O PAPEL DA ENGENHARIA GENÉTICA NO TRATAMENTO DO DIABETES

1. DNA recombinante, a base da Engenharia Genética

A biotecnologia, processo também denominado como engenharia genética ou tecnologia do DNA

recombinante, contempla a manipulação direta do material genético das células (DNA), objetivando

alterar pontualmente características orgânicas ou introduzir novos caracteres genéticos nos seres vivos.

Por isso, o uso da biotecnologia moderna requer a identificação e isolamento de seqüências de DNA

(genes) responsáveis por expressar uma característica de interesse.

Utiliza-se a clonagem molecular a fim de isolar os genes desejados através de técnicas que induzem um

ser vivo a amplificar a seqüência de DNA de interesse. Para essa finalidade são usados vetores de

clonagem (plasmídeos bacterianos ou vírus), nos quais a seqüência de DNA de interesse é inserida. Esses

genes selecionados podem ser liberados dos vetores e – como por milagre – são incorporados através de

técnicas sofisticadas ao genoma do organismo-alvo. Esse processo é capaz de produzir um organismo

geneticamente modificado (OGM), também chamado de organismo transgênico, cuja característica

adquirida passa a ser hereditária. Na espécie humana, a clonagem é utilizada na produção de insulina que é

retirada de um gene humano e introduzida em bactérias. Essas produzem grande quantidade do hormônio que é

isolado e purificado, são utilizados por diabéticos.

Assim, a engenharia genética permite a transferência do material genético de um organismo para outro.

Ao invés de promover o cruzamento entre organismos relacionados para obter uma característica

desejada, cientistas podem identificar e inserir, no genoma de um determinado organismo, um único

gene responsável pela característica em particular.

Isto permite que as alterações no genoma do organismo sejam precisas e previsíveis, ao contrário do

melhoramento genético clássico, que consiste na transferência de genes de um organismo para outro

por meio de cruzamentos sexuais (hibridação), misturando todo o conjunto de genes dos dois

organismos em combinações aleatórias. Como conseqüência, o processo de seleção do caráter

desejado demanda uma enorme quantidade de tempo e não é exatamente preciso. Além disso, os

resultados de melhoramento clássico de animais e vegetais estão limitados à variação natural dentro de

diferentes recursos genéticos. Com a biotecnologia, virtualmente qualquer gene de qualquer organismo

pode ser isolado e transferido para o genoma de qualquer outro ser vivo por mais divergente ou distante

que seja na escala evolutiva. Sendo assim, é possível transferir para plantas, por exemplo, qualquer

gene de fungos, algas, animais, bactérias ou vírus.

2. Plasmídeos: ferramentas fundamentais na tecnologia do DNA recombinante

O DNA é o material genético que define as características de uma espécie. É pelas técnicas de DNA

recombinante que a Engenharia Genética produz os famosos produtos transgênicos. O DNA recombinante nada

mais é que uma molécula de DNA contendo sequências derivadas de mais de uma fonte. O DNA recombinante é

feito pela separação de um fragmento de DNA de interesse e sua ligação em uma molécula de DNA pequena de

replicação rápida.

Para “cortar” o DNA do organismo de interesse utilizam-se as enzimas de restrição, espécies de tesouras

biológicas que permitem cortar em pedaços o DNA (código genético de todos os seres vivos), isolando trechos

ou genes dele. Isso quebrou a barreira genética entre as espécies, tornando possível, teoricamente, a

transferência de pedaços do genoma de umas para outras. Em 1974, os pesquisadores Stanley Cohen, de

Stanford, e Herbert Boyer, da Universidade da Califórnia, colocaram isso em prática pela primeira vez,

combinando o material genético de um anfíbio com o de uma bactéria (Escherichia coli). Estava criada a

chamada técnica do DNA recombinante ou "engenharia genética", que abriu caminho para os transgênicos,

organismos que têm um gene de outra espécie inserido em seu genoma.

Existem várias técnicas de DNA recombinante. Há uma dessas técnicas que usa bactérias como vetores dos

genes que serão transferidos. As bactérias produzem fragmentos de DNA chamados PLASMÍDEOS, que podem

ser inseridos no DNA de outras espécies. Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA de cadeia dupla,

dispersas no citoplasma, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelos menos um gene que

confere resistência a antibiótico. Geralmente ocorrem em bactérias e por vezes também em organismos

eucarióticos. O seu tamanho varia entre 1 e 250 kbp (milhares pares de bases). Existem entre uma, para

grandes plasmídeos, até cinqüenta cópias de um mesmo plasmídeo numa única célula. Os plasmídeos contêm

geralmente um ou dois genes que conferem uma vantagem seletiva à bactéria que os abriga, por exemplo, a

capacidade de construir uma resistência aos antibióticos. Todos os plasmídeos contêm pelo menos uma

sequência de DNA que serve como uma origem de replicação ou um ponto inicial para replicação de DNA, e que

permite ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA cromossômico.

Os plasmídeos, portanto, são ferramentas moleculares importantes nos laboratórios de genética e bioquímica,

onde são usados rotineiramente para multiplicar ou expressar genes específicos. Os plasmídeos modificados

transformam-se em vetores do material genético e podem ser incorporados em outras células bacterianas, que

passam a constituir os chamados bancos de genes, pois cada grupo de bactérias contém um determinado gene

implantado. Outro uso importante também dos plasmídeos é a produção de grandes quantidades de proteínas.

Da mesma forma que uma bactéria produz proteínas que lhe conferem resistência aos antibióticos, também pode

ser induzida a produzir grandes quantidades de proteínas a partir do gene que nelas foi introduzido. Esta é uma

maneira barata e simples de produzir um gene ou a proteína que ele codifica - por exemplo, a insulina - ou até

mesmo antibióticos.

3. A Engenharia Genética na trilha da cura de doenças humanas

Muitas doenças humanas estão ligadas à deficiência de certas proteínas. Uma delas é o diabetes, em que

ocorre deficiência de insulina, uma proteína com 51 aminoácidos. O gene que determina a produção de

insulina pode ser incorporado no material genético de bactérias, que passam a produzi-la. É possível, então, a

obtenção de insulina em um meio de cultura. Por ser insulina humana, embora fabricada por uma bactéria, tem

maior eficácia que a insulina suína ou a bovina, habitualmente empregadas no tratamento de diabéticos, além

de não provocar reações alérgicas.

Um novo produto, resultado de recentes pesquisas biotecnológicas, é a Insulina Lispro, produzida e

comercializada pelo laboratório Eli Lilly com o nome de Humalog. Dentre outros exemplos de produtos

obtidos pela biotecnologia pode-se citar o interferon-alfa-2b e interferon-beta, o fator anti-hemofílico

empregados no tratamento da leucemia, da esclerose múltipla e hemofilia A, respectivamente, e o

hormônio de crescimento humano (somatotropina). No caso da doença de Chagas, a Fiocruz (Instituto

Oswaldo Cruz) desenvolveu um kit para diagnóstico, obtido a partir da transformação genética de

bactérias contendo genes de Trypanosoma cruzi, as quais passaram a expressar antígenos desse

parasita; as proteínas recombinantes são utilizadas no imunodiagnóstico da doença.

4. Algumas palavras sobre o Diabetes Mellitus

Um dos mais importantes processos metabólicos do organismo é a conversão de alimentos em energia e calor,

dentro do corpo.

Os alimentos são constituídos de três nutrientes principais:

Carboidratos - (digestão) -> Glicose(açúcar no sangue)

Proteínas - (digestão) Aminoácidos

Gorduras - (digestão) Ácidos Graxos

Podemos retirar energia de qualquer uma das três categorias, mas os carboidratos são c especialmente

importantes porque eles são rapidamente convertidos em glicose quando precisamos rapidamente de energia.

Entre as refeições, o fígado libera a glicose estocada para a corrente sangüínea.

Assim, mantém normais os níveis de glicose rio sangue. Para ajudar a penetração do suprimento de açúcar em

cada célula do corpo, o pâncreas envia Insulina para a corrente sanguínea, fazendo corri que o hormônio chegue

aos receptores de insulina ria superfície destas células. Só quando a insulina se liga à superfície das células é

que elas podem absorver a glicose da corrente sanguínea.

Quando o nível de glicemia (açúcar no sangue) aumenta após unia refeição, a quantidade de insulina (chamada

de insulina da hora da refeição) também aumenta para que este excesso de glicose possa ser rapidamente

absorvido pelas células. 0 fígado pára de secretar glicose e passa a estocar glicose do sangue para usá-la

posteriormente. Quando a insulina termina seu trabalho ela se degrada. 0 corpo, assim, tem que renovar

constantemente seu estoque de insulina.

O Diabetes Mellitus é uma disfunção causada pela deficiência total ou parcial de produção de insulina,

hormônio produzido pelo pâncreas. Como conseqüência a glicose não é aproveitada adequadamente pelas

células provocando sua elevação no sangue, ultrapassando as taxas normais ( 70 a 110 mg/dl ). Para entender

melhor o Diabetes, é preciso conhecer a função da glicose e da insulina em nosso organismo. A glicose é quem

gera energia para nosso organismo funcionar, mas isso só ocorre se houver insulina. Portanto a função da

insulina é garantir a entrada de glicose nas células para a produção de energia.. Quando nos alimentamos,

ingerimos vitaminas, proteínas, sais minerais e glicose ( açúcar ). Essa glicose é absorvida no intestino, entra na

corrente sanguinea e com a ajuda da insulina, penetra nas células para produzir energia e assim garantir o

funcionamento do organismo. Existem algumas formas ou tipos de Diabetes, sendo os mais conhecidos os do

tipo 1 e do tipo 2, no entanto existem ainda outros tipos como o gestacional , o provocado pelo uso de alguns

medicamentos ou provocados por doenças do pâncreas ( tumores, etc )

O Diabetes quando não diagnosticado ou se diagnosticado e não tratado adequadamente, passa a ser um grave

problema de saúde pública devido as suas complicações.

4.1. Tipos de Diabetes Mellitus

A) Diabetes tipo 1

No Diabetes Tipo 1, ou insulino-dependente, as células do pâncreas que normalmente produzem insulina, foram

destruídas. Quando pouca ou nenhuma insulina vem do pâncreas, o corpo não consegue absorver a glicose do

sangue; as células começam a "passar fome" e o nível de glicose no sangue fica constantemente alto. A solução

é injetar insulina subcutânea (embaixo da pele) para que possa ser absorvida pelo sangue.

Ainda não é possível produzir uma forma de insulina que possa ser administrada oralmente já que a insulina é

degradada, pelo estômago, em urna forma inativa. Uma vez que o distúrbio se desenvolve, não existe maneira

de "reviver" as células produtoras de insulina do pâncreas. 0 transplante de um pâncreas sadio ou, apenas, o

transplante de células produtoras de insulina de uni pâncreas sadio já foram tentados, irias ainda são

considerados em estágio experimental.

Portanto, a dieta correta e o tratamento com a insulina ainda são necessários por toda a vida de um diabético.

Não se sabe o quê causa a destruição das células produtoras de insulina do pâncreas ou o porquê do diabetes

aparecer em certas pessoas e não em outras. Fatores hereditários parecem ter o seu papel, mas o distúrbio,

praticamente, nunca é diretamente herdado. Os diabéticos, ou as pessoas com diabetes na família, não devem

ter restrições quanto a ter filhos.

B) Diabetes tipo 2

Embora não se saiba o que causa o Diabetes Tipo II, sabe-se que neste caso o fator hereditário tem uma

importância bem maior do que no Diabetes Tipo I.

Também existe uma conexão entre a obesidade e o Diabetes Tipo II; embora a obesidade não leve,

necessariamente ao diabetes. 0 Diabetes Tipo II é um distúrbio comum, afetando 2-10% da população. Todos os

diabéticos tipo II produzem insulina quando diagnosticados e, a maioria, continuará produzindo insulina pelo

resto de suas vidas.

O principal motivo que faz com que os níveis de glicose no sangue permaneçam altos está na incapacidade das

células musculares e adiposas de usar toda a insulina secretada pelo pâncreas. Assim, muito pouco da glicose

presente no sangue é aproveitado por estas células.

Esta ação reduzida de insulina é chamada de "resistência insulínica". Os sintomas do Diabetes Tipo II são

menos pronunciados e esta é a razão para considerar este tipo de diabetes mais "brando" que o Tipo I. 0

Diabetes Tipo II deve ser levado a sério; embora seus sintomas possam permanecer desapercebidos por muito

tempo, pondo em sério risco a saúde do indivíduo

C) O Diabetes Gestacional

Geralmente surge em mulheres grávidas que não eram diabéticas, onde ocorreu alteração da tolerância a

glicose em graus diversos diagnosticado durante a gestação. Geralmente, desaparece quando esta termina.

Futuramente elas podem vir a desenvolver o Diabetes tipo 2.

Outros tipos específicos de diabetes podem vir a ocorrer, mas constituem situações raras e são causadas por:

Defeitos genéticos funcionais das células Beta e na ação da insulina;

Doenças do Pâncreas;

Endocrinopatias;

Induzidos por fármacos e agentes químicos;

Infecções;

Formas incomuns de diabetes imuno-mediado;

Outras síndromes genéticas associadas ao diabetes.

4. Produção de insulina: melhoria da qualidade de vida de diabéticos

Entre as mais importantes descobertas deste final de século, uma tem destaque especial, particularmente para

milhões de pessoas em todo o mundo portadoras de Diabetes mellitus e que dependem da insulina para

estabilizar o nível de glicose no sangue. A primeira aplicação comercial da biotecnologia ocorreu em 1982,

quando a empresa Genentech produziu insulina humana para o tratamento da diabetes. Para fornecer insulina

em quantidades necessárias, o gene que produz a insulina humana foi isolado e transferido para a bactéria

Escherichia coli. As bactérias se multiplicam e crescem em tanque de fermentação, produzindo a proteína

insulina que, a partir daí, é isolada e purificada.

Com o advento da biologia molecular, via DNA recombinante, iniciou-se a era das insulinas biossintéticas

humanas, utilizadas por muitos pacientes até os dias atuais. Por meio de injeções subcutâneas em comparação

com a insulina animal, a insulina humana sintética apresenta farmacodinâmica e farmacocinética diferentes. A

insulina humana tende a ser de absorção mais rápida e de período de ação mais curto, mas com picos de ações

que ocorrem de maneira totalmente imprevisíveis. É importante citar que na prática diária, estas diferenças não

são tão significantes quando a insulina humana é usada com estratégias terapêuticas adequadas.

4. 1 Estrutura e funções

A insulina é uma pequena hormona polipeptídica constituída por duas cadeias a e b ( 51 aminoácidos)

unidas por duas pontes dissulfureto que permitem a conexão dos aminoácidos a7 e b7, a20 e b19. Uma terceira

ponte de dissulfureto na cadeia a liga os resíduos a6 e a11.

Esta hormona é fundamental para manter o nível de glucose no sangue, de forma que o cérebro,

músculos, coração e outros tecidos tenham a quantidade de "combustível" necessária para o metabolismo

celular normal. A insulina também desempenha um papel muito importante no metabolismo das gorduras e das

proteínas na circulação sanguínea. Promove, por exemplo, o transporte de aminoácidos do sangue para os

músculos e outras células. Dentro destas, a insulina não só é responsável pela promoção da absorção

intracelular de aminoácidos da circulação, aumentando a síntese proteica, como também reduz o catabolismo

(processo de quebra de proteínas dos músculos).

A acrescentar às demais funções já descritas, há participação da insulina na síntese de

neurotransmissores e no funcionamento eficaz do sistema imunitário. O cromo é um mineral muito importante no

desempenho das funções da insulina na medida em que transporta e veicula o açúcar da corrente sanguínea

para as células além de facilitar a ligação da insulina à membrana celular. Caso os níveis mínimos de cromo

estejam ausentes, a insulina é incapaz de actuar prejudicando a formação de massa muscular do organismo

( efeito anabólico ) e não reduzir a gordura convenientemente.

4.2. História

A doença que é provocada pela anormal actividade da insulina é a diabetes que embora já fosse

conhecida há dois mil anos, só nos últimos cem foram descobertas formas de a tratar e controlar. Em 1921 na

Universidade de Toronto no Canadá, Dr. Frederick Banting (cirurgião) e Charles Best (estudante de Fisiologia)

descobriram a insulina. Esta importantíssima descoberta levou a que Banting e McLeod (porque as experiências

foram realizadas no laboratório J. J.R.Macleod) recebessem o premio Nobel da medicina em 1923.

A insulina foi a primeira proteína em que foi comprovada actividade hormonal, a primeira proteína a ser

cristalizada (Abel, 1926), a primeira proteína a ser sequenciada ( Sanguer et al, 1955 ), a primeira proteína a ser

sintetizada por técnicas químicas ( Duetal;Zahn;Katsoyanis; » 1964 ), a primeira proteína foi demonstrada como

sendo sintetizada na forma de uma molécula grande precursora ( Steiner et al, 1967 ) e a primeira a ser

preparada para o uso comercial com a metodologia do DNA recombinante.

Em 1958 o cientista Frederick Sanger ( Reino Unido ) foi laureado com o prémio Nobel de Química por

ter contribuído no trabalho sobre a estrutura da insulina.

Em 1978 fez-se a clonagem do gene da insulina humana e em 1982 a insulina humana era produzida

por Engenharia Genética.

4.3.Biossíntese e extração

A insulina humana pode ser extraída do pâncreas na medida em que esta é produzida nas células b dos

ilhéus de Langerhans do pâncreas.

No processo de síntese proteica, os aminoácidos entram na ordem exacta para a formação de cada

proteína .

Como existe uma grande semelhança entre os tipos de insulina humana, suína e bovina também pode

ser extraído destes dois últimos mamíferos. A insulina suína difere num único aminoácido, substituição da

alanina ou treonina na porção b30. A bovina tem esta modificação mais as substituições de alanina por treonina

em a8 e valina por isoleucina em a10. Estas modificações não alteram a actividade biológica dos vários tipos

insulina.

Assim, através destas extracções (suína e bovina ) é possível haver terapia padrão para a diabetes

mellitus. Para o caso de indivíduos com antecedências alérgicas é produzida insulina humana .

Secção do pâncreas humano, evidenciando os ilhéus de Langerhans

4.4.Produção sintética

A insulina pode ser produzida sinteticamente através de uma técnica que consiste em modificar geneticamente a

bactéria Escherichia coli para a tornar capaz de sintetizar a hormona ausente. Deste modo a hormona é

produzida em trinta dias o que equivale a um terço do tempo necessário para a obter pelo método tradicional.

Depois é introduzido o gene da pró-insulina humana da bactéria fazendo com que o gene, precursor da insulina

activa, passe a produzir a hormona em grandes quantidades.

Cristais da hormona insulina produzida sinteticamente

As bactérias também têm DNA como material genético e produzem RNA para sintetizar proteínas. A Escherichia

coli tem um segmento de DNA que possui aproximadamente 4 a 5 mil genes. Além desse segmento possui

também porções de DNA que se denominam por plasmideos. Estes podem-se reproduzir, duplicando o seu

DNA. Deste modo quando a célula de uma bactéria se multiplica, a célula filha recebe um cromossoma e

plasmideos iguais aos da célula mãe. Os genes contidos nos plasmideos não são essenciais para a vida da

bactéria mas podem ser responsáveis pela síntese de proteínas que aumentam a resistência dessas bactérias

aos antibióticos. Estas bactérias, como já foi referido anteriormente, reproduzem-se de modo muito rápido.

Para a bactéria produzir insulina humana, ela precisa de ter o RNA específico para sintetizar essa proteína.

Nenhuma bactéria possuí DNA com informações para a síntese da insulina mas, actualmente, é possível alterar

o DNA da bactéria introduzindo segmentos de DNA humano no DNA das bactérias, através de técnica de cortar

o DNA com enzimas especificas e de refazer o DNA com outras enzimas.

Se as bactérias forem mantidas vivas e em crescimento, tornam-se verdadeiras fábricas de produtos

exactamente iguais aos que o organismo humano produz.

A produção artificial da insulina só se concretizou em 1922, pelo pesquisador canadense Frederick Banting e seu

assistente Charles Best. Isto representou um marco no tratamento da doença. Segundo o endocrinologista Leão

Zagury, ex-presidente da Sociedade Brasileira de Diabetes, ela foi usada pela primeira vez por um menino

americano chamado Leonardo Thompson, que sofria de diabetes do tipo 1, e estava condenado à morte. "Ele foi

levado pelo pai ao laboratório, bastante desnutrido, e recebeu a insulina de forma experimental.

Bibliografia Consultada

CARNEIRO, J. ; JUNQUEIRA, L. C. Biologia celular e molecular. 6. ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 1997. p.189-193.

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INSULINA. Disponível em: http://www.fiocruz.br/jovem/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?tpl=printerview&sid=5&infoid=269. Acesso em 20/03/2010

LISONI, F. C. R. Noções básicas de Engenharia Genética e Biotecnologia. Disponível em: http://www.zoo.feis.unesp.br/material-didatico/Fl%E1via%20Lisoni/Aula%201%20-20DNA%20recombinante%20%5BModo%20de%20Compatibilidade%5D.pdf. Acesso em: 18/03/2010.

MERCADANTE, C. et ali. Biologia – volume único. São Paulo: Moderna, 1999. p.145-146.

UNIVERSIDADE ANHANGUERA

UNIDERP

O PAPEL DA ENGENHARIA GENÉTICA NO TRATAMENTO DO DIABETES

(Trabalho apresentado como forma de aproveitamento à

disciplina Biologia e Bioquímica, sob a responsabilidade do Prof.

MSc André Silveira, do Curso de Educação Física da

Universidade Anhanguera/Uniderp)

Discente: Joníferson Corvalan Rodrigues

RA: 3004935197

Bacharelado em Educação Física Turma : N102

Campo Grande/MS2010

UNIVERSIDADE ANHANGUERA

UNIDERP

O PAPEL DA ENGENHARIA GENÉTICA NO TRATAMENTO DO DIABETES

Discente: Joníferson Corvalan Rodrigues RA3004935197 Turma N102

Campo Grande/MS2010

O PAPEL DA ENGENHARIA GENÉTICA NO TRATAMENTO DO DIABETES