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TÉCNICAS EM NUTRIGENÉTICA E NUTRIGENÔMICA

Augusto Schneider Faculdade de Nutrição

Universidade Federal de Pelotas

TÉCNICAS EM ESTUDOS DE NUTRIGENÉTICA

Coleta de amostras Pop. Saudável vs. Pop. Alvo

Extração de DNA

Checagem Quantificação Reação de PCR Análise RLFP

Array SNPs Densidade?

Uso de ferramentas de bioinformática

Variedade de tecidos

TÉCNICAS EM ESTUDOS DE NUTRIGENÔMICA

Coleta de amostras Pop. Alimento vs. Pop. Controle

Extração de RNA

Checagem Quantificação Separação do RNAm

Array Expressão

Uso de ferramentas de bioinformática

Tecido alvo é importante

Real time PCR

EXTRAÇÃO DE DNA

Princípio: romper a célula, eliminar resíduos celulares e precipitar o DNA

EXTRAÇÃO DE DNA

Princípio: Com a célula rompida o sal adicionado e o álcool precipitam o DNA. Molécula de DNA é polar e se dissolve em água … alcool diminui polaridade

O DNA é estável armazenado na

geladeira ou mesmo TA por longos períodos

EXTRAÇÃO DE RNA

Princípio: Coleta do tecido de interesse … ao contrário do DNA o RNAm é tecido específico

RNA é altamente instável – RNAses Coleta deve ser rápida e passar imediatamente para ultrafreezer

EXTRAÇÃO DE RNA

Princípio: Método de extração Tiocianato de Guanidina-Fenol-Clorofórmio (Trizol®) Amostras devem ser mantidas a baixa temperatura durante a ruptura

Após ultracentrifugação

Precipita fase aquosa com álcool

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Reação em cadeia da polimerase: Funciona como uma replicação in vitro São adicionados todos os ingredientes para o funcionamento da DNA polimerase 1. Água 2. MgCl2 3. Tampão 4. dNTPs (A, T, C, G) 5. Taq DNA Polimerase 6. Primers 7. DNA

Termociclador: controle da temperatura

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Animação PCR

GEL DE AGAROSE

GEL DE AGAROSE

Marcador Peso conhecido de DNA

Moléculas menores migram mais

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Reconhecem uma sequência específica de DNA Que é então cortada pela enzima

TÉCNICA DE RFLP

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição

PCR da região de interesse (gene alvo) +

Digestão com enzimas de restrição +

Eletroforese em gel de agarose

TÉCNICA DE RFLP

1000 pb

400 1000

800

600

400

200

NC AA aa Aa

400 600

AluI

SEPARANDO O RNA MENSAGEIRO

Cauda poli-A

AAAAAAAAAAAAAAAAA-------------------------- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAAAAAAAAA-------------------------- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

Transcriptase Reversa

AAAAAAAAAAAAAAAAA-------------------------- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT---------------------------

RNAm

cDNA

Adicionar uma RNAse para se livrar do RNA deixando uma fita simples de DNA

Adicionar

Primer poli(T)

QUANTIFICANDO O RNA MENSAGEIRO


Quanto mais no início Mais é amplificado


Controle interno Expressão não varia

Beta-actina GADPH

18S RPS9 Etc…


SYBR Green se liga e fluoresce quando há DNA dupla fita

Animação SYBR Green


SYBR Green se liga a cada ciclo de extensão quando há DNA dupla fita

Medição na fase exponecial

Quanto mais tarde começa a ampificação menor o nível de RNAm

SEQUENCIAMENTO DE DNA

ARRAYS

Chips – Microarrays Contendo: - 500.000 SNPs - 50.000 transcritos de mRNA

ARRAYS

RNA-Seq

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