ÍNDICE PÁGINA

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA 02ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02EXAME DE GOTA ESPESSA 03CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) 04CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) 05MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA 06HEMATÓCRITO 06HEMOGLOBINA 07VCM - HCM - CHCM 07MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08RETICULÓCITOS 09DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS 10MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) 12PESQUISA DE CÉLULAS LE 12TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) 13PROVA DO LAÇO (PL) 14RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) 14TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) 15TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18TEMPO DE TROMBINA (TT) 19 TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19DOSAGEM DE FATOR V 21PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA 23PROVA DE FALCIZAÇÃO 25TESTE DE ITANO 25DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35TIPAGEM ABO EM TUBO 36TIPAGEM Rh EM TUBO 37PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) 38TESTE DE COOMBS DIRETO 39ELUATO 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA

A. MATERIAIS = - Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA - Lâminas de vidro de 24x76 mm; - lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina- com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm- deixar secar na horizontal sobre a bancada- identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data.- Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO

A . MATERIAIS- sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro

B . PROCEDIMENTO- colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos- aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio- fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA .

A .MATERIAIS- amostra de sangue total em EDTA- lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada

B .PROCEDIMENTO- colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina- esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC- corar com Giemsa por 30 min.- transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min- deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )=

Céls./mm3 = no. células contadas x 1 / área x 1 / altura x diluição (Área em mm 2 e altura em mm)

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)

A) MATERIAIS- tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL- câmaras de Neubauer espelhadas;- lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ]

Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) 625 mg Ácido acético glacial 1,66 mL Água destilada 10 mL B) METODOLOGIA– pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200)– agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos– colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara– cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos– ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2

– calcular segundo a fórmula :

N o . Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = n o . Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS

A) MATERIAIS- tubos de hemólise; - micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL- câmara de Neubauer espelhadas - Solução diluente de Turk

Ácido Acético Glacial PA 150-200 μLVioleta genciana ou Azul de Metileno 100 μLÁgua destilada qsp 10 mL

B) PROCEDIMENTO- pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 )- misturar por inversão, por 2 minutos; preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL)- deixar sedimentar por 3 minutos; contar todas as células dos 4 quadrados externos, com objetiva 40 x- Leucócitos / mm3 = no. x ¼ x 1/ 0,1 x 20 = no. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3

4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite)

A) MATERIAIS- ST com EDTA ; - micropipetas de 10 µ l; - tubos de ensaio;- câmaras de Neubauer espelhadas;- solução diluente

oxalato de amônio 100 mgAD 10 mLAzul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL)

guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados- BM a 37oC, placa de Petri, algodão

B) PROCEDIMENTO- Pipetar 1000 µ L, tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra; homogenizar; preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL)- sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD)- contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja, todo o quadrado central de 1 mm2), com objetiva 40x- PLAQ/ mm3 = no. x 1 x 10 x 100 = no. plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3

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5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA

MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto)- preparo do esfregaço do hemograma normal- contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente :

exemplo = se em 1000 hemácias ------------ 80 plaquetasem 4.000.000 hemácias / mm3 ----------- x

6. MORFOLOGIA DE PLAQUETASMorfologia normal =

1 – 3 μm de diâmetro, granulação fina azurófila no citoplasmaVPM (fl) = 6,20 – 11,55 [181]PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15,3 – 19,5 [181]

Alterações do Tamanho =1. Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas :

de 4 – 8 μm de diâmetro, indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO)

2. Plaquetas Gigantesdo tamanho de Hc ou linfócitos, isto é, > 8 – 10 μm

3. Microplaquetas< que 2 μm, na maioria delas, achado encontrado na rara doença de Wiskott - Aldrich

Alterações da Forma =1. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 . Satelitismo Plaquetário

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7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA)

7.1 HEMATÓCRITO

A) Micrométodo

-MATERIAIS : - tubo capilar para microhematócrito- sangue total (ST) com EDTA- lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar - Centrífuga de microhematócrito

- TÉCNICA :- encher o capilar com ST até a 1 cm da borda- fechar a extremidade vazia com calor/massa, sem atingir a coluna de Hemácias- centrifugar com a extremidade fechada para fora, a 11000 rpm / 5 min.- leitura no gráfico (acompanha as centrífugas)- Ht = ___ %

7.2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA

MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINAA . MATERIAIS- tubos de ensaio 75 x 100mm, - solução de Hb padrão comercial- reagente de cor (solução de Drabkin)- espectrofotômetro,- micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro, de 5 mL

B . METODOLOGIA- pipetar 2,5 mL da solução de Drabkin em tubo, pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes; - homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos- ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo)- empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco”

Obs : Cálculo do Fator :Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância

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Calculado o Fator, faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g %

7.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM)Relação entre Hc e Ht; volume médio de cada Hc

VCM = Ht (%) x 1000 ou = Ht(%) x 10 VR = 84 - 96 µ m3 ou fl(10-15)

Hc (x1012 / L) Hc (x106 / mm3) 82,5 – 97,4 [181]

7.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM)

Quantidade média, em peso, de Hb em cada Hc

HCM = Hb(g%) ou = Hb (g%) x 10 VR = 27 - 32 pg(10-12) Hc(x1012 /L) Hc (106 /mm3) 26,4 – 32,2 [181]

7.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM)concentração de Hb na Hc, exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a %

da Hc que existe como Hb”)

CHCM = Hb(g%) x 100 VR = 30-35 g / dl 31,4 – 33,8 [181] Ht(%)

8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS

MATERIAIS =- lâmina de hemograma corada;- óleo de imersãoTÉCNICA =- olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço- na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço, em objetiva de 100x, observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço, onde pode haver distorção das células)

VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas

a) Alterações do tamanho = - Normocitose - Microcitose - Macrocitose - Anisocitose

b) Alterações da cor (teor de Hb) = - Normocromia- Hipocromia

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- Hipercromia - Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia

c) Alterações da forma = - Poiquilocitose- Esferocitose- Eliptocitose

Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos - Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) - Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) - Hemáceas crenadas ou Equinócitos- Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas - Drepanócitos ou hemáceas falciformes - Ovalócitos- Estomatócitos- Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos - Rouleaux - Aglutinação de hemáceas

d) Presença de inclusões eritrocitárias - Ponteados basófilos- Corpos de Howell-Jolly - Anéis de Cabot- Eritroblastos- Hematozoários

9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS

MATERIAIS=- lâminas de vidro 24 x 76 mm, tubos de hemólise- micropipetas de 20 µ L- amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C- solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg

NaCl PA _____________________ 850 mgcitrato de sódio. 2H2O __________ 40 mgAD _______________________ qsp 100 mL

METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= - colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise- deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos- ressuspender com agitação suave, fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço, com objetiva de 100, campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e , ao mesmo tempo, marcar quantos reticulócitos foram vistos

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EXPRESSÃO DOS RESULTADOS :

a) como % de células = se em 1000 Hc 30 Retem 100 Hc y Ret

RET = 3 %

b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente, em mm3se em 1000 Hc 30 Retem 4.150.000 Hc / mm3 y Ret RET = 124.500 / mm3

c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x %

Ht normal

d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) =leva em conta, além da correção pela anemia, o tempo que o Ret permanece na circulação

(em dias), que é diretamente proporcional ao grau de anemia. Os estudos de ferrocinética de Hillman , em 1985, mostraram que, quando a eritropoiese é

muito estimulada em relação à anemia, os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais, há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0,8 – 1 % das Hc / dia.

Ht (%) Index (dias)> 40% 1,030 - 40 % 1,520 - 30 % 2,010 - 20 % 2,5

IPR = % RET / index

10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS

- feito o esfregaço corado com Leishman , olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra- passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão), e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda)- observar as alterações qualitativas dos leucócitos

Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço):

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- Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro, porque cada tipo

celular é um sistema separado, com suas próprias funções, mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças, não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2,4,7,62,481]

- em valores absolutos : x células / mm3- em valores percentuais : x %

- Fórmula Leucocitária =é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos, podendo ser absoluta (no. /

mm3) ou relativa (%). Por convenção, anota – se na seguinte seqüência :

MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO , isto é,

(mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos)

ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS :

1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS =- Neutrofilia ou Neutrocitose - Neutropenia ou Neutrocitopenia - Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado- Reação Leucemóide - Reação Leuco-Eritroblástica - Hiato Leucêmico - Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita)- Hipossegmentação Nuclear - NO necrobióticos - Hipogranulações Citoplasmáticas - Granulações Tóxicas - Vacuolizações

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- Bastões de Auer - Corpos de Dohle

2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS- Eosinofilia - Eosinopenia ou Anaeosinofilia - Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas - Granulações bsofílicas

3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS- Basofilia - Basopenia

4 ) LINFÓCITOS- Linfocitose - Linfopenia ou Linfocitopenia - Linfócitos Atípicos - Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells)

5 ) MONÓCITOS- Monocitose - Monocitopenia - Inclusões Anormais - Vacuolizações Citoplasmáticas

11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS)

MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ :

MATERIAIS =- ST com EDTA- Pipetas de Westergreen; - pera- Suporte para pipetas Westergreen

METODOLOGIA =- Homogenizar a amostra e encher, com auxílio da pera, a pipeta de Westergreen, até a marca superior 0;

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- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas

12-PESQUISA DE CÉLULAS LE

MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO :

1. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO; deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas2. separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min./5000 rpm; reservar3. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro4. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. passar o filtrado, recolhido em vidro de relógio, para um tubo B, e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos6. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L7. passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A8. homogenizar manualmente ou no vórtex9. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos; 10. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11. aspirar e desprezar o sobrenadante; homogenizar o sedimento; fazer esfregaços e corar com Leishman12. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x, contando 500 neutrófilos

se > 5 células LE / 500 NO (>1%), sugestivo de LESse < 5 células LE / 500 NO (<1%), sugestivo de outra doenças

13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS)

MATERIAIS :- lancetas para punção digital; - papel de filtro;- cronômetro- algodão; álcool para antissepsia- esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy)

MÉTODOS :

1 . IVY [260]

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- recomendado pela ICSH, descrito em 1941- fazer antissepsia com algodão embebido em álcool- punção na face volar lateral do antebraço., 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo - o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção- escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais - fazer 2 incisões de +- 5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos )- absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “, sem encostar no coágulo plaquetário

VR = 1 a 7 minutos

2 . DUKE [260]- descrito em 1912, a punção é feita no lóbulo da orelha, com uma incisão de +- 4 mm de extensão em sua

borda, com cerca de 3 – 4 mm de profundidade- haveria melhor correlação clínica, embora seja tido como menos sensível

VR = 1 a 4 minutos

3 . DUKE MODIFICADO- a punção é feita na polpa digital, estando mais sujeito a falsos resultados, pela maior sensibilidade a

vasoconstricção ou vasodilatação (febre, temperatura ambiente , ansiedade ou medo do paciente)

VR = 1 a 3 minutos

14 - PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE)

MATERIAIS :- Esfigmomanômetro adulto ou infantil- Cronômetro

MÉTODO : ( Rumpel – Leed )- medir a PA do paciente

- calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD3

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- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço , abaixo da prega do cotovelo- inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos- contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62)

Interpretação = até 5 = negativo 6 a 10 = duvidoso 10-50 = + >50, até o dorso da mão = ++ >70, 2 a 4 mm = +++ incontáveis, >5 mm = ++++

17 - TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC)

MATERIAIS =- tubos de ensaio 75 x 100 mm- BM a 37 oC- Tubo de hemograma (EDTA)- pipetas graduadas

METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) =- colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase)- após coagulação, deixar o tubo no BM por até 2 horas- determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira- após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o

restante da amostra, no tubo original- medir com pipeta graduada o volume de soro restante- calcular

% retração = volume de soro x Ht teste volume do ST Ht normal VR = 40 – 60 %

18 - TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5,6,62,71]

MATERIAIS =- 3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados- banho-maria a 37 o C- amostra de sangue total colhido sem anticoagulante

MÉTODO (Lee – White , descrito em 1913) =- identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62)

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- colher 4 – 5 mL de ST, com o menor trauma possível, e colocar 1 mL em cada tubo, pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual)

- disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) .

- incubar a 37 o C- de minuto a minuto, observar o 1º tubo , por inversão lenta, até que o sangue coagule (marcar o tempo)- passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos, e após a coagulação deste, o 3 º tubo- anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética

VR = tubos de vidro = 6 – 12 min. tubos siliconizados = 20 – 30 min.

19 - TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP)

MATERIAIS = ST colhido em tubo citratado; centrífuga de soro; tubos de ensaio BM a 37oC Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI ou similar) cronômetro

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alça de metal, para detectar a formação do coágulo

METODOLOGIA (Método de Quick modificado)=1. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril, no volume indicado no frasco.

Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea; agitar o frasco antes do uso

2 . separar o PPP, centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos3. se não realizar imediatamente, deixar o PPP a 4oC até a realização do teste4 . em tubo de hemólise , colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos, pelo menos, a 37oC5 . colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo, incubar por dois minutos também6. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro6 . após a leitura em segundos, olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE, para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI

VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11,5 A 13,5 SEGUNDOSAvaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de APRelação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1,25Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1,00 a 1,40

ISI ISIRNI = R = TAP paciente

TAP normal

TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11,5 – 13,5 segundos

20 - TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA)

MATERIAIS =1. idem TAP2. Cefalina comercial (Cefamat ou Replastin ou Hemostat ou similar) 3. CaCl2 solução a 0,25 M (estoque) ou a 0,025 (pronta para uso)

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METODOLOGIA =2. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril, no volume indicado no frasco. Deixar

dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea, agitar o frasco antes do uso3. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos4. se não realizar imediatamente, deixar o PPP a 4oC até a realização do teste5. preparar a solução de CaCl2 para uso (0,025 M), diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10.

Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso6. em tubo de hemólise em BM, colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina ; incubar por 3 minutos7. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0,025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro

VR = 26 a 35 segundosRelação = TTPA paciente de 0,9 a 1,25

TTPA normal(teste)

TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos

21 - PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO

Método de Howell ou Método da Mistura de Soros =

1. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1,25, fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal)

2. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP)3. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2)

VR = se R paciente > 1,25 = presença de inibidor normal

se R paciente < 1,25 = deficiência de fator e ausência de inibidornormal

Obs.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1, mas aumentam com a mistura M2

22- DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO

1. MÉTODO DE CLAUSS (1957)

MATERIAIS=- amostra de ST em tubo citratado - centrífuga de soro, BM a 37o C, cronômetro- reagentes :

1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL);

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2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia, segundo o fabricante)- plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit

METODOLOGIA =- centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas

(PPP)- reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante); deixar à temperatura ambiente de

20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).- Homogenizar suavemente antes de usar.- diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos- misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no

cronômetro. - calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit, onde o resultado em segundos será

convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K, pré - determinado pelo fabricante, sendo que a concentração de FIB. será = K x n, onde n é a diluição do PPP usada (10). Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido)

23 - TEMPO DE TROMBINA (TT)

MATERIAIS =1 . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio, diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2. Tampão do mesmo kit3. PPP citratado4 . tubos de ensaio5 . centrífuga de soro6 . BM a 37o C

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7 . cronômetro

METODOLOGIA (método de Caen) = [5,6,62]1. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar2. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM3. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro4. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo5. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas6. não deixar a solução de trombina a 37o C

VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1,25

24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA

MATERIAIS =1. PPP citratado2. solução salina tamponada pH 7,3

a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1,94 gdietilbarbiturato de sódio 2,94 gAD qsp 100 mL

b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0,1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL

3. solução de CaCl2 M/10 = 1,37 mL de CaCl2 1,8 M em 100 mL de AD 4. Ácido acético 1 % = 0,1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD, ajustando o pH para 5,2 com ácido acético a 1 %

24.1- Método de Bloom (1961) [141]=1. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0,5 mL de PPP + 0,1 mL de ácido acético 1 %2. homogenizar e incubar a 4o.C por 30 minutos3. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão, enxugando as paredes do

tubo com lenço de papel4. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado5. centrifugar novamente como no item b)6. pipetar 0,5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado7. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0,5 mL do CaCl2.8. quando formar o coágulo, disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos; após o

início da lise observar a cada 5 minutos.

20

9. anotar o tempo de lise total do coágulo; a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina

VR = 90 – 180 minutosObs.:- as variações fisiológicas são acentuadas, segundo atividade, alimentação, cuidados na coleta. Só levar em

consideração os grandes encurtamentos.- Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 - 30 minutos - O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do

precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93])

- A heparina não precipita na fração euglobulínica- A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio

24.2- Método de Nilsson, (1978) [5] =1. PPP citratado mantido a 4o C2. solução de ácido acético 0,025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3. tampão salina barbital pH 7,38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2,1 m L de HCl 0,1 N, diluídos em AD qsp 10 ml4. Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina), preparar na hora

- misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5,9 – 6,0 (PASSO FUNDAMENTAL)

- misturar e incubar 30 min. / 4o C- centrifugar 2000 rpm / 5 min.- descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo- dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml; incubar 37o C / 10 min.- adicionar 500 l da solução de trombina e, após a formação do coágulo, disparar o cronômetro- checar a lise do coágulo a cada 15 minutos

VR = 70 – 300 minutos

25 . DOSAGEM DE FATOR V

I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5]Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1,34 g

21

AD 100 mL

1. Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio2. Centrifugar por 10 minutos a 3.000 rpm para obtenção do PPP3. Fazer pool de plasmas normais oxalatados4. Incubar em BM 37o C por 24 horas5. Checar o TAP, que deve estar entre 60 - 80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se >

80, desprezar e preparar outro)6. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL

METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal, na mesma técnica para dosagem de fator VIIIao trabalhar com a amostra-teste,

PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS

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26. ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA

Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8,6

23

MATERIAIS = 1. cubas de eletroforese, fonte geradora de voltagem2. tiras de acetato de celulose3. papel de filtro ou Perfex, aplicador, estufa a 60 – 70o C4. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 %

REAGENTES = 1. Solução tampão tris-EDTA-borato 0,025 pH = 8,6tris-hidroxi-metilamina 10,2 g + EDTA 0,6 g + Ácido bórico 3,2 g + AD qsp 1000 mL

4. Solução Corante (Ponceau)Ponceau S 0,5g + Ácido tricloroacético 5,0 g + AD qsp 100 mL

3. Solução DescoranteÁcido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL

4. Solução TransparentizadoraÁlcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL

5. SF 0,9 %

METODOLOGIA (método de Kohn) =1. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante)2. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba;3. embeber o acetato de celulose na solução tampão, previamente, em outra cuba, por pelo menos 10 –

15 min.;4. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão, sem deixa-lo

totalmente seco) e colocar no suporte da cuba, em posição reta e esticada, tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex, mergulhada na solução tampão;

5. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador, a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo);

6. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra;7. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida, desligar a fonte;8. analisar o fracionamento inicialmente sem corar;9. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min.;10. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante;11. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min., agitando-a cuidadosamente, e

deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural;12. fazer a transparentização, deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min., e depois por 3

min. na solução transparentizadora;13. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C, até sua

transparentização (alguns minutos);14. Remover as fitas e colar no laudo do paciente

PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb :

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- existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra- se usadas Hc não lavadas, as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais- se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4, é tecnicamente mais demorado, e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas- se usado KCN, não deve ser feita coloração nas tiras- uso de AD é o método mais puro, e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis- pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas, em congelador (controles, por

exemplo). - Ao usar hemolisados congelados, recentrifugar antes de usar.

1. Técnica do Clorofórmio = [13]1. amostra com heparina ou EDTA2. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min.3. lavar as Hc por 3 vezes com SF4. um volume de Hc. Lavadas + dois volumes de AD, agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise

completa5. adicionar um volume de clorofórmio 6. agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min.7. transferir o sobrenadante para o outro tubo8. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar, se houver a formação de precipitados no tubo,

deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm9. ST são estáveis a 4o C, desde que mantidos estéreis10. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C

2. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143]Indicada para toda eletroforese de Hb, para poder detectar Hb H, o que não é possível com o uso de

clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143]AD 100 ml

- para 100 μl de ST, colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2%

- homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado; está pronto para uso, não pode ser guardado.

Obs.: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos)OBS.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%; se necessário, dosa-la no hemolisado; Regra Prática =

Se Ht paciente vol. ST vol. Sol. hemolisante> 40 % 1 2 – 330 – 40 % 1 1< 30 % 2 1

27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO

MATERIAIS =

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1. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL, preparar antes de fazer o esfregaço2. amostra de ST colhido com EDTA1. lâminas e lamínulas de vidro2. esmalte de unhas ou Entellan3. placa de Petri, algodão e AD

METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948)

1. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 %2. colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina3. colocar a lamìnula sobre a gota de sangue, ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar4. retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro5. vedar as bordas da lamínula com o esmalte6. deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas, em lugar fresco, à temperatura ambiente7. ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação

28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO)

MATERIAIS =1. tubos de vidro 12 x 75 mm, pipetas2. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33,78 g + K2HPO4 anidro 59,33 g + Saponina 2,50 g + AD qsp 250

mL3. ditionito de sódio (Na2S2O4)

METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] =1. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste)2. acrescentar 20 µ L da amostra de ST3. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos4. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais5. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S

se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S

29. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2

26

MATERIAIS =1. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8,0 – 9,02. espectrofotômetro3. tesoura

METODOLOGIA =1. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio4. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2,5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4,5 – 5,5

cm de largura5. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos, observando visualmente a separação da Hb A2 das

demais; terminada a corrida eletroforética, cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1, sem coloração, colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD

6. deixar eluir por 2 horas, agitando os tubos a cada 15 minutos7. ler, em absorbância de 415 nm, acertando o zero com AD8. calcular

Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 1005 x DO Hb A1 + DO Hb A2

VR = 2,0 – 3,7 %

30. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL

27

MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey)

MATERIAIS :1. Solução NaOH 0,083 N(N/12) NaOH 332 mg

AD 100 ml2. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml

(solução de uso) AD 800 mlHCl 10 N 4 ml

3. Hidróxido de Amônio 0,04% NH4(OH)2 4 mlAD 1000 ml

4. espectrofotômetro 5. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 - 500 µ L6. cronômetro, papel de filtro Whatmann ou similar7. tubos de hemólise 13 x 100 mm, funis pequenos (3-4 cm de diâmetro)

METODOLOGIA :1. Colocar 4 tubos em fila (A,B,C,D)2. Pipetar inicialmente 3,2 ml de NaOH 0,083 N no tubo A3. Separar o tubo B para o filtrado4. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C5. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D6. Pipetar 0,2 ml do hemolisado no tubo A, misturar bem; após exatamente 1 minuto acrescentar 6,8 ml de SAS 50%; misturar e deixar em repouso por 20 minutos7. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo8. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C, misturar e transferir 50 μl para o tubo D9. Ler a absorbância em 415 nm, acertando o zero do aparelho com água destilada

10. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B)Leitura do Padrão (D)

VR = < 1,0% (ADULTOS)

31. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA

28

MATERIAIS = 1. solução fisiológica, AD;2. Espectrofotômetro, tubos de ensaio3. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue)

4. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7,4 = SOLUÇÃO ESTOQUENaCl P.A. 90 g OBS.: é importante controlar o pH para 7,4NaH2PO4.2H2O 2,43 g pois cada diminuição de 0,1 equivale a Na2HPO4 13,65 g diminuir a tonicidade da solução de NaClAD qsp 1000 mL em 0,1 g/L

5. solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO)solução estoque 10% 25 mLAD qsp 250 mL

METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie, 1960)=

1. coletar ST do paciente e controle normal2. diluir a SF 1% como indicado na tabela

TUBOS NaCl 1% AD conc. HEMÓLISE (mL) (mL) NaCl(%) (%)

1 10 0,0 1,00 0 2 8,5 1,5 0,85 0 3 7,5 2,5 0,75 0 4 6,5 3,5 0,65 0 5 6,0 4,0 0,60 0 6 5,5 4,5 0,55 0 7 5,0 5,0 0,50 0 a 5 8 4,5 5,5 0,45 5 a 45 9 4,0 6,0 0,40 50 a 90 10 3,5 6,5 0,35 90 a 99 11 3,0 7,0 0,30 97 a 100 12 2,0 8,0 0,20 100 13 1,0 9,0 0,10 100 14 0,0 10,0 0,00 100

3. transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados, e trabalhar com a metade da diluição (2,5 mL em cada tubo = para o controle e o teste)

4. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo , homogenizar por inversão 5. deixar em repouso por 30 minutos em TA6. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279](transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo, sem ressuspender o depósito, e pingar 2 gotas de NH4OH 1%, misturando-se por inversão [279])7. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm

29

8. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise)9. o tubo 14 representa o 100% de hemólise10. calcular

% hemólise = DO sobrenadante cada tubo x 100cada tubo(1-13) DO sobrenadante tubo 14

VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0,45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0,30 % de NaCl)

OBS.:1. no teste com incubação por 24 horas, incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas, sendo que a esterilidade é fundamental. Neste, não pode ser usado o EDTA, porque provoca alterações morfológicas nas Hc. A sequência técnica é a mesma como descrito acima, porém usando 17 tubos, com a inclusão de concentrações de 0,9 – 0,8 – 0,7 % de NaCl

VR = % de NaCl % de hemólise

17 0,10 10016 0,20 91 – 10015 0,25 90 - 10014 0,30 80 - 10013 0,35 75 - 10012 0,40 65 - 10011 0,45 55 - 9510 0,50 36 - 8809 0,55 15 - 7008 0,60 0 - 4007 0,65 0 - 1906 0,70 0 – 905 0,75 004 0,80 003 0,85 002 0,90 001 1,00 0

2. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado, com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa3. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil)

32. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb)

30

MATERIAIS = 1. espectrofotômetro; tubos de ensaio 17 x 100 mm2. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L3. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6,8 (solução de estoque)

Na2HPO4.12H2O 9 gKH2PO4 5,7 gAD qsp 1000 mL

4. solução tampão fosfato M/60 pH = 6,8 (solução de trabalho)solução 3 (ESTOQUE) 250 mLAD qsp 1000 mL

5. amostra de ST normal para controle

METODOLOGIA (método colorimétrico) =1. em tubo de ensaio, pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST +

100 µ L de saponina a 1 %, e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6,8 (tubo A)2. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B)3. no tubo B, ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no

sangue); 4. no tubo A, ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb)5. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2,5 mL e 50 µ L de

saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante)6. calcular

% MHb = DO A x 100 VR = até 4 %DO A + (10 x DO B)

OBS.: - É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes- Outros métodos podem ser usados, como :

a) eletroforese de Hb pH 8,6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +)

b) pesquisa de corpos de Heinz

33. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE

31

(G6PD)

33.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina)

MATERIAIS =1. Solução de Glicose 0,28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL2. Solução de Nitrito de Sódio 0,18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL

Obs.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL, nas mesmas dosagens

3. Solução de Azul de Metileno 0,0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1,5 mg + AD 10 mL4. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos)5. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L6. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%, retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%)

METODOLOGIA QUALITATIVA =1. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC, estável por 72 horas)2. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST

B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3

3. homogenizar os tubos sem agitar, invertendo – os delicadamente, por 15 minutos4. incubar em BM a 37ºC por 3 horas, exatamente, homogenizando de 15 / 15 minutos5. diluir todos os tubos na proporção de 0,1 mL para 10 mL de AD, misturar e fazer a leitura6. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B, entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras

- A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste)

- B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste)

- C (teste) = cor variável, do vermelho ao castanho, dependendo dos níveis de G6PD

34. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H

32

MATERIAIS = 1. idem para contagem de reticulócitos2. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil 1 g

citrato de sódio 0,4 gNaCl 0,8 gAD qsp 100 mL

3. usar amostra controle normal

METODOLOGIA =1. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %, em BM, por 1 a 2 horas2. ler em lâmina de imersão , procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul –

pálidas, tipo bolas de golfe

VR = negativo

OBS.:1. No Portador Silencioso de α - talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 –

1 / 2000 Hc2. No Traço α - talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc3. Na Doença da Hb H, + em todos os campos observados

À Eletroforese Hb em pH 8,6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal, enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.

33

GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA

A leitura das reações de aglutinação / hemólise, em Imunohematologia, podem ser lidas macroscopicamente, contra fonte de luz ou superfície iluminada, ou microscopicamente, colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula.

A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios.

Segundo a literatura, as intensidades de reação podem ser :

4 + botão sólido com pequenos grumos e fundo claro

3 + grumos grandes e numerosos com fundo claro

2 + grumos pequenos e numerosos com fundo róseo

. . . . . . .

1 + grumos pequenos e fundo bastante róseo

. . . . . . .. . . . . . .

w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo

. . . . .

. . . . . .

. . . . ..

0 ausência de aglutinação; fundo bastante róseo com hemáceas emsuspensão

34

Quantificação das reações de aglutinação :

Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+

Método do escore numérico = segundo Race e Sanger, modificado por Marsh [Marsh W.L., Scoring of Hemaglutination. Transfusion 1972;12:352 – 353] , faz-se a conversão da intensidade de aglutinação, de cada diluição em valores individuais, depois somados (medida semi - quantitativa da reatividade do anticorpo)

Intensidade da Aglutinação Escore

++++ 12+++ 10++ 8+ 5fraco 2negativo 0

35

35. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS :As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%, em tubo. Essas suspensões são usadas para Tipagem, PAI, e TCD

MATERIAIS : - teste de triagem sorológica1. amostra de ST colhida em EDTA2. pisseta com SF 0,9 %3. tubos de hemólise 12 x 75 mm4. centrífuga de soro ou de Imunohematologia5. pipetas de Pasteur6. micropipetas de 10, 50 e 100 μl

METODOLOGIA :1. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm2. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise3. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda4. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm5. esvaziar o tubo por inversão6. homogenizar o botão de hemáceas7. repetir os procedimentos 3 a 6, por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical)8. após a última lavagem, retirar completamente o sobrenadante

OBS. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia, porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor, fazemos diluição simples sem lavar as hemácias

SUSPENSÃO SF 0,9%Gotas (μl)

HEMÁCIAS LAVADAS (μl)

METODOLOGIA INDICADA

3% 20 (1.000 μl) 30 Microtubos , Cartão (GEL)

5% 19 (950 μl) 50 Tubos , Cartão (GEL)

5 % 950 Sangue total = 50

Tubos, exceto para Hemoterapia

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36. TIPAGEM ABO EM TUBO

MATERIAIS :1. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco, APENAS se fôr feita a Fase Reversa)2. antissoros anti-A, anti-B e anti-A,B3. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa)4. tubos de hemólise, centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl

METODOLOGIA :

Fase Direta = 1. prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)2. rotular tubos em A, B e AB3. colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste 4. homogenizar5. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada)6. ressuspender o botão7. ler

Fase Reversa =1. rotular tubos A e B2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B)3. homogenizar4. centrifugar5. ressuspender6. ler

Causas de Discrepâncias ABO =1. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1, -M)2. amostra contaminada ou erro de identificação3. TCD positivo4. subgrupos de A ou B5. presença de rouleaux6. autoanticorpo anti-I7. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B

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37. TIPAGEM Rh EM TUBO

MATERIAIS :1. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)2. soro anti-Rh (D) e Controle Rh3. Soro de Coombs monoespecífico 4. tubos de hemólise, centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl

OBS. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE

METODOLOGIA :1. identificar 2 tubos D e CRh2. colocar no tubo D, 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste3. colocar no tubo CRh, 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste4. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos5. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo6. se aglutinação negativa, pesquisar D fraco = repetir passos 1,2 e 3, e incubar em

BM 37o C / 15-30 minutos7. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos8. ressuspender e ler; se positivo = D fraco positivo = Rh positivo9. se aglutinação negativa, lavar cada tubo 3 vezes em salina10. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo11. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos12. ressuspender o botão e ler; se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo, = D negativo (Rh negativo)

Causas de Falso-positivos =1. uso de antissoro errado2. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação)3. poliaglutinação, autoaglutinação, proteínas anormais no soro-teste4. contaminação dos reagentes com bactérias, substâncias estranhas

Causas de Falso-negativos =1. uso de antissoro errado2. falta de adicionar antissoro ao tubo teste3. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro, tempo ou velocidade de centrifugação)4. agitação forte na ressuspensão das células, dispersando aglutinações fracas

Obs.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D, mas sem o anticorpo. Como testemunho negativo, deve ser da mesma procedência que o anti-D. Se não for possível, usar controle Rh de outro fabricante, mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente).

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38. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO

MATERIAIS :

1. tubos de hemólise 12 x 75 mm, estantes para tubos, centrífuga, microscópio óptico2. pisseta com SF 0,9 %3. Hc de triagem Triacell ou similar, em suspensão salina ou BFI 4. albumina humana 22% ou BFI5. SAH (soro de Coombs poliespecífico)6. amostra de soro do paciente a testar7. suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário, para autocontrole)

METODOLOGIA :

PAI EM SALINA =

1. separar o soro a testar2. identificar os tubos I e II3. em cada um, pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados)4. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina)5. ressuspender e ler6. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%, homogenizar, centrifugar e ler (fase albumínica imediata)7. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica)8. homogenizar, centrifugar e ler9. lavar 3 vezes em salina10. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana)11. homogenizar, centrifugar e ler

PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE)

1. idem 1 – 2 acima2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI, incubar em BM 37o C / 15 minutos3. lavar 3 vezes em salina4. acrescentar 50 μl de SAH5. centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos, ressuspender e ler

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39. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD)

MATERIAIS :

1. amostra do paciente em EDTA2. suspensão de Hc em 5% (página 35) 3. (se ST de cordão umbelical, lavar 6 vezes em salina, antes de fazer a suspensão)4. SAH (soro de Coombs poliespecífico)5. tubos de hemólise, centrífuga

METODOLOGIA :

1. após fazer a suspensão, pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH2. homogenizar, centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler3. se negativo, deixar de repouso em TA por 5-10 minutos, recentrifugar e ler4. se reação + em qualquer etapa, repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs)

SORO POLIESPECÍFICO

POSITIVO POSITIVO NEGATIVO

SORO MONOESPECÍFICO

POSITIVO NEGATIVO POSITIVO

CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO

Ig G, ou Ig G + Ig M Ig M Ig G

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40 .TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO)

MATERIAIS:

- tubos de ensaio, centrífuga, banho maria 37o C- Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35)- Albumina humana 22%- Hemácias controle A1, B e O (suspeita de incompatibilidade ABO); ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1, Revercell B e Triacell, ou hemácias de doadores conhecidos- Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano)

METODOLOGIA

Método de LUI : [218]

1. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22%2. rolar o tubo para os lados, pôr em freezer a – 6 / - 20o C, deitado, até congelar (tempo mínimo = 10

minutos)3. descongelar em BM 37o C4. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos5. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo6. rotular tubos A1, B e O, colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo

(hemácias Revercell A1, Revercell B e Triacell )7. por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado, antes de fazer a

suspensão a 5% do paciente, em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos8. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. ler a olho nu e em microscópio óptico, com objetiva 100 x, entre lâmina e lamínula

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