tcc-willian [29-11-06]

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC

CURSO DE FARMÁCIA

WILLIAN BONELI DE ALMEIDA

ATIVIDADE NUCLEÁSICA DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl 2(nic)4]

SOBRE O ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO “IN VITRO” E “IN VIVO”

CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2006.




Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado para obtenção do grau de Farmacêutico no curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC.

Orientador: Prof. Msc. Claus Tröger Pich

CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2006.




Trabalho de Conclusão de Curso aprovado pela Banca Examinadora para obtenção do Grau de Farmacêutico, no Curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, com Linha de Pesquisa em Interação de complexos organometálicos com DNA.

Criciúma, 29 de novembro de 2006.

_____________________________________________________

Profa. Msc. Tatiana Barichello – Coordenadora do curso de Farmácia

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________

Prof. Msc. Claus Tröger Pich – Biólogo - (UNESC) - Orientador

______________________________________________________

Prof. Dr. Marcos Marques da Silva Paula - Químico - (UNESC)

______________________________________________________

Prof. Dr. Ernandes Benedito Pereira - Engenheiro Químico Industrial - (UNESC)

Dedico esse trabalho para toda a minha família,

aos meus colegas pesquisadores do Grupo de

Pesquisa em Imunológia e Genética Ambiental –

GPIGA, e para todos que de alguma maneira

contribuíram para minha formação profissional.

AGRADECIMENTOS

Deixo expressos meus sinceros agradecimentos às seguintes pessoas e

instituições, das quais ajudaram em muito, durante o período da minha graduação e no

desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço especialmente ao professor orientador e amigo Claus Tröger Pich pelo

apoio e incentivo prestados durante toda minha permanência na pesquisa e além de sua

participação ativa neste trabalho.

Agradeço ao Professor Marcos Marque da Silva Paula pelo fornecimento do

complexo que possibilitou a realização do projeto e também pela amizade.

Agradeço ao Grupo de Pesquisa em Imunológia Genética Ambiental – GPIGA,

pela oportunidade de trabalho e pela verba destinada à realização deste trabalho.

Agradeço aos colegas pesquisadores do GPIGA: Bruno Castro Caurio, Geverson

Teixeira Jean Borges Bertoldo, Juliano Urbano Bobassaro, Luceli Ficagna, Rodrigo Costa

Zeferino, Tiago Bortoloto, Juana Villatore, Larissa Pavei, que contribuíram em muito na

realização deste trabalho e principalmente pela amizade.

Agradeço ao professores integrantes do GPIGA: Silvio Ávila Junior, Tatiana

Shoenfelder, Reginaldo Geremias e Cláudio Ricken.

Agradeço aos técnicos do Laboratório de Bioquímica, Sinara Colonetti, Tiago

Inácio, Mara e Geovana pela amizade destes anos todos.

Agradeço a minha família, meu pai João Batista de Almeida, minha mãe Rosania

Boneli de Almeida e a meu irmão Lucas Boneli de Almeida, pelo estímulo e apoio

incondicional desde há primeira hora; pela paciência e grande amizade com que sempre me

ouviram, e sensatez com que sempre me ajudaram.

“Costumávamos pensar que nosso futuro estava

nas estrelas. Agora sabemos que ele está nos

nossos genes”.

James Watson

RESUMO

A química sintética dos complexos coordenados por íons metálicos de transição, tem possibilitado diversas combinações por sua capacidade de afinidade com diversos ligantes. Atualmente é resultado de trabalho intenso por parte de vários grupos de pesquisa, com especial atenção ao seu potencial terapêutico e a compreensão das atividades desempenhadas por metais e metaloenzimas em sistemas naturais. Complexos de rutênio são de grande interesse, devido a forte estabilização do campo ligante e afinidade e habilidade de ajustar diversos tipo de ligantes e apresentam um grande potencial redox. O complexo trans-[Ru(II)Cl2(piridina-3-ácido carboxílico)4] foi descrito como agente antioxidante, onde demonstrou interferência em reações envolvendo espécies químicas como NO e H2O2, apresentou atividade genotóxica em testes ''in vitro'', entre outras características. Levando em consideração estes resultados, este trabalho objetivou aumentar o conhecimento dos efeitos biológicos deste complexo através de testes de genotoxicidade e mutagênese “in vivo” , além de testes de sua interação com DNA plasmidial “in vitro” .Após a aprovação pelo comitê de ética desta universidade a genotoxicidade (teste cometa) e mutagênese (teste de micronúcleo), utilizando-se 6 camundongos CF1 para o teste cometa e 3 para o teste de micronúcleo. Os animais foram tratados com complexo via intraperitoneal nas concentrações de (45,2; 90,4; 180,7µM/Kg) e com o respectivo controle. O período de exposição para todos os camundongos foi de 0 a 120 minutos para o teste cometa (sangue periférico) e de 24 horas para o teste de micronúcleo (células de medula óssea). Na análise de interação do complexo e do ligante com moléculas de DNA, foi analisada em incubações contendo plasmídeo pBSK-II com complexo nas concentrações de (250, 500 e 1000µM) para os respectivos pHs (6,0; 7,0 e 8,0) foram realizadas à 37ºC por 16h, para análise do possível mecanismo de clivagem foram analisadas em incubações contendo DMSO. A cinética de catalítica do complexo sobre o DNA foi realizada com incubações em pH 6,5 monitoradas por 480 minutos. O teste estatístico utilizado para todos as análises foi à análise de variância ANOVA através do programa Microcal Origin 6.0.O complexo foi capaz de clivar o DNA, porem essa atividade é diferente em cada pH testado, observando-se uma maior atividade em pH 6,0. Em incubações de complexo e DNA contendo DMSO a atividade de clivagem foi diminuída mais não inibida sugerindo um possível mecanismo oxidativo envolvendo as reações de Fenton e Haber-Weiss, e uma possível atividade hidrolítica. Na incubação de DNA com ligante não complexado, os resultados obtidos foram nulos, demonstrando ser a atividade nucleásica característica do complexo. Os resultados de cinética realizados a partir da reação de Michaelis-Menten, demonstraram os valores para os seguintes parâmetros analisados, Vmax=

1,4x10-3mol min-1, Km= 457,14µM e Kcat= 8,4x10-2 h-1. A eficiência catalítica observada foi de 183,75M-1.h-1 e o valor de Enhancement para a aceleração da reação foi de 2,33x106. Efeitos genotóxicos “in vivo” foram observados, levando em consideração que esses efeitos são diferentes para cada concentração testada e o tempo de exposição dos animais ao complexo. Foi observada também uma atividade mutagênica do complexo nas concentrações testadas. Palavras-chave: Complexos de Rutênio; Clivagem de DNA; Genotoxicidade e Mutagênese.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Bases nitrogenadas............................................................................................. 15

Figura 2 – Ligações fosfodiéster entre nucleotídeos ............................................................ 16

Figura 3 – Estrutura química de um nucleotídeo. O “R” pode ser um Hidrogênio no caso do

DNA ou uma Hidroxila no caso do RNA. ............................................................................ 17

Figura 4 – Modelo Watson-Crick para Estrutura do DNA ................................................... 18

Figura 5 – Pareamento de bases ......................................................................................... 19

Figura 6 – Pareamento de Hoogsteen .................................................................................. 20

Figura 7– Representação esquemática da desnaturação e renaturação do DNA.................... 21

Figura 8 – O espectro de absorbância ao UV do DNA de E. coli nativo e desnaturado pelo

calor. Observe que a desnaturação não muda o formato geral da curva de absorbância, mas

apenas aumenta sua intesidade. ............................................................................................ 22

Figura 9 – Formas do DNA................................................................................................ 23

Figura 10 – Conformação da pentose .................................................................................. 23

Figura 11 – Supertorção do DNA........................................................................................ 24

Figura 12 – Medida do superenrolamento. Eletroforese em gel de agarose corado com

brometo de etídeo. O DNA aparece como bandas claras(fluorescente) na presença de UV. (a)

0µMol de topoisomerase I (b) 0,25µMol de topoisomerase I; (c) 0,50µMol de topoisomerase

I; (d) 1,0µMol de topoisomerase I; (e) 2,0µMol de topoisomerase I. ....................................25

Figura 13 – Mecanismo hidrolítico da endonucleases sobre os ácido nucléicos. .................. 26

Figura 14 – Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases purínicas.................. 27

Figura 15 – Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases pirimidínicas ............ 28

Figura 16 – dímeros de pirimidinas CPD (Dímero de pirimidina ciclobutano) e o 6-4

(Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto)............................................................................... 28

Figura 17 – Lesões geradas pelo radical hidroxila (OH•) na pentose do DNA...................... 29

Figura 18 – Junção Holliday ............................................................................................... 30

Figura 19 – Análogos de Base............................................................................................. 32

Figura 20 – Agentes químicos intercalantes de DNA........................................................... 32

Figura 21 – Estrutura da Cisplatina e Carboplatina.............................................................. 36

Figura 22 – Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78 H2O........... 38

Figura 23 – Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6-butiladenina)]].................... 38

Figura 24 – estrutura do complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III) Cl4(DMSO-S)] ................. 39

Figura 25 – Estrutura do Complexo de Rutênio(III) KP1019 (FFC14A) ................................ 39

Figura 26 – Estrutura proposta para os complexos de rutênio trans-[RuCl2(nic)4] (A) e trans-

[RuCl2(i-nic)4] (B). .............................................................................................................. 40

Figura 27 – Estrutura proposta para os complexos de rutênio trans-[Ru (II)Cl2(dinic)4] (A) e

trans-[Ru(II)Cl2(i-dinic)4] (B) .............................................................................................. 41

Figura 28 – Distribuição de espécies protonadas correspondente ao complexo (I) em função

do pH. H4C(espécie tetraprotonada), H3C(espécie triprotonada), H2C(espécie diprotonada),

HC (espécie monoprotonada) e C(espécie sem próton)......................................................... 43

Figura 29 – Esquema de Corte da Molécula de DNA Plasmidial ......................................... 45

Figura 30 – Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separação das formas do DNA

plasmidial ............................................................................................................................ 45

Figura 31– Mapa do Plasmídio pBSK-II .............................................................................45

Figura 32 – Esquema representativo do método da estração do DNA. ................................. 47

Figura 33 – Mostra um esquema representativo da eletroforese em gel de agarose. (A) a

matriz é solidificada deixando forma os poços. (B)as amostra são depositadas no poços. (C)

são submetidas a um campo elétrico.(D) os fragmentos apresentam uma migração diferencial.

............................................................................................................................................ 50

Figura 34 – Descrição simplificada do teste cometa. ........................................................... 52

Figura 35 – Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3;

(c) dano classe 4................................................................................................................... 53

Figura 36 – Diferença na coloração de PCE e NCE: (a) eritrócito policromático

micronucleado (PCEMN); (b) eritrócito policromático; (c) eritrócito normocromatico. ........ 53

Figura 37 – Média da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com

concentrações crescentes do ligante (ácido nicotínico) descomplexado, nos pHs(6,0; 7,0; 8,0)

demonstrados no gráfico. ..................................................................................................... 57

Figura 38 – Média da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com

concentrações crescentes do complexo, nos pHs (6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no gráfico.

(**p<0,01 e ***p<0,001). .................................................................................................... 59

Figura 39 – Comparação da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II

em pH 6,0, na presença ou não de 10% DMSO. (***p<0,001). ............................................ 60


em pH 7,0, na presença ou não de 10% DMSO. ................................................................... 61


em pH 8,0, na presença ou não de 10% DMSO. (***p<0,001; **p<0,01 e *p<0,05). ........... 62

Figura 42 – Atividade catalítica de diversas concentrações do complexo sobre o DNA

plasmidial pBSK-II em 480 minutos de incubação a um temperatura de 50ºC em pH 6,5. .... 64

Figura 43 – Constante catalítica do complexo calculado em base a concentrações crescentes

de complexo e a quantidade em moles de substrato degradado por minuto. .......................... 64

Figura 44 – modelo de Lineweaver-Burk ............................................................................ 65

Figura 45 – Índice de fragmentação do DNA de células sangüíneas de camundongos CF1.. 66

Figura 46 – Percentual de células sangüíneas de camundongos CF1, com o seu DNA

fragmentado......................................................................................................................... 68

Figura 47 – Percentual de micronúcleo encontrados em eritrócitos policromáticos, da medula

óssea de camundongos CF1. (*p<0,05). ............................................................................... 69

Figura 48 – Reação de Fenton adaptada para o íon de Ru(II)............................................... 71

Figura 49 – Reação proposta de hidrolise da ligação fosfodiéster do DNA plasmidial (pBSK-

II) causado pelo complexo de rutênio trans-[RuCl2(nic)4]. .................................................. 72

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Fotos dos géis das incubações do ligante e complexo . ....................................... 55

Tabela 2 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do ligante com o DNA

plasmidial ............................................................................................................................ 56

Tabela 3 – Porcentagem da formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA

plasmidial. ........................................................................................................................... 58

Tabela 4 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em

ausência e presença de DMSO em pH 6,0. ........................................................................... 60





Tabela 7 – Fotos do Géis do experimento de cinética catalítica do complexo....................... 63

Tabela 8 – Valores do índice de fragmentação do DNA....................................................... 66

Tabela 9 – Valores da freqüência de células com DNA danificado. ..................................... 68

Tabela 10 – Porcentagem de micronúcleos.......................................................................... 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C – graus Celsius

A - adenina

Ax – absorbância

C -citosina

CaCl2 – cloreto de cálcio

DMSO - dimetil sulfóxido

DNA – ácido desoxirribonucléico

E.coli – Escherichia coli

EDTA – ácido etilenodiaminotetracético

FI - forma superenrolada do plasmídio

FII - forma circular aberta do plasmídio

FIII - forma linear do plasmídio

G -guanina

HEPES - N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-ácido etanosulfônico

Mg2+ - íon magnésio

mL - mililitros

mM - milimolar

NaCl - cloreto de sódio

NaOH – hidróxido de sódio

NCE – eritrócito normocromático

OH• - radical hidrolixa

PBS – Cloreto de sódio/cloreto de potássio/ fosfato de sódio dibásico/ fosfato de sódio

monobásico

pBSK-II - plasmídio pBluescript® II SK(+)

PCE – eritrócito policromático

pH – potencial hidrogênionico

PIPES – piperazina-N-N’-bis(ácido 2-etano sulfônico).

RNA - ácido ribonucléico

RPM – rotações por minuto

T - timina

TBE - tampão Tris/borato/EDTA

trans-[RuCl2(nic)4] - trans-Dicloro Tetraquis Ácido-3-piridina Carboxílico Rutênio

Tris - tris(hidroximetil) aminometano

Triton X-100 - éter p-t-octilfenil polioxietileno

U – uracila

uM – micromolar

UV-Vis – ultravioleta - visível

λ – comprimento e onda

µg – microgramas

µL - microlitros

K obs – constante observada

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................... 12

2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 13

3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 14

3.1 Geral ............................................................................................................................. 14

3.2 Especifico...................................................................................................................... 14

4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................. 15

4.1 Ácidos nucléicos............................................................................................................ 15

4.1.1 Propriedades Físicas e Químicas do DNA................................................................ 16

4.1.1.1 Modelo Watson–Crick para estrutura do DNA.......................................................... 17

4.1.1.2 Desnaturação e Renaturação do DNA....................................................................... 20

4.1.1.3 Formas Tridimensionais de DNA ............................................................................. 22

4.1.1.4 Supertorção do DNA................................................................................................ 24

4.1.2 Degradação do DNA por Nucleases .......................................................................... 25

4.1.3 Danos e Sistemas de Reparo...................................................................................... 26

4.1.3.1 Reparo Por Excisão de Bases.................................................................................... 26

4.1.3.2 Reparo Por Excisão de Nucleotídeos ........................................................................ 28

4.1.3.3 Reparo Por Recombinação........................................................................................ 29

4.1.3.4 Reparo Sujeito a Erros.............................................................................................. 30

4.1.4 Genotoxicidade.......................................................................................................... 31

4.1.4.1 Mutação e Câncer..................................................................................................... 31

4.2 Complexos organometálicos......................................................................................... 34

4.2.1 Complexos de Lantanídeos ....................................................................................... 35

4.2.2 Complexos de metais de transição ............................................................................ 36

4.2.2.1 Complexos de Rutênio.............................................................................................. 37

4.2.2.1.1 Complexo polipiridínico de Rutênio trans-[RuCl2(L)4] .......................................... 39

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................... 44

5.1 Local. ............................................................................................................................ 44

5.2 Obtenção do complexo trans-[RuCl2(nic)4] ................................................................. 44

5.3 Análise de Interação com Moléculas de DNA plasmidial ........................................... 44

5.3.1.1 Preparação de bactérias competentes ........................................................................ 46

5.3.1.2 Transformação das bactérias competentes................................................................. 46

5.3.1.3 Extração do DNA plasmidial das bactérias transformadas......................................... 47

5.3.1.3.1 Análise da Pureza do DNA plasmidial ................................................................... 47

5.3.2.1 Interação do ligante com moléculas de DNA ............................................................ 48

5.3.2.2 Interação do complexo com moléculas de DNA........................................................ 48

5.3.2.3 Interação do complexo com moléculas de DNA na presença de DMSO.................... 49

5.3.2.4 Cinética catalítica do complexo sobre o DNA........................................................... 49

5.3.3 Confecção do gel de agarose e corrida eletroforética............................................... 49

5.4 Análise de Genotoxicidade e Mutagênese.................................................................... 50

5.4.1 Animais e Tratamento............................................................................................... 50

5.4.2 Análise de Genotoxicidade ........................................................................................ 51

5.4.2.1 Teste cometa ............................................................................................................ 51

5.4.3 Analise de Mutagênese .............................................................................................. 53

5.4.3.1 Teste de micronúcleo................................................................................................ 53

5.5. Análise Estatística ....................................................................................................... 54

6 RESULTADOS ............................................................................................................... 55

6.1 Análises de Interação com Moléculas de DNA plasmidial.......................................... 55

6.1.1 Interação do ligante com moléculas de DNA............................................................ 56

6.1.2 Interação do complexo com moléculas de DNA ....................................................... 57

6.1.3 Interação do complexo com moléculas de DNA em presença de DMSO...................... 59

6.1.4 Cinética catalítica do complexo sobre moléculas de DNA ....................................... 63

6.2. Análise de Genotoxicidade e Mutagênese................................................................... 65

6.2.1 Teste Cometa ............................................................................................................. 65

6.2.1.1 Índice de Fragmentação ao DNA.............................................................................. 65

6.2.1.2 Freqüência de dano ao DNA..................................................................................... 67

6.2.2 Teste Micronúcleo ..................................................................................................... 68

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS................................................................................ 70

7.1 Clivagem do DNA......................................................................................................... 70

7.1.1 Atividade de clivagem do Ligante............................................................................. 70

7.1.2 Atividade de clivagem do complexo.......................................................................... 70

7.1.3 Atividade de clivagem do complexo em presença de DMSO................................... 71

7.4 Cinética Catalítica do Complexo ................................................................................. 72

7.2 Teste Cometa ................................................................................................................ 73

7.2.1 Índice e freqüência de dano ao DNA ........................................................................ 73

7.3 Teste Micronúcleo ........................................................................................................ 73

8 CONCLUSÃO................................................................................................................. 75

9 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 76

REFERÊNCIAS................................................................................................................. 77

APÊNDICES ...................................................................................................................... 82

APÊNDICE A – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE DE INTERA ÇÃO.................. 83

APÊNDICE B –VALORES DOS RESULTADOS DE CINÉTICA CATA LÍTICA ....... 87

APÊNDICE C – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE COMETA. .. ........................... 88

APÊNDICE D – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE MICRONÚCL EO.................. 90

ANEXO .............................................................................................................................. 91

ANEXO A – APROVAÇÃO DO TRABALHO PERANTE O COMITÊ DE ÉTICA

DESTA UNIVERSIDADE................................................................................................. 92

12

1 INTRODUÇÃO

Torna-se cada vez maior o interesse no esclarecimento de processos químicos que

ocorrem em sistemas biológicos, para aumentar o conhecimento sobre a atividade de diversas

macromoléculas em processos fisiológicos e patológicos. Para o entendimento desses

sistemas biológicos, hoje tem acontecido a troca viva de idéias entre químicos inorgânicos e

os bioquímicos, que têm conduzido ao crescimento e ao reconhecimento da área

interdisciplinar de “Química Bioinorgânica”. Assim a Química Bioinorgânica tem como

principal objetivo à elaboração, da síntese e da caracterização estrutural e físico-química de

sítios ativos de proteínas, membranas e ácidos nucléicos.

Atualmente vêm sendo muito estudados compostos coordenados por metais, para

a compreensão das atividades desempenhadas por metais e metaloproteínas em sistemas

biológicos. Especialmente aqueles que são capazes de clivar ácidos nucléicos em condições

mais próximas das fisiológicas, de forma hidrolítica que possibilita uma clivagem do DNA

com terminais religáveis enzimaticamente. Tornaram-se objeto de grande interesse por vários

grupos de pesquisas, por servir como ferramenta em biologia molecular e bioquímica, e

também na terapêutica.

As características químicas adotadas pelos complexos coordenados por metais, de

ter uma estrutura tridimensional, caráter catiônico e tendência para fazer reações redox, de

hidrólise, ou fotorreações, torna-os conhecidos por interferir em processos celulares, como

divisão celular e expressão de gênica. Também podem desempenhar atividades em processos

não naturais como toxicidade e carcinogenicidade.

Um dos primeiros complexos coordenados por metais a serem utilizados na

terapêutica contra o câncer, foram os complexos a base de platina. A partir dessa descoberta

houve uma procura maior de novos complexos coordenados por metais de transição com

atividade contra o câncer

Entre os compostos a base de platina, entra os complexos coordenados por íons de

Rutênio (II, III) que apresentam características semelhantes, e através de alguns testes “in

vitro” , indícios de interação com o DNA, havendo possibilidade, em um futuro próximo,

destes também se tornarem uma referência na terapia contra o câncer.

O Complexo polipiridínico trans-dicloro tetraquis ácido-3-piridina carboxílico

Rutênio (trans-[Ru(II)Cl2(nic)4]) em estudo nesse presente trabalho, apresentou em outros

trabalhos indícios de influenciar em certos sistemas biológicos.

13

2 JUSTIFICATIVA

A síntese de novos compostos que interagem com o DNA, com a função de clivar

ou de impossibilitar a transcrição e/ou reparo desta estrutura é de grande interesse na busca de

agentes antitumorais. Diante dos resultados encontrados em experimentos prévios já descrito

na literatura referentes ao complexo trans-[RuCl2(nic)4], que demonstrou atividade sobre

sistemas biológicos, incluindo, atividade antioxidante e genotoxicidade “in vitro”, atividade

reguladora de NO e atividade analgésica “in vivo” é de interesse prosseguir nos estudos afim

de verificar a sua atividade genotóxica e mutagênica “in vivo” e sua capacidade de interação

com moléculas de DNA “in vitro”.

14

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a atividade nucleásica do complexo, trans-[RuCl2(nic)4], quanto ao seu

potencial de ligação com moléculas de DNA plasmidial “ in vitro” , e conseqüentemente sua

capacidade de promover dano aos ácidos nucléicos de células sanguíneas e medulares de

camundongos CF1 “in vivo” .

3.2 Especifico

� Avaliar em diferentes concentrações e pHs o potencial de ligação e clivagem do

complexo com moléculas de DNA plasmidial “in vitro” , utilizando técnica de

eletroforese em gel de agarose;

� Analisar em diferentes concentrações e pHs o potencial de ligação e clivagem do

ligante não complexado com moléculas de DNA plasmidial “in vitro” , utilizando

técnica de eletroforese em gel de agarose;

� Verificar o mecanismo de clivagem hidrolítico ou oxidativo do complexo sobre

moléculas de DNA plasmidial, utilizando varias concentrações do complexo e pHs,

na presença de DMSO(quelante de radicais livres) seguida de visualização em corrida

eletroforetica de gel de agarose;

� Calcular a cinética catalítica do complexo sobre moléculas de DNA plasmidial,

utilizando o modelo matemático Lineweaver-Burk para equação pseudo-Michaelis-

Menten e a técnica de corrida eletroforetica de gel de agarose;

� Avaliar o potencial genotóxico do complexo em diferentes concentrações e tempo de

exposição em sistema biológico, utilizando o ensaio cometa de células de sangue

periférico de camundongos CF1;

� Analisar a atividade mutagênica do complexo em diferentes concentrações, utilizando

teste de micronúcleo em medula óssea de camundongos CF1;

� Relacionar os resultados decorrentes com a estrutura do complexo e suas

propriedades químicas.

15

4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

4.1 Ácidos nucléicos

Os ácidos nucléicos são macromoléculas de enorme importância biológica. Todos

os seres vivos possuem dois tipos de ácidos nucléicos, chamados ácido desoxirribonucléico

(DNA) e ácido ribonucléico (RNA). (DE ROBERTIS e HIB, 2001).

O DNA ocupa uma posição central entre as macromoléculas biológicas como um

repositório da informação genética. As seqüências nucleotídicas do DNA codificam as

estruturas primarias de todos os RNAs e proteínas celulares e, por meio das enzimas, podem

afetar indiretamente a síntese de todos os constituintes celulares. Essa passagem da

informação do DNA para o RNA e as proteínas direciona o tamanho, a forma e a função de

todos os seres vivos. (NELSON e COX, 2002).

Toda informação genética de um organismo encontra-se acumulada na seqüência

linear das quatro bases. A estrutura básica de todas as proteínas deve estar codificada por um

alfabeto formando por quatro letras (A, T, G e C) na molécula de DNA e na molécula de

RNA é substituída à timina (T) por uma Uracila (U). Onde a quantidade de adenina é igual á

de timina (A = T) e de citosina, idem a de guanina (C = G), podemos disser que o numero

total de purinas (A+G) é igual ao de pirimidinas (T+C), onde essa relação (AT/GC) possa

variar espécie por espécie conforme figura 1. (ZAHA et al, 2001).

N

N

NH

N

NH2

Adenina

N

NH

NH2

O

Citosina

N

NH

NH

N

NH2

O

GuaninaNH

NH

O

O

CH3

Timina

NH

NH

O

O

Uracila

Figura 1 - Bases nitrogenadas Fonte: modificado de Nelson e Cox (2002).

Diferente dos procarióticos o DNA de eucarióticos encontra-se no núcleo

constituindo os cromossomos (uma pequena quantidade se encontra no citoplasma, dentro de

mitocôndrias e cloroplastos). O RNA se localiza tanto no núcleo, onde é sintetizado como no

citoplasma onde se dirige para reger a síntese protéica. (DE ROBERTIS e HIB, 2001).

16

4.1.1 Propriedades Físicas e Químicas do DNA

Uma molécula de DNA é um polímero linear cujos monômeros (nucleotídeos) se

encontram unidos pelas ligações fosfodiéster, conforme figura 2. Os desoxirribonucleotídeos

possuem três componentes característicos: (1) uma base nitrogenada heterocíclica (que podem

ser purinas ou pirimidinas), (2) uma pentose (2’-desoxi-D-Ribose) e (3) um ou até três grupos

fosfatos (PO4-). (VOET, VOET e PRATT, 2002).

OO

O

P

O

O-

O-

P O

O

O-

O

R

R

OH

Extremidade 5'

Extremidade 3'

Ligação fosfodiéster

Figura 2 - Ligações fosfodiéster entre nucleotídeos Fonte: Modificado de Voet, Voet e Pratt (2002).

A base de nucleotídeo une-se covalentemente (pelo N -1 das pirimidinas e pelo N

-9 das purinas), por meio de uma ligação N-β –glicosídica, ao carbono-1’ da pentose, e o

fosfato está esterificado ao carbono-5’. A ligação N-β –glicosídica é formada pela remoção

dos elementos da água (um grupo hidroxila da pentose e o hidrogênio da base), como na

formação da ligação fosfodiéster (ligação O –glicosídica). A molécula composta pela base e o

açúcar, sem o grupo fosfato é denominada nucleosídeo, como mostra a figura 3. (NELSON e

COX, 2002).

17

OO

OH

P

O

OH

P

O

O

OH

OH

OH

O

O

P

N

N

NH2

O

R

Base

Pentose

Fosfatos

Nucleotídeo

Nucleosídeo

Figura 3 - Estrutura química de um nucleotídeo. O “R” pode ser um Hidrogênio no caso do DNA ou uma

Hidroxila no caso do RNA. Fonte: modificado de Zaha et al (2001).

Como foi comentado anteriormente os nucleotídeos estão ligados entre si por

pontes dos fosfodiéster, estão ligados ao carbono 3’ da pentose de um nucleotídeo, bem como

ao carbono 5’ da pentose do nucleotídeo seguinte. Em conseqüência, o eixo do ácido nucléico

está constituído por pentoses, fosfatos, e bases nitrogenadas que se origina das pentoses. A

extremidade da molécula que contem a pentose ligada no Carbono 5’ livre, chama-se

extremidade 5’, ao passo que aquela possui a pentose ligada no Carbono 3’ livre denominada

extremidade 3’. O ácido fosfórico utiliza dois de seus três grupos ácidos para formar as

ligações 3’, 5’–diéster. O grupo restante confere ao ácido nucléico suas propriedades ácidas, e

permite a formação de ligação iônica com proteínas básicas conhecidas como histonas, com

as quais forma o complexo núcleoprotéico denominado cromatina. (DE ROBERTIS e HIB,

2001).

4.1.1.1 Modelo Watson–Crick para estrutura do DNA

A molécula de DNA é formada por duas cadeias polinucleotídicas helicoidal, com

giro para a direita, formando uma dupla hélice em torno de um eixo central, mostrado na

figura 4. As desoxirriboses ficam externas em relação ás bases nitrogenadas, expostas ao meio

aquoso. As ligações fosfodiéster nas duas fitas estão em direções opostas (uma na direção 5’

18

� 3’ e a outra 3’ � 5’) sendo antiparalelas. Os anéis aromáticos das bases nitrogenadas são

hidrofóbicos e ficam orientados para o interior, quase perpendiculares ao eixo da hélice. As

bases estão pareadas entre as duas fitas da molécula, mantendo a sua estrutura. (WATSON e

CRICK, 1953).

Figura 4 – Modelo Watson-Crick para Estrutura do DNA

Fonte: retirado de Watson e Crick (1953).

O pareamento das bases é fundamental para a manutenção da dupla-hélice. Duas

características das bases nitrogenadas são importantes: sua estrutura química e seu tamanho.

A presença de grupos funcionais nas pirimidinas e purinas são os nitrogênios do anel, os

grupos carbonila e os grupos aminoexocíclicos, conforme mostrado na figura 5, permite a

formação de ponte de hidrogênio entre as bases dessa forma T, que contêm um grupo

carbonila, pode parear com A, que contem um grupo aminoexocíclicos, através de ponte de

hidrogênio. C e G, que contem tanto grupo carbonila e aminoexocíclicos, podem formar duas

pontes de hidrogênio. Alem disso, uma ponte de hidrogênio adicional pode ser formada entre

os nitrogênios dos anéis aromáticos em todos os pares. Assim, entre T e A são formados duas

pontes de hidrogênio e entre C e G são formadas três pontes. (ZAHA et al, 2001)

Interações hidrofóbicas de empilhamento representam outro importante

mecanismo de interação de bases, em que duas ou mais bases são posicionadas com os planos

de seus anéis em paralelo. O empilhamento envolve uma combinação de interações de Van

der Waals e dipolo-dipolo entre as bases. Finalmente, as cadeias de açúcar-fosfato, que são

carregadas negativamente, interagem com cátions (principalmente Mg2+) em solução, o que

neutraliza a repulsão entre as duas cadeias e estabiliza a dupla-hélice. A carga negativa da

ponte fosfodiéster protege o ataque de agente nucleofílicos, tais como íon hidróxido. Em

19

conseqüência, as ligações fosfodiéster são muito menos susceptíveis ao ataque hidrolítico que

outros ésteres, tais como os de ácido carboxílico. Esta resistência é crucial para manter a

integridade da informação armazenada nos ácidos nucléicos. A ausência de hidroxila 2’ no

DNA aumenta ainda mais sua resistência á hidrolise. A maior estabilidade do DNA

provavelmente explica seu uso em vez do RNA como o material hereditário em todas as

células modernas e em muitos vírus. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004 e NELSON E

COX, 2002).

Figura 5 - Pareamento de bases

Fonte: Almeida et al (2005).

As bases possuem tamanhos distintos, as pirimidinas são menores que as purinas.

Entretanto, os pares AT e CG têm aproximadamente o mesmo tamanho e dimensões

semelhantes. Desta maneira, os dois pares de ocupam o mesmo espaço, permitindo uma

dimensão uniforme ao longo da molécula de DNA. Assim, não existe nenhuma restrição

quanto á seqüência de nucleotídeos ao longo do DNA. Essas características de pareamento

explicam o fato de que, em qualquer seqüência de DNA, a relação molar entre A/T seja igual

a 1,0 e mesmo ocorrendo com a relação C/G, embora as concentrações molares entre AT e

CG variem com a seqüência de DNA analisado. Essa característica de pareamento tem grande

significância fisiológica e, devido a ela, as duas fitas de DNA são ditas complementares. Essa

20

propriedade garante a replicação precisa de cadeias longas de DNA e a transmissão de

informação ás proteínas, via transcrição. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX, 2002).

Além dos pareamentos AT e CG, outros pareamentos podem ser encontrados. O

pareamento de Hoogsteen, que ocorre em fitas triplas e quatros fitas de DNA, ver (figura 6).

(NELSON E COX, 2002).

N

NO

O

CH3

H

HH

H

N N

O

CH3

O

C-1'

N

N

N

N

N

1'-C

C-1'

T A.T

H

N

N

N

N

NH

OH

HN

N

O

NH

H

H

NN

O

1'-C

C-1'

C-1'

NH

G.C+

C

N

N

N

N

NH

OH

H

N

N

N

N

NH

O

NN

NN

NH

O

H

H

H

NN

N N

NH

O

H

H

H

C-1'

1'-C

C-1'C-1'

Guanosina tetraplex

Figura 6 - Pareamento de Hoogsteen Fonte: modificado de Nelson e Cox (2002).

4.1.1.2 Desnaturação e Renaturação do DNA

Os termos desnaturação e renaturação são sinônimos de fusão e reanelamento,

respectivamente. Esses fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice são

fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação. Soluções de DNA

nativo cuidadosamente isolados são altamente viscosas em pH 7,0 e à temperatura ambiente

(25ºC). Quando a tal solução é exposta a extremos de pH ou temperaturas acima de 80ºC, sua

viscosidade diminui rapidamente, indicando que o DNA sofreu uma alteração física. Da

mesma forma que o calor e os extremos de pH causam desnaturação em proteínas globulares,

esse fatores também provocam desnaturação e fusão da dupla hélice do DNA. A ruptura das

21

pontes de hidrogênio entre as bases pareadas e do empilhamento de bases induz o

desenrolamento da dupla hélice para formar duas fitas simples, completamente separadas

entre si ao longo de toda a extensão, ou parte da extensão (desnaturação parcial), da molécula.

Nenhuma ligação covalente é quebrada, como mostrado na figura 7. A desnaturação da

estrutura secundaria do DNA pode ser obtida em solução por aumento da temperatura,

titulação de ácidos ou álcalis e por agentes desnaturantes como a formamida e o dimetil

sulfóxido (DMSO). Os ácidos protonizam os anéis nitrogenados de A, G e C, e os álcalis

desprotonizam os anéis nitrogenados de G e T. Esses tratamentos geram grupos carregados no

interior da dupla fita, o que leva ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases

complementares. Como as ligações glicosídicas nas purinas são sensíveis a pH baixo, a

desnaturação por ácidos tem pouca aplicação prática. O processo inverso ocorre na

renaturação. Esses processos podem ser desencadeados “in vitro”. Quando a temperatura, ou

pH retorna ao nível em que a maioria dos organismos dos organismos vive, os segmentos

deserolados das duas fitas se enrolam novamente ou se anelam para produzir o dúplex intacto.

Entretanto as duas fitas estão totalmente separadas, a renaturação ocorre em dois passos: (1) é

relativamente lento, porque as duas fitas devem primerio “se encontrar” pela colisão ao acaso

e formar um seguimento curto de dupla hélice complementar, (2) é muito mais rápido, as

bases despareadas remanescentes entram sucessivamente em registro como pares de bases e

as duas fitas se fecham, formando a dupla hélice. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX,

2002).

Figura 7- Representação esquemática da desnaturação e renaturação do DNA

Fonte: Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

A desnaturação pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro da

absorbância da luz ultravioleta (UV) em 260nm. Como as bases são a responsáveis pela

22

absorção pelo UV, quando o DNA desnatura totalmente aumenta em 37% sua absorção, esse

efeito é chamado de efeito hipocrômico. Os pares GC são mais estáveis que os pares AT, isso

se da pelo o numero de pontes de hidrogênio entre eles. Assim a temperatura, o pH, o

comprimento da dupla fita e os tipos de pares de bases são fatores que modificam a

velocidade de desnaturação, conforme figura 8. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX,

2002).

Figura 8 – O espectro de absorbância ao UV do DNA de E. coli nativo e desnaturado pelo calor. Observe que a

desnaturação não muda o formato geral da curva de absorbância, mas apenas aumenta sua intesidade. Fonte: Voet, Voet e Pratt (2002).

4.1.1.3 Formas Tridimensionais de DNA

O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua composição de

bases e do meio em que se encontra. Os tipos de DNA encontrados em condições fisiológicas

são o B, A e o Z-DNA. O Tipo B é a estrutura referida como a estrutura de Watson -Crick, é

uma forma mais estável para uma seqüência ao acaso da molécula de DNA em condições

fisiológicas e, portanto é o padrão de referencia em qualquer estudo das propriedades do

DNA. O B-DNA é a forma mais abundante encontrada nas células, na presença de 92% de

unidade relativa e em soluções de baixa força iônica. A forma A do DNA aparece quando a

unidade é reduzida a menos de cerca de 75%. O A-DNA, como o B-DNA, é uma dupla hélice

dextrosa, constituída de filamentos com sentidos inverso mantidos juntos por pareamento de

bases do tipo de Watson-Crick. A hélice A é mais larga e mais curta do que a B, e seus pares

23

de bases são inclinados em vez de perpendiculares ao eixo da hélice. A dupla hélice de B-

DNA conclui uma volta a cada 10,5 pares de bases e essa diferença aumenta da forma A para

a cada 11 pares de base. A cavidade maior torna-se mais estreita e mais profunda, e a

cavidade menor torna-se mais larga e mais rasa na forma A em comparação com a forma B,

como mostra a figura 9. Muitas das diferenças estruturais entre B-DNA e A-DNA surgem de

franzimentos diferentes de suas unidades de ribose, conforme representado na figura 10. No

A-DNA, o C-3’ fica fora do plano (uma conformação chamada de C-3’ endo) formado pelos

outros quatro átomos do anel furanose. No B-DNA, o C-2’ fica fora do plano (uma

conformação chamada de C-2’ endo). O enrugamento C-3’-endo no A-DNA leva a 19 graus

de torção dos pares de bases em relação à perpendicular à hélice. Os fosfatos e outros

grupamentos na hélice A ligam-se menos com moléculas de H2O do que o B-DNA, portanto,

a desidratação favorece a forma A, ver. (ZAHA et al, 2001; BERG, TYMOCZKO e

STRYER, 2004; NELSON e COX, 2002).

Figura 9 - Formas do DNA Fonte: Almeida et al (2005).

Figura 10 - Conformação da pentose

Fonte: Oliveira (2006).

24

Outro de tipo de DNA conhecido como Z-DNA, esse tipo é mais longo e mais

fino que as formas A e B. Uma volta completa da hélice ocorre a cada 12 pares de base. São

necessárias altas concentrações de sais para diminuir a repulsão eletrostática entre os fosfatos

do arcabouço, que estão mais próximos uns dos outros do que no A e B-DNA. Essa

conformação do Z-DNA torna o sulco maior achatado e o sulco menor muito estreito e

profundo, como mostra a figura 9. (ZAHA et al, 2001; BERG, TYMOCZKO e STRYER,

2004).

4.1.1.4 Supertorção do DNA

O DNA nem sempre está na forma até aqui apresentada, aquela de um bastão de

dupla-hélice. Essa forma linear pode ter suas extremidades ligadas covalentemente formando

estruturas circulares. Bactérias têm seu cromossomo na forma circular e podem possuir

formas extracromossomais também em forma circular, os plasmídeos. As mitocôndrias, os

cloroplastos e alguns vírus e bacteriófagos também possuem DNA na forma circular. Além da

estrutura secundária da dupla-hélice, o DNA assume uma conformação tridimensional

denominada supertorcida, superenrolada, super-hélice ou simplesmente forma I (FI), como

ilustrado na figura 11a-e. Quando a estrutura da dupla hélice fica perfeitamente assentada em

uma superfície plana, sem alterar a geometria da dupla-hélice, ela é denominada relaxada,

circular aberta ou forma II (FII), como na figura 11-a. Existem enzimas que realizam este

processo são conhecidas como topoisomerases. Sabe-se que esses tipos de arranjos

geométricos no DNA são essenciais para diversos processos, como: transcrição,

recombinação e expressão gênica. (ZAHA et al, 2001).

Figura 11 - Supertorção do DNA

Fonte: Nelson e Cox (2002).

25

Como descrita anteriormente a FI é mais compacta que a FII. Assim, um DNA

supertorcido move-se mais rapidamente do que um relaxado quando analisado por

eletroforese, como mostrado na figura 12. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

Figura 12 - Medida do superenrolamento. Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo. O DNA

aparece como bandas claras(fluorescente) na presença de UV. (a) 0µMol de topoisomerase I (b) 0,25µMol de topoisomerase I; (c) 0,50µMol de topoisomerase I; (d) 1,0µMol de topoisomerase I; (e) 2,0µMol de

topoisomerase I. Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer (2004).

4.1.2 Degradação do DNA por Nucleases

As enzimas que tem como atividade a degradação de ácidos nucléicos são

conhecidas como Nucleases ou Dnases, se forem especificas para DNA. As nucleases são

classificadas como Exonucleases ou Endonucleases. As exonucleases degradam o ácido

nucléico na direção 5’ � 3’ ou na direção 3’ � 5’, removendo apenas nucleotídeos das

extremidades 5’ ou 3’, de uma fita de ácido nucléico de dupla hélice, respectivamente. As

endonucleases, essas enzimas podem degradar os ácidos nucléicos em qualquer lugar da fita,

reduzindo a fragmentos cada vez menores. Existem algumas classes importantes que clivam

apenas seqüências especificas de nucleotídeos, essas enzimas são muito aplicadas em

biotecnologia, e são conhecidas como endonucleases de restrição. (NELSON E COX, 2002).

A principal reação catalisada pelas endonucleases de restrição é a hidrolise ao

arcabouço de fosfodiéster do DNA. Especificamente, é rompida a ligação entre o átomo de

oxigênio 3’ e o fósforo, os produtos desta reação são terminações de DNA com uma hidroxila

3’ livre e uma fosforila em 5’ , que podem ser religadas com ajuda de outros tipos de enzimas

chamadas de ligases no qual não é o enfoque desse trabalho. Esta reação de hidrolise acontece

por um ataque nucleofílico ao átomo de fósforo. As endonucleases podem clivar o DNA como

representado na figura 13. Neste mecanismo o nucleófilo ataca o átomo de fósforo, e se forma

um estado de transição pentacovalente. Esta forma tem uma geometria de dupla pirâmide

triangular, centralizada no átomo de fósforo, com nucleofílico que chega em um dos vértices e

um grupamento e deslocado. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

26

Figura 13- Mecanismo hidrolítico da endonucleases sobre os ácido nucléicos.

Fonte: Modificado de Berg; Tymoczko e Stryer (2004).

O átomo de magnésio (Mg) é essencial para atividade da endonuclease, ele foi

encontrado unido a seis ligantes: três são moléculas de água, dois são carboxilatos de

aspartatos da enzima, e um é um átomo de oxigênio da fosforila no local da clivagem. O

átomo de magnésio mantém uma molécula de água em uma posição a partir da qual ela pode

atacar a fosforila e, junto com os aspartatos, ajuda a polarizar a molécula de água para a

desprotonação. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

4.1.3 Danos e Sistemas de Reparo

A sobrevivência em longo prazo de uma espécie pode ser aumentada através de

mudanças genéticas, mas a sobrevivência de um indivíduo demanda estabilidade genética. A

manutenção da estabilidade genética necessita não apenas de um mecanismo extremamente

preciso para replicação do DNA, antes da célula se dividir, mas também de mecanismos para

reparação das muitas lesões acidentais que ocorrem continuamente no DNA. A maioria das

mudanças no DNA é temporária, por que são rapidamente corrigidas por mecanismos

enzimáticos complexos, denominado sistema de reparação (ALBERTS et al, 1997). O DNA

pode se tornar lesado por diversos processos, alguns espontâneos, outros catalisados por

agentes ambientais e a apropria replicação do DNA pode ocasionalmente deixar bases

desemparelhadas. A química das lesões do DNA é diversa e complexa, nesse trabalho vamos

dar ênfase em processos de reparo desempenhados por células eucarióticas. (NELSON E

COX, 2002).

4.1.3.1 Reparo Por Excisão de Bases

27

As modificações de bases são produtos de reações simples como desaminações

espontâneas, oxidações e alquilações do DNA. (RIBEIRO et al, 2003). Alguns tipos de lesões,

nas bases nitrogenadas envolvem oxidações realizadas pelo radical hidroxila (OH•), pela sua

alta eletrofilicidade, que possibilita sua interação com as bases nitrogenadas por adição as

insaturações em sítios de alta densidade eletrônica. Assim reage com bases púricas formando

diversos produtos como 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina (Figura 14-a), 4,6-

diamino-5-formamidopirimidina (Figura 14-b), 8-oxo-7,8-diidro-2’-desoxiguanosídeo (8-

oxoG) (Figura 14-c), 8-oxoA (Figura 14-d). O ataque às bases pirimidínicas produz produtos

como 5-hidroxi-6-hidrocitosina (Figura 15-a), 6-hidroxi-5-hidrocitosina (Figura 15-b),

citosinaglicol (Figura 15-c), 5-hidroxi-6-hidrotimina (Figura 15-d), 6-hidroxi-5- hidrotimina

(Figura 15-e), 5-hidroxi-6-oxotimina (Figura 15-f) e timinaglicol (Figura 15-g) como

principais produtos. (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 14 - Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases purínicas.

Fonte: Modificado de Barreiros, David, E David (2006).

Toda célula possui uma classe de enzimas chamadas de DNA glicosilases que

reconhecem lesões particularmente comuns do DNA e removem a base afetada clivando a

ligação N-glicosídica. Essa clivagem hidrolítica forma um sitio apuríco ou apirimidínico no

DNA, ambos comumente referidos como sítios AP ou abásicos (álcali-lábeis). (NELSON E

COX, 2002). Existem diferentes tipos de DNA glicosilases e cada uma age em uma lesão

especifica. (ALBERTS et al, 1997).

28

Figura 15 - Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases pirimidínicas

Fonte: Modificado de Barreiros, David, E David (2006).

4.1.3.2 Reparo Por Excisão de Nucleotídeos

O reparo por excisão de nucleotídeo (NER, nucleotide excision repair) é um dos

sistemas de reparo mais versáteis, pois atua em vários tipos de lesões no DNA. Esse sistema é

basicamente capaz de reparar quase todos os tipos de lesões que produza distorções na dupla-

hélice do DNA. Alguns tipos de lesões podem ser os dímeros de pirimidinas (Dímero de

pirimidina ciclobutano – “CPD” e a Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto - 6,4 PP), como

representado na figura 16, induzidas pela radiação UV, lesões causadas por adultos, como os

gerados pela formação de ligações covalentes entre as bases do DNA e hidrocarbonetos

(exemplo benzopireno). (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 16 – dímeros de pirimidinas CPD (Dímero de pirimidina ciclobutano) e o 6-4 (Pirimidina 6,4 pirimidona

fotoproduto). Fonte: Modificado de Ribeiro et al (2003).

Esta via de reparação também atua em lesões geradas pelo radical hidroxil (OH.),

pela a oxidação de pentoses do DNA gerando como principais produtos 5’-8-ciclo-2’-

29

desoxiadenosina 8OHdA (Figura 17-a) e 5’-8-ciclo-2’-desoxiguanosina 8OHdG 8OHdA

(Figura 17-b). (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 17 - Lesões geradas pelo radical hidroxila (OH•) na pentose do DNA.

Fonte: Barreiros, David, E David (2006).

O reparo funciona por uma varredura no DNA, realizado por uma exonuclease

(endonuclease), constituído por três subunidades, denominadas (UvrA, UvrB e UvrC), a

procura de uma distorção na dupla-fita, mais do que uma procura por uma mudança especifica

de base. (ALBERTS et al, 1997). Quando o complexo enzimático encontra a distorção na

dupla fita, hidrolisa a sexta ligação fosfodiéster no lado 3’ e a vigésima ligação fosfodiéster,

no lado 5’ produzindo um fragmento de 27 a 29 nucleotídeos. Após a incisão, os

oligonucleotídeos excisados são liberados da dupla fita pela atividade da uma helicase, e a

lacuna resultante é preenchida pela DNA polimerase ε, o corte é selado pela DNA ligase,

reconstituindo a fita lesada. (NELSON E COX, 2002).

4.1.3.3 Reparo Por Recombinação

Diferente das outras vias comentadas acima que utilizavam a fita complementar

para reparar danos, essa via de reparo recombinacional utiliza informação de um cromossomo

homologo. (ZAHA et al, 2001). Os principais danos que ativam essa via são quebras de fita

dupla do DNA, causados por exposições a radiação ionizantes, raios-X, radiacais livres,

agentes químicos, durante replicação de DNA simples fita ou, ainda, como intermediário

durante certos processos de recombinação sítio especifica. Além de ser potencialmente

mutagênica, este tipo de lesão é particularmente tóxica uma vez que pode induzir vários tipos

de aberrações cromossômicas como aneuplodias, inversões, deleções (perda de

30

heterozigozidade) e translocações, eventos que estão altamente associados com carcinogênese

e apoptose. (RIBEIRO et al, 2003). Esta via atua tanto em lesões que provocam quebras com

em lesão que bloqueiam a replicação como os dímeros de pirimidinas. (ZAHA et al, 2001).

O reparo recombinante normalmente envolve uma permuta de uma única fita entre

duas duplas hélices. Uma importante estrutura intermediaria é formada nesse processo, é

conhecido como fita cruzada permutada ou “Junção de Holliday”, mostrado na figura 18.

(ALBERTS et al, 1997). O mecanismo funciona após ser detectada uma lesão, que dispara

uma cascata de reações cuja finalidade é bloquear o clico celular e recrutar as proteínas de

reparo especificas. (RIBEIRO et al, 2003).

Figura 18 – Junção Holliday

Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

4.1.3.4 Reparo Sujeito a Erros

A existência de sistemas de reparação que envolve síntese de DNA leva a um

questionamento importante, no qual se discute a o controle de qualidade destes sistemas. É

onde se sabe os sistemas de reparo por excisão não diferem da replicação, na freqüência de

erros. (LEWIN, 2001).

Muitas das lesões letais, bloqueadoras da replicação, são reparadas pelo processo

de excisão de nucleotídeos ou de bases. Se estes sistemas estão saturados ou são incapazes de

reparar estes danos antes da fase S do clico celular, a morte celular pode ocorrer. Para escapar

da morte, todas as células possuem mecanismos de tolerância a essas lesões. Como as lesões

em geral não são codificadoras, podem ser geradas mutações. Esse processo, portanto sujeito

a erro, é conhecido como síntese de DNA translesão ou também chamada de resposta SOS.

(RIBEIRO et al, 2003). Essa via de reparo é parte de uma resposta celular ao estresse a lesões

extensas do DNA. Essa resposta envolve a participação de muitas enzimas. Uma DNA

polimerase especializada (DNA polimerase V), que pode replicar sobre muitas lesões no DNA

que, normalmente, bloqueiam a replicação. O próprio pareamento de bases é impossível no

31

local de tais lesões, de forma que essa replicação está sujeita a erros. É incoerente que exista

um sistema que aumente a taxa de mutação, mas devemos pensar nesse sistema como uma

estratégia desesperada para a célula conservar a integridade genética. As mutações resultantes

matam muitas células, mas esse é o preço biológico que as células pagam para contornar uma

barreira, de outra forma intransponível para a replicação, à medida que ela permite que

algumas poucas células mutantes sobrevivam. (NELSON E COX, 2002).

4.1.4 Genotoxicidade

A genotoxicidade é o setor da genética que estuda os processos que alteram a base

genética da vida, sendo na estrutura físico-química do DNA, processo este classificado de

mutagênese; seja na alteração do determinismo genético ao nível celular ou orgânico, onde

são identificados respectivamente como carcinogênese e teratogênese. A mutagênese,

carcinogênese e teratogênese são agrupadas em uma área de estudo porque um mesmo

processo ou produto pode produzir os três efeitos. Cada área destas tem suas peculiaridades, e

possuem os seus especialistas, em função da complexidade dos processos e nível de

conhecimentos destas áreas da ciência. A genotoxicidade estuda, sob o aspecto genético, o

que perturba a vida ou induz a morte tanto a nível celular como orgânico. (ERDTMANN

2003 apud, SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003).

4.1.4.1 Mutação e Câncer

Durante a vida, o DNA sofre modificações súbitas e hereditárias no material

genético que são denominadas de mutações, que nada mais é que alteração permanente de

uma determinada seqüências nucleotídica, que podem ser causadas por erros durante a

duplicação, reparação do DNA, radiações ionizantes, agentes químicos. (NELSON E COX,

2002). Todos os seres vivos sofrem um certo número de mutações como resultado de funções

celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente, essas mutações são denominadas

espontâneas. A taxa de ocorrência destas mutações espontâneas é caracterizada para um

determinado organismo e constitui o chamado nível basal (background). (ZAHA et al, 2001).

Compostos químicos chamados de agentes mutagênicos podem alteram a seqüência das bases

no DNA, causando mutações induzidas, assim podem acelerar ou aumentar o aparecimento de

mutações. (RIBEIRO et al, 2003). Alguns mutágenos químicos são bem específicos, como os

análogos de bases, como 5-bromouracil e 2-aminopurina, representados na figura 19, podem

32

ser incorporados ao DNA e tem mesmo maior probabilidade do que as bases normais de ácido

nucléicos de formar tautomeros temporários que levam a mutações de transição. Outros

mutágenos atuam modificando quimicamente as bases do DNA, como o ácido nitroso (HNO2)

reage com bases que contêm aminas, provocando desaminação. (BERG; TYMOCZKO e

STRYER, 2004).

N

N

NH

N

NH2

2-Amino purina

NHNH O

Br O

NHNH O

Br O-

5-Bromo uracilForma cetonica

5-Bromo uracilForma Enólica

Figura 19 – Análogos de Base

Fonte: modificado de Zaha et al (2001).

Um tipo diferente de mutação é produzido por moléculas de corantes aromáticos

como acridinas, Brometo de etídeo e por antibióticos macrociclicos como a dactinomicina,

ilustrados na figura 20. Estes compostos se intercalam no DNA, isto é, eles se introduzem

entre pares de bases adjacentes da dupla hélice do DNA conseqüentemente causam a inserção

ou deleção de um ou mais pares de bases. (ZAHA et al, 2001).

N

O

CH3CH3

O

OO L-Thr

D-val

OL-Meval

SarL-Pro

L-ThrD-val

OL-Meval

Sar

L-Pro

N+

NH2

NH2CH2CH3

Br-

N NN

CH3

CH3

CH3

CH3

Laranja de acridina

Brometo de EtídeoDactinomicina

Figura 20 – Agentes químicos intercalantes de DNA

Fonte: modificado de Zaha et al (2001) e Almeida et al (2005).

33

Considerando os sítios de mutações dentro de uma seqüência de DNA, alguns

sítios sofrem um número de mutações muito maior que o esperado pela distribuição aleatória;

podem existir 10 ou até 100 vezes mais mutações que o previsto por impactos aleatórios.

Estas posições são chamadas de “sítios quentes” (hotsposts). Mutações podem ocorrer em

“sítios quentes” e diferentes agentes mutagênicos podem atuar em diferentes “sítios quentes”.

(LEWIN, 2001).

O aparecimento de mutações está associado ao desenvolvimento de neoplasias,

após passar por várias divisões, uma célula poderá acumular mutações que, se em número

elevado, poderão determinar a perda do controle de sua divisão, determinando, assim, o

aparecimento do câncer. (RIBEIRO et al, 2003).

Os mecanismos de mutagênese e carcinogênese parecem estar intrinsecamente

ligados. A mutação é uma conseqüência do dano no DNA e este pode ser o estágio inicial no

processo pelo qual a maioria dos carcionógenos químicos inicia a formação do tumor. Muitos

estudos têm mostrado que mutações em vários genes críticos têm sido encontradas nas

neoplasias. Os primeiros genes identificados foram os protooncogenes, nos quais mutações

ocorrendo em um ou poucos códons críticos, podem gerar um produto gênico ativado que

causa a transformação celular. Por outro lado há os genes supressores de turmor que

codificam proteínas essenciais para o controle do crescimento celular. Quando esses genes são

inativados por perda da seqüência ou mutação, podem resultar em crescimento celular

aberrante. (RIBEIRO et al, 2003).

Os primeiros eventos no processo da carcinogenese química incluem a exposição

ao carcinógeno, seu transporte à célula alvo, sua ativação em metabólitos ativos (caso o

agente seja um pré-carcinógeno), e o dano no DNA, levando a mudanças que resultam em

uma célula iniciada. O homem é exposto repetidamente a misturas químicas variáveis e

complexas. Essas misturas ambientais contêm tanto agentes iniciadores como promotores. A

maioria dos carcinogenos genotoxicos que comprovadamente causam tumores em seres

humanos é considerada pré–carcinógeno, são composto estáveis em no pH fisiológico e,

portanto, incapazes de reagir com o DNA. Esses carcinógenos são biotranformados por

enzimas como citocromos P450 (CYP) e glutationa s-transferese (GST), em compostos mais

hidrossolúveis e, portanto passíveis de serem excretados. Os produtos gerados são

extremamente eletrofílicos e irão reagir com centros nucleofílicos das células, dentre eles

regiões do DNA, levando à formação de produtos de degradação. (RIBEIRO et al, 2003).

34

4.2 Complexos organometálicos

Ao contrario do mundo mineral e mais estático, a matéria viva baseia-se em

estruturas muito mais intricadas como as células, que persistem nos estados fora do equilíbrio,

mantendo um fluxo constante de nutrientes e energia. Os organismos usam muitos dos

elementos para manter esse estado constante, assim os princípios da química inorgânica são

relevantes para o entendimento dos sistemas biológicos. Como resultado, há uma troca viva

de idéias entre químicos inorgânicos e os bioquímicos, que têm conduzido ao crescimento e

ao reconhecimento da área interdisciplinar de “química bioinorgânica”. (SHRIVER e

ATKINS, 2003).

Drogas ou moléculas que interagem com ácidos nucléicos vem sendo o objeto de

grande interesse em pesquisas, por servir como ferramenta em biologia molecular e

bioquímica, e também na terapêutica, especialmente aqueles capazes de clivar ácidos

nucléicos.(OLIVEIRA et al, 2005).

Os Complexos coordenados metais são conhecidos por interferir em processos

celulares de maneira drástica. O efeito desses metais não esta somente em interferir em

processos naturais, tais como a divisão de células e a expressão de genes, mas também

processos não naturais, como toxicidade, carcinogenicidade. (REEDIJK, 2003).

Complexos de organometálicos apresentam uma característica catiônica, estrutura

tridimensional, por estas características demonstra propensão para realizar reações de

hidrolise, redox e/ou fotoreação, tem uma aptidão natural para interagir com DNA.

Certamente, a necessidade para a regulação celular do DNA conduziu à evolução das

metalonucleases (enzimas que clivam o DNA e possuem núcleo metálico). (BOERNER E

ZALESKI, 2005).

Essas enzimas sintéticas empregam íons metálicos como cofatores para baixar a

energia de ativação da quebra de ligações químicas. O mecanismo pelo qual isso acontece

depende de cada metalonuclease. Dentre esta classe de enzimas, pode-se citar as fosfatases,

que usam íons metálicos para facilitar a quebra da ligação P-O de ácidos nucléicos. O tempo

de meia vida (t1/2), para a clivagem hidrolítica do DNA, em pH 7 e a 25 °C, tem sido

estimado em milhões de anos. Por outro lado, o DNA e o RNA são clivados em apenas alguns

segundos em condições fisiológicas quando enzimas ativadas por um, dois ou mais íons

metálicos estão presentes.(DOMINGOS et al, 2003).

Outra possibilidade seria através de um ataque oxidativo ao anel da ribose,

mecanismo este característico de complexos tais como 1,10-fenantrolina-cobre (II), Fe-EDTA

35

e seus derivados, metalporfirinas, complexos octahédricos contendo 4,7-difenil-1,10

fenantrolina e Bleomicina, por exemplo. No entanto estes compostos apresentam a

desvantagem da geração de radicais livres e a geração de fragmentos que não podem ser

enzimaticamente ligados, o que limita a sua possibilidade de uso em biologia molecular e

Bioquímica. (CLARKE, 2003).

Uma variedade bastante grande de substâncias já foi testada no que se refere a

estes resultados, compostos a base de metais de transição e lantanídeos apresentaram

resultados que, no mínimo, sugerem a necessidade de continuidade dos estudos com estas

substâncias (SCARPELLINI et al, 2003).

4.2.1 Complexos de Lantanídeos

Nos últimos anos, os lantanídeos1 têm despertado a atenção dos pesquisadores

como catalisadores em reações de hidrólise de ésteres fosfóricos. A carga total do íon

metálico e a sua habilidade para polarizar as ligações (P-O), são fatores importantes no estudo

dos mecanismos de reações promovidas por metais. Os lantanídeos (Ln3+) apresentam

vantagens sobre os metais de transição na eficiência catalítica devidas, em grande parte, ao

efeito da carga, ao elevado número de coordenação em solução (entre 8 e 9) e à sua restrição

geométrica relativamente livre se comparada aos metais de transição. (DOMINGOS et al,

2003).1

Recentemente, um grande número de complexos macrociclicos binucleares de

lantanídeos tem mostrado atividade hidrolítica na clivagem do DNA. Complexos

macrociclicos coordenados por Ho3+ (íon Hólmio) e Er3+ (íon Érbio) tem mostrado atividade

hidrolítica em temperatura de 37ºC em pH neutro, de conversão da F I para as formas II e

III(linear) do DNA. (SREEDHARA e COWAN, 2001).

Outro complexo Macrociclico binuclear de Ce4+ (íon Cério) com ligantes de

peróxido, tem um mecanismo de reação hidrolítica, envolvendo o ataque nucleofílico do

ligante peróxido ao ácido nucléico.(LIU et al, 2004).

1 Os lantanídeos são também freqüentemente chamados de elementos das terras-raras, embora as "terras" possuam os seus óxidos, não são particularmente raros: ocorrem em grandes quantidades e geralmente juntos. Todos os elementos são metais reativos e prateados, eles estão classificados na Tabela Periódica, após o lantânio (Z = 57), com números atômicos de 57 (lantânio) a 71 (lutécio). Todos eles têm dois elétrons na camada mais externa, numa configuração 6s2. (RUSSELL, 1981).

36

4.2.2 Complexos de metais de transição

A química sintética dos compostos coordenados por íons metálicos de transição,

tem possibilitado diversas combinações por sua capacidade de afinidade com diversos

ligantes. Atualmente é resultado de trabalho intenso por parte de vários grupos de pesquisa,

com especial atenção ao seu potencial terapêutico e a compreensão das atividades

desempenhadas por metais e metaloenzimas em sistemas naturais.(CLARK, 2003).

Compostos de coordenação com platina, como a cisplatina e carboplatina (Figura

21), alquilam o DNA. O mecanismo de ação está relacionado com a inibição seletiva da

síntese do DNA. As propriedades citotóxicas destes compostos, assim como de numerosos

análogos, têm sido atribuídas à sua habilidade de formar ligações cruzadas do tipo

interfilamentares como também intrafilamentares. Mais recentemente, tem-se dado particular

ênfase à capacidade da cisplatina em provocar mutações no DNA e alterar a ligação DNA-

proteína. (ALMEIDA et al, 2005).

Figura 21 - Estrutura da Cisplatina e Carboplatina

Fonte: retirado de Almeida et al, (2005).

Complexos Bi e Multi–nuclear de ferro vem sendo freqüentemente reportados

como capacidade de clivagem hidrolítica no DNA. Um desses complexos é o Bi-nuclear de

ferro Fe2 (N,N,N’,N’- tetrakis(2-benzimidazolymethyl)-2-hydroxyl-1,3-diaminopropane))

(OH)(NO3)4.(LIU et al, 2004).

Outro complexo descrito em literatura é um macrocíclico bi-nuclear de cobre

Cu2BMXD tem uma grande afinidade por DNA, sendo ativo na clivagem oxidativa destas

moléculas. Esta atividade está relacionada com um ciclo catalítico que envolve a formação de

Cu+ e radicais HO· (OLIVEIRA et al, 2005).

Segundo Rossi et al (2002) outro complexo vem sendo reportado em literatura, o

complexo bi-nuclear de cobre(II,II) [Cu2(H2bbppnol)(µ-CH3COO)(H2O)2)]Cl2•.2H2O

•, possui

37

um mecanismo hidrolitico de clivagem de ligações fosfodiéter em condições de temperatura e

pHs variados

Compostos coordenados por íons de Rutênio (II, III) que apresentaram através de

alguns testes in vitro, indícios de interação com o DNA. (CLARK, 2003).

4.2.2.1 Complexos de Rutênio

De muito compostos de metal de transição, os complexos octaédricos de Rutênio

atraíram grande interesse para seu uso como agente anticancer e representam a classe de

compostos mais extensamente estudas no grupo da platina. (ALESSIOA et al, 2004).

A produção de metalofármacos a base de Rutênio pode conceder ao complexo um

potencial de múltiplas aplicações, entre elas podemos destacar a atividade anti-tumoral; a

atenuação da reperfusão, do número de infartos e diminuição de dano; a inibição da

proliferação em linhas de células no câncer do cólon retal e a habilidade de interagir com

proteínas, tais como, albumina, apotransferinas e polimerases. (CRECZYNSKI-PASA et al,

2001).

A química sintética do Rutênio é particularmente bem desenvolvida no que se

refere à utilização de ligantes do tipo amina e imina, fornecendo novas e interessantes

possibilidades para a indústria farmacêutica. Devido a forte estabilização do campo ligante, os

estados mais comuns de oxidação são (Ru II; Ru III; e Ru IV) em solução aquosa se mostra

geralmente octaédrico e razoavelmente inerte à substituição do ligante. Vantagens são

atribuídas no desenvolvimento de complexos a base de Rutênio são respectivamente, métodos

de confiança na síntese de complexos com estruturas estáveis, afinidade e habilidade de

ajustar o ligante, taxas de transferência de elétrons e da substituição, e potencias da redução; e

um conhecimento crescente dos efeitos biológicos de complexos de Rutênio. (CLARK, 2003).

Interação entre derivados purínicos com íons de Rutênio tem atraído interesse em

um grande numero de complexos de adenina, hipoxantina e guanina, estes derivados tem sido

estruturalmente descritos, na qual a coordenação mais freqüentemente feita no Nitrogênio 7.

Em outra mão sabe-se que os derivados de adenina são importantes substratos para atividade

de citoquinas. Elas são citoxicas e poderia exibir atividade anticancer e/ou inibir o

crescimento e diferenciação de diferentes linhagens de células tumorais. (GARCÍA-RASO et

al, 2005).

38

Figura 22 - Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78 H2O.

Fonte: García-Raso et al (2005).

Reação entre [(DMSO)2H][ trans-RuCl4(DMSO)2] e o correspondente derivado de

purina, em condições ácidas, tem permitido o isolamento de dois novos complexos

[Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78H2O (Figura 22) e [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6-

butiladenina)]] (figura 23). Em ambos as estruturas uma ligeira distorção octaédrica ao redor

do íon de coordenação Rutênio(III) com quatro íons de cloros ligados em plano equatorial e

dois íons ligadas em plano axial ocupados por um enxofre e um nitrogênio. O primeiro

complexos de Ru(III)-hipoxantina a coordenação é feita pelo nitrogênio 3 e no complexo dois

é feito no nitrogênio 9. Esse complexos em teste de mobilidade eletroforética, mostraram

modificar a corrida do DNA plasmidial pBR322 e através de microscopia de força atômica

observou-se que modificou a morfologia do plasmídeo. (GARCÍA-RASO et al, 2005).

Figura 23 - Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6-butiladenina)]]

Fonte: García-Raso et al (2005).

O complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III)Cl4(DMSO-S)] (Im=imidazol,

DMSO=dimetilsufoxido) (Figura 24). (BACAC et al, 2004). NAMI-A é um complexo de

Rutênio dotado com um seletivo efeito em metástases do pulmão. NAMI-A aplicado em ratos

por seis dias não reduziu a massa do tumor mais diminuo a proliferação de metástases na qual

demonstra uma seletividade a células cancerígenas com alto taxa de divisão. (SAVA et al,

2003).

39

2

Figura 24 - estrutura do complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III) Cl4(DMSO-S)] Fonte: Sava et al (2003).

Depois do sucesso na atividade contra metástases2 do NAMI-A, hoje já estão

sendo desenvolvidos diversos complexos originados do NAMI-A. O complexos NAMI-UM-

tipo dinuclear e o NAMI-A [H2Im[trans-RuCl4(DMSO)HIm], onde mudam-se apenas a

natureza dos ligantes. Esse complexos já demonstraram uma atividade antimetástase “in

vivo” . (ALESSIOA et al, 2004).

Complexo de Rutênio (III) KP1019 (FFC14A) (figura 25) induz a formação de

peróxido de hidrogênio(H2O2) em células de tumor de coloretal. Casou também rupturas no

DNA e induzido a apoptose das células tumorais por clivagem caspase-dependente de poly-

(ADPribose)- polimerase (PARP). Esses resultados indicaram que o papel principal do

complexo KP1019 é a indução de estresse oxidativo. (KAPITZA et al, 2005).

Figura 25 - Estrutura do Complexo de Rutênio(III) KP1019 (FFC14A)

Fonte: Kapitza et al (2005).

4.2.2.1.1 Complexo polipiridínico de Rutênio trans-[RuCl2(L) 4]

Os complexos de rutênio trans-[RuCl2(nic)4] (complexo I) como ilustrado na

figura 26(A), trans-[RuCl2(i-nic)4] (Complexo II) como mostra a figura 26(B) , trans-[Ru

2 Metástases, do grego metástatis que significa mudança de lugar, tranferência é a formação de uma nova lesão tumoral a partir da primeira, mas sem continuidade entre as duas. Isso implica que as células neoplásicas se desprendem do tumor primario caminham atrvés do intersticio , ganham uma via de desseminação, são levadas para um local distante e lá formam uma nova colônia neoplasica. (ROBBINS et al, 2005).

40

(II)Cl2(dinic)4] (Complexo III), mostrado na figura 27(A) e trans-[Ru(II)Cl2(i-dinic)4]

(complexo IV) representado na figura 27(B), participam da família de complexos de rutênio

tendo como ligantes os anéis piridínicos associados a outras moléculas. (CRECZYNSKI-

PASA et al, 2001; SEIFRIZ et al, 1999; MEZZARI, 2005 e FERMIANO, 2005).

N N

Ru2+

NN

OOH OOH

OHO OHO

Cl

Cl

N N

Ru2+

NNCl

Cl

OH

OOH

O

O

OH

OH

O

(A) (B)

Figura 26 – Estrutura proposta para os complexos de rutênio trans-[RuCl2(nic)4] (A) e trans-[RuCl2(i-nic)4] (B). Fonte: Modificado de Paula et al (1998).

Os complexos (I e II), são complexos caracterizados pela presença de um grupo

carboxílico ligado ao anel piridínico, sendo respectivamente na posição 3 e 4. Estes são

capazes de diminuir os níveis de nitrito em cultura média de macrófagos, também atuando

como capturador de monóxido nitrogênio e protegendo os hepatócitos contra a peroxidação

lipídica. (CRECZYNSKI-PASAet al, 2001).

Esse complexos apresentaram respostas anti-nocepitiva significativas nas

concentrações de (45,2 - 180,7µM/Kg) para o complexo I e (0,08 – 13,6µM/Kg) para o

complexo II. (BEIRITH et al. 1999).

Esses complexos têm como provável ação à atividade de interação com DNA e

podem interferir diretamente no metabolismo de NO em sistemas biológicos.

(MARCONDES, 2002).

Segundo Amboni (2003) o complexo I (trans-[RuCl2(nic)4]) e o complexo II

(trans-[RuCl2(i-nic)4]) quando incubados por 90 minutos em cultura de células de sangue

periférico de indivíduos humanos, ambos apresentaram atividade genotóxica ou pró-

genotóxica, em todas as concentrações testadas.

41

Naspoline (2004) avaliou sua atividade genotóxica e antigenotóxica perante a

solução de leucócitos isolados, tendo uma atividade genotóxica na concentração de 1000µM

para o complexo I e, para o complexo II a atividade genotóxica em todas as concentrações

avaliadas. Sua atividade antigenotóxica foi observada no complexo I na concentração de

1000µM e no complexo II esta atividade foi observada através de uma grande queda no índice

de dano na concentração de 1000µM, mas, que ainda permaneceu significativamente elevado

quando comparado com o controle negativo.

N N

Ru2+

NN

OOH OOH

OHO OHO

Cl

Cl

O

OH

O

OHO

OH

OH

O

N N

Ru2+

NN

OOH OOH

OHO OHO

Cl

ClO

OHO

OHO

OHO

OH

(A) (B) Figura 27 - Estrutura proposta para os complexos de rutênio trans-[Ru (II)Cl2(dinic)4] (A) e trans-[Ru(II)Cl2(i-

dinic)4] (B) Fonte: Modificado de Seifritz et al (1999) e Mezzari (2005).

Os complexos (III e IV), diferentemente dos dois anteriores possuem dois ácidos

carboxílicos por anel piridinico. (SEIFRITZet al, 1999).

O complexo III não apresenta citotoxicidade, pelo menos em macrófagos, e não

afeta significativamente a resposta motora de animais quando avaliados em teste rota-rod,

nem aumenta a latência da resposta em ensaio Hot-Plate. Ele não tem ação considerável sobre

iNOS ou nNOS, porém é capaz de capturar radicais hidroxila, sendo esta uma importante

propriedade, pois esta espécie reativa de oxigênio é uma das mais agressivas em nível

biológico. Este radical é o principal produto da alta energia de ionização da água, e sua mais

importante fonte é a reação de Haber-Weiss envolvendo O2• e H2O2. Estas propriedades

tornam o complexo um possível agente antioxidante com provável ação protetora do DNA.

(SEIFRITZ et al, 1999).

Mas em baixas concentrações (8µM) quando incubado em conjunto com peróxido

de hidrogênio, o complexo III apresentou efeito protetor diferente dos anteriores, sendo este

42

mais pronunciado, provavelmente pela presença de dois ácidos carboxílicos na estrutura de

cada um de seus ligantes. (FERMIANO, 2005).

Já o complexo IV, isômero do complexo anterior, tem ação significativa na

concentração de 8µM, avaliado pelo Teste Cometa, porém em experimento

espectrofotométrico, que observa a interação do complexo com o peróxido de hidrogênio, não

é observada uma interação direta com essa espécie química, sugerindo que a queda do índice

de dano ao DNA observada é referente a uma ação indireta seja pelo metabolismo celular ou

pela oxidação do complexo de Rutênio não observada no espectrofotômetro. (MEZZARI,

2005).

4.2.2.1.1.1 Caracterização Química do Complexo em Estudo

Como foi abordado anteriormente o complexo trans-Dicloro Tetraquis Ácido-3-

piridina Carboxílico Rutênio ou trans-[Ru(II)Cl2(nic)4] apresentou atividade biológica tanto

“ in vitro” como “in vivo”.

A síntese do complexo foi realizada utilizado a metodologia do azul de

Rutênio.(PAULA et al, 1998).

A analise espectroscópica do complexo (I) apresentou uma banda na região de

399,70nm no pH 3,00, em pH 5,60 a banda sofreu um deslocamento hipsocrômico se

localizado em 397,30nm, alcançou um pico máximo de 395,40nm no pH 12,00. A principal

mudança observada em espectroscopia eletrônica para complexos que apresentam grupos

carboxílicos é o deslocamento que as bandas sofrem em virtude da variação do pH. (PAULA,

1994).

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear 1H apresenta picos

característicos do complexo. A integração relativa dos picos do espectro revela a presença dos

hidrogênios característicos no anel pirídinico e do hidrogênio ácido do grupo carboxílico. Para

ajudar na identificação foi realizada a espectroscopia vibracional onde o espectro

infravermelho apresentou as bandas características dos Ligantes. (PAULA, 1994).

Estudos voltametria cíclicos repetitiva demonstram que o complexo é apresenta

um potencial catódico em pH mais baixo e que à medida que o pH do meio aumenta, o

complexo apresenta um potencial anódico, que demonstrou ser um sistema quase reversível

para reações de ox-redução, que se assemelha as resultados de UV-vis discutido

anteriormente. (PAULA et al, 1998).

43

Segundo Paula et al (1998) na análise de titulação potenciometrica os resultados

mostram as espécies químicas do complexo em determinados pHs analisados, como

representado na figura 28. À medida que o pH aumenta ocorrer uma deprotonação do

Complexo.

Figura 28 – Distribuição de espécies protonadas correspondente ao complexo (I) em função do pH. H4C(espécie tetraprotonada), H3C(espécie triprotonada), H2C(espécie diprotonada), HC (espécie monoprotonada) e C(espécie

sem próton). Fonte: Paula et al (1998).

44

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5.1 Local.

Os testes de interação com moléculas de DNA foram realizados no Laboratório de

Expressão Gênica da Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, coordenado pelo

Professor Dr. Hernan Francisco Terenzi. As análises de genotoxicidade e mutagênese foram

realizadas no Laboratório de Bioquímica da Universidade do Extremo Sul Catarinense –

UNESC, utilizado pelo Grupo de Pesquisa em Imunologia e Genética Ambiental (GPIGA),

coordenado Pelo Professor Msc. Claus Tröger Pich.

5.2 Obtenção do complexo trans-[RuCl2(nic)4]

O complexo de Rutênio foi gentilmente fornecido pelo Professor Dr. Marcos

Marques da Silva. Paula do Laboratório de Síntese de Complexos Multifuncionais -

LASICOM da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC, tendo o mesmo sido

sintetizado nas dependências desta Universidade.

5.3 Análise de Interação com Moléculas de DNA plasmidial

Este teste é aplicado para a separação de produtos da clivagem do DNA plasmidial.

Aspectos de funcionamento: (1º) Como já foi abordado anteriormente o DNA adota diferentes

formas tridimensionais, quando o DNA está na forma superenovelada (FI), ela se encontra

tencionada e no momento que sofre um corte em uma das fitas, a molécula perda a tesão e

assim desenrolando e forma uma estrutura circular aberta (FII), agora se a molécula sofrer

outro corte na fita oposta a que foi cortada, esta assume outra forma conhecida como forma

linear (FIII), o esquema de corte está ilustrado na figura 29. (2º) As diferentes formas da

molécula de DNA plasmidial possuem mobilidade eletroforética distintas umas da outras, o

que possibilita a sua separação e quantificação, como mostrado na figura 30. (OLIVEIRA,

2006).

45

Figura 29- Esquema de Corte da Molécula de DNA Plasmidial

Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

Figura 30 – Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separação das formas do DNA plasmidial

5.3.1 Obtenção do Plasmídeo

Foi utilizado o plasmídio33 pBluescript II SK(+) (pBSK-II), como modelo de molécula

de DNA. Esse plasmídio é derivado do pUC19, possui 2961 pares de bases e contém um gene

para resistência a ampicilina, como ilustrado na figura 31 do mapa do plasmídio.

Figura 31–Mapa do Plasmídio pBSK-II

Fonte: kit HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM

3 Plasmídeos são elementos extracromossomais com capacidade de replicação autônoma, constituídos por uma molécula de DNA fita dupla circular. Qualquer plasmídeo contém todas as seqüências para sua autoduplicação, incluindo uma origem de replicação (oriC) e, usualmente, um gene que codifica uma proteína que regula o processo. Além disso, muitos plasmídeos carregam uma considerável quantidade de informações genéticas adicional, grande parte da qual pode ser importante para a célula bacteriana em seu ambiente natural. (ZAHA et al, 2001).

46

5.3.1.1 Preparação de bactérias competentes

Essa metodologia é empregada com a finalidade de tornar cepas bacterianas

capazes de incorporar facilmente fragmentos de DNA, através de tratamento químico. Essa

preparação foi realizada pelo Laboratório de Expressão Gênica da UFSC, no qual utilizou

uma cepa de bactéria E.coli DH5α.(AUSUBEL, 1995).

Conforme o protocolo utilizado pelo laboratório, a técnica funciona da seguinte

maneira: (1º) as cepas bacterianas foram inoculados em 4 mL de uma cultura de bactéria pré-

crescida overnigth (durante a noite) 37°C, em 50 mL de meio LB líquido (peptona 1%,

extrato de levedura 0,5%, NaCl 1% em pH = 7,5). Esta cultura foi incubada a 37 ºC, sob

agitação (140RPM), até atingir A590 = 0,4 (aproximadamente 18 horas).(2º) esse passo a

cultura bacteriana é dividida em alíquotas em eppendorfs, e mantidas em banho de gelo por

10 minutos.(3º) as alíquotas foram centrifugadas por 7 minutos a 1600g à 4ºC, o sobrenadante

foi desprezado, foi acrescentado 10mL de solução de CaCl2 gelada(CaCl2 60 mM, glicerol

15%, tampão PIPES 10 mM pH = 7,0)ao precipitado.(3º) os tudos com as alíquotas foram

centrifugados novamente agora por 5 minutos e 1600g à 4ºC, onde o sobrenadante foi

desprezado e o precipitado restante foi suspenso em 10mL de solução de CaCl2, onde foi

mantido em banho que gelo por 30 minutos, (4º) o material foi centrifugado mais uma vez em

5 minutos em 1600g à 4ºC, onde o sobrenadante foi desprezado e o precipitado suspendido

em 1,5mL de solução de CaCl2, onde foram divididas em alíquotas e armazenadas em freezer

(-80ºC), para posterior utilização experimental. (AUSUBEL, 1995).

5.3.1.2 Transformação das bactérias competentes

Essa metodologia também foi realizada pelo Laboratório de Expressão Gênica da

UFSC, A transformação bacteriana tem por objetivo introduzir o plasmídio desejado nas

bactérias competentes, através do choque térmico. Com esse método obtém–se em placas de

petri com meio sólido, colônias de bactérias transformadas com quantidades grandes do

plasmídeo desejado. (AUSUBEL, 1995).

O funcionamento da metodologia é descrito agora: (1º) as bactérias competentes e

o plasmídio desejado foram retirados do freezer -80°C e descongelados em banho de gelo.

(2º) foram transferidos 10-100ng do plasmídio para um tubo de ensaio com 50 µl de bactérias,

onde este foi colocado em repouso por 15 minutos em banho de gelo, em seguida, foi

transferido para banho Maria a 37-42ºC por 1 minuto.(3º) foi adicionado ao tubo 1mL de

47

meio LB líquido, onde o mesmo foi levado para uma estufa 37ºC por 60 minutos. Após o

termino do tempo o tubo foi centrifugado por 2 minutos a 5000g, onde se retirou 750µL do

sobrenadante, e as células bacterianas foram suspensas com aproximadamente 250µL

restante.(4º) a suspensão de bactérias foi plaqueada com ajuda de uma alça de vidro, em uma

placa de petri contendo o meio LB sólido (peptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%,

agar 1,5% em pH = 7,5) e ampicilina (100 µg/ml de meio LB – antibiótico utilizado para a

seleção das bactérias portadoras do plasmídio). Essa placa pronta foi levada para estufa a

37ºC com a tampa para cima, por 60minutos, ao termino da incubação a placa foi virada com

a tampa para cima, deixada overnight, para o crescimento bacteriano.(5º) O ultimo passo foi

armazenar a placa em geladeira por no máximo 10 dias. (AUSUBEL, 1995).

5.3.1.3 Extração do DNA plasmidial das bactérias transformadas

A extração foi realizada pelo Laboratório de Expressão Gênica da (UFSC) que

utiliza um kit comercial, o HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM, onde se seguiu o

protocolo padrão do fabricante, como representado na figura 32, onde mostra

esquematicamente o processo de extração do DNA plasmidial.

Figura 32 – Esquema representativo do método da estração do DNA.

Fonte: kit HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM

5.3.1.3.1 Análise da Pureza do DNA plasmidial

A quantificação e pureza do DNA plasmidial, foi realizado em um

espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, que pertence ao Laboratório

de Expressão Gênica da (UFSC).

Como as bases nitrogenadas do DNA absorvem energia em uma faixa de 260nm e

os principais contaminantes são RNAs e proteínas (absorvem em 280nm). Esta avaliação é

48

feita através do valor da relação A260/A280, onde valores entre 1,8 e 1,9 indicam uma solução

de DNA com alta pureza. (OLIVEIRA, 2006).

5.3.2 Incubações

Primeiramente foram preparadas soluções de complexo trans-[RuCl2(nic)4] e do

ligante(ácido nicotínico) descomplexado com uma molaridade de 2000µM. Forma feitas 4

soluções com os determinados tampões( PIPES pH 6,0 ; PIPES pH 6,5; PIPES pH 7,0 e

HEPES pH 8,0), todas essas soluções de complexo e ligante continha seus respectivos

tampões com uma molaridade de 50mM.

As incubações das soluções de complexo e do ligante com o DNA plasmidial

pBSK-II foram realizadas em temperaturas controlada de 37ºC e 50ºC. Ao término do período

de incubação as reações foram interrompidas pela adição de 2 µL de tampão de corrida 6X

concentrado (EDTA 0,25 M, glicerol 50% e azul de bromofenol 0,01% - pH 8,0), para cada

20 µL de reação, e imediatamente resfriadas em banho de gelo. Em seguida, as amostras

foram submetidas à eletroforese em gel de agarose ou armazenadas a -20°C para uso

posterior.

5.3.2.1 Interação do ligante com moléculas de DNA

Foi realizado com reações contendo um volume final de 60µL, o que possibilitou

a realização da análise em triplicatas.A reações foram incubadas por um período de 16 horas à

37ºC, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0). Para cada uma das incubações realizadas nesses pHs, foram

utilizadas concentrações de 25mM do respectivo tampão. As concentrações do ligante (ácido

nicotínico) utilizadas no teste foram 0µM(controle); 250µM; 500µM e 1000µM, incubadas

com aproximadamente 25µM de DNA pBSK II.

5.3.2.2 Interação do complexo com moléculas de DNA

Foi realizado com reações contendo um volume final de 60µL, o que possibilitou

a realização da análise em triplicatas. A reações foram incubadas por um período de 16 horas

à 37ºC, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0). Para cada uma das incubações realizadas nesses pHs, foram

utilizadas concentrações de 25mM do respectivo tampão. As concentrações do complexo

49

utilizadas no teste foram 0µM(controle); 250µM; 500µM e 1000µM, incubadas com

aproximadamente 25µM de DNA pBSK II.

5.3.2.3 Interação do complexo com moléculas de DNA na presença de DMSO

As reações foram preparadas na presença de 10% de DMSO, que age como

capturador de radicais hidroxila (OH•.), que podem aparecer com uma atividade oxidativa do

complexo na presença de oxigênio. Da mesma forma que na outras reações esta foi incubada

por 16horas à 37ºC, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0), contendo 25mM do respectivo tampão e

utilizando as concentrações de complexo 0µM(controle); 250µM; 500µM e 1000µM

incubadas com aproximadamente 25µM de DNA pBSK-II. Da mesma forma que nas outra

reação, esta foi realizado com um volume final de 60µL o que possibilitou sua análise em

triplicata.

5.3.2.4 Cinética catalítica do complexo sobre o DNA

Para a verificação da atividade catalítica as reações foram realizadas a 50ºC em

tampão PIPES pH 6,5 e monitorada por 8 horas. As concentrações utilizadas foram às

mesmas da outras reações comentadas acima 0µM(controle); 250µM, 500µM e 1000µM de

complexo. Cada tubo de reação foi planejado para ter um volume final de 240µL o que

possibilitou a retirada de 6 pontos (60µL cada), que corresponde a tempos de 0h, 1h, 2h, 4h,

6h e 8h.

Os resultados obtidos foram analisados utilizando o modelo matemático de

Lineweaver-Burk para equação de pseudo-Michaelis-Meten, para obtenção dos parâmetros:

Km, Vmax, Kcat e Kcat/Km.

5.3.3 Confecção do gel de agarose e corrida eletroforética

A preparação dos géis de agarose foi feita a partir da dissolução, sob aquecimento em

forno de microondas, da quantidade de agorase necessária para um gel com concentração de

0,8 %, em solução de TBE 0,5x concentrado (Tris 44,5 mM, ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1

mM – pH 8,0 ). Após resfriamento da solução até 60°C, é adicionado o brometo de etídio

(concentração final de 0,3 µg/ml). Colocou-se a solução em uma forma plana contendo os

pentes, sendo preciso esperar em torno de uma hora para polimerização da agarose e a fixação

50

dos poços. Foram aplicados 20µL de cada amostra nos poços do gel, para em seguida ser

aplicado a uma corrida eletroforética em (100V e 30 mA), por aproximadamente 2horas ou

até que a frente de migração (azul de bromofenol) atingisse o final do gel. As fontes de

corrente contínua Life Technologies™ modelo 250 ou 250EX foram utilizadas ver (figura

33), mostra de maneira ilustrativa a realização deste tipo de eletroforese. Com o término da

corrida foi feita a visualização através de um transiluminador (Biorad®) e programa de

computador adequado para comparar as massas de DNA. Por fim, os géis resultantes são

digitalizados num sistema de fotodocumentação DigiDoc.It System (UVP), basicamente

composto por um transiluminador UV (λ = 302 nm) e uma câmera digital acoplada a um

microcomputador. Em seguida são analisados as bandas formadas com o software

LabWorks™ 4.0, UVP.

Figura 33 – Mostra um esquema representativo da eletroforese em gel de agarose. (A) a matriz é solidificada

deixando forma os poços. (B)as amostra são depositadas no poços. (C) são submetidas a um campo elétrico.(D) os fragmentos apresentam uma migração diferencial.

Fonte: modificado de Oliveira (2006).

5.4 Análise de Genotoxicidade e Mutagênese

5.4.1 Animais e Tratamento

Após a aprovação do projeto pelo comitê de ética os animais foram obtidos no

biotério da UNESC.

Para realização dos experimentos foram utilizados camundongos CF1 (Mus

muscullus), machos (25 – 40 g de peso), que foram pesados e divididos em 4 (quatro) grupos

e mantidos em gaiolas plásticas sobre condições controladas (ciclo claro-escuro de 12 h,

temperatura 25·C (60% umidade do ar), e receberam ração comercial e água ad libitum para

adaptação).

51

Os animais foram tratados com complexo via intraperitoneal nas concentrações de

45,2µM/Kg (grupo teste 1); 90,4µM/Kg (grupo teste 2); 180,7µM/Kg (grupo teste 3) que já se

demonstraram efetivas na regulação de NO segundo Beirith et al (1999), e com o respectivo

grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0). Na análise de genotoxicidade para cada concentração

e controle foi utilizado um n=6 para cada grupo, para a análise de mutagênese foram

utilizados um n=3 para cada grupo. O período de exposição para todos os camundongos foi de

0 a 120 minutos para análise de genotoxicidade (sangue periférico) e de 24 horas para

Mutagênese (células de medula óssea). Para o primeiro procedimento o sangue periférico foi

coletado por punção ocular e para o último procedimento os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical e a medula retirada por processo cirúrgico.

5.4.2 Análise de Genotoxicidade

5.4.2.1 Teste cometa

O Teste Cometa ou SCGE (Single Cell Gel Assay), que tem sido cada vez mais

utilizado, pois permite a avaliação de danos causados no DNA e o reparo do mesmo, o

potencial genotóxico de substâncias variadas pode ser avaliado pelo teste cometa.

(GUECHEVA et al. 2001). Pode-se realizar o teste em qualquer organismo vivo ou tipo

celular, apresentando algumas vantagens quando comparado a outros testes para detecção de

substâncias que promovem dano ao DNA, porem, não é utilizado para detectar mutação, mas

sim lesões genômicas que, após serem processadas podem resultar nesta. (RIBEIRO, 2003).

Este método pode ser realizado em tempo que varia de horas a dias, além de poder ser

aplicado a qualquer célula de organismo vivo, tornando-o um excelente método para

avaliações ambientais, de fármacos e produtos químicos. (SILVA et al., 2000; MALUF e

ERDTMANN, 2000). Também pode ser avaliado o número de células que tiveram ou não o

seu DNA afetado e este valor, chamado de “freqüência de dano ao DNA”, é expresso como

porcentagem de células que tiveram algum dano mensurável ao seu código genético.

O teste Cometa em pH alcalino está representado na figura 34. Após os

tratamentos, as células foram colhidas e dissolvidas em agarose low-melting point (0,75%) e

então plaqueadas sobre uma lâmina de microscopia com pré-cobertura de agarose (1,5%). As

lâminas foram feitas em duplicata para cada tratamento. As células foram lisadas com uma

solução de lise (2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10% DMSO

pH 10) por no mínimo duas horas. Após a lise, as lâminas foram colocadas em uma cuba de

52

eletroforese horizontal contendo uma solução tampão (300mM NaOH e 1 mM EDTA, pH

13,00-13,50 a 4°C) que permite o desenrolamento do DNA, as laminas ficaram incubadas por

20 minutos nesta solução alcalina feito na hora do uso. Uma corrente elétrica de 300mA e

25V foi aplicada por 15 minutos a 4°C. As lâminas foram então neutralizadas com 0.4M Tris,

pH 7.5. Após estarem secas, as lâminas foram fixadas por uma solução contendo ácido

tricloroacético 15%, sulfato de zinco 5% e glicerol 5% e então coradas com solução de

coloração contendo carbonato de sódio 5% mais nitrato de amônio 0,1%, nitrato de prata

0,1%, ácido tungstosilicico 0,25% e formaldeído 0,15%. A reação foi parada com acido

acético 1%. (SINGH et al. 1988, HARTMANN; SPEIT, 1997).

Figura 34 – Descrição simplificada do teste cometa.

Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann, Henriques (2003).

Foram analisados num total de 100 células para cada grupo teste, 50 por lamina,

em microscópio óptico NIKON®, com aumento de 400x, onde se observaram os núcleos

contendo DNA intacto se apresentam redondos, nas células lesadas observa-se migração de

DNA para fora do núcleo, apresentando forma similar a um “cometa”, de onde se origina a

nomenclatura do teste (Figura 35). As células são classificadas visualmente em cinco classes,

de acordo com o tamanho da cauda, sem danos - classe 0 até danos máximos - classe 4.

Assim, o índice de danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0; 100 células

observadas completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 células observadas com dano

máximo).(VILLELA et al apud SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES 2003).

53

Figura 35 - Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3; (c) dano classe 4.

Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann, Henriques (2003).

5.4.3 Analise de Mutagênese

5.4.3.1 Teste de micronúcleo

O teste do micronúcleo é o ensaio “in vivo” mais amplamente utilizado para a

detecção de agentes clastogênicos (que quebram Cromossomos), e de agentes aneugênicos

(que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal). (RIBEIRO, et al, 2003).

Este teste foi inicialmente desenvolvido em eritrócitos de medula óssea de camundongo, mas

também é realizado em ratos. (SCHMID, 1976).

As características básicas do teste são: (1º) o efeito do químico é observado em

eritrócitos policromáticos (PCEs) anucleados; (2º) os (PCEs) tem um tempo de vida

relativamente curto, de modo que qualquer micronúcleo que ele contenha deve ter sido gerado

como resultado de danos cromossômicos induzidos recentemente; (3º) os micronúcleos são

facilmente identificáveis e a sua distribuição é bem definida; como na figura 36 e (4º) a

freqüência de micronúcleo induzida em (PCEs) é dependente do tempo de amostragem.

(RIBEIRO et al, 2003).

Figura 36 - Diferença na coloração de PCE e NCE: (a) eritrócito policromático micronucleado (PCEMN); (b)

eritrócito policromático; (c) eritrócito normocromatico. Fonte: Ribeiro et al (2003).

O teste funcionou da seguinte maneira: (1º) após 24 horas do tratamento os 12

(doze) camundongos foram sacrificados, e através de procedimento cirúrgico retirou-se o

54

fêmur do animal; (2º) a extremidade final proximal do fêmur foi cortada para expor o canal da

medula; (3º) o canal foi previamente preenchido com soro fetal bovino com ajuda de uma

agulha de uma seringa de 1mL, foi inserida firmemente na abertura do fêmur, injetando-se o

soro, de modo a empurrar a medula para cima de uma lamina de microscopia onde se fez uma

homogeneização e esfregaço com uma lamínula; (4º) deixou-se secar as laminas em

temperatura ambiente (25ºC), logo depois foram fixadas em uma solução contendo metanol

puro por 10 minutos, e novamente foram deixadas para secar em temperatura ambiente (25º);

(5º) a coloração das lâminas foi feita com o corante Giemsa diluído em solução tampão

fosfato (1x) com (pH 6,8), na proporção de 1:10, durante 15 minutos; (6º) após a coloração, as

lâminas foram lavadas com água destilada, onde se removeu o excesso de corante e foram

deixadas para secar em temperatura ambiente (25ºC). A coloração serve para diferenciar

eritrócito policromático (PCE) de eritrócito normocromático (NCE). Os (PCE) ou jovens se

coram de azul claro e os (NCE) se coram de vermelho-telha. (RIBEIRO et al, 2003).

5.5. Análise Estatística

As análises estatísticas dos resultados obtidos foram realizadas através de análise

de variância (ANOVA) e do Teste t de Student, para ambos os testes foi utilizado o software

Microcal Origin 6.0, admitindo níveis de significância de p<0,05; p<0,01 e p<0,001.

55

6 RESULTADOS

6.1 Análises de Interação com Moléculas de DNA plasmidial

Na Tabela 1 é mostrado as fotos dos géis das incubações do DNA com o ligante

não complexado e o complexo, em ausência e presença de DMSO à 37ºC por 16 horas.

Tabela 1 – Fotos dos géis das incubações do ligante e complexo .

pH Ligante Complexo

Em ausência de DMSO Em presença DMSO

(0µM) (250µM) (500µM) (1000µM) (0µM) (250µM) (500µM) (1000µM) (0µM) (250µM) (500µM) (1000µM)

6,0

7,0

8,0

56

6.1.1 Interação do ligante com moléculas de DNA

Na figura 37 mostra a porcentagem das formas plasmidiais induzido por

concentrações variadas do ligante não complexado a uma temperatura de 37ºC por 16 horas,

nos seguintes pHs (6,0; 7,0 e 8,0) testados.

Os resultado em pH 6,0 apresentou ambas as formas de DNA, no controle (0µM),

manteve 78,451% na FI e 21,548% na FII. A concentração de 250µM teve 77,181% na FI e

22,818 na FII. Na incubação com 500µM apresentou 77,430% da FI e 22,569% na FII. No pH

7,0 o controle (0µM) mostrou 95,804% na FI e 4,196% na FII, a concentração de 250µM teve

93,348% do DNA plasmidial na FI e 6,52% na FII. A concentração de 500µM manteve

91,813% na FI e 8,187% na FII. A concentração de 1000µM teve 93,149% na FI e 6,851% na

FII. No pH 8,0 o DNA plasmidial se apresentou em diferentes formas para todas as

concentrações. Na incubação controle (0µM) apresentou 89,443% na FI e 10,557% na FII, a

concentração de 250µM apresentou o DNA com 88,443% na FI e 11,284% na FII, A

concentração de 500µM apresentou 90,117% de FI e 9,883% FII do DNA. Em 1000µM de

complexo o DNA manteve 89,334% na FI e 10,656% na FII.

Tabela 2 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do ligante com o DNA plasmidial

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

[ ] %FI %FII %FI %FII %FI %FII

0µM 78,451 21,549 95,804 4,196 89,443 10,557

250µM 77,181 22,819 93,348 6,652 88,716 11,284

500µM 77,430 22,570 91,813 8,187 90,117 9,883

1000µM 77,526 22,474 93,149 6,851 89,344 10,656

57

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

[0µM] [250µM] [500µM] [1000µM] [0µM] [250µM] [500µM] [1000µM] [0µM] [250µM] [500µM] [1000µM]

% d

a F

orm

a pl

asm

idia

lFIFII

pH=6,0 pH=7,0 pH=8,0

Figura 37 - Média da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentrações crescentes do ligante (ácido nicotínico) descomplexado, nos pHs(6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no gráfico.

6.1.2 Interação do complexo com moléculas de DNA

A figura 38 mostra a porcentagem das plasmidiais causado por concentrações

variadas de complexo trans-[RuCl2(nic)4] a 37ºC por 16 horas, nos seguintes pHs (6,0; 7,0 e

8,0) testados.

A análise dos géis das incubações feitas no pH 6,0 mostrou que no controle

(0µM), as porcentagens das FI e FII de DNA plasmidial foram respectivamente,

70,872%±2,23 e 36,504%±3,07. Na concentração de 250µM ocorreu uma diminuição na

forma FI para 47,383%±0,84 e ocorreu um aumento na FII para 60,853%±0,98. Em 500µM

também ocorreu uma diminuição da FI para 51,407%±0,75 e um aumento na FII para

56,957%±0,90. A maior atividade de clivagem do DNA plasmidial ocorreu na concentração

de 1000µM onde reduziu a forma FI para 47,046%±1,03 e aumentou a FII para

61,174%±1,21. A diferença estatística é notada nas concentrações de 250µM, 500µM e

1000µM com p<0,001 tendo como referencia para comparação com controle negativo

contendo 25mM de tampão PIPES pH 6,0.

Os géis do pH 7,0 mostraram que ocorreu a clivagem do DNA plasmidial da FI

para FII em todas as concentrações. No controle a porcentagem da FI foi de 89,850%±1,02 e

o da FII foi de 10,150%±1,25.Na concentração de 250µM teve uma redução na FI para

58

86,486%±1,58 e um aumento na FII para 13,514%±1,9. Em 500µM ocorreu também uma

redução da FI para 85,776%±1,24 e um aumento para FII em 14,224%±1,51. Na maior

concentração 1000µM a FI foi reduzida para 83,509%±0,98 e a FII aumentou para

16,491%±1,20. A diferença estatística é notada nas concentrações de 250µM, 500µM e

1000µM com p<0,01 tendo como referencia para comparação com controle negativo

contendo 25mM de tampão PIPES pH 7,0.

No pH 8,0 a clivagem do DNA plasmidial ocorreu em todas as concentrações

analisadas. No controle (0µM) a FI teve uma porcentagem de 86,663%±0,26 e a FII uma

porcentagem de 13,337%±0,32. Na incubação contendo 250µM de complexo a FI foi

reduzida para 85,633%±0,37 e a FII aumentou para 14,367%±0,45. Na concentração de

500µM ocorreu à diminuição da FI para 84,359%±0,52 e um aumento da FII para

15,641%±0,64. Em 1000µM a porcentagem da FI diminui para 83,166%±0,89 e a FII

aumentou para 16,834%±1,09. A diferença estatística é notada nas concentrações de 250µM,

500µM e 1000µM com p<0,01 tendo como referencia para comparação com controle

negativo contendo 25mM de tampão HEPES pH 8,0.

Tabela 3 - Porcentagem da formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA plasmidial.

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

[ ] %FI %FII %FI %FII %FI %FII

0µM 70,872±2,23 36,504±3,07 89,850±1,02 10,150±1,25 86,663±0,26 13,337±0,32

250µM 47,383±0,84 60,853±0,98 86,486±1,58 13,514±1,93 85,633±0,37 14,367±0,45

500µM 51,407±0,75 56,957±0,90 85,776±1,24 14,224±1,52 84,359±0,52 15,641±0,64

1000µM 47,046±1,03 61,174±1,21 83,509±0,98 16,491±1,20 83,166±0,89 16,834±1,09

59

0

20

40

60

80

100

[0µM] [250µM] [500µM] [1000µM] [0µM] [250µM] [500µM] [1000µM] [0µM] [250µM] [500µM] [1000µM]

% d

a fo

rma

plas

mid

ial

FIFII

pH=6,0 pH=7,0 pH=8,0

******

***

** ** ** ** ****

Figura 38 – Média da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentrações crescentes do

complexo, nos pHs (6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no gráfico. (**p<0,01 e ***p<0,001).

6.1.3 Interação do complexo com moléculas de DNA em presença de DMSO

A figura 39 mostra a comparação da porcentagem das formas plasmidiais causado

por concentrações variadas de complexos trans-[RuCl2(nic)4] no pH 6,0, a 37ºC por 16 horas

em presença e ausência de DMSO.

Em presença de DMSO os seguintes resultados foram apresentados, no controle a

porcentagem da FI foi de 70,913%±0,35 e a de FII foi de 29,089%±0,432. Na concentração

de 250µM a porcentagem da FI foi de 56,618%±0,82 e aumentou em relação a essa mesma

concentração em ausência de DMSO, já a FII em comparação com esta diminuiu para

43,382%±1,01. Em 500µM de complexo com a presença de DMSO a porcentagem da FI

aumento em relação à concentração sem DMSO para 62,356%±0,94 e a FII diminui para

37,643%±1,15. A concentração de 1000µM em presença de DMSO aumentou a porcentagem

da FI e diminuiu a FII respectivamente para 56,652%±1,09 e 43,348%±1,34; em relação à

concentração de 1000µM em ausência de DMSO.

A diferença estatística é notada nas concentrações de 250µM, 500µM e 1000µM

contendo DMSO, com p<0,001 tendo como referencia para comparação com as mesmas

concentrações e controle em ausência de DMSO.

60

Tabela 4 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 6,0.

Ausência de DMSO Presença 10% de DMSO

[ ] %FI %FII %FI %FII

0µM 70,872±2,23 36,504±3,07 70,911±0,35 29,089±0,43

250µM 47,383±0,84 60,853±0,98 56,618±0,82 43,382±1,01

500µM 51,407±0,75 56,957±0,90 62,357±0,95 37,643±1,16

1000µM 47,046±1,03 61,174±1,21 56,652±1,01 43,348±1,34

0

20

40

60

80

100

[0µM] [250µM] [500µM] [1000µM] [0µM] [250µM] [500µM] [1000µM]

% d

a fo

rma

plas

mid

ial

FIFII

****** ***

Sem DMSO Com DMSO

Figura 39 - Comparação da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 6,0, na

presença ou não de 10% DMSO. (***p<0,001).

Na figura 40 é mostrado a porcentagem das formas plasmidiais causado por

concentrações variadas de complexos trans-[RuCl2(nic)4] no pH 7,0, a 37ºC por 16 horas em

presença e ausência de DMSO.

Em presença de DMSO os seguintes resultados foram apresentados, no controle a

porcentagem da FI foi de 91,993%±4,25 e a de FII foi de 8,007%±5,21. Na concentração de

250µM a porcentagem da FI foi de 89,143%±3,05 e a FII apresentou uma porcentagem de

10,857%±3,74. Em 500µM de complexo a porcentagem da FI foi de 87,461%±2,44 e a FII se

apresentou com 12,539%±2,99. A concentração de 1000µM apresentou uma porcentagem

61

para FI de 87,247%±2,55 e para a FII a porcentagem foi de 12,753%±3,12.

A diferença estatística não foi notada em nenhuma das concentrações testadas,

contendo DMSO, tendo como referencia para a comparação com as mesmas concentrações e

controle em ausência de DMSO.

Tabela 5 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 7,0.



0µM 89,850±1,02 10,150±1,25 91,993±4,25 8,007±5,21

250µM 86,486±1,58 13,514±1,93 89,143±3,05 10,857±3,74

500µM 85,776±1,24 14,224±1,52 87,461±2,44 12,539±2,99

1000µM 83,509±0,98 16,491±1,20 87,247±2,54 12,753±3,12

0

20

40

60

80

100


% d

a fo

rma

plas

mid

ial

FIFII

Sem DMSO Com DMSO


presença ou não de 10% DMSO.

A figura 40 mostra a porcentagem das formas plasmidiais causado por

concentrações variadas de complexo trans-[RuCl2(nic)4] no pH 8,0, a 37ºC por 16 horas em

presença e ausência de DMSO.

Os resultados obtidos a partir dos géis em pH 8,0, na presença de DMSO, mostrou

62

os seguintes resultados, o controle apresentou uma porcentagem para FI de 89,317%±0,23 e

para FII de 10,683%±0,29. Em 250µM apresentou 87,752%±0,42 para FI e 12,224%±0,44

para FII. Na concentração de 500µM a porcentagem da FI foi de 87,776%±0,36 e a FII se

apresentou com 12,223%±0,43. Na concentração de 1000µM mostrou uma porcentagem de

DNA plasmidial na FI de 85,982%±0,39e 14,018%±0,48 para FII.

A diferença estatística é notada no controle com p<0,001 e nas concentrações de

250µM e 500µM com p<0,01 e na concentração de 1000µM com p<0,05, contendo DMSO,

tendo como referencia para comparação com as mesmas concentrações e controle em

ausência de DMSO.

Tabela 6 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 8,0.



0µM 86,663±0,26 13,337±0,32 89,317±0,23 10,683±0,29

250µM 85,633±0,37 14,367±0,45 87,752±0,42 12,248±0,52

500µM 84,359±0,52 15,641±0,64 87,776±0,36 12,224±0,44

1000µM 83,166±0,89 16,834±1,09 85,982±0,39 14,018±0,48

0

20

40

60

80

100


% d

a fo

rma

plas

mid

ial

FIFII

** ** ****

Sem DMSO Com DMSO


presença ou não de 10% DMSO. (***p<0,001; **p<0,01 e *p<0,05).

63

6.1.4 Cinética catalítica do complexo sobre moléculas de DNA

Na Tabela 2 é mostrado as fotos dos géis da análise de cinética catalítica do

complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre moléculas de DNA plasmidial em uma temperatura de

50ºC em pH 6,5 monitorada por 480 minutos (8 horas).

Tabela 7 - Fotos do Géis do experimento de cinética catalítica do complexo.

[ ] 1ºgel 2ºgel

0min 60min 120min 240min 360min 480min 0min 60min 120min 240min 360min 480min

0µM

250µM

500µM

1000µM

Na figura 42 mostra a atividade catalítica do complexo sobre o DNA plasmidial

em diferentes concentrações do complexo trans-[RuCl2(nic)4] a 50ºC por 480minutos

(8horas) horas no pH 6,5.

A degradação do DNA por diversas concentrações de complexo foi demonstrada

no gráfico como escala logarítmica. Sendo que o valor da degradação do controle foi utilizado

para normatizar a degradação natural do DNA nesse meio e não interferir nos resultados.

Foram obtidas as seguintes equações de reta para cada concentração utilizada no teste. Em

250µM y=-0,0005x-0,1159 com o coeficiente de correlação linear de R2=0,6572, em 500µM

64

y= -0,0007x-0,0991 e R2=0,7591 e em 1000µM y=-0,0001x-0,0723 e R2=0,9043.

-0,60

-0,50

-0,40

-0,30

-0,20

-0,10

0,000 60 120 180 240 300 360 420 480

Tempo em minutos

ln (S

/S0)

Controle

250µM

500µM

1000µM

Linear (Controle)

Linear (250µM)

Linear (500µM)

Linear (1000µM)

Figura 42 – Atividade catalítica de diversas concentrações do complexo sobre o DNA plasmidial pBSK-II em

480 minutos de incubação a um temperatura de 50ºC em pH 6,5.

Na figura 43 mostra a constante catalítica observada para as concentrações de

complexo trans-[RuCl2(nic)4] analisadas a 50ºC por 480minutos (8horas) horas no pH 6,5. A

figura 43 foi construído em base aos valores de “a” da equação da reta da figura anterior.

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 250 500 750 1000

[complexo](µM)

kobs

min

-1

Figura 43 - Constante catalítica do complexo calculado em base a concentrações crescentes de complexo e a

quantidade em moles de substrato degradado por minuto.

Na figura 44 usou-se o modelo de Lineweaver-Burk para a equação pseudo-

Michaelis-Menten, para determinar a velocidade máxima (Vmax) e constante média de reação

(Km) do complexo, que é a sua concentração necessária para obtenção da metade da

velocidade máxima de reação. Os valores obtidos da equação foram os seguintes:

Vmax=1,4x10-3 Mol/ min-1 e um Km =457,14µM.

65

y = 326531x + 714,29

R2 = 0,9884

0

500

1000

1500

2000

2500

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004

1 / [complexo]

1 / V

o

Figura 44 – modelo de Lineweaver-Burk

6.2. Análise de Genotoxicidade e Mutagênese

6.2.1 Teste Cometa

6.2.1.1 Índice de Fragmentação ao DNA

A figura 45 demonstra a média do índice de fragmentação no DNA causado pelo

complexo trans-[RuCl2(nic)4] em células sangüíneas dos seis camundongos testados, durante

um período de 120 minutos.

No tempo 0 minuto retirada antes da aplicação do complexo, o grupo controle e os

grupos teste 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg apresentaram índices de fragmentação

ao DNA de 22,667±4,55, 23,333±5,28, 25,00±4,23 e 22,667±5,01 respectivamente. Em base

a estes dados obtidos não foi notada nenhuma diferença estatística tendo como referencia a

comparação das dos grupos testes com o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

No tempo de 30 minutos o índice de fragmentação ao DNA para o grupo controle

e os grupos teste 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg foram de 30,167±7,31,

60,667±3,09, 66,500±10,75 e 71,500±16,61 respectivamente para cada grupo. A diferença

estatística é notada nas concentrações de 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg com

p<0,001, tendo como referência para comparação com o grupo controle (Tampão PIPES pH

7,0).

No tempo de 60 minutos, o índice de fragmentação ao DNA apresentado pelo

grupo controle e grupos teste 45,2; 90,4 e 180,7µM/Kg forma os seguintes 36,667±5,13,

68,167±8,64, 70,667±10,09 e 109,667±30,10 respectivamente. Com os seguintes dados

66

obtidos foi possível notar uma diferença estatística nas concentrações de 45,2µM/Kg;

90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg com p<0,001, tendo como referência para comparação com o

grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

No tempo de 120 minutos, o índice de fragmentação ao DNA das células

analisadas para o grupo controle e grupos teste 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg

foram de 34,667±11,43, 37,00±14,70, 38,667±13,41 e 37,833±14,19 respectivamente. Não foi

observada diferença estatística no índice de fragmentação dos grupos testes, tendo como

referência a comparação como o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

Tabela 8 - Valores do índice de fragmentação do DNA.

Tempo em minutos

[ ] 0 30 60 120

Controle 22,667±4,55 30,167±7,31 36,667±5,13 34,667±11,43

45,2µM/Kg 23,333±5,28 60,667±3,09 68,167±8,64 37,00±14,70

90,4µM/Kg 20,50±4,23 66,50±10,75 70,667±10,09 38,667±13,41

180,7µM/Kg 22,667±5,01 71,50±16,61 109,667±30,10 37,833±14,19

É importante relembrar que o índice de dano ao DNA varia de 0 (0x100 numero

de células analisadas) à 400 (4x100 numero de células analisadas).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 30 60 90 120

Tempo em Minutos

Índi

ce d

e fr

agm

enta

ção

do D

NA

Controle[45,2]µM/Kg[90,4]µM/Kg[180,7]µM/Kg

Figura 45 –Índice de fragmentação do DNA de células sangüíneas de camundongos CF1.

67

6.2.1.2 Freqüência de dano ao DNA

A freqüência de dano ao de DNA é realizado por um calculo simples de

porcentagem, das células analisadas no teste cometa que tenham o seu DNA fragmentado

(danificado).

Na figura 46 é mostrado as médias das porcentagens de células sanguíneas com o

DNA danificado, dos seis camundongos analisados, causado pelo complexo trans-

[RuCl2(nic)4], durante um período de exposição de 120 minutos.

No tempo 0 minuto retirada antes da aplicação do complexo, o grupo controle e os

grupos teste 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg apresentaram respectivamente

21,833%±4,83, 22,500%±4,64, 20,00%±3,85 e 20,500%±4,85 de células com DNA

danificado. Não foi notada nenhuma diferença estatística tendo como referencia a comparação

das dos grupos testes com o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

No tempo de 30 minutos, o grupo controle e os grupos teste 45,2; 90,4 e

180,7µM/Kg apresentaram respectivamente 25,667%±5,57; 47,667%±4,50; 51,667%±5,59 e

51,500%±10,07 de células com o DNA danificado. A diferença estatística é notada nas

concentrações de 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg com p<0,001, tendo como

referência para comparação com o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

No tempo de 60 minutos, a porcentagem de células com fragmentação no DNA no

grupo controle e nos grupos teste 45,2; 90,4 e 180,7µM/Kg apresentaram respectivamente

33,000±5,76; 50,167±6,18; 54,000±5,76 e 66,667±13,50. A diferença estatística é notada nas

concentrações de 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg com p<0,001, tendo como

referência para comparação com o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

No tempo de 120 minutos, foi observado que no grupo controle e nos grupos teste

45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg apresentam respectivamente porcentagem de células

com DNA danificado de 28,167%±7,25; 32,000%±10,47; 29,000%±7,70 e 32,5000%±10,47.

Não foi observada diferença estatística no índice de fragmentação dos grupos testes, tendo

como referência a comparação como o grupo controle (Tampão PIPES pH 7,0).

68

Tabela 9 - Valores da freqüência de células com DNA danificado.

Tempo em minutos

[ ] 0 30 60 120

Controle 21,833±4,83 25,667±5,57 33,000±5,76 28,167±7,25

45,2µM/Kg 22,50±4,64 47,667±4,50 50,167±6,18 32,000±10,47

90,4µM/Kg 20,00±3,85 51,667±5,60 54,000±5,76 29,000±7,70

180,7µM/Kg 20,50±4,85 51,50±10,07 66,667±13,50 32,500±10,47

0

20

40

60

80

100

0 30 60 90 120

Tempo em Minutos

% d

e cé

lula

s co

m fr

agm

enta

ção

no D

NA

Controle[45,2]µM/Kg[90,4]µM/Kg[180,7]µM/Kg

Figura 46 - Percentual de células sangüíneas de camundongos CF1, com o seu DNA fragmentado.

6.2.2 Teste Micronúcleo

A porcentagem de micronúcleos é realizada através do numero de micronúcleos

encontrados na analise de 2000 eritrócitos policromáticos (PCEs) anucleados. A figura 44

mostra as medias das porcentagens encontradas de micronúcleos dos (PCEs) anucleados da

medula óssea de três camundongos testados, com concentrações do complexo trans-

[RuCl2(nic)4] e seu respectivo controle.

Analisando os resultados, o controle apresentou uma porcentagem de

micronúcleos de 0,033%±0,06, a concentração de 45,2µM/Kg mostrou uma porcentagem de

0,517%±0,25, na concentração de 90,4µM/Kg foi de 0,400%±0,10 e na concentração de

69

180,7µM/Kg a porcentagem observada foi de 0,567%±0,20. Com os dados obtidos foi notada

uma diferença estatística nas concentrações de 45,2µM/Kg; 90,4µM/Kg e 180,7µM/Kg com

p<0,05, tendo como referência para comparação com o grupo controle (Tampão PIPES pH

7,0).

Tabela 10 - Porcentagem de micronúcleos

Indivíduos Controle 45,2µM/Kg 90,4µM/Kg 180,7µM/Kg

1 0,100% 0,250% 0,300% 0,450%

2 0,000% 0,550% 0,500% 0,450%

3 0,000% 0,750% 0,400% 0,800%

Média 0,033% 0,517% 0,400% 0,567% Desvio padrão 0,058 0,252 0,100 0,202

0,57

0,40

0,52

0,03

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

Controle [45,2µM/Kg] [90,4µM/Kg] [180,7µM/Kg]

Tratamento

% d

e M

icro

núcl

eo

*

*

*

Figura 47 – Percentual de micronúcleo encontrados em eritrócitos policromáticos, da medula óssea de

camundongos CF1. (*p<0,05).

70

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

7.1 Clivagem do DNA

7.1.1 Atividade de clivagem do Ligante

Não foi notada uma a clivagem do DNA plasmidial na presença de concentrações

crescentes do ligante e em pHs diferentes. É notada a formação de bandas mais intensa de

DNA FII no pH 6,0; que devido à própria instabilidade do DNA plasmidial nesse pH que

pode acelerar sua degradação natural. No pH 7,0 a formação de bandas de DNA FII não foi

significativa, em nenhuma concentração testada e estas formaram muito menos intensas que

no pH 6,0. No pH 8,0 não diferente dos outros pHs testado a formação de bandas de DNA FII

não aumentou significativamente com o aumento das concentrações. As bandas de DNA FII,

nesse pH foram mais intensas quando comparadas com o pH 7,0 e menos intensas do que

quando comparadas com as do pH 6,0, levando a se observar uma pequena instabilidade do

DNA em meio ácido.

7.1.2 Atividade de clivagem do complexo

Analisando os géis, observou-se que em pH 6,0 houve uma redução das bandas de

DNA FI e um aumento das bandas de DNA FII. Para todas as concentrações testas no pH 6,0;

em comparação com seu respectivo controle. Observou-se que a concentração de 1000µM de

complexo para esse mesmo pH teve uma maior redução das bandas de DNA FI e um aumento

acentuado das bandas da FII. Nos pHs 7,0 e 8,0 houve também a clivagem do DNA

plasmidial FI para a FII, cuja atividade aumenta com a concentração, tendo seu valor máximo

em 1000µM de complexo.

Comparando se a atividade do complexo nos pHs testados, nota-se que o mesmo

tem sua atividade catalítica diminuída com o aumento do pH. Sendo assim possui uma maior

atividade em pH 6,0. Segundo Paula et al, (1998), o complexo sofre uma deprotonação

conforme com o meio mais alcalinizado. Também sugere um rearranjo geométrico na

estrutura da molécula, conforme ocorra a deprotonação. Analisando essas características já

observadas em literatura, podemos sugerir que sua atividade diferenciada em determinados

pHs é devido a uma conformação geométrica adotada pela molécula nesses pHs.

71

Levando em consideração à atividade que o complexo e do ligante sobre o DNA,

podemos pensar que a clivagem do DNA pelo complexo, dependa primeiramente da presença

do átomo de coordenação Rutênio e em segundo lugar o tipo de alinhamento que essa

coordenação está exercendo sobre os ligantes, já que o ligante não complexado não

demonstrou uma atividade significativa sobre a clivagem do DNA.

7.1.3 Atividade de clivagem do complexo em presença de DMSO

Houve uma diminuição significativa da atividade de clivagem de moléculas de

DNA plasmidial causado pelo complexo em presença de 10% de DMSO nas incubações.

Com a diminuição da atividade do complexo em presença de DMSO (quelante de

radicais OH•), analisando esse resultado pode-se sugerir que o complexo tenha um mecanismo

oxidativo de clivagem do DNA. Esse mecanismo pode estar ligado com o átomo de

coordenação no caso Ru (II) que segundo Paula et al (1998) demonstram grande potencial ox-

redução. Por essa característica apresentada, o átomo de Ru poderia estar evolvido com o O2

molecular em uma via catalítica de formação de radicais OH•.

Uma possibilidade de formação de radicais OH• seria no envolvimento do íon

Ru(II) nas reações de Fenton e Haber-Weiss, que segundo Macyk, Franke e Stochel (2005)

metais de transição tem a habilidade de catalisar essas reações e aumentar a formação de

diferentes tipos de espécies reativas de oxigênio.

A figura 48 representa o mecanismo oxidativo proposto de clivagem do DNA

plasmidial pelo íon de Ru(II) presente no centro de coordenação do complexo.

- .O2

OH

Ru2+ + O2 Ru

3++

-.2O2 2H

++ O2 + H2O2

Ru2+ + H2O2 Ru

3+ + OH+.-

- .O2

OH

Ru3+ + O2Ru

2++

+ +

+ H2O2

OH+.-

H2O2Ru2+ Ru

3+

- .O2 OH OH+

.-- .O2 +

Reação de Fenton Reação de Haber-Weiss

Figura 48- Reação de Fenton adaptada para o íon de Ru(II).

A formação de produtos como Ru3+ e OH• nas reações comentadas na figura 48

podem ser os responsáveis pela clivagem do DNA. O íon de Ru3+ pode estar sendo reduzindo

para Ru2+ pelo próprio DNA que se oxida formando diversos produtos. O radical OH• formado

72

nas reações, segundo Macyk, Franke e Stochel (2005) é o radical mais lesivo que pode reagir

com diversas moléculas incluindo o DNA.

Notou-se que a clivagem do DNA causada pelo complexo em presença de DMSO

nas incubações foi diminuída mais não inibida. Essa pequena atividade observada pode estar

relacionada com um mecanismo hidrolítico de clivagem. De acordo com Creczynski-Pasa

(2001) o complexo em solução substitui os cloros na posição trans por moléculas de H2O.

Essas moléculas podem ser ativadas a um nucleofílico, por polarização da mesma e atacar os

grupos fosfatos da estrutura do DNA. A figura 49 mostra o mecanismo hidrolítico proposto de

clivagem do DNA plasmidial.

N N

Ru2+

NN

OOH OOH

OHO OHO

OH+

Cl

Base O

R

O

Base O

O

R

O-

OP

H Base O

R

OH

Base O

O

R

OH

OH

O

P

+

Figura 49 - Reação proposta de hidrolise da ligação fosfodiéster do DNA plasmidial (pBSK-II) causado pelo

complexo de rutênio trans-[RuCl2(nic)4].

7.4 Cinética Catalítica do Complexo

Os resultados de cinética demonstraram que o complexo na maior concentração

1000µM começou a saturar a reação, pela formação do complexo enzima-substatrato que

talvez esteja impedindo que a velocidade de catalise aumente devido a uma competitividade

ao substrato. A constante catalítica (Kcat), observada para o complexo foi a seguinte

Kcat=8,4x10-2 h-1. A eficiência catalítica Kcat/Km(M-1.h-1 é observada para o complexo em

183,75M-1.h-1. A degradação natural do DNA foi aumentada em 2,33x106 vezes, onde esse

numero corresponde o número de “Enhancement”.

Este aumento promovido pelo complexo se apresenta próximo de muitas

nucleases sintéticas, como a nuclease Rh-P-Zn que apresenta um Enhancement de 2,50x106

73

muito próximo do complexo e outro exemplo também demonstrado por Sreedhara e Cowan

(2001) é a nuclease Mg-MutT dGTPase que apresenta um valor de 4,00x1011 , muito maior

que o valor observado pelo complexo.

7.2 Teste Cometa

7.2.1 Índice e freqüência de dano ao DNA

O complexo de rutênio em estudo, trans-[RuCl2(nic)4], quando analisado pelo

teste cometa, apresentaram índice de fragmentação e freqüência de células com DNA

danificado alteados. Levando em consideração que o teste foi realizado em um período de

exposição de 120 minutos dos animais ao complexo, e que as retirada de sangue forma feitas

em intervalos de tempo de 0 minuto (antes da aplicação do complexo), 30 minutos após a

aplicação do complexo, 60 minutos e por final 120 minutos. Notou-se que o índice de

fragmentação e a freqüência de células com DNA lesado, teve um aumento proporcional as

doses e o tempo de exposição ao complexo, esse aumento foi efetivo até um período de 60

minutos, após esse período chegando em 120 minutos de exposição, foi notada uma

diminuição significativa de ambos os parâmetros avaliados.

Com o aumento progressivo da atividade do complexo em um período de 60

minutos no organismo dos camundongos, podemos sugerir que o complexo possa estar

sofrendo algum tipo de ativação no organismo desses. E pelo fato das concentrações

utilizadas neste experimento serem menores do que aquelas que causaram um efeito

genotóxico nos experimentos de Amboni (2003) e Naspoline (2004), onde foram utilizadas

apenas células sangüíneas em cultura “in vitro” .

A diminuição da atividade do complexo sobre o DNA das células sanguíneas dos

animais analisados após um período de exposição ao complexo. Pode ser explicada

observando-se que, a quantidade de complexo no organismo dos camundongos poderiam estar

diminuindo com a ativação de algum mecanismo de metabolização e/ou de eliminação, como

sugerido por Ribeiro (2003) para ativação de pró-genotóxicos. Com essa suposta diminuição

do complexo o sistema de reparo do DNA já ativo pelas lesões causadas pelo complexo,

poderia ser mais eficiente no que diz respeito da reparação do DNA lesado.

7.3 Teste Micronúcleo

74

Quando analisado a freqüência de micronúcleo em eritrócitos policromaticos

anucleados dos animais tratados com o complexo trans-[RuCl2(nic)4], durante um período de

24 horas, observou-se que a freqüência aumentou nos grupos testes quando comparado com o

grupo controle. Mas esse aumento não foi significativo entre os grupos testes. O resultado

apresentado pode ser conseqüência de concentrações muito elevadas que poderia estar

extrapolando a dose resposta da substancia.

Como o complexo apresentou atividade genotóxica, talvez seja um dos motivos

pelo qual a possa estar provocando a atividade mutagênica, como o aumento da freqüência de

micronúcleos em eritrócitos policromaticos anucleados.

O DNA pode estar sofrendo lesões extensas em sua estrutura, que passa ser

responsável por fatores que formem micronúcleos, como as quebras cromossômicas e o

desvio de cromossomos do fuso mitótico na divisão celular, já que o teste é feito 24 horas

após a exposição do químico. Em lesões extensas no DNA um sistema de reparação do DNA

pode estar sendo ativado como o Sistema de Reparo Sujeito a Erros que aumento a taxa de

mutação, e pode estar inferindo na formação de células micronucleadas.

75

8 CONCLUSÃO

O complexo trans-[RuCl2(nic)4], apresentou uma atividade de clivagem no DNA

plasmidial, sendo essa mais efetiva em pH 6,0. Essa característica é fundamenta na busca de

quimioterápicos mais específicos para tumores, sabendo que tecidos tumorais devido a

hipóxia apresentam um pH inferior ao fisiológico.

Foram propostos dois mecanismos para a clivagem do DNA plasmidial pelo

complexo, sendo um oxidativo e o outro hidrolítico. O primeiro mecanismo esta envolvido

em um ciclo catalítico de reação com o Oxigênio e o centro metálico do complexo. Esse

mecanismo de oxidação não de grande vantagem para o uso em biotecnologia, pois forma

produtos irreversíveis e terminais que não podem ser religados enzimaticamente.

O Mecanismo hidrolítico, menos ativo que o primeiro é o resultado de uma

coordenação de moléculas de H2O e a polarização da mesma, e formação de um nucleofílico

para o ataque as ligações fosfodiéster do DNA. Esse mecanismo forma terminais com

hidroxilas (OH) livres que podem se religados por enzimas especificas como exemplo, uma

T4 ligase.

A velocidade de degradação natural do DNA plasmidial foi aumentada pelo

complexo, com valores muito próximos de algumas nucleases sintéticas já conhecidas. Esse

resultado observado apresenta uma possibilidade futura na terapêutica contra o câncer já que

acelera a velocidade de degradação do DNA, que em tumores a síntese de DNA está muito

intensa.

O complexo apresentou efeitos genotóxicos “in vivo” em concentrações bem

menores que quando comparada às que produziram dados signitivamente diferentes “in

vitro” . Desta forma pode-se inferir que um processo de ativação metabólica do complexo

quando este se faz presente em sistema biológico, semelhante ao proposto por Creczynski-

Pasa (2001) para regulação de NO, já que o mesmo apresentou um pico de ativação e uma

redução de atividade ao logo do tempo testado.

Uma atividade Mutagênica foi notada no teste de micronúcleo de células de

medula de camundongos tratados com o complexo após 24 horas, devido talvez pela

quantidade de danos genômicos causado pelo complexo, acumulado durante todo o tempo de

incubação. Esse efeito não teve diferença nas concentrações testas, devido talvez pelo excesso

de complexo e do nível de acumulação do mesmo no tecido estudado, assim tornado tóxico

para as células analisadas.

76

9 PERSPECTIVAS

É recomendável mais experimentos que venham a contribuir para o entendimento

do complexo trans-[RuCl2(nic)4] frente a reações biológicas.

Teste de clivagem com moléculas de DNA sob atmosfera de argônio, para

verificar mais precisamente o tipo de mecanismo de clivagem que o complexo esta

desempenhando.

Separação dos produtos de clivagem do DNA causado pelo complexo, utilizado

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Teste de genotoxicidade “in vitro” e “in vivo” com diferentes linhagens de

células tumorais, para verificar se o complexo o tipo de atividade desempenhada nessas

linhagens celulares.

Aumentar o “n” do teste de mutagênese (teste de micronúcleo) para verificação

detalhada da atividade do complexo sobre mecanismo de mutação.

77

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82

APÊNDICES

83

APÊNDICE A – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE DE INTERA ÇÃO

As Tabelas 1 à 3 apresentam respectivamente as análises de variância ANOVA

dos resultados encontrados de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre moléculas de

DNA plasmidial, nos pHs 6,0; 7,0 e 8,0; utilizando o software Microcal Origin 6.0.

Tabela 1 – Valores do teste ANOVA no pH 6,0.

[30/9/2006 10:49 "/Data1" (2454008)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(sem0) -> Col(sem1000):

Data Mean Variance N 0µM(controle) 70,87171 7,48779 3

250µM 47,38309 1,05226 3 500µM 51,40747 0,84189 3 1000µM 47,04627 1,59681 3

F = 139,6838 p = 3,00788E-7

At the 1E-3 level, the means are significantly different.




250µM 86,48557 3,72577 3 500µM 85,77573 2,30202 3 1000µM 83,50921 1,43918 3

F = 9,1498 p = 0,00578

At the 0,01 level, the means are significantly different.




250µM 85,63278 0,20715 3 500µM 84,35911 0,4104 3 1000µM 83,16609 1,18889 3

F = 14,51771 p = 0,00134


As Tabelas 4 à 7 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados de

clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre moléculas de DNA plasmidial no pH 6,0 na

presença de DMSO, comparando com os resultados em ausência de DMSO, utilizando o

software Microcal Origin 6.0.

84

Tabela 4 – Valores do Teste –t dos controles no pH 6,0.

[29/9/2006 20:18 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presença de DMSO) and col(Ausência de DMSO):

Data Mean Variance N Presença de DMSO 70,87167 7,48692 3 Ausência de DMSO 70,91133 0,18599 3

t = 0,0248 p = 0,9814

At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

Tabela 5 – Valores do Teste –t das concentrações 250µM no pH 6,0.

29/9/2006 20:57 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presença de DMSO) and col(Ausência de DMSO):


t = 11,10722 p = 3,73782E-4

At the 1E-3 level, the two means are significantly different.

Tabela 6 – Valores do Teste –t das concentrações de 500µM no pH 6,0.



t = 12,83443 p = 2,12456E-4





t = 9,0202 p = 8,36594E-4


As Tabelas 8 à 11 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados

de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre moléculas de DNA plasmidial no pH 7,0

na presença de DMSO, comparando com os resultados em ausência de DMSO, utilizando o

software Microcal Origin 6.0.

85




t = 0,69357 p = 0,52612





t = 1,09378 p = 0,3355





t = 0,87039 p = 0,4332





t = 1,93873 p = 0,12456


As Tabelas 12 à 15 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados

da atividade de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre moléculas de DNA

plasmidial no pH 8,0 na presença de DMSO, comparando com os resultados em ausência de

DMSO, utilizado o software Microcal Origin 6.0.

86




t = 10,67383 p = 4,3639E-4


Tabela 13 – Tabela 11 – Valores do Teste –t das concentrações de 250µM no pH 8,0.



t = 5,31655 p = 0,00602

At the 0,01 level, the two means are significantly different.




t = 7,62388 p = 0,00159





t = 4,09204 p = 0,01495


87

APÊNDICE B –VALORES DOS RESULTADOS DE CINÉTICA CATA LÍTICA

As Tabelas 16 e 17 mostram os valores de degradação do DNA plasmidial de cada

concentração testadas ao longo de 480 minutos em pH 6,5

Tabela 16 – valores da degradação do DNA plasmidial expressados em porcentagem. [ ] 0 60 120 240 360 480

0µM 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 250µM 0,91 0,75 0,72 0,66 0,68 0,66 500µM 0,90 0,77 0,70 0,63 0,63 0,62 1000µM 0,89 0,78 0,71 0,60 0,56 0,55

Tabela 17 – valores da degradação do DNA plasmidial expressados em logaritmo (In). [ ] 0 60 120 240 360 480

0µM 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 250µM 0,000 -0,195 -0,237 -0,320 -0,298 -0,331 500µM 0,000 -0,154 -0,250 -0,351 -0,361 -0,366 1000µM 0,000 -0,135 -0,224 -0,393 -0,466 -0,486

88

APÊNDICE C – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE COMETA.

As Tabelas 18 à 21 mostram os valores da análise ANOVA dos índices de dano

ao DNA, utilizado o software Microcal Origin 6.0.

Tabela 18 – Valores análise ANOVA no tempo “0”.

[28/9/2006 13:35 "/Data1" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind):

Data Mean Variance N 0µM/kg(controle) 22,66667 20,66667 6

45,2µM/kg 23,33333 27,86667 6 97,4µM/kg 20,5 17,9 6 180,7µM/kg 22,66667 25,06667 6

F = 0,40012 p = 0,75441

At the 0,05 level, the means are NOT significantly different.


[28/9/2006 14:04”/Data5” (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind):


45,2µM/kg 60,66667 11,46667 6 97,4µM/kg 66,5 138,7 6 180,7µM/kg 71,5 275,9 6

F = 17,25034 p = 9,05168E-6





45,2µM/kg 68,16667 74,56667 6 97,4µM/kg 70,66667 101,8667 6 180,7µM/kg 109,6667 905,8667 6

F = 19,35247 p = 3,95143E-6





45,2µM/kg 37,00 216,00 6 97,4µM/kg 38,66667 179,8667 6 180,7µM/kg 37,83333 201,3667 6

F = 0,09792 p = 0,96026

At the 1E-3 level, the means are NOT significantly different.

89

As Tabelas 22 à 25 mostram os valores da análise ANOVA das freqüência de

células com DNA fragmentado, utilizado o software Microcal Origin 6.0.


[28/9/2006 13:38 "/Data1" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq):


45,2µM/kg 22,5 21,5 6 97,4µM/kg 20 14,8 6 180,7µM/kg 20,5 23,5 6

F = 0,38677 p = 0,76372

At the 0,05 level, the means are NOT significantly different.




45,2µM/kg 47,66667 24,26667 6 97,4µM/kg 51,66667 37,46667 6 180,7µM/kg 51,5 101,5 6

F = 19,12592 p = 4,30677E-6





45,2µM/kg 50,16667 38,16667 6 97,4µM/kg 54,00 33,20 6 180,7µM/kg 66,66667 182,2667 6

F = 16,15243 p = 1,43625E-5





45,2µM/kg 32,00 109,60 6 97,4µM/kg 29,00 60,80 6 180,7µM/kg 32,50 109,50 6

F = 0,33487 p = 0,80026

At the 1E-3 level, the means are NOT significantly different.

90

APÊNDICE D – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE MICRONÚCL EO.

A Tabela 26 mostra os valores da análise do teste ANOVA da porcentagem de

micronúcleos.

Tabela 26 – Análise ANOVA da atividade Mutagênica do complexo pelo software Microcal Origin 6.0



45,2µM/kg 0,51667 0,06333 3 97,4µM/kg 0,4 0,01 3 180,7µM/kg 0,56667 0,04083 3

F = 5,92671 p = 0,01977


91

ANEXO

92

ANEXO A – APROVAÇÃO DO TRABALHO PERANTE O COMITÊ DE ÉTICA

DESTA UNIVERSIDADE.

tcc-willian [29-11-06]

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