicidade destas plantas. (SILVA, et al. 2006; ALEXANDRE et al. 2008).
As plantas utilizadas com propósitos medicinais podem possuir compostos químicos
com potencial mutagênico ou até mesmo carcinogênico, quando ingeridas de maneira
indiscriminada. Estudos de toxicidade e genotoxicidade de plantas medicinais ou seus
compostos isolados em modelos experimentais de culturas celulares são escassos (PERON,
2008).
As culturas celulares vêm se destacando em diversos estudos, onde se avaliam suas
respostas quando expostas a alguma substância potencialmente tóxica. Nestes estudos com
as células em cultura, já se avaliou, por exemplo, sua resposta à exposição à polímeros de
albumina (SALDANHA, 2007) ou a drogas antivirais (FRÖHNER, 2003), ou ainda
avaliação de ativos isolados de plantas (BACANI, 2010). Os empregos das culturas
celulares apresentam algumas vantagens em relação aos tradicionais modelos in vivo
(DAVILA, et al, 1998), os quais apresentam dificuldades, como os critérios de segurança
que devem ser envolvidos em sua utilização, bem como a experimentação com grande
quantidade de animais, pode ir contra questões éticas (MATUO, 2011).
Os ensaios de genotoxicidade são muito úteis na investigação dos processos que causam
macro alterações no material genético, isto é, no ácido desoxirribonucleico (DNA). Estes
ensaios podem também detectar alterações no determinismo gênico a níveis celulares e
orgânicos, que são respectivamente a carcinogênese e teratogênese (SILVA et al. 2003,
SILVA et al. 2007). Dentre os diversos ensaios que permitem a avaliação de substâncias
35
genotóxicas, o ensaio do cometa vem se destacando nas últimas décadas, por permitir a
utilização de amostras de qualquer célula eucariótica, desde que possam ser devidamente
isoladas (COLLINS, 2008), permite também, a avaliação de danos ao DNA, tanto os
permanentes, como aqueles que podem ser reparados (TICE, 1995), além de ser uma técnica
economicamente acessível (SAWANT, 2014)
No presente trabalho, o ensaio do cometa foi realizado para o estudo da resposta de
células tumorais de melanoma (B16F10) e de carcinoma de mama (3LL), em cultura,
visando avaliar o potencial genotóxico de extratos aquosos das plantas janaúba e avelóz.
Observa-se da literatura, outros trabalhos que avaliaram os efeitos tóxicos de extratos de
planta,in vivo (MACHADO, 2007; BANI, 2007), bem como estudos semelhantes a este,
empregando extrato de avelóz em culturas celulares de leucócitos humanos (Lima et
al.,2009) e de ratos (WACZUKI, 2014). Em nosso grupo, culturas de células B16F10 foram
empregadas para o estudo da sua viabilidade, quando expostas à extratos aquosos de janaúba
e avelóz, por meio do teste 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
(MTT) (SERAFIM, 2017). Contudo, não há registro de estudos com os extratos de janaúba
e/ou avelóz com as culturas aqui empregadas para avaliação de genotoxicidade.
Para orientar a leitura e interpretação dos resultados, construiu-se um gabarito, como
apresentado na figura 12, com os diferentes níveis de dano ao material genético,
classificados de 0 até 4.
Figura 9:Gabarito do ensaio do cometa. 0: sem dano (<5%); 1:Baixo Nível de dano (5 -10%); 2: Médio nível
de dano (20-40%); 3: Alto nível de dano (40-95%); 4: Dano total (>95%).
Fonte: Autor.
36
O experimento realizado pela exposição das células de melanoma B16F10 aos extratos
aquosos de janaúba, nas concentrações de 25, 50 e 100%, por um período de 24 horas,
resultou em uma consistente redução do número de células, quando comparado com as
mesmas células sem previa exposição (controle) (Figura 13).
Figura 10: Células B16F10 expostas aos extratos aquosos de janaúba por 24 horas. As numerações
representam os respectivos níveis de dano celular
Fonte: Autor.
Extratos de janaúba foram novamente aplicados por 24 e 48 horas sobre as células
B16F10. As figuras 14 e 15 demonstram os resultados usando os extratos de janaúba.
Observa-se nas imagens, que a frequência e intensidade dos danos foi proporcional
à concentração dos extratos na maioria dos casos. As concentrações mais elevadas de
janaúba (50 e 100%), resultaram em maiores índices de dano, evidenciados pela maior
presença de cometas de nível 3 e 4. No gráfico da Figura 16, pode-se notar que os maiores
37
danos ocorreram após 48 horas. É possível também notar, que houve alto número de
cometas de nível 3 na concentração de 100% após 24 horas, de modo que o dano se torna
maior discorrido período de 24 para 48 horas nesta concentração.
Outra observação feita a partir dos gráficos da figura 16, foi que na exposição de
50% por 24 horas, houve maior número de cometas de grau 4 do que a exposição a 100%
no mesmo período, porém, após as 48 horas, houve um predomínio do grau 4 em 100%,
indicando novamente maior efeito genotóxico com o prolongamento da exposição em maior
concentração.
Semelhante aos nossos dados, no trabalho desenvolvido por Paz, et al. (2013) foi
estudada uma planta do gênero Himathantus sobre células ex vivo de linfócitos humanos,
usando as concentrações de 1g/100ml, 2g/100mL e 3g/100mL. Seus resultados mostraram
efeitos genotóxicos, principalmente nas concentrações mais elevadas.
O trabalho desenvolvido por Paz et al (2013) também demostrou inibição da divisão
celular, quando usou células de Allium cepa como indicador de toxicidade de extratos de
Himanthantus, observada pela redução no crescimento das raízes, que neste caso, também
foi proporcional às concentrações utilizadas. Na Figura 14 e 15 torna-se nítido a redução na
quantidade de cometas ao se comparar com controle, o que pode indicar a inibição da
divisão celular durante a exposição aos extratos.
38
Fonte: Autor.
Figura 11:Cometas das células expostas B16F10 a extrato de janaúba por 48 horas. A esquerda mostra os cometas no
aumento de 40x, a direita cometas evidenciados com aumento de 100x. (A) Nas células expostas a 100% pode-se
perceber a presença de cometas de grau 4 destacado com os círculos. Na concentração de 50% (B) é possível
visualizar um cometa de grau 3 dentro do circulo. Na concentração de 25% (C) destacado alguns cometas de grau 2.
(D) controle.
39
Fonte: Autor
Figura 12:Cometa das células B16F10 expostas a extratos de janaúba por 24 horas. A esquerda mostra os cometas
no aumento de 40x, já a direita mostra os cometas evidenciados com aumento de 100x. Na concentração de 100%
(A) presença de cometas de nível 3. Na concentração de 50% (B) observa-se a presença também de cometas de grau
3 com alguns de nível 4 evidenciado pelo círculo. Na concentração de 25% presença modesta de cometas de nível
3. A letra D demonstra o controle.
40
Figura 13: Gráficos da contagem dos cometas das lâminas de janaúba cada concentração está dividida de 0 a
4 com células B16F10.
Fonte: Autor
41
Os mesmos experimentos realizados usando a linhagem celular 3LL de carcinoma
de pulmão. Os resultados obtidos empregando estas células foram diferentes dos
anteriormente apresentados. As figuras 17 e 18 apresentam os resultados da exposição a
janaúba, nas concentrações de 25, 50 e 100%, por 48 e 72 horas. Nestas figuras pode-se
notar um maior número de células, as quais apresentaram menores níveis de cometa, quando
comparados com as células B16F10. Diferentemente de outros resultados analisados, a
exposição do extrato a 25%, por 48 horas apresentou maiores níveis de dano (Figura 19),
do que nas demais concentrações, esta resposta talvez se deva à maior capacidade de
adaptação destas células, que quando expostas as maiores concentrações, podem reparar-se
para sobreviver neste ambiente de maneira mais rápida que em baixas concentrações. Já na
exposição de 72 horas, as concentrações mais elevadas (50 e 100%) apresentaram mais
danos no nível 3, com resultados mais próximos aos das células B16F10.
42
Fonte: Autor.
Figura 14:Células 3LL expostas a Janaúba por 72 horas(cometas). A esquerda aumento de 40x e a direita aumento de
100x. Na concentração de 100% (A) pode-se visualizar alguns dos cometas de nível 3. Na concentração de 50 % (B)
cometas de nível 3 em azul e vermelho nível 2. As concentrações de 25% (C) apresentam predominância de cometas de
nível2. Na letra D observa-se o controle.
43
Fonte: Autor.
Figura 15:Células 3LL expostas ao extrato de janaúba por 48 horas(cometas). A esquerda campo com aumento
de 40x e a direita aumento de 100x. Na concentração de 100(A) a direita pode-se notar uma região com
predominância de cometas nível 3. Na concentração de 50%(B) cometas de nível 3 em azul e nível 2 vermelho.
No aumento de 100x da concentração de 25% é possível notar um campo com cometas de nível 4. A letra D
evidencia os controles.
44
Fonte: Autor
Figura 16: Gráfico contendo os dados das contagens dos níveis de dano das células 3LL expostas a janaúba
45
Os resultados usando as células B16F10, expostas aos extratos aquosos de avelóz
são apresentados nas figuras 20 e 21. Neste caso, observa-se maior incidência de cometas
de nível 4 nas concentrações de 50 e 100% por 24 horas (Figura 22), diferentemente das
concentrações de janaúba que os apresentaram em 48 horas, indicando assim que o avelóz
pode ser potencialmente mais genotóxico em períodos de 24 do que 48 horas.
Em suma, quando foi empregado o extrato do avelóz notou-se que as células
apresentaram cometas com quebras, de modo similar aos apresentados com o emprego dos
extratos de janaúba no que tange à frequência de cometas com índices de dano 3 e 4 nas
concentrações de 50 e 100%.
46
Figura 17:Células B16f10 expostas a extratos de avelóz por 48 horas (cometas). A esquerda mostra os cometas
no aumento de 40x, já a direita mostra os cometas evidenciados no aumento de 100x. Na lâmina de 100%(A)
nota-se a presença discreta de cometa de grau 2 destacado pelo círculo. Na concentração de 50%(B) nota-se
dentro do círculo também presença de cometas de nível 2, na imagem da direita pode notar alguns cometas de
nível 3 presentes em outra parte da lâmina, por fim na lâmina que recebeu os extratos a 25% grande presença
de cometas de nível 1 também evidenciados pelos círculos. D controle do experimento.
Fonte: Autor.
47
Figura 18: Cometas das Células B16F10 expostas a extratos de avelóz por 24 horas. A esquerda mostra os
cometas no aumento de 40x já a direita mostra os cometas evidenciados no aumento de 100x. Na lâmina de
100%(A) ocorre quase prevalência de cometas de nível 4. Na lâmina de 50%(B) pode-se notar cometas de
nível 3. Na lâmina contendo as células expostas as concentrações de 25%(C) pode-se também notar a presença
de alguns cometas de nível 4 destacados pelos círculos. (D) Controle.
Fonte: Autor.
48
Figura 19: Gráficos das contagens das células B16F10 expostas aos extratos de avelóz.
Fonte: Autor.
49
Estudos anteriores com a planta avelóz demonstraram redução da proliferação de
células tumorais em cultura de carcinoma epidermóide de laringe sem alterar sua morfologia
(FRANCO, 2014) . No mesmo estudo, demonstrou-se alterações nas cascatas de sinalização
de processos tumorigênicos e inflamatórios. No presente trabalho observou-se também a
diminuição do número de células presentes nas lâminas (principalmente em A da figura 20
e A e C da figura 21) quando comparadas com o controle (D) na mesma figura.Outros
trabalhos também apontam a atividade antitumoral do avelóz (REZENDE et al, 2004), bem
como sua interferência no microambiente celular (Richter et al , 2014).
Waczuk (2014), assim como no presente trabalho, também utilizou o ensaio do
cometa para verificar a ação genotóxica de extratos aquosos de avelóz, porém nas
concentrações de 10µg/mL a 150 µg/mL do látex. Este autor apontou riscos na utilização
destes extratos, baseado nos resultados de seus testes de viabilidade celular em leucócitos
humanos. Neste trabalho, pelo ensaio do cometa foi possível verificar a ação genotóxica do
avéloz, sobretudo nas mais altas concentrações, fato similar foi encontrado nas pesquisas
desenvolvidas nas células B16F10 no presente estudo.
Ainda com o ensaio do cometa, foi realizado um estudo com o ativo julocrotina,
isolado do extrato do gênero Euphorbiaceae, o qual apresentou efeitos genotóxicos que
foram proporcionais as concentrações empregadas. (CORREA, 2011).
Diferentemente dos achados descritos, Lima et al. (2009), não mostrou qualquer
efeito do extrato aquoso do avelóz em células eucariontes, atribuindo seu resultado à grande
capacidade de reparação destas células.
No modelo de Drosophila melanogaster não foi possível demonstrar atividade
genotóxica do extrato de avelóz (OLIVEIRA e NEPOMUCENO, 2004). Neste trabalho
também foi apontada a capacidade de reparo do DNA por estes organismos.
Ao expor a célula 3LL ao extrato de avelóz pode-se constar que estas células
apresentaram maiores danos quando expostas por 48 e 72 horas na concentração de 25%,
conforme mostrado no gráfico da figura 25. Porém, quando as células foram expostas por
48 horas nas demais concentrações, apresentaram poucas quebras de DNA, se
assemelhando ao controle. Estes resultados permitem dizer que o avelóz é pouco genotóxico
para estas células. A figura 23 e 24 mostram os cometas das células 3LL por 48 e 72 horas
respectivamente.
50
A este experimento não se sabe exatamente a explicação do porquê as concentrações
de 25% causaram maiores danos. Parece que os efeitos, neste caso, não se correlacionam
com as concentrações. Há necessidade de mais experimentos para poder confirmar estes
dados.
51
Fonte: Autor.
Figura 20Cometas das células 3LL expostas aos extratos aquosos de avelóz por 72 horas, em suas respectivas
concentrações. A esquerda aumento de 40x e a direita aumento de 100x. Os círculos vermelhos representam cometas
de nível 2, azul 3 e verde 4.D representa o controle.
52
Fonte: Autor.
Figura 21: Cometas das células 3LL expostas a extratos aquosos de avelóz por 48 horas. A esquerda aumento de
40x e a direita aumento de 100x. Pode-se notar na concentração de 100% predomínio de cometas de nível 0 e
cometa de nível 1 destacado pelo círculo branco. Na concentração de 50% predomínio de cometas de nível 0 e
na concentração de 25%cometas de nível 4.
53
Fonte: Autor.
Figura 22: Gráficos com as contagens das células 3LL expostas aos extratos de avelóz.
54
Quando se consideram as duas plantas em estudo (janaúba e avelóz), observou-se
maior número de publicações envolvendo o avelóz, cujas ações mais conhecidas são suas
propriedades antitumorais. Um levantamento de dados feito por Neodini (2015) compilou
alguns estudos de diversos autores sobre a Euphorbia tirucalli, juntamente com um resumo
de seus resultados, conforme demonstrado na tabela 1.
Tabela 1: Estudos envolvendo avelóz.
AUTOR Concentração Organismo e teste Resultado
Lima et al. (2009) Látex homeopático e
látex fitoterápico (2
gotas em 250ml de
água e 2 gotas em
25ml de água)
In vitro
Induteste, Teste de
Ames e Cromoteste
Apresentou
genotoxicidade em
células procariontes
Oliveira e
Nepomuceno
(2004)
Látex diluído em
água (0,33µL/mL,
0,5µl/mL e 1µL/mL)
In vitro
SMART (Teste de
Detecção de
Mutação e
Recombinação
Somática)
Não apresentou
genotoxicidade
Waczuk (2014) Extrato aquoso dos
ramos (10 a
150µg/mL
In vitro
Genotoxicidade e
viabilidade celular
(leucócitos
humanos)
Apresentou
genotoxicidade e
citotoxicidade
Machado (2007 Látex diluído em
água (1, 5 e 10%)
In vitro
Cultura de células de
leucócitos de rato
Alterações em
diversas células
Bani (2007) Fração do extrato
etanólico
In vivo
Camundongos com
artrite
Provocou alteração
da resposta
imunológica
55
Silva et al. (2007) Látex diluído em
água (de acordo com
informações
etnobotânicas para
obter ação anti-
inflamatória)
In vivo
Tratamento, por
gavagem, das ratas
durante duas fases da
gestação
Não apresentou
toxicidade
Brasileiro et al.
(2006)
Extrato bruto Teste de Artemia
salina
Altamente tóxico
Tiwari e Singh
(2006)
40 e 80% da DL50
In vivo
Peixes expostos
acima de 24 ou 96
horas
Apresentou
alterações
bioquímicas
Machado (2007) Extrato bruto (2.000 a
5.000mg/Kg)
In vivo
Toxicidade oral
aguda em
camundongos
(gavagem)
Não apresentou
toxicidade
Sousa et al. (2012) Látex diluído em
água (0,05%)
In vivo
Toxicidade oral
subcrônica em ratos
(gavagem)
Não apresentou
toxicidade
subcrônica
Fonte: Adaptado pelo autor.
Em relação aos resultados obtidos neste trabalho foi resumido de maneira
simplificada conforme o demonstrado na tabela 2
56
Tabela 2: Resultados do presente trabalho.
Planta Célula Concentração Tempo Resultado
Janaúba B16F10 25, 50 e 100% 24
Horas
Redução no número de células
e danos ao DNA conforme
aumento da concentração.
Janaúba B16F10 25, 50 e 100% 48
horas
Redução no número de células
e maior frequência de cometas
de nível 3 e 4 nas
concentrações de 50 e 100%.
Janaúba 3LL 25, 50 e 100% 48
horas
Apresentou maiores danos na
concentração de 25% a 48
horas.
Janaúba 3LL 25, 50 e 100% 72
Horas
Os maiores danos foram nas
concentrações de 50 e 100%
Avelóz B16F10 25, 50 e 100% 24
horas
Redução no numero de celulas
em relação ao controle, e
maiores danos na
concentração de 50 e 100%
Avelóz B16F10 25, 50 e 100% 48
Horas
Redução no número de células
quando comparadas ao
controle, menores níveis de
danos do que nas mesmas
concentrações expostas a 48
horas
Avelóz 3LL 25, 50 e 100% 48
horas
Maior dano na concentração
de 25%, nas demais
concentrações baixo dano
Avelóz 3LL 25,50 E 100% 72
horas
Maior dano na concentração
de 25%
Fonte: Autor.
57
5. CONCLUSÃO
O estudo da genotoxicidade pode fornecer informações bastante úteis no que diz
respeito a avaliação de substâncias e a capacidade destas de lesarem algum tecido ou célula,
podendo levar ao aparecimento de um tumor.
A partir dos resultados obtidos nestes experimentos foi possível observar ainda de
maneira preliminar, que os extratos de janaúba e avelóz se apresentaram mais genotóxicos
nas culturas de células de melanoma murino (B16F10) do que em células de carcinoma de
mama (3LL). Nas células B16F10 constatou-se redução na quantidade de nucleóides em
comparação aos controles e, na maior parte dos resultados, a exposição mais prolongada
causou maiores danos no DNA. Porém, o avelóz se mostrou mais genotoxico nos períodos
de 24 horas enquanto a janaúba em 48 horas para a células B16F10. Os resultados
encontrados com as células 3LL não foram conclusivos e necessitam de mais experimentos.
A continuação das pesquisas com utilização do cometa podem fornecer maiores
informações sobre a capacidade dos extratos de janaúba e avelóz de causarem danos sobre
o DNA, confirmando assim sua genotoxicidade, e saber se esta pode vir a aumentar a
agressividade do tumor. Este efeito necessita maiores estudos para correlacioná-lo com o
potencial antineoplásico atribuído a estas plantas.
58
REFERÊNCIAS
ALEXANDRE, R. F., BAGATINI, F. & SIMÕES, C. M. O. Potenciais interações entre
fármacos e produtos à base de valeriana ou alho. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.
18 p. 455-463, 2008.
ALVES, E. M. Avaliação do efeito anticarcinogênico do látex do avelós (Euphorbia
tirucalli), por meio do teste para detecção de clones de tumor (warts) em Drosophila
melanogaster, 2012.
ALVES, E. M.; NEUPOMUCENO, J. C. Avaliação do efeito anticarcinogênico do látex
do avelós (Euphorbiatirucalli), por meio do teste para detecção de clones de tumor (warts)
em Drosophilamelanogaster. Perquirere,. v. 9, n. 2, p.125-140, 2012.
ALVES, E. A; GUIMARÃES, A. C. R. Cultivo celular- Capitulo 5. 1.1. Histórico da
cultura de células. 2010. Disponível
em:<http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/capitulo_5_vol2.pdf>. Acesso em 29 Set 2017.
AMARAL, J. B., et al. Tissue Engineering Part C: Methods. November 2011, v. 17 n. 11,
p. 1097-1107. doi:10.1089/ten.tec0260. 2011
ANDERSON, D.; YU, T.W.; MCGREGOR, D.B.. Comet assay responses as indicators of
carcinogen exposure. Mutagenesis. 1998. v. 13 n.6, p. 539-555, 1998.
ANDRADE, A.F.; ALVES, J.M.; CORRÊA, M.B.;CUNHA, W.R.; VENEZIANI, R.C.;
TAVARES, D.C. In vitro cytotoxicity, genotoxicity and antigenotoxicity assessment of
Solanum lycocarpum hydroalcoholic extract. Pharm Biol. v.54, n.11, p.2786- 2790, 2016.
59
BACANI, P. M. C. Citoxicidade, genotoxicidade, mutagenicidade e potencial
apoptótico da isantina em células de mamíferos. 2010. 83 f. Dissertação (Mestrado),
curso genética e biologia molecular, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2010.
BANI, S. et al. Anti-arthritic activity of a biopolymeric fraction from Euphorbia tirucalli.
Journal of Ethnopharmacology, v. 110, n. 1, p. 92-98, mar. 2007.
BARBOSA et al. Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal. 2015. v.9, n.2, p.
334-347, 2015.
BELPAEME, K. ; COOREMAN & M. KIRSCH-VOLDERS. 1998. Development and
validation of the in vivo alcaline comet assay for detecting genomic damage in marine
flatfish. Mutat Res- Genet. Toxicol. Environ. Mutag, 415, p. 167-184, 1998.
BERTRAM J. S, JANIK P. Establishment of a cloned line of Lewis lung carcinoma cells
adapted to cell culture. Cancer Lett. 11: 63-73, 1980.
BEZERRA, W. K. T. et al. O uso de fitoterapia com ação anti-inflamatória que atuam
no sistema gênito-urinário. Informativo Técnico do Semiárido, 8(1). p.24-36, 2014.
BOROJEVIC, R. Terapias Celulares e Bioengenharia. Gazeta Médica da Bahia, Rio de
Janeiro, v. 78, n. 1,p. 42-46, 2008.
60
BRASILEIRO, B. G. et al. Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some
brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Revista Brasileira de
Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 42, n. 2, p. 195- 202, abr./jun. 2006. Disponível
em: . Acesso em: 2 nov. 2016
BRASIL. Organização Mundial da Saúde. Medical Device Regulations: Global
Overview and Guiding Principles, 2003.
BRIANEZI, G.; DE CAMARGO, J. L. V.; MIOT, H. A. Desenvolvimento e validação
de técnica quantitativa de análise de imagem para avaliação do teste do cometa corado
pela prata. Bras Patol Med Lab, v.45 n.4 p. 325-334, 2009.
CARVALHO, D.K. Princípios ativos de plantas medicinais. Universidade do Sul de
Santa Catarina; Curso de Enfermagem. 2011. Disponível em:
<http://ecaths1.s3.amazonaws.com/fitoterapia/1518404063.Aula%20principios%20ati
vos.pdf >. Acesso em: 21 set. 2017
CENTRO PAULA SOUZA. Centro Paula Souza Completa 45 anos. 2014. Disponível
em: <http://www.cps.sp.gov.br/centro-paula-souza-completa-45-anos/>. Acesso em 25 set
2017.
CENTRO PAULA SOUZA. Histórico da Instituição . 2015. Disponível em:
<http://www.centropaulasouza.sp.gov.br/quemsomos/perfil-historico/>. Acesso em: 25 set.
2017.
CERDA, H.; DELINCÉE, H.; HAINE, H.; RUPP, H. The DNA„comet assay as
a rapid screening technique to control irradiated food.1997. Mutat.Res. 375, 167–181, 1997
61
COLLINS, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications,
and limitations. Mol Biotechnol, v. 26, n.3,p. 249-61, 2004.
COLLINS, A. R. The comet assay: topical inssues. Mutagenisis.v.23, p. 143-151, 2008.
CORREA, R. M. S. Avaliação in vitro dos possíveis efeitos citotóxicos e genotóxicos
do alcalóide julocrotina em linfócitos humanos. 2011. 49 f. Dissertação (Mestrado) -
Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal do Pará,, Belém, 2011.
DAVILA, J. C.; et al. Predictive value of in vitro model systems in toxicology. Annual
Review of Pharmacology and Toxicology, v.38, p. 63-69, 1998.
ETEC JOSE BENTO - CENTRO PAULA SOUZA. Manual do professor ingressante.
2013. Disponível em: < http://etecjbento.com.br/web/wp-content/uploads/2016/09/ma
nual_Professor-Ingressante.pdf>. Acesso em: 17 de set 2017.
FAIRBAIRN, D.W.; OLIVE, P.L.; O‟NEILL, K.L. The comet Assay: a comprehensive
review. Mutation Research, v. 339, p. 37-59, 1995.
FATEC SOROCABA¹. Histórico. 2017. Disponível em:
<http://www.fatecsorocaba.edu.br/histo rico.asp>. Acesso em: 17 set. 2017.
FATEC SOROCABA². Iniciação científica. 2017. Disponível em:
<http://www.fatecsorocaba.edu.br/iniciacao.asp>. Acesso em: 17 set. 2017.
FATEC SOROCABA³. Núcleos de pesquisa. NEPA. 2017. Disponível em:
<http://www.fatecsorocaba.edu.br/nucleos.asp >. Acesso em: 17 set. 2017.
62
FERREIRA, V. F.; PINTO, A.C.. A fitoterapia no mundo atual.Quím.Nova. 33(9):1829-
1829, 2010,.
FRANÇA, W.C.S.; SOUZA, A.C.R.L.A.; CORDEIRO, J.A.; CURY, P.M. Análise da ação
do Himatatnthus drasticus na progressão do câncer de pulmão induzido por uretana
em 69 camundongos.2011. Faculdade de Medicina de São José do Rio - FAMERP.v.9 n.3
pt. 1, p.350-353, 2011.São José do Rio Preto, 2011.
FRANCO, G. B. Análise da expressão gênica em resposta ao tratamento com
Euphorbia tirucalli (Aveloz) em carcinoma epidermóide de laringe. 2014. 115 f.
Dissertação (Mestrado em Genética) - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, São José do Rio Preto, 2014.
Disponível em: . Acesso em: 15 nov. 2017.
FRESHNEY, R. I. Basic Principles of Cell Culture, in Culture of Cells for Tissue
Engineering. 2006.(eds G. Vunjak-Novakovic and R. I. Freshney), John Wiley & Sons,
Inc, Hoboken, NJ, USA. doi:10.1002/0471741817.ch1 . Inc p. 03-22, 2006.
FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5°ed. New
York. Wiley-Liss,. Cap. 8, p. 105-113, cap. 12, p. 175-197, cap. 18 p. 291-306, 2005.
FRÖHNER, C. R. A. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE, DA
GENOTOXICIDADE E DA POTENCIAL ATIVIDADE ANTIVIRAL DA
VIOLACEÍNA, PRODUZIDA PELA Chromobacterium violaceum. 2003. 136 f.
Dissertação (Mestrado) – Curso de pós graduação em farmácia, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2003. Disponível em: <
https://repositorio.ufsc.br/xmlui/bitstream/handle/123456789/86072/191935.pdf;jsessioni
d=371A20E6960F152DA58A8888E7DF969A?sequence=1>. Acesso em 19 de nov. 2017.
63
GALVÃO, C. M.; SAWADA N. O.; ROSSI L. A. A prática baseada em evidências:
considerações teóricas para sua implementação na enfermagem perioperatória. Ver.Lat-
Am. Enferm.; 2002.
GARCÍA, O.; MANDINA, T.; LAMADRID, A. I.; DIAZ, A.; REMIGIO, A.;
GONZALEZ, Y.; PILOTO, J.; GONZALEZ, J. E.; ALVAREZ, A. Sensitivity and
variability of visual scoring in the comet assay: Results of an inter-laboratory scoring
exercise with the use of silver staining. Mutat. Res.-Fundam. Mol. Mech. Mutag., 556(1-
2), p. 25-34, 2004.
GONÇALVES, A. L.; ALVES FILHO, A.; MENEZES, H. Estudo comparativo da
atividade antimicrobiana de extratos de algumas árvores nativas. Arquivos do Instituto
Biológico, v.72, n.3,p.353-358, 2005.
GONSALVES, A.; ARAÚJO, C. R. M.;SOARES, N. A.; GOULART, M. O. F.; ABREU,
F. C. 2011. Diferentes estratégias para a reticulação de quitosana.Quim. Nova, 34(7),
p.1215-1223, 2011.
GUY, R. H. Dhermatopharmacokinetics of betamethasone 17 – valerate: Prediction of
Bioavailability. In Brain, K, R.; WALTERS, K. A, eds. Perspectives in percutaneous
Penetration. TS Publishing, Cardiff, p. 2005. v. 11., p. 101, 2005.
HARTMANN, A., AGURELL, E., BEEVERS,C., BRENDLERSCHWAAB, S.,
BURLINSON, B., CLAY, P., COLLINS, A., SMITH,A., SPEIT, G., THYBAUD, V. &
TICE, R.R. 2003. Recommendationsfor conducting the in vivo alkaline Comet assay.
Mutagenesis, v. 18, p. 45-51, 2003.
64
HARTMANN, A., SCHUMACHER, M., PLAPPERT-HELBIG, U.,LOWE, P., SUTER,
W. & MUELLER, L.. Use of the alkaline invivo comet assay for mechanistic genotoxicity
investigations. 2004. Mutagenesis,v. 19, p. 51-59, 2004.
HAYFLICK, L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. 1965. Exp. Cell
Res. v.37 p.614-636, 1965.
JOCA, F. J. G. Avaliação de genotoxicidade de trabalhadores expostos à sílica. 2009. 95
f. Mestrado em Saúde, FIOCRUZ, FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ, 2009.
JOLY, A. B. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. 13º ed. São Paulo: Companhia
Editora Nacional, 8080. 2002.
KIZILIAN, N.; WILKINS, R. C.; REINHARDT, P.; FERRAROTTO, C.; MCLEAN,J.R.
N.; MCNAMEE, J. P. Silver-stained comet assay for detection of apoptosis.
Biotechniques. v. 27, p.926-930, 1999,.
LIAO, W.; MCNUTT, M. A.; ZHU, W. The comet assay: A sensitive method for detecting
DNA damage in individual cells. Methods, v. 48, p. 46–53, 2009.
LIMAN, R. Genotoxic effects of Bismuth (III) oxide nanoparticles by Allium and Comet
assay. Chemosphere. 2013 Sep; 93 n.2, 269-273, 2013.
LINHARES, J. F. P. et al. Ambientes de ocorrência e flora acompanhante do gênero
Himatanthus em Alcântara, Maranhão, Brasil. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais, v.13, p.550-558, 2011.
65
LINHARES, J. F. P. Sustentabilidade sócio-ambiental da extração de janaúba
(Himatanthus Willd. ex. Schult.) no município de Alcântara, MA, Brasil. 2010. 116f.
Dissertação (Mestrado em Sustentabilidade de Ecossistemas) – Departamento de
Oceonografia e Liminologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, MA,
2010.
LINDEE. M. S. The Culture of Cell Culture. Science. Ed. 316, 2007.
LIMA, L. G. S. et al. Avaliação do potencial genotóxico e mutagênico de soluções diluídas
e dinamizadas de Euphorbia tirucalli Lineu (Aveloz). Brazilian Homeopathic Journal,
Rio de Janeiro, v. 11, n. 1, p. 1-2, 2009. Disponível em: . Acesso em: 10 nov. 2016.
LIMA. V. B.; Estudo fitoquímico de Himatathus obovatus (Muell. Arg.) Woodson
(APOCYNACEAE): Isolamento, elucidação estrutural e atividade biológica.
2005. 174f. Tese (Doutorado em Química Orgânica) – Universidade Estadual de
Campinas, SP, Campinas, 2005
LOPES, C.R. et al.UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA. Folhas de chá.
Viçosa: UFV, 2005.
KIRSCH-VOLDERS M, VANHAUWAERT A, DE BOECK M and DECORDIER L.
Importance of detecting numerical versus structural chromosome aberrations. 2002. Mutat
Resn. 504, p.137-148, 2002.
MACHADO, M. M;.Perfil fitoquímico e avaliação dos principais efeitos biológicos e
imunológicos in vitro da Euphorbia tirucalli L. 2007. 105 f. Tese de Mestrado do
Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal de Santa
Maria: Santa Maria – RS,p.105 , 2007.
66
MACIEL, M.A.M.; Pinto, A.C.; Veiga, V.E. 2002. Plantas medicinais:a necessidade de
estudos multidisciplinares. Química Nova 23: 429-438.
MATEUCA R, et al. Chromosomal changes: induction, detection methods and applicability
in human biomonitoring. 2006.. Biochimie. v. 88 p. 1515–1531, 2006.
MATOS, F. J. A. et al. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. 2 ed. Instituto
Plantarum, Nova Odessa – SP, 544 p. 2008.
MATUO, M. C. S.; Indução do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma
humano para utilização como modelo in vitro no desenvolvimento de fármacos. 2011.
110 f. Tese (Doutorado) – Curso de pós-graduação em fármacos e medicamentos.
Faculdade de ciências farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
MAYO. J. G. Cancer Chemother Rep 2. 1972 Nov; v3 n.1 p.325-30.
MEZZACA, P. I, et al.Comparative analysis of immunocritical melanoma markers in the
mouse melanoma cell lines B16, K1735 and S91-M3. Melanoma Research, 11:21-30,
2001.
MIGITA, N. A. Cultivo celular in vitro: Importância para pesquisa biomédica e
dimensão da problemática de autenticação das linhagens celulares. 2012. 69 f.
Monografia(Graduação)- Curso de Bacharel em Ciências Biomédicas., Universidade
Estadual Paulista (UNESP). Disponível em:
<https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/11449/119982/000785350.pdf?sequence=1
>. Acesso em 29 Set 2017.
NEODINI, D. N. R; GASPI, F. O. G. ANÁLISE DOS EFEITOS TÓXICOS DA
67
AVELÓZ (Euphorbia tirucalli L.)Revista Científica da FHO|UNIARARAS v. 3, n.
2/2015.
NADIN, S. B.; VARGAS-ROIG, L. M.; CIOCCA, D. R. A silver staining method for
single-cell gel assay. J. Histochem. Cytochem., v. 49 n. 9, p.1183-1186, 2001.
NICOLSON, G. L., BRUNSON, K.W., FIDLER, I.J. Specificity of arrest, survival, and
growth of selected metastatic variant cell lines. Cancer Research, 38:4105-4011, 1978
OLIVEIRA, A. P.; NEPOMUCENO, J. C. Avaliação dos efeitos genotóxicos e
antigenotóxicos do avelós (Euphorbia tirucalli) em Drosophila melanogaster. Bioscience
Journal, Uberlândia, v. 20, n. 2, p. 179-186, maio/ago. 2004. Disponível em: . Acesso em:
4 nov. 2016
OLIVEIRA, D. Padronização do Ensaio do Cometa para Análise de Células Vegetais de
Allium cepa. 2015. 57 f. Trabalho de Graduação – Curso Sistemas Biomédicos, Faculdade
de Tecnologia (FATEC), Sorocaba, 2015.
OLIVEIRA, L. A. R.; MACHADO, R. D.; RODRIGUES, A. J. L. Levantamento sobre o
uso de plantas medicinais com a terapêutica anticâncer por pacientes da Unidade
Oncológica de Anápolis. Rev. bras. plantas med. v.16 n.1 Botucatu Jan./Mar. 2014
OLIVE, P. L. & BANÁTH, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in
individual cells. 2006. Nature Protocols. v. 1 n. 1, p. 23-29, 2006.
OSTLING, O.; JOHANSON, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced
DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun., v. 123,
n.1, p. 291-298, ago. 1984.
PAZ, M.F.C.J. et a. Avaliação tóxica, citotóxica, mutagênica e genotóxica do látex da
68
Himatanthus sucuuba: uma questão de saúde pública.R. Interdiciplinar. v.6, n.1, p.52-61,
jan.fev.mar. 2013
PERON, A. P.; Avaliação mutagênica das plantas medicinais Baccharis trimera Less.
e Solanum melongena L. em células de medula óssea de ratos Wistar. 2008. Revista
Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 6, n. 2, p. 127-130, abr./jun. 2008.
PLUMEL, M.M. Le genre Himatanthus (Apocinaceae). Revisión taxonomique: bradea.
Boletim do Herbarium Bradeanu, Rio de Janeiro, v.5, supl., p.1-20, 1991.
REINHARDT-POULIN, P.; MCLEAN, J. R.; DESLAURIES, Y.; GORMAN, .;
CABAT, S.; ROUABHIA,M. The use of silver-stained ”comets” to visualize DNA
damage and repair in normal and xeroderma pigmentosum fibroblasts after exposure to
simulated solar radiation. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 71, n. 4, p. 422- 425,
2000.
REZENDE, J. R. et al. Efeito antimutagênico do látex de Euphorbia tirucalli no sistema
metionina em Aspergillus nidulans. Acta Scientiarum Biological Sciences, Maringá, v. 26,
n. 4, p. 481- 484, 2004. Disponível em:. Acesso em: 4 nov. 2016
SALDANHA, C. A. Avaliação in vitro da citoxicidade e da genotoxicidaede dos
polímeros de albumina magnéticos. 2007. 71 f. Dissertação (Mestrado). Curso de pós
graduação em biologia animal. Instituto de ciências biológicas. Universidade de Brasília,
2007.
SAMPAIO, J. et al. Estudo da genotoxicidade in vitro e in vivo após exposição aguda e
subcrônica de extratos aquosos de Ilex paraguariensis A. St.-Hil. obtidos por infusão. R.
brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 10, n. 4, p. 462-467, out./dez. 2012
SÃO PAULO.Especial 40 anos do Centro Paula Souza: Conheça a linha do tempo da
69
instituição. 2009. Disponível em:<http://www.saopaulo.sp.gov.br/spnoticias/ultimas-
noticias/especial-40-anos-do-centro-paula-souza-conheca-a-linha-do-tempo-da-
instituicao>. Acesso em 17 set. 2017.
SERAFIM, H. S. Avaliação do efeito da Janaúba ( Himatanthus drasticus) e do Avelóz
(Euphorbia tirucalli) sobre células de Melanoma Murino – B16F10 in vitro.2017. 60 f.
Trabalho de graduação – Curso de Sistemas Biomédicos, Faculdade de Tecnologia
(FATEC), Sorocaba, 2017.
SHARMA S, et al. T cell-derived IL-10 promotes lung cancer growth by suppressing both
T cell and APC function. J. Immunol. 163: 5020-5028, 1999
SINGH, N. P.; MCCOY, M. T.; TICE, R.R.; SCHNEIDER, E.L. A simple technique for
quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cells Res. 1998. 75. n.1,
p. 81- 184.
SILVA, A. C. P. et al. Toxicological screening of Euphorbia tirucalli L.: developmental
toxicity studies in rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 110, n. 1, p. 154-159, 2007.
SILVA, C. F. et al. Modelos experimentais de melanoma murino in vivo. Biosaúde,
Londrina, v. 15, n. 2, 2013.
SILVA, et al. Perfil metabólico de ratos diabéticos submetidos ao exercício físico. 2004.
Motriz. v10 n.3, p. 189-193, 2004.
SILVA, F. C. A Faculdade de Tecnologia de Sorocaba: antecedentes e primeiros anos
(1971-1981).Programa de pós-graduação em educação, Universidade de Sorocaba.
Sorocaba, SP. 2008.
70
SILVA, G. N., DE CAMARGO, E. A., SALVADORI, D. M. & RIBEIRO, D. A. 2007.
Genetic damage in human peripheral lymphocytes exposed to antimicrobial endodontic
agents.2007. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and
Endontology.104, p. 58-61, 2007.
SILVA, J., ERDTMANN, B. & HENRIQUES, J.A.P. 2003. GenéticaToxicológica.Porto
Alegre: Alcance. p. 344, 2003.
SILVA, M. I. G., GONDIM, A. P. S., NUNES, I. F. S. & SOUSA, F. C. F. Utilização de
fitoterápicos nas unidades básicas de atenção à saúde da família no município de Maracanaú
(CE). 2006. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16,p. 455-462, 2006.
SOUSA, D. M. N. et al. Avaliação da toxicidade de uma solução aquosa obtida do látex de
Euphorbia tirucalli L. em ratos. Revista Biofar, Campina Grande, PB, v. 8, n. 1, p. 25-37,
2012. Disponível em: . Acesso em: 10 nov. 2017.
TEIXEIRA, J. B.P. et al. A Fitoterapia no Brasil: da Medicina Popular à
regulamentação pelo Ministério da Saúde, 2008.
TICE, R.R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMANN, A.;
KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J.C.E.; SASAKI, Y.F.
SingleCell Gel/Comet Assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology
testing.Environmental and Molecular Mutagenesis, 35:.206-221, 2000.
TICE, R. The Single Cell/ Comet Assay: A Microgel Eletroforetic Technique for the
Detection of DNA Damage and Repair in Individual Cell. In: Phillips, D. H.; Vennit, S.
(Eds.). Environmental Mutagenesis. Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. 1995.
p. 315- 339, 1995
71
TIWARI, S.; SINGH, A. Biochemical stress response in freshwater fish Channa punctatus
induced by aqueous extracts of Euphorbia tirucalli plant. Chemosphere, v. 64, n. 1, p. 36-
42, jun. 200
VEIGA JUNIOR, V.; PINTO, A.C; MACIEL, M. A. plantas medicinais: cura
segura?. Quim. Nova, v. 28, n. 3, p. 519-528, 2004.
WACZUK, E. P. et al. Aspectos etnobotânicos, fitoquímicos, toxicológicos e
farmacológicos da Euphorbia tirucalli L.: dos riscos às possibilidades. Acta Ambiental
Catarinense, Chapecó, SC, v. 9, n. 1-2, p. 35-56, 2012. Disponível em: . Acesso em: 5 fev.
2016.
WEISBURGER, J.H. & WILLIAMS, G.M. The Distinction between Genotoxic and
Epigenetic Carcinogens and Implication for Cancer Risk. 2000.Toxicol. Sci. ed. 57 p. 4-5,
2000.
WORLD HEALTH ORAGANIZATION (WHO). The world medicines situation 2011:
traditional medicines: global situation, issues and challenges. Geneva: WHO, 2011
72
OUTRAS ATIVIDADES
73
74
ANEXO A
SOLUÇÕES
MEIO COMPLETO COM RPMI
Tabela 1- Meio completo RPMI
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
de RPMI líquido 87 mL As soluções devem ser
misturadas nas devidas
proporções dentro do fluxo
laminar evitando possíveis
contaminações
de soro fetal bovino 10mL
antibiótico 1 mL
glutamina 1 mL
MEM. 1 mL
SOLUÇÃO DE JANAÚBA 100%
Tabela 2- Solução de Janaúba 100%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 500 mL Mistura das soluções seguida
da esterilização da solução. Látex janaúba 16 gotas
SOLUÇÃO DE JANAÚBA 50%
Tabela 2- Solução de Janaúba 50%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 5 mL Realiza as soluções a partir de
diluições seriadas a partir da
solução de janaúba 100% Janaúba 100% 5 mL
75
SOLUÇÃO DE JANAÚBA 25%
Tabela 2- Solução de Janaúba 25%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 5 mL Realiza as soluções a partir de
diluições seriadas a partir da
solução de janaúba 50% Janaúba 50% 5 mL
SOLUÇÃO DE AVELÓS 100%
Tabela 2- Solução de Avelós 100%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 500 mL Mistura das soluções seguida da
esterilização da solução. Látex Avelóz 8 gotas
SOLUÇÃO DE JANAÚBA 50%
Tabela 2- Solução de Janaúba 50%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 5 mL Realiza as soluções a partir de
diluições seriadas a partir da
solução de janaúba 100% Avelóz 100% 5 mL
SOLUÇÃO DE JANAÚBA 25%
Tabela 2- Solução de Janaúba 25%
REAGENTE/SOLUÇÃO QUANTIDADE PREPARO
Água mineral 5 mL Realiza as soluções a partir de
diluições seriadas a partir da
solução de janaúba 50% Avelóz 50% 5 mL
76
ANEXO B
Solução de Lise (Estoque) - (Protocolo de SINGH et al., 1988)
Solução de Lise (Uso) – (Protocolo de SINGH et al., 1988)
77
Solução de Lise – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Solução de EDTA (A)
Solução de NaOH (B)
78
Solução de Eletroforese – (Protocolo de SINGH et al., 1988)
✓ Deve-se fazer separadas as soluções: A (EDTA) e B(NaOH).
✓ Em balão volumétrico, reagir 10 mL de solução A com 60 mL de
solução B, completando para 2L com H2Odestilada.
O pH deve ser ajustado para >13 com NaOH.
Solução de Eletroforese – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Solução de Neutralização
79
Agarose – Ponto de Fusão Normal – 1,0%
Ponto de Fusão Normal – 1,5%
Agarose – Low Melting Point (Baixo Ponto de fusão) – 0,5%
80
Agarose – Low Melting Point (Baixo Ponto de fusão) – 0,8%
Tampão PBS (livre de Ca++ e Mg++) – (Protocolo de SINGH et al.,
1988)
81
Tampão Tris- MgCl2 – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Solução Fixadora
82
Soluções de Coloração
83
Para o preparo da Solução de Coloração adicionar:
✓ 53 mL da “A”com
✓ 27 mL da “B” em cada cuba (que deve ser coberta com papel
alumínio).
✓ Misturar as duas soluções direto na cuba de coloração.
Solução de Parada