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Técnicas Avançadas em Biologia Celular e Molecular

Cultivo de células

George Gey, 1951Células HeLa (Henrietta Lacks): primeira cultura de células

Cultura de bactérias, Escherichia coli

Centrifugação FracionadaRadioautografia

Radioautografia Histoquímica e citoquímicaLocalização intracelular das diversas substâncias que compõem as células

:Ácido nucléico:Polissacarídeo:Lipidio:Íons:Proteinas...

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ImunocitoquímicaÉ uma reação altamente específica porque envolve interação entre moléculas de antígeno e anticorpo

ImunocitoquímicaÉ uma reação altamente específica porque envolve interação entre moléculas de antígeno e anticorpo

CromatografiaMistura de componentes dissolvidos éfracionada a medida que se move através de uma matriz porosa

Cromatografia de troca iônica Cromatografia por afinidade

Eletroforese

Difração de raio X ou cristalografia de raio X

DNA

processo de cristalografia por raio-Xpadrão resultante de difração –

estrutura tridimensional do DNA

Difração de raio X ou

cristalografia de raio X

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Hibridação de ácidos nucléicos

Método para identificação e localização de ácidos nucléicos em materiais fixados

Cromossomos

Fibra de cromatina

CélulasNúcleo

Tecidos

DNA imobilizado

Sondas cromossômicas

Cariótipo humano masculino normal

Hibridação de ácidos nucléicos

Hibridação em núcleos interfásico

Cromossomo 18 (azul), X (verde) e Y (vermelho)

Cromossomo 13 (vermelho) e 21 (verde)

Hibridação cromossômica

Alteração cromossômica estrutural: Translocação

HibridaHibridaHibridaHibridaçççção cromossômicaão cromossômicaão cromossômicaão cromossômica

AlteraAlteraAlteraAlteraçççção cromossômica estruturalão cromossômica estruturalão cromossômica estruturalão cromossômica estrutural : : : : DeleDeleDeleDeleççççãoãoãoão

AlteraAlteraAlteraAlteraçççção cromossômica numão cromossômica numão cromossômica numão cromossômica numéééérica: rica: rica: rica: AneuploidiaAneuploidiaAneuploidiaAneuploidia ---- TrissomiaTrissomiaTrissomiaTrissomia

EXEMPLO - síndrome de Down em humanos (trissomia do autossomo 21)

normais: 2n = 46

com síndrome de Down: 2n = 46 + 1Normal

Cromossomo 13 (azul) e 21 (vermelho)

Down

Cromossomo 13 (azul) e 21 (vermelho)

Hibridação cromossômica

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célula normal masculina

célula tumoral feminina

Alterações cromossômicas estruturais em células tumorais

Hibridação cromossômica

Mapeamento dos cromossomos humanos – “pintura cromossômica”

Hibridação cromossômica

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Síntese de DNA in vitro

DNA totalDNA totalDNA totalDNA total

30 ciclos de PCR30 ciclos de PCR30 ciclos de PCR30 ciclos de PCR

PCRPCRPCRPCR

----DiagnDiagnDiagnDiagnóóóósticossticossticossticos molecularesmolecularesmolecularesmoleculares----IdentificaIdentificaIdentificaIdentificaççççãoãoãoão e e e e isolamentoisolamentoisolamentoisolamento de genes de genes de genes de genes ----MarcadoresMarcadoresMarcadoresMarcadores molecularesmolecularesmolecularesmoleculares----Expressão gênica (RTExpressão gênica (RTExpressão gênica (RTExpressão gênica (RT----PCR e PCR em tempo real)PCR e PCR em tempo real)PCR e PCR em tempo real)PCR e PCR em tempo real)

AAAAPLICAPLICAPLICAPLICAÇÇÇÇÕES ÕES ÕES ÕES ExExExEx: : : : Teste de paternidade e identificaTeste de paternidade e identificaTeste de paternidade e identificaTeste de paternidade e identificaçççção de indivão de indivão de indivão de indivííííduosduosduosduos

MMMM FFFF SPSPSPSP MMMM FFFF SPSPSPSP MMMM FFFF SPSPSPSP

APLICAAPLICAAPLICAAPLICAÇÇÇÇÕES ÕES ÕES ÕES dadadada PCR PCR PCR PCR

5

Um exame de DNA, feito sem o consentimento de

Roberta Jamilly Martins Borges, 23, provou, segundo a

polícia, que ela não é filha natural de Vilma Martins Costa,

47, mulher acusada de levar o hoje adolescente Pedrinho

-registrado como Osvaldo Martins Borges Júnior- de uma

maternidade, em 1986.

Por meio de uma bituca de cigarro deixada por Roberta

no lixo da delegacia, em janeiro deste ano, os peritos

conseguiram isolar a saliva da jovem e fazer o exame. Os

policiais tiveram ajuda de especialistas em genética e do

Instituto de Pesquisa de DNA Forense, da Polícia Civil de

Brasília.

GENGENGENGENÉÉÉÉTICA FORENSETICA FORENSETICA FORENSETICA FORENSE

Ex: identificação de criminosos

caso de estupro

ExExExEx: : : : Polimorfismo da enzima conversora da Polimorfismo da enzima conversora da Polimorfismo da enzima conversora da Polimorfismo da enzima conversora da AngiotensinaAngiotensinaAngiotensinaAngiotensina I I I I →→→→ AngiotensinaAngiotensinaAngiotensinaAngiotensina IIIIIIII→→→→ CardiopatiasCardiopatiasCardiopatiasCardiopatias

Alelo IAlelo IAlelo IAlelo I

Alelo DAlelo DAlelo DAlelo D

IndivIndivIndivIndivííííduosduosduosduos

APLICAAPLICAAPLICAAPLICAÇÇÇÇÕES ÕES ÕES ÕES dadadada PCR PCR PCR PCR CursoCursoCursoCurso de de de de FFFFéééériasriasriasrias

Introdução Prática àBiologia Molecular

18 a 22 de julho de 2011

Realização

Informações: www.ibb.unesp.br (link eventos), ou pelo email: cmartins@ibb.unesp.br