Tecnologia do DNA recombinante

QBQ 0102 – Educação Física Carlos Hotta

18/06/13

A Tecnologia do DNA recombinante

• A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos

1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de Salmonella

Polimerase Chain Reaction

Gel de agarose• O DNA é negativo e é atraído pelo pólo positivo do aparato;• A malha de agarose atrapalha a migração de moléculas maiores, que acabam migrando

mais devagar no gel;• O DNA é visualizado com marcadores fluorescentes e o tamanho produzido é estimado

com a adição de marcadores com o tamanho conhecido.

Plasmídeos

• Plasmídeos são DNA circulares, muito menores que um cromossomos circular, que podem complementar as sequências do genoma da bactéria

• Plasmídeos são capazes de se auto-replicar e podem apresentar múltiplas cópias em uma só célula

• Plasmídeos geralmente possuem: origem de replicação, um local de múltiplos sítios de restrição, um gene de resistência a antibiótico

Enzimas de restrição cortam o DNA• Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em

sequências específicas

• Geralmente reconhecem palíndromos no DNA

• Não nomeadas de acordo com seu organismo de origem -> Escherichia coli

Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou pontas cegas

Há centenas de enzimas de restrição diferentes

Ligação

Transformação

• Bactérias podem incorporar um plasmídeo por choque térmico ou eletroporação

• No choque térmico há a incorporação de DNA após um tratamento rápido a 37oC a 42oC.

• Na eletroporação, um pulso de alta voltagem faz com que a memebrana da bactéria permita a entrada dos plasmídeos.

Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?

A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA

• A transcriptase reversa nos permite tornar o RNA novamente em DNA (cDNA)

• O cDNA é mais estável que o RNA e pode ser usado em reações de PCR

• Geralmente as sequências obtidas são de RNA maduro

Animais e plantas transgênicas

• Transgênicos são organismos que tiveram seu genoma alterado utilizando-se a tecnologia do DNA recombinante

• A agricultura convencional vêm introduzindo genes novos nos organismos faz anos

Como se gera animais transgênicos?

A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferir sequências definidas para o genoma das plantas

Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos

Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de replicação

Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores fluorescentes

• Automatização permite sequenciar 96 sequências por vez, 8 a 12 vezes por dia

• 96 x 10 x 1000 = 960 mil pb por dia!

Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção de milhões de sequências simultâneas

• Pode-se obter o mesmo número de sequências que no Projeto Genoma em questão de dias

• Existem diversas técnicas envolvidas que geram diversos tipos de sequências (de 50 pb a 10000pb) em diversas quantidades (de milhares a centenas de bilhões)

• Como analisar?

• A busca é a do genoma humano por U$1000 -> cada pessoa no planeta pode ter seu próprio genoma sequenciado!

• Por quê sequenciar?

O 454 é um (velho) sequenciador de nova geração

O pirosequenciamento mede a luminescência produzida quando um deoxinucleotídeo é incorporado

O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e sequenciar milhões de sequências em paralelo