TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTESECRETARIA DO ESTADO DA EDUCAÇÃO, DA CULTURA E DOS DESPORTOS - SECDUNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE - UERNFACULDADE DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – FANATDEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – DECBDISCIPLINA: GENÉTICA BÁSICA

CONCEITOS BÁSICOS

• Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da década de 70 quando foram descobertas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição.

• Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA, considerando seqüências específicas, com a perpetuação de tal seqüência in vivo.

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

VETORES DE CLONAGEM

DNA LIGASE

CÉLULA HOSPEDEIRA

SELEÇÃO

CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR

• A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana.

• A técnica central do DNA recombinante é a clonagem molecular

• Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas.

• Estágios da Clonagem molecular

VetorrDNA

recombinanteTransformação

transformante ou célula

transformada Inserto

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

• Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias.

• Função: reconhecer e clivar um DNA estranho.

• Sistema de restrição e modificação.

Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e propagar o DNA recombinante:

• Endonucleases de restrição.

• DNA ligases

• Existem três tipos de endonucleases de restrição: I, II e III;

• I e II geralmente grandes complexos com múltiplas subunidades contendo tanto a atividade endonucleásica como metilase; sua clivagem é aleatória;

• III cliva o DNA a cerca de 25pb da seqüência de reconhecimento.

Há 2 tipos distintos de clivagens: • Extremidades abruptas: os dois cortes

ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica.

• Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.

• EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI.

• Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

INTERESSE

IMPORTÂNCIA

FAMÍLIA ÚNICA DE FRAGMENTOS

DNA LIGASE

• Promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição.

Junção de duas fitas de DNA

A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias deDNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia

CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE

Ela atua na clonagem molecular unindo o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento.

A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA

Fragmentos de DNA

• Fragmentos com extremidades coesivas;

• Fragmentos com extremidades não coesivas;

A. Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3’ de um fragmento de DNA, e polidesoxitimina na extremidade 3’ de um outro fragmento de DNA;

B. Adição de adaptadores às extremidades não coesivas.

CLONAGEMFragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).

Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.

TRASFORMAÇÃO BACTERIANA

TRANSFORMAÇÃO INDUZIDA

CAPTAÇÃO DO DNA

CLONAGEM

- As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio seguido de um choque térmico de curta duração.

- Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico.

Vetor - Conceito

• Um vetor pode definir-se como um agente capaz de promover uma ou mais etapas no processo global de transferência de material genético.

• Plasmídeos• Bacteriófago λ• BACs

VETORES UTILIZADOS EM ANIMAIS

LipossomosRetrovírus ( integram seu DNA ao do

hospedeiro)Adenovírus Microinjeção pronuclearTransferência de genes por bombardeamento

de partículas (biobalística)

LIPOSSOMOS (in vitro)

MICROINJETADOS

TODO ESSE PROCESSO É INDUZIDO

TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO

VETORES RETROVIRAIS

• Transcriptase reversa (RNA – DNA) e integrase;• Retrovírus: seqüências

LTR e ψ e gene exógeno;• Vírus assistentes

Genes gag,pol e env( sem ψ – requerida para o empacotamento )

MICROINJEÇÃO EM PRONÚCLEO

PIPETA MICROCAPILAR MICROSCÓPIO INVERTIDO

IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DESSA TÉCNICAS

• O fim da seleção artificial

• Xenotransplante

• Biorreatores

• Terapia gênica

QUESTÕES RELACIONADAS COM A TRANSGENIA

• Bioéticas

• Ecológicas

• Econômicas

• Científicas