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ANDERSON MESSIAS RODRIGUES

TAXONOMIA POLIFÁSICA E CARACTERÍSTICAS PROTEÔMICAS

DO COMPLEXO Sporothrix schenckii

Dissertação apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de Medicina como

requisito para a obtenção do título de Mestre em

Ciências. Área de concentração: Micologia.

São Paulo

2010

Livros Grátis

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ANDERSON MESSIAS RODRIGUES

TAXONOMIA POLIFÁSICA E CARACTERÍSTICAS PROTEÔMICAS

DO COMPLEXO Sporothrix schenckii


de São Paulo – Escola Paulista de Medicina como

requisito para a obtenção do título de Mestre em

Ciências. Área de concentração: Micologia.

Orientação: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo

São Paulo

2010

FICHA CATALOGRÁFICA

Rodrigues, Anderson Messias

Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii. São

Paulo, 2010.

241 p. il. 30 cm.

Polyphasic taxonomy and proteomic features in the Sporothrix schenckii complex. São

Paulo, 2010.

Dissertação apresentada ao Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, da

Universidade Federal de São Paulo. Área de concentração: Micologia Médica.

Orientação: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo

1. Sporothrix schenckii, 2. Esporotricose, 3. Taxonomia polifásica, 4. Proteômica, 5.

Imunoproteômica, 6. Caracterização, 7. Micologia Médica

“Permitida a cópia parcial deste documento desde que citada a fonte – O autor”

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia Médica, Disciplina de Biologia

Celular, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia (DMIP) da

Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo. Recebeu apoio

financeiro da Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

processo 2008/55975-8 e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível

Superior (CAPES).

Chefe de Disciplina: Profa. Dra. Rosana Puccia

Chefe de Departamento: Profa. Dra. Clara Lúcia Barbiéri Mestriner

Coordenador de Pós-graduação: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara

Pró-reitor de Pós-graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo

Dedico

À minha mãe Lucilene e ao meu pai Reinaldo

As pessoas mais importantes da minha vida.

Aos meus irmãos Jaqueline e Alexander

Muito obrigado por tudo!

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado com a contribuição conjunta de diversas pessoas,

sem as quais não teria sido possível a sua concretização. Neste sentido, gostaria de

expressar a minha gratidão a todos aqueles que direta ou indiretamente me

apoiaram tanto no âmbito científico como pessoal.

Agradeço ao Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo pela orientação e conselhos

durante o desenvolvimento desta dissertação. Agradeço pela amizade, pela

oportunidade de participar do grupo de pesquisa, pela confiança depositada e é

claro, pela paciência que não foi pouca, diga-se de passagem... Muito obrigado por

tudo professor!

Agradeço à Profa. Dra. Olga Fischman Gompertz pela generosidade em

colocar seu laboratório de pesquisa à disposição e pelos valiosos ensinamentos em

Micologia Médica.

Agradeço aos meus amigos de bancada durante o período de execução desta

dissertação pelo excelente convívio: Alexandre Sasaki, Cristiane Amaral (Cris),

Geisa Fernandes, Priscila Oliveira (Pri), Rodrigo Berzaghi, Agenor Júnior, Thiago

Roberto e Mayra Maciel. Agradeço também a Rosângela Pfister, por ter feito mais de

5.000 tubos de ensaios com meio de cultura!

Je remercie mes amis, Antoine Bahri et Nesma Zaid El Kilani, de la Faculté de

Pharmacie de Lyon - Université Claude Bernard Lyon (France).

Agradeço aos funcionários da Disciplina de Biologia Celular: Rose Pfister,

Maria, Claudeci, Cláudio, Luiz e Américo.

Agradeço aos secretários Márcia Martins, Marcelo Rodrigues, Mércia Maia e

Regiane Escobar pela colaboração, disponibilidade, eficiência e apoio.

Um agradecimento especial as amigas Priscila Oliveira dos Santos e Márcia

Martins pelo precioso auxílio e disponibilidade no momento da impressão deste

documento.

Agradeço aos meus queridos amigos de Guarulhos, a quem carinhosamente

menciono de “família”, pela ajuda e carinho: Claudete, Walas, Natália, Nayara,

Matheus e Nair. Vocês foram pessoas fundamentais para que eu concluísse mais

uma etapa da minha formação. Muito obrigado por tudo!

Agradeço aos meus familiares e amigos por entenderem a minha ausência no

convívio durante a maior parte do período de execução deste trabalho!

Agradeço ao Prof. Dr. Ricardo Bertolla do Centro de Pesquisa em Urologia do

Departamento de Cirurgia – UNIFESP, por disponibilizar o Scanner Image III e o

software Image Master 7 para a digitalização dos géis bidimensionais de proteínas e

análise de Bioinformática das imagens.

Agradecemos aos esforços das pesquisadoras Dra. Leila Maria Lopes

Bezerra (Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto

Alcantara Gomes, Departamento de Biologia Celular e Genética, Laboratório de

Micologia Celular e Proteômica - LMCProt) e Dra. Rosane Orofino Costa

(Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas, Chefe

do Laboratório de Micologia - HUPE) pela doação dos soros humanos de pacientes

com esporotricose (padrão-ouro) utilizados neste trabalho;

Agradecemos aos pacientes com esporotricose que permitiram utilização das

amostras biológicas (soros);

Agradeço aos amigos dos laboratórios de pesquisa da Disciplina de Biologia

Celular pelo apoio, pelo empréstimo dos equipamentos, pela disponibilidade e

amizade!

Agradeço a participação dos professores do DMIP durante a minha formação

neste programa de pós-graduação;

Agradecemos sinceramente aos esforços de diversos pesquisadores do Brasil

e da América Latina em enviar as culturas de Sporothrix spp. necessárias para a

confecção da micoteca utilizada neste trabalho: Dr. Carlos Pelleschi Taborda,

Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo (USP); Dr.

Arnaldo Lopes Colombo, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Dr. Luiz

Carlos Severo, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS); Dra. Gilda

Maria Barbaro Del Negro, Instituto de Medicina Tropical, Universidade de São Paulo

(USP); Dra. Junia Hadam, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Dra.

Liline M. S. Martins, Universidade Federal do Piauí (UFPI); Dr. Flávio de Queiroz

Telles Filho, Universidade Federal do Paraná (UFPR); Dr. José Júlio Costa Sidrim,

Universidade Federal do Ceará (UFC); Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha,

Universidade Estadual do Ceará (UECE); Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva,

Universidade Federal de Goiás (UFG); Dra. Patrícia Fagundes da Costa,

Universidade Federal do Pará (UFPA); Dr. Mario Carlos Araujo Meireles,

Universidade Federal de Pelotas; Dr. Eduardo Bagagli, Universidade Estadual de

São Paulo (UNESP – Botucatu); Dra. Mariceli Araujo Ribeiro, Universidade Federal

do Espírito Santo (UFES); Dr. Marcio Nucci, Universidade Federal do Rio de Janeiro

(UFRJ); Dr. Diltor Vladimir Araújo Opromolla (Instituto Lauro de Souza Lima); Dra.

Rosane Christine Hahn, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT); Dr. Mario

Léon Silva-Vergara, Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (UFTM); Dra.

Cláudia Maria Leite Maffei, Dpto. Biologia Celular e Bioagentes Patogênicos,

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP (FMRP-USP); Dra. Angélica Zaninelli

Schreiber, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP); Dra. Cristina Ma. de

Souza Motta, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); Dr. Mário Augusto Ono,

Universidade Estadual de Londrina (UEL); Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima,

Universidade Federal da Paraíba (UFPB); Dra. Cintia de Moraes Borba, Fundação

Oswaldo Cruz (Fiocruz); Dra. Melissa Orzechowski Xavier, Universidade Federal do

Rio Grande do Sul (UFRGS); Dra. Carmelia Matos Santiago Reis, Universidade de

Brasília (UnB); Dra. Beatriz Bustamante, Instituto de Medicina Tropical Alexander

Von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia (Lima, Peru); Dra.

Concepcíon Torielo Nájera, Departamento de Microbiología y Parasitologia

Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Agradeço imensamente ao Prof. Dr. Josep Guarro Artigas e a Profa. Dra.

Josepa Gené Díaz do Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques da Facultat de

Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, Reus, Espanha, por terem

gentilmente cedido as cepas tipo das novas espécies descritas do complexo

Sporothrix schenckii utilizadas neste trabalho.

Todas as parcerias estabelecidas e citadas acima foram imprescindíveis

para o bom andamento e realização deste trabalho, sem as quais nada

seria possível!

Agradeço sinceramente as agências de fomento CAPES, CNPq e FAPESP

pelas diversas formas de auxílios recebidos durante o desenvolvimento deste

trabalho.

Anderson Messias Rodrigues.

Taxonomia polifásica e características

proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.


de São Paulo – Escola Paulista de Medicina

como requisito para a obtenção do título de

Mestre em Ciências. Área de concentração:

Micologia.

Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo (Orientador)

Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – DMIP

Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia

Banca examinadora

Prof. Dr. Carlos Pelleschi Taborda

Universidade de São Paulo – USP Instituto de Ciências Biomédicas – ICB

Programa de Pós-graduação em Microbiologia

Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida

Universidade de São Paulo – USP Faculdade de Ciências Farmacêuticas – FCF

Departamento de Analises Clínicas e Toxicológicas

Profa. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante

Universidade Federal do Ceará – UFC Centro Especializado em Micologia Médica – CEMM Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas

Profa. Dra. Olga Fischman Gompertz

Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – DMIP

Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia

“Com o conhecimento nossas dúvidas aumentam”

Johann Wolfgang von Goethe

Escritor alemão (1749–1832)

ÍNDICE

RESUMO.......................................................................................................................................... I

ABSTRACT...................................................................................................................................... II

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ III

LISTA DE TABELAS....................................................................................................................... VIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.................................................................................... X

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................. 01

1.1 Fungos de importância médica: Perspectiva geral......................................................... 01

1.2 Sporothrix schenckii Hektoen et Perkins 1900 e o complexo S. schenckii……………. 03

1.3 Conceitos de espécie em micologia.................................................................................. 12

1.4 Taxonomia polifásica de fungos patogênicos: Técnicas empregadas para a

classificação...................................................................................................................... 16

1.5 Esporotricose: uma micose reemergente......................................................................... 21

1.5.1 Esporotricose cutânea fixa............................................................................................ 23

1.5.2 Esporotricose linfocutânea........................................................................................... 24

1.5.3 Esporotricose disseminada.......................................................................................... 24

1.6 Diagnóstico da esporotricose: da sorologia à detecção molecular............................... 26

1.7 Epidemiologia da esporotricose: uma micose de espectro mundial............................. 28

1.8 Análise proteômica............................................................................................................. 32

1.8.1 Eletroforese bidimensional de proteínas....................................................................... 33

1.8.2 Primeira dimensão: Focalização Isoelétrica (IEF)........................................................ 34

1.8.3 Segunda dimensão: SDS-PAGE.................................................................................. 35

1.8.4 Detecção de proteínas.................................................................................................. 35

1.8.5 Aquisição de imagens................................................................................................... 36

1.8.6 Espectrometria de massas............................................................................................ 36

1.9 Importância da proteômica no estudo de patógenos humanos..................................... 37

1.10 Imunoproteômica: Importância dos marcadores sorológicos de doenças................. 39

1.11 Justificativa........................................................................................................................ 39

2. OBJETIVOS................................................................................................................................. 42

2.1 Delineamento experimental................................................................................................ 44

3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 45

3.1 Cepas de Sporothrix spp. utilizadas e condições de cultivo.......................................... 45

3.2 Caracterização fenotípica................................................................................................... 45

3.2.1 Ensaios morfológicos.................................................................................................... 54

3.2.1.1 Microcultivo........................................................................................................... 54

3.2.1.2 Crescimento vegetativo em meio CMA (Corn Meal Agar).................................... 55

3.2.2 Ensaios fisiológicos....................................................................................................... 56

3.2.2.1 Crescimento vegetativo em função das temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C....... 56

3.2.2.2 Influência da temperatura na inibição do crescimento.......................................... 56

3.2.2.3 Análise de clusterização e análise estatística....................................................... 57

3.2.2.4 Efeito fungistático e fungicida da temperatura no crescimento fúngico................ 58

3.2.3 Ensaios bioquímicos..................................................................................................... 59

3.2.3.1 Assimilação de fontes de carbono, segundo protocolo de Marimon et al.

(2007)................................................................................................................... 59

3.2.3.1.1 Preparo das microplacas de assimilação..................................................... 59

3.2.3.1.2 Preparo do inóculo fúngico........................................................................... 59

3.2.3.1.3 Inoculação, incubação e leitura dos resultados............................................ 60

3.2.3.1.4 Avaliação dos resultados de assimilação..................................................... 61

3.3 Taxonomia Molecular.......................................................................................................... 62

3.3.1 Extração de DNA genômico de leveduras de Sporothrix spp....................................... 62

3.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)............................................................................... 64

3.3.2.1 Purificação e quantificação do produto de PCR............................................... 65

3.3.3 Sequenciamento dos produtos de PCR........................................................................ 65

3.3.4 BLAST........................................................................................................................... 66

3.4 Taxonomia polifásica do complexo Sporothrix schenckii.............................................. 66

3.5 Proteômica........................................................................................................................... 67

3.5.1 Isolado e condição de cultivo........................................................................................ 67

3.5.2 Extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii....................................... 68

3.5.2.1 Protocolos de extração (I) (Nitrogênio líquido)..................................................... 70

3.5.2.2 Protocolos de extração (II) (Fastprep® 1200)........................................................ 70

3.5.2.3 Quantificação protéica pelo método de Bradford (1976) e avaliação da

integridade da amostra........................................................................................ 71

3.5.3 Precipitação de proteínas............................................................................................. 72

3.5.3.1 TCA (ácido tricloroacético).................................................................................... 72

3.5.3.2 Acetona................................................................................................................. 73

3.5.3.3 TCA/Acetona......................................................................................................... 73

3.5.3.4 2D-Clean up kit (GE Healthcare, USA)…………………………...…...….………… 74

3.5.4 Análise dos resultados de extração e precipitação de proteínas.................................. 75

3.5.5 Eletroforese bidimensional............................................................................................ 75

3.5.5.1 Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão)........................................................ 76

3.5.5.2 Tratamento das tiras de pH imobilizado................................................................ 76

3.5.5.3 SDS-PAGE (Segunda dimensão)......................................................................... 76

3.5.6 Géis analíticos (Nitrato de prata).................................................................................. 77

3.5.7 Géis preparativos (Coomassie coloidal G-250)............................................................ 77

3.5.8 Aquisição e análise das imagens.................................................................................. 78

3.6 Imunoproteômica................................................................................................................ 79

3.6.1 Western Blot Bidimensional.......................................................................................... 79

4. RESULTADOS............................................................................................................................. 82

4.1 Características fenotípicas................................................................................................. 82

4.2 Influência da temperatura no crescimento fúngico......................................................... 83

4.2.1. Crescimento vegetativo................................................................................................ 83

4.2.2. Inibição do crescimento vegetativo.............................................................................. 101

4.3 Características microscópicas.......................................................................................... 118

4.4 Perfil bioquímico de assimilação de fontes de carbono................................................. 119

4.5 Taxonomia molecular......................................................................................................... 130

4.6 Taxonomia polifásica.......................................................................................................... 138

4.7 Epidemiologia do complexo Sporothrix schenckii no Brasil.......................................... 146

4.8 Análise Proteômica............................................................................................................. 149

4.8.1 Extração de proteínas de Sporothrix schenckii............................................................. 149

4.8.2. Análise proteômica das cepas de importância clínica e ambiental do complexo S.

schenckii...................................................................................................................... 153

4.8.3. Moléculas imunogênicas presentes no extrato precipitado de leveduras do

complexo S. schenckii................................................................................................ 160

5. DISCUSSÃO................................................................................................................................ 168

6. CONCLUSÕES............................................................................................................................ 199

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................ 201

8. APÊNDICE I................................................................................................................................. 231

– I –

RESUMO

RODRIGUES, A. M. Taxonomia polifásica e características proteômicas do

complexo Sporothrix schenckii. 2010. 241 f. Dissertação (Mestrado) –

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2010.*

A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela

implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo.

Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem

sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo

termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No

entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade

genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta

informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de

espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161

cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do

Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento

vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em

meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as

características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia

molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus

calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem

uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição

na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano.

S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de

Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie.

Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados

de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína

entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar

o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as

proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram

transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas

principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram

que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com

um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no

perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas.

Palavras-chave: Sporothrix schenckii. Esporotricose. Taxonomia. Caracterização. Proteômica.

Imunoproteômica. Micologia.

* Orientador: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo – UNIFESP.

– II –

ABSTRACT

RODRIGUES, A. M. Polyphasic taxonomy and proteomic features in the

Sporothrix schenckii complex. 2010. 241 p. Dissertation (Master) – Federal

University of São Paulo, São Paulo, 2010. *

Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic

implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since

1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been

attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus

that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as

S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic

species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic

taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161

strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse

regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth

on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the

assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic

features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the

sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S.

globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our

knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing

disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul

and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this

specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp.

isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the

cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major

antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular

proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then

incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and

linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens

from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies

reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile

differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here.

Key words: Sporothrix schenckii. Sporotrichosis. Taxonomy. Characterization. Proteomic.

Immunoproteomic. Mycology

* Advisor: Zoilo Pires de Camargo, PhD – UNIFESP.

– III –

Lista de Figuras

Figura 1: Triangulo da doença. As interações compatíveis entre um patógeno e o hospedeiro

apenas resultarão em doença quando forem atendidos os três fatores: patógeno, hospedeiro e

condições do ambiente (adaptado de van Baarlen et al., 2007 e Sullivan et al., 2005)................... 02

Figura 2: O complexo Sporothrix schenckii. As espécies crípticas do complexo S. schenckii são

indistinguíveis macroscopicamente, sendo empregadas as diferenças microscópicas,

características fisiológicas e metabólicas para a distinção clássica entre as espécies. A) S.

brasiliensis; B) S. schenckii; C) S. globosa; D) S. mexicana; E) S. albicans e F) S. luriei............... 08

Figura 3: Resolução taxonômica de algumas técnicas empregadas na taxonomia e sistemática

de fungos. As barras horizontais indicam o poder discriminatório de cada abordagem entre os

táxons (Adaptado de Bruns et al., 1991 & Vandamme et al., 1996)................................................ 20

Figura 4: Manifestações clínicas da esporotricose. Esporotricose linfocutânea (L); Esporotricose

cutânea fixa (F); Esporotricose disseminada (D)............................................................................. 25

Figura 5: Delineamento experimental. Caracterização proteômica do complexo Sporothrix

schenckii: Análise de proteínas diferencialmente expressas e proteínas imunogênicas de

isolados de S. schenckii, S. brasiliensis, S globosa e S. mexicana................................................. 44

Figura 6: Distribuição dos isolados depositados na coleção de cultura de Sporothrix spp. quanto

à forma clínica da doença provocada em humanos (A) ou a origem ambiental (B) e animal (C)... 52

Figura 7: Esquema do teste de assimilação utilizando microplacas de 96 orifícios. (A) Preparo

das placas contendo 150 µL do meio Yeast Nitrogen Base (Difco) complementado ou não com

os açúcares testes; (B) Preparo do inóculo de conídios em solução salina (0,85%) e

quantificação em espectrofotômetro a 520 nm. A suspensão é ajustada para uma absorbância

de 0,21–0,29 DO, a qual corresponde a um inóculo final de 2x105 a 2x10

6 UFC/mL; (C) Ensaio

de assimilação. São aplicados, em triplicata, 50 µL do inóculo da suspensão original de conídios

aos 150 µL do meio “C” complementado ou não com os diferentes açúcares testes (0,02 g/mL)

previamente distribuído. C -, controle negativo; C +, controle positivo; Raf, rafinose; Rib, ribitol;

Sac, sacarose................................................................................................................................... 61

Figura 8: Abordagem esquemática em proteômica diferencial. Mapas bidimensionais de

referência gerados a partir do antígeno celular total extraído de leveduras de Sporothrix

schenckii, S. brasiliensis, S. globosa e S. mexicana (n=3). As possíveis comparações entre as

imagens adquiridas dos géis provenientes das triplicatas experimentais são esquematizadas. As

análises comparativas de variações interespecíficas (→) são representadas pelas setas.

Abreviações: pI, ponto isoelétrico; mw, molecular weigth (massa molecular); Ss, Sporothrix

schenckii; Sb, Sporothrix brasiliensis; Sg, Sporothrix globosa; Sm, Sporothrix mexicana.............. 68

Figura 9: Protocolos de extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii (7 dias de

cultivo). Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de homogeneização das leveduras (em

suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45

segundos. Os protocolos 7 e 8 combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido

seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio e Uréia-Tiouréia

respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads

de vidro (0,5mm diâmetro). Após ruptura das células nos 8 protocolos, os lisados são

centrifugados a 15.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos. O sobrenadante (extrato bruto) é dosado

pelo método de Bradford, aliquotado e armazenados em freezer -80°C, até o momento do uso.

Aproximadamente 20 µg de amostra de cada protocolo são aplicados em um gel SDS-PAGE

69

– IV –

para verificação da integridade da amostra e do perfil de bandas gerados..................................... 69

Figura 10: Abordagem imunoproteômica. Comparação entre as formas clínicas da doença e as

espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii................................................................ 81

Figura 11: Detecção de proteínas imunogênicas com a técnica de Western-Blot. (A)

Transferência das proteínas fúngicas para uma membrana de nitrocelulose; (B) Incubação da

membrana com soro de paciente com esporotricose; (C) Incubação da membrana com um

anticorpo anti-IgG humana conjugado com peroxidase; (D) Incubação da membrana com

luminol; (E) e (F) Detecção dos spots imunogênicos com auxílio de filme fotográfico através da

impressão de pontos luminosos provenientes da reação de quimiluminescência entre a

peroxidase e o luminol..................................................................................................................... 81

Figura 12: Aspecto macroscópico de culturas do complexo S. schenckii em placas de Petri (9

cm diam.) em meio PDA (potato-dextrose-agar), após 21 dias de incubação à 30 °C. A) Ss 49 –

Cluster III (taxa de crescimento lento); B) Ss 139 – Cluster II (taxa de crescimento

intermediário); C) Ss 132 – Cluster I (taxa de crescimento rápido). Imagens reduzidas em 50%

do original......................................................................................................................................... 91

Figura 13: Análise de clusterização em função do crescimento vegetativo apresentado pelos

isolados do complexo Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas

temperaturas de 30, 35, 37 e 40ºC, em meio PDA, aos 21 dias de incubação, de acordo com o

coeficiente Euclidiano (método de ligação complete)...................................................................... 92

Figura 14: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado

pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,

agrupados de acordo com o estado de origem das cepas brasileiras de Sporothrix spp.

Distância Euclidiana (método de ligação complete)......................................................................... 96

Figura 15: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado

pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,

agrupados de acordo com a forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem

ambiental. Distância Euclidiana (método de ligação complete)...................................................... 99

Figura 16: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias (30, 35, 37 e 40

ºC) apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo S. schenckii de acordo com o


Figura 17: Análise de clusterização baseado na inibição do crescimento vegetativo aos 21

dias de incubação em meio PDA, apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii

em função do diâmetro das colônias nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em relação à

temperatura de 30 ºC, de acordo com o coeficiente Euclidiano...................................................... 109

Figura 18: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo

apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e

40ºC em relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com o

estado de origem das cepas brasileiras. Distância Euclidiana (método de ligação complete)..... 112

Figura 19: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo

apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e

40ºC em relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com a

forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem ambiental. Distância Euclidiana

(método de ligação complete).......................................................................................................... 114

– V –

Figura 20: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo nas

temperaturas de 35, 37 e 40 ºC (em relação ao diâmetro obtido na temperatura de 30 ºC)

apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii, de acordo com o


Figura 21: Inibição do crescimento dos isolados do complexo Sporothrix schenckii de acordo

com a origem geográfica dos isolados brasileiros (A e B), a origem humana (fixa e

linfocutânea), animal e ambiental (C e D) e a espécie filognética (E e F) a 35º e 37º C em

relação a temperatura de 30 ºC (21 dias de incubação). SE= Sudeste; S= Sul; CO= Centro-

Oeste; N= Norte; NE= Nordeste. (Barras: Valores máximos e mínimos)........................................ 117

Figura 22: Tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas brasileiras do complexo

Sporothrix schenckii. A) Conídios globosos de S. globosa (Ss06) diam.: 3,18 µm; B) Conídios

triangulares de S. schenckii (Ss 58) diam.: 3,2 µm; C) Conídios obovóides de S. mexicana (Ss

132) diam.: 3,13 µm; D) Conídios circulares de S. brasiliensis (Ss 10) diam.: 2,6 µm. Aumento

400X. Quadrantes em destaque 1000X........................................................................................... 118

Figura 23: Assimilação das fontes de carbono glicose (controle positivo), rafinose, ribitol e

sacarose após 10 dias de incubação a 25 ºC. O isolado Ss54 é capaz de assimilar apenas

glicose e fracamente ribitol, enquanto o isolado Ss131 é capaz de assimilar as quatro fontes de

carbono avaliadas. O controle negativo é representado apenas pelos conídios inoculados (2 x

105 a 2 x 10

6 UFC/mL) em meio YNB sem adição de fontes de carbono........................................ 120

Figura 24: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes

de carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii, após 05 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC. Coeficiente de

Jaccard (método de ligação average).............................................................................................. 126

Figura 25: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes

de carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii, após 10 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC. Coeficiente de

Jaccard (método de ligação average).............................................................................................. 129

Figura 26: Porcentagem de assimilação dos açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose pelas

cepas do complexo Sporothrix schenckii (n=170) após 5 e 10 dias de incubação.......................... 130

Figura 27: Extração de DNA de Sporothrix schenckii (1). Gel de agarose 0,8%, 100 v, 60

minutos. À esquerda, padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen, USA)............. 131

Figura 28: Amplicon do fragmento do gene da calmodulina (éxon 3-5), pela técnica de PCR, de

cepas representativas das espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii. (1) S.

schenckii (Ss 01); (2) S. brasiliensis (Ss 54); (3) S. globosa (Ss 06); (4) S. mexicana (Ss 131);

(5) controle negativo. Gel de agarose 1,2%, 80 v, 60 minutos. À esquerda padrão de peso

molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek, Canadá)............................................ 131

Figura 29: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento do gene da calmodulina

das espécies do complexo Sporothrix schenckii. Os sítios destacados em azul demonstram o

polimorfismo da sequência comparada entre as espécies S. schenckii (Ss01); S. brasiliensis

(Ss54); S. globosa (Ss06) e S. mexicana (Ss132) representadas no Brasil. CLC Sequence

Viewer 5, versão 5.1......................................................................................................................... 132

Figura 30: Distribuição dos isolados brasileiros do complexo Sporothrix schenckii após a

taxonomia polifásica de acordo com o estado de origem em que a cepa foi isolada. Os estados

em branco não possuem representantes estudados (A distribuição dos isolados dentro dos

148

– VI –

limites geográficos dos estados não representa a dispersão destes no território ou o ponto em

que foram isolados. No estado do Rio de Janeiro, por exemplo, todos os isolados estudados

são provenientes da região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro)........................................

148

Figura 31: Separação eletroforética por SDS-PAGE do extrato de proteínas de leveduras de

Sporothrix schenckii (Ss118), após 7 dias de cultivo em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um

inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida (10%) representativo da triplicata biológica

realizada para esta condição de cultivo. Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de

extração (2 µg de proteínas). Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein

Ladder (kDa).................................................................................................................................... 150

Figura 32: Perfis de bandas após a precipitação de proteínas. Aproximadamente 300 µg de

proteínas foram precipitadas utilizando Acetona, TCA, TCA/Acetona ou 2D Clean-up kit (GE

Healthcare) ressupensos em tampão de solubilização (uréia-tiouréia) e aplicados em gel de

SDS-PAGE (10%). Padrão de peso molecular Invitrogen – BenchMark Protein Ladder................ 151

Figura 33: Eletroforese bidimensional do extrato celular total do isolado Ss 118, resultante da

combinação do protocolo de extração através da maceração em nitrogênio líquido e

solubilização em tampão de extração tris-cálcio. Aproximadamente 300 µg de proteínas foram

precipitadas utilizando o 2D Clean-up kit (GE Healthcare), solubilizadas em tampão uréia-

tiouréia e aplicados em tiras de pH imobilizado (pH 4-7, 13 cm). Gel de poliacrilamida (10%)

representativo da triplicata biológica realizada. Padrão de peso molecular Invitrogen –

BenchMark Protein Ladder (kDa)..................................................................................................... 152

Figura 34: Perfil protéico de leveduras do complexo Sporothrix schenckii, após 7 dias de cultivo

em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida

(10%). Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de extração (2 µg de proteínas).

Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein Ladder. Coloração por nitrato de

prata................................................................................................................................................. 153

Figura 35: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix brasiliensis (Ss 54). Aproximadamente

300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16

cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein

Ladder.............................................................................................................................................. 156

Figura 36: Perfil proteômico de leveduras de S. globosa (Ss 06). Aproximadamente 300 µg de

proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).

Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein Ladder.... 156

Figura 37: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix mexicana (FMR 9108).

Aproximadamente 300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-

PAGE 10% (16 x 16 cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-

BenchMark Protein Ladder............................................................................................................... 157

Figura 38: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix schenckii (Ss 118). Aproximadamente

300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16


Ladder.............................................................................................................................................. 157

Figura 39: Imunoproteômica da cepa Ss 54 de S. brasiliensis. As proteínas do fungo S.

brasiliensis são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de

soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B)

forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana

162

– VII –

conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000) Revelação por

quimioluminescência........................................................................................................................

162

Figura 40: Imunoproteômica da cepa Ss 06 de S. globosa. As proteínas do fungo S. globosa

são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de soros de

pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma

linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana

conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por

quimioluminescência........................................................................................................................ 163

Figura 41: Imunoproteômica da cepa FMR 9108 de S. mexicana. As proteínas do fungo S.

mexicana são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de

soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B)

forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana



Figura 42: Imunoproteômica da cepa Ss 118 de S. schenckii. As proteínas do fungo S.

schenckii são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de soros

de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma

linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana



– VIII –

Lista de Tabelas

Tabela 1: Classificação taxonômica do gênero Sporothrix.............................................................. 04

Tabela 2: Resumo das características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das espécies

filogenéticas do complexo S. schenckii............................................................................................ 11

Tabela 3: Representação dos principais gêneros de fungos de importância médica que

sofreram alterações na classificação nos últimos anos................................................................... 15

Tabela 4: Manifestações clínicas da esporotricose no hospedeiro humano (Lopes-Bezerra et al.,

2006)................................................................................................................................................ 23

Tabela 5: Código dos isolados, forma clínica da doença/ ou substrato ambiental e origem

geográfica das cepas de Sporothrix spp. depositados na micoteca do Laboratório de Mico-

Sorologia, Disciplina de Biologia Celular.......................................................................................... 46

Tabela 6: Isolados de referência do complexo Sporothrix schenckii, descritos em 2007 por

Marimon et al., depositados na coleção de culturas de fungos Centraalbureau voor

Schimmelcultures (CBS), Utrecht, The Netherlands........................................................................ 51

Tabela 7: Resumo dos aspectos morfofisiológicos chaves para a diferenciação das espécies do

complexo S. schenckii. Adaptado de Marimon et al. (2007)............................................................ 51

Tabela 8: Marcador molecular utilizado para amplificação e sequenciamento do gene da

calmodulina, temperatura de anelamento e longitude do fragmento amplificado............................ 65

Tabela 9: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação

em diferentes temperaturas............................................................................................................. 84

Tabela 10: Diâmetro médio da colônia (mm) de isolados brasileiros cultivado em meio de

cultura PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas, de acordo com a origem

geográfica do isolado....................................................................................................................... 95


em diferentes temperaturas de acordo com a origem do isolado e a forma clínica da doença

desenvolvida no hospedeiro............................................................................................................. 97


em diferentes temperaturas de acordo com a espécie filogenética................................................. 100

Tabela 13: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo in vitro em meio PDA aos 21

dias de incubação nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em função de diferentes temperaturas..... 102

Tabela 14: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo em meio de cultura PDA aos 21

dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a origem geográfica do isolado.... 110

Tabela 15: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA aos 21

dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a origem do isolado e a forma

clínica da doença desenvolvida no hospedeiro................................................................................ 113

Tabela 16: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA aos 21

dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a espécie filogenética................... 115

Tabela 17: Resultados das provas fisiológicas de assimilação das fontes de carbono glicose,

rafinose, ribitol e sacarose para os conídios das cepas do complexo S. schenckii, após 05 e 10

dias de incubação a 25 ºC............................................................................................................... 120

– IX –

Tabela 18: Taxonomia molecular dos isolados do complexo Sporothrix schenckii baseados na

comparação da sequência de nucleotídeos entre o éxon 3-4 e 3-5 do gene da calmodulina......... 133

Tabela 19: Taxonomia polifásica das cepas do complexo Sporothrix schenckii utilizando

parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares....................................................................... 141

Tabela 20: Quantidade de proteínas extraídas de acordo com os protocolos de extração

avaliados.......................................................................................................................................... 150

Tabela 21: Resumo das características proteômicas das espécies do complexo S. schenckii...... 155

Tabela 22: Proteoma comparativo das espécies do complexo S. schenckii................................... 160

Tabela 23: Características moleculares experimentais das proteínas imunogênicas detectadas

na esporotricose humana................................................................................................................. 166

– X –

Lista de abreviaturas e símbolos

µg Micrograma M Molar

µl Microlitro mA Miliampere

ρmol Picomol MALDI-TOF

matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

1D Unidimensional Mg Miligrama

2D Bidimensional mL Mililitro

BHI Brain Heart Infusion Mm Milímetro

BLAST Basic Local Alignment Search Tool mM Milimolar

BSA Bovine Serum Albumin MS Espectrometria de Massa

CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures

MW Molecular weigth

CFU Colony Forming Unit NCBI National Centre for Biotechnology Information

cm Centímetros Ng Nanograma

CMA Corn Meal Agar OD Optical density

ConA Concanavalina A Pb Pares de bases

DNA Ácido desoxirribonucléico PBS phosphate buffered saline

dNTP Desoxirribonucleotídeo PCR Reação da polimerase em cadeia

DTT Ditiotreitol PDA Potato Dextrose Agar

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay pI Ponto isoelétrico

et al. “et allia” RNA Ácido ribonucléico

FMR Facultat de Medicina de Reus RPM Rotações por minuto

IEF Focalização isoelétrica SDA Sabouraud Dextrose Agar

Ig Imunoglobulina SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

IPG Gradiente imobilizado de pH Ss Sporothrix schenckii

Kb Kilo base TCA Ácido tricloroacético

kDa kilo Dalton(s) Tm Temperatura de anelamento

Kg Quiilograma V Volts

µg Micrograma v/v Volume por volume

µl Microlitro YNB Yeast Nitrogen Base

® Marca registrada

1

Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1 Fungos de importância médica: Perspectiva geral

A vida na Terra é diversa e interativa: não foi descrito ainda nenhum

ecossistema contendo uma única espécie. As interações entre os organismos

podem ser de naturezas muito distintas, variando de benéficas, neutras a

prejudiciais. As doenças infecciosas são geralmente definidas como o resultado de

uma ou de um conjunto de interações prejudiciais, e comumente são restritas para

uma determinada combinação de hospedeiro (o doente) e patógeno (o agente

causador de doenças) (van Baarlen et al., 2007) (Figura 1). Estima-se que

aproximadamente 15 milhões, das 57 milhões de mortes mundiais estejam

relacionadas a doenças infecciosas (Morens et al., 2004).

Os primeiros fósseis de plantas terrestres e fungos apareceram entre 480 e

460 milhões de anos atrás (Heckman et al., 2001). Desde então as espécies

fúngicas evoluíram e adaptaram-se a viver em uma grande variedade de ambientes

e nichos ecológicos e, consequentemente, constituem atualmente, um grupo muito

diverso de organismos. Pouco mais do que 100.000 espécies foram identificadas até

o presente momento, todavia, isto significa apenas uma pequena parcela da

biodiversidade total das espécies fúngicas. De acordo com Sullivan et al. (2005)

estima-se que existam ao menos 1,5 milhões de espécies fúngicas habitando o

planeta Terra. Aproximadamente 150 a 200 espécies são capazes de provocar

doença em hospedeiro humano, as quais comumente são denominadas de micoses.

Robert & Casadevall (2009), consideram que a endotermia e a homeotermia

desenvolvidas por mamíferos e insetos respectivamente, são potentes defesas não-

específicas contra a maioria dos fungos. Tais adaptações fisiológicas de

manutenção da temperatura, embora dispendiosas para os hospedeiros, podem ter

2


Introdução

favorecido a sobrevivência evolucionária destes contra o estabelecimento da

infecção.

Devido ao fato de poucos fungos serem essencialmente patógenos, o

mecanismo de patogênese tende a ser altamente complexo, resultando em grande

parte de adaptações pré-existentes de características de organismos com modo de

vida não parasitária (van Burik & Magee, 2001). Os fungos patogênicos têm

emergido como uma ameaça à saúde pública devido a expansão da população de

pacientes vulneráveis com algum déficit imunitário (Charlier et al., 2005) e a elevada

exposição a estes microrganismos em nosso ambiente, particularmente aos fungos

dimórficos sistêmicos que habitam amplamente o solo (Brandhorst et al., 2002).

Figura 1: Triangulo da doença. As interações compatíveis entre um patógeno e o hospedeiro apenas

resultarão em doença quando forem atendidos os três fatores: patógeno, hospedeiro e

condições do ambiente (adaptado de van Baarlen et al., 2007 e Sullivan et al., 2005).

No caso de algumas micoses em especial, observa-se com o passar do

tempo, o aumento do número de ocorrências, atingindo patamares epidêmicos assim

como o aumento da severidade com que essas doenças acometem o homem, em

pacientes não necessariamente imunocomprometidos. O tratamento é realizado por

3


Introdução

longos períodos, com drogas muitas vezes agressivas, que produzem diversos

efeitos colaterais e resultados em grande parte insatisfatórios, acarretando em ônus

para a saúde pública.

Neste atual panorama, a micologia médica não pode valer-se apenas de

caracteres morfológicos, fisiológicos e bioquímicos isolados, para a classificação e

estudo da biologia dos fungos. Cada vez mais, torna-se necessário agregar novos

valores no âmbito da pesquisa. Neste contexto tem sido inestimável a contribuição

em conjunto de ciências como a ecologia, a epidemiologia, a imunologia, a genética

e a biologia molecular para o entendimento da complexidade que esta por trás das

interações destes microrganismos com o homem no século XXI.

A micologia médica, que há algumas décadas era considerada uma ciência

enigmática, caracterizada por infecções “exóticas” apresentada por pacientes na

rotina clínica, tem atualmente entrado na era genômica e proteômica.

1.2 Sporothrix schenckii Hektoen et Perkins 1900 e o complexo S.

schenckii

O patógeno mais importante da ordem Ophiostomatales é o fungo

dimórfico Sporothrix schenckii, o agente etiológico da esporotricose (Guarro et al.,

1999) (Tabela 1). O primeiro caso apresentado com o quadro clínico de

esporotricose foi relatado por Schenck em 1898 no Johns Hopkins Hospital em

Baltimore, EUA (Schenck, 1898, Rippon, 1982). O gênero Sporothrix foi proposto em

1900 por Hektoen & Perkins para o fungo isolado por Schenck dois anos antes.

Diversos sinônimos são descritos na literatura, dentre eles: Sporotrichum sp.

Smith 1898; Sporotrichum schenckii Matruchot 1910; Sporotrichum beurmanni

Matruchot & Ramond 1905; Sporotrichum asteroides Splendore 1909; Sporotrichum

equi Carougeau 1909; Sporotrichum jeanselmei Brumpt e Langeron 1910;

4


Introdução

Sporotrichum councilmani Wobach 1917; Sporotrichum grigsby Dodge 1935;

Sporotrichum fonsecai Filho 1930; Sporotrichum cracoviense Lipinski 1928;

Rhinocladium schencki Verdun e Mandoul 1924; Rhinotricum schenckii Ota 1928.

Tabela 1: Classificação taxonômica do gênero Sporothrix.

Reino Fungi

Divisão Ascomycota

Classe Sordariomycetes

Ordem Ophiostomatales

Família Ophiostomataceae

Gênero Sporothrix

Espécies S. schenckii; S. brasiliensis; S. globosa; S. mexicana; S. albicans; S. luriei

S. schenckii existe em todo o mundo, principalmente nas zonas temperadas

e tropicais (Esteves et al., 1990) e é um fungo termodimórfico, saprófito e geofílico,

comumente isolado de fontes ambientais como o solo e plantas. Este microrganismo

é responsável por causar uma infecção crônica na pele e tecido subcutâneo (Mehta

et al., 2007; Hay & Morris-Jones, 2008) a qual é adquirida principalmente por

implantação traumática deste patógeno (Hogan et al., 1996; Del Piero, 2003;

Benchekroun et al., 2008), sendo raros os casos de transmissão de pessoa para

pessoa (Carr et al., 1995).

O principal reservatório de fungos patogênicos para o homem é o solo

(Esteves et al., 1990) e este certamente não funciona como reservatório passivo de

esporos. Além do solo as plantas também são consideradas reservatórios naturais

de S. schenckii (Gumaa, 1989). O clima pode influenciar no desenvolvimento de S.

schenckii, o qual necessita de 95-100% de umidade relativa para seu

desenvolvimento (Mackinnon, 1949; Menges et al., 1952; Mackinnon, 1968).

5


Introdução

A questão do estado teleomórfico de S. schenckii tem sido enfatizada em

estudos pela comparação de características fenotípicas e genotípicas de S.

schenckii e espécies ascígeras de Ceratocystis (Travassos, 1985). Certos

ascomicetos pertencentes ao gênero Ceratocystis são relacionados à S. schenckii

(Travassos & Lloyd, 1980).

Estudos realizados por Mariat (1969, 1971), Taylor (1970), Nicot & Mariat

(1973), Toriello & Mariat (1974), Bievre & Jourd’huy (1974), Bievre & Mariat (1975)

sugerem que o estado perfeito de S. schenckii se encontre no gênero Ceratocystis.

De acordo com Esteves et al. (1990) é conhecida a variante não sexuada de

Ceratocystis stenoceras, patogênica em modelo murino, muito semelhante à S.

schenckii. A divisão do gênero Ceratocystis tem sido proposta (Weijman & de Hoog,

1975), onde as espécies que apresentam conidiogênese endógena ou com estado

chalara são consideradas Ceratocystis sensu strictu, enquanto aquelas espécies

com conidiogênese exógena ou com estados Graphium-like foram classificadas

como Ophiostoma. As espécies ascígeras relacionadas à S. schenckii pertencem ao

gênero Ophiostoma (Travassos & Lloyd, 1980) embora algumas espécies do gênero

Ceratocystis produzam anamorfos indistinguíveis de S. schenckii (Travassos, 1985).

Estudos prévios de hibridização de DNA fornecem fortes evidências de que

O. stenoceras não é o teleomorfo de S. schenckii (Lopes-Bezerra et al., 2006).

Fundamentado na composição de bases do DNA e experimentos de hibridização,

Travassos & Lloyd (1980) sugerem que diferentes isolados de S. schenckii não

sejam os anamorfos de diferentes espécies do gênero Ceratocystis, mas que

possivelmente a espécie S. schenckii seja a forma homogênea imperfeita de uma

ainda não identificada espécie do gênero Ceratocystis (Travassos, 1985). De acordo

com Berbee & Taylor (1992) e de Meyer et al. (2008) a sequência de DNA do gene

ribossomal (18S) evidencia indiretamente que o teleomorfo de S. schenckii possa

6


Introdução

pertencer ao gênero Ophiostoma (Ophiostomatales) e que provavelmente seja o

fungo não-patogênico O. stenoceras.

Os procedimentos habituais para a identificação de fungos baseiam-se no

exame da colônia (pigmentação superficial e inferior da colônia, topografia, textura e

taxa de crescimento) e morfologia microscópica (tamanho e forma dos macro e

microconídios, espiral, órgãos nodulares e ramificações), além de se valerem de

características como necessidades nutricionais e tolerância à temperatura.

Na natureza e/ou em cultura in vitro à temperatura ambiente S. schenckii é

um fungo filamentoso, enquanto que no tecido do hospedeiro e/ou em cultura in vitro

a 37 ºC existe como levedura.

Macroscopicamente, as colônias de S. schenckii são achatadas

apresentando crescimento lento, 4-15 mm em sete dias, em meio de ágar

Sabouraud à temperatura de 25° C (Summerbell, 2002). A colônia jovem exibe cor

variando de branca ao creme, de textura coriácea, com superfície sulcada. Algumas

amostras permanecem com a tonalidade creme, enquanto outras desenvolvem uma

coloração castanha escura a negra com o passar do tempo de cultivo. À temperatura

de 37 °C, o fungo semeado em ágar infusão de cérebro e coração (BHI), acrescido

ou não de sangue, transforma-se em colônia leveduriforme, de aspecto cremoso,

com coloração variando de branca a creme e com superfície irregular. A coloração

enegrecida apresentada por muitas culturas de S. schenckii tem sido atribuída à

presença do pigmento melanina (Romero-Martinez et al., 2000; Morris-Jones et al.,

2003; Madrid et al., 2010b) um reconhecido fator de virulência em fungos (Gómez &

Nosanchuk, 2003; Taborda et al., 2008). Fatores como diferentes concentrações de

pH e carboidratos podem ser responsáveis por afetar a produção de melanina in

vitro em S. schenckii (Almeida-Paes et al., 2009). A adição de tiamina e biotina aos

cultivos, bem como o fraco teor de CO2 facilitam a conversão da forma miceliana

para a leveduriforme (Lacaz et al., 2002).

7


Introdução

Microscopicamente, à temperatura de 25 °C verificam-se hifas delgadas,

hialinas, septadas e ramificadas, com conidióforos delgados em cujos ápices são

encontrados simpodulosporos hialinos, unicelulares, globosos a ovóides que nascem

em pequenos dentículos, ficando reunidos caracteristicamente em disposição floral

(lembrando margaridas) (Benade et al., 1997; Lacaz et al., 2002). As células

conidiogêneas surgem perpendicularmente à superfície das hifas. Elas são, por

vezes, terminais, cilíndricas, de 10-40 x 1-2 μm na maturidade, levemente

intumescidas, com ráquides simpodialmente compactas com fiálides semelhantes à

dentículos no ápice. Muitas vezes apresentam dentículos escassamente dispersos

ao longo da haste. Os conídios primários são formados em rosetas simpodiais sobre

o ápice dos conidióforos. Eles são obovóides (em forma de ovo, ligados por uma

terminação delgada), com dimensão de 3-6 x 1,5-3 μm (Summerbell, 2002). Os

conídios secundários são marrons escuros, geralmente subglobosos e medem cerca

de 3 μm de diâmetro. Em alguns isolados é comum a presença de conídios

triangulares ligados individualmente a dentículos nas hifas, especialmente em

cultivos em substrato sólido (ágar) (Summerbell, 2002). Os conídios desprendem-se

dos conidióforos, ficando por vezes dispostos um ao lado dos outros, enfileirados e

em ambos os lados da hifa.

Em esfregaço de cultura corado pelo método de Gram, o exame

microscópico de culturas leveduriformes revela a presença de células Gram-

positivas, globosas, ovais ou fusiformes (em forma de charutos) (Lacaz et al., 2002).

A transição para o estado dimórfico foi descrito por Howard (1961). A

conversão de fase pode ser obtida in vitro através do cultivo do fungo em meio

infusão de cérebro e coração (BHI). As colônias leveduriformes são brilhantes e

possuem coloração branca a creme. As leveduras medem de 3-10 x 1-3 μm com

brotos oboclavados (em forma de charuto). Brotos simpodiais formando pares são

tipicamente vistos (em forma de orelhas de coelho) (Summerbell, 2002).

8


Introdução

Figura 2: O complexo Sporothrix schenckii. As espécies crípticas do complexo S. schenckii são

indistinguíveis macroscopicamente, sendo empregadas as diferenças microscópicas,

características fisiológicas e metabólicas para a distinção clássica entre as espécies. A) S.

brasiliensis; B) S. schenckii; C) S. globosa; D) S. mexicana; E) S. albicans e F) S. luriei.

Estudos com diferentes isolados de S. schenckii relatam a existência de

variações fenotípicas entre as cepas. Estas diferenças incluem variações na

morfologia da colônia (Ghosh et al., 2002), no crescimento em diferentes meios de

cultura (Ghosh et al., 2002; Mendoza et al., 2005), na termotolerância (Marimon et

al., 2007; Fernandes et al., 2009b), na virulência em modelo murino (Nobre et al.,

2005; Kong et al., 2006; Brito et al., 2007; Arrillaga-Moncrieff et al., 2009), na

suscetibilidade às drogas antifúngicas (Marimon et al., 2008a), na secreção de

proteínas (Fernandes et al., 2009a) e na síntese de melanina (Romero-Martinez et

al., 2000; Almeida-Paes et al., 2009).

9


Introdução

São diversos os relatos que comprovam a diversidade genética e

morfológica de isolados clínicos de S. schenckii. Smith & Batenburg-Van der Vegte

(1985) propuseram a heterogeneidade do gênero Sporothrix com base em estudos

de microscopia eletrônica evidenciado ao menos três padrões distintos de micro-

poros presente na membrana celular entre os septos.

A primeira indicação molecular de que a espécie S. schenckii aparenta ser

um complexo de espécies distintas foi proposto por Marimon et al. (2006) através da

análise filogenética combinada da sequência de DNA de três loci (Quitina sintase, β-

tubulina e Calmodulina) de sessenta isolados de S. schenckii de diversas regiões

geográficas. Os isolados foram agrupados em três “clusters” principais,

compreendendo um grupo de isolados europeus, um grupo apenas com isolados

brasileiros e um último grupo com isolados de países da América Latina e África.

Recentemente, Marimon et al. (2007) caracterizaram fenotipicamente e

genotipicamente 127 isolados previamente classificados como S. schenckii de

diversas regiões do mundo e propuseram além de S. schenckii, três novas espécies,

como agentes etiológicos da esporotricose com base nos perfis de assimilação de

açúcares (rafinose e ribitol), no diâmetro médio das colônias após crescimento nas

temperaturas de 20, 30, 35 e 37 °C, na morfologia dos conídios e nas sequências do

gene da calmodulina. As seguintes espécies foram propostas: S. brasiliensis, S.

globosa e S. mexicana. Em 2008, Marimon et al. propuseram que S. schenckii var.

luriei, uma variante morfológica de S. schenckii (patogênica ao homem e de

amplitude geográfica restrita) fosse elevado a espécie sendo denominado de S.

luriei.

Sporothrix stylites, S. humicola e S. lignivora foram descritos recentemente

como novos táxons dentro do gênero Sporothrix, baseados na sequência dos genes

LSU, ITS e -tubulina (de Meyer et al., 2008). Com base em sequências de LSU os

isolados de Sporothrix spp. de madeiras e de solo formam três distintos grupos

10


Introdução

dentro do complexo O. stenoceras-S. schenckii. Estes grupos diferem quanto as

regiões geográficas e hospedeiros de que foram isolados. O fungo Sporothrix stylites

compreende o grupo de isolados provenientes de madeira de pinheiros em

Plettenberg Bay, e filogeneticamente relacionada com S. pallida. A espécie S.

humicola compreende os isolados provenientes do solo e que anteriormente eram

denominados por de Beer et al. (2003) como isolados ambientais de S. schenckii. S.

lignivora corresponde aos isolados de Eucaliptos de ambas localidades Saint Lucia e

Stellenbosch. Os isolados clínicos de S. schenckii formaram um grupo distinto dentro

da análise filogenética realizado por de Meyer et al. (2003) levando em consideração

o polimorfismo da sequência do gene LSU. As análises filogenéticas também

confirmaram a sinonímia de S. albicans e S. nivea com S. pallida.

Madrid e colaboradores (2010a) descreveram duas novas espécies

saprófitas dentro do gênero Sporothrix, a saber: S. brunneoviolacea e S.

dimorphospora. A espécie S. brunneoviolacea caracteriza-se fenotipicamente pela

produção de um pigmento violeta-marrom difuso na cultura in vitro.

Microscopicamente os conídios são globosos, pigmentados, com a presença de

blastoconídios laterais. S. dimorphospora, entretanto, não apresenta a produção do

pigmento característico em cultivos in vitro. Os conídios são basicamente

subglobosos a obovóides com a presença de blastoconídios laterais pigmentados.

Em contraste aos resultados obtidos para a cepa tipo de S. inflata, as espécies

descritas por Madrid et al. (2010a) são capazes de assimilar o açúcar rafinose como

única fonte de carbono. A tabela 2 resume as principais características fenotípicas e

genotípicas que possibilitam diferenciar as espécies filogenéticas de importância

clínica propostas por Marimon et al. (2007). Em virtude das recentes alterações que

ocorreram na taxonomia do agente etiológico da esporotricose é necessário rever a

concepção de espécie utilizada no estudo de fungos e como o emprego deste tem

sido alterado, aplicado e influenciado na prática clínica.

11


Introdução

Tabela 2: Resumo das características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das espécies filogenéticas do complexo S. schenckii.

Características Espécies filogenéticas

S. brasiliensis S. schenckii S. globosa S. mexicana S. albicans S. luriei

Clado (genótipo) I II (IIa e IIb) III IV V –

Co

lôn

ia

(mm

)

30°C 15-38 23-34 18-40 66-69 62-71 51

35°C 10-22 14-30 6-16 10-11 27-29 35-36

37°C 5-10 3-9 0 1.5-2.5 2-5.5 21

40°C 0 0 0 0 0 0

Fo

nte

s

de

Ca

rbo

no

Rafinose Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo

Sacarose Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo

Ribitol Variável Variável Variável Variável Variável Positivo

Co

níd

io

Sim

po

dia

l Tamanho (µm) 2-6 x 1-4 3-6 x 1,5-3 2-5 x 1-3 3-5.5 x 2-2.5 - 4-10 x 1-2

Formato Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide

Coloração Hialino a

subhialino Hialino a



Subhialino Hialino a

Subhialino Hialino

Sé

ss

il

Tamanho (µm) 2.5-5x2-3 3 2.5-4 x 2-3.5 3-4 x 2-2.5 - 4-10 x 1-2

Formato Globoso a subgloboso

Triangulares a cuneiformes

Globoso a subgloboso

Subgloboso, obovóides e elipsóide

Obovóides a elipsóide

Obovóide

Coloração Marrom a

Marrom escuro Marrom a



Marrom escuro Marrom a Marrom

escuro Hialino

MIC

- µ

g/m

l

(co

níd

io) Terbinafina 0.06–0.25 0.06–0.5 0.06–1 0.5 0.25–4 0.25

Itraconazol 0.5–2 1–32 1–32 32 32 1

Posaconazol 0.25–1 0.5–16 1–16 32 1–2 0.5

Anfotericina B 1–4 0.5–4 2–8 16–32 2–8 2

Virulência (modelo murino) OF-1 male mice

Alta Alta Intermediária Baixa Baixa Não testado

Informações baseadas nos trabalhos publicados na literatura por: Summerbell (2002); Marimon (2007); Marimon et al. (2007, 2008a,b); e Arrillaga-Moncrieff et al. (2009).

12


Introdução

1.3 Conceitos de espécie em micologia

A natureza detesta categorias e de todas elas, uma das mais difíceis de

conciliar é a categoria de espécies biológicas (Lemke, 2001). Existem muitas

peculiaridades que são utilizadas na micologia tradicional e moderna que contribuem

para os estudos taxonômicos dos fungos. Estas incluem morfologia, anatomia,

bioquímica, sequenciamento de ácidos nucléicos, entre outras (Kurtzman, 1989;

Vinnere, 2004).

O conceito de espécie é a categoria fundamental utilizada em todas as

classificações biológicas (van Regenmortel, 1992) e a sua definição e aplicação é

sempre uma tarefa difícil (Valente et al., 1999). De um aspecto filosófico a questão

concentra-se na definição e delimitação do que é uma espécie em micologia,

enquanto que na perspectiva prática o problema esta centrado no reconhecimento

das espécies através das características morfológicas, fisiológicas e moleculares

apresentadas pelo grupo estudado.

A definição de espécie, seja para plantas superiores, animais, ou

microrganismos, tem sua base no princípio do isolamento genético. De acordo com

Mayr (1970), espécies são grupos de populações naturais intercruzantes, os quais

são isolados reprodutivamente de outros grupos. Basicamente, segundo

Dobzhansky (1976), membros de uma mesma espécie podem ser considerados

inférteis, enquanto que espécies geneticamente separadas podem não o ser.

Entretanto, até o final da década de 1960, a principal maneira pela qual era possível

definir espécie em leveduras baseava-se na avaliação subjetiva do mensuramento

de propriedades fenotípicas como a morfologia celular e resposta de crescimento em

várias fontes de açúcares entre outros compostos (Kurtzman, 1998).

O reino Fungi apresenta vários problemas na determinação das espécies,

pois pouco se sabe sobre a amplitude da variabilidade dentro das populações; os

13


Introdução

ciclos de vida são diversos e complexos; e a reprodução (sexual e assexual) além de

extremamente complexa, pode afetar os padrões evolutivos de formas biológicas

que ainda não compreendemos (Petersen & Hughes, 1999).

Não existe um conceito de espécie único, universalmente reconhecido em

Biologia. De acordo com Nelson (1963) seria ingênuo insistir em uma definição de

espécie completamente exclusiva, porém dentro dos limites aceitáveis, um conceito

praticável é necessário. Tem feito pouca diferença se é teoricamente possível

determinar se duas populações compreendem espécies distintas, a menos que estas

espécies sejam delimitadas claramente o bastante para que outros pesquisadores

possam distingui-las com base nos caracteres definidos.

O que constitui uma espécie continua sendo o principal problema

taxonômico, independente da metodologia (Seifert et al., 1995). De acordo com de

Hoog et al. (2007) e Gräser et al. (2008), com o desenvolvimento recente de

ferramentas moleculares mais sensíveis para a identificação de espécies, tem-se

chegado sem dúvida à correta identidade do suposto agente infeccioso.

De acordo com Guarro et al. (1999) diferentes conceitos de espécie têm sido

utilizados pelos micologistas para definir as espécies fúngicas. Segundo Mayden

(1977), dentre os conceitos existentes os mais empregados são: conceito fenético ou

morfológico (morfológicos, fenotípicos), conceito biológico (cruzamentos) e conceito

cladístico (filogenética evolutiva).

Espécies microbianas podem ser definidas como um grupo ou táxon com

uma história evolucionária comum, e consequentemente, compartilham

características únicas (Simpson, 1951). O conceito morfológico de espécie

(fenético ou fenotípico) (MSC – morphological species concept) é um enfoque

clássico utilizado pelos micologistas. Neste conceito as unidades são definidas com

base nas características morfológicas idealizando as diferenças entre estas. O

conceito ecológico, que é baseado preferencialmente na adaptação a um habitat

14


Introdução

particular do que o isolamento reprodutivo, tem sido geralmente adotado para a

classificação de fungos fitopatogênicos. O conceito biológico (BSC – biological

species concept), que foi desenvolvido antes do advento da análise filogenética

moderna, enfatiza a troca gênica (reprodução sexual e parasexual) entre as

espécies e a presença de barreiras que previnam o intercruzamento (cross-breeding)

de espécies. O conceito filogenético de espécie (PSC – phylogenetic species

concept) considera que os indivíduos que pertencem a uma espécie contêm todos

os descendentes de uma única população de ancestrais, ou seja, são monofiléticos.

Define-se espécie então como “o menor agrupamento diagnosticável de organismos

individuais dentro dos quais há um padrão de ancestralidade e descendência”

(Harrington & Rizzo, 1999). Assim, a premissa implícita no conceito filogenético é

que a classificação deve refletir a relação ramificada entre as espécies, a qual é

indicada por um cladograma.

O MSC é problemático porque pode ser de difícil aplicação para os

microrganismos crípticos que possuem diferenças fenotípicas indistinguíveis entre as

espécies relacionadas. O BSC baseado na incapacidade de intercruzamento exige o

entendimento dos requerimentos para a reprodução sexual, os quais são

desconhecidos para um grande número de fungos, incluindo Sporothrix. O PSC é

aplicável para todos os organismos e tem sido utilizado para caracterizar a

organização de espécies de diversos fungos de importância médica (Barker et al.,

2007) incluindo H. capsulatum (Kasuga et al., 2003), C. neoformans (Know-Chung &

Varma, 2006), P. brasiliensis (Matute et al., 2006; Teixeira et al., 2009), A. fumigatus

(Pringle et al., 2005), Coccidioides immitis (Koufopanou, 2001; Fischer et al., 2002),

Pseudallescheria boydii (Gilgado et al., 2005), Candida parapsilosis (Tavanti et al.,

2005), Fonsecaea nubica (Najafzadeh et al., 2010), Pneumocystis carinii (Beard et

al., 2000) entre outros. A tabela 3 resume algumas modificações taxonômicas que

ocorreram nos principais gêneros de fungos de importância médica.

15


Introdução

Tabela 3: Representação dos principais gêneros de fungos de importância médica que sofreram alterações na classificação nos

últimos anos.

Gênero Espécies

Evidências morfológicas e/ou moleculares Referência Representante do Gênero Espécies propostas

Coccidioides Coccidioides immitis Coccidioides immitis 9 Simple tandem repeats (STRs), 7 Single nucleotide

polymorphisms (SNPs); genômica comparativa. Fisher et al., 2002.

Coccidioides posadasii

Candida Candida albicans Candida albicans Cariótipo eletroforético, diferenças quanto à hibridização das

sondas 27A e Cd25, diferentes condições de crescimento. Sullivan et al., 1995.

Candida dubliniensis

Cryptococcus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Genômica comparativa (C. neoformans, H99 sorotipo A; C.

gattii, sorotipo B, isolado WM276 e R265)

Kwon-Chung et al., 2002.

Idnurm et al., 2005. Cryptococcus gattii

Paracoccidioides Paracoccidioides brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis Concordância genealógica para o reconhecimento de espécies

filogenéticas (GCPSR) utilizando 13 loci nucleares. Teixeira et al., 2009.

Paracoccidioides lutzii

Sporothrix Sporothrix schenckii

Sporothrix schenckii Análise multilócus de genes: calmodulina (CAL), quitina sintase

(CHS), β-tubulina (Bt2), ITS4, ITS5, 28S; diferentes padrões de

assimilação de fontes de carbono, diferentes padrões de

crescimento vegetativo em função da temperatura; morfologia

dos conídios e tipo de conidiogênese; diferentes padrões de

virulência em modelo murino, etc.

Marimon, 2007, Marimon

et al., 2006; 2007; 2008.

Arrillaga-Moncrieff et al.,

2009.

Sporothrix brasiliensis

Sporothrix globosa

Sporothrix mexicana

Sporothrix luriei

Fonsecaea Fonsecaea pedrosoi

Fonsecaea pedrosoi Perfil de AFLP, sequenciamento dos genes ITS e

sequenciamento parcial do gene de divisão do ciclo celular

(cdc42), β-tubulina (tub1) e actina (act1).

Najafzadeh et al., 2010. Fonsecaea monophora

Fonsecaea nubica

Trichosporon Trichosporon beigelli

Trichosporon cutaneum

Análise da ultra-estrutura dos poros entre os septos, % G-C,

hibridização de DNA, perfil nutricional, sequenciamento parcial

de DNA ribossomal (rDNA) da região 26S.

Guého et al., 1992; 1994.

Chagas-Neto et al., 2008.

Trichosporon asahii

Trichosporon asteroides

Trichosporon mucoides

Trichosporon inkin

Trichosporon ovoides

16


Introdução

Devido à biodiversidade do reino Fungi, a vasta abrangência de nichos e

habitats, assim como o desconhecimento do ciclo sexual do microrganismo na

natureza, torna-se necessário que sejam levados em consideração

concomitantemente os mais diversos aspectos da biologia do microrganismo quando

se tem interesse em propor novas espécies, tais como: diferenças morfológicas,

fisiológicas, virulência, manifestações clínicas, sensibilidade a antifúngicos, nicho,

polimorfismo gênico, entre outras, para que não sejam formados grupos ou táxons

artificiais.

1.4 Taxonomia polifásica de fungos patogênicos: Técnicas empregadas

para a classificação.

A sistemática é o estudo da diversidade biológica, mais especificamente, é a

ciência que descobre, descreve e classifica todos os organismos. A taxonomia, a

nomenclatura e a filogenia são todos ramos da sistemática. Estudos da sistemática

de fungos resultam na descoberta e descrição de novas espécies. Enquanto a

nomenclatura designa o nome do organismo, os estudos filogenéticos contribuem

para a classificação dos táxons em grupos geneticamente relacionados (Rossman &

Palm-Hernández, 2008). Todas as categorias taxonômicas devem ser monofiléticas

de um ponto de vista evolucionário (Valente et al., 1999). O sistema de taxonomia

fúngica atual é baseado no Código Internacional de Nomenclatura Botânica. Todas

as classificações fúngicas são designadas pelo homem e nenhuma está livre de

falhas (Wolf & Wolf, 1947a).

A taxonomia é uma ciência dinâmica que está associada com a síntese dos

dados obtidos da bioquímica, biologia celular, genética, morfologia e fisiologia em

um sistema de classificação útil e prático (McGinnis, 1980; Guarro et al., 1999).

Critérios taxonômicos tradicionais como a morfologia celular, o modo de brotamento,

17


Introdução

a presença e o tipo de ciclo sexual e os esporos ainda são fundamentais para a

identificação do gênero. Outros testes utilizados para a classificação de espécie,

como os testes fisiológicos devem ser reconsiderados uma vez que muitas

limitações na taxonomia microbiana têm sido observadas nos últimos anos (Baleiras

Couto et al., 1994; Da Silva et al., 2007; Feau et al., 2009; Moriarty et al., 2009;

Žaloudíková et al., 2009; Alanio et al., 2010; Lu et al., 2010).

De fato, antes do uso rotineiro da taxonomia molecular, demonstrou-se que

mutações pontuais ocorrem em leveduras armazenadas por longos períodos de

tempo em coleções de culturas e que podem resultar em respostas

significantemente modificadas em testes fisiológicos. Sabe-se também que mesmo

quando métodos idênticos são empregados, os resultados podem variar de

laboratório para laboratório. Isto implica que diferentes conceitos têm sido aplicados

na taxonomia fúngica (Guarro et al., 1999).

A identificação de espécies crípticas fungos é ainda um desafio para os

micologistas. Dentro da micologia médica os testes laboratoriais são essenciais para

a identificação e o estabelecimento do diagnóstico das infecções fúngicas (Davey et

al., 1996). Os métodos utilizados são baseados em três enfoques: (1) detecção do

patógeno no tecido através do exame microscópico direto; (2) seu isolamento e

identificação em cultura; e (3) a detecção de uma resposta imunológica ao patógeno

(Davey et al., 1996; Yeo & Wong, 2002). A identificação e a classificação das

espécies de leveduras são muitas vezes difíceis quando baseadas apenas em

características fenotípicas (Meyer et al., 1997).

Variações fenotípicas das espécies fúngicas são comuns em níveis inter e

intra-específicos (Mitchell & Xu, 2003). A observação de caracteres fenotípicos

isolados em microrganismos pode levar a classificações errôneas, exigindo a

necessidade de métodos mais precisos de reconhecimento. O problema de

18


Introdução

microrganismos assexuais leva à ampla aceitação dos métodos moleculares para a

delimitação de espécies.

As técnicas de biologia molecular fornecem muitas oportunidades para

determinar as relações de parentesco entre os organismos. A comparação de

macromoléculas, especialmente a reassociação de DNA nuclear (nDNA/nDNA) pode

ser utilizada para a discriminação de leveduras. Duas leveduras são consideradas

da mesma espécie se apresentarem uma taxa de reassociação superior a 80%

(Price et al., 1978). Porém, Vaughan-Martini & Martini (1996) demonstraram que

mesmo quando tudo é rigorosamente controlado experimentalmente, a semelhança

fenotípica não corresponde necessariamente à sinonímia (Vaughan-Martini &

Martini, 1996).

A atual revolução na biologia molecular tem fornecido subsídios e

refinamento às técnicas empregadas para identificar numerosos táxons de fungos de

importância médica, incluindo espécies patogênicas (Mitchell & Xu, 2003; Putignani

et al., 2010; Sidrim et al., 2010). Métodos baseados na técnica PCR oferecem novas

ferramentas que são diretamente aplicáveis à sistemática de fungos (Bridge & Arora,

1998). Muitos são os genes estudados até o presente momento, cujas sequências

são utilizadas como marcadores moleculares de fungos, como β-tubulina (Cabañes

et al., 2007; Balajee et al., 2009; Shinzato et al., 2009; Ferdman et al., 2009;

Peterson & Horn, 2009; Nalim et al., 2009; Huang et al., 2009), actina (Kawasaki et

al., 2008; Najafzadeh et al., 2009), quitina sintase (Kano et al., 2001; Cabañes et

al., 2007; Marimon et al., 2006; Kano et al., 2008; Ferdman et al., 2009; Horiuchi, et

al., 2009; Tintelnot et al., 2009), fator de elongação (EF-1a) (O'Donnell et al., 2008;

Liu et al., 2009a; Tintelnot et al., 2009), calmodulina (Hirata et al., 2007; Marimon et

al., 2007; O’Donnell et al., 2000; Balajee et al., 2009; Peterson & Horn, 2009), entre

outros.

19


Introdução

Técnicas como imunofluorescência (Camargo, 1974), eletroforese em campo

pulsado para análise do cariótipo (Tateishi et al., 1996) e RFLP mitocondrial (Takeda

et al., 1991; Ishizaki et al., 2009) têm sido utilizadas para identificação de isolados de

S. schenckii. Apesar do conhecimento de que nenhum método em particular é

suficiente para discernir entre duas espécies, muitos pesquisadores têm

desenvolvido uma tendência em superestimar os dados provenientes de análises

filogenéticas para classificar as espécies fúngicas.

Para superar esta premissa, uma abordagem polifásica foi proposta há

quatro décadas, visando a integração dos diferentes dados e informações sobre os

microrganismos e, essencialmente, indica um tipo de consenso na taxonomia.

O termo “taxonomia polifásica” possivelmente foi introduzido por Colwell

em 1970 para se referir a uma taxonomia que engloba diversos níveis de

informações, levando em consideração a síntese das características moleculares à

características ecológicas, incorporando porções de informações extraídas de um

sistema não homogêneo com o intuito de gerar sistema taxonômico

multidimensional. Este enfoque tem sido adotado em diversos estudos no campo da

micologia (Hong et al., 2005; Gräser et al., 2006; Samson et al., 2006; Balajee et al.,

2007; Samson & Varga, 2009).

De acordo com Samson & Varga (2009) o “padrão ouro” para a delimitação

de espécies deve levar em consideração o sequenciamento multilocus de genes

conservados (ITS, calmodulina, β-tubulina, actina, etc.), integrados à análise de

características morfológicas, fisiológicas e ecológicas. A figura 2 ilustra a resolução

de diversas técnicas comumente utilizadas no campo da micologia para a taxonomia

de fungos.

20


Introdução

Figura 3: Resolução taxonômica de algumas técnicas empregadas na taxonomia e sistemática de

fungos. As barras horizontais em azul indicam o poder discriminatório de cada técnica

entre os táxons (linhas verticais) (Adaptado de Bruns et al., 1991 e Vandamme et al.,

1996).

21


Introdução

1.5 Esporotricose: uma micose reemergente

De uma perspectiva antropocêntrica, as doenças infecciosas podem ser

definidas como uma ação biológica que leva ao rompimento de um processo

fisiológico normal de um organismo multicelular na presença de um microrganismo

patogênico no corpo do hospedeiro. As doenças podem diferir quanto a sua

apresentação, porém são sempre precedidas pela infecção e colonização (van

Baarlen et al., 2007).

O desenvolvimento da civilização humana e o comércio global têm levado à

emergência e à circulação mundial de muitas doenças infecciosas (Keim & Wagner,

2009; Del Poeta, 2010). Atualmente, a ocorrência dos fungos termodimórficos que

há algumas décadas estava limitada a zonas temperadas e tropicais tem ampliado o

domínio biogeográfico, e observamos o aumento da frequência dos diagnósticos

destas micoses em países geograficamente distantes das áreas endêmicas. Este

evento é o resultado multifatorial de diversas mudanças biológicas e sociais, como o

avanço da medicina no século XXI e ao aumento das facilidades de rotas e do fluxo

migratório populacional entre áreas endêmicas e não endêmicas de micoses.

Poucos anos após a descrição do primeiro caso de esporotricose em 1898

por Schenck, um amplo espectro de doenças típicas foi apontado (Rippon, 1982). A

esporotricose é a micose subcutânea mais frequente em áreas urbanas, afetando

ambos os sexos, sem diferenças relacionadas à raça ou idade (Mendoza et al.,

2005). Esta doença tem distribuição mundial sendo principalmente encontrada em

regiões temperadas e tropicais (Ghosh et al., 2002) e comumente observada em

países da América Latina (Galhardo et al., 2008). Este patógeno é o único entre os

fungos dimórficos que não provoca tipicamente uma doença sistêmica (Hogan et al.,

1996). Esta micose é uma infecção crônica que algumas vezes assume proporções

epidêmicas (Alexopoulos & Mims, 1979).

22


Introdução

A micose provocada por S. schenckii é também conhecida como doença de

Schenck ou doença de jardineiros de rosas (Devi et al., 2006). A esporotricose é

descrita como uma micose de risco ocupacional (Lima & Pereira Jr., 1981) para

floricultores (Avenel-Audran, 2009), pescadores (Haddad Jr. et al., 2002)

empacotadores, veterinários, cientistas (Thompson & Kaplan, 1977; Cooper et al.,

1992; Landell et al., 2010) entre outros profissionais que venham a ter contato com

musgos do gênero Sphagnum (Gastineau et al., 1941; González Benavides, 1952),

palha (González Benavides, 1952), objetos de madeira (Balabanoff et al., 1968)

espinhos (Del Piero, 2003) e solo, além de ser descrita como uma micose de risco

para pessoas que viajam à países tropicais (Zeegelaar & Faber, 2008). A maioria

das infecções ocorre devido a algum acidente cutâneo traumático no qual

propágulos de S. schenckii são introduzidos no tecido. A transmissão zoonótica

também é possível e diversos animais podem estar envolvidos (Del Piero, 2003).

Em algumas partes do Brasil estima-se que a esporotricose seja responsável

por 0,5% de todas as dermatoses (Sampaio et al., 1954). Esta doença é

especialmente comum no México (Lavalle, 1968) sendo considerada na cidade de

Guadalajara, a micose não cutânea mais prevalente.

A esporotricose humana pode ocorrer como diferentes formas clínicas,

dependendo da interação de dois fatores principais, como a integridade do sistema

imune do hospedeiro e as características biológicas do fungo. Devido às variadas

manifestações da doença em relação à topologia orgânica, a quantidade de lesões e

a severidade das mesmas, existem diversas classificações disponíveis na literatura.

Atualmente, a classificação mais adotada é baseada na revisão publicada por

Lopes-Bezerra et al. (2006) - Tabela 4.

23


Introdução

Tabela 4: Manifestações clínicas da esporotricose no hospedeiro humano (Lopes-

Bezerra et al., 2006).

1. Cutânea

Linfocutânea

Fixa

Disseminada ou múltipla

2. Mucosa

Ocular

Nasal

Outras

3. Extracutânea

Pulmonar

Osteoarticular

Meningite

Generalizada

4. Residual (Sequela)

5. Formas especiais

Regressão espontânea

Hipersensibilidade (eritema nodoso, eritema multiforme)

1.5.1 Esporotricose cutânea fixa

A esporotricose fixa é caracterizada pela presença de lesão única,

localizada, a qual pode aparecer na face, pescoço, tronco ou braços como uma

ferida ulcerativa, verrucosa ou papular (Gonzalez Ochoa, 1955) (Figura 3). De

acordo com Kwon-Chung (1975) esta forma clínica pode ocorrer como uma

reinfecção em pessoas que foram previamente sensibilizadas com o fungo, e o

agente etiológico é muitas vezes incapaz de crescer a temperaturas superiores a 35

°C. A esporotricose fixa pode ser um desafio para o diagnóstico clínico, mimetizando

uma série de outras doenças dermatológicas (Roldán-Marín et al., 2009).

24


Introdução

1.5.2 Esporotricose linfocutânea

Após a implantação traumática do patógeno na derme e dependendo de

fatores como o tamanho do inóculo e a imunidade do hospedeiro, o período de

incubação é altamente variável, com uma média de aproximadamente 3 semanas

(Gumaa, 1989). A lesão inicial pode ter o aspecto de uma úlcera ou de um pequeno

nódulo subcutâneo, a pele varia de uma coloração enegrecida a avermelhada e,

posteriormente, adquire coloração negra (Gumaa, 1989) (Figura 3). As lesões

linfocutâneas são características da esporotricose (Pappas, 2003). Juntamente com

a forma cutânea fixa da doença constitui mais de 95% das ocorrências de

esporotricose (Campbell & Zaitz, 2004). Casos não tratados de esporotricose

linfocutânea podem tornar-se crônicos, mas algumas vezes a cura pode ocorrer

espontaneamente (Gumaa, 1989).

1.5.3 Esporotricose disseminada

A esporotricose pode acometer virtualmente qualquer órgão, manifestando-

se como uma doença disseminada (Pappas, 2003). A disseminação hematogênica

não é muito comum, mas algumas vezes pode ocorrer especialmente em pacientes

imunocomprometidos (Gumaa, 1989) ou com doenças associadas (Campbell &

Zaitz, 2004). Idade avançada, alcoolismo, diabetes, Cushing, corticoterapia

prolongada, AIDS, nefropatias entre outras são condições predisponentes ao

aparecimento desta forma clínica (Campbell & Zaitz, 2004). A esporotricose

disseminada é caracterizada por lesões múltiplas que inicialmente aparecem como

nódulos subcutâneos e então podem evoluir para pápulas, pústulas, úlceras ou

lesões úlcero-gomosas (Gumaa, 1989) (Figura 4).

25


Introdução

Figura 4: Manifestações clínicas da esporotricose. Esporotricose linfocutânea (L); Esporotricose

cutânea fixa (F); Esporotricose disseminada (D). Adaptado de: Mycology Online - The

University of Adelaide (www.mycology.adelaide.edu.au/); Montes et al. 2009

(www.dermato-santacasa.com.br); Carvalho et al. (2002).

26


Introdução

1.6 Diagnóstico da esporotricose: da sorologia à detecção molecular

S. schenckii não é facilmente detectado por observação direta de espécimes

patológicos (Travassos & Lloyd, 1980), embora o diagnóstico laboratorial apóie-se

principalmente no estudo micológico das lesões (Esteves et al., 1990).

Nos exames histopatológicos podem ser observadas reações teciduais

granulomatosas mistas constituídas por células epitelióides, células gigantes,

linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e presença de microabscessos e granulomas. O

S. schenckii encontra-se sob a forma de corpúsculos redondos, ovais ou em

navetas, com 4 a 6 µm, e mais raramente na forma de “corpúsculos asteróides” que,

por sua vez, são estruturas fúngicas revestidas por imunoglobulinas (fenômeno de

Splendore-Hoeppli) (Sidrim & Moreira, 1999).

Diversos métodos sorológicos podem ser empregados como auxílio ao

diagnóstico da esporotricose, como por exemplo, a prova de aglutinação de Widal &

Abrami, reação de fixação do complemento, aglutinação em partículas de látex,

imunodifusão em gel, imunoeletroforese, ELISA e imunofluorescência (Nishikawa,

1975; Ripon, 1982; Sidrim & Moreira, 1999).

A esporotriquina é o antígeno para aplicação intradérmica, preparado com

filtrados de cultura da fase miceliana ou leveduriforme do S. schenckii (Campbell &

Zaits, 2004). A prova intradérmica com esporotriquina, quando positiva, constitui um

elemento adicional (Pappas, 2003), porém esta não pode fundamentar o diagnóstico

da micose (Esteves et al., 1990), uma vez que em áreas endêmicas um número

considerável de pessoas são reativas à esporotriquina sem apresentarem sinais

clínicos da doença (Pereira et al., 1962a,b; 1964; da Silva et al., 1963; Wernsdörfer

et al., 1963), devido provavelmente ao contato prévio do paciente com o patógeno

sem que se desenvolva a esporotricose.

27


Introdução

A fração peptídeo-ramnomanana (CWPR) de S. schenckii tem sido utilizada

em testes intradérmicos (Lloyd & Bitton, 1971; Radentz & Elewski, 1992; Lima &

Lopes-Bezerra, 1997). Penha e Lopes-Bezerra (2000) aplicaram o teste de ELISA,

utilizando como antígeno o CWPR da parede celular do fungo. Os autores

observaram que a molécula fracionada (SsCBF – Sporothrix schenckii Con A Binding

Fraction), purificada por cromatografia de afinidade ligada a Con A, era altamente

específica para o diagnóstico da doença pelo teste de ELISA. O teste de ELISA,

utilizando exoantígeno bruto da fase micelial tem sido proposto por Almeida-Paes et

al. (2007).

A detecção molecular do patógeno é muito mais prática e rápida do que a

utilização de testes morfológicos, fisiológicos, bioquímicos ou sorológicos. Diversos

genes têm sido utilizados para a detecção molecular de S. schenckii. Kano et al.

(2001; 2003) desenharam as sequências de oligonucleotídeos iniciadoras

denominadas de S2 (5’-TGGGCGTCTACCAAGAGGGTATTGC-3’) e R2 (5’-

GCACATGGGCTCAAGATCAAAGGCC-3’) específicas para a o gene da quitina

sintase 1 de S. schenckii com o objetivo de realizar a detecção molecular do fungo

em biopsia de pacientes. Como resultado, a sensibilidade do teste de PCR foi

equivalente a detecção de até 10 pg de DNA genômico de S. schenckii.

Hu et al. (2003) empregaram a técnica de Nested-PCR utilizando como alvo

iniciadores específicos para a sequência do gene rRNA 18S, viabilizando a detecção

de DNA genômico de S. schenckii em amostras clínicas de pacientes. Este teste

permitiu o rápido diagnóstico de esporotricose assim como forneceu subsídios para

facilitar o diagnóstico de pacientes que tiveram o teste histoquímico ou a cultura

negativa do patógeno.

Kanbe et al. (2005), utilizaram as sequências de oligonucleotídeos

iniciadoras denominadas SSHF31 (5’-GCAGCCCACGTCCAACAAGACT-3’),

SSLF64 (5’-CATTAGATATTATCGGGGCCCAAGT-3’) e SSHR97 (5’-

28


Introdução

GTCAGAGGTCTTATTGGACGTGA-3’) alvos para o gene da topoisomerase II. O

conjunto SSHF31/SSHR97 foi específico para S. schenckii, enquanto que o conjunto

SSLF64/SSHR97 foi específico para S. schenckii var. luriei. Os conjuntos de primers

utilizados por Kanbe et al. (2005) foram úteis para a rápida identificação de S.

schenckii em laboratório e distinção de espécies relacionadas.

1.7 Epidemiologia da esporotricose: uma micose de espectro mundial

Diversos fatores influenciam a epidemiologia das micoses, dentre eles: (i)

fatores biológicos como a virulência do fungo e a resistência do hospedeiro; (ii)

fatores ecológicos como a temperatura, a umidade relativa atmosférica, a radiação

ultravioleta, características geológicas, o bioma, a inter-relação com outros seres

vivos e (iii) fatores sócio-econômicos como o meio social, condições sanitárias, o

vestuário, a profissão, hábitos profiláticos, as migrações populacionais entre outros.

A incidência da esporotricose varia amplamente de país para país baseada

na observação de dados e relatos de casos (Pappas, 2003). A epidemia de

esporotricose que ocorreu nas minas de ouro do Transvaal, onde surgiram 2.825

casos de doença no homem, entre 1941 e 1944, contribuiu decisivamente para o

esclarecimento da ecologia do fungo. Foi possível isolar o fungo de vigas de

eucalipto das minas, do pavimento e mesmo dos pés dos trabalhadores sem

doença. Verificou-se que nas galerias a umidade atmosférica atingia valores de

100% ou muito próximos, que oferecia condições ótimas para o desenvolvimento do

fungo (Findlay, 1970). A fonte do surto foi atribuída à contaminação da mina por

madeiras que faziam o suporte das galerias subterrâneas (Gastineau et al., 1941).

Itoh et al. (1986) e Eisfelder et al. (1993) descreveram centenas de casos de

esporotricose humana diagnosticados no Departamento de Dermatologia do Hospital

da Universidade de Chiba no Japão durante os períodos de 1965 a 1983 e 1965 a

29


Introdução

1991, respectivamente. No estudo realizado até o ano de 1983 por Itoh et al. (1986)

haviam sido descritos aproximadamente 200 casos da doença, sendo que

aproximadamente metade dos indivíduos diagnosticados eram agricultores,

enquanto que no estudo realizado por Eisfelder et al. (1993) haviam 241 casos. A

diminuição do número de pacientes observados desde 1983 foi atribuída, segundo

Eisfelder et al. (1993), principalmente à queda no percentual da população local

envolvida na agricultura.

Kusuhara et al. (1988) relataram 150 casos de esporotricose atendidos no

Ambulatório de Dermatologia do Hospital Universitário de Kurume no Japão, durante

os anos de 1962 a 1986. A distribuição geográfica dos casos foi notável, estando

concentrados especialmente em torno dos rios Chikugo e Yabe, regiões de alta

umidade. A forma cutânea fixa da doença foi predominante, acometendo 85

pacientes, seguido da forma linfocutânea desenvolvida por 64 pacientes. Apenas um

paciente apresentou um caso atípico de esporotricose. As extremidades dos

membros superiores e a face foram as regiões mais afetadas pelas lesões.

Takenaka et al. (2009) relataram 155 casos de esporotricose, no período de

1951 a 2007 na província de Nagasaki, no Japão. As lesões foram frequentemente

observadas na face e membros superiores dos pacientes, sendo o tipo fixo da

doença a forma mais frequente, seguida da forma linfocutânea. Takenaka et al.

(2009) observaram ainda um aumento do número de pacientes de faixa etária

superior aos 50 anos com a doença.

Fukushiro (1984) resume os aspectos epidemiológicos e ecológicos da

esporotricose no Japão, atribuindo a algumas regiões do país as seguintes

características: i) incidência relativamente elevada; ii) aparecimento frequente de

infecções em estações frias; iii) predomínio da infecção no sexo feminino; iv)

predomínio da infecção em crianças e idosos; v) predileção de lesões no rosto das

crianças, assim como sobre a extremidade superior, no caso de pacientes

30


Introdução

adolescentes e adultos; vi) ocorrência familiar e vii) alta frequência na demonstração

do parasita no tecido.

A incidência de micoses animais, especialmente a esporotricose, tem

aumentado recentemente no Japão e segundo Nakamura (2003) isto estaria

relacionado, em parte, a mudanças nos ambientes de vida humana e animal, para

uma relação mais próxima entre ambos. O número de micoses profundas tem

aumentado entre os animais velhos com o progresso da quimioterapia, imunoterapia

e prevenção na medicina veterinária (Nakamura, 2003).

Dixon et al. (1991) relatam uma grande epidemia de esporotricose em 1988

na América do Norte, envolvendo 84 casos em 15 estados, e atribui as condições

precárias de armazenamento do musgo do gênero Sphagnum como possível fonte

para dispersão do microrganismo. Cooper et al. (1992) demonstraram por meio de

técnicas de biologia molecular que existiam ao menos seis padrões distintos dentre

os isolados recuperados do evento epidemiológico descrito por Dixon et al. (1991).

Segundo Cooper et al. (1992) um padrão de DNA típico foi comum aos isolados

clínicos embora tenha sido diferente dos padrões exibidos pelos grupos II a VI. Os

últimos grupos (II a VI) descritos por Cooper et al. (1992) parecem formar um

conjunto heterogêneo, com alguns membros do mesmo grupo apresentando

diferentes padrões de DNA. Assim, os estudos de tipagem de DNA confirmaram que

o grupo I formado por isolados ambientais são indistinguíveis de isolados clínicos e

que os isolados pertencentes aos grupos II a VI representam um complexo de

fungos relacionados com anamorfo semelhantes à Sporothrix.

De acordo com Summerbell (2002), na América Central e do Sul, uma forma

não progressiva da doença, a esporotricose cutânea fixa, é especialmente vista em

pessoas que são repetidamente expostas ao patógeno, e que desta maneira

manifestam uma resposta imune que tende a prevenir a propagação linfocutânea.

31


Introdução

Devi et al. (2006) realizaram análise retrospectiva de casos de esporotricose

ocorridos no período de 1999 a 2005, em Manipur na Índia. No período de 6 anos

foram detectados 73 casos de esporotricose humana, dentre os quais 30 foram

confirmados por análise da cultura e 43 casos foram diagnosticados pela análise do

aspirado de lesão. A maioria dos pacientes pertencia à faixa etária de 21 a 40 anos,

com infecções acometendo predominantemente os membros superiores dos

indivíduos seguidos dos membros inferiores, sendo a esporotricose linfocutânea a

forma mais comum da doença seguida pela forma cutânea fixa. Este estudo revelou

o estado de Manipur como uma nova área endêmica para a esporotricose.

A esporotricose foi primeiramente relatada no Brasil em 1907 por Lutz &

Splendore. Desde então, outros casos têm sido descritos em diversos estados

brasileiros, como Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo (Freitas et al.,

1965; Lopes et al., 1999, Fleury et al., 2001; Xavier et al., 2004; Lopes-Bezerra et al.,

2006; Madrid, 2007).

No Brasil, uma importante epidemia de esporotricose tem sido descrita na

região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro a partir de 1998, afetando seres

humanos, gatos e cães (em menor proporção) (Barros et al., 2001, 2004; Schubach

et al., 2004, 2006). A micose tem acometido principalmente indivíduos que habitam

áreas com condições sócio-econômicas desprivilegiadas e serviços de saúde

precários. No período de 1998 a 2004, um total de 759 pessoas, 1.503 gatos e 64

cães foram diagnosticados com esporotricose através do isolamento de S. schenckii

em diferentes tipos de amostras no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

(IPEC), Fiocruz-RJ (Lopes-Bezerra et al., 2006). Um levantamento recente

demonstra que o número de ocorrências duplicou na região (Barros et al., 2010).

Singer & Muncie (1952) relataram o primeiro caso de esporotricose felina

naturalmente adquirida em 1952. A primeira epidemia de esporotricose em

humanos, como resultado de transmissão zoonótica, foi identificada na cidade do

32


Introdução

Rio de Janeiro, em 1998 (Barros et al., 2008b). O período mais longo de

esporotricose infantil com transmissão zoonótica foi relatado por Barros et al.

(2008a) na cidade do Rio de Janeiro, entre 1998 e 2004, com o diagnóstico total de

81 casos de jovens com idade inferior a 15 anos.

Mais recentemente foi descrito na Austrália o aumento no número de casos

de esporotricose, que por métodos moleculares ficou demonstrado ser relacionado à

exposição ao fungo presente no feno (O’Reilly & Altman, 2006; Feeney et al., 2007).

S. schenckii é talvez, o agente de micoses humanas que se isola mais

frequentemente de plantas, detritos vegetais (Mackinnon et al., 1969) e solo (Criseo

& Romeo, 2010). As poeiras, o ar e a água são considerados meios de

disseminação (Esteves et al., 1990). São numerosas as observações que levam à

conclusão de que S. schenckii se associa no meio ambiente às plantas. Os dados

epidemiológicos e os estudos de distribuição na natureza são concordantes (Esteves

et al., 1990).

1.8 Análise proteômica

O transcriptoma, a proteômica, a metabolômica e seus aspectos

correlacionados formam uma fonte de dados integrados para o entendimento dos

sistemas biológicos (Panchaud et al., 2008). Análises proteômicas, podem ser

definidas como o estudo metódico das proteínas expressas por um genoma, célula,

tecido ou organismo (Bhadauria et al., 2007) em um estado biológico particular,

sendo uma poderosa ferramenta que pode proporcionar o entendimento sistemático

destes eventos molecularmente (Kim et al., 2007). A análise proteômica é

considerada segundo Cantú (2007) como uma área interdisciplinar da ciência, a qual

agrega principalmente química, biologia e informática.

Um fenótipo protéico é uma característica, segundo Thomas & VanBogelen

(2000) que pode ser observada através de métodos baseados na tecnologia

33


Introdução

proteômica, tais como a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida e a

espectrometria de massa (MS). O fenótipo proteômico é determinado pelo estado do

sistema biológico em análise, sendo que o genótipo e o ambiente podem modificar

os fenótipos proteômicos. Utilizando metodologia proteômica, vários componentes

de fenótipos protéicos podem ser facilmente mensurados (Thomas & VanBogelen,

2000).

A análise detalhada do proteoma pode então levar à identificação de alvos

da doença, tratamento, ou desenvolvimento de vacinas (Rohrbough et al., 2007). A

análise proteômica provou ser extremamente importante para a micologia médica

(Murphy, 2007) fornecendo a rápida caracterização de proteínas envolvidas em

diversos processos biológicos como a interação parasita-hospedeiro, a resistência a

antifúngicos e no estudo da morfogênese de muitos fungos (Fernández-Arenas et

al., 2004; Asif et al., 2006; Ebanks et al., 2006; Thomas et al., 2006; Schmidt et al.,

2008; Martínez-Gomariz et al., 2009).

1.8.1 Eletroforese bidimensional de proteínas

A resolução de complexas amostras protéicas consiste basicamente na

eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (two-dimensional gel

electrophoresis, 2D-GE). Tradicionalmente, géis bidimensionais tem sido uma

ferramenta primária para a obtenção de um perfil de nível de expressão de um

proteoma sob várias condições (Zhu et al., 2003). Esta técnica foi desenvolvida

independentemente em 1975 por O’Farrell, a qual combina duas etapas de

fracionamento baseadas em um gel de poliacrilamida, composta por uma separação

inicial (primeira dimensão) com base em um gradiente de pH, onde as proteínas que

compõem a amostra migram horizontalmente até alcançarem o ponto isoelétrico (pI)

por meio de uma focalização isoelétrica (IEF). Uma segunda etapa de separação

(segunda dimensão) ocorre em função do estabelecimento de uma corrente elétrica

34


Introdução

constante em um gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato sódio (SDS-PAGE),

onde as proteínas migram verticalmente em função de suas massas moleculares

(MM).

Muitas proteínas são modificadas pós-tranducionalmente e existem como

isoformas. Isso ocorre porque as proteínas podem existir em estados modificados e

não modificados, podendo conter diferentes números de um ou mais tipos de

modificações, e algumas modificações, como os carboidratos N e O-ligados, são

heterogêneos por natureza. Esta diferença no tipo e estequiometria das

modificações pode levar à presença de um grande número de produtos de proteína

para qualquer gene. Isto representa um enorme desafio para os pesquisadores que

desejem separar e visualizar isoformas distintas. A técnica que é mais útil para a

separação de isoformas de proteínas é o 2DE em gel de poliacrilamida (PAGE), que

separa as proteínas de acordo com a sua carga elétrica e massa molecular (Packer

et al., 2007).

1.8.2 Primeira Dimensão: Focalização Isoelétrica (IEF)

As proteínas são moléculas anfotéricas contendo grupos ácidos e básicos.

Estes se tornam protonados ou desprotonado dependendo do pH ambiente. No

ambiente básico, os grupos ácidos tornam-se negativamente carregados, em

ambiente ácido os grupos básicos tornam-se positivamente carregados. A carga

líquida de uma proteína é a soma de todas as cargas negativas ou positivas das

cadeias laterais dos aminoácidos. Quando um campo elétrico é aplicado, as

proteínas começarão a migrar para o eletrodo de sinal oposto da sua carga líquida.

No ponto isoelétrico (pI), a proteína tem carga líquida zero e deste modo encerra a

sua migração (López, 2007). A presença de ácidos nucléicos, particularmente DNA,

pode interferir com a focalização isoelétrica (IEF) na região ácida das tiras de IEF

(Berkelman, 2008).

35


Introdução

1.8.3 Segunda Dimensão: SDS-PAGE

A segunda dimensão da 2DE separa as proteínas com base em sua massa

molecular aparente em um gel de poliacrilamida na presença de SDS. O

procedimento para a segunda dimensão não sofreu grandes alterações quanto à

metodologia para a IEF. Entretanto, para o SDS-PAGE alguns desenvolvimentos na

química e instrumentação tem contribuído para um melhor manuseio e

reprodutibilidade na posição dos spots (López, 2007).

Nesta etapa, grandes quantidades de SDS são incorporadas em um

complexo SDS-proteína na taxa de aproximadamente 1,4g de SDS/g de proteína.

Desta maneira, o SDS oculta a carga das proteínas e os complexos aniônicos

formados possuem carga elétrica líquida negativa por unidade de massa. Assim, a

mobilidade eletroforética das proteínas tratadas com SDS depende apenas do peso

molecular da proteína (López, 2007).

1.8.4 Detecção de proteínas

A detecção de proteínas em um gel de SDS-PAGE é um passo importante

para análise das proteínas (Kang et al., 2002). A visualização das proteínas ocorre

diretamente no gel após a coloração com corantes específicos como Coomassie

coloidal ou a prata. Cada ponto observado no gel (spot) corresponde a milhares de

cópias de uma proteína, as quais podem ser quantificadas de acordo com a

intensidade e área do respectivo spot. Existem diversos métodos para visualização

de spots de proteínas in gel. Protocolos utilizando Coomassie Brilliant Blue são

altamente compatíveis com a espectrometria de massas, porém são pouco sensíveis

quanto à detecção de proteínas. Existem diversas alternativas para aumentar a

sensibilidade de detecção empregando diferentes técnicas e diversos reagentes. As

36


Introdução

colorações baseadas em nitrato de prata e Coomassie coloidal são as técnicas mais

utilizadas. O maior obstáculo encontrado para a utilização da técnica de detecção

pela prata é a incompatibilidade com os passos subsequentes de extração das

proteínas in gel para a espectrometria de massas. Como alternativa, destaca-se a

utilização do Coomassie coloidal, que embora seja menos sensível que a coloração

pela prata é mais sensível que o Coomassie Brilliant Blue e é compatível com os

passos subsequentes da espectrometria de massas.

1.8.5 Aquisição de imagens

O processo de fotodocumentação ocorre com a digitalização do gel em

scanner densitométrico e posterior análise por software específico como o Image

MasterTM 2D Platinum®. A comparação de diversos géis de diferentes proteomas

pode ser aplicada como uma importante ferramenta para detectar proteínas que são

expressas diferencialmente em função das distintas condições e estímulos testados.

1.8.6 Espectrometria de massas

A identificação de proteínas separadas em gel de poliacrilamida apresenta

inúmeras vantagens quando comparado às técnicas gel-free (Shevchenko et al.,

2006). Dentre as principais vantagens observadas pode ser citada a possibilidade de

observação de alterações quantitativas e qualitativas na expressão de proteínas,

assim como a observação de modificações pós-traducionais e a comparação de

inúmeras situações testes.

Nos últimos 20 anos ocorreram avanços extraordinários na tecnologia de

espectrometria de massas. Tais avanços fizeram com que a análise do proteoma de

uma amostra biológica qualquer transpusesse o efeito contemplativo criado até

37


Introdução

então e as alterações observadas no proteoma pudessem ser analisadas. Isto tem

influenciado no estabelecimento da ciência proteômica.

Duas formas de ionização de proteínas e peptídeos são amplamente

utilizadas, o Electrospray Ionization (ESI) e a Ionização dessorção assistida por

matriz (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – MALDI), e estes estão

acoplados com uma variedade de detectores e analisadores de massas (Wilkins &

Appel, 2007).

1.9 Importância da proteômica no estudo de patógenos humanos

Os estudos de proteômica têm produzido detalhadas listas de proteínas

presentes nas células (Robinson et al., 2007) e na última década, tem sido notável

os avanços na tecnologia de proteômica (Cravatt et al., 2007). Segundo Oberg et al.

(2008), proteínas que possuem a expressão aumentada/diminuída entre dois ou

mais grupos de interesse são consideradas candidatas a biomarcadores.

Biomarcadores podem ser definidos como uma característica que é objetivamente

medida e avaliada como indicador de um processo biológico normal, um processo

patogênico ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica (Atkinson et

al., 2001).

Trichophyton rubrum é o dermatófito mais comum entre os agentes de

micose de pele humana. A esporulação assexual é um eficiente meio de propagação

do patógeno. Leng et al. (2008) em estudo do proteoma do conídio deste patógeno,

identificaram 1.026 proteínas, sugerindo que o proteoma do conídio de T. rubrum é

consideravelmente complexo. Algumas das proteínas identificadas estão

relacionadas à sobrevivência e dispersão enquanto outras estão relacionadas com a

germinação conidial e resposta a condições ambientais, sendo importantes para o

monitoramento e germinação do conídio em condições favoráveis.

38


Introdução

Xi et al. (2007) estudaram a expressão diferencial de proteínas durante as

fases de micélio e levedura no fungo termodimórfico Penicillium marneffei e

relataram mais de 500 proteínas que demonstraram perfis de expressão diferencial

entre as duas fases. Chandler et al. (2008) demonstraram que durante a fase

parasítica de P. marneffei ocorre aumento na expressão de proteínas relacionadas

ao choque térmico (heat shock protein), ao metabolismo geral e à biossíntese da

parede celular ao estudarem o dimorfismo neste fungo.

Diversos estudos de proteômica têm sido realizados com fungos do gênero

Aspergillus e nos últimos anos foram publicados 10 trabalhos, os quais, de acordo

com Kim et al. (2008) realizaram a identificação de 28 proteínas de superfície, 102

proteínas secretadas e 139 proteínas intracelulares.

Com o objetivo de entender a patogênese fúngica em pacientes com

inflamação da córnea, “ceratites” e refinar o tratamento existente, Ananthi et al.

(2008) analisaram o perfil protéico da lágrima de pacientes infectados com fungos,

utilizando géis bidimensionais para separação e fracionamento de proteínas. Ao

comparar o perfil de pacientes infectados com controles não infectados foi possível

evidenciar 63 spots nos dois géis. A proteína Glutaredoxina, cuja expressão é

relacionada ao estresses oxidativo em Aspergillus, estava expressa apenas em

amostras de lágrimas de pacientes infectados, permanecendo ausente em amostras

controle. De modo interessante detectou-se níveis mais elevados da expressão da

Glutaredoxina em amostras de pacientes com ceratites provocada por Aspergillus do

que amostras de pacientes com ceratites provocada por Fusarium, podendo de

algum modo esta proteína estar relacionada ao processo patofisiológico de ceratites

micóticas.

Os estudos de proteômica diferencial têm levado de fato à melhor

compreensão da biologia de patógenos importantes como T. rubrum, P. marneffei,

Aspergillus, Fusarium entre outros.

39


Introdução

1.10 Imunoproteômica: importância dos marcadores sorológicos de

doenças

A imunoproteômica pode ser definida como a combinação de qualquer

tecnologia proteômica com a presença de dados imunológicos (Falisse-Poirrier et al.,

2006). A imunoproteômica é uma forma rápida e prática de buscar moléculas

imunogênicas que possam servir como biomarcadores de doença ou fornecer

subsídios para o entendimento da patogênese.

A técnica de Western blot é geralmente empregada na pesquisa clínica

(Hayes et al., 1989). A proteômica combinada com Western blot (imunoproteômica)

e técnicas de espectrometria de massas tem sido reconhecida como uma ferramenta

proveitosa para a identificação de proteínas de interesse no desenvolvimento de

vacinas (Poobalane, 2007), no estudo de proteínas imunogênicas entre outros.

O imunoblot é amplamente utilizado para detectar e comparar os níveis

relativos de uma proteína de interesse particular em uma célula, soro e outros

materiais biológicos (Krajewski et al., 1996). Atualmente na micologia médica

diversos trabalhos têm empregado esta combinação de técnicas para compreender

a resposta imunológica do hospedeiro aos antígenos fúngicos, detectando

principalmente anticorpos circulantes produzidos na resposta imune humoral (da

Fonseca et al., 2001; Tarcha, 2006; Gautam et al., 2007; Jobbins et al., 2010).

1.11 Justificativa

Nas últimas duas décadas tem-se presenciado o retorno das doenças

infecciosas como uma das principais causas de mortes humanas e da diminuição da

qualidade de vida dos pacientes. Dentre os fatores que contribuem para este quadro

destacam-se a presença de organismos mais resistentes à drogas, o surgimento de

40


Introdução

novos patógenos e/ou re-emergentes e o aumento no número de pacientes

imunocomprometidos como aqueles com AIDS, câncer ou ainda aqueles que

sofreram transplante de órgãos. Deste modo, torna-se crucial o entendimento da

biologia dos fungos patogênicos, como a fisiologia e aspectos moleculares assim

como o aprofundamento do conhecimento das interações patógeno-hospedeiro.

Durante muito tempo a esporotricose foi descrita como uma doença de baixa

incidência no Brasil, no entanto, relatos recentes mostram que não só o número de

casos descritos vem aumentando como a incidência de formas clínicas mais graves

ou atípicas da doença vem ocorrendo com maior frequência (Lopes-Bezerra et al.,

2006).

Com o advento e a diminuição dos custos de técnicas moleculares que estão

cada vez mais acessíveis à pesquisa, como a reação da polimerase em cadeia

(PCR) e o sequenciamento de genomas inteiros, um verdadeiro boom de espécies

novas tem sido propostas na literatura. Nesta era molecular, a análise multilocus de

polimorfismo gênico tem sido uma ferramenta importante para propor a divisão de

espécies de fungos. Marimon et al. (2007) propuseram três novas espécies de

interesse clínico na esporotricose. Esta, entre outras publicações recentes,

despertou nosso interesse em estudar a epidemiologia destas espécies no Brasil e

as moléculas imunogênicas destes novos patógenos. Diversas perguntas e

hipóteses foram formadas dentre elas: Qual a importância clínica da diferenciação

das espécies consideradas agentes etiológicos da esporotricose? Quais as

diferenças intra e interespecíficas dos proteomas destes fungos? Essas possíveis

diferenças refletem proteínas imunogênicas distintas? Alguma proteína poderia ser

utilizada como biomarcador da espécie? Os diferentes quadros clínicos

apresentados por pacientes refletem a infecção por diferentes espécies? Sporothrix

schenckii está relacionado com todas as manifestações clínicas da doença ou

estaria relacionado com uma forma em particular e o mesmo raciocínio se

41


Introdução

empregaria as demais espécies do complexo e as diferentes manifestações clínicas

da doença?

Os estudos de caracterização bioquímica das proteínas imunogênicas

expressas por S. schenckii são escassos. Até o momento, a proteína melhor

caracterizada é uma glicoproteína de 70 kDa (gp70) com função de adesina. A

análise proteômica é uma forma global de identificar e caracterizar proteínas

envolvidas em processos biológicos. Informações sobre níveis de expressão,

organização estrutural, localização celular e modificações pós-traducionais

permitirão a ampla caracterização dos alvos funcionais envolvidos nos mecanismos

de colonização e patogenicidade. A utilização desta poderosa ferramenta de análise

diferencial de proteínas foi proposta neste trabalho com o intuito de identificar

proteínas diferencialmente expressas pelas quatro espécies do complexo S.

schenckii que possam servir como marcadores biológicos, sendo importantes para a

utilização em testes clínicos sorológicos de detecção do patógeno no hospedeiro

como Western blot ou ELISA. Aliado a isto, o conhecimento de proteínas

diferencialmente expressas nas formas clínicas da doença poderá levar ao

conhecimento de moléculas importantes como futuros alvos terapêuticos.

42


Objetivos

2. OBJETIVOS

Tendo em vista a importância clínica do S. schenckii como patógeno

humano e animal, a necessidade do desenvolvimento de técnicas mais rápidas de

identificação e de uma maior compreensão dos aspectos de sua biologia,

patogênese, e epidemiologia, o presente trabalho tem como objetivo geral contribuir

para o a compreensão do complexo S. schenckii no Brasil buscando evidências

moleculares de variações intra e interespecíficas através de análise molecular e

proteômica comparativa entre as espécies S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e

S. schenckii. Com esta finalidade foram estabelecidos os seguintes objetivos

específicos:

Reclassificar os 161 isolados, inicialmente depositados em nossa

micoteca como pertencentes à espécie S. schenckii, de acordo com os

padrões morfológicos, fisiológicos e moleculares apresentados pelas

cepas em testes de assimilação de fontes de carbono, crescimento

vegetativo em meio PDA, microcultivo e sequenciamento parcial do gene

da calmodulina;

Descrever a distribuição das novas espécies filogenéticas do complexo S.

schenckii em território brasileiro;

Analisar a influência da temperatura no crescimento in vitro de cepas de

Sporothrix spp., buscando uma correlação entre a origem geográfica, a

forma clínica da doença e a espécie filogenética;

Analisar com auxílio de ferramentas de bioinformática o polimorfismo do

fragmento de 800 pb do gene da calmodulina de cepas de diferentes

origens geográficas;

Padronizar a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) para o extrato

celular total (levedura) e selecionar uma cepa representante de cada

43


Objetivos

espécie do complexo S. schenckii (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis

e S. mexicana) para análise proteômica comparativa, com base no perfil

da doença e da origem geográfica do patógeno;

Buscar proteínas diferencialmente expressas pelas espécies do complexo

S. schenckii (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis e S. mexicana)

através da comparação entre os mapas de proteoma (pH 4-7) das

espécies estudadas;

Comparar o perfil de detecção de anticorpos da esporotricose humana,

utilizando soros de pacientes com a forma cutânea fixa e linfocutânea,

através da técnica de 2D- Western blot e analisar as possíveis diferenças

dos perfis das proteínas imunogênicas evidenciadas entre as diferentes

espécies.

44


Objetivos

2.1 Delineamento experimental

Figura 5: Delineamento experimental. Caracterização proteômica do complexo Sporothrix schenckii:

Análise de proteínas diferencialmente expressas e proteínas imunogênicas de isolados de

S. schenckii, S. brasiliensis, S globosa e S. mexicana

45


Material e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Cepas de Sporothrix spp. utilizadas e condições de cultivo

Cento e sessenta e um (161) isolados de Sporothrix spp. provenientes de

amostras clínicas e ambientais (Figura 6) oriundas de diversas regiões do Brasil e de

outros países foram estudadas (Tabelas 5 e 6). Estes microrganismos encontram-se

depositados na Micoteca do laboratório de Micologia Médica do Prof. Dr. Zoilo Pires

de Camargo, na UNIFESP. As culturas dos isolados são mantidos em tubos de

ensaio inclinados com 10-15 mL de meio SDA (Sabouraud-dextrose-agar) (DIFCO) a

temperatura ambiente. A manutenção dos isolados é realizada trimestralmente

através de repiques para novos tubos.

3.2 Caracterização fenotípica

A taxonomia clássica em micologia médica tem por fundamento a análise de

características morfológicas e fisiológicas para a classificação dos fungos. Diferentes

testes laboratoriais morfológicos, fisiológicos e bioquímicos foram realizados para a

caracterização fenotípica dos 161 isolados de Sporothrix spp. Os resultados obtidos

foram comparados com as características consideradas peculiares de cada nova

espécie do complexo, resumidas na tabela 7 e/ou aplicados nos passos da chave

dicotômica descrita por Marimon et al. (2008).

46


Material e Métodos

Tabela 5: Código dos isolados, forma clínica da doença/ ou substrato ambiental e

origem geográfica das cepas de Sporothrix spp. depositados na micoteca do

Laboratório de Micologia Médica, Disciplina de Biologia Celular.

Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País

Ss 01 Gato Linfocutânea São Paulo SP Brasil

Ss 02 Humano Fixa Porto Alegre RS Brasil



Ss 05 Gato Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil

Ss 06 Humano Fixa Belo Horizonte MG Brasil

Ss 07 Humano Disseminada Belo Horizonte MG Brasil

Ss 08 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil




Ss 12 Humano Fixa Belo Horizonte MG Brasil


Ss 14 Humano Disseminada Belo Horizonte MG Brasil


Ss 16 Humano Linfocutânea Teresina PI Brasil

Ss 17 Humano Fixa Curitiba PR Brasil

Ss 19 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil













Continua...

47


Material e Métodos

Continuação...








Ss 40 Humano Fixa Fortaleza CE Brasil




Ss 44 Humano Linfocutânea Fortaleza CE Brasil

Ss 45 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil






Ss 51 Humano Fixa Belém PA Brasil

Ss 52 Humano Fixa São Paulo SP Brasil

Ss 53 Gato Linfocutânea Rio Grande RS Brasil

Ss 54 Gato Linfocutânea Rio Grande RS Brasil

Ss 55 Humano Linfocutânea Rio Grande RS Brasil



Ss 58 Humano Fixa Botucatu SP Brasil

Ss 59 Humano Linfocutânea Botucatu SP Brasil

Ss 60 Humano Linfocutânea Botucatu SP Brasil

Ss 61 Solo Isolado ambiental Botucatu SP Brasil

Ss 62 Humano Linfocutânea Vila Velha ES Brasil



Ss 65 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil

48


Material e Métodos

Continuação...







Ss 71 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil




























49


Material e Métodos

Continuação...




Ss 101 Humano Linfocutânea Bauru SP Brasil



Ss 104 Humano Linfocutânea Cuiabá MT Brasil

Ss 105 Humano Linfocutânea Uberaba MG Brasil



Ss 109 Humano Fixa Uberaba MG Brasil

Ss 110 Humano Fixa Uberaba MG Brasil

Ss 111 Humano Fixa São Paulo SP Brasil

Ss 112 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil





Ss 117 Humano Fixa Campinas SP Brasil


Ss 119 Humano Extracutânea Campinas SP Brasil










Ss 129 Humano Linfocutânea - SP Brasil

Ss 130 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil



50


Material e Métodos

Conclusão...







Ss 138 Humano Linfocutânea João Pessoa PB Brasil



Ss 141 Humano Linfocutânea Brasília DF Brasil

Ss 143 Humano Linfocutânea Belém PA Brasil

Ss 144 Humano Linfocutânea - RS Brasil

Ss 145 Humano Linfocutânea - RS Brasil

Ss 146 Humano Linfocutânea Manaus AM Brasil

Ss 147 Humano Linfocutânea Manaus AM Brasil

Ss 148 Humano Linfocutânea São Paulo SP Brasil

Ss 149 Humano Linfocutânea Pelotas RS Brasil

Ss 150 Humano Linfocutânea Pelotas RS Brasil

Ss 151 Cão Linfocutânea Pelotas RS Brasil

Ss 152 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil






Ss 158 Humano Fixa Manaus AM Brasil

Ss 159 Humano Linfocutânea - - Japão

Ss 160 Humano Linfocutânea - - México

Ss 161 Humano Linfocutânea - - México

Ss 162 Vegetal Isolado ambiental - - México

Ss 163 Humano Fixa - - Peru


Ss 167 Solo Isolado ambiental - - Peru


51


Material e Métodos

Tabela 6: Isolados de referência do complexo Sporothrix schenckii, descritos em

2007 por Marimon et al., depositados na coleção de culturas de fungos

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, The Netherlands.

Isolados1 Espécie Hospedeiro País

Código FMR Outro Código

FMR 8309 CBS 120339 S. brasiliensis Humano Brasil

FMR 8314 IPEC 16919 S. brasiliensis Humano Brasil

FMR 8600 CBS 120340 S. globosa Humano Espanha

FMR 8595 FMR 8595 S. globosa Humano Espanha

FMR 9108 CBS 120341 S. mexicana Isolado ambiental México

FMR 9107 CBS 120342 S. mexicana Isolado ambiental México

FMR 8939 CBS 302.73 S. albicans Isolado ambiental Reino Unido

FMR 8803 KMU 4217 S. albicans Isolado ambiental China

FMR 6618 CBS 359.36 S. schenckii Humano EUA

FMR 9018 UTHSC 99-173 S. schenckii Humano EUA

FMR 9280 CBS 937.72 S. luriei Humano África

1Todos os isolados tipo descritos para o complexo Sporothrix schenckii foram gentilmente cedidos pelo Dr. Josep Guarro e pela

Dra. Josepa Gené, da Universitat Rovira i Virgili (URV), Facultat de Medicina i Ciències de la Salut de Reus, Unitat de Microbiologia, Reus, Espanha. FMR: Facultat de Medicina de Reus; CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands; IPEC: Instituto de Pesquisa Evandro Chagas, Rio de Janeiro, Brasil; KMU: Kanazawa Medical University, Ishikawa, Japan. UTHSC: Fungus Testing Laboratory, University of Texas Health Science Center.

Tabela 7: Resumo dos aspectos morfofisiológicos chaves para a diferenciação das

espécies do complexo S. schenckii. Adaptado de Marimon et al. (2007).

Espécie

Presença de conídios

pigmentados sésseis

Colônias em PDA a 30 °C excedem 50

mm em 21 dias

Crescimento a 37 °C

Teste de assimilação

Sacarose Rafinose

S. brasiliensis Sim Não Sim – –

S. luriei Não Não Sim – –

S. globosa Sim Não Não + –

S. mexicana Sim Sim Sim + +

S. schenckii Sim Não Sim + +

S. albicans Não Sim Sim + –

52


Material e Métodos

Figura 6: Distribuição dos isolados depositados na coleção de cultura de Sporothrix spp. quanto à

forma clínica da doença provocada em humanos (A) ou a origem ambiental (B) e animal

(C).

53


Material e Métodos

Chave taxonômica para a classificação das espécies do complexo Sporothrix

schenckii. (Adaptado de Marimon et al., 2007; 2008b).

1. Assimilação de sacarose negativa...............................................................2

Assimilação de sacarose positiva.................................................................3

2. Colônias em PDA a 35 °C não excedem 30 mm de diâmetro em 21 dias,

conídios sésseis e pigmentados presentes, conídios simpodiais de 2 a 6

µm de ....................................................................................S. brasiliensis

Colônias em PDA a 35 °C excedem 30 mm de diâmetro em 21 dias;

conídios sésseis pigmentados ausentes, conídios simpodiais de 4 a 10 µm

de longitude.......................................................................................S. luriei

3. Colônias em PDA a 30 °C excedem os 50 mm de diâmetro aos 21

dias...............................................................................................................4

Colônias em PDA a 30 °C não excedem os 50 mm de diâmetro aos 21

dias...............................................................................................................5

4. Assimilação de rafinose positiva; colônias em CMA a 30 °C apresentam

coloração marrom em duas semanas.......................................S. mexicana

Assimilação de rafinose negativa; colônias permanecem incolores em

CMA a 30 °C em duas semanas.................................................S. albicans

5. Assimilação de rafinose negativa; temperatura máxima para o crescimento

vegetativo é 35 °C; conídios sésseis pigmentados, globosos ou

subglobosos.................................................................................S. globosa

Assimilação de rafinose positiva; temperatura máxima para o crescimento

vegetativo é 37 °C; conídios sésseis pigmentados predominantemente de

outra forma................................................................................S. schenckii

54


Material e Métodos

3.2.1 Ensaios morfológicos

Diversos aspectos fenotípicos são utilizados em micologia como

características auxiliares para a caracterização macro e microscópica de fungos de

importância médica. Dentre estes, os mais importantes são: o formato, a coloração,

a ornamentação, a disposição e o arranjo dos conídios; a coloração, a textura e o

diâmetro da colônia; a coloração, o diâmetro e os septos apresentados pelas hifas,

etc. Deste modo, realizamos a caracterização morfológica de 161 cepas de

Sporothrix schenckii de origem humana, animal e ambiental, levando em

consideração os caracteres descritos na Tabela 7.

3.2.1.1 Microcultivo

A análise morfológica através da visualização das estruturas vegetativas do

fungo como hifas, conidióforos e conídios foi realizada através do microcultivo dos

isolados em lâmina pela técnica de Riddell (1950). A técnica consiste em semear

amostras do fungo em delgadas camadas de meio de cultura sobre lâminas estéreis,

posterior posicionamento de uma lamínula sobre o meio e o armazenamento em

câmara úmida. Após 10 dias de incubação a 30°C em meio de Agar batata (PDA,

DIFCO), as lamínulas foram removidas suavemente, a fim de não danificar as

estruturas vegetativas assim como a disposição das mesmas. O fungo aderido à

lamínula foi corado com lactofenol para facilitar a visualização das estruturas

fúngicas. As lâminas foram observadas em microscópio óptico (OLYMPUS BX50,

Japan) acoplado a uma câmera fotográfica digital (Sony DXC-107A, CCD-Iris Color

Video Camera, Japan). As principais características morfológicas como a presença

ou ausência de conídios sésseis, a pigmentação, a disposição, a forma e o tamanho

longitudinal dos conídios foram registradas. Para a estimativa do tamanho dos

55


Material e Métodos

conídios a partir das imagens capturadas foi utilizado o software Image-Pro® Express

versão 5.1 para Windows (Media Cybernetics, Inc., USA) mensurando-se

longitudinalmente ao menos 20 conídios em 5 campos distintos, perfazendo um total

de 100 amostras por isolado. Após mensurar os conídios, calculou-se o valor médio

do diâmetro. Algumas cepas mais representativas foram escolhidas para a

fotodocumentação em microscópio óptico.

3.2.1.2 Crescimento vegetativo em meio CMA (Corn Meal

Agar)

O crescimento em meio CMA é importante, de acordo com Marimon et al.

(2007; 2008) para a distinção entre as espécies S. mexicana e S. albicans. A

obtenção de culturas marrons ou incolores após a incubação do fungo a 30 °C

durante 14 dias pode ser utilizada como característica taxonômica.

Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados previamente em meio PDA,

a temperatura ambiente, durante 10 dias antes de serem realizados os ensaios de

crescimento vegetativo em meio CMA. Fragmentos de micélio de aproximadamente

1 mm de diâmetro foram inoculados assepticamente no centro de placas de Petri (5

cm de diâmetro) vertidas com o meio CMA. As placas foram identificadas e

incubadas em triplicata a 30 °C durante 14 dias. Após este período, a coloração

apresentada por cada isolado foi avaliada por dois examinadores, com a intenção de

evitar uma classificação individual.

56


Material e Métodos

3.2.2 Ensaios fisiológicos

3.2.2.1 Crescimento vegetativo em função das

temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C

De acordo com Marimon et al. (2007) as temperaturas de incubação

discriminatórias para a comparação durante o crescimento vegetativo destes

patógenos correspondem as faixas de 30, 35 e 37 °C.

Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados em meio PDA, a

temperatura ambiente, durante 10 dias, antes de serem realizados os ensaios de

crescimento em função da temperatura. Fragmentos de micélio aproximadamente 1

mm de diâmetro foram inoculados assepticamente no centro de placas de Petri de 9

cm de diâmetro vertidas com 20 mL de meio PDA. As placas foram identificadas,

vedadas com filme plástico pvc e incubadas em triplicata nas temperaturas de 30,

35, 37 e 40 °C. Após 21 dias de incubação foram escolhidas duas colônias mais

uniformes e o crescimento vegetativo foi avaliado mensurando-se o diâmetro da

colônia (mm) em dois sentidos ortogonais, com o auxílio de um paquímetro digital

(150 x 0.01mm, King Tools, Ltda), e calculando-se a média das duas medidas. Os

dados obtidos foram comparados com os dados da Tabela 7 e/ou aplicados nos

passos da chave dicotômica.

3.2.2.2 Influência da temperatura na inibição do

crescimento

Os dados obtidos para o diâmetro das colônias de Sporothrix spp, descritos

no item anterior (3.2.2.1) foram comparados entre as diferentes temperaturas de

incubação a fim de se verificar a influência da temperatura na inibição do

57


Material e Métodos

crescimento fúngico. A taxa de inibição foi calculada para as temperaturas de 35, 37

e 40 °C em relação ao diâmetro obtido para a temperatura de 30 °C utilizando-se a

seguinte equação (1) descrita por Mesa-Arango et al. (2002):

(1)

Em que:

% IC = porcentagem de inibição do crescimento;

DC = diâmetro da colônia em mm.

3.2.2.3 Análise de clusterização e análise estatística

Os valores de diâmetro médio das colônias em milímetros obtidos para os

ensaios de crescimento vegetativo nas temperaturas de 30, 35 e 37 °C foram

analisados conjuntamente através da análise de clusterização hierárquica dos casos

(cepas), utilizando a distância Euclidiana para o cálculo de similaridade entre os

perfis de crescimento vegetativos apresentados pelas cepas e o método de ligação

completo para a formação dos grupos. Este algoritmo permite o agrupamento de

todas as distâncias em pares de objetos em diferentes clusters para decidir quão

distantes eles são.

Os valores obtidos para a inibição do crescimento vegetativo, em

porcentagem, nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, foram utilizados

concomitantemente para a análise de clusterização hierárquica utilizando os

mesmos parâmetros descritos acima. Os cálculos, a construção e a visualização dos

dendogramas foram realizados utilizando-se o software SYSTAT 13, versão

13.00.05 (Chicago, IL, USA).

58


Material e Métodos

Os dados obtidos dos isolados quanto ao crescimento vegetativo e inibição do

crescimento foram submetidos à análise estatística, com o intuito de verificar se

existiam diferenças entre os isolados relacionadas à origem geográfica. O mesmo foi

feito quando os isolados foram agrupados por espécie filogenética, origem clínica

humana ou animal. Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA / teste de

Tukey utilizando o software GraphPad (GraphPad Prism v. 5.00 para Windows, San

Diego California USA, www.graphpad.com), considerando estatisticamente

significante quando p < 0.05.

3.2.2.4 Efeito fungistático e fungicida da temperatura no

crescimento fúngico

Com o objetivo de avaliar se a temperatura atua sobre o crescimento fúngico

como um fator fungistático, capaz apenas de inibir o crescimento fúngico ou como

um fator fungicida capaz de inviabilizar as células fúngicas após a incubação in vitro,

o seguinte experimento foi realizado: as cepas de Sporothrix spp. foram inoculadas

centralmente em placas de Petri de 5 cm de diâmetro e incubadas durante 21 dias a

40 ºC. Decorrido o tempo de incubação avaliou-se o diâmetro médio das colônias

com auxílio de um paquímetro. As mesmas culturas foram então incubadas

novamente, porém à temperatura de 28 ºC, durante 14 dias. Após a incubação, o

diâmetro da colônia foi avaliado com auxílio de um paquímetro digital (150 x

0.01mm, King Tools, Ltda).

59


Material e Métodos

3.2.3 Ensaios bioquímicos

3.2.3.1 Assimilação de fontes de carbono, segundo

protocolo de Marimon et al. (2007)

Para a prova de assimilação de carboidratos foram utilizados conídios de

Sporothrix spp.

3.2.3.1.1 Preparo das microplacas de assimilação

Adicionou-se em tubos Falcon estéreis o meio de cultura Yeast Nitrogen Base

(Difco) e um dos açúcares testes (Glicose, Rafinose, Ribitol, Sacarose) na

concentração final de 2%. Os solutos foram suspensos em água MilliQ®. Como

controle negativo do teste, utilizou-se uma solução contendo apenas o meio Yeast

Nitrogen Base (Difco) sem a adição de qualquer fonte de carbono. Após a

dissolução completa dos solutos, a solução resultante foi esterilizada por filtração

utilizando-se filtros Millipore 0,22 µm de diâmetro. Optou-se por não autoclavar os

meios a fim de evitar a degradação dos açúcares.

Após a esterilização, foram distribuídos em triplicata 150 µL de cada um dos

meios de cultura individualmente em regiões distintas de microplacas de fundo chato

de 96 oríficios (Corning Costar Corporation) (Figura 7a).

3.2.3.1.2 Preparo do inóculo fúngico

Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados previamente à temperatura

ambiente, em tubos inclinados contendo meio PDA durante 10-14 dias. Os conídios

foram coletados adicionando-se à superfície das culturas 2-3 mL de solução salina

60


Material e Métodos

estéril (0,85%). Os tubos foram agitados suavemente a fim de promover a liberação

dos conídios na solução. A suspensão foi recuperada com auxílio de uma pipeta

Pasteur e filtrada em gaze estéril a fim de se obter uma preparação contendo

apenas conídios, removendo resquícios de meio de cultura e fragmentos de hifas.

Procedeu-se a quantificação dos conídios em espectrofotômetro (Tecan

Sunrise, Grödlg, Austria) utilizando-se o software Magellan CE v.1.3.5. Cinquenta

microlitros (50 µL) da suspensão foram adicionados, em duplicata, a uma microplaca

de fundo chato de 96 orifícios (Corning Costar Corporation). A leitura foi realizada

em um comprimento de onda de 520 nm (A520) e a suspensão ajustada para a

absorbância de 0,21 – 0,29 DO (Densidade Ótica) que corresponde a um inóculo

final de 2 x 105 a 2 x 106 UFC/mL (Figura 7b).

A viabilidade dos conídios foi verificada concomitantemente ao experimento,

semeando-se 100 µL da suspensão original dos conídios em placas de Petri (5 cm

de diâmetro) contendo o meio PDA e incubada a temperatura ambiente por 10 dias.

3.2.3.1.3 Inoculação, incubação e leitura dos resultados

Os ensaios de assimilação foram realizados inoculando-se, em triplicata, 50

µL da suspensão de conídios aos 150 µL de meio de cultura de cada tratamento

previamente descrito (Figura 7c). Após inocular os conídios procedeu-se a leitura

das microplacas em espectrofotômetro, no tempo zero, num comprimento de onda

ajustado em 520 nm (A520). As placas foram incubadas em estufa, a 25 °C, durante

10 dias, sendo realizadas leituras durante o quinto e o décimo dia de incubação sob

as mesmas condições de absorbância.

61


Material e Métodos

Figura 7: Esquema do teste de assimilação utilizando microplacas de 96 orifícios. (A) Preparo das

placas contendo 150 µL do meio Yeast Nitrogen Base (Difco) complementado ou não com

os açúcares testes; (B) Preparo do inóculo de conídios em solução salina (0,85%) e

quantificação em espectrofotômetro a 520 nm. A suspensão é ajustada para uma

absorbância de 0,21–0,29 DO, a qual corresponde a um inóculo final de 2x105 a 2x10

6

UFC/mL; (C) Ensaio de assimilação. São aplicados, em triplicata, 50 µL do inóculo da

suspensão original de conídios aos 150 µL do meio “C” complementado ou não com os

diferentes açúcares testes (0,02 g/mL) previamente distribuído. C -, controle negativo; C +,

controle positivo; Raf, rafinose; Rib, ribitol; Sac, sacarose.

3.2.3.1.4 Avaliação dos resultados de assimilação

O valor médio das absorbâncias obtido para as triplicatas dos tratamentos

com glicose (controle positivo) e sem açúcar (controle negativo) foi calculado e

utilizado para a comparação com os demais tratamentos (rafinose, ribitol e

sacarose). Assim, consideramos assimilação positiva para determinado açúcar teste,

o tratamento que apresentasse absorbância média semelhante ao controle positivo

ou superior ao valor obtido para o controle negativo.

Os resultados obtidos no quinto e décimo dia de incubação para as variáveis

testadas foram transformados em dados binários, atribuindo-se o valor “0” para

ausência de crescimento (assimilação negativa) e o valor “1” para presença de

crescimento (assimilação positiva). Estes dados foram utilizados para a construção

de dendogramas distintos. As variáveis testadas foram avaliadas

62


Material e Métodos

concomitantemente, utilizando-se o coeficiente de Jaccard para a análise da

distância métrica entre os perfis de assimilação, e o método de ligação Average para

a formação dos clusters. Este algoritmo permite o agrupamento de todas as

distâncias em pares de objetos em diferentes clusters para decidir quão distantes

eles são. Os mesmos parâmetros foram adotados para avaliar os resultados

referentes a 10 dias de incubação. Os cálculos, a construção e a visualização dos

dendogramas foram realizados utilizando-se o software SYSTAT 13, versão

13.00.05 (Chicago, IL, USA).

3.3 Taxonomia Molecular

As quatro espécies do complexo Sporothrix (S. brasiliensis, S. globosa, S.

mexicana e S. schenckii), recentemente propostas por Marimon et al. (2007), tiveram

como principal base molecular para sua diferenciação o polimorfismo na sequência

de nucleotídeos de um fragmento do gene da calmodulina (CAL). As sequências de

nucleotídeos geradas pelo grupo espanhol no referido trabalho, estão depositadas e

disponíveis para o acesso no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.

html). A partir desta informação, realizamos a taxonomia molecular das cepas de

Sporothrix spp. com base na comparação das sequências obtidas para nossos

isolados com as sequências depositadas no Genbank.

3.3.1 Extração de DNA genômico de leveduras de Sporothrix

spp.

Células leveduriformes dos isolados de Sporothrix spp. foram cultivadas em

meio BHI ágar (DIFCO) com o pH ajustado em 8,0, a 37 °C, durante o período de

10-14 dias. As células foram coletadas com auxílio de uma alça de platina e

transferidas para tubos plásticos Eppendorfs e suspensas em 1.000 µL de água

63


Material e Métodos

MilliQ®. A suspensão foi agitada por 10-20 segundos e então centrifugada a 14.500

rpm, 4°C, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o procedimento de

lavagem das células foi repetido ao menos 3 vezes. O pellet formado foi suspenso

em 200 µL do tampão de protoplasto, incubado por 2 horas a 37 °C. A suspensão foi

homogeneizada por inversão, durante a incubação, em intervalos de 30 minutos.

Aos protoplastos foram adicionados 200 µL de solução de lise com proteinase K. A

suspensão foi homogeneizada por inversão e incubada a 65 °C, durante 20 minutos.

Após a lise celular, foram adicionados 200 µL de acetato de sódio, 5M, pH 5,4 e a

suspensão foi incubada a -20 °C durante 15 minutos. Os tubos Eppendorfs foram

centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi

transferido para um novo tubo e foram acrescentados 600 µL de isopropanol. A

solução foi homogeneizada por inversão e incubada a - 20 °C por 16 horas. Após a

precipitação do DNA, os tubos foram centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15

minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi lavado com etanol a

70% (-20ºC), para a remoção dos sais. O processo de lavagem foi repetido ao

menos 2 vezes. Após descartar o etanol proveniente da última lavagem o pellet de

DNA foi seco durante 10 minutos a temperatura ambiente. O DNA foi então

ressuspenso em 98 µL de água ultra pura, 1µL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 e 1 µL de

RNAse (10 µg/mL), sendo incubado a 37 °C, durante 60 minutos. O DNA foi

aliquotado em tubos Eppendorfs e estocado em freezer a -20 °C até o momento do

uso nas reações de PCR.

A concentração de DNA foi determinada em espectrofotômetro NanoDrop

2000 (Thermo Fischer Scientific, USA) pela absorbância das preparações a 260 nm,

utilizando como valor padrão 1DO = 50 µg/mL de DNA dupla fita. O grau de pureza

foi avaliado pela relação DO 260/280 nm. Amostras de DNA consideradas de boa

qualidade, livre de proteínas e outros resíduos apresentam relação entre 1,7 e 2,0.

64


Material e Métodos

A integridade do DNA genômico extraído foi verificado através de corrida

eletroforética em gel de agarose 0,8%, adicionado de 1% de Brometo de etídeo (10

mg/mL). Ao gel foram aplicados 1 µL da amostra de extração concomitantemente

com 5 µL do padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen). A corrida

foi realizada em tampão TBE 1X, aplicando-se uma corrente eletroforética constante

de 100 V por 60 minutos. A visualização e a documentação foram realizadas em um

sistema de fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho

transiluminador UV (Loccus Biotecnologia) acoplado a uma câmera fotográfica digital

(Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.

3.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Para as reações de PCR foram adicionados em um microtubo Eppendorf

(200µL): 12,5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, USA) (contendo MgCl2, dATP,

dTTP, dCTP, dGTP e Taq polimerase), 1 µl do primer CL1 [10 ρmol/µl] e 1 µl do

primer CL2A [10 ρmol/µl] (Tabela 8), 9,5 µl de água MilliQ estéril e 1 µl de DNA de

Sporothrix spp. [100 ng/µl], perfazendo um volume final de 25 µL.

As reações de PCR foram incubadas em um termociclador (MyGene Series

Peltier Thermal Cycler, MG96G, LongGene Scientific), com um passo inicial de 94°C

por 5 minutos e então amplificadas por 35 ciclos utilizando-se o seguinte programa:

94 °C (desnaturação) por 1 minuto; 60 °C (anelamento) por 1 minuto e 72 °C

(extensão) por 3 minutos. Após a ciclagem realizou-se um passo a 72 °C por 7

minutos para a extensão final. Os amplicons resultantes da reação foram

homogeneizados em tampão de amostra (DNA), aplicados em gel de agarose 2%,

previamente acrescido brometo de etídeo (1mg/mL), concomitantemente com 5 µL

do padrão de peso molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek,

Canadá), e submetidos à corrente elétrica constante de 80 V por 60 minutos. Após a

65


Material e Métodos

corrida, procedeu-se a visualização dos amplicons em um sistema de

fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho transiluminador UV

(Loccus Biotecnologia, São Paulo) acoplado a uma câmera fotográfica digital

(Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.

Tabela 8: Marcador molecular utilizado para amplificação e sequenciamento do

gene da calmodulina, temperatura de anelamento e longitude do

fragmento amplificado.

Região Primers Sequência (5’ a 3’) Tm Amplicon Referência

CAL CL1 GA(AG)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC

60 °C ≈ 800 pb O’Donnell

(2000) CL2A TTTTTGCATCATGAGTTGGAC

3.3.2.1 Purificação e quantificação do produto de PCR

Os fragmentos visualizados foram recuperados do gel após a eletroforese e

purificados utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,

USA) seguindo-se as recomendações do fabricante. As amostras purificadas foram

quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific,

USA) e armazenadas em freezer a -20 °C até o momento do sequenciamento.

3.3.3 Sequenciamento dos produtos de PCR

O sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR foi realizado no

Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP),

utilizando-se o sistema de análise de DNA de 96 capilares MegaBACE 1000 (GE

Healthcare). As reações de sequenciamento foram realizadas de acordo com o

protocolo para o MegaBACE 1000, utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator Kit

66


Material e Métodos

(com Thermo Sequenase™ II DNA Polimerase). As sequencias foram analisadas

pelo software Sequence Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.12.

3.3.4 BLAST

Para buscar similaridades com sequencias depositadas no Genbank foi

utilizado o software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool –

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al., 1997).

Sequencias consenso foram obtidas através do alinhamento das sequencias

foward e reverse utilizando-se o software DNA Baser (versão 2.91). Todas as

sequencias foram analisadas automaticamente por comparação no banco de dados

de sequências não redundantes (NR) do NCBI (Altschul et al., 1997). Utilizando o

algoritmo BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), as sequências consenso obtidas

para o amplicon do gene da Calmodulina foram avaliadas e os resultados obtidos

tiveram como parâmetro de aceitação, um e-value igual ou menor que 10-3, que

confirma segundo Maranhão (2008) a obtenção de alinhamento com similaridade

confiável por estar mais próximo de zero e diminui a probabilidade do alinhamento

ter ocorrido casualmente.

3.4 Taxonomia polifásica do complexo Sporothrix schenckii

A classificação final dos isolados de Sporothrix spp. foi realizada levando-se

em consideração os resultados obtidos da caracterização molecular e fenotípica das

161 cepas estudadas. Em casos isolados, em que houvesse discrepância dos

resultados entre o método molecular e fenotípico, optou-se por repetir os

experimentos. Persistindo a divergência, adotamos o resultado obtido para o método

molecular como padrão para a classificação final.

67


Material e Métodos

3.5 Proteômica

A análise do proteoma da fase parasitária das principais espécies que

compõem o complexo Sporothrix schenckii foi proposta neste trabalho utilizando

como ferramenta a eletroforese bidimensional de proteínas em gel de poliacrilamida

(Figura 8).

Alguns fatores devem ser levados em consideração quando existe a

intenção de extrair e solubilizar proteínas, entre eles: tempo, temperatura, pH,

concentração de proteínas, sais, íons metálicos e cofatores (Leimgruber, 2005). Os

protocolos de extração, solubilização, precipitação, focalização isoelétrica (IEF),

SDS-PAGE foram adaptados e otimizados neste trabalho para nossas amostras.

3.5.1 Isolado e condição de cultivo

Utilizamos o isolado Ss 118 para os ensaios de padronização das

metodologias propostas. Um fragmento de micélio, de aproximadamente 20 mg foi

adicionado em frascos Erlenmeyers de 500 mL de capacidade, contendo 100 mL de

caldo BHI, pH 8,0. A cultura foi colocada para crescer sob agitação constante de 120

rpm, em agitador rotatório (Nova Ética, São Paulo) a 37 °C, durante 7 dias.

Alíquotas das culturas foram recuperadas após o crescimento e analisadas ao

microscópio óptico para confirmação do estágio de diferenciação celular (levedura) e

pureza das culturas quanto à presença de microrganismos contaminantes.

As células foram transferidas assepticamente para tubos Falcons de 50 mL e

lavadas em água MilliQ® 18MΩ, centrifugando a suspensão a 3.500 rpm, 4°C, por 10

minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi

novamente lavado em água MilliQ até que não houvesse mais resquícios visual de

meio de cultura entre as células. O pellet resultante foi incubado em gelo (4 ºC) e,

posteriormente, utilizado nos protocolos de extração de proteínas descritos a seguir.

68


Material e Métodos

3.5.2 Extração de proteínas de leveduras de Sporothrix

schenckii

O preparo de extrato protéico de leveduras é complicado pela presença de

uma parede celular rica em quitina e glucanas que necessitam ser rompidas durante

o processo de extração (Norbeck, 2005). Neste trabalho foram testados 9 protocolos

de extração de proteínas, que variaram em dois aspectos principais: a combinação

de métodos físicos e químicos de lise celular e a solubilização do extrato protéico.

Didaticamente estes protocolos foram divididos em dois blocos, variando a principal

forma de lise física, por (I) nitrogênio líquido ou (II) por ação de pérolas de vidro

(beads) no aparelho Fastprep 1200®. O esquema geral dos protocolos de extração

pode ser visualizado na Figura 9.

Figura 8: Abordagem esquemática em proteômica diferencial. Mapas bidimensionais de referência

gerados a partir do antígeno celular total extraído de leveduras de Sporothrix schenckii, S.

brasiliensis, S. globosa e S. mexicana (n=3). As possíveis comparações entre as imagens

adquiridas dos géis provenientes das triplicatas experimentais são esquematizadas. As

análises comparativas de variações interespecíficas (→) são representadas pelas setas.

Abreviações: pI, ponto isoelétrico; mw, molecular weigth (massa molecular); Ss, Sporothrix

schenckii; Sb, Sporothrix brasiliensis; Sg, Sporothrix globosa; Sm, Sporothrix mexicana.

69


Material e Métodos

Figura 9: Protocolos de extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii (7 dias de cultivo). Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de

homogeneização das leveduras (em suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45 segundos. Os protocolos

7 e 8 combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio e Uréia-Tiouréia

respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads de vidro (0,5mm diâmetro). Após ruptura das células

nos 8 protocolos, os lisados são centrifugados a 15.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos. O sobrenadante (extrato bruto) é dosado pelo método de

Bradford, aliquotado e armazenados em freezer -80°C, até o momento do uso. Aproximadamente 20 µg de amostra de cada protocolo são aplicados

em um gel SDS-PAGE para verificação da integridade da amostra e do perfil de bandas gerados.

70


Material e Métodos

3.5.2.1 Protocolos de extração (I) (Nitrogênio líquido)

Leveduras do isolado Ss 118 foram cultivadas e coletadas de acordo com a

metodologia descrita no item 2.5.1. Aproximadamente 5 mL de células

leveduriformes foram transferidas para um almofariz (previamente autoclavado, a

120 °C, 40 minutos). As células foram maceradas por aproximadamente 30 minutos,

com auxílio de um pistilo até a obtenção de um pó extremamente fino. O macerado

foi transferido com auxílio de uma espátula para um frasco Falcon estéril de 50 mL e

ressuspenso em 3 mL de tampão Tris-Cálcio (Apêndice I) ou Uréia-Tiouréia

(Apêndice I). Ao homogeneizado foram adicionadas pérolas de vidro de 0,5 mm de

diâmetro (Invitrogem, USA). A suspensão foi agitada vigorosamente em vórtex

durante 40 minutos, a 4 °C, com a finalidade de aumentar o índice de lise celular e

consequentemente aumentar a liberação de proteínas na suspensão.

O homogeneizado foi recuperado com auxílio de uma pipeta Pasteur e

transferido para tubos plásticos Eppendorf, 1,5 mL de capacidade e centrifugados a

15.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O pellet formado, contendo os restos

celulares, foi descartado e os sobrenadantes provenientes dos diversos Eppendorfs

foram homogeneizados em um Falcon de 15 mL e, em seguida, alíquotado em

novos Eppendorfs. Ditiotreitol (DTT) foi adicionado à amostra a uma concentração

final de 20 mM (Missall et al., 2006) no protocolo com o tampão Tris-Cálcio. O

extrato protéico bruto foi armazenado imediatamente em freezer a – 80 °C.

3.5.2.2 Protocolos de extração (II) (Fastprep® 1200)

Os protocolos que compõem este segundo grupo de extração variam a

composição do tampão de lise química das células e solubilização de proteínas.

Tubos Eppendorfs de 2 mL foram adicionados de uma esfera de cerâmica de ¼ de

71


Material e Métodos

diâmetro (MP Biomedicals, USA), 500 mg de esferas de vidro 0,5 mm de diâmetro

(Invitrogen, USA). Os Eppendorfs adicionados das esferas foram autoclavados a 120

°C, 1atm durante 30 minutos.

Aproximadamente 600 µL de células (2x1010 UFC/mL) foram adicionadas

aos tubos Eppendorfs por protocolo, em triplicata. Os tubos Eppendorfs foram

mantidos em gelo, até o momento da agitação. A seguir foram adicionados 600 µL

de cada tampão de extração. Os tubos Eppendorfs foram então posicionados em um

aparelho Fastprep® 1200 e as condições de agitação foram ajustadas para 1 ciclo de

45 segundos, a velocidade 5.0 X.

Após a agitação, os tubos Eppendorfs foram centrifugados a 15.000 rpm, 4

°C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e em

seguida armazenado a -80 °C.

3.5.2.3 Quantificação protéica pelo método de Bradford

(1976) e avaliação da integridade da amostra

Todos os extratos brutos provenientes dos protocolos de extração foram

quantificados pelo ensaio colorimétrico proposto por Bradford (1976) baseado em

uma curva com concentração conhecida da proteína soroalbumina bovina (BSA),

utilizando o reagente Coomassie® Plus Protein Assay Reagent Kit (Pierce

Biotechnology , USA). Após a quantificação, aproximadamente 2 µg do extrato

protéico bruto foi aplicado em um gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970) composto

por gel de empacotamento (3 %) e gel de separação linear (10 %) a fim de verificar a

integridade da amostra.

72


Material e Métodos

3.5.3 Precipitação de proteínas

A precipitação de proteínas é um passo opcional na preparação de amostra

para a eletroforese bidimensional. A precipitação, seguida pela ressuspensão da

amostra, é geralmente empregada para separar as proteínas presentes na amostra

bruta de moléculas contaminantes como sais, detergentes, ácidos nucléicos, lipídios,

etc., que podem interferir com os resultados finais dos géis bidimensionais, gerando

géis de baixa resolução com arrastes horizontais.

Diversos métodos e reagentes são empregados para a precipitação de

proteínas, dentre eles os mais comumente empregados são: precipitação em sulfato

de amônio, TCA, Acetona, TCA/Acetona e Acetato de amônio em metanol seguido

de extração fenólica.

3.5.3.1 TCA (ácido tricloroacético)

Aproximadamente 300 µg de proteínas foram precipitadas utilizando uma

solução a 15 % de ácido tricloroacético (TCA). Em um tubo Eppendorf estéril

contendo o extrato bruto de proteínas das leveduras de S. schenckii foi adicionado o

TCA na razão 1:1 (TCA: amostra). A amostra foi homogeneizada por inversão e

incubada a 4 °C durante 15 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 14.000

rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e ao pellet resultante

foram adicionados 200 µL de acetona previamente refrigerada (-20 °C). Os tubos

foram incubados em gelo durante 15 minutos, e em seguida centrifugados a 14.000

rpm, 4 °C, durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o processo de

lavagem com acetona foi repetido. Os Eppendorfs foram abertos durante 5 minutos,

a temperatura ambiente, para a evaporação da acetona residual. As proteínas foram

ressuspensas em um tampão de solubilização e reidratação das tiras de pH

imobilizado (Apêndice I).

73


Material e Métodos

3.5.3.2 Acetona

Em um tubo Eppendorf estéril contendo o extrato bruto de proteínas das

leveduras de S. schenckii foi adicionado uma solução de acetona (-20 °C) na razão

4:1 (acetona: amostra). A solução foi homogeneizada em agitador de tubos durante

30-60 segundos e em seguida incubado a -20 °C, durante 2 horas. Os tubos foram

então centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi

removido e ao pellet resultante foram adicionados 500 µL de acetona a -20 °C e, em

seguida, centrifugado a 14.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. Os tubos Eppendorfs

foram abertos para a evaporação da acetona residual durante 5 minutos, a

temperatura ambiente. As proteínas foram ressuspensas em um tampão de

solubilização e reidratação das tiras de pH imobilizado (Apêndice I).

3.5.3.3 TCA/Acetona

Em um tubo Eppendorf estéril foram misturados o extrato bruto de leveduras

de S. schenckii, a acetona -20 °C e o ácido tricloroacético (TCA) na proporção de

1:8:1 respectivamente. A solução foi homogeneizada em agitador de tubos durante

30-60 segundos e, em seguida, incubado a -20 °C, durante 2 horas. Os tubos foram

então centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi

removido e ao pellet resultante foram adicionados 1000 µL de acetona a -20 °C. Os

tubos foram novamente centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. Os

Eppendorfs foram abertos para a evaporação da acetona residual durante 5 minutos,

a temperatura ambiente. As proteínas foram ressuspensas em um tampão de

solubilização e reidratação das tiras de pH imobilizado (Apêndice I).

74


Material e Métodos

3.5.3.4 2D-Clean up kit (GE Healthcare, USA)

O 2D-clean up é um kit comercial desenvolvido para utilização em

precipitação de amostras protéicas visando a aplicação em análises de géis

bidimensionais. O princípio deste protocolo é similar ao método de precipitação

desenvolvido por Damerval et al. (1986), porém, com o auxílio um detergente co-

precipitante as proteínas são eficientemente precipitadas e as moléculas

interferentes removidas da solução (Westermeier & Navem, 2002).

Aproximadamente 300 µg de proteínas foram precipitadas utilizando o 2D-

clean up kit, seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, foram

adicionados a 1 volume de amostra do extrato bruto de leveduras de S. schenckii, 3

volumes da solução precipitante. A amostra foi homogeneizada em agitador de

tubos durante 30-60 segundos e incubada a 4 °C durante 15 minutos. Ao

homogeneizado foi adicionado 3 vezes o volume original da amostra de co-

precipitante. A amostra foi homogeneizada novamente e em seguida centrifugada a

11.500 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao tubo

Eppendorf foi adicionado novamente a solução co-precipitante em um volume de 3-4

vezes o tamanho do pellet resultante. Os tubos foram centrifugados a 11.500 rpm, 4

°C, durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e ao tubo Eppendorf foi

adicionado 50 µL de água MilliQ® 18MΩ. Os tubos foram agitados em vórtex

vigorosamente e, em seguida, foram adicionados 1.000 µL de wash buffer

refrigerado (-20 °C) e 5 µL da solução wash additive. Os tubos foram incubados a -

20 °C durante 30 minutos sendo novamente agitados em vórtex durante 30

segundos, a cada intervalo de 10 minutos de incubação. Os tubos foram novamente

centrifugados a 11.500 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi

descartado e os tubos Eppendorfs foram abertos para a evaporação da solução

wash buffer residual durante 5 minutos, a temperatura ambiente. As proteínas foram

75


Material e Métodos

ressuspensas em um tampão de solubilização e reidratação das tiras de pH

imobilizado (Apêndice I).

3.5.4 Análise dos resultados de extração e precipitação de

proteínas

A relação quantidade de células/ tampão de lise/ quantificação protéica foi

estabelecida e o rendimento da extração foi determinado para cada protocolo.

Aproximadamente 10 µg de proteínas foram aplicadas em um gel de

poliacrilamida 10% e submetidas à eletroforese. Os géis resultantes foram corados

com nitrato de prata e/ou Coomassie coloidal. Após a coloração os géis foram secos

em papel celofane (BioRad, USA) e, em seguida, digitalizados com auxílio de um

scanner convencional (HP Photosmart C4480).

As imagens foram analisadas densitométricamente em relação à quantidade

de bandas e a intensidade apresentada por cada banda, utilizando o software

ImageLab 1D (Loccus Biotecnologia, São Paulo).

3.5.5 Eletroforese bidimensional

Durante a escolha do método de extração e precipitação optou-se por

combinar o passo de extração de proteínas que fornecesse o melhor rendimento de

extração/ padrão de bandas com a possibilidade de futura precipitação de proteínas,

sem perda de amostra e que apresentasse melhor solubilização protéica.

76


Material e Métodos

3.5.5.1 Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão)

Após precipitadas, as proteínas foram ressuspensas diretamente em 250 µL

do tampão de reidratação das tiras de pH imobilizado e solubilização das proteínas

(Apêndice I). A suspensão foi aplicada por toda a extensão de um sarcófago de

cerâmica (strip holder). Uma tira de pH imobilizado de 13 cm (pH 3-10 ou 4-7) foi

posicionada sob a solução, com a face do gel voltada para baixo. Aproximadamente

2 mL de óleo mineral (GE Healthcare, USA) foram aplicados sob a tira e em seguida,

o aparato foi posicionado em um aparelho Ettan IPGphor III para realizar a

isoeletrofocalização à 20 ºC até completar 65.000 Vhrs totais.

3.5.5.2 Tratamento das tiras de pH imobilizado

Após a isoeletrofocalização as tiras foram congeladas em freezer a -80 ºC

ou aplicadas imediatamente na segunda dimensão. As tiras foram equilibradas

durante 20 minutos, a temperatura ambiente, sob agitação constante em 5 mL

tampão de equilíbrio para a redução e alquilação dos grupos tióis das proteínas,

respectivamente em DTT (0,1%) e Iodoacetamida (0,2%).

3.5.5.3 SDS-PAGE (Segunda dimensão)

Após o tratamento, as tiras foram aplicadas na parte superior de um gel de

poliacrilamida 10% (160 x 150 mm), juntamente com 8 µL do padrão de peso

molecular BenchMark Protein Ladder (Invitrogen, USA). Na parte superior foi

aplicado 1mL de agarose 0,5% com azul de bromophenol (0,001%). O gel foi

posicionado em uma cuba de eletroforese vertical, Hoefer SE 600 e a corrida foi

conduzida a 10 ºC, aplicando-se um corrente eletroforética constante de 15 mA/gel

77


Material e Métodos

durante 10 minutos e 23 mA/gel até que o corante alcançasse o final do gel. Após a

separação das proteínas em segunda dimensão os géis foram fixados e corados

com nitrato de prata ou coomassie coloidal de acordo com o objetivo desejado.

3.5.6 Géis analíticos (Nitrato de prata)

Após a eletroforese os géis foram submersos em tampão de fixação sob

agitação moderada por no mínimo 3 horas, sendo em seguida lavados três vezes em

água ultra-pura por 10 minutos. Em seguida o gel foi incubado por 30 minutos em

uma solução de etanol 50%, 10 minutos em uma solução de Tiossulfato e 10

minutos em uma solução de nitrato de prata, sendo lavados com água ultra-pura por

10 minutos entre as soluções citadas. Após a coloração os géis foram submersos

em uma solução de revelação até o aparecimento dos spots (por um período de 2 a

3 minutos). A reação de revelação foi finalizada adicionando ao gel uma solução de

parada (Apêndice I).

3.5.7 Géis preparativos (Coomassie coloidal G-250)

Os géis preparativos foram utilizados para a obtenção de proteínas para o

sequenciamento. Deste modo foram aplicados aproximadamente 500 µg de

proteínas para a eletroforese. Após a eletroforese, os géis foram submersos em

tampão de fixação II sob agitação constante por no mínimo 3 horas. Em seguida, os

géis foram lavados em água ultra-pura por 10 minutos e, em seguida, submersos em

150 mL de solução coloração (Coomassie coloidal G-250), por no mínimo 16 horas

(Apêndice I). A descoloração foi realizada utilizando água ultra pura.

78


Material e Métodos

3.5.8 Aquisição e análise das imagens

A aquisição das imagens dos géis bidimensionais foi realizada em um

digitalizador densitométrico Image Scanner III (GE Healthcare, USA). A

determinação dos spots foi realizada automaticamente no software Image Master 7.0

(GE Healthcare, USA) levando-se em consideração os critérios de área mínima,

suavização e saliência. Após a detecção automática procedeu-se a detecção manual

dos spots caso houvesse necessidade. Em seguida, foram adotados 5 spots de

referência (landmarks) para que o software pudesse comparar a posição das

proteínas nos diferentes géis e suprimisse deste modo possíveis variações

provocadas por diferenças no tamanho dos géis, migração das proteínas, entre

outros. As triplicatas biológicas foram comparadas entre si gerando um mapa

proteômico de referência. Os mapas de referências das espécies filogenéticas

estudadas foram comparados sendo evidenciadas as diferenças do mapa utilizando

como parâmetro a intensidade e a área dos spots para inferir os níveis de expressão

diferencial de proteínas.

79


Material e Métodos

3.6 Imunoproteômica

3.6.1 Western Blot bidimensional

Para os ensaios de imunoproteômica foram feitos géis bidimensionais com o

extrato protéico celular total dos isolados selecionados, seguindo a mesma

metodologia citada nos itens 2.5.1 (condições de cultivo) 2.5.2.1 (extração), 2.5.5.1

(IEF) e 2.5.5.3 (SDS-PAGE). As proteínas separadas no gel foram transferidas para

membranas Amersham Hybond™ (Amersham Bioscience, USA), 0,45 µm,

embebidas em uma solução de transferência contendo Trizma Base 25 mM, Glicina

192 mM, Metanol 20% em pH 8.3 (Towbin et al., 1979) utilizando-se o sistema

Trans-Blot® Semi-Dry (Bio-Rad, USA), aplicando-se uma corrente elétrica de 25 V,

durante 60 minutos. A confirmação da transferência foi realizada com o corante

Ponceau (Ponceau’S 0,15% e Ácido acético 1%).

Confirmada a transferência pela coloração das proteínas na membrana, esta

foi lavada com água MilliQ estéril para retirar o excesso do corante e os sítios livres

de proteínas foram bloqueados com 5% de leite em pó desnatado adicionado de 1%

de BSA fração V em solução de PBS Tween 20 por 2-3 horas. Em seguida, a

membrana foi lavada com PBS-Tween estéril (NaCl a 80%, KCl a 2%, Na2HPO a

11,5%, KH2PO4 a 2% e Tween 20 a 1%) e incubada com soro de pacientes com a

forma cutânea fixa ou a forma linfocutânea da doença, diluídos na proporção de

1:500, com agitação constante por 1 hora, a temperatura ambiente. A membrana foi

lavada com PBS-Tween 20 por 10 minutos, 3 vezes. Após os procedimentos de

lavagem, a membrana foi incubada por 1 hora, sob agitação constante com o

anticorpo secundário IgG de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase,

diluído 1:1000, a temperatura ambiente. Após este procedimento foi realizada uma

última lavagem com PBS-Tween 20 por 15 minutos, sob agitação leve.

80


Material e Métodos

O blotting foi revelado por quimioluminêscencia (Figura 11) utilizando-se o kit

SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology, USA)

diluído em tampão carbonato CO3- HCO3

- 50mM, pH 9,6 (Carbonato de sódio 0,5 M,

Carbonato ácido de sódio 0,5 M), de acordo com as informações do fabricante. O

luminol diluído foi incubado com a membrana durante 5 minutos. Após a exposição,

a membrana foi colocada em contato com filme High Performance

Chemiluminescence (GE Healthcare, USA) por até 5 minutos. O filme foi revelado

em solução de revelação, Revelador e Reforçador GBX (Kodak, USA), lavado em

água destilada, e solução de fixação, Fixador e Reforçador GBX (Kodak, USA).

As imagens impressas no filme de revelação foram fotodocumentadas em

scanner densitométrico (Image Scanner III – GE Healthcare) e os spots

imunogênicos foram analisados pelo software Image Master. O objetivo deste

ensaio é observar quais são as proteínas do fungo que reagem com o soro do

paciente com esporotricose e se existem diferentes moléculas imunogênicas entre

as espécies estudadas e entre as duas formas clínicas da doença escolhidas para

análise (Figura 10). Pretendemos deste modo, propor proteínas candidatas a

biomarcadores baseados nos perfis imunológicos observados nas reações das

proteínas quando incubadas com o soro de pacientes. Como controle negativo dos

ensaios as membranas serão incubadas com soro de indivíduos sadios.

81


Material e Métodos

Figura 10: Abordagem imunoproteômica. Comparação entre as formas clínicas da doença e as

espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii.

Figura 11: Detecção de proteínas imunogênicas com a técnica de Western-Blot. (A) Transferência

das proteínas fúngicas para uma membrana de nitrocelulose; (B) Incubação da membrana

com soro de paciente com esporotricose; (C) Incubação da membrana com um anticorpo

anti-IgG humana conjugado com peroxidase; (D) Incubação da membrana com luminol;

(E) e (F) Detecção dos spots imunogênicos com auxílio de filme fotográfico através da

impressão de pontos luminosos provenientes da reação de quimiluminescência entre a

peroxidase e o luminol.

82


Resultados

4. RESULTADOS

4.1 Características fenotípicas

As cepas de Sporothrix spp. foram isoladas diretamente de lesões de

pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença, de felinos, assim como

de diferentes substratos na natureza como superfície vegetal e solo. Estas cepas

estão mantidas sob cultivo in vitro em tubos com meio SDA, à temperatura ambiente,

por tempos distintos que variam de poucos meses a sessenta anos.

A caracterização fenotípica foi realizada em meio de cultura PDA, a fim de

obtermos parâmetros de comparação com os dados publicados na literatura.

Quando incubados à temperatura de 30 ºC, o crescimento vegetativo foi

relativamente lento para a maioria das cepas (41,37 ± 8,25 mm em 21 dias).

Macroscopicamente, as colônias apresentam micélio densamente emaranhado,

fortemente compactado, gerando um aspecto coriáceo ou membranoso, de difícil

dissociação por ação mecânica. Durante os primeiros dias de incubação algumas

colônias apresentaram coloração branca, a qual foi adquirindo tonalidade marron em

diferentes intensidades dependendo do isolado e da região da colônia, enquanto

outros isolados apresentaram colônias que desenvolveram uma coloração vermelho-

esmaecida com o decorrer do tempo de cultivo.

À temperatura de 35 ºC (21 dias) as colônias apresentaram em média

diâmetro de 9,88 ± 3,86 mm com crescimento vegetativo protuberante com algumas

áreas de saliência pronunciada. A velocidade de expansão da colônia foi em parte

reduzida pela atuação da temperatura quando comparado ao diâmetro obtido para

30 ºC.

Quando incubadas em meio PDA à temperatura de 37 ºC o crescimento foi

extremamente lento, atingindo apenas 6,15 ± 2,53 mm, em 21 dias de incubação.

83


Resultados

Macroscopicamente, as cepas cultivadas não apresentaram o aspecto cremoso

característico das colônias leveduriformes, devido provavelmente ao meio de cultivo

utilizado. In vitro, a transição para a fase leveduriforme é induzida principalmente

pela ação da temperatura, porém os aspectos nutricionais do meio de cultura

também podem influenciar o dimorfismo. As colônias apresentaram um aspecto

cerebriforme, com sulcos acentuados, de coloração branca a creme. Para algumas

cepas esta temperatura foi capaz de inibir completamente o crescimento.

4.2 Influência da temperatura no crescimento fúngico

4.2.1. Crescimento vegetativo

A influência da temperatura sobre o crescimento vegetativo foi avaliada em

170 isolados do complexo S. schenckii. Os resultados obtidos foram utilizados como

dados taxonômicos para a classificação fenotípica dos isolados assim como dados

fisiológicos para o entendimento da biologia deste patógeno. O diâmetro das

colônias dos isolados após 21 dias de incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e

40 °C são descritos na Tabela 9.

84


Resultados

Tabela 9: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de

incubação em diferentes temperaturas.

Código do

Isolado

Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster

30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ss 01SP 36,27 ± 0,77 7,28 ± 0,24 3,22 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 02RS 42,45 ± 2,95 10,13 ± 0,74 4,16 ± 1,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 03RS 47,55 ± 4,55 12,08 ± 0,53 4,72 ± 0,22 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 04RS 48,52 ± 2,52 10,30 ± 0,45 5,70 ± 0,60 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 05MG 47,15 ± 0,50 17,83 ± 1,18 5,96 ± 0,23 0,00 ± 0,00 II.b.1.1

Ss 06MG 36,67 ± 1,82 2,10 ± 0,12 1,82 ± 0,62 0,00 ± 0,00 III.a.2.2

Ss 07MG 40,55 ± 7,05 11,14 ± 0,08 5,03 ± 1,12 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 08MG 41,50 ± 1,20 13,18 ± 0,04 5,65 ± 2,45 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 09MG 41,97 ± 0,92 14,24 ± 0,51 1,16 ± 0,03 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 10MG 38,90 ± 0,25 13,60 ± 0,66 4,98 ± 0,96 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 11MG 40,32 ± 0,72 15,26 ± 1,61 5,02 ± 0,47 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 12MG 40,55 ± 0,95 10,21 ± 0,34 7,98 ± 0,93 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 13MG 30,42 ± 1,22 11,47 ± 0,12 1,90 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Ss 14MG 37,95 ± 2,35 13,37 ± 0,32 1,91 ± 0,06 0,00 ± 0,00 III.a.1.2

Ss 15MG 40,50 ± 0,40 5,04 ± 0,43 1,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.a.2.2

Ss 16PI 46,28 ± 1,43 16,80 ± 1,39 1,45 ± 0,10 0,00 ± 0,00 II.b.1.1

Ss 17PR 32,90 ± 5,90 13,44 ± 1,35 3,28 ± 0,68 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Ss 19PR 28,95 ± 0,70 4,80 ± 0,28 1,31 ± 0,06 0,00 ± 0,00 III.b.1.1

Ss 20PR 33,62 ± 6,37 16,49 ± 0,27 4,51 ± 1,36 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Ss 21PR 41,05 ± 2,55 13,52 ± 0,94 1,75 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 22PR 37,12 ± 0,07 14,84 ± 0,47 3,15 ± 1,95 0,00 ± 0,00 III.a.1.2

Ss 24PR 24,75 ± 0,20 7,05 ± 0,68 2,20 ± 1,05 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 25PR 43,70 ± 4,10 11,48 ± 0,11 1,47 ± 0,12 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 26PR 40,60 ± 2,15 12,10 ± 0,17 2,85 ± 0,15 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 27PR 39,37 ± 1,37 15,57 ± 0,01 4,17 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 28PR 40,32 ± 1,12 11,09 ± 0,41 1,67 ± 0,37 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 30PR 37,67 ± 1,67 14,13 ± 0,87 2,36 ± 0,63 0,00 ± 0,00 III.a.1.2

Ss 31PR 46,25 ± 1,85 16,35 ± 2,15 7,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 II.b.1.1

Ss 32PR 38,35 ± 2,60 8,29 ± 0,16 7,25 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 33PR 34,22 ± 5,67 11,01 ± 1,03 8,00 ± 2,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 34PR 52,75 ± 0,06 11,28 ± 0,41 11,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 35PR 34,10 ± 0,00 17,12 ± 0,20 7,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Ss 36PR 50,57 ± 2,42 10,53 ± 0,08 7,50 ± 0,50 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 37PR 27,45 ± 0,00 19,70 ± 0,24 7,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Continua...

85


Resultados

Continuação…

Código do Isolado


30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ss 38PR 39,35 ± 0,25 15,35 ± 1,06 9,75 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 39PR 44,35 ± 2,60 12,57 ± 0,21 6,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 40CE 42,75 ± 2,15 14,53 ± 0,49 7,25 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

Ss 41CE 41,00 ± 0,00 4,01 ± 0,04 4,00 ± 0,50 0,00 ± 0,00 III.a.2.2

Ss 42CE 35,20 ± 0,80 12,31 ± 1,33 7,75 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 43CE 38,75 ± 3,75 15,76 ± 0,51 8,50 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 44CE 36,55 ± 2,05 13,09 ± 1,19 8,00 ± 1,50 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 45GO 41,57 ± 1,92 11,10 ± 1,79 6,50 ± 1,00 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 46GO 26,50 ± 0,00 13,78 ± 0,05 4,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.1

Ss 47GO 31,85 ± 0,25 9,01 ± 0,03 6,25 ± 1,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 48GO 44,10 ± 1,50 6,88 ± 0,01 5,50 ± 0,50 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 49GO 32,57 ± 0,67 4,43 ± 0,12 4,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.1.1

Ss 50GO 37,55 ± 1,95 6,1 ± 0,05 3,50 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 51PA 37,70 ± 1,30 15,38 ± 1,82 9,82 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 52SP 28,92 ± 1,67 8,44 ± 0,46 8,22 ± 1,77 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 53RS 33,97 ± 4,02 10,71 ± 0,32 10,00 ± 1,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 54RS 38,00 ± 3,00 11,06 ± 0,53 11,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 55RS 33,90 ± 1,06 14,29 ± 0,33 9,75 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 56RS 37,20 ± 0,64 14,56 ± 1,09 7,83 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 57RS 37,75 ± 1,20 14,69 ± 1,30 9,63 ± 0,98 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 58SP 41,17 ± 1,06 9,23 ± 0,89 7,26 ± 0,03 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 59SP 48,79 ± 0,12 12,67 ± 0,88 9,93 ± 0,78 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 60SP 50,66 ± 0,49 10,57 ± 0,94 8,15 ± 0,22 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 61SP 49,31 ± 0,17 5,16 ± 0,02 5,43 ± 0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 62ES 40,40 ± 0,14 6,30 ± 0,17 6,58 ± 0,81 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 63ES 42,46 ± 1,69 6,31 ± 0,26 7,70 ± 0,09 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 64ES 44,79 ± 0,58 6,20 ± 0,67 8,29 ± 0,02 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 65RJ 40,19 ± 0,47 5,06 ± 0,18 7,86 ± 0,34 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 66RJ 37,31 ± 0,06 6,77 ± 0,07 5,02 ± 0,35 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 67RJ 32,89 ± 1,64 5,18 ± 0,01 4,66 ± 0,10 0,00 ± 0,00 III.b.1.1

Ss 68RJ 33,35 ± 0,26 8,87 ± 1,11 8,31 ± 0,24 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 69RJ 37,00 ± 0,17 10,66 ± 0,68 5,67 ± 0,24 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 70RJ 46,51 ± 1,41 9,51 ± 0,04 8,10 ± 0,16 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 71RJ 40,54 ± 1,11 5,90 ± 0,87 4,84 ± 0,14 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 72RJ 39,66 ± 0,70 6,98 ± 0,17 5,66 ± 0,81 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

86


Resultados

Continuação...

Código do Isolado


30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ss 73RJ 47,96 ± 0,48 10,13 ± 0,61 6,21 ±0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 74RJ 37,87 ± 0,25 5,06 ± 0,03 5,44 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 75RJ 49,99 ± 1,42 8,55 ± 0,30 5,45 ± 0,54 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 76RJ 39,17 ± 0,34 7,05 ± 0,18 7,20 ± 0,03 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 77RJ 32,21 ± 1,27 10,01 ± 0,98 8,74 ± 0,05 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 78RJ 38,01 ± 0,06 7,18 ± 0,17 5,01 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 79RJ 37,78 ± 0,31 4,42 ± 0,55 5,33 ± 0,48 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 80RJ 52,16 ± 0,24 6,42 ± 0,64 6,17 ± 0,49 0,00 ± 0,00 II.b.2.1

Ss 81RJ 39,10 ± 0,64 5,27 ± 0,18 4,81 ± 0,56 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 82RJ 38,95 ± 0,62 7,46 ± 0,45 6,49 ± 0,14 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 83RJ 34,33 ± 0,24 10,19 ± 0,81 6,24 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 84RJ 36,41 ± 0,14 6,25 ± 0,05 7,18 ± 0,38 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 85RJ 35,09 ± 0,57 8,61 ± 0,07 8,85 ± 0,09 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 86RJ 39,17 ± 0,50 7,39 ± 0,05 7,42 ± 0,72 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 87RJ 27,80 ± 0,11 10,82 ± 0,44 7,49 ± 1,40 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 88RJ 39,08 ± 0,12 5,51 ± 0,23 7,50 ± 0,21 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 89RJ 36,89 ± 0,81 3,82 ± 0,20 4,69 ± 0,12 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 90RJ 43,70 ± 0,65 8,87 ± 0,49 7,67 ± 0,53 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 91RJ 33,56 ± 0,79 8,60 ± 0,36 6,59 ±0,13 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 92RJ 42,33 ± 0,68 8,63 ± 2,58 5,82 ±0,85 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 93RJ 38,27 ± 0,48 3,54 ± 0,14 4,60 ±0,37 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 94RJ 46,94 ± 0,41 8,11 ± 0,81 8,67 ±0,51 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 95RJ 32,83 ± 0,95 5,78 ± 0,18 4,86 ±0,69 0,00 ± 0,00 III.b.1.1

Ss 96RJ 38,38 ± 0,78 8,17 ± 0,05 4,41 ±0,21 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 97RJ 38,00 ± 1,87 6,02 ± 0,24 4,09 ±0,35 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 98RJ 37,63 ± 1,27 6,85 ± 0,35 4,40 ±0,06 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 99RJ 38,77 ± 0,97 10,41 ± 0,18 4,59 ±0,53 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 100RJ 45,76 ± 0,86 8,27 ± 0,62 6,38 ±0,22 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 101SP 41,36 ± 1,25 10,84 ± 0,18 4,62 ±0,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 102SP 44,77 ± 0,09 5,72 ± 1,12 6,56 ±0,42 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 103SP 38,62 ± 1,34 9,30 ± 0,26 4,45 ±0,08 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 104MG 45,92 ± 1,19 13,06 ± 0,05 5,74 ±0,18 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 105MG 45,02 ± 0,34 12,16 ± 0,31 8,17 ±1,11 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 106MG 47,99 ± 1,35 5,60 ± 1,07 5,40 ±0,05 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 107MG 39,88 ± 0,78 12,70 ± 0,61 7,00 ±0,67 0,00 ± 0,00 III.a.1.1

87


Resultados

Continuação...

Código do Isolado


30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ss 109MG 48,39 ± 6,47 11,48 ± 1,17 7,17 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 110MG 54,39 ± 1,17 14,06 ± 0,46 7,41 ±0,44 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 111SP 45,76 ± 0,04 12,94 ± 1,13 6,50 ±0,79 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 112SP 46,72 ± 0,25 8,88 ± 1,00 6,70 ±0,23 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 113SP 44,99 ± 0,70 10,71 ± 1,51 3,57 ±0,33 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 114SP 53,12 ± 1,06 8,32 ± 0,77 8,15 ±0,97 0,00 ± 0,00 II.b.2.1

Ss 115SP 41,43 ± 0,59 10,37 ± 0,03 7,34 ±0,10 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 116SP 46,91 ± 0,26 4,32 ± 0,28 4,88 ±0,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 117SP 60,81 ± 0,47 9,59 ± 0,66 7,16 ±0,25 0,00 ± 0,00 I

Ss 118SP 43,63 ± 0,76 8,73 ± 0,06 8,54 ±0,17 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 119SP 43,76 ± 0,55 13,13 ± 0,31 6,45 ±0,34 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 120SP 51,49 ± 0,21 13,03 ± 0,68 7,20 ±0,15 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 121SP 54,43 ± 2,10 11,77 ± 1,05 8,87 ±0,26 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 122SP 24,10 ± 0,08 7,60 ± 0,01 4,74 ±0,16 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 123SP 53,66 ± 0,27 13,02 ± 0,02 8,29 ±0,23 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 124SP 51,70 ± 0,52 12,35 ± 0,49 5,65 ±0,09 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 125SP 43,89 ± 0,08 9,20 ± 0,13 9,44 ±1,14 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 126SP 45,62 ± 0,20 6,67 ± 1,18 5,11 ±0,78 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 127SP 53,47 ± 0,49 3,63 ± 0,04 5,59 ±0,59 0,00 ± 0,00 II.b.2.1

Ss 128SP 43,08 ± 0,56 10,73 ± 0,89 11,16 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 129SP 47,54 ± 0,88 6,52 ± 0,09 5,25 ±0,01 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 130PE 38,28 ± 0,48 9,63 ± 1,02 4,11 ±0,06 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 131PE 47,97 ± 1,53 7,50 ± 0,01 4,23 ±0,28 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 132SP 68,76 ± 0,32 4,89 ± 0,06 4,80 ±0,15 0,00 ± 0,00 I

Ss 133PE 68,11 ± 0,50 5,96 ± 0,76 3,48 ±0,64 0,00 ± 0,00 I

Ss 134PE 68,11 ± 2,38 2,00 ± 0,01 3,37 ±0,16 0,00 ± 0,00 I

Ss 135PE 43,84 ± 0,95 7,85 ± 0,36 6,61 ±0,35 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 136PE 47,74 ± 0,91 8,63 ± 0,10 8,89 ±0,31 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 137PE 48,42 ± 0,42 10,81 ± 0,11 8,36 ±0,18 0,00 ± 0,00 II.b.2.2

Ss 138PB 43,45 ± 0,25 6,96 ± 0,10 6,22 ±0,60 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 139PB 45,14 ± 0,31 8,94 ± 0,96 3,49 ±0,55 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 140PB 48,23 ± 1,74 7,07 ± 0,30 7,06 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 141DF 50,77 ± 0,35 6,89 ± 0,02 6,78 ±0,76 0,00 ± 0,00 II.b.2.1

Ss 143PA 38,08 ± 1,05 9,36 ± 0,31 7,07 ±0,26 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 144RS 53,83 ± 0,09 9,40 ± 0,03 8,99 ±0,91 0,00 ± 0,00 II.b.2.1

88


Resultados

Conclusão...

Código do Isolado


30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ss 145RS 29,12 ± 0,84 10,46 ± 0,01 5,33 ±0,00 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 146AM 36,28 ± 0,30 20,12 ± ,015 16,10 ±0,07 0,00 ± 0,00 –

Ss 147AM 35,86 ± 0,88 19,03 ± 0,59 16,59 ±0,83 0,00 ± 0,00 –

Ss 148SP 33,87 ± 1,79 8,96 ± 0,11 8,29 ±0,48 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 149RS 38,08 ± 0,52 10,01 ± 0,67 9,92 ±0,26 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 150RS 31,74 ± 0,34 9,41 ± 0,05 6,76 ±0,30 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 151RS 30,63 ± 0,50 9,35 ± 0,36 9,14 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 152RS 30,92 ± 2,85 11,06 ± 0,29 8,80 ± 0,27 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 153RS 32,48 ± 0,28 8,85 ± 0,02 8,76 ±0,09 0,00 ± 0,00 III.b.2.2

Ss 154RS 28,29 ± 0,99 9,87 ± 0,40 9,67 ±0,51 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 155RS 24,97 ± 0,19 8,20 ± 0,09 7,58 ±0,75 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 156RS 42,88 ± 2,58 10,72 ± 0,42 7,69 ±0,25 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 157RS 29,64 ± 0,23 10,18 ± 0,34 6,34 ±0,48 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 158AM 25,62 ± 0,74 6,66 ± 0,07 7,54 ±0,15 0,00 ± 0,00 III.b.1.2

Ss 159JPO 38,42 ± 0,24 5,07 ± 0,65 5,08 ±0,19 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 160MEX 41,09 ± 0,22 9,32 ± 0,47 8,59 ±0,45 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 161MEX 38,86 ± 0,22 10,32 ± 0,46 4,89 ±0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

Ss 162MEX 46,59 ± 0,45 6,47 ± 0,40 8,57 ±0,28 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 163PER 45,83 ± 0,26 7,40 ± 0,45 3,91 ±0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 164PER 41,31 ± 0,02 8,71 ± 0,07 4,33 ±0,20 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 167PER 43,85 ± 0,75 7,95 ± 0,22 5,64 ±0,62 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

Ss 168PER 37,00 ± 0,59 7,16 ± 0,22 3,85 ±0,12 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

FMR 8309RJ 41,33 ± 0,10 8,58 ± 0,34 4,79 ±0,61 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

FMR 8314RJ 42,23 ± 0,01 10,46 ± 0,30 8,19 ±1,26 0,00 ± 0,00 II.b.1.2

FMR 8600ESP 37,78 ± 1,06 1,67 ± 0,07 1,66 ±0,17 0,00 ± 0,00 III.a.2.2

FMR 8595ESP 36,97 ± 0,28 3,02 ± 0,20 2,24 ±0,04 0,00 ± 0,00 III.a.2.2

FMR 9108MEX 65,89 ± 0,02 3,59 ± 0,17 3,92 ±0,67 0,00 ± 0,00 I

FMR 9107MEX 63,62 ± 0,20 3,65 ± 0,00 2,54 ±0,25 0,00 ± 0,00 I

FMR 8939UK 39,78 ± 0,40 7,43 ± 0,62 4,53 ±0,57 0,00 ± 0,00 III.a.2.1

FMR 8803CHI 64,17 ± 0,64 19,91 ± 0,45 5,18 ±0,06 0,00 ± 0,00 II.a

FMR 6618USA 34,70 ± 0,10 4,54 ± 0,25 3,41 ±0,22 0,00 ± 0,00 III.b.1.1

FMR 9018USA 36,29 ± 0,40 11,73 ± 0,15 2,76 ±0,16 0,00 ± 0,00 III.a.1.2

CBS937.72AFR 52,32 ± 1,21 27,75 ± 0,82 3,12 ±0,00 0,00 ± 0,00 II.a

Média (n=170) 41,43 ± 8,28 9,76 ± 3,73 6,03 ± 2,28 0,00 ± 0,00 –

89


Resultados

Os isolados de Sporothrix spp. (n=170) crescem em média 41,43 ± 8,28 mm;

9,76 ± 3,73 mm; 6,03 ± 2,28 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias de incubação nas

temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente. A análise de clusterização

utilizando a distância Euclidiana revelou dentre os cento e setenta isolados a

presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas de crescimento distintas.

O cluster I é formado por seis cepas (3,52%), sendo duas de Pernambuco

(Ss 133 e Ss 134), duas do México (FMR 9107 e FMR 9108) e duas cepas de São

Paulo (Ss 117, Ss 132) as quais apresentam taxa de crescimento rápido a 30 ºC

(Figura 12C). A taxa de crescimento do cluster I foi de 65,88 ± 2,85 mm; 5,40 ± 2,01

mm; 4,21 ± 1,48 mm e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,

respectivamente. Dentre as amostras que compõem o cluster I, quatro foram

isoladas de casos de esporotricose humana (Ss 117, Ss 132, Ss 133 e Ss134) e 2

isolados do meio ambiente (FMR 9107 e FMR 9108) (Figura 13).

O cluster II é formado por 70 cepas (41,17%) com representantes da África

(1,42%, n=1), China (1,42%, n=1), Peru (4,28%, n=3), México (2,85%, n=2) e dos

estados brasileiros do Espírito Santo (2,85%, n=2), Goiás (2,85%, n=2), Minas

Gerais (10%, n=7), Mato Grosso (1,42%, n=1), Paraíba (4,28%, n=3), Pernambuco

(5,71%, n=4), Piauí (1,42%, n=1), Paraná (5,71%,n=4), Rio de Janeiro (10%, n=10),

Rio Grande do Sul (7,14%, n=5), São Paulo (32,85%, n=23), além do Distrito Federal

(1,42%, n=1) com taxa de cresimento intermediário a 30 ºC (Figura 12B). Dentre

as amostras que compõem o cluster II, 35 cepas (50%) foram isoladas de casos de

esporotricose cutânea fixa, 24 (34,28%) de esporotricose humana linfocutânea, 1

(1,42%) de esporotricose humana extracutânea, 1 (1,42%) de esporotricose humana

disseminada, 3 (4,28%) de esporotricose humana (sem dados clínicos), 2 (2,85%) de

esporotricose felina linfocutânea e 4 (5,71%) isolados ambientais. A taxa de

crescimento do cluster II foi de 46,79 ± 4,34 mm; 10,32 ± 3,67 mm; 6,65 ± 1,86 mm e

0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente (Fig. 13).

90


Resultados

O cluster III é formado por 94 cepas (55,29%) com representantes do Japão

(1,06%, n=1), México (1,06%, n=1), Peru (1,06%, n=1), Espanha (2,12%, n=2),

Estados Unidos (2,12%, n=2), Reino Unido (1,06%, n=1) e dos estados brasileiros

do Amazonas (1,06%, n=1), Ceará (5,31%, n=5), Espírito Santo (1,06%, n=1), Goiás

(4,25%, n=4), Minas Gerais (9,57%, n=9), Pará (2,12%,n=2), Pernambuco (1,06%,

n=1), Paraná (17,02%, n=16), Rio de Janeiro (29,78%, n=28), Rio Grande do Sul

(14,89%, n=14) e São Paulo (5,31%, n=5) que apresentam taxa de crescimento

lento a 30 ºC (Figura 12A). Dentre as amostras que compõem o cluster III, 44 cepas

(46,80%) foram isoladas de casos de esporotricose humana fixa, 35 (37,23%) de

esporotricose humana linfocutânea, 1 (1,06%) de esporotricose humana

disseminada, 4 (4,25%) de esporotricose humana (sem dados clínicos), 8 (8,51%) de

esporotrotricose felina linfocutânea, 1 (1,06%) de esporotricose canina e 1 (1,06%)

isolado ambiental. A taxa de crescimento do cluster III foi de 35,88 ± 4,37 mm; 9,62

± 3,67 mm; 5,68 ± 2,47 mm e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40

ºC, respectivamente (Figura 13).

A análise de variância para o crescimento vegetativo nas diferentes

temperaturas de incubação foi considerada extremamente significantiva (p <

0,0001). As comparações estatísticas entre os clusters I e II; I e III e II e III para o

crescimento vegetativo a 30 ºC foram consideradas signigicativas pelo teste de

Tukey (p<0,001). À 35 ºC, o cluster I e II diferem estatísticamente pelo teste de

Tukey (p<0,01), assim como os cluster I e III (p<0,05). Os clusters II e III não diferem

estatísticamente (p>0,05) nesta temperatura de incubação . À 37 ºC, os clusters I e II

e os cluster II e III diferem estatísticamente pelo teste de Tukey (p<0,05). Os

clusters I e III não apresentam diferenças estatísticas significativas pelo mesmo teste

a 37 ºC (p>0,05).

91


Resultados

Figura 12: Aspecto macroscópico de culturas do complexo S. schenckii em placas de Petri (9 cm diam.) em meio PDA (potato-dextrose-agar), após 21 dias de

incubação à 30 °C. A) Ss 49 – Cluster III (taxa de crescimento lento); B) Ss 139 – Cluster II (taxa de crescimento intermediário); C) Ss 132 – Cluster I

(taxa de crescimento rápido).

92


Resultados

Figura 13: Análise de clusterização baseado no crescimento vegetativo apresentado pelos isolados do complexo

Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40ºC, em meio PDA,

aos 21 dias de incubação, de acordo com o coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).

93


Resultados

Os isolados brasilieros (n=153) do complexo S. schenckii crescem em média

41,04 ± 7,96 mm; 9,85 ± 3,25 mm; 6,21 ± 2,25 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias de

incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente. Os dados

referentes ao diâmetro das colônias obtidas para os isolados brasileiros separados

por região geográfica estão descritos na Tabela 10.

Quando agrupados por estados de origem os isolados brasileiros são

divididos em três grupos principais (Figura 14). O cluster I é formado pelo estado do

Amazonas com uma cepa (Ss158). O cluster I apresenta taxa de crescimento de

25,62 ± 0,00 mm; 7,66 ± 0,00 mm; 7,54 ± 0,00 mm e 0,00 ± 0,00 mm, em 21 dias de

incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.

O cluster II é formado pelo subgrupo II.a contendo os estados do Espírito

Santo e Rio de Janeiro e o subgrupo II.b com os estados de Goiás, Rio Grande do

Sul, Pará, Ceará, Paraná e Minas Gerais. O cluster II apresenta taxa de crescimento

de 38,83 ± 6,15 mm; 10,13 ± 3,41 mm; 6,16 ± 2,33 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias

de incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.

O cluster III é formado pelo subgrupo III.a contendo o estado do Piauí

enquanto o subgrupo III.b é composto pelos clados III.b.1 contendo os estados de

Mato Grosso, São Paulo e Paraíba e pelo clado III.b.2, contendo o estado de

Pernambuco e o Distriro Federal. O cluster III apresenta taxa de crescimento de

47,94 ± 3,25; 10,24 ± 3,57; 5,30 ± 1,80 e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30,

35, 37 e 40 ºC, respectivamente.

A análise de clusterização hierárquica dos estados brasileiros amostrados,

cujas cepas foram incubadas em diferentes temperaturas, indica que o agrupamento

dos estados ocorre de maneira independente das condições climáticas e

características ambientais peculiares de cada região (Figura 14). A origem

geográfica não influenciou o fitness das cepas brasileiras do complexo S. schenckii.

Desta maneira, cepas provenientes de estados com clima mesotérmico brando (com

94


Resultados

temperatura média entre 10 e 15 ºC) como o Rio Grande do Sul não apresentaram

diferenças significativas com relação ao desempenho fisiológico de cepas

provenientes de regiões de clima subquente (média entre 15 e 18 ºC) como o estado

de Goiás ou aquelas provenientes de clima predominantemente quente (temperatura

média maior que 18 ºC em todos os meses do ano) como o estado do Ceará.

95


Resultados

Tabela 10: Diâmetro médio da colônia (mm) de isolados brasileiros cultivado em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação em

diferentes temperaturas, de acordo com a origem geográfica do isolado.

Localização Geográfica Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão

País Região Estado (nº de espécimes) 30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Brasil

(n=153)

Sul

(n=39)

Rio Grande do Sul (19) 36,42 ± 7,50 10,81 ± 1,81 7,99 ± 1,93 0,00 ± 0,00

Paraná (20) 38,37 ± 7,01 12,86 ± 3,50 5,08 ± 3,03 0,00 ± 0,00

Sudeste

(n=87)

São Paulo (30) 45,95 ± 8,64 9,36 ± 2,48 6,72 ± 1,91 0,00 ± 0,00

Rio de Janeiro (38) 39,19 ± 5,03 7,87 ± 1,72 6,19 ± 1,42 0,00 ± 0,00

Minas Gerais (16) 42,01 ± 5,41 11,46 ± 3,93 4,86 ± 2,40 0,00 ± 0,00

Espírito Santo (3) 42,55 ± 1,79 7,85 ± 0,46 7,52 ± 0,70 0,00 ± 0,00

Centro-Oeste

(n=8)

Mato Grosso (1) 45,92 ± 0,00 13,06 ± 0,00 5,74 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Goiás (6) 35,69 ± 6,02 8,55 ± 3,15 5,00 ± 1,14 0,00 ± 0,00

Distrito Federal (1) 50,77 ± 0,00 6,89 ± 0,00 6,78 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Nordeste

(n=16)

Ceará (5) 38,85 ± 2,77 11,94 ± 4,13 7,10 ± 1,60 0,00 ± 0,00

Pernambuco (7) 51,78 ± 10,82 7,91 ± 2,18 5,58 ± 2,17 0,00 ± 0,00

Piauí (1) 46,28 ± 0,00 16,80 ± 0,00 1,45 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Paraíba (3) 45,60 ± 1,97 7,66 ± 0,90 5,59 ± 1,52 0,00 ± 0,00

Norte

(n=3)

Amazonas (1) 25,62 ± 0,00 7,66 ± 0,00 7,54 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Pará (2) 37,89 ± 0,19 12,37 ± 3,01 8,44 ± 1,37 0,00 ± 0,00

Média (n=153) 41,04 ± 7,96 9,85 ± 3,25 6,21 ± 2,25 0,00 ± 0,00

96


Resultados

Figura 14: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado pelos

isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,

agrupados de acordo com o estado de origem das cepas brasileiras de Sporothrix spp.

Distância Euclidiana (método de ligação complete).

Os isolados de Sporothrix spp. (n=163) foram agrupados de acordo com a

forma clínica provocada em hospedeiro humano e a origem animal ou ambiental. As

taxas de crescimento destes isolados estão descritos na Tabela 11.

97


Resultados

Tabela 11: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo

com a origem do isolado e a forma clínica da doença desenvolvida no hospedeiro.

Origem do isolado Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão

Hospedeiro Forma Clínica (nº de espécimes) 30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ori

gem

Clín

ica

Humana

(n=145)

Cutânea fixa (80) 41,26 ± 7,22 9,75 ± 3,35 6,17 ± 2,12 0,00 ± 0,00

Linfocutânea (62) 41,78 ± 8,53 9,67 ± 3,18 5,92 ± 2,28 0,00 ± 0,00

Disseminada (2) 39,25 ± 1,30 12,25 ± 1,11 3,47 ± 1,55 0,00 ± 0,00

Extracutânea (1) 43,76 ± 0,00 13,13 ± 0,00 6,45 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Animal

(n=11)

Esporotricose Felina (10) 34,46 ± 6,44 10,58 ± 2,70 7,90 ± 2,16 0,00 ± 0,00

Esporotricose Canina (1) 30,63 ± 0,00 9,35 ± 0,00 9,14 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Ambiental (n=7) Solo e Vegetal (7) 53,32 ± 10,11 8,27 ± 5,05 5,12 ± 1,71 0,00 ± 0,00

Média1 (163) 41,48 ± 8,37 9,75 ± 3,35 6,12 ± 2,24 0,00 ± 0,00

1Nesta análise não foram incluídos os isolados FMR 8309, FMR 8314, FMR 8600, FMR 8595, FMR 6618, FMR 9018 e CBS 937.72 porque não tínhamos em

mãos os dados referentes à forma clínica destas cepas.

98

Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii

Resultados

Quando calculamos a média de crescimento, agrupando as cepas de acordo

com a forma clínica apresentada pelo paciente, a origem animal ou ambiental

observou-se três grupos distintos (Figura 15). Os clusters I e II são formados por

cepas isoladas de hospedeiros mamíferos enquanto que o cluster III é formado por

cepas de origem ambiental. O cluster I compreende as cepas isoladas de casos

clínicos de esporotricose canina e felina. O cluster II corresponde a média dos

fungos isolados de lesões provocadas em hospedeiro humano.

Os agrupamentos detectados para a origem geográfica ocorrem

independentemente das características clímáticas ou dos biomas brasileiros. Não

observamos nenhuma correlação entre a área geográfica de isolamento do fungo e

e o comportamento in vitro em função da temperatura , evidenciando deste modo

que os aspectos morfológicos derivados da expansão da colônia independem da

origem geográfica do fungo e que a população de Sporothrix é altamente

heterogenea ao longo do território brasileiro, sendo isolado de uma mesma área

fungos com atributos biológicos diferentes.

Quando os isolados são agrupados por forma clínica ou origem ambiental

nota-se que as cepas de origem ambiental cresceram mais rapidamente e obtiveram

maior diâmetro da colônia (53,32 ± 10,11 mm) aos 21 dias de incubação a 30 ºC em

meio PDA. Os isolados provenientes da forma clínica cutânea fixa e linficutânea de

esporotricose humana apresentam o mesmo padrão de crescimento nas diferentes

temperturas avaliadas. Juntamente com os isolados provenientes de outras formas

clínicas humanas formam o cluster II. Não exite diferença no perfil de similaridade

entre estas cepas, o que nos leva a acreditar que a capacidade de provocar as

distintas formas clínicas da doença em hospedeiro humano poderia não estar

diretamente relacionado à sensibilidade térmica, mas possívelmente o curso da

doença decorra das condições de defesa do sistema imunitário do hospedeiro aliado

a outras caraterísticas biológicas e fisiológicas de virulência do patógeno.

99


Resultados

Por outro lado, os isolados obtidos de casos de esporotricose canina e felina

obtiveram as maiores médias de crescimento a 37 ºC. Possivelmente a temperatura

corporal destes mamíferos (aproximadamente 38 ºC) possa exercer uma pressão

seletiva sobre a população parasita, selecionando espécimes termotolerantes.

Figura 15: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado pelos

isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,

agrupados de acordo com a forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem

ambiental. Distância Euclidiana (método de ligação complete).

Após a taxonomia polifásica das cepas de Sporothrix spp., os isolados foram

agrupados de acordo com a espécie filogenética e, em seguida, calculou-se a média

de crescimento nas diferentes temperaturas de incubação (30, 35, 37 e 40 ºC),

seguindo-se o parâmetro taxonômico. Os dados referentes ao crescimento

vegetativo levando-se em consideração a espécie filogenética estão descritos na

Tabela 12.

100


Resultados

Tabela 12: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de

incubação em diferentes temperaturas de acordo com a espécie

filogenética.

Espécie

filogenética

Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão

30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC

S. brasiliensis (n=73) 37,71 ± 5,14 10,15 ± 3,18 6,86 ± 2,20 0,00 ± 0,00

S. schenckii (n=84) 43,27 ± 7,76 9,76 ± 3,03 5,69 ± 2,12 0,00 ± 0,00

S. globosa (n=5) 37,00 ± 2,69 3,04 ± 1,06 2,79 ± 1,10 0,00 ± 0,00

S. mexicana (n=5) 62,87 ± 7,66 5,27 ± 1,34 3,79 ± 0,76 0,00 ± 0,00

S. albicans (n=2) 51,97 ± 12,1 13,67 ± 6,23 4,86 ± 0,32 0,00 ± 0,00

S. luriei (n=1) 52,32 ± 0,00 29,75 ± 0,00 3,12 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Média (n=170) 41,43 ± 8,28 9,76 ± 3,73 6,03 ± 2,28 0,00 ± 0,00

Quando os isolados (n=170) são agrupados levando-se em consideração a

variável espécie filogenéticas nota-se a presença de três clusters (Figura 16).

Sporothrix schenckii, S. brasiliensis e S. globosa formam o cluster I

contendo a maioria dos isolados estudados (95,29%, n=160). Com exceção de S.

globosa, as espécies S. brasiliensis e S. schenckii apresentaram desenvolvimento

satisfatório in vitro quando incubadas à 37 ºC.

O cluster II (4,11%, n=7) é formado por S. albicans (51,97 ± 12,1) e S.

mexicana (62,87 ± 7,66) os quais apresentam as maiores taxas de crescimento em

meio PDA, aos 21 dias de incubação a 30 ºC.

O cluster III (0,58%, n=1) é formado por S. luriei com um único

representante descrito na literatura, o qual é capaz de crescer por volta de 30 mm

aos 21 dias de incubação a 35 ºC.

101


Resultados

Figura 16: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias (30, 35, 37 e 40 ºC)

apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo S. schenckii de acordo com o

coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).

4.2.2. Inibição do crescimento vegetativo

Em posse dos dados de diferentes variáveis de incubação foi possível

calcular a inibição do crescimento vegetativo nas diferentes temperaturas descritas

para cada isolado fúngico. Os dados referentes às porcentagens de inibição são

descritos na tabela 13. Em todos os experimentos de crescimento vegetativo

utilizamos as cepas tipo descritas por Marimon et al. (2007) e depositadas no

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) como parâmetros de comparação de

resultados. Os dados referentes a estas cepas encontram-se junto à referida tabela.

102


Resultados

Tabela 13: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo in vitro em meio PDA

aos 21 dias de incubação nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em função

de diferentes temperaturas.

Código do

Isolado

Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:

35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster

Ss 01SP 79,91 91,10 100 II.b.1.2

Ss 02RS 76,13 90,19 100 II.b.2.1

Ss 03RS 74,58 90,06 100 II.b.2.1

Ss 04RS 78,76 88,25 100 II.b.1.2

Ss 05MG 62,17 87,35 100 II.b.2.2

Ss 06MG 94,27 95,02 100 III.b.2

Ss 07MG 72,52 87,59 100 II.b.2.1

Ss 08MG 68,23 86,38 100 II.b.2.1

Ss 09MG 66,06 97,23 100 II.b.2.2

Ss 10MG 65,02 87,17 100 II.b.2.2

Ss 11MG 62,13 87,53 100 II.b.2.2

Ss 12MG 74,81 80,30 100 II.b.1.1

Ss 13MG 62,28 93,75 100 II.b.2.2

Ss 14MG 64,76 94,96 100 II.b.2.2

Ss 15MG 87,53 96,79 100 III.a.2

Ss 16PI 63,68 96,86 100 II.b.2.2

Ss 17PR 59,13 90,00 100 II.b.2.2

Ss 19PR 83,40 95,46 100 III.a.2

Ss 20PR 50,95 86,57 100 I

Ss 21PR 67,05 95,73 100 II.b.2.2

Ss 22PR 60,00 91,51 100 II.b.2.2

Ss 24PR 71,51 91,11 100 II.b.2.1

Ss 25PR 73,71 96,62 100 II.b.2.1

Ss 26PR 70,19 92,98 100 II.b.2.1

Ss 27PR 60,45 89,39 100 II.b.2.2

Ss 28PR 72,48 95,84 100 II.b.2.1

Ss 30PR 62,48 93,72 100 II.b.2.2

Ss 31PR 64,64 83,24 100 II.a.1.2

Ss 32PR 78,38 81,09 100 II.b.1.1

Ss 33PR 67,81 76,62 100 II.a.1.2

Ss 34PR 77,65 77,72 100 II.b.1.1

Ss 35PR 49,77 77,27 100 I

Ss 36PR 79,17 85,17 100 II.b.1.2

Continua...

103


Resultados

Continuação...

Código do

Isolado



Ss 37PR 28,20 73,58 100 I

Ss 38PR 60,97 75,22 100 II.a.1.1

Ss 39PR 71,65 86,47 100 II.b.2.1

Ss 40CE 66,01 83,04 100 II.a.1.2

Ss 41CE 90,21 90,24 100 III.a.1

Ss 42CE 65,02 77,98 100 II.a.1.2

Ss 43CE 59,30 78,06 100 II.a.1.1

Ss 44CE 64,17 78,11 100 II.a.1.2

Ss 45GO 73,28 84,36 100 II.b.2.1

Ss 46GO 48,00 84,90 100 I

Ss 47GO 71,71 80,37 100 II.b.1.1

Ss 48GO 84,38 87,52 100 II.b.1.2

Ss 49GO 86,38 86,95 100 II.b.1.2

Ss 50GO 83,75 90,67 100 II.b.1.2

Ss 51PA 59,18 73,93 100 II.a.1.1

Ss 52SP 70,82 71,56 100 II.a.2.1

Ss 53RS 68,46 70,56 100 II.a.2.1

Ss 54RS 70,87 71,05 100 II.a.2.1

Ss 55RS 57,83 71,23 100 II.a.1.1

Ss 56RS 60,84 78,93 100 II.a.1.1

Ss 57RS 61,08 74,47 100 II.a.1.1

Ss 58SP 77,56 82,35 100 II.b.1.1

Ss 59SP 74,02 79,63 100 II.b.1.1

Ss 60SP 79,12 83,91 100 II.b.1.2

Ss 61SP 88,00 88,97 100 III.a.1

Ss 62ES 81,91 83,70 100 II.b.1.1

Ss 63ES 81,60 81,86 100 II.b.1.1

Ss 64ES 81,12 81,48 100 II.b.1.1

Ss 65RJ 79,93 80,43 100 II.b.1.1

Ss 66RJ 81,85 86,52 100 II.b.1.2

Ss 67RJ 84,24 85,81 100 II.b.1.2

Ss 68RJ 73,39 75,08 100 II.a.2.1

Ss 69RJ 71,18 84,65 100 II.b.2.1

Ss 70RJ 79,55 82,57 100 II.b.1.1

Ss 71RJ 85,42 88,05 100 II.b.1.2

Ss 72RJ 82,38 85,71 100 II.b.1.2

104


Resultados

Continuação...

Código do

Isolado



Ss 73RJ 78,86 87,05 100 II.b.1.2

Ss 74RJ 85,30 85,63 100 II.b.1.2

Ss 75RJ 82,89 89,09 100 II.b.1.2

Ss 76RJ 79,44 81,59 100 II.b.1.1

Ss 77RJ 68,91 72,86 100 II.a.2.1

Ss 78RJ 81,09 86,80 100 II.b.1.2

Ss 79RJ 84,31 85,88 100 II.b.1.2

Ss 80RJ 86,25 88,16 100 II.b.1.2

Ss 81RJ 86,52 87,69 100 II.b.1.2

Ss 82RJ 80,83 83,32 100 II.b.1.1

Ss 83RJ 70,32 81,81 100 II.a.1.2

Ss 84RJ 80,06 80,25 100 II.b.1.1

Ss 85RJ 74,04 74,77 100 II.a.2.1

Ss 86RJ 80,49 81,04 100 II.b.1.1

Ss 87RJ 61,07 73,03 100 II.a.1.1

Ss 88RJ 80,77 80,80 100 II.b.1.1

Ss 89RJ 86,92 87,27 100 II.b.1.2

Ss 90RJ 79,69 82,43 100 II.b.1.1

Ss 91RJ 74,36 80,34 100 II.b.1.1

Ss 92RJ 79,60 86,23 100 II.b.1.2

Ss 93RJ 87,61 87,96 100 III.a.1

Ss 94RJ 80,59 81,52 100 II.b.1.1

Ss 95RJ 82,38 85,19 100 II.b.1.2

Ss 96RJ 78,71 88,49 100 II.b.1.2

Ss 97RJ 84,14 89,23 100 II.b.1.2

Ss 98RJ 81,79 88,30 100 II.b.1.2

Ss 99RJ 73,13 88,14 100 II.b.2.1

Ss 100RJ 81,91 86,05 100 II.b.1.2

Ss 101SP 73,79 88,81 100 II.b.2.1

Ss 102SP 84,98 85,33 100 II.b.1.2

Ss 103SP 75,90 88,46 100 II.b.2.1

Ss 104MG 71,55 87,48 100 II.b.2.1

Ss 105MG 72,98 81,85 100 II.b.1.1

Ss 106MG 88,33 88,74 100 III.a.1

Ss 107MG 68,14 82,44 100 II.a.1.2

Ss 109MG 76,26 85,16 100 II.b.2.1

105


Resultados

Continuação...

Código do

Isolado



Ss 110MG 74,13 86,37 100 II.b.2.1

Ss 111SP 71,70 85,79 100 II.b.2.1

Ss 112SP 80,98 85,65 100 II.b.1.2

Ss 113SP 76,17 92,05 100 II.b.1.2

Ss 114SP 84,33 84,64 100 II.b.1.2

Ss 115SP 74,96 82,27 100 II.b.1.1

Ss 116SP 89,17 89,59 100 III.a.1

Ss 117SP 84,21 88,21 100 II.b.1.2

Ss 118SP 79,98 80,42 100 II.b.1.1

Ss 119SP 69,98 85,24 100 II.b.2.1

Ss 120SP 74,69 86,00 100 II.b.2.1

Ss 121SP 78,36 83,69 100 II.b.1.2

Ss 122SP 68,45 80,33 100 II.a.1.2

Ss 123SP 75,72 84,54 100 II.b.2.1

Ss 124SP 76,11 89,07 100 II.b.2.1

Ss 125SP 76,76 78,48 100 II.b.1.1

Ss 126SP 85,36 88,78 100 II.b.1.2

Ss 127SP 88,98 89,53 100 III.a.1

Ss 128SP 73,93 74,07 100 II.a.2.1

Ss 129SP 86,27 88,95 100 II.b.1.2

Ss 130PE 74,84 89,25 100 II.b.2.1

Ss 131PE 84,35 91,16 100 II.b.1.2

Ss 132SP 92,88 93,01 100 III.b.1

Ss 133PE 91,23 94,89 100 III.b.1

Ss 134PE 94,11 95,04 100 III.b.2

Ss 135PE 82,09 84,90 100 II.b.1.2

Ss 136PE 79,81 81,36 100 II.b.1.1

Ss 137PE 77,67 82,73 100 II.b.1.1

Ss 138PB 83,97 85,66 100 II.b.1.2

Ss 139PB 80,19 92,25 100 II.b.1.2

Ss 140PB 85,33 85,34 100 II.b.1.2

Ss 141DF 86,42 86,63 100 II.b.1.2

Ss 143PA 75,42 81,43 100 II.b.1.1

Ss 144RS 82,53 83,29 100 II.b.1.1

Ss 145RS 64,05 81,69 100 II.a.1.2

106


Resultados

Conclusão...

Código do

Isolado



Ss 146AM 44,54 55,62 100 –

Ss 147AM 46,91 53,73 100 –

Ss 148SP 73,53 75,50 100 II.a.2.1

Ss 149RS 73,70 73,93 100 II.a.2.1

Ss 150RS 70,33 78,70 100 II.a.1.2

Ss 151RS 69,46 70,14 100 II.a.2.1

Ss 152RS 64,23 71,53 100 II.a.2.2

Ss 153RS 72,73 73,02 100 II.a.2.1

Ss 154RS 65,09 65,81 100 II.a.2.2

Ss 155RS 67,13 69,63 100 II.a.2.2

Ss 156RS 75,00 82,06 100 II.b.1.1

Ss 157RS 65,66 78,58 100 II.a.1.2

Ss 158AM 70,07 70,57 100 II.a.2.1

Ss 159JPO 85,49 86,77 100 II.b.1.2

Ss 160MEX 76,09 79,09 100 II.b.1.1

Ss 161MEX 73,43 87,40 100 II.b.2.1

Ss 162MEX 81,28 81,60 100 II.b.1.1

Ss 163PER 83,84 91,46 100 II.b.1.2

Ss 164PER 78,91 89,51 100 II.b.1.2

Ss 167PER 81,87 87,12 100 II.b.1.2

Ss 168PER 80,63 89,57 100 II.b.1.2

FMR 8309RJ 79,22 88,41 100 II.b.1.2

FMR 8314RJ 75,22 80,59 100 II.b.1.1

FMR 8600ESP 95,57 95,59 100 III.b.2

FMR 8595ESP 91,82 93,94 100 III.b.1

FMR 9108MEX 93,41 94,04 100 III.b.1

FMR 9107MEX 94,25 96,00 100 III.b.2

FMR 8939UK 81,31 88,60 100 II.b.1.2

FMR 8803CHI 68,97 91,91 100 II.b.2.1

FMR 6618USA 86,90 90,15 100 III.a.1

FMR 9018USA 67,67 92,39 100 II.b.2.1

CBS 937.72AFR 43,12 94,03 100 I

Média (n=172) 75,53 ± 10,24 84,88 ± 6,61 100 ± 0,00 –

107


Resultados

A análise de clusterização utilizando a distância Euclidiana revelou a

presença de três grupos principais (cluster I, II e III) com taxas de inibição do

crescimento distintas (Figura 17).

O cluster I é formado por cinco cepas (2,94%), sendo três do estado do

Paraná (Ss 20, Ss 35 e Ss 37), uma cepa de Goiás (Ss 46) e uma cepa da África

(CBS 937.72), as quais são fracamente inibidas à temperatura de 35 ºC e

moderadamente inibidas à temperatura de 37 ºC. A porcentagem de inibição do

crescimento do cluster I em relação ao diâmetro obtido para a temperatura de 30 ºC

foi de 44,01 ± 8,34; 83,27 ± 7,19; e 100 ± 0,00 nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC

respectivamente.

O cluster II é formado por 148 cepas (87,05%), com representantes da

China (0,67%, n=1), Estados Unidos (0,67%, n=1), Japão (0,67%, n=1), México

(2,02%, n=3), Peru (2,70%, n=4), Reino Unido (0,67%, n=1) e os estados brasileiros

do Amazonas (0,67%, n=1), Ceará (2,70%, n=4), Espírito Santo (2,02%, n=3), Goiás

(3,37%, n=5), Minas Gerais (8,78%, n=13), Mato Grosso (0,67%, n=1), Pará (1,35%,

n=2), Paraíba (2,02%, n=3), Pernambuco (3,37%, n=5), Piauí (0,67%, n=1), Paraná

(10,81%, n=16), Rio de Janeiro (25%, n=37), Rio Grande do Sul (12,83%, n=19),

São Paulo (17,56%, n=26) além do Distrito Federal (0,67%, n=1) as quais são

moderadamente inibidas à temperatura de 35 e 37 ºC. Dentre as amostras que

compõem o cluster II, 73 cepas (49,32%) foram isoladas de casos de esporotricose

humana cutânea fixa, 54 (36,48%) foram isoladas de casos de esporotricose

humana linfocutânea, 1 (0,67%) de esporotricose humana extracutânea, 2 (1,35%)

de esporotricose humana disseminada, 3 (2,02%) de esporotricose humana (sem

dados clínicos), 10 (6,75%) de esporotricose felina, 1 (0,67%) de esporotricose

canina e 4 (2,70%) isolados ambientais. A porcentagem de inibição do crescimento

do cluster II em relação ao diâmetro (em mm) obtido para a temperatura de 30 ºC foi

108


Resultados

de 74,88 ± 7,57; 84,04 ± 6,31 e 100 ± 0,00 nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC,

respectivamente.

O cluster III é formado por 17 cepas (10%), com representantes da Espanha

(11,76%, n=2), México (11,76%, n=2), Estados Unidos (5,88%, n=1) e os estados

brasileiros do Ceará (5,88%, n=1), Minas Gerais (17,64%, n=3), Pernambuco

(11,76%, n=3), Paraná (5,88%, n=1), Rio de Janeiro (5,88%, n=1) e São Paulo

(23,52%, n=3) as quais são fortemente inibidas à temperatura de 35 e 37 ºC.

Dentre as amostras que compõem o cluster III, 4 cepas (23,52%) foram isoladas de

casos de esporotricose humana cutânea fixa, 7 cepas (41,17%) foram isoladas de

casos de esporotricose humana linfocutânea, 3 (17,64%) de esporotricose humana

(sem dados clínicos) e 3 cepas (17,64%) de origem ambiental. A porcentagem de

inibição do crescimento do cluster III em relação ao diâmetro obtido para a

temperatura de 30 ºC foi de 90,45 ± 3,24; 92,64 ± 2,93 e 100 ± 0,00 mm nas

temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.

A análise de variância para a inibição do crescimento vegetativo nas

diferentes temperaturas de incubação foi considerada extremamente significante (p

< 0,0001). As comparações entre os clusters I, II e III para a inibição a 35ºC foi

considerada signigicativas pelo teste de Tukey (p<0,001). A 37 ºC, o cluster I e II

não diferem estatísticamente (p>0,05). O cluster I difere estatisticamente do cluster

III (p<0,01) e o cluster II apresenta diferença estatística significativa quando

comparado ao cluster III (p<0,001) pelo teste de Tukey.

109


Resultados

Figura 17: Análise de clusterização baseado na inibição do crescimento vegetativo aos 21 dias de incubação em

meio PDA, apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas

temperaturas de 35, 37 e 40ºC em relação à temperatura de 30 ºC, de acordo com o coeficiente Euclidiano.

110


Resultados

Os isolados brasilieros (n=153) do complexo S. schenckii são inibidos em

média 75,00 ± 9,85%; 84,32 ± 6,57% e 100 ± 0,00% aos 21 dias de incubação nas

temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, respectivamente, em relação ao diâmetro obtido

para a temperatura de incubação de 30 ºC. Os dados referentes à inibição do

crescimento vegetativo em função da temperatura de incubação dos isolados

separados por região geográfica estão descritos abaixo na Tabela 14.

Tabela 14: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo em meio de cultura

PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo

com a origem geográfica do isolado.

Localização Geográfica Inibição do crescimento (%) em relação à

30ºC:

Região Estado (Espécimes) 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Sul

(n=39)

Rio Grande do Sul (19) 69,39 ± 6,35 77,01 ± 7,12 100 ± 0,00

Paraná (20) 65,48 ± 12,28 86,77 ± 7,45 100 ± 0,00

Sudeste

(n=87)

São Paulo (30) 78,89 ± 6,23 84,86 ± 5,21 100 ± 0,00

Rio de Janeiro (38) 79,59 ± 5,53 83,91 ± 4,44 100 ± 0,00

Minas Gerais (16) 72,48 ± 9,63 88,66 ± 5,18 100 ± 0,00

Espírito Santo (3) 81,54 ± 0,32 82,35 ± 0,96 100 ± 0,00

Centro-

Oeste

(n=8)

Mato Grosso (1) 71,55 ± 0,00 87,48 ± 0,00 100 ± 0,00

Goiás (6) 74,58 ± 13,14 85,80 ± 3,17 100 ± 0,00

Distrito Federal (1) 86,42 ± 0,00 86,63 ± 0,00 100 ± 0,00

Nordeste

(n=16)

Ceará (5) 68,94 ± 10,87 81,48 ± 4,78 100 ± 0,00

Pernambuco (7) 83,44 ± 6,52 88,47 ± 5,18 100 ± 0,00

Piauí (1) 63,68 ± 0,00 96,86 ± 0,00 100 ± 0,00

Paraíba (3) 83,16 ± 2,17 87,75 ± 3,18 100 ± 0,00

Norte

(n=3)

Amazonas (1) 70,07 ± 0,00 70,57 ± 0,00 100 ± 0,00

Pará (2) 67,30 ± 8,11 77,68 ± 3,74 100 ± 0,00

Média (n=153) 75,00 ± 9,85 84,32 ± 6,57 100 ± 0,00

111


Resultados

Quando os resultados de inibição do crescimento foram avaliados levendo-

se em consideração a similariade de inibição obtida de acordo com a origem

geográfica observou-se três clusters distintos (Figura 18). Os isolados do complexo

S. schenckii apresentam comportamento de termotolerância distintos, independente

da região de origem.

O cluster I é formado por dois subgrupos (I.a e I.b). O subgrupo I.a é

representado pelo estado do Amazonas. O subgrupo I.b é formado pelos estados do

Rio Grande do Sul, Pará e Ceará. O cluster II, compreende os subgrupos II.a e II.b.

O subgrupo II.a é composto pelos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito

Santo. O subgrupo II.b é formado pelos estados da Paraíba, Pernambuco e o Distrito

Federal. O cluster III é formado pelos subgrupos III.b e III.a. O subgrupo III.a é

formado pelos estados de Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais e Paraná. O subgrupo

III.b é representado pelo estado do Piauí.

112


Resultados

Figura 18: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo apresentado

pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em

relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com o estado

de origem das cepas brasileiras. Distância Euclidiana (método de ligação complete).

A inibição do crescimento foi avaliada levando-se em consideração a forma

clínica apresentada pelo paciente, a origem animal ou ambiental. Os dados

referentes à inibição do crescimento vegetativo agrupados de acordo com a fonte

estão descritos na Tabela 15.

113


Resultados

Tabela 15: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA

aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a

origem do isolado e a forma clínica da doença desenvolvida no

hospedeiro.

Origem da amostra Inibição do crescimento (%) em relação

à 30ºC:

Hospedeiro Forma Clínica/Fonte 35 ºC 37 ºC 40 ºC

Ori

ge

m C

lín

ica

Humana

(n=145)

Cutânea fixa (80) 75,69 ± 10,04 84,73 ± 5,64 100 ± 0,00

Linfocutânea (62) 75,62 ± 9,83 85,31 ± 6,29 100 ± 0,00

Disseminada (2) 68,64 ± 3,87 91,27 ± 3,68 100 ± 0,00

Extracutânea (1) 69,98 ± 0,00 85,24 ± 0,00 100 ± 0,00

Animal

(n=11)

Esporotricose felina (10) 69,12 ± 5,21 76,07 ± 7,92 100 ± 0,00

Esporotricose canina (1) 69,46 ± 0,00 70,14 ± 0,00 100 ± 0,00

Ambiental (n=7) Solo e vegetal (7) 84,16 ± 8,05 89,75 ± 4,42 100 ± 0,00

Média1 (n=163) 75,46 ± 9,88 84,63 ± 6,57 100 ± 0,00

1Nesta análise não foram incluídos os isolados FMR 8309, FMR 8314, FMR 8600, FMR 8595, FMR 6618, FMR 9018 e CBS

937.72 porque não tínhamos em mãos os dados referentes à forma clínica destas cepas.

A análise de clusterização utilizando a distância Euclidiana revelou dentre os

173 isolados a presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas de inibição do

crescimento distintas (Figura 19) levando-se em consideração a variação obtida para

cada categoria.

O cluster I é formado pelos isolados ambientais (n=7; 4,29%), os quais são

inibidos em média 84,16% a 35 ºC e 89,75 % a 37 ºC. O cluster II é formado pelas

cepas de hospedeiro humano (n=145; 88,95%) as quais são inibidas em média

75,52% a 35 ºC e 85,07% a 37 ºC. O cluster III é representado pelas cepas isoladas

de casos de esporotricose animal (n=11; 6,74%), as quais são inibidas 69,16% em

média a 35 ºC e 75,53% a 37 ºC. As cepas de origem animal são mais

termotolerantes do que as cepas de orgiem humana e ambiental. As cepas de

origem ambiental foram mais sensíveis à ação da temperatura quando comparados

114


Resultados

as cepas de esporotricose humana. Os isolados provenientes de esporotricose

animal foram mais resistentes ao aumento da temperatura in vitro quando

comparados com os isolados de origem ambiental e humana.

Figura 19: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo apresentado

pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em

relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com a forma

clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem ambiental. Distância Euclidiana

(método de ligação complete).

Após a taxonomia polifásica das cepas de Sporothrix spp., os isolados foram

agrupados de acordo com a espécie filogenética e, em seguida, calculou-se a

porcentagem de inibição do crescimento nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em

relação ao diâmetro obtido para o crescimento das cepas quando incubadas a 30 ºC.

Os dados referentes à inibição do crescimento vegetativo levando-se em

consideração a espécie filogenética estão descritos na Tabela 16.

115


Resultados

Tabela 16: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA

aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a

espécie filogenética.

Código do Isolado Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:

35 ºC 37 ºC 40 ºC

S. brasiliensis (n=73) 72,60 ± 9,53 81,32 ± 6,78 100 ± 0,00

S. schenckii (n=84) 76,58 ± 8,93 86,76 ± 4,85 100 ± 0,00

S. globosa (n=5) 91,65 ± 3,22 92,35 ± 3,27 100 ± 0,00

S. mexicana (n=5) 91,23 ± 3,57 93,82 ± 1,65 100 ± 0,00

S. albicans (n=2) 75,14 ± 6,17 90,25 ± 1,65 100 ± 0,00

S. luriei (n=1) 43,12 ± 0,00 94,03 ± 0,00 100 ± 0,00

Média (n=170) 75,53 ± 10,24 84,88 ± 6,61 100 ± 0,00

A análise de clusterização das espécies filogenéticas com base nos

resultados de inibição de crescimento nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC utilizando

a distância Euclidiana revelou a presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas

de inibição do crescimento distintas (Figura 20).

O cluster I é formado pelas espécies S. globosa e S. mexicana as quais

apresentam o mesmo perfil de inibição nas temperaturas avaliadas. Estas espécies

apresentaram inibição no crescimento vegetativo superior a 90%.

O cluster II é formado pelas espécies S. brasiliensis, S. albicans e S.

schenckii, com comportamento mais heterogêneo nas temperaturas de incubação

avaliadas. A taxa de inibição do crescimento vegetativo variou entre 70 e 90%.

O cluster III compreende a espécie filognética S. luriei, a qual é pouco

inibida na temperatura de 35 ºC (43,12%), diferenciando-se fisiologicamente das

demais espécies filogenéticas estudadas.

116


Resultados

Figura 20: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo nas

temperaturas de 35, 37 e 40 ºC (em relação ao diâmetro obtido na temperatura de 30

ºC) apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii, de

acordo com o coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).

A figura 21 sumariza os resultados referentes à inibição do crescimento dos

isolados estudados do complexo S. schenckii, levando-se em consideração três

variáveis para agrupamento: i) origem geográfica (Figura 21 A e B); ii) origem clínica

ou substrato (Figura 21 C e D) e; iii) espécie filogenética (Figura 21 E e F). A análise

estatística foi realizada com base no teste de ANOVA, seguida do teste de Tukey

para a comparação de médias (GraphPad Prism v. 5.00, San Diego California USA).

Foram consideradas estatisticamente significativas as comparações em que p <

0.05. As diferenças estatísticas significativas estão anotadas diretamente na Figura

21.

117


Resultados

Figura 21: Inibição do crescimento dos isolados do complexo Sporothrix schenckii de acordo com a

origem geográfica dos isolados brasileiros (A e B), a origem humana (fixa e linfocutânea),

animal e ambiental (C e D) e a espécie filognética (E e F) a 35º e 37º C em relação a

temperatura de 30 ºC (21 dias de incubação). SE= Sudeste; S= Sul; CO= Centro-Oeste;

N= Norte; NE= Nordeste. (Barras: Valores máximos e mínimos).

118


Resultados

4.3 Características microscópicas

Os tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas de Sporothrix

spp. foram avaliados através do microcultivo em meio de cultura PDA, incubados a

temperatura ambiente, durante 7-10 dias. Os caracteres morfológicos foram

empregados como dados taxonômicos para a classificação das cepas estudadas. A

figura 22 ilustra os principais tipos morfológicos encontrados para as cepas de

Sporothrix spp. Dentre estes se destacam os conídios globosos demácios (Figura

22A), triangulares demácios (Figura 22B), subglobosos hialinos (Figura 22C) e

circulares pigmentados (Figura 22D).

Figura 22: Tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas brasileiras do complexo

Sporothrix schenckii. A) Conídios globosos de S. globosa (Ss06) diam.: 3,18 µm; B)

Conídios tringulares de S. schenckii (Ss 58) diam.: 3,2 µm; C) Conídios obovóides de S.

mexicana (Ss 132) diam.: 3,13 µm; D) Conídios circulares de S. brasiliensis (Ss 10)

diam.: 2,6 µm. Aumento 400X. Quadrantes em destaque 1000X. Barra: 3 µm.

119


Resultados

4.4 Perfil bioquímico de assimilação de fontes de carbono

Conídios de 170 cepas de Sporothrix spp., com 10 a 14 dias de cultivos,

foram utilizados em ensaios de assimilação de fontes de carbonos (glicose, rafinose,

ribitol e sacarose), sendo realizadas leituras no quinto e décimo dia de incubação

(Figura 23). Os resultados obtidos para os dois tempos de leitura estão descritos na

Tabela 17.

Após 5 dias de incubação, 100% das cepas utilizadas foram capazes de

assimilar glicose como única fonte de carbono. Os açúcares rafinose, ribitol e

sacarose foram assimilados de maneira distinta pelos isolados. O tempo de

incubação de 5 dias não permitiu detectar um perfil de assimilação eficiente cujas

características fossem capazes de discriminar bioquimicamente entre as espécies do

complexo S. schenckii. Os resultados satisfatórios de assimilação foram encontrados

no décimo dia de incubação.

Figura 23: Assimilação das fontes de carbono glicose (controle positivo), rafinose, ribitol e sacarose

após 10 dias de incubação a 25 ºC. O isolado Ss54 é capaz de assimilar apenas glicose e

fracamente ribitol, enquanto o isolado Ss131 é capaz de assimilar as quatro fontes de

carbono avaliadas. O controle negativo é representado apenas pelos conídios inoculados

(2 x 105 a 2 x 10

6 UFC/mL) em meio YNB sem adição de fontes de carbono.

120


Resultados

Tabela 17: Resultados das provas fisiológicas de assimilação das fontes de carbono

glicose, rafinose, ribitol e sacarose para os conídios das cepas do

complexo S. schenckii, após 05 e 10 dias de incubação a 25 ºC.

Código do Isolado

Tempo de incubação

05 dias 10 dias

Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster

Ss 01SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 02RS + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 03RS + - - + I.b + + + + II.b.1.1.2

Ss 04RS + - - + I.b + - + + II.b.2

Ss 05MG + - + - II.b + - + + II.b.2

Ss 06MG + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2

Ss 07MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 08MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 09MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 10MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 11MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 12MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 13MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 14MG + - - - II.a + - + - II.a

Ss 15MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 16PI + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 17PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 19PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 20PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 21PR + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2

Ss 22PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 24PR + - - + I.b + + + + II.b.1.1.2

Ss 25PR + - - - II.a + - + - II.a

Ss 26PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 27PR + - - - II.a + - + - II.a

Ss 28PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 30PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 31PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 32PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 33PR + - + - II.b + - + - II.a

Ss 34PR + - + - II.b + - + - II.a

Ss 35PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-) Continua...

121


Resultados

Continuação...

Código do

Isolado


05 dias 10 dias


Ss 36PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 37PR + - - - II.a + - + - II.a

Ss 38PR + - - - II.a + - + - II.a

Ss 39PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 40CE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 41CE + - - + I.b + - + + II.b.2

Ss 42CE + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 43CE + - - - II.a + - + - II.a

Ss 44CE + - + - II.b + - + - II.a

Ss 45GO + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 46GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 47GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 48GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 49GO + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2

Ss 50GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 51PA + - + - II.b + - + - II.a

Ss 52SP + - - - II.a + - + - II.a

Ss 53RS + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 54RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 55RS + - - - II.a + - + - II.a

Ss 56RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 57RS + - - - II.a + - + - II.a

Ss 58SP + - - + I.b + + - + II.b.1.2

Ss 59SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 60SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 61SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 62ES + + + - I.a.2.1.1 + + + - II.b.1.1.1

Ss 63ES + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 64ES + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 65RJ + - - - II.a + - - - I

Ss 66RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 67RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 68RJ + - + - II.b + - + - II.a

Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-)

122


Resultados

Continuação...

Código do Isolado


05 dias 10 dias


Ss 69RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 70RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 71RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 72RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 73RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 74RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 75RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 76RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 77RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 78RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 79RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 80RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 81RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 82RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 83RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 84RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 85RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 86RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 87RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 88RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 89RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 90RJ + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2

Ss 91RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 92RJ + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 93RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 94RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 95RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 96RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 97RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 98RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 99RJ + - + - II.b + - + - II.a

Ss 100RJ + - - - II.a + - + - II.a

Ss 101SP + - - - II.a + - + - II.a


123


Resultados

Continuação...

Código do Isolado


05 dias 10 dias


Ss 102SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 103SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 104MT + - - - II.a + - + - II.a

Ss 105MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 106MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 107MG + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2

Ss 109MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 110MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 111SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 112SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 113SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 114SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 115SP + - - - II.a + + + + II.b.1.1.2

Ss 116SP + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 117SP + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 118SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 119SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 120SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 121SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 122SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 123SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 124SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 125SP + - + - II.b + + + - II.b.1.1.1

Ss 126SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 127SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 128SP + - - - II.a + - + - II.a

Ss 129SP + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 130PE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 131PE + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 132SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 133PE + - + - II.b + - + + II.b.2

Ss 134PE + - - - II.a + - + + II.b.2

Ss 135PE + - - + I.b + + - + II.b.1.2


124


Resultados

Conclusão...

Código do Isolado


05 dias 10 dias


Ss 136PE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 137PE + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 138PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 139PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 140PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 141DF + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 143PA + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 144RS + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 145RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 146AM + + + + – + + + + –

Ss 147AM + + + + – + + + + –

Ss 148SP + - - - II.a + - + - II.a

Ss 149RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 150RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 151RS + - - - II.a + - + - II.a

Ss 152RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 153RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 154RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 155RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 156RS + - + - II.b + - + - II.a

Ss 157RS + - - - II.a + - + - II.a

Ss 158AM + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2

Ss 159JPO + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2

Ss 160MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 161MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 162MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 163PER + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 164PER + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2

Ss 167PER + - - + I.b + + - + II.b.1.2

Ss 168PER + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2


125


Resultados

Os resultados de assimilação, positivo e negativo, foram transformados em

dados binários e empregados para avaliar a similaridade entre os perfis de

assimilação entre as cepas de acordo com o coeficiente de Jaccard. Os

dendogramas baseados nos resultados de 5 e 10 dias de incubação estão descritos

nas figuras 24 e 25, respectivamente.

Aos 5 dias de incubação foi possível distinguir entre dois cluster, os quais

são separados principalmente pela capacidade de assimilar o açúcar sacarose

(Figura 24). Os conídios das cepas pertencentes ao cluster I (n=100, 58,82%,

subgrupos Ia e Ib) são capazes de assimilar tal açúcar após 5 dias de incubação

(com exceção da cepa Ss 62, subgrupo I.a.2.1.1). O subgrupo I.a é formado por 87

cepas (51,17%) as quais compreendem os subgrupos I.a.1 e I.a.2. O subgrupo I.a.1

possui 13 cepas (7,64%) as quais são capazes de assimilar glicose, rafinose e

sacarose aos 5 dias de incubação. O subgrupo I.a.2 é formados pelos grupos

menores I.a.2.1 (subgrupos I.a.2.1.1 e I.a.2.1.2) e I.a.2.2. O subgrupo I.a.2.1.1

compreende a cepa Ss 62 (0,58%), como perfil glicose, rafinose e ribitol positivo e

sacarose negativo, enquanto que o subgrupo I.a.2.1.2 é composto por 64 cepas

(37,64%) as quais são capazes de assimilar as quatro fontes de carbono avaliadas

após 5 dias de incubação. O subgrupo I.a.2.2 possui 9 representantes (5,29%), os

quais são capazes de assimilar glicose, ribitol e sacarose neste período de

incubação. Dentre as 11 cepas que compõem o subgrupo I.b (6,47%), apenas os

açúcares glicose e sacarose são assimilados até o 5 dia de incubação.

As cepas do cluster II (n=72, 48,82%) são incapazes de assimilar sacarose

até o quinto dia de incubação a 25 ºC. O cluster II compreende os subgrupos II.a

(n=38, 22,35%) e II.b (n=34, 20%). Os conídios das cepas que compõem o subgrupo

II.a foram capazes de assimilar apenas glicose como única fonte de carbono até o

quinto dia de incubação. As cepas do subgrupo II.b foram capazes de assimilar além

da glicose, o açúcar ribitol como única fonte de carbono (5 dias, 25ºC).

126


Resultados

Figura 24: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes de

carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii, após 05 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC.

Coeficiente de Jaccard (método de ligação average).

127


Resultados

Os resultados de assimilação de fontes de carbono referentes a 10 dias de

incubação também foram utilizados para a construção de um dendograma de

similaridade baseado no coeficiente de Jaccard (Figura 25). Aos 10 dias de

incubação foi possível observar novamente a presença de dois clusters principais.

O cluster I é formado por duas cepas (1,17%), Ss 65 e FMR 8309 (cepa tipo

de Sporothrix brasiliensis), ambas provenientes da cidade do Rio de Janeiro. Os

conídios produzidos por estas cepas não foram capazes de assimilar nenhuma das

fontes de carbono testadas com exceção da glicose.

O cluster II é formado por 168 cepas (98,82%), divididas em subgrupos que

apresentaram os mais distintos perfis de assimilação de fontes de carbono. O

subgrupo II.a é formado por 64 cepas (37,64%). Dentre as cepas que compõem o

subgrupo II.a 45,31% e 21,87% são originárias dos estados do Rio de Janeiro (n=29)

e Rio Grande do Sul (n=14), respectivamente. As regiões sul (n=20, 31,25%) e

sudeste (n=41, 64,06%) respondem por 95,31% das cepas deste grupo. As cepas

deste subgrupo apresentam como perfil de assimilação os açúcares glicose e ribitol

apenas. A assimilação dos açúcares rafinose e sacarose foi considerada negativa

aos 10 dias de incubação. O subgrupo II.a contem as cepas tipo de Sporothrix

brasiliensis FMR 8314 e Sporothrix luriei FMR 9280 (CBS 937.72), ambas descritas

por Marimon et al. 2007 e 2008, respectivamente.

O subgrupo II.b é formado por 103 cepas (60,58%) com distribuição

geográfica mais heterogênea, abrangendo os representantes de todos os estados e

países amostrados neste trabalho. Compreendem o subgrupo II.b os subgrupos

II.b.1 (n=89, 52,35%) e II.b.2 (n=12, 7,05%).

Integram o subgrupo II.b.1, os clusters II.b.1.1 e II.b.1.2. O subgrupo II.b.1.1

(n=83, 48,82%) por sua vez é subdividido em dois subgrupos menores: II.b.1.1.1

com duas cepas (1,17%) capazes de assimilar glicose, rafinose e ribitol aos 10 dias

de incubação e II.b.1.1.2 (n=81, 47,64%), cujas cepas são capazes de assimilar

128


Resultados

todas as fontes de carbono avaliadas neste período de incubação. As cepas tipo de

Sporothrix schenckii, FMR 9018 e FMR 6618, descritas por Marimon et al. (2007)

estão dentro do cluster II.b.1.1.2. O subgrupo II.b.1.2 (n=8, 4,70%) é formado por

cepas cujos conídios são capazes de assimilar glicose, rafinose e sacarose aos 10

dias de incubação. As cepas tipo de Sporothrix mexicana, FMR 9107 e FMR 9108,

descritas por Marimon et al. (2007) estão dentro deste subgrupo.

As cepas do subgrupo II.b.2 possuem o perfil de assimilação positivo dos

açúcares glicose, ribitol e sacarose aos 10 dias de incubação. As cepas tipo de

Sporothrix globosa FMR 8595 e FMR 8600 assim como as cepas tipo de S. albicans

FMR 8803 e FMR 8939 descritas por Marimon et al. (2007) estão inclusas neste

subgrupo.

Algumas cepas apresentaram mudanças nos perfis de assimilação entre o

quinto e o décimo dia de incubação. Alguns microrganismos foram mais fastidiosos

para assimilar tais fontes e devido a isto optou-se por empregar os resultados

referentes ao décimo dia de incubação, como já havia sido proposto por Marimon et

al. (2007), como dados taxonômicos para as cepas do complexo S. schenckii. A

figura 26 demonstra a dinâmica de assimilação apresentada pelas 170 cepas do

complexo Sporothrix schenckii utilizadas neste trabalho. Aos cinco dias de incubação

a porcentagem de assimilação positiva foi de 100%, 45,88%, 63,52% e 57,05% para

os açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose, respectivamente. A glicose (100%),

ribitol (94,11%), sacarose (59,41%) e rafinose (53,52%) foram nesta ordem as fontes

mais utilizadas aos 10 dias de incubação.

129


Resultados

Figura 25: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes de

carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii, após 10 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC.

Coeficiente de Jaccard (método de ligação average).

130


Resultados

Positivo Negativo

Figura 26: Porcentagem de assimilação dos açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose pelas cepas

do complexo Sporothrix schenckii (n=170) após 5 e 10 dias de incubação.

4.5 Taxonomia molecular

O DNA genômico foi extraído diretamente de 170 culturas puras do fungo

Sporothrix spp. (Figura 27) em meio sólido. Utilizando o par de iniciadores CL1 e

CL2A fomos capazes de amplificar um fragmento de aproximadamente 800 pb

referente ao éxon 3-4 ou 3-5 do gene da calmodulina (Figura 28).

As sequências de nucleotídeos senso e anti-senso geradas a partir do

amplicon da calmodulina para os isolados do complexo S. schenckii foram alinhadas

e as sequências consenso obtidas estão em fase de depósito no banco de dados de

sequência genética GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). As sequências

consenso foram utilizadas para a comparação com as sequências depositadas no

Genbank. A figura 29 ilustra o polimorfismo de nucleotídeos encontrados nas

sequências consensos entre os isolados brasileiros Ss 01, Ss 06, Ss 54 e Ss 132.

Os resultados referentes à taxonomia molecular estão descritos na Tabela 18.

131


Resultados

Figura 27: Extração de DNA de Sporothrix schenckii (1). Gel de agarose 0,8%, 100 v, 60 minutos. À

esquerda, padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen, USA).

Figura 28: Amplicon do fragmento do gene da calmodulina (éxon 3-4 ou 3-5), pela técnica de PCR,

de cepas representativas das espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii. (1)

S. schenckii (Ss 01); (2) S. brasiliensis (Ss 54); (3) S. globosa (Ss 06); (4) S. mexicana (Ss

131); (5) controle negativo. Gel de agarose 1,2%, 80 v, 60 minutos. À esquerda padrão de

peso molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek, Canadá).

132


Resultados

Figura 29: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento do gene da calmodulina das espécies do complexo Sporothrix schenckii. Os sítios

destacados em azul demonstram o polimorfismo da sequência comparada entre as espécies S. schenckii (Ss01), S. brasiliensis (Ss54), S. globosa

(Ss06) e S. mexicana (Ss132) representadas no Brasil. Software CLC Sequence Viewer 5, versão 5.1.

133


Resultados

Tabela 18: Taxonomia molecular dos isolados do complexo Sporothrix schenckii

baseados na comparação da sequência de nucleotídeos entre o éxon

3-4 e 3-5 do gene da calmodulina.

Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)

Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade

Ss 01SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 99% 99%

Ss 02RS S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%



Ss 05MG S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 99%

Ss 06MG S. globosa FMR 8598 Espanha 98% 99%







Ss 13MG S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%



Ss 16PI S. schenckii FMR 8677 Argentina 97% 95%

Ss 17PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%




Ss 22PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 99% 99%


Ss 25PR S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%










Continua...

134


Resultados

Continuação...







Ss 40CE S. schenckii FMR 8608 Peru 100% 99%

Ss 41CE S. globosa FMR 8598 Espanha 99% 100%

Ss 42CE S. schenckii FMR 8608 Peru 96% 99%

Ss 43CE S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 100%

Ss 44CE S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 100%

Ss 45GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 97%




Ss 49GO S. globosa FMR 8598 Espanha 99% 100%


Ss 51PA S. brasiliensis IPEC 17920 Rio de Janeiro 98% 95%

Ss 52SP S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%

Ss 53RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 100%





Ss 58SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%



Ss 61SP S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%

Ss 62ES S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 98% 99%

Ss 63ES S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%

Ss 64ES S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%

Ss 65RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%






135


Resultados

Continuação...





Ss 73RJ S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%


Ss 75RJ S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%



Ss 78RJ S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%


Ss 80RJ S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%










Ss 90RJ S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 100%














Ss 104MT S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%

Ss 105MG S. schenckii FMR 8608 Peru 100% 98%


136


Resultados

Continuação...





Ss 110MG S. schenckii FMR 8608 Peru 98% 98%












Ss 122SP S. schenckii FMR 8608 Peru 96% 99%








Ss 130PE S. schenckii CBS 359.36 EUA 93% 99%

Ss 131PE S. mexicana FMR 9108 México 75% 100%



Ss 134PE S. schenckii CBS 359.36 EUA 100% 95%

Ss 135PE S. schenckii FMR 8678 Argentina 95% 99%



Ss 138PB S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%

Ss 139PB S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 98%

Ss 140PB S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%

Ss 141DF S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 92% 99%

Ss 143PA S. schenckii CBS 359.36 EUA 98% 99%

Ss 144RS S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%

137


Resultados

Continuação...




Ss 146AM B. proliferans – – – –

Ss 147AM B. proliferans – – – –











Ss 158AM S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 98%

Ss 159JPO S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%

Ss 160MEX S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 99%

Ss 161MEX S. schenckii CBS 359.36 EUA 93% 100%

Ss 162MEX S. schenckii FMR 8608 Peru 98% 99%

Ss 163PER S. schenckii IHEM 15499 Peru 96% 100%



Ss 168PER S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 99% 99%

De acordo com os dados moleculares identificamos 82 S. schenckii, 71 S.

brasiliensis, 3 S. globosa e 3 S. mexicana. Dois isolados (Ss 146 e Ss 147),

recebidos como S. schenckii e morfologicamente semelhantes a S. schenckii foram

classificados como Blastobotrys proliferans Marvanová (1976), sinônimo B.

navarrensis Sesma & C. Ramirez (1978) de acordo com a sequência do gene ITS

(Internal Transcriber Spacer) utilizando o par de iniciadores ITS1 e ITS4. A

sequência de nucleotídeos do amplicon da calmodulina utilizando os iniciadores

CL1A e CL2 não apresentou homologia significativa (< 90%) com as sequências de

138


Resultados

Sporothrix spp. depositadas no GenBank. O gene ITS figura entre os mais utilizados

na taxonomia molecular de espécies fúngicas e deste modo escolhemos este

marcador para a taxonomia das espécies não pertencentes ao gênero Sporothrix.

Dentre os isolados de S. brasiliensis, 83,09% (n=59), apresentam entre 98-

100% de homologia com a sequência da calmodulina do isolado IPEC 16490. Estes

isolados foram obtidos de uma área epidêmica de esporotricose na cidade do Rio de

Janeiro, além dos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul.

Dentre os 82 isolados molecularmente classificados como S. schenckii,

aproximadamente 86,58% (n=71) apresentam alta similaridade (98-100%) com

isolados provenientes de países da América do Sul como Argentina (cepas FMR

8677 e FMR 8678; n=36, 43,9%), Colômbia (cepa IHEM 3774; n=22, 26,82%) e Peru

(cepas FMR 8608, IHEM 15499 e IHEM 15511; n=13, 15,85%). Onze isolados

(13,41%) apresentam similaridade com a cepa CBS 359.36 proveniente dos Estados

Unidos.

Os três isolados de S. globosa apresentam entre 99 e100% de similaridade

com as cepas da Espanha FMR 8598, assim como os três isolados de S. mexicana

apresentam 100% de similaridade com os dois isolados mexicanos ambientais FMR

9107 e FMR 9108, descritos por Marimon e colaboradores (2007).

4.6 Taxonomia polifásica

A taxonomia polifásica do complexo S. schenckii foi realizada levando-se em

consideração os dados morfo-fisiológicos e moleculares obtidos nos ensaios de

microcultivo, morfometria, crescimento vegetativo e sequenciamento de ácidos

nucléicos.

Foram encontrados alguns resultados divergentes quando comparamos a

classificação baseada na taxonomia clássica e molecular. Os principais aspectos

139


Resultados

que influenciaram esta divergência estão relacionados a três fatores: i) aos valores

de diâmetro da colônia após 21 dias de incubação a 30 ºC como característica chave

para a distinção entre as espécies S. schenckii e S. mexicana (Ss 36, Ss 60, Ss 61,

Ss 75, Ss 80, Ss 110, Ss 114, Ss 117, Ss 120, Ss 121, Ss 123, Ss 124, Ss 127 e Ss

141); ii) a assimilação positiva de sacarose para 5 isolados de Sporothrix spp.

classificados molecularmente como S. brasiliensis (Ss 05, Ss 53, Ss 67, Ss 92 e Ss

107); e iii) a ausência de assimilação de rafinose para o isolado Ss 133 de S.

mexicana.

Com exceção das cepas Ss 67 e Ss 92, os demais isolados classificados

molecularmente como S. brasiliensis e que foram capazes de assimilar o açúcar

sacarose foram coletados de regiões geograficamente distantes da área epidêmica

na cidade do Rio de Janeiro, como por exemplo os estados de Minas Gerais (Ss 05

e Ss 107) e Rio Grande do Sul (Ss 53).

As características fenotípicas observadas para a descrição da espécie

filogenética S. brasiliensis por Marimon et al. (2007) e proposição da chave

dicotômica (Marimon et al. 2008) é baseada na observação do desempenho em

testes morfo-fisiológicos de um grupo geograficamente restrito e de uma área

epidêmica no Brasil. As cepas utilizadas por Marimon et al. (2006, 2007) são

provenientes de casos clínicos de esporotricose de pacientes atendidos no Instituto

de Pesquisa Evandro Chagas (IPEC), na cidade do Rio de Janeiro. Possivelmente, o

número amostral avaliado não expresse a real diversidade da população de S.

brasiliensis ao longo do território brasileiro.

Até o presente momento, esta descrito na literatura a existência de apenas

duas cepas de S. mexicana. Nossos dados moleculares indicam que os isolados Ss

131, Ss132 e Ss 133 pertencem a espécie S. mexicana, porém nossos dados

fenotípicos são discordantes em dois aspectos: i) o isolado Ss 131 não foi capaz de

atingir um diâmetro superior a 50 mm após 21 dias de crescimento em meio PDA a

140


Resultados

30 ºC, o que o classificaria de acordo com a chave dicotômica como S. schenckii; e

ii) o isolado Ss 133 não foi capaz de assimilar o açúcar rafinose após 10 dias de

incubação, fato este que impossibilitaria a sua classificação como S. mexicana.

Possivelmente o pequeno número de representantes amostrados e estudados possa

influenciar na discrepância de valores e respostas fisiológicas encontradas para as

cepas brasileiras de S. mexicana.

A medida que novos dados biológicos e epidemiológicos forem adicionados

a estudos do agente etiológico da esporotricose, maiores serão as chances do

conhecimento real de variações dentre estas características e a adequação do

sistema de classificação.

Este fato denota claramente a necessidade de atualizações constantes nas

variáveis morfo-fisiológicas empregadas para a classificação dos isolados que

compõem o complexo Sporothrix schenckii. Nos casos em que houve divergência

entre os métodos de classificação adotados optou-se por realizar a taxonomia das

cepas baseadas no polimorfismo do gene da calmodulina. Os resultados

comparativos, referentes à taxonomia polifásica dos isolados de Sporothrix spp.

estão resumidos na Tabela 19.

141


Resultados

Tabela 19: Taxonomia polifásica das cepas do complexo Sporothrix schenckii

utilizando parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares.

Código do Isolado

Método de classificação Classificação

final Classificação inicial

Taxonomia clássica

Taxonomia molecular

Ss 01SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 02RS S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii


Ss 04RS S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii

Ss 05MG S. schenckii S. globosa S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 06MG S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa

Ss 07MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis






Ss 13MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii



Ss 16PI S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 17PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii






Ss 25PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis







Continua...

142


Resultados

Continuação...

Código do Isolado



Taxonomia clássica

Taxonomia molecular




Ss 36PR S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii




Ss 40CE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 41CE S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa

Ss 42CE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 43CE S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 44CE S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 45GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii




Ss 49GO S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa


Ss 51PA S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 52SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 53RS S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 54RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis






Ss 60SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii


Ss 62ES S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis

Ss 63ES S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

143


Resultados

Continuação...

Código do Isolado



Taxonomia clássica

Taxonomia molecular

Ss 64ES S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 65RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis


Ss 67RJ S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis






Ss 73RJ S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii


Ss 75RJ S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii



Ss 78RJ S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii


Ss 80RJ S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii










Ss 90RJ S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii


Ss 92RJ S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis



144


Resultados

Continuação...

Código do Isolado



Taxonomia clássica

Taxonomia molecular










Ss 104MT S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis



Ss 107MG S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis


Ss 110MG S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii

















145


Resultados

Continuação…

Código do Isolado



Taxonomia clássica

Taxonomia molecular




Ss 130PE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 131PE S. schenckii S. mexicana S. mexicana S. mexicana

Ss 132PE S. schenckii S. mexicana S. mexicana S. mexicana

Ss 133PE S. schenckii S. albicans S. mexicana S. mexicana

Ss 134PE S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii




Ss 138PB S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii



Ss 141DF S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii

Ss 143PA S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii



Ss 146AM S. schenckii Blastobotrys sp B. proliferans B. proliferans

Ss 147AM S. schenckii Blastobotrys sp B. proliferans B. proliferans











Ss 158AM S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

146


Resultados

Conclusão...

Código do

Isolado


final Classificação

inicial

Taxonomia

clássica

Taxonomia

molecular

Ss 159JPO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii

Ss 160MEX S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii



Ss 163PER S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii




4.7 Epidemiologia do complexo Sporothrix schenckii no Brasil

Após a taxonomia polifásica das cepas do complexo S. schenckii

depositadas em nossa micoteca apresentamos na Figura 30 a distribuição das

espécies filogenéticas descritas por Marimon et al. (2007) no Brasil, de acordo com o

estado de origem. Com exceção de S. luriei e S. albicans, as demais espécies foram

descritas em território brasileiro, no presente estudo.

Os dados geográficos indicam que S. brasiliensis ocorre com maior

frequência nas regiões Sul e Sudeste (94,36%). Detectamos a sua alta ocorrência

nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, Paraná e Rio Grande do Sul. Devido

principalmente, ao número amostral obtido, os estados do Ceará, Pará, Espírito

Santo, São Paulo e Mato Grosso do Sul, apresentam menor ocorrência desta

espécie.

Os fungos isolados na região Sul do país foram obtidos de casos clínicos de

esporotricose felina. A espécie filogenética S. brasiliensis ocorreu com maior

frequência em hospedeiro felino (90%) do que as demais espécies do complexo S.

schenckii.

147


Resultados

A espécie filogenética S. schenckii esta amplamente distribuída em território

brasileiro sendo encontrada com alta frequência nos estados de São Paulo, Paraná,

Goiás, Minas Gerais, Rio Grande do Sul, e em menor quantidade nos estados do

Espírito Santo, Rio de Janeiro, Pernambuco, Paraíba, Ceará, Pará e Amazonas.

A espécie filogenética S. globosa foi registrada em três estados brasileiros, a

saber: Minas Gerais (Ss 06), Ceará (Ss 41) e Goiás (Ss 49). O fungo Ss 06 foi

isolado em 2002, de um paciente do sexo masculino de 76 anos, agricultor,

residente na cidade de Belo Horizonte - MG, com lesão de esporotricose cutânea

fixa no braço direito. O isolado Ss 41 foi obtido em 2002 de um caso humano onde o

paciente apresentava lesão fixa no braço. O isolado de S. globosa Ss 49, foi obtido

de um caso de esporotricose linfocutânea em 2004, na cidade de Goiânia-GO.

A espécie filognética S. mexicana foi encontrada nos estados de

Pernambuco (Ss 131 e Ss 133) e São Paulo (Ss 132). As duas cepas de S.

mexicana descritas por Marimon et al. (2007) foram isoladas de amostras de solo

(FMR 9108) e vegetal (FMR 9107). Nossos isolados de S. mexicana são

provenientes de casos clínicos de esporotricose humana. A caracterização destes

isolados neste trabalho destaca a descrição do primeiro caso de esporotricose

humana provocado por S. mexicana no mundo. Nosso dados indicam ainda que

embora a primeira descrição da espécie tenha ocorrido em 2007, esta espécie está

presente em território brasileiro desde a década de 50. Os isolados Ss 133 e Ss 131

foram isolados na cidade de Recife-PE em 1955 e 1958, respectivamente, enquanto

que o isolado Ss 132 foi obtido de um caso de esporotricose humana em 1977, em

São Paulo.

Os estados de Minas Gerais e Ceará foram considerados mais

heterogêneos devido a presença das espécies S. schenckii, S. brasiliensis e S.

globosa, assim como o estado de São Paulo onde foram detectadas as espécies S.

schenckii, S. brasiliensis e S. mexicana.

148


Resultados

Figura 30: Distribuição dos isolados brasileiros do complexo Sporothrix schenckii após a taxonomia

polifásica de acordo com o estado de origem em que a cepa foi isolada. Os estados em

branco não possuem representantes estudados (A distribuição dos isolados dentro dos

limites geográficos dos estados não representa a dispersão destes no território ou o ponto

em que foram isolados. No estado do Rio de Janeiro, por exemplo, todos os isolados

estudados são provenientes da região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro).

149


Resultados

4.8 Análise Proteômica

4.8.1 Extração de proteínas de Sporothrix schenckii

Dentre os métodos físicos de lise avaliados para a extração de proteínas, a

maceração das células em nitrogênio líquido apresentou melhor perfil de extração

protéica quando comparado ao método utilizando agitação no aparelho Fast-prep

1200®. Levou-se em consideração a quantidade de proteínas extraídas, a

diversidade de bandas, a integridade das amostras, além da reprodutibilidade das

extrações. A quantificação dos extratos brutos de proteínas de acordo com o

protocolo de extração é apresentada na Tabela 20.

Quando avaliamos os tampões de lise e solubilização destas proteínas

(Apêndice I), os tampões tris-cálcio e uréia-tiouréia apresentaram os melhores perfis

de banda pela eletroforese unidimensional, levando-se em consideração os

parâmetros de avaliação citados acima. Devido ao fato do tampão tris-cálcio

apresentar maior reprodutibilidade durante a eletroforese bidimensional (dados não

mostrados) optou-se por adotar este tampão associado à maceração em nitrogênio

líquido para a extração de proteínas das demais amostras estudadas.

Quatro métodos de precipitação foram avaliados para purificação do extrato

bruto. A principal dificuldade encontrada foi a precipitação de proteínas de baixo

peso molecular (inferiores a 30 kDa) e a ressolubilização completa da amostra.

Dentre os métodos de precipitação avaliados, o 2D Clean-up kit foi mais reprodutível

e apresentou melhor perfil de proteínas pela eletroforese unidimensional e

bidimensional. A figura 31 ilustra os perfis de bandas gerados a partir dos 8

protocolos de extração avaliados utilizando leveduras com 7 dias de cultivo em meio

BHI caldo do isolado Ss 118. A figura 32 ilustra os protocolos de precipitação de

proteínas avaliados (acetona, TCA, TCA/Acetona e 2D Clean-up kit) utilizando o

extrato protéico do isolado Ss 118 (Protocolo de extração 7).

150


Resultados

Tabela 20: Quantidade de proteínas extraídas de acordo com os protocolos de

extração avaliados.

Protocolo Método de lise física Tampão Quantificação

(µg/mL)

C Fast-prep® Água MilliQ 65,09

P1 Fast-prep® Tampão de lise I 886,56

P2 Fast-prep® Tampão de lise II 265,19

P3 Fast-prep® Tampão de lise III 138,42

P4 Fast-prep® Tris-cálcio 450,75

P5 Fast-prep® Uréia 279,40

P6 Fast-prep® Uréia-Tiouréia 583,23

P7 Maceração em N2 Tris-cálcio 2.280,81

P8 Maceração em N2 Uréia-Tiouréia 2.497,33

C: controle com água MilliQ; P1: Protocolo 1; Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de homogeneização das leveduras

(em suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45 segundos. Os protocolos 7 e 8

combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio

e Uréia-Tiouréia respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads de vidro

(0,5mm diâmetro).

Figura 31: Separação eletroforética por SDS-PAGE do extrato de proteínas de leveduras de

Sporothrix schenckii (Ss118), após 7 dias de cultivo em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir

de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida (10%) representativo da triplicata

biológica realizada para esta condição de cultivo. Extratos protéicos brutos referentes

aos protocolos de extração (20 µg de proteínas). PM: Padrão de peso molecular -

Invitrogen – BenchMark Protein Ladder (kDa). Coloração por nitrato de prata.

151


Resultados

Figura 32: Perfis de bandas após a precipitação de proteínas. Aproximadamente 300 µg de proteínas

foram precipitadas utilizando Acetona, TCA, TCA/Acetona ou 2D Clean-up kit (GE

Healthcare) ressupensos em tampão de solubilização (uréia-tiouréia) e aproximadamente

2 µg foram aplicados em gel de SDS-PAGE (10%). Padrão de peso molecular Invitrogen –

BenchMark Protein Ladder.

Após a escolha do método de extração e de precipitação da amostra, as

proteínas foram fracionadas através da técnica de eletroforese bidimensional.

Inicialmente avaliamos as condições de focalização isoelétrica (IEF) utilizando tiras

de pH imobilizado (IPG) com amplitude de pH 3-10 (13 cm). Estas análises

evidenciaram uma grande concentração de proteínas com ponto isoelétrico variando

de 4 a 7 (dados não mostrados). O resultado final da padronização de eletroforese

bidimensional e a análise comparativa do proteoma dos isolados do complexo S.

schenckii será apresentado a seguir em IPG strips de pH 4-7 (13 cm).

Avaliou-se dois tampões de solubilização e reidratação das tiras de pH

imobilizado (Apêndice I). Diversos protocolos de focalização (primeira dimensão)

foram utilizados, alterando-se a voltagem aplicada em cada passo para separação

de proteínas (dados não mostrados). A figura 33 ilustra o mapa bidimensional

gerado para o tampão de escolha uréia-tiouréia (Figura 33).

152


Resultados

Figura 33: Eletroforese bidimensional do extrato celular total do isolado Ss 118, resultante da

combinação do protocolo de extração através da maceração em nitrogênio líquido e

solubilização em tampão de extração tris-cálcio. Aproximadamente 300 µg de proteínas

foram precipitadas utilizando o 2D Clean-up kit (GE Healthcare), solubilizadas em tampão

uréia-tiouréia e aplicados em tiras de pH imobilizado (pH 4-7, 13 cm). Gel de

poliacrilamida (10%) representativo da triplicata biológica realizada. Padrão de peso

molecular Invitrogen – BenchMark Protein Ladder (kDa).

Definidas as condições de extração, solubilização, precipitação, focalização

isoelétrica e SDS-PAGE aplicou-se estes procedimentos para as demais amostras a

fim de compararmos o proteoma da fase parasítica nas diferentes espécies do

complexo S. schenckii.

153


Resultados

4.8.2. Análise proteômica das cepas de importância clínica e

ambiental do complexo S. schenckii

A análise proteômica comparativa foi realizada em quatro isolados do

complexo S. schenckii, as quais foram escolhidas com base na origem geográfica,

hospedeiro ou substrato e espécie filogenética. Os isolados Ss 06 de S. globosa, Ss

54 de S. brasiliensis, Ss 118 de S. schenckii e FMR 9108 de S. mexicana foram

escolhidos para o estudo. O perfil protéico bruto dos isolados escolhidos é

representado na Figura 34.

Figura 34: Perfil protéico de antígenos do complexo Sporothrix schenckii, após 7 dias de cultivo em

meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida

(10%). Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de extração (2 µg de

proteínas). PM: Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein Ladder.

Coloração por nitrato de prata. (S. schenckii: Ss 118; S. brasiliensis: Ss 54; S. globosa: Ss

06; S. mexicana: FMR 9108).

154


Resultados

Aproximadamente 300 µg de proteínas foram fracionadas por eletroforese

bidimensional. Os géis resultantes foram fixados e corados com nitrato de prata

(Apêndice I). As imagens dos géis de poliacrilamida foram obtidas com auxílio de um

scanner densitométrico (Image Scanner III, GE Healthcare). Os parâmetros

adotados para a obtenção das imagens foram constantes para todas as amostras.

Adotou-se uma resolução de 300 dpi para as imagens com filtro verde e

transparente. As imagens capturadas foram utilizadas no software Image Master v.

7.0 (GE Healthcare).

Após a detecção automática dos spots as imagens foram inspecionadas

visualmente para a adição de spots não detectados ou a remoção de falsos spots

gerados a partir de artefatos no gel.

O fungo Ss 54 é um isolado obtido de um caso de esporotricose felina na

cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. O proteoma deste isolado, classificado

como S. brasiliensis apresentou alta diversidade de proteínas, sendo visualizados

aproximadamente 549 spots. Com relação a massa molecular experimental, as

proteínas variaram de 14 a 236 kDa. Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos

uma variação na amplitude de pI de 4.07 a 6.7. A triplicata biológica apresentou

pareamento de 98% dos spots detectados, indicando boa reprodutibilidade (Tabela

21). A figura 35 representa o proteoma do isolado Ss 54 de S. brasiliensis.

A espécie filogenética S. globosa foi representada neste trabalho por um

isolado clínico (Ss 06), proveniente de um paciente do sexo masculino, lavrador,

com quadro de esporotricose cutânea fixa, residente na cidade de Belo Horizonte,

Minas Gerais. O proteoma das leveduras deste isolado apresentou grande

diversidade de proteínas, sendo visualizados aproximadamente 491 spots. Com

relação a massa molecular experimental, as proteínas variaram de 14 à 298 kDa.

Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos uma variação na amplitude de pI de

4.08 à 6.91. A triplicata biológica apresentou pareamento de 97% dos spots

155


Resultados

detectados (Tabela 21). A figura 36 representa o proteoma do isolado Ss 06 de S.

globosa corado por nitrato de prata.

O isolado FMR 9108 foi utilizado como representante da espécie S.

mexicana. Este isolado é proveniente de uma amostra de solo coletada na cidade de

Puebla, no México. Esta cepa foi descrita e caracterizada por Marimon et. (2007) e

encontra-se depositada na CBS sob o código CBS 120341. O proteoma do isolado

FMR 9108 apresentou baixa diversidade de proteínas quando comparado aos

demais isolados estudados. Foram visualizados aproximadamente 298 spots, os

quais variaram de 10 à 231 kDa, com relação a massa molecular de 4,2 à 6,87 de

amplitude de pI. A triplicata biológica apresentou pareamento de 98% entre os spots

detectados (Tabela 21). A figura 37 representa o proteoma do isolado FMR 9108 de

S. mexicana corado por nitrato de prata.

O fungo Ss 118 é um isolado obtido de um caso de esporotricose humana

cutânea fixa, residente na cidade de São Paulo. O proteoma deste isolado,

classificado como S. schenckii, apresentou aproximadamente 450 spots. Com

relação a massa molecular experimental, as proteínas variaram de 13 a 267 kDa.

Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos uma variação na amplitude de pI de

4,00 à 6,74. A triplicata biológica apresentou pareamento de 99% dos spots

detectados (Tabela 21). A figura 38 representa o proteoma do isolado Ss 118 de S.

schenckii corado por nitrato de prata.

Tabela 21: Resumo das características proteômicas das espécies do complexo S.

schenckii.

Espécie Diversidade Características

Nº de spots Pareamento pI MM (kDa)

S. brasiliensis 549 98% 4.07 – 6.70 14 – 236

S. globosa 491 97% 4.08 – 6.91 14 – 298

S. mexicana 298 98% 4.20 – 6.87 10 – 231

S. schenckii 450 99% 4.00 – 6.70 13 – 267

156


Resultados

Figura 35: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix brasiliensis (Ss 54). Aproximadamente 300

µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16


Ladder.

Figura 36: Perfil proteômico de leveduras de S. globosa (Ss 06). Aproximadamente 300 µg de

proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).

Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein

Ladder.

157


Resultados

Figura 37: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix mexicana (FMR 9108). Aproximadamente

300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x

16 cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark

Protein Ladder.

Figura 38: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix schenckii (Ss 118). Aproximadamente 300 µg

de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).

Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein

Ladder.

158


Resultados

A comparação dos spots diferencialmente expressos foi realizada aos pares

com base em um gel de referência de cada espécie filogenética. Uma proteína foi

considerada diferencialmente expressa nos casos em que houve variação entre as

classes comparadas, de pelo menos duas vezes o volume detectado para o spot

analisado.

A comparação global entre o perfil protéico apresentado pelas quatro

espécies do complexo S. schenckii revelou perfis claramente distintos com relação a

abundância, diversidade e organização nos mapas bidimensionais.

Aproximadamente 100 spots foram comuns às quatro espécies; 153 spots foram

comuns a pelo menos 3 espécies; 237 spots foram comuns a pelo menos 2

espécies. As proteínas que apareceram exclusivamente em algum representante

das espécies estudadas, somadas, atingiram o patamar de 475 spots.

As alterações estatisticamente significativas (p<0.01) de acordo com a

análise de variância (ANOVA) para a comparação entre S. schenckii e S. globosa

revelou 83 spots diferencialmente expressos. Dentre estas proteínas, 25 foram

encontradas nas duas classes avaliadas e 58 foram encontradas exclusivamente em

uma das classes (30 em S. schenckii e 28 em S. globosa). Dentre as proteínas

comuns, 10 spots obtiveram níveis de expressão superiores em S. schenckii e 15 em

S. globosa.

A comparação do perfil protéico de S. schenckii e S. brasiliensis demonstrou

234 spots diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre estes, 27 foram encontrados

nas duas classes avaliadas e 207 foram encontrados exclusivamente em uma das

classes (62 em S. schenckii e 145 em S. brasiliensis). Com relação às proteínas

comuns, 18 spots foram super-expressos em S. schenckii e 9 em S. brasiliensis.

Cento e trinta e três proteínas foram consideradas diferencialmente

expressas (p<0.01) quando comparamos o perfil protéico de S. schenckii e S.

mexicana. Dentre estas proteínas, 20 foram encontradas nas duas classes avaliadas

e 113 foram encontradas exclusivamente em uma das classes (82 em S. schenckii e

159


Resultados

31 em S. mexicana). Dentre os spots protéicos comuns 4 foram super-expressos em

S. schenckii, enquanto que 16 apresentaram níveis de expressão superior em S.

mexicana.

A comparação entre S. globosa e S. brasiliensis revelou 232 spots

diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre os spots diferencialmente expressos 30

foram encontrados nas duas classes avaliadas e 202 foram encontrados

exclusivamente em uma das classes (48 em S. globosa e 154 em S. brasiliensis).

Dentre as proteínas comuns 18 spots foram super-expressos em S. globosa e 12 em

S. brasiliensis.

A comparação entre S. globosa e S. mexicana revelou 120 spots



exclusivamente em uma das classes (66 em S. globosa e 32 em S. mexicana).

Dentre as 22 proteínas comuns, 5 spots foram super-expressos em S. globosa e 17

em S. mexicana.

A comparação entre S. brasiliensis e S. mexicana revelou 209 spots



exclusivamente em uma das classes (160 em S. brasiliensis e 25 em S. mexicana).

Dentre as proteínas comuns 10 spots foram super-expressos em S. brasiliensis e 14

em S. mexicana. A tabela 22 resume as comparações realizadas entre as espécies

crípticas do complexo S. schenckii.

Nossos géis bidimensionais de proteínas dos isolados do complexo

Sporothrix schenckii evidenciam a existência de diferenças significativas entre os

perfis de proteoma das espécies estudadas, reforçando nossa hipótese inicial.

Porém, fica claro que a evidência aqui apontada se refere a distribuição e

diversidade destes spots no gel de poliacrilamida. A confirmação desta hipótese

160


Resultados

apenas poderá ocorrer com a caracterização detalhada destas moléculas utilizando

técnicas de espectrometria de massas para a identificação de proteínas.

A caracterização funcional destas proteínas diferencialmente expressas nos

levarão a explicar algumas perguntas importantes, como por exemplo, qual a função

destas proteínas na interação parasito-hospedeiro e quais são os possíveis fatores

de virulência provavelmente envolvidos na patogênese destas espécies nos

diferentes hospedeiros mamíferos.

Tabela 22: Proteoma comparativo das espécies do complexo S. schenckii.

Análise comparativa Expressão diferencial de proteínas

Spots ≠ expressos

Proteínas exclusivas

Proteínas comuns

S. schenckii x S. brasiliensis 234 207 62 (Ss)

27 18 ↑ (Ss)

145 (Sb) 9 ↑ (Sb)

S. schenckii x S. globosa 83 58 30 (Ss)

25 10 ↑ (Ss)

28 (Sg) 15 ↑ (Sg)

S. schenckii x S. mexicana 133 113 82 (Ss)

20 4 ↑ (Ss)

31(Sm) 16 ↑ (Sm)

S. globosa x S. brasiliensis 232 202 48 (Sg)

30 18 ↑ (Sg)

154 (Sb) 12 ↑ (Sb)

S. globosa x S. mexicana 120 98 66 (Sg)

22 5 ↑ (Sg)

32 (Sm) 17 ↑ (Sm)

S. brasiliensis x S. mexicana 209 185 160 (Sb)

24 10 ↑ (Sb)

25 (Sm) 14 ↑ (Sm) Spots ≠ expressos: Spots diferencialmente expressos; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii. ↑: Expressão superior na classe descrita.

4.8.3. Moléculas imunogênicas presentes no extrato precipitado

de leveduras do complexo S. schenckii.

A análise imunoproteômica comparativa foi realizada entre as quatro cepas

do complexo S. schenckii (Ss 06, Ss 54, Ss 118 e FMR 9108) descritas

anteriormente, avaliando-se o conjunto de proteínas expressas durante a fase

parasítica e que são reconhecidas por anticorpos IgG circulantes no soro de

161


Resultados

pacientes que desenvolveram a forma cutânea fixa ou a forma linfocutânea da

doença.

O isolado Ss 54 de S. brasiliensis, apresentou 9 spots imunogênicos na

esporotricose cutânea fixa e 8 spots imunogênicos na esporotricose linfocutânea

(Figura 39). Três proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose

cutânea fixa (Identificação (ID): 7, 8 e 9), enquanto que duas proteínas foram

reconhecidas exclusivamente na esporotricose linfocutânea (ID: 10 e 11).

O isolado Ss 06 de S. globosa, apresentou 13 spots imunogênicos na


(Figura 40). Três proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose

linfocutânea (ID: 9, 10 e 11).

O isolado FMR 9108 de S. mexicana, apresentou 6 spots imunogênicos em

cada forma clínica avaliada (Figura 41). O perfil de reconhecimento antigênico deste

isolado foi diferente das demais espécies avaliadas.

O isolado Ss 118 de S. schenckii, apresentou 14 spots imunogênicos na


(Figura 42). Oito proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose

cutânea fixa (ID: 7-14).

Os dados de ponto isoelétrico (pI) e massa molecular (MW) das proteínas

fúngicas reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G de pacientes com

esporotricose cutânea fixa e linfocutânea estão descritos na Tabela 23. O perfil

antigênico de cada isolado é útil para a seleção de candidatos a biomarcadores da

espécie em testes sorológicos para o diagnóstico diferencial da esporotricose

humana.

162


Resultados

Figura 39: Imunoproteômica da cepa Ss 54 de S. brasiliensis. As proteínas do fungo S. brasiliensis são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG)

presentes em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído

em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por

quimioluminescência.

163


Resultados

Figura 40: Imunoproteômica da cepa Ss 06 de S. globosa. As proteínas do fungo S. globosa são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em

um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween

20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por quimioluminescência.

164


Resultados

Figura 41: Imunoproteômica da cepa FMR 9108 de S. mexicana. As proteínas do fungo S. mexicana são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG)

presentes em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído

em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por


165


Resultados

Figura 42: Imunoproteômica da cepa Ss 118 de S. schenckii. As proteínas do fungo S. schenckii são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes

em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído em PBS

tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por


166


Resultados

Tabela 23: Características moleculares experimentais das proteínas imunogênicas

detectadas na esporotricose humana.

Iso

lad

o

Proteínas imunogênicas

Características

experimentais

Soro

humano

Comum à:

Sb Sg Ss Sm

ID pI MM

(kDa) Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF

S. b

ras

ilie

ns

is

1 4.45 62 X X – – X X X X – –

2 4.50 61 X X – – X X X X – –

3 4.56 59 X X – – X X X X – –

4 4.62 58 X X – – X X X X – –

5 4.70 56 X X – – X X X X – –

6 4.80 55 X X – – X X X X – –

7 4.49 40 X – – – – – – – – –

8 4.56 39 X – – – – – – – – –

9 4.61 36 X – – – – – – – – –

10 4.45 91 – X – – – X – – – –

11 4.51 90 – X – – – X – – – –

S. g

lob

os

a

1 4.33 73 X X X X – – X X – –

2 4.38 73 X X X X – – X X – –

3 4.43 72 X X X X – – X X – –

4 4.51 73 X X X X – – X X – –

5 4.58 72 X X X X – – X X – –

6 4.68 69 X X X X – – X X – –

7 4.77 68 X X – – – – – – – –

8 4.85 64 X X – – – – – – – –

9 5.74 91 - X – – – – X – – –

10 4.77 107 - X – – – – X – – –

11 4.68 107 - X – – – – X – – –

12 4.58 107 X X – – – – X – – –

13 4.51 107 X X – – – – X – – –

14 4.43 107 X X – X – – X – – –

15 4.38 107 X X – X – – X – – –

16 4.33 107 X X – – – – X – – –

Continua...

As marcações “X” indicam detecção da proteína descrita, pelo respectivo soro de pacientes com a doença. As marcações em vermelho “X” indicam reconhecimento exclusivo para a espécie, e as marcações em verde “X” indicam reconhecimento comum para as espécies. Abreviações: ID: Identificação; pI: ponto isoelétrico; MM: Massa molecular em kDa; Fixa: Esporotricose cutânea fixa; LF: Esporotricose linfocutânea; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii.

167


Resultados

Conclusão... Is

ola

do

Proteínas imunogênicas

Características

experimentais

Soro

humano

Comum à:

Sb Sg Ss Sm

ID pI MM

(kDa) Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF

S. m

ex

ica

na

1 4.80 52 X – – – – – – – – –

2 4.89 52 X – – – – – – – – –

3 4.86 42 X – – – – – – – – –

4 4.65 26 X – – – – – – – – –

5 4.71 26 X – – – – – – – – –

6 4.77 27 X – – – – – – – – –

7 5.84 72 – X – – – – – – – –

8 5.88 80 – X – – – – – – – –

9 5.97 80 – X – – – – – – – –

10 6.08 80 – X – – – – – – – –

11 6.20 82 – X – – – – – – – –

12 4.75 154 – X – – – – – – – –

S. s

ch

en

ck

ii

1 4.54 70 X X X X X X – – – –

2 4.60 69 X X X X X X – – – –

3 4.67 69 X X X X X X – – – –

4 4.73 69 X X X X X X – – – –

5 4.76 66 X X X X X X – – – –

6 4.82 68 X X X X X X – – – –

7 5.21 53 X – – – – – – – – –

8 4.31 91 X – – – X X – – – –

9 4.36 91 X – X X X – – – –

10 4.42 88 X – X X X – – – –

11 4.49 87 X – – X X – – – –

12 4.54 87 X – – X X – – – –

13 4.63 267 X – – – – – – – –

14 4.68 267 X – – – – – – – –

As marcações “X” indicam detecção da proteína descrita, pelo respectivo soro de pacientes com a doença. As marcações em vermelho “X” indicam reconhecimento exclusivo para a espécie, e as marcações em verde “X” indicam reconhecimento comum para as espécies. Abreviações: ID: Identificação; pI: ponto isoelétrico; MM: Massa molecular em kDa; Fixa: Esporotricose cutânea fixa; LF: Esporotricose linfocutânea; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii.

168


Discussão

5. DISCUSSÃO

A descrição e caracterização do complexo S. schenckii foi realizada

recentemente por Marimon et al. (2007, 2008). Nosso trabalho teve como principal

objetivo descrever a distribuição deste complexo de espécies crípticas em território

brasileiro e contribuir para estudos da epidemiologia e biologia destes

microrganismos.

Com o propósito de estudar as diferenças fenotípicas, moleculares e

antigênicas entre as cepas do complexo S. schenckii utilizamos isolados de origem

clínica, que provocaram diferentes quadros de esporotricose no homem e em

animais, assim como isolados ambientais de diferentes regiões geográficas.

Dentre as características fenotípicas estudadas, o crescimento vegetativo é

um importante fator para a distinção das espécies que compõem o complexo S.

schenckii. O crescimento fúngico é um processo fisiológico complexo, coordenado e

que sofre influência de diversos fatores externos e internos. O crescimento tem sido

definido pelos biólogos nos últimos 50 anos como o aumento de tamanho

(Davenport et al., 1939) no número de células ou na massa (Lilly & Barnett, 1951).

No caso dos fungos o crescimento vegetativo ocorre através da expansão apical da

hifa.

Diversos fatores ambientais como diferentes regimes de nutrientes, a

presença de distintos indutores químicos e perturbações físicas como o pH externo e

a temperatura foram evidenciados como capazes de influenciar a taxa de

crescimento de leveduras e hifas (Gow, 1994). Dentre estes, a temperatura possui

um papel extremamente importante (Trinci, 1969, Wolf & Wolf, 1947b; Lilly & Barnett,

1951; Cochrane, 1958) determinando o nicho fundamental de todos os fungos

(Cooke & Whipps 1993).

169


Discussão

Em muitos microrganismos tem-se demonstrado que o crescimento cessa à

temperatura levemente acima da temperatura ótima (Langridge, 1963). Por outro

lado, à baixa temperatura ocorre aumento no número de interações não covalentes

entre as moléculas; consequentemente, a membrana celular torna-se mais rígida

impedindo o crescimento (Jermy, 2010). A temperatura de incubação é um fator que

afeta notavelmente o crescimento vegetativo e a morfologia dos fungos e no caso de

S. schenckii este fator tem uma importância especial, pois altera a expressão gênica

do fungo e possibilita, junto a outros fatores, a transição de uma forma de vida

saprofítica para uma forma parasítica.

Em nosso estudo com S. schenckii o efeito da temperatura sobre o

crescimento fúngico foi mais evidente quando a temperatura de crescimento passou

de 30 para 35ºC, ocorrendo diminuição do crescimento e alterações morfológicas.

Estes dados estão de acordo com os esperados, quando consideramos a

diversidade de fatores ambientais com as quais estes isolados são desafiados no

ambiente. A temperatura do solo, principal reservatório de Sporothrix spp., varia

sazonalmente e diariamente, sendo afetada principalmente pelas variações na

temperatura do ar e radiação solar, além de variar espacialmente de acordo com a

profundidade amostrada. Quando o fungo encontra-se no solo, sob desenvolvimento

saprofítico, a temperatura em determinadas regiões do Brasil e em muitos outros

países de clima tropical a subtropical, onde a doença é endêmica, varia numa faixa

de 20-40 ºC, o que garante a preservação e viabilidade das estruturas fúngicas. Este

fato possivelmente restringe geograficamente a densidade populacional do fungo em

algumas regiões consideradas de temperaturas extremas, como as regiões

desérticas (temperaturas ocorrem acima de 40 ºC) e polares (abaixo de 0 ºC).

Devido à restrição térmica de alguns isolados de S. schenckii, a hipertermia

tem sido utilizada como terapia alternativa no tratamento da esporotricose

linfocutânea (Thomas et al., 1951; Galiana & Conti-Diaz, 1963; Laca, 1964; Trejos &

170


Discussão

Ramirez, 1966; Lii et al., 1973; Sutherland et al., 1980; Takahashi et al., 1981;

Doherty et al., 2010). As espécies filogenéticas S. brasiliensis e S. schenckii

apresentaram as maiores taxas de crescimento a 37 ºC, o que nos leva a acreditar

que o emprego da hipertermia não seja satisfatório para o tratamento da

esporotricose que tenha como agente etiológico estas duas espécies. Destacamos

deste modo, a importância da correta identificação do agente patogênico para o

emprego da terapia mais adequada para o paciente.

Nossos resultados sobre a influência da temperatura no crescimento

vegetativo não estão de acordo com os encontrados por Kwon-Chung (1979). Os

isolados obtidos de pacientes que desenvolveram esporotricose linfocutânea não

foram mais termotolerantes do que os fungos isolados de pacientes com

esporotricose cutânea fixa. O isolado Ss 49 de S. globosa, por exemplo, não foi

capaz de crescer após 21 dias de incubação a 37 ºC embora tenha sido obtido de

um paciente com esporotricose linfocutânea. Este fato nos leva a acreditar que a

capacidade em provocar os mais diferentes quadros clínicos da doença esteja

intimamente relacionada e seja resultado da interação do patógeno com o sistema

imune do hospedeiro. Cabe ressaltar que o meio de cultura utilizado não reconstitui

os nutrientes disponíveis in vivo no hospedeiro. Estes nutrientes podem estimular

juntamente com a temperatura a expressão de diversos genes importantes para a

manutenção celular, virulência e patogenicidade in vivo. Estes fatores, aliados à

debilidade do sistema imune, podem culminar na capacidade deste isolado de S.

globosa provocar o quadro de esporotricose linfocutânea.

Vidal et al. (1997) demonstraram em Paecilomyces fumosoroseus que o

potencial de um isolado em tolerar altas ou baixas temperaturas está normalmente

relacionado com os dados climáticos da sua origem geográfica. Este fato não foi

observado com os isolados de Sporothrix spp. estudados. Os isolados apresentaram

perfis de similaridade distintos quando agrupados por origem geográfica e estes

171


Discussão

perfis não foram congruentes com os dados climáticos das regiões brasileiras

estudadas. Nossa hipótese inicial teorizava que quando num estado saprofítico, a

pressão ambiental dos diferentes biomas do Brasil sobre a população natural de

Sporothrix spp. poderia selecionar fungos de uma mesma região com taxas de

crescimento similares. Embora existam grandes variações sazonais no clima

brasileiro, os fungos provenientes de estados com clima predominantemente quente

como acontece no nordeste brasileiro (temperatura média anual superior a 18 ºC),

não são mais termo resistentes do que os fungos isolados de regiões com clima

mesotérmico brando (com temperatura média entre 10 e 15 ºC) como acontece na

região sul do país.

O risco potencial quando são feitas correlações entre a origem geográfica e

a resposta térmica utilizando poucos ou apenas um espécime é a grande dificuldade

no conhecimento, a priori, de quão representativo da população natural um isolado

em particular pode ser, assim como a ausência de conhecimento sobre a presença e

fontes de variação na população natural de fungos (Cooke & Rayner, 1984).

A análise de clusterização baseada em dados de crescimento vegetativo e

inibição do crescimento vegetativo em diferentes temperaturas com 170 isolados de

Sporothrix revelou o comportamento fisiológico distinto pelos mesmos. Não

observamos uma correlação entre os perfis de crescimento e inibição do

crescimento vegetativo e a origem geográfica ou forma clínica da doença. Fungos

obtidos de uma mesma área geográfica demonstraram respostas fisiológicas

distintas, assim como fungos que provocaram diferentes quadros clínicos da doença

em hospedeiro humano demonstraram perfis de inibição semelhantes.

Para Angilletta et al. (2002) e McLean et al. (2005), a temperatura que

possibilita um crescimento rápido pode variar entre genótipos, e espera-se que a

seleção natural favoreça variantes particulares em função dos padrões espaciais e

temporais da temperatura ambiental. Um fator que pode explicar a diversidade de

172


Discussão

fenótipos em relação à tolerância térmica pode estar relacionado à diversidade de

genótipos encontrados em Sporothrix spp. A questão da ploidia em S. schenckii

ainda não está totalmente esclarecida, sendo considerados estados diplóides,

haplóides e aneuplóides (Tateishi et al., 1996; Torres-Guerreiro, 1999). Segundo

Deacon (1997), fungos haplóides como Pandora blunckii e Zoophthora radicans

expressam todos os seus genes, além disso, todos são expostos a mutações. Como

resultado eles podem ter núcleos geneticamente diferentes no citoplasma da hifa

(heterocariose). A taxa de tipos nucleares pode variar de acordo com as condições

ambientais. Isto possibilita ao fungo acumular mutações e escondê-las da pressão

seletiva entre os núcleos selvagens, e eventualmente propicia a colônia alterar a

taxa nuclear em resposta às condições prevalentes. Este fenômeno é um atributo

importante, o qual proporciona aos fungos adaptarem-se às mudanças nas

condições ambientais pela alteração na taxa do tipo nuclear. Segundo Guzmán-

Franco et al. (2008) esta pode ser uma das razões pela qual, de uma mesma área

geográfica podem ser obtidos isolados com diferentes atributos biológicos.

O aspecto mais importante das populações naturais está geneticamente

baseado na existência de variação dentro delas. A variabilidade fenotípica

apresentada pelos isolados dessas espécies em reposta à temperatura sugere uma

grande adaptação aos ambientes em que estas espécies são encontradas, assim

como a diversidade de hospedeiros (vários gêneros de mamíferos e artrópodes) que

são parasitados pelos fungos do gênero Sporothrix.

De acordo com Mitchell & Xu (2003), a variação fenotípica das espécies

fúngicas são comuns em níveis inter e intra-específicos. As estirpes patogênicas

desenvolvem-se bem a 37°C, o que geralmente não acontece com as estirpes

saprofíticas (Esteves et al., 1990). De fato, os microrganismos que provocam doença

em hospedeiro humano apresentam um estilo de vida saprofítico e apenas aqueles

que conseguem adaptar-se à temperatura corporal sobreviverão (Ripon, 1982).

173


Discussão

Robert & Casadevall (2009) consideram que a endotermia desenvolvida por

mamíferos seja um mecanismo de defesa não específico contra este tipo de

patógeno. Fungos que são capazes de provocar doenças em insetos e em

mamíferos possuem uma ótima termotolerância quando comparados aos fungos que

comumente habitam o solo e plantas. Nossos dados indicam que os isolados

provenientes de amostras clínicas (humana e animal) são mais termotolerantes do

que os isolados provenientes de fontes ambientais. Existe diferença estatística

significativa com relação a inibição do crescimento a 35 ºC entre os isolados

ambientais e de origem animal (p<0.01). À 37 ºC os isolados humanos (p<0.001) e

animais (p<0.001) diferem dos isolados ambientais.

Criseo e Romeo (2010) relatam a presença de dois clusters entre isolados

clínicos e ambientais de S. schenckii baseados nas informações da sequência do

gene ribossomal 28S (D1-D2). O primeiro cluster é formado apenas por isolados

ambientais, enquanto que o segundo grupo é formado por isolados clínicos de

origem humana e animal. Segundo Criseo e Romeo (2010), as cepas estudadas

apresentam uma translocação conservada entre todos os isolados de origem clínica

(T C e A G) e os ambientais (C T e G A). No estudo das cepas italianas

Criseo e Romeo (2010) apontam que as cepas ambientais estudadas apresentam

nível de diferença na região D1-D2 do rDNA 18S suficiente para justificar a

separação dos isolados examinados em dois grupos (ambientais e clínicos), embora

não esteja claro se o valor dessas diferenças genéticas é suficiente para definir

novas espécies ou se isto apenas demonstra uma variação genética entre isolados

de diferentes origens de S. schenckii.

Em ambientes naturais os fungos podem ser expostos a uma ampla faixa de

temperaturas, sujeitas a variações diárias e sazonais, de maneira que o crescimento

ativo nem sempre pode ser possível (Carlile et al., 2001).

174


Discussão

A abundância e riqueza de fungos em um habitat são limitadas pela duração

das condições meteorológicas. Deste modo, segundo Talley et al. (2002), a

caracterização das condições climáticas favoráveis para os fungos patogênicos

podem ser utilizadas para prever a pressão seletiva imposta a estes em diferentes

habitats. Barrozo et al. (2009) demonstraram que a variação climática em uma

região hiper-endêmica de Paracoccidioides brasiliensis, no estado de São Paulo,

afeta o número de ocorrências da infecção na população. Acredita-se que este fator

abiótico seja importante para a ocorrência de outras micoses onde o reservatório

seja o solo. No caso da paracoccidioidomicose, a infecção se dá pela liberação dos

propágulos na natureza e inalação destes pelo hospedeiro mamífero. No caso da

esporotricose, uma micose geralmente subcutânea, ocorre a necessidade da

inoculação traumática do patógeno no tecido do hospedeiro.

Informações sobre o possível papel desempenhado pelos animais nas

infecções fúngicas em seres humanos apresentam consequências importantes na

saúde pública assim como no entendimento da ecologia fúngica (Restrepo et al.,

2000). Alguns mamíferos como gatos (Felis catus) e tatus (Dasypus novemcinctus)

são apontados como importantes reservatórios de fungos patogênicos e possuem

influência na transmissão destes para o homem. Na cidade do Rio de Janeiro, uma

área de grande incidência da esporotricose no Brasil, os gatos possuem um papel

de destaque na transmissão desta zoonose. No estado de São Paulo, alguns casos

estão ligados à caça de tatus na natureza. Os hospedeiros felinos podem adquirir o

fungo por meio do contato com outros animais infectados ou pelo contato direto com

solo e plantas, podendo assim transmitir o patógeno ao homem.

Em hipótese, o clima pode favorecer a expansão da população do

microrganismo na natureza, aumentando as chances de contaminação de algum

hospedeiro mamífero como gatos e tatus através do solo e deste modo ampliar as

possibilidades de transmissão da micose para humanos.

175


Discussão

A região Sul do Brasil é considerada área endêmica da doença sendo

descritos 304 casos de esporotricose entre 1967 e 2002 (Rosa et al., 2005), assim

como o estado do Rio de Janeiro na região sudeste do país (Barros et al., 2008a;

Bernardes-Engemann, 2009) com a descrição de 759 casos humanos, 1.503 gatos e

64 cachorros entre 1998 e 2004 (Lopes-Bezerra et al., 2006). Possivelmente as

regiões sul e sudeste, onde são relatados mais casos da doença em humanos, as

condições climáticas de temperatura e umidade do ar favoreçam o desenvolvimento

e a expansão do número de focos do fungo na natureza. Isto pode aumentar as

possibilidades de aquisição da micose pelo gato através do contato direto com o

foco, favorecendo com que este seja posteriormente o principal agente de

transmissão da doença para o homem. Deste modo, acredita-se que o gato atue

mais do que um mero portador da doença, sendo, portanto um hospedeiro chave

para a ecoepidemiologia da doença nestes estados.

Nenhum isolado de Sporothrix spp. apresentou crescimento vegetativo aos

21 dias de incubação a 40 °C, e a temperatura atuou como fator fungistático e

fungicida, uma vez que após a incubação as placas foram armazenadas a

temperatura ambiente por 14 dias e o inóculo inicial permaneceu inerte.

A temperatura do micro-ambiente em que o fungo vive, seja ela a

temperatura do hospedeiro ou a temperatura ambiental (solo ou planta), representa

um fator abiótico de extrema importância sobre o crescimento, a reprodução, a

patogenicidade entre outros aspectos da fisiologia do microrganismo, podendo este

fator estabelecer a correlação entre a temperatura de crescimento in vitro, a

distribuição geográfica do patógeno e a época de ocorrência da enfermidade. O

aumento da temperatura global, poderá influenciar na eco-epidemiologia das

doenças fúngicas. Em sua grande maioria, as doenças fúngicas são restritas ou

ocorrem com maior intensidade em determinadas áreas geográficas. Muitas dessas

doenças são consideradas endêmicas de áreas tropicais, onde prevalecem

176


Discussão

temperaturas e umidade relativa do ar elevadas durante a maior parte do tempo.

Este tipo de comportamento em função das condições climáticas pode ser associado

à maioria dos microrganismos, assim como às micoses provocadas por fungos

termodimórficos. De acordo com Garcia-Solache & Casadevall (2010) o aquecimento

global afetará a amplitude geográfica de ocorrência das espécies patogênicas e

selecionará fungos cada vez mais termo resistentes, favorecendo espécies

termotolerantes com potencial patogênico, mas que atualmente não acometem o

hospedeiro mamífero em virtude de serem restritas pela temperatura corpórea

desenvolvida por estes.

Outra característica morfológica avaliada como parâmetro taxonômico foram

os tipos de conídios produzidos por Sporothrix spp. Dados biométricos, como a

morfometria de micro-estruturas vegetativas como conídios e hifas têm sido

amplamente empregados na taxonomia de grupos fúngicos. A morfologia das micro-

estruturas vegetativas dos isolados de S. schenckii estudados são congruentes com

a diversidade encontrada por Marimon et al. (2007 e 2008). Embora o

mensuramento das microestruturas seja uma característica importante para

comparação dos nossos resultados com os resultados publicados por Marimon et al.

(2007 e 2008) este não foi um fator decisivo para a taxonomia do fungo utilizando

isolados brasileiros. De fato, dados publicados na literatura demonstram que em

outros fungos como ocorre em Cercospora sesani, de acordo com Carvalho e

Carvalho (1973), os conídios produzidos em temperaturas médias são maiores que

aqueles produzidos em temperaturas elevadas ou baixas. Segundo Cochrane

(1958), em Aspergillus janus, a temperatura pode ser um fator determinante para a

alteração da morfologia dos conídios. Deste modo, fica evidente que mesmo quando

os parâmetros experimentais estipulados são seguidos rigorosamente em condições

laboratoriais, poderá haver alterações morfológicas importantes dependendo da

composição do meio de cultura (os quais podem não ter a composição

177


Discussão

quimicamente definida), do tamanho e do tempo de cultivo, do período e da

temperatura de incubação, da luminosidade fornecida durante a incubação, entre

outros fatores.

A população de Sporothrix spp. estudada demonstrou ser altamente

heterogênea quanto aos parâmetros morfológicos avaliados. A maioria dos estudos

sobre diversidade fúngica tem focado sua atenção na variabilidade entre indivíduos

isolados ao invés de focar as diferenças populacionais (Francis, 1976). Entretanto, a

existência de populações (unidades micro-evolucionárias) tem sido demonstrada

dentro de algumas espécies fúngicas. Lovelles (1971) distinguiu populações de

Claviceps purpurea baseado no tamanho do conídio, o qual tem sido relacionado à

origem do hospedeiro. Shepherd & Pratt (1973) encontraram isolados de

Phytophthora drechsleri de algumas origens geográficas as quais diferem com

relação à taxa de crescimento. O papel do isolamento geográfico como um

mecanismo seletivo, o qual contribui para o desenvolvimento de discretas

populações tem sido bem relatado na literatura.

A análise morfométrica do crescimento vegetativo dos 170 isolados de

Sporothrix spp. de diversas origens geográficas nos leva a acreditar que a taxa

crescimento vegetativo não está relacionado com a origem geográfica nem com as

diversas formas clínicas apresentada pelos pacientes. Entretanto, existe uma forte

correlação entre a taxa de crescimento nas temperaturas de 30, 35 e 37 ºC e a

termotolerância apresentada pelos isolados com as espécies filogenéticas

estudadas.

Sporothrix schenckii é descrito na literatura como uma espécie amplamente

distribuída na natureza. Os padrões de distribuição do agente etiológico da

esporotricose apresentam mudanças quando levamos em consideração a espécie

filogenética e a origem geográfica do fungo. A frequência de ocorrência desta

178


Discussão

micose em determinada fonte ou vetor, afeta os padrões de distribuição da espécie

entre os hospedeiros.

Os dados geográficos indicam que S. brasiliensis ocorre com maior

frequência nas regiões Sul e Sudeste. Os fungos isolados na região Sul do país

foram obtidos de casos clínicos de esporotricose felina. A espécie filogenética S.

brasiliensis ocorreu com maior frequência em hospedeiro felino do que as demais

espécies do complexo S. schenckii. De modo concordante, a espécie filognética S.

brasiliensis predomina entre o hospedeiro humano nesta região. O contato direto do

homem com o animal contaminado pode estar relacionado com a disseminação

desta espécie entre seres humanos no Brasil e este fato pode ser uma das razões

que influenciam os aspectos epidemiológicos da doença cujo agente etiológico é o

fungo S. brasiliensis. No estado do Rio de Janeiro, esta espécie predomina em

casos de esporotricose humana. Uma importante epidemia de esporotricose felina é

descrita na região metropolitana do Rio de Janeiro sugerindo este animal como um

importante vetor. No estado de São Paulo, por exemplo, onde não ocorre a epidemia

de esporotricose felina, a espécie S. schenckii é predominante na esporotricose

humana, indicando possivelmente outra fonte de infecção no ambiente. Os dados de

crescimento vegetativo associados a outros caracteres morfológicos são importantes

para a caracterização populacional dos isolados fúngicos. A diversidade fenotípica

dentro da população de Sporothrix spp. ainda não está totalmente elucidada. À

medida que novos dados forem disponibilizados na literatura, os padrões de

classificação poderão ser alterados.

Os micróbios devem assimilar carbono para crescer (Barelle et al., 2006). O

desenvolvimento de microrganismos patogênicos em uma ampla gama de

hospedeiros depende, não apenas de certos fatores de virulência, mas também de

uma grande flexibilidade metabólica (Askew et al., 2009). Patógenos devem ser

capazes de assimilar fontes de carbono em seu ambiente para gerar metabólitos e

179


Discussão

energia suficientes para sobreviver (Askew et al., 2009). De acordo com Kingsbury et

al. (2006), potenciais fontes de nitrogênio in vitro incluem amônia, uréia e

aminoácidos, enquanto que potenciais fontes de carbono incluem glicose, lactato,

piruvato e ácidos graxos. Saccharomyces cerevisiae e muitas outras leveduras

podem sobreviver utilizando uma grande variedade de fontes de carbono, entretanto,

os açúcares glicose e frutose constituem as fontes preferidas. Quando um destes

carboidratos está presente, as enzimas requeridas para a utilização de fontes de

carbono alternativas são sintetizadas a taxas basais ou totalmente reprimidas

(Gancedo, 1998).

A capacidade de um micróbio sobreviver in vivo é determinada por uma

complexa interação entre o microambiente do hospedeiro e o micróbio. O

metabolismo de fontes de carbono in vivo depende de diversos fatores como: i) a

concentração e a qualidade das fontes de carbono disponível; ii) fatores como o pH

e a temperatura influenciam a absorção de fontes de carbono; iii) A capacidade de o

microrganismo assimilar e metabolizar diferentes fontes de carbono in vivo é

determinado por genes e vias metabólicas específicos (Kingsburg et al., 2006).

A capacidade de assimilar carboidratos assim como substratos que

fornecem nitrogênio e a capacidade fermentativa constituem características muito

empregadas em testes fisiológicos para a definitiva identificação de leveduras de

interesse médico, pois permitem a diferenciação entre as espécies (Jones, 1990;

Sandven, 1990; Milan et al., 1997).

Os fungos são organismos quimio-organotróficos, obtendo sua energia a

partir da quebra de compostos orgânicos (Walker & White, 2005). Remetendo a um

modo de nutrição saprofítica, os fungos filamentosos demonstram naturalmente altos

níveis de secreção de hidrolases extracelulares (Wang et al., 2005; Barry et al.,

2009), o que lhes permitem a degradação extracelular de numerosas substâncias de

alto peso molecular e, consequentemente, a sua utilização (Esteves et al., 1990).

180


Discussão

A identificação das espécies fúngicas, pelos procedimentos microbiológicos

padrões, é demorada e geralmente necessita de profissionais especializados de um

laboratório de referência (Schwarz et al., 2007).

Os resultados de testes de assimilação de diferentes fontes de carbono são

amplamente empregados em laboratórios para a identificação de microrganismos

(Wickerham & Burton, 1948). A metodologia clássica para a realização de testes de

assimilação é proposta por Beijerinck (1889). Marimon et al. (2007) utilizaram uma

metodologia distinta, que emprega a homogeneização de uma suspensão de

conídios do fungo em um meio líquido isento de fontes de carbono. Embora a

metodologia descrita por Beijerinck (1889) seja o método mais comumente utilizado

para a identificação de fungos leveduriformes, optou-se, por utilizar a mesma técnica

empregada e descrita pelo grupo espanhol para a realização dos testes de

assimilação de fontes de carbono, a fim de obtermos parâmetros comparativos de

nossos resultados.

Os isolados estudados neste trabalho apresentaram padrões de assimilação

distintos para as fontes de carbono testadas. Dentre as possibilidades de

combinações diferentes, todas foram apresentadas pelos isolados estudados.

Escolhemos aleatoriamente 70 isolados para repetir os ensaios e avaliar a

reprodutibilidade dos resultados. Satisfatoriamente, dentre os isolados escolhidos

obtivemos o mesmo perfil de assimilação quando comparados aos primeiros

resultados obtidos.

A fisiologia dos fungos determina os parâmetros de dispersão global das

espécies. A possibilidade de utilizar certos nutrientes aliados as condições

ambientais podem suportar a sua posição competitiva no seu ecossistema. Na

natureza, muitos fungos degradam fontes de carbono poliméricas com o intuito de

utilizar os componentes monoméricos como fonte de carbono. No entanto, a

disponibilidade e a diversidade destas fontes de carbono variam fortemente no

181


Discussão

ambiente. O trissacarídeo rafinose (C18H32O16) (α-D-galactopiranosil-(16)-α-D-

glucopiranosil-(1↔2)-β-D-fructofuranosideo), assimilado por 53,52% dos isolados de

Sporothrix spp. avaliados, ocorre naturalmente em sementes de muitas plantas,

especialmente legumes (Côté et al., 2009). O fungo S. schenckii tem sido isolado da

superfície de vegetais. Os isolados que são capazes de assimilar a rafinose

disponível no micro-ambiente podem obter vantagem competitiva no

desenvolvimento sobre os isolados que não são capazes de realizar o metabolismo

de tal carboidrato. Os resultados de assimilação de rafinose, quando positivos,

podem ser indicadores do possível nicho fúngico, além de indicar forte associação

com a capacidade utilizar nutrientes derivados de vegetais. Enquanto alguns

microrganismos do gênero Sporothrix se tornaram especialistas em determinadas

fontes de carbono, outros são mais generalistas, sendo capazes de sobreviverem e

crescerem utilizando uma grande variedade de compostos orgânicos. Estas

diferenças na fisiologia podem, portanto, refletir importantes limites entre as

espécies, além da possibilidade da utilização destes dados como características

taxonômicas.

Os dados sobre a ecologia da maioria dos fungos de importância médica são

escassos. De fato, a capacidade de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio é

um importante determinante do nicho ecológico do microrganismo. De acordo com

Baumgardner (2009), o acúmulo de amônia em certos micro-ambientes pode ser

tóxico para a maioria dos microrganismos, incluindo a maioria dos fungos e

bactérias, porém Blastomyces dermatitidis, um fungo patogênico termodimórfico, é

capaz de sobreviver e crescer em condições de déficit de fontes de carbono

orgânica e altas concentrações de amônia. Para Baumgardner (2009) esta

habilidade pode resultar no sucesso competitivo do agente da blastomicose na

natureza, garantindo a sua sobrevivência em detrimento aos outros organismos

presentes no mesmo micro-ambiente.

182


Discussão

As vias metabólicas assim como os genes que são expressos ou reprimidos

para que haja a assimilação destes açúcares ainda não foram bem descritos em S.

schenckii ou espécies relacionadas (com exceção da glicose). Em bactérias, como

Erwinia chrysanthemi, por exemplo, dois conjuntos de genes, scrKYABR e rafRBA

foram descritos por Hugouvieux-Cotte-Pattat & Charaoui-Boukerzaza (2009) como

necessários para o catabolismo dos carboidratos sacarose e rafinose como única

fonte de carbono disponível para o crescimento. Ambos os grupos gênicos são

controlados pelo ativador global do catabolismo de carboidratos, a proteína

receptora de AMP cíclico (CRP). O ribitol (adonitol) foi assimilado por 94,11% dos

isolados avaliados após 10 dias de incubação. Primrose & Ronson (1980)

descrevem em Rhizobium trifolii, uma bactéria de importância agronômica, uma

enzima denominada ribitol desidrogenase, com ação substrato-específico para o

ribitol.

Durante os últimos anos, a análise da sequência de DNA tornou-se um dos

principais meios de identificação taxonômica das espécies biológicas (Nilsson et al.,

2005; Nilsson et al., 2006), particularmente para microrganismos crípticos ou de

difícil distinção baseado em caracteres morfo-fisiológicos como ocorre no complexo

S. schenckii. Milhares de sequências estão disponíveis em bancos de dados on-line

para a consulta pública. A sequência nucleotídica de um fragmento de

aproximadamente 800 pb do gene da calmodulina foi empregada por Marimon et al.

(2007) para caracterizar e distinguir molecularmente entre os isolados que compõem

o complexo Sporothrix schenckii.

A calmodulina é uma proteína ubíqua, ancestral em organismos eucariotos

(Friedberg & Taliaferro, 2005) e pertence a uma grande família de proteínas ligantes

a íons cálcio Ca2+ (Kretsinger, 1980). Proteínas ligantes de cálcio têm sido

identificadas em muitos fungos filamentosos e leveduras (Ortega Perez et al., 1981;

Hoshino et al., 1992; Ortega Perez et al., 1994; Bindra et al., 1995) e existem cada

183


Discussão

vez mais evidências para o seu envolvimento em inúmeros eventos dependentes de

íons cálcio. Uma mudança conformacional induzida pela interação com íons cálcio

capacita a Calmodulina a interagir com “proteínas alvo de cálcio” as quais incluem

proteínas do citoesqueleto (Bonafé & Sellers, 1998), quinases (Lukas et al., 1998),

fosfatases (Perrino & Soderling, 1998), adenilato ciclase, fosfodiésterases

(Sonnenburg et al., 1998), Ca2+-ATPases, entre outras. O cálcio ligado à calmodulina

possui uma afinidade muito superior, em torno de quatro ordens de magnitude, para

a enzima alvo, do que o cálcio livre da calmodulina. (Pietrobon et al., 1990).

A calmodulina é uma das proteínas mais conservadas conhecidas até hoje,

e é geneticamente representada por um único gene que varia de 1 a 15 Kb (de

Carvalho et al., 2003).

De acordo com Marimon et al. (2008) quando comparamos a sequência de

nucleotídeos do amplicon da calmodulina das espécies do complexo S. schenckii à

sequência correspondente de S. luriei são encontradas 121 alterações em S.

albicans; 62 em S. brasiliensis; 70 em S. globosa; 124 em S. mexicana e 63 em S.

schenckii.

Com relação à variabilidade da sequência da calmodulina em isolados do

complexo Sporothrix schenckii, Marimon et al. (2006) relatam que 12,8% dos

nucleotídeos que compõem a sequência gênica analisada são sítios variáveis,

correspondendo a aproximadamente 100 nucleotídeos. Dentre estes, 84

nucleotídeos são sítios parcimoniosos informativos. Nossos dados moleculares

estão de acordo com o polimorfismo encontrados por Marimon et al. (2006 e 2007).

Estas características moleculares referentes ao sequenciamento do gene da

calmodulina aliados a fatores morfo-fisiológicos, já citados anteriormente, foram

utilizados por Marimon et al. (2006, 2007 e 2008) como subsídio para a proposição

da diferenciação de S. schenckii em um complexo de espécies crípticas

filogeneticamente relacionadas.

184


Discussão

Para Lemke (2001) os três principais aspectos que influenciam a especiação

em fungos são: (i) a grande maioria dos fungos são organismos haplóides; (ii) os

fungos empregam uma considerável quantidade de energia para controlar a

formação e a manutenção de heterocários específicos; e (iii) os fungos tidos como

um grupo são paradoxais, pois num contexto de extravagantes e variados ciclos

sexuais, estes têm uma tendência para restringir o fluxo de genes e a recombinação.

Para a o fungo patogênico S. schenckii assim como para as demais

espécies filogenéticas, recentemente descritas na literatura, ainda não são

conhecidas a forma perfeita ou teleomórfica, assim como o nicho ecológico de cada

espécie, desvendando a sua fonte no meio ambiente. Este fato dificulta o

entendimento das relações gênicas atribuídas a cada espécie e ainda poucas e

inconclusivas afirmações podem ser feitas sobre o processo de especiação para um

determinado grupo de isolados morfologicamente crípticos.

As técnicas de sequenciamento de genomas inteiros, como o

pirosequenciamento, estão cada vez mais sofisticadas e possivelmente possibilitarão

aos pesquisadores olharem de uma forma global para os processos de mutações,

recombinação e fluxo gênico dentro de organismos de uma mesma espécie. Deste

modo, estes futuros dados genômicos serão importantes e poderão ser utilizados

com maior acurácia e confiabilidade como estimativa de diversidade taxonômica

dentro do Reino Fungi.

A comparação entre as classificações adotadas na taxonomia fúngica

indicam que quanto mais informações forem integradas à biologia de um

determinado microrganismo e inseridas no contexto da micose, por exemplo,

influenciará positivamente o sistema de classificação, o qual tem sido proposto de

tempos em tempos, tornando este mais adequado e compreensivo para os

micologistas. Diversos dados publicados na literatura indicam a importância da

distinção entre as espécies do complexo S. schenckii. No âmbito da

185


Discussão

ecoepidemiologia abrem-se novas perspectivas para a amplitude geográfica de

ocorrência destas espécies, assim como para o habitat e o nicho ambiental. Na área

terapêutica, os antifúngicos ganham um enfoque diferencial para as espécies

filogenéticas e reescrevem o tratamento da micose. No campo da biologia, a busca

pelo estado perfeito (teleomorfo) poderá encontrar novas respostas para uma

questão que não estava bem especificada há algumas décadas. Numa perspectiva

sorológica a preparação de antígenos e as moléculas purificadas utilizadas no

diagnóstico necessitam ser mais especificas, uma vez que distintas espécies

filogenéticas poderão influenciar de maneira singular o desenvolvimento da resposta

imune humoral. Na área clínica, a associação entre a forma da doença (cutânea fixa,

linfocutânea, disseminada, etc.) e a espécie filogenética poderão nos ajudar a

compreender melhor a interação fungo-hospedeiro e o desenvolvimento da doença.

Estudos recentes demonstram que algumas espécies definidas com base

em caracteres morfológicos consistem na verdade em entidades crípticas com

distribuição geográfica restrita. Até o momento, pouco são os estudos capazes de

decifrar a estrutura populacional e a distribuição fúngica na natureza. Para alguns

fungos de importância médica o verdadeiro nicho ambiental ainda é completamente

desconhecido ou existem dados escassos. Os estudos taxonômicos que identificam

e descrevem estas espécies crípticas são importantes neste contexto para que

possamos, em estudos futuros, testar hipóteses sobre entidades monofiléticas e

estabelecer com maior confiabilidade a distribuição biogeográfica das espécies

fúngicas.

O fungo S. schenckii, descrito há 112 anos por Schenck, está amplamente

distribuído de acordo com dados publicados na literatura desde a sua descrição,

porém estes dados refletem a distribuição de um grupo polifilético. Os dados

moleculares iniciais publicados na literatura e que discriminam as novas espécies

filogenéticas indicam que S. luriei esta restrito ao continente Africano, enquanto S.

186


Discussão

brasiliensis é restrito ao continente Americano. As demais espécies que compõem

o complexo, como S. globosa e S. schenckii já foram descritas no continente

americano, asiático e europeu (Marimon et al., 2007; Madrid et al., 2009a). Uma

hipótese que explicaria estes achados seria que o processo evolutivo dentro do

complexo S. schenckii estaria relacionado ao fenômeno de vicariância.

Possivelmente, o evento de separação natural dos continentes nos primórdios da

pangéia explique a distribuição destas espécies na natureza. Com a divisão dos

continentes, a população fúngica ancestral teria sido fragmentada e as espécies

fúngicas passaram a adaptar-se a novos hospedeiros e/ou associar-se a novas

formas de vida no ambiente, evoluindo separadamente.

Atualmente, num contexto de mundo globalizado, o aumento das facilidades

de rotas e do fluxo migratório populacional entre áreas endêmicas e não endêmicas

de micoses, aliado ao fato que o homem é um importante hospedeiro deste fungo,

poderia explicar a ocorrência de determinadas espécies em áreas não endêmicas ou

de menor incidência.

Como não existem dados sobre a existência de ciclo parasexual em S.

schenckii, assim como não sabemos ao certo quais são os mecanismos que

governam a troca gênica e proporcionam a variabilidade genética entre as espécies

ou mesmo a adaptabilidade a determinados ambientes e possíveis interações

ecológicas, fica difícil prever a flutuação populacional destas espécies na natureza.

Embora intrigante, o fenômeno de especiação que deu origem ao complexo S.

schenckii é uma questão ainda sem respostas e de difícil comprovação.

Antes de 1960, a dispersão oceânica era uma possível explicação para a

distribuição das espécies fúngicas (Liu et al., 2009a). Posteriormente, e

crescentemente após a validação da teoria das placas tectônicas muitas

distribuições foram explicadas como eventos de vicariância. Entre os fungos, a

vicariância tem sido atribuída como um fenômeno capaz de explicar a distribuição

187


Discussão

das espécies filogenéticas do complexo Gibberella fujikuroi (O’Donnell et al., 1998) e

Hyphoderma setigerum (Nilsson et al., 2003). Por outro lado, recentes avanços nas

técnicas que estimam a taxa de tempo de divergências pela substituição de

nucleotídeos sugerem que em muitos táxons irmãos, espalhados através do oceano,

divergiram mais recentemente do que possa ser explicado pelo evento de

fragmentação continental. Nestes casos, a dispersão oceânica é a explicação mais

racional para os padrões de separação e distribuição das espécies. De fato, muitos

fungos podem ser dispersos por uma variedade de propágulos os quais incluem

esporos, esclerócios e micélio aderido ao tecido de hospedeiros ou substratos. De

acordo com Liu et al. (2009a), não seria surpresa encontrar que dispersão oceânica

desempenhou e desempenha um importante papel nos padrões de separação.

Outro fator que pode influenciar a distribuição desta micose no ambiente

pode estar associado ao fato que este fungo possui o solo como reservatório. O

comércio industrial de solo para fins de jardinagem podem ter importado o fungo

para regiões onde a micose não ocorre. De fato, foi descrito recentemente por

Criseo & Romeo (2010) na Itália, o isolamento e identificação de S. schenckii em

amostras de solo natural e industrial. Como ressaltam os autores, as amostras de

solo comercial em que foram isolados S. schenckii foram adquiridas na Itália, porém

a procedência destas foi atribuída a outros países europeus como Alemanha,

Holanda, Espanha e Austria. Na Itália (e no continente europeu de uma maneira

geral) poucos casos de esporotricose são descritos. Neste exemplo, um dos fatores

que parece influenciar a distribuição e ocorrência da micose no ambiente deve-se

principalmente a introdução do fungo pelo homem através de amostras comerciais

de solo.

Um dos objetivos deste trabalho foi contribuir para a iniciativa da construção

de mapas proteômicos comparativos das espécies do complexo S. schenckii

utilizando inicialmente mapas bidimensionais. Como esperado, a padronização da

188


Discussão

técnica para nossas amostras biológicas exigiu o uso de diferentes protocolos até

que obtivéssemos resultados satisfatórios representados por um amplo número de

“spots” individuais presentes nos géis. As condições foram testadas inicialmente

para o isolado de S. schenckii, Ss 118, e depois de estabelecidas foram aplicadas

para os demais isolados estudados. Em ordem cronológica foram avaliados fatores

como o preparo da amostra (tempo de cultivo, método de lise e solubilização das

proteínas), a focalização isoelétrica e a eletroforese em segunda dimensão.

Os tampões padrões de lise celular são compostos por uréia (9 M), CHAPS

(4%), DTT (1%), anfólitos (0,8%), azul de bromophenol (0,002%). Dentre os tampões

avaliados, os tampões de lise tris-cálcio e uréia-tiouréia associados à lise física por

maceração em nitrogênio líquido obtiveram o melhor perfil protéico quando avaliados

por eletroforese unidimensional. O perfil protéico foi avaliado seguindo os

parâmetros de diversidade, integridade e intensidade das bandas. Porém, quando

avaliamos os dois protocolos de extração frente à eletroforese bidimensional o

protocolo que empregou o tampão tris-cálcio apresentou melhor resolução na

separação das proteínas.

Algumas proteases continuam ativas na presença de uréia e detergentes.

Inibidores de proteases podem inativar a maior parte da atividade proteolítica da

mistura, entretanto, este efeito inibitório não ocorre em sua plenitude em alguns

lisados de células. O PMSF é frequentemente utilizado (8mmol/L), porém este é um

composto tóxico. Misturas (cocktails) comerciais de inibidores de protease são

amplamente utilizadas durante a extração de proteínas e promovem uma eficaz

preservação da integridade da amostra. Deste modo, utilizamos uma mistura de

inibidores de proteases no extrato bruto para a conservação da amostra.

O extrato bruto pode estar “contaminado” com sais, fosfolipídios e ácidos

nucléicos, comprometendo o resultado da focalização isoelétrica. Sobre condições

denaturantes, como as utilizadas nas preparações das amostras, os complexos de

189


Discussão

DNA são dissociados e podem provocar aumento na viscosidade da solução,

inibindo a entrada das proteínas nas tiras de pH imobilizado (IPG strips), dificultando

a migração protéica. O DNA também é capaz de se ligar às proteínas e gerar uma

migração artefactual e arrastes horizontais, facilmente detectados na coloração pela

prata. A utilização de uma mistura comercial de nucleases, contendo DNAse e

RNAse, responsáveis pela degradação dos ácidos nucléicos, diminuiu

significativamente os arrastes observados nos géis.

Diversos protocolos têm sido utilizados para a precipitação de distintas

amostras protéicas. Basicamente a remoção de contaminantes e a inibição da

atividade de protease têm sido atribuídas como benefícios deste procedimento.

Ainda utilizando a eletroforese unidimensional avaliamos quatro protocolos de

precipitação.

O método utilizando a precipitação com TCA acetona foi proposto

inicialmente por Damerval et al. (1986). Este protocolo foi utilizado com algumas

modificações. Após a extração, as proteínas foram misturadas com TCA (10%) em

acetona gelada (–20 ºC). A amostra foi precipitada por centrifugação e o pellet foi

seguidamente lavado em acetona gelada. Após a centrifugação, as proteínas foram

solubilizadas em tampão de solubilização contendo uréia-tiouréia. A desvantagem,

entretanto, é que algumas proteínas ácidas são perdidas durante este processo,

porque elas não são precipitadas. A utilização de DTT (20 mM) foi preferida à

utilização de 2-mercaptoetanol, com o objetivo de aumentar o número de proteínas

básicas.

A utilização do 2D Clean-up kit é prática e reprodutível. A sua utilização não

implica em ganho ou perda de spots segundo o fabricante. O princípio é semelhante

ao método proposto por Damerval et al. (1986). Com a adição de um detergente co-

precipitante, as proteínas são mais eficientemente e completamente removidas do

extrato bruto. O “wash buffer” contém aditivos orgânicos que possibilitam a rápida e

190


Discussão

completa ressuspensão das proteínas com o tampão de solubilização (Stasyky et al.,

2001).

Dentre os protocolos testados a utilização do 2D Clean up kit da GE

Healthcare apresentou melhor perfil de precipitação de proteínas, incluindo proteínas

de alto e baixo peso molecular, além de apresentar melhor reprodutibilidade durante

os ensaios. Este fato nos levou a adotar este método de precipitação para aplicação

nos ensaios de eletroforese bidimensional.

A solubilização das proteínas após a precipitação é um passo importante da

focalização isoelétrica. Altas concentrações de uréia são necessárias para converter

proteínas em conformações primárias pelo cancelamento das estruturas secundárias

e terciárias, para solubilizar proteínas hidrofóbicas na solução e evitar as interações

proteína-proteína. Em alguns casos, um segundo denaturante caotrópico, como a

tiouréia, tem sido adicionado à tampões contendo 7-9 M de uréia com a intenção de

aumentar a solubilidade de proteínas muito hidrofóbicas, como proteínas de

membrana.

O CHAPS é um detergente zwitteriônico, sendo seu uso preferível às

misturas poliol não iônicas como Triton X-100 e NP-40, devido a sua pureza ser

superior. A adição do CHAPS à solução aumenta a solubilidade de proteínas

hidrofóbicas. Outra característica importante é o fato de que a espectrometria de

massas é particularmente sensível a contaminantes derivados de detergentes como

o Triton X-100. Agentes redutores como o DTT previnem diferentes passos de

oxidação das proteínas. O DTT pode tornar-se ionizado acima do seu pK de 8 e

migrar através ânodo durante a IEF em gradiente de pH básico. Isto leva a streaks

horizontais derivadas de alguns spots na área básica. Anfólitos, os quais têm sido

designados para geração de gradientes de pH, aumentam consideravelmente a

solubilidade das proteínas pela substituição de tampões iônicos. A utilização do

191


Discussão

tampão uréia-tiouréia apresentou melhores resultados durante os ensaios de

padronização.

Deste modo resolvemos empregar o método de extração física através da

maceração da amostra em nitrogênio líquido, associado à lise celular química,

utilizando o tampão tris-cálcio, seguido de precipitação das proteínas suspensas no

extrato bruto com auxílio do 2D Clean-up kit e solubilização das proteínas

precipitadas utilizando o tampão uréia-tiouréia. Este protocolo resultou na extração

de uma grande quantidade de proteínas, de forma reprodutível, revelando um

proteoma altamente complexo, composto de proteínas de baixa e alta massa

molecular, bem como de proteínas ácidas e básicas.

Barreira (2007) padronizou a técnica de eletroforese bidimensional para a

análise de proteínas de superfície do S. schenckii. A autora relata que variações nas

condições de cultivo (inóculo inicial) para a obtenção da fase leveduriforme levam a

significativas alterações na expressão de proteínas evidenciado pela alteração do

perfil proteômico bidimensional. Este trabalho ilustra a importância na determinação

rigorosa das condições experimentais a serem utilizadas na abordagem proteômica.

A comparação do perfil bidimensional de proteínas dos isolados do

complexo Sporothrix schenckii evidenciam a existência de diferenças significativas

entre as espécies estudadas.

Dentre todas as proteínas expressas in vitro pelas leveduras das diferentes

espécies de Sporothrix sp, 475 spots apareceram exclusivamente em pelo menos

uma das quatro classes (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis e S. mexicana). O

sequenciamento destas proteínas fornecerá dados importantes sobre a biologia

destes microrganismos assim como será útil para a proposição de marcadores

biológicos nestas espécies.

Alguns resultados publicados recentemente por Fernandes (2009) e

Fernandes et al. (2009a,b) podem ajudar a esclarecer as diferenças nos níveis de

192


Discussão

expressão encontrados para os isolados Ss 06, Ss 54 e Ss 118. Estes resultados

serão discutidos abaixo e co-relacionados com nossas hipóteses para as diferenças

nos níveis de expressão.

De acordo com Fernandes et al. (2009b) os isolados brasileiros de S.

schenckii apresentam grande variabilidade genética quando avaliados por RAPD

(primer OPD18) com a reunião de 7 grupos majoritários. Dentre os isolados

estudados, o isolado Ss 06 apresenta genótipo I.b.2.1, distinto de Ss 118

(I.b.2.2.1.1) e de Ss 54, o qual apresenta genótipo II.

Dentre as características genéticas dos isolados de S. schenckii

representativos do Brasil, analisado por Southern blot, observadas para a digestão

do DNA genômico com a enzima APA I e hibridização com a sonda ITS, Fernandes

(2009) relata a presença de três perfis distintos. O isolado Ss 54 pertence ao grupo I

(bandas 3.849,81 bp e 1.548,38 bp) enquanto o isolado Ss 06 pertence ao grupo III

(bandas 13.103,88 bp, 8.989,17 bp, 7.215,06 bp, 6.363,26 bp, 5.107,40 bp e

4.504,43 bp).

Outro fator avaliado por Fernandes (2009) leva em consideração a

capacidade de isolados de Sporothrix spp. na indução à morte. O isolado de

Sporothrix globosa (Ss 06) não é capaz de levar camundongos Balb/C à morte após

20 semanas de infecção. O isolado Ss 54 de S. brasiliensis foi capaz de induzir a

morte na segunda semana de infecção. Com relação à capacidade de colonização e

disseminação para os órgãos fígado, baço e pulmões em camundongos Balb/c, o

isolado Ss 54 foi capaz de colonizar todos os órgãos avaliados enquanto que o

isolado Ss 06 não foi capaz de disseminar no modelo experimental murino. Os

resultados obtidos por Fernandes (2009) são concordantes com os obtidos por

Arrillaga-Moncrieff et al. (2009) utilizando camundongos OF1. Os dados de ambos

os grupos confirmam que a espécie filogenética S. brasiliensis é altamente

patogênica em modelo murino experimental, enquanto que a espécie S. globosa

193


Discussão

apresenta dificuldades para obter sucesso na infecção. No atual trabalho fomos

capazes de detectar 262 proteínas diferencialmente expressas entre estas duas

espécies, onde, 154 proteínas, aparecem exclusivamente no isolado Ss 54 além da

ocorrência de expressão superior em 12 proteínas em S. brasiliensis quando

comparado com S. globosa (Ss06).

Os isolados selecionados para os estudos proteômicos apresentam

diferenças fenotípicas, genotípica e de virulência já observadas por Fernandes

(2009) e Fernandes et al. (2009a,b). Os perfis bidimensionais de proteínas

observados deixam claro que existem diferenças significativas entre as espécies

filogenéticas estudadas, fornecendo subsídios que fortalecem a separação destes

microrganismos em espécies distintas.

O estudo das proteínas imunogênicas dos isolados do complexo Sporothrix

schenckii foi proposto neste trabalho. A caracterização bioquímica e imunológica

destas moléculas são importantes por fornecerem subsídios para a compreensão da

interação parasito-hospedeiro e da resposta imune humoral na esporotricose

humana. O conhecimento das proteínas imunodominantes de Sporothrix spp. pode

ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e para o

estabelecimento de testes para o diagnóstico diferencial entre os agentes etiológicos

e as diversas manifestações clínicas doença.

Almeida-Paes et al. (2007) relataram em pacientes a presença de anticorpos

da classe IgG, IgM e IgA contra antígenos brutos secretados in vitro durante a fase

micelial de Sporothrix schenckii. Anticorpos IgG possuem um papel importante na

patogênese da doença.

De acordo com as condições biológicas estabelecidas neste trabalho para a

aquisição e fracionamento do extrato protéico celular total de leveduras de

Sporothrix spp. observamos através da técnica de Western-Blot quais são as

proteínas que são reconhecidas por imunoglobulinas séricas do tipo G (IgG) na

194


Discussão

esporotricose humana. Para tanto, estabeleceu-se um pool de soro de 15 pacientes

que apresentam o quadro clínico de esporotricose.

As imunoglobulinas presentes no soro de pacientes infectados com

Sporothrix sp e que desenvolveram a forma cutânea fixa da doença foram capazes

de reconhecer 14 proteínas de S. schenckii, 9 proteínas de S. brasiliensis 13

proteínas de S. globosa e 6 proteínas de S. mexicana. Os anticorpos gerados nos

pacientes que desenvolveram esporotricose linfocutânea foram capazes de

reconhecer 6 proteínas de S. schenckii, 8 proteínas de S. brasiliensis, 16 proteínas

de S. globosa e 6 proteínas de S. mexicana.

A resposta imune humoral na esporotricose murina foi avaliada por

Fernandes (2009) utilizando proteínas secretadas in vitro pela fase micelial de

culturas de Sporothrix. Houve diferenças significativas no perfil de secreção de

proteínas entre os isolados (Fernandes et al. 2009a) assim como no reconhecimento

por anticorpos IgG. As frações protéicas secretadas pelo isolado Ss 06 (160, 120,

87, 60, 45 e 40 kDa) não foram reconhecidas por Igs presentes no soro de

camundongos. O isolado Ss 54 secretou oito frações protéica/glicoprotéica (110, 87,

80, 60, 45, 40, 38 e 30 kDa) sendo reconhecidas as frações de 80, 60 e 30 kDa.

Em nosso estudo, 6 proteínas presentes no extrato protéico celular total de

ambos os isolados, Ss 06 e Ss 54, foram reconhecidos de maneira idêntica por

anticorpos IgG presentes na esporotricose humana em ambas as formas clínicas

(cutânea fixa e linfocutânea).

Dentre as proteínas celulares expressas pelas leveduras, uma molécula de

aproximadamente 70 kDa foi majoritariamente reconhecida por três (Ss 06, Ss 54 e

Ss 118) dos quatro isolados estudados em ambas as formas clínicas avaliadas

(esporotricose cutânea fixa e linfocutânea). O isolado de Sporothrix mexicana, FMR

9108, não apresentou a reatividade característica dos demais isolados do complexo.

195


Discussão

As respostas do sistema imune inato são mediadas pelas células fagocíticas

como os macrófagos e neutrófilos, os quais fagocitam e matam os patógenos

invasores e, então, estimulam o sistema imune adaptativo através da secreção de

citocinas e quimiocinas (Dostert & Tschopp, 2007). Os mecanismos de defesa do

hospedeiro influenciam na manifestação e severidade das infecções fúngicas, de

modo que as formas clínicas da doença dependem da resposta imune do paciente

(Romani, 2004, 2007). Ambos, os fatores patogênicos de isolados de S. schenckii e

o estado imunológico do hospedeiro podem determinar as manifestações clínicas da

esporotricose, entretanto, os fatores envolvidos na patogênese de S. schenckii e os

mecanismos que determinam a sua virulência permanecem obscuros (Uenotsuchi et

al., 2006). Acredita-se que o tamanho inicial do inoculo, a integridade do sistema

imune do hospedeiro, a virulência do fungo, a profundidade em que este é inoculado

e a termotolerância possuam um papel importante no desenvolvimento da doença

no hospedeiro mamífero.

O escape das defesas do sistema imune é um fator crucial para a

sobrevivência e/ou multiplicação no hospedeiro para muitos microrganismos,

incluindo S. schenckii. De acordo com Uenotsuchi et al. (2006) os isolados

provenientes de esporotricose cutânea são mais eficazes para ativar as células

dendríticas e induzir subsequentemente uma reposta imune via Th1, do que isolados

de origem visceral como evidenciado pela: (i) forte expressão de HLA-DR e outras

moléculas co-estimulatórias e (ii) alta indução de citocinas Th1(IFN-γ e TNF-α).

Importantes vias de sinalização como JNK e p38 MAPK, podem estar envolvidas na

indução diferencial de resposta Th1 por isolados de S. schenckii de diferentes

origens (Uenotsuchi et al., 2006).

A resposta imune humoral na esporotricose é diversa. Fatores como o grupo

de antígeno utilizado, as características biológicas do agente etiológico, a

integridade do sistema imune do hospedeiro assim como o seu perfil genético

196


Discussão

podem influenciar no perfil de moléculas reconhecidas por imunoglobulinas

presentes no soro de pacientes.

Scott & Muchmore (1989), por meio da técnica de Western blot

unidimensional, observaram que 100% dos soros de pacientes utilizados

reconhecem as moléculas de 40 kDa e 70 kDa. As moléculas de 22 e 36 kDa foram

reconhecidas pela maioria dos soros de pacientes com esta micose. Mendoza et al.

(2002) relataram que as bandas de 40 kDa, 55 kDa, 74 kDa, 90 kDa e 147 kDa são

reconhecidas por anticorpos presentes em soros de pacientes com esporotricose.

É importante ressaltar que fatores como o meio de cultura utilizado para a

produção do extrato protéico/glicoprotéico podem influenciar o perfil de proteínas

expressas e deste modo interferir na diversidade de reconhecimento,

consequentemente dificultando a comparação de resultados.

De acordo com Fernandes (2009), os anticorpos gerados na esporotricose

murina experimental reconhecem as moléculas de 90 kDa, 87 kDa, 80 kDa, 75kDa,

60 kDa, 45 kDa, 38 kDa e 30 kDa. A diversidade de combinações de

reconhecimento ocorreu em função do exoantígeno testado. A molécula que foi mais

reconhecida em diferentes exoantígenos foi a de 60 kDa, em 5 de 10 exoantígenos

avaliados. Por outro lado, de acordo com Carlos et al. (1999) na esporotricose

experimental murina, os anticorpos presentes no soro reconhecem a molécula de 67

kDa.

Nascimento & Almeida (2005) apontam como molécula imunodominante da

esporotricose experimental a fração de 70 kDa. Posteriormente, Nascimento (2008)

e Nascimento et al. (2008) demonstraram que esta molécula é uma glicoproteína

presente na superfície das células leveduriformes e é uma adesina putativa para

fibronectina e laminina.

De acordo com Fernandes (2009) as frações protéicas de 70 e 38 kDa

secretadas in vitro são majoritariamente reconhecidas na esporotricose humana,

197


Discussão

independente da forma clínica avaliada (cutânea fixa ou linfocutânea). Nossos

resultados de reconhecimento antigênico são congruentes com os encontrados por

Nascimento & Almeida (2005) e Fernandes (2009).

O isolamento e a caracterização parcial do antígeno de 70 kDa de Sporothrix

schenckii foi realizada por Ruiz-Baca et al. (2009). No referido trabalho a molécula

de 70 kDa purificada foi fracionada por eletroforese bidimensional utilizando IPG

strips de pH3-10 (11 cm). A reação com anticorpos policlonais anti-gp70,

provenientes de soro hiperimune de coelho detectou a molécula na faixa de pH de

4.1.

Quando utilizamos IPG strips com resolução superior (13 cm, pH4-7)

identificamos a presença de pelo menos 8 moléculas, possivelmente isoformas, nas

espécies estudadas e que variam de pI de 4.3 à 4.8, todas sendo reconhecidas por

anticorpos gerados na resposta imune humoral humana.

De acordo com Ruiz-Baca et al. (2009) aproximadamente 5,7% da massa

molecular da proteína é influenciado por glucanos N-ligados. A glicosilação da

molécula de 70 kDa pode ser responsável pela alteração no peso molecular

observado para as possíveis isoformas desta proteínas. Observamos variações no

peso molecular e no ponto isoelétrico das proteínas imunogênicas expressas (com

exceção de FMR 9108) e entre as diferentes espécies analisadas. A reação

característica destas proteínas foi observada na altura de 62-55 kDa em S.

brasiliensis (ID: 1-6), 73-64 kDa em S. globosa (ID: 1-8) e 70-68 kDa em S. schenckii

(ID: 1-6).

A presença de anticorpos específicos contra as moléculas de 70 kDa pode

ser importante para a defesa do hospedeiro uma vez que Ruiz-Baca et al. (2009)

demonstram in vitro que as células leveduriformes de S. schenckii aderem à derme

de camundongos e que a presença de anticorpos anti-gp70 reduzem este processo

de maneira dose-dependente.

198


Discussão

A identificação de espécies crípticas ainda é um desafio para os

micologistas. A habilidade de delimitação destes microrganismos influencia a

estimativa da diversidade fúngica. O monitoramento das micoses cutâneas,

subcutâneas e sistêmicas depende diretamente da precisão da identificação do

suposto agente infeccioso. Nosso estudo sobre o agente etiológico da esporotricose

humana e animal teve como foco abordar características eco-epidemiológicas,

fenotípicas, genotípicas, proteômicas e imunoproteômicas levando em consideração

as alterações na taxonomia deste fungo. O uso correto da taxonomia pode revelar

aspectos e características importantes de uma população heterogênea que

previamente era tratada de forma homogênea. À medida que mais dados biológicos

tornarem-se disponíveis para estas espécies, teremos uma compreensão mais

precisa da sua estrutura populacional, distribuição e flutuação geográfica, do seu

papel nas manifestações clínicas da doença, nos perfis de sensibilidade e

mecanismos de resistência a diferentes antifúngicos, em suma, das complexas

relações biológicas que estão por trás do complexo Sporothrix schenckii.

199


Conclusões

6. CONCLUSÕES

A população de Sporothrix spp. é altamente heterogênea ao longo do território

brasileiro, levando-se em consideração os aspectos morfológicos, fisiológicos e

moleculares;

Os isolados de Sporothrix spp. apresentam padrões de crescimento vegetativo

rápido, intermediário e lento dependendo do isolado. A temperatura de

incubação in vitro afeta a taxa de crescimento vegetativo assim como a

morfologia (macroscópica) dos isolados do complexo S. schenckii;

Os isolados do complexo S. schenckii apresentam padrões diferenciados de

assimilação de fontes de carbono e os açúcares sacarose, rafinose e ribitol são

importantes marcadores fisiológicos para a classificação dos isolados

brasileiros;

A sequência nucleotídica de um fragmento de aproximadamente 800 pb do

gene da calmodulina foi suficiente para a correta classificação dos isolados

brasileiros inicialmente identificadas como S. schenckii. Assim sendo, os 161

isolados recebidos como S. schenckii foram redefinidos como: 82 S. schenckii,

71 S. brasiliensis, 3 S. mexicana e 3 S. globosa. Dois isolados, Ss 146 e Ss

147 não foram classificados como Sporothrix spp. e sim como Blastobotrys

proliferans.

A utilização de caracteres moleculares não exclui a utilização de caracteres

morfológicos e estes dados devem ser analisados de maneira integrada para a

correta identificação dos isolados do complexo S. schenckii.

Foi detectada a presença das espécies filogenéticas S. schenckii, S.

brasiliensis, S. globosa e S. mexicana em território brasileiro como agentes da

esporotricose humana e felina.

200


Conclusões

Ocorre alta frequência da espécie filogenética S. brasiliensis em felinos e estes

podem ser responsáveis pela epidemiologia da doença e prevalência desta

espécie filognética em humanos nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande

do Sul, onde ocorrem epidemias de esporotricose felina; Nos demais estados

avaliados, onde não são relatados surtos de esporotricose felina, ocorre o

predomínio da espécie S. schenckii em humanos, indicando outras fontes de

aquisição da micose no ambiente;

Os perfis bidimensionais de proteínas observados deixam claro que existem

diferenças significativas entre as espécies filogenéticas estudadas, fornecendo

subsídios que fortalecem a separação destes microrganismos em espécies

distintas;

O padrão de reconhecimento antigênico de proteínas dos fungos por anticorpos

circulantes presentes no soro de pacientes com as formas cutânea fixa e

linfocutânea da esporotricose foi semelhante entre os isolados de S.

brasiliensis, S. globosa e S. schenckii estudados e as duas formas clínicas

escolhidas. A molécula de 70 kDa destas espécies foi majoritariamente

reconhecida por anticorpos IgG e pode ser considerada um bom marcador

sorológico para o diagnóstico da esporotricose provocada por estas espécies;

A espécie S. mexicana apresenta perfil protéico e perfil antigênico diferente das

demais espécies estudadas assim como entre as formas clínicas cutânea fixa e

linfocutânea da doença.

201


Referências Bibliográficas

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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231


Apêndice I

8. APÊNDICE I

Meios de cultura

Meio Sabouraud (SDA - Sabouraud Dextrose Agar)

Peptona de caseína…..…………....................…………………...………........ 5 g

Peptona de carne…………………………………....................………….……. 5 g

Dextrose……………………………………………………………..................... 40 g

Ágar……………………………………………………….………........................ 15 g

Água destilada q.s.p. .................................................................................... 1.000 mL

pH 5.6 ± 0.2 (25 °C)

Foram dissolvidos 65 g do meio de cultura SDA (Acumédia, USA) em água destilada

suficiente para 1.000 mL até se obter uma suspensão homogênea. O meio de cultura foi autoclavado

a 1 atm e 120 ºC durante 20 min.

Meio PDA - Potato Dextrose Agar (Hawksworth et al., 1995)

Extrato de batata (infusão 200 g)................................................................. 4 g

Dextrose....................................................................................................... 20 g

Ágar.............................................................................................................. 15 g

Água destilada q.s.p. ................................................................................... 1.000 mL

Trinta e nove gramas do meio de cultura PDA (Acumédia, USA) foram dissolvidos em água

destilada suficiente para 1.000 mL. O meio de cultura foi autoclavado, 1 atm e 120 ºC durante 20 min.

Meio BHI (Brain-Heart-Infusion)

Infusão de cérebro e coração...................................................................... 17.5 g

Digestão enzimática de gelatina………………………...……...................… 10 g

Dextrose…………………………………………………………...................… 2 g

Cloreto de sódio……………………………………………….…..................... 5 g

Fosfato de disódio………………………………………………...................... 2.5 g

Água destilada q.s.p. .................................................................................. 1.000 mL

pH 7,5 ± 0,2 (25 °C)

Trinta e sete gramas do meio de cultura BHI (Acumédia, USA) foram adicionadas a 1.000 mL

de água destilada. Para a obtenção do meio sólido foram adicionados à suspensão 20 g de ágar. O

pH do meio de cultura quando necessário foi ajustado em 8,0 e, em seguida, autoclavado a 1 atm e

120 ºC durante 20 min.

232


Apêndice I

Meio CMA – Corn Meal Agar (Atlas & Snyder, 2006)

Farinha de milho (Fubá)………………………………....................…………. 30 g

Ágar………………………………………………….…………......................... 15 g

Água destilada q.s.p. .................................................................................. 1.000 mL

pH 5.6 ± 0.2 (25 °C)

Foram dissolvidos 30 g de fubá em 500 mL de água. A seguir, a solução foi aquecida a 100°C

e homogeneizada durante 1 hora. Após este procedimento a solução foi filtrada em gaze para

remoção do material particulado formado durante o preparo. Em outro recipiente foram dissolvidos 15

g de ágar em 500 mL de água destilada. As soluções resultantes foram reunidas em Becker e o

volume foi ajustado para 1.000 mL. O meio de cultura foi autoclavado a 1 atm e 120 ºC durante 20

min.

Soluções corantes utilizadas para a visualização das estruturas morfológicas, em microscópio

óptico, dos isolados de Sporothrix spp.

Solução de Lactofenol (Barnett et al., 1974)

Ácido lático.................................................................................................. 20 g

Fenol............................................................................................................ 20 mL

Glicerol........................................................................................................ 40 mL

Água destilada autoclavada........................................................................ 20 mL

Solução de Lactofenol azul de algodão (Barnett et al., 1974)

Ácido lático................................................................................................... 20 g

Fenol............................................................................................................. 20 mL

Glicerol.......................................................................................................... 40 mL

Azul de algodão............................................................................................ 0.05-0.10 g

Água destilada autoclavada.......................................................................... 20 mL

233


Apêndice I

Soluções para extração de DNA de leveduras de S. schenckii.

Tampão de protoplasto.

β-Mercaptoetanol.......................................................................................... 10 µL

Tris-HCl, 1M, pH 7,5..................................................................................... 100 µL

EDTA, 0,5 M................................................................................................. 20 µL

Zimoliase 0,2 mg/mL.................................................................................... 2 µL

18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 870 µL

As soluções de Tris-HCl (1 M, pH 7,5) e EDTA (0,5 M) foram preparadas separadamente e

autoclavadas a 1 atm e 120 °C durante 20 min. A enzima Zimoliase foi adicionada apenas no

momento do uso do tampão.

Tampão de lise do protoplasto.

NaOH 10N.................................................................................................... 20 µL

SDS 10%...................................................................................................... 100 µL

Proteinase K................................................................................................. 20 mg

18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 880 µL

As soluções de NaOH (10 N) e SDS a 10% foram preparadas separadamente e autoclavadas

a 1 atm e 120 °C durante 20 min. A proteinase K foi adicionada apenas no momento do uso do

tampão.

Solução Acetato de potássio, 5M, pH 5,4.

Acetato de potássio...................................................................................... 49,07 g

18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 100 mL

O pH da solução foi ajustado em 5,4 e autoclavada a 1 atm e 120 °C durante 20 min.

Tampão TBE (10X) (Sambrook et al., 2001)

Trizma base................................................................................................. 108 g

Ácido Bórico................................................................................................ 55 g

EDTA 0,5 M pH 8,0..................................................................................... 40 mL

18MΩ Água MilliQ®...................................................................................... 1.000 mL

O tampão TBE 10 X foi preparado e em seguida autoclavado a 1 atm e 120 °C durante 20

min.

234


Apêndice I

Tampão de amostra de DNA 6X (Sambrook et al., 2001)

Azul de bromofenol...................................................................................... 0,25 g

Xileno cianol FF........................................................................................... 0,25 g

Sucrose....................................................................................................... 40 g

18MΩ Água MilliQ® q.s.p ............................................................................ 100 mL

O tampão de amostra de DNA foi preparado assepticamente, esterilizado por filtração com

filtros Millipore 0,22 µm, sendo em seguida aliquotado em tubos tipo Eppendorf e armazenado a 4ºC.

Soluções utilizadas em técnicas Proteômicas

Tampão de lise celular I (Adaptado de Chandler et al., 2008)

Tris-HCl, 1M, pH 7,6..................................................................................... 20 mM

NaCl, 1M....................................................................................................... 10 mM

Deoxicolato de sódio 0,5 M.......................................................................... 0,5 mM

Cocktail de inibidor de protease (1X)............................................................ 40 µL/mL

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 1.000 µL

A solução de Deoxicolato de sódio (0,5 M) foi aquecida a 60 °C durante 15 min para a

completa dissolução do reagente, sendo em seguida esterilizada por filtração em filtro Millipore® 0,22

µm de diâmetro. As soluções de Tris-HCl (1M, pH 7,6) e NaCl (1M) foram autoclavadas a 1 atm e a

120 °C, durante 20 min. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado

apenas no momento do uso do tampão.

Tampão de lise celular II (Adaptado de Winters et al., 2008)

Uréia.......................................................................................................... 9M

CHAPS...................................................................................................... 2%

DTT............................................................................................................ 1%

Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 10 mM

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 µL

Foram dissolvidos a uréia, o CHAPS e o DTT em água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A

solução foi homogeneizada e esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de

diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no


235


Apêndice I

Tampão de lise celular III (Adaptado de Missall et al., 2008)

Tris HCl, 1M, pH 9,0.................................................................................. 40 mM

CHAPS...................................................................................................... 4%

EDTA 0,5 M............................................................................................... 1 mM

Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 1 x


O detergente aniônico CHAPS foi inicialmente dissolvido em 250 µL de água MilliQ®. A seguir

foram adicionadas as quantias correspondentes de Tris-HCl (1M, pH 9,0) e EDTA (0,5M)

(autoclavados separadamente a 1 atm e 120 °C durante 20 min). O volume da solução foi ajustado

para 1.000 µL e a solução resultante foi esterilizada por filtração, utilizando um filtro Millipore® 0,22

µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no


Tampão de lise celular IV (Tris-Cálcio) (Silva et al., 1994; Salem et al., 1997; Da Fonseca et al.,

2001)

Tris-HCl, 2M, pH 8,8……………………………………………..................... 1 %

CaCl2, 1M……………………….………………………………...................... 0,5 %


DTT*.......................................................................................................... 20 mM


As quantias correspondentes das soluções de Tris-HCl (2M, pH 8,8) e CaCl2 (1M) foram

adicionadas ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução resultante foi esterilizada

por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE

Healthcare, USA) foi adicionado apenas no momento do uso do tampão. *Após a extração, foi

adicionado 20 mM de DTT à suspensão de proteínas.

Tampão de lise celular V (Uréia)

Uréia………………….…………………………………………...................... 8 M

CHAPS…………………………….……………………………...................... 2 %

IPG Buffer pH 3-10..................................................................................... 2 %

DTT............................................................................................................ 20mM


Cocktail de nuclease (1X).......................................................................... 10 mM

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1000 µL

236


Apêndice I

A uréia, o CHAPS e o DTT foram dissolvidos em 500 µL de água MilliQ. A suspensão foi

homogeneizada com auxílio de uma micropipeta. Após a dissolução completa, adicionou-se o IPG

Buffer pH 3-10 ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução resultante foi

esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de

protease e o cocktail de nuclease (GE Healthcare, USA) foram adicionados apenas no momento do

uso do tampão.

Tampão de lise celular VI (Uréia-Tiouréia)

Uréia………….……...................……………………………………………... 7 M

Tiouréia..…...…………………….....................……………………………… 2 M

CHAPS…...……………………………..………...................………………... 2 %

IPG Buffer pH 3-10..................................................................................... 2 %

DTT............................................................................................................ 20mM


Cocktail de nuclease (1X).......................................................................... 10 mM


A uréia, a tiouréia, o CHAPS e o DTT foram dissolvidos em 500 µL de água MilliQ. A

suspensão foi homogeneizada com auxílio de uma micropipeta. Após a dissolução completa,

adicionou-se o IPG Buffer pH 3-10 ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução

resultante foi esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de

inibidor de protease e o cocktail de nuclease (GE Healthcare, USA) foram adicionados apenas no


Tampão de lise celular VII

Tris-HCl, 1M, pH 7,6.................................................................................. 20 mM

NaCl, 1M.................................................................................................... 10 mM

Triton X-100............................................................................................... 2%

Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 40 µL/mL


As soluções de Tris-HCl (1M, pH 7,6) e NaCl (1M) foram autoclavadas a 1 atm e 120 °C

durante 20 min. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no


237


Apêndice I

Tampão (I) de solubilização de proteínas e reidratação para Immobiline™ DryStrip gels (GE

Healthcare).

Uréia……………...................……………………….………………………... 8 M

CHAPS…………………………....................………..………………………. 2 %

IPG Buffer*................................................................................................. 2 %

DeStreak®.................................................................................................. 1,2 %

Azul de bromophenol................................................................................. 0,8 %


*Anfólitos (IPG Buffer) aplicados de acordo com a faixa de pH das strips utilizadas, pH 3-10

ou pH 4-7.

Tampão (II) de solubilização de proteínas e reidratação para Immobiline™ DryStrip gels (GE

Healthcare).

Uréia………....................…..………………………………………..………... 7 M

Tiouréia………….…………....................……………………..……………… 2 M

CHAPS……………………………………....................…..…..……………... 2 %

IPG Buffer*................................................................................................. 2 %

DeStreak®.................................................................................................. 1,2 %

Azul de bromophenol................................................................................. 0,8 %


*Anfólitos (IPG Buffer) aplicados de acordo com a faixa de pH das strips utilizadas, pH 3-10

ou pH 4-7.

Tampão de equilíbrio para Immobiline™ DryStrip gels (GE Healthcare).

Uréia.......................................................................................................... 6 M

Tris-HCl pH 8,8.......................................................................................... 0,375 M

Glicerol....................................................................................................... 20 %

SDS........................................................................................................... 2 %

DTT1.......................................................................................................... 0,1 %

Iodoacetamida2.......................................................................................... 0,2 %

Azul de Bromophenol................................................................................ Traço

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL

O DTT1 ou a Iodoacetamida

2 foram adicionados separadamente ao tampão para a redução

ou alquilação das proteínas respectivamente.

238


Apêndice I

PBS 10X (1,5M, pH 7,4)

NaCl………...................……..…………………..…………….……………… 80 g

KCl………………….……...................……….….…………..……………...... 2 g

Na2PO4…………………..……….….…...................……….………………... 14,4 g

KH2PO4…………………….…………….……………...................………….. 2,4 g


O KH2PO4 foi dissolvido em 100 mL de água MilliQ e o pH foi ajustado para 7,2. Após a

dissolução completa, os demais reagentes foram adicionados e completou-se o volume de água

MilliQ® suficiente para 1.000 mL. O tampão foi preparado e em seguida autoclavado a 1 atm e 120 °C

durante 20 min.

Gel de poliacrilamida 10% (Segunda dimensão)

Acrilamida (30%), Bis-acrilamida (8%)...................………….……..……… 15 mL

Tris-HCl, pH 8,8…………………………………………....................….…… 16,8 mL

SDS 10%................................................................................................... 300 µL

Perssulfato de amônio (10%)….……………………..……..….................... 450 µL

TEMED...................................................................................................... 30 µL

Água MilliQ® 18MΩ.................................................................................... 14,7 mL

1D SDS-PAGE

Solução estoque Gel de

separação (10%)

Gel de

empacotamento (3%)

Acrilamida (30%), Bis-acrilamida (8%).............. 5 mL 0,65 mL

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 – SDS 0,2%................... 3,75 mL ---

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 – SDS 0,2%................... --- 1,25 mL

Água MilliQ® 18MΩ............................................ 6,25 mL 3,05 mL

Perssulfato de amônio (10%)………….............. 50 µL 25 µL

TEMED……………………………………............ 10 µL 5 µL

239


Apêndice I

Tampão de corrida para SDS-PAGE (10 X)

Trizma Base…………………………...................…………………………… 30,825 g

Glicina…………………………..……………………......................…………. 144,13 g

SDS………………………………....……………………………..................... 10 g


pH 8,0

O tampão de corrida eletroforética de proteínas 10 X foi preparado e estocado a 4 °C até o momento

do uso.

Tampão de amostra 4X para proteínas SDS-PAGE

Trizma HCl 0,5 M, pH 6,8….……......................…..……..………………… 6 mL

SDS…………………………….…..……………….....................……………. 1 g

Glicerol…………………………..….…………………………....................… 5 mL

Azul de bromofenol………………………….…………..…..…..................... 0,005 g

β-mercaptoetanol 1%................................................................................. 120 µL


pH 8,0

Detecção de proteínas utilizando Nitrato de prata (géis analíticos)

As proteínas foram visualizadas pela coloração com nitrato de prata, de acordo com a

metodologia proposta por Blum et al. (1987).

Solução de fixação I (16 horas)

Metanol……………………….……....................……………………………..... 125 mL

Ácido Acético………………………….…………...................………………… 30 mL

Formaldeído 37%......................................................................................... 125 µL

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 250 mL

Solução de lavagem (30 min)

Etanol……………………………...................…………………..……………… 125 mL

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 250 mL

Solução de sensibilização (10 min – 30 min)

Tiossulfato de sódio…………….………….…..….………...................……. 0,05 g

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 mL

240


Apêndice I

Solução de coloração (10 min – 30 min)

Nitrato de prata…………….………..………………………...................…... 0,5 g

Formaldeído (37%)……….…….………………………………..................... 175 µL


Solução de revelação

Carbonto de sódio………….…………………………………….................... 15 g

Tiossulfato de sódio………………………………………….…..................... 0,001 g


Solução de parada

Metanol……………....................……………………………………………... 125 mL

Ácido acético……………………...................……………….………………. 30 mL


Solução de lavagem

Metanol…………..…………………………..…………………...................... 125 mL

Água MilliQ® 18MΩ q.s.p........................................................................... 250 mL

Detecção de proteínas utilizando Coomassie coloidal (géis preparativos)

Solução de fixação II (16 horas)

Metanol……..……….………...................………………………….………... 40 mL

Ácido acético………………………………...................………….…………. 10 mL


Solução de coloração Coomassie Coloidal G-250 (Candiano et al., 2004)

Ácido fosfórico........................................................................................... 140 mL

Sulfato de amônio...................................................................................... 200 g

Metanol...................................................................................................... 400 mL

Coomassie coloidal G-250......................................................................... 2,4 g


O ácido fosfórico e o sulfato de amônio foram dissolvidos em 200 mL de água. Após a

dissolução, completou-se o volume com água MilliQ® suficiente para 600 mL. Em seguida, o

Coomassie coloidal foi adicionado e a solução permaneceu sob agitação constante durante 2-3

horas. O metanol foi adicionado à solução e esta foi agitada por 30 minutos. A solução resultante foi

armazenada em frasco âmbar.

241


Apêndice I

Tampão de transferência para Western Blot (Towbin et al., 1979)

Trizma Base............................................................................................... 3,62 g

Glicina........................................................................................................ 18 g

Metanol...................................................................................................... 250 mL


pH 8,3

O tampão foi preparado, devidamente vedado para evitar a evaporação do metanol e em

seguida armazenado a 4 °C, até o momento do uso.

Ponceau’S (Confirmação de transferência de proteínas)

Ponceau’S................................................................................................. 0,15 g

Ácido acético............................................................................................. 1 mL


A solução foi preparada e armazenada em frasco âmbar.

Tampão Carbonato CO3- HCO3

- 50mM, pH 9,6

Carbonato de sódio................................................................................... 0,5 M

Carbonato ácido de sódio.......................................................................... 0,5 M


O tampão foi preparado e em seguida esterilizado por filtração utilizando um filtro Millipore®

0,22 µm de diâmetro e armazenado a 4 °C, até o momento do uso.

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