taxonomia, análise de sementes de manihot glaziovii e...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
Taxonomia, análise de sementes de Manihot glaziovii e citogenética de
outras espécies relacionadas do gênero
Marcela Tarciana Cunha Silva Martins
AREIA – PARAÍBA
2009
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
Taxonomia, análise de sementes de Manihot glaziovii e citogenética de
outras espécies relacionadas do gêneros
Marcela Tarciana Cunha Silva Martins
AREIA – PARAÍBA
2009
Taxonomia, análise de sementes de Manihot glaziovii e citogenética de
outras espécies relacionadas do gênero
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia da Universidade
Federal da Paraíba, em cumprimento às
exigências para obtenção do grau de Doutor em
Agronomia - Área de Concentração: Sementes.
Orientadores:
Prof. Dr. Leonardo Pessoa Felix
Prof. Dra. Riselane de Lucena Alcântara Bruno
AREIA – PARAÍBA
2009
Taxonomia, análise de sementes de Manihot glaziovii e citogenética de
outras espécies relacionadas do gênero
MARCELA TARCIANA CUNHA SILVA MARTINS
______________________________________________
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________________
Prof. Dr. Leonardo Pessoa Felix
Orientador – CCA/UFPB
________________________________________________
Profa. Dra. Riselane de Lucena Alcântara Bruno
Orientadora - CCA/UFPB
__________________________________________________
Profa. Dra. Edilma Pereira Gonçalves
Examinadora – UFRPE
___________________________________________________
Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho
Examinador – UFRPE
____________________________________________________
Prof. Dr. Alberício Pereira de Andrade
Examinador – CCA/UFPB
À Deus (soberano Pai).
Aos meus Pais Maria Adelma Cunha e Francisco de Assis Silva.
Ao meu esposo Glauber Sousa Martins.
Ao meu querido avô, Severino Pedro da Silva (in memoriam).
DEDICO
Ao meu amado filho Gustavo Cunha Silva Martins.
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
À Deus que sempre esteve e está comigo em todas as horas da minha vida.
À Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências Agrárias, pela oportunidade
oferecida para a realização deste curso.
Ao programa de Pós-Graduação da Universidade federal da Paraíba (UFPB), Centro
de Ciências Agrárias (CCA), Departamento de Fitotecnia, pela oportunidade para
realizações dos trabalhos de tese.
Ao Prof. Dr. Genildo Bandeira Bruno (in memoriam), exemplo de dedicação e
compreensão.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), pela concessão de bolsa.
Ao Prof. Dr. Leonardo Pessoa Felix pela ajuda, compreensão, orientação,
oportunidade e pelos ensinamentos para realização da pesquisa.
À Prof. Dra. Riselane Lucena Alcântara Bruno, pela orientação e ajuda no
desenvolvimento da pesquisa.
Aos Professores Dr. Reginaldo de Carvalho, Dra. Edilma Pereira Gonçalves e Dr.
Alberício pela participação na banca de defesa de tese e pelas valiosas sugestões.
À Professora Dra. Elizanilda Ramalho do Rêgo, pela paciência, sugestões e análise
estatística do trabalho.
À Professora Dra. Luciana Cordeiro, pelas sugestões e orientação.
A todos os Professores do Centro de Ciências Agrárias pelos ensinamentos,
especialmente aos que contribuíram com sugestões.
A todos dos Laboratórios de Citogenética Vegetal e de Sementes pelo valioso apoio e
incentivo.
Ao Professor Dr. Enio Pereira de Souza, do Departamento de Metereologia na
UFCG, pela atenção e ajuda na produção dos mapas.
Aos colegas e amigos da Pós-Graduação pela agradável convivência.
Ao meu esposo, Glauber Sousa Martins, pelo amor, paciência e incentivo.
Ao meu lindo filho, razão da minha vida, pelo enorme carinho e amor.
Aos meus pais, que sempre contribuíram e estiveram ao meu lado a cada etapa da
minha vida. Em especial a minha amada mãe.
Aos meus queridos irmãos, Danilo e Morgana, que são pontos de apoio e sempre
estiveram ao meu lado.
Aos meus amados sobrinhos, Kelly e Matheus, pelo amor e carinho.
À minha querida Tia Roselma, pelo amor, incentivo, dedicação e confiança.
Aos meus sogros Lourival Sousa Martins e Iraci Soares Martins pelo incentivo e
apoio.
A minha família que sempre esteve ao meu lado, me ajudado e confortando nos
momentos difíceis.
Às minhas amigas especiais que sempre estiveram ao meu lado, ajudando e
confortando, Juliana, Emmanuelle e Edilma.
À Laura pela amizade e ajuda no trabalho.
Ao meu amigo Fellipe Nollet pelo apoio e incentivo.
Em especial minha grande amiga, Lânia Isis, pelo apoio, ajuda e pelas palavras que
me confortaram nos momentos difíceis da minha vida.
Enfim, a todos aqueles que, de alguma forma, torceram por mim, dedicando e
ajudando a auxiliar este trabalho, o meu reconhecimento e a minha gratidão.
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE FIGURAS IX
LISTA DE TABELAS X
LISTA DE MAPAS XI
ANEXOS XII
RESUMO XIII
1. 1.INTRODUÇÃO 1
2.REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1GÊNERO Manihot 4
2.1.1Características Morfológicas 4
2.1.2Origem e Distribuição 5
2.1.3Importância Econômica e Agrícola 6
2.2CITOGENÉTICA DE Manihot 7
2.3CARACTERES TAXONÔMICOS 12
2.4GERMINAÇÃO E DORMÊNCIA 13
2.5PATOLOGIA DE SEMENTES E EXTRATOS VEGETAIS 14
2.6VIGOR 16
2.6.1Tetrazólio 17
3.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19
MANUSCRITO 1 31
RESUMO 31
ABSTRACT 31
INTRODUÇÃO 32
MATERIAL E MÉTODOS 33
RESULTADOS 34
DISCUSSÃO 35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 37
MANUSCRITO 2 44
RESUMO 44
ABSTRACT 44
INTRODUÇÃO 45
MATERIAL E MÉTODOS 46
RESULTADOS 47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
MANUSCRITO 3 62
RESUMO 62
ABSTRACT 62
INTRODUÇÃO 63
MATERIAL E MÉTODOS 64
RESULTADOS E DISCUSSÕES 65
CONCLUSÕES 68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69
MANUSCRITO 4 75
RESUMO 75
ABSTRACT 75
INTRODUÇÃO 76
MATERIAL E MÉTODOS 78
RESULTADOS E DISCUSSÕES 79
CONCLUSÕES 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84
ANEXOS 91
LISTA DE FIGURAS
MANUSCRITO 1 Pág.
Figura 1. Metáfase mitóticas de espécies do gênero Manihot
(Euphorbiaceae) do Nordeste do Brasil, com 2n = 36. (a) Manihot
esculenta cultivar Pornunça, Serraria-PB, com quatro satélites nos braços
curtos (setas); (b) M. esculenta cultivar Manipeba, Goiana-PE; (c) M.
glaziovii, Areia-PB, com um par satélite nos braços curtos (setas); (d) M.
pseudoglaziovii, Acari-RN, com um par satélite nos braços curtos (setas);
(e) M. catingae, Canguaretama-RN, com dois satélites (setas); (f) Manihot
glaziovii subsp. noronhense subsp. nv., Fernando de Noronha-PE, com
quatro satélites localizados nos braços curtos (setas); (g) M. tripartita,
Jacobina-BA; (h) M. leptophyla, Goianinha-RN com constrição secundária
proximal longamente distendida (cabeça de setas)........................................
41
Figura 2. Ilustração de alguns representantes do gênero Manihot. (a) M.
esculenta cultivar Pornunça; (b) M. glaziovii; (c) M. pseudoglaziovii; (d)
M. catingae; (e) Manihot glaziovii subsp. noronhense subsp. nv.; (f) M.
tripartita; (g) M. leptophyla...........................................................................
43
MANUSCRITO 2
Figura 1. A-G. Manihot glaziovii Muell Arg. A. ramo com a
inflorescência; B. detalhes da inflorescência; C e D. detalhes da folha; E.
flor feminina; F. flor masculina; G. fruto. E, F e G = Tamanho natural.
Barra equivale à 2cm......................................................................................
55
Figura 2. A-F. Manihot glaziovii subsp. norohense. A. ramo com a
inflorescência; B. detalhes da inflorescência; C. flor feminina; D. detalhes
da flor feminina; E. detalhe da flor masculina; F. fruto. B, C, D, E e F =
Tamanho natural. Barra equivale à 2cm.........................................................
56
Figura 3. Morfologia vegetativa de Manihot glaziovii Müll. Arg. a – f.
variação morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h. variação
morfológica da estípula; i. botões florais e brácteas.......................................
58
Figura 4. Morfologia vegetativa de Manihot pseudoglaziovii Pax &
Hoffman. a – f. variação morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h.
variação morfológica da estípula; i. botões florais e brácteas........................
59
Figura 5. Morfologia vegetativa de Manihot glaziovii subsp. norohense. a
– f. variação morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h. variação
morfológica da estípula; i. botões florais e brácteas.......................................
60
IX
Figura 6. Flores masculinas e femininas do gênero Manihot. Manihot
glaziovii (a e b); M. pseudoglaziovii (c e d) e M. glaziovii sups. norohense
(e e f)...............................................................................................................
61
MANUSCRITO 3
Figura 1. Crescimento micelial em sementes de Manihot glaziovii, no
substrato BDA, tratadas com diferentes concentrações do extrato de melão-
de-são-caetano.................................................................................................
73
Figura 2. Crescimento micelial em sementes de Manihot glaziovii, no
substrato papel, tratadas com diferentes concentrações do extrato de melão-
de-são-caetano.................................................................................................
74
MANUSCRITO 4
Figura 1. Morfologia da semente de Manihot glaziovii: a – Face dorsal e
ventral, ar (anti-rafe na face dorsal da semente), cr (carúncula), r (rafe na
face ventral); b – corte longitudinal, ct (cotilédone), em (eixo embrionário),
tg (tegumento); c – corte transversal, e (endosperma)....................................
80
Figura 2. Testes preliminares de tetrazólio (TZ), em sementes de M.
glaziovii. Escarificação total seguido de embebição por 24h e imersão em
TZ (0,075%) por 24h (1- 3); Escarificação total, abertura da semente,
seguido de embebição por 24h e imersão em TZ (0,075%) por 24h (4-9);
Escarificação total, abertura da semente, seguido de embebição por 18h e
imersão em TZ (0,5%) por 18h (10-13); Escarificação total, abertura da
semente, seguido de embebição por 24h e imersão em TZ (0,1%) por 24h
(14); Escarificação total, embebição por 24h e imersão em TZ (0,5%) por
24h (15); Escarificação total, embebição por 18h e imersão em TZ (0,5%)
por 24h (16); Fissura com prensa mecânica, seguido de embebição por 18
h TZ (0,075%) por 24h (17 e 18)....................................................................
89
Figura 3. Classe para a determinação da viabilidade de sementes de M.
glaziovii...........................................................................................................
90
X
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA
Pag.
Tabela 1. Espécies de maniçobas reconhecidas para o nordeste
brasileiro.............................................................................................................
6
Tabela 2. Números cromossômicos referidos para o gênero Manihot...............
9
MANUSCRITO 1
Tabela 1. Lista de espécies analisadas, com os respectivos locais de coletas,
número cromossômico, contagens prévias e referências.....................................
42
MANUSCRITO 3
Tabela 1. Incidência de Fungos em Sementes de Manihot glaziovii, Tratadas
com Extratos de Melão-de-São-Caetano, em Diferentes Concentrações,
Incubados em BDA e Papel de Filtro..................................................................
73
MANUSCRITO 4
Tabela 1. Preparo e coloração de sementes de Manihot glaziovii submetidas a
diferentes condições, em BOD à 30ºC.................................................................
81
XI
LISTA DE MAPAS
MANUSCRITO 2
Pag.
Mapa 1. Manihot glaziovii…………………………………………………….. 57
Mapa 2. Manihot glaziovii subsp. norohense.....................................................
57
XII
ANEXOS
MANUSCRITO 3 Pág.
Anexo 1. Resumo da análise de variância da incidência de fungos em
sementes de Manihot glaziovii..........................................................................
91
Anexo 2. Quadrados médios para os dados para a regressão no substrato
BDA..................................................................................................................
91
Anexo 3. Quadrados médios para os dados para a regressão no substrato
Papel..................................................................................................................
91
MANUSCRITO 4
Anexo 1. Prensa mecânica utilizada para abertura das sementes de M.
glaziovii no teste de tetrazólio...........................................................................
92
XIII
MARTINS, Marcela Tarciana Cunha Silva, D.S., Universidade Federal da Paraíba, 2009.
Taxonomia, análise de sementes de Manihot glaziovii e citogenética de outras espécies
relacionadas do gênero
Orientadores: Prof. Dr. Leonardo Pessoa Felix e Prof. Dra. Riselane de Lucena Alcântara
Bruno
RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram: obter conhecimentos sobre a análise citológica de
algumas espécies do gênero Manihot ocorrentes no Nordeste brasileiro; discutir os limites
taxonômicos entre Manihot glaziovii e M. pseudoglaziovii, além da análise de materiais
previamente identificados como M. glaziovii, proveniente do arquipélago de Fernando de
Noronha e que constitui uma nova espécie para a ciência; avaliar diferentes concentrações
de extrato vegetal aquoso de melão-de-são-caetano em sementes de M. glaziovii e
desenvolver um protocolo para o uso de tetrazólio com as sementes de M. pseudoglaziovii.
Os estudos foram conduzidos nos Laboratórios de Citogenética Vegetal, Fitopatologia e
Análise de Sementes da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB e nos Herbários (EAN,
IPA, UFP, HST e PEUFR), além de observações de campo. Foram analisadas
citogeneticamente sete espécies de Manihot, através das técnicas de coloração convencional
com Giemsa. As análises morfológicas comparativas de plantas, de M. glaziovii e M.
pseudoglaziovii, foram realizadas através das observações no campo e de materiais
herborizados depositados nos Herbários, além de uma análise de uma nova subespécie
proveniente de Fernando de Noronha. Para o estudo de atividade antifúngica foi utilizado o
extrato aquoso de melão-de-são-caetano nas concentrações de 0 (testemunha), 10, 20, 30 e
40%, onde as sementes, após imersas no extrato, foram distribuídas em placas de Petri
contendo os substratos papel e BDA, sendo analisado pelo delineamento experimental
inteiramente casualizado, empregando-se arranjo fatorial (2x5). Para a avaliação da
viabilidade, foi desenvolvido um protocolo para o teste de tetrazólio com as sementes de M.
pseudoglaziovii com os seguintes métodos de pré-condicionamento à 30ºC: água quente (90ºC)
por 10, 20 e 30 minutos; imersão direta em água por 18, 24 e 48 horas, seguido de
escarificação lateral (um e dois lados) e total; escarificação lateral (um e dois lados) e total,
imersão em água (18 e 24 horas); escarificação total, abertura da semente e imersão em água
(18 e 24 horas); fissura com prensa mecânica, imersão em água (18 e 24 horas); embebição
em papel umedecido (água equivalente a 2,5 vezes o peso do papel seco), por 18 e 24 h, e
escarificação total, além da testemunha que foi diretamente imersa na solução de tetrazólio.
Em todos os métodos testados as sementes foram colocadas em solução 2,3,5 trifenil cloreto
de tetrazólio por 18 e 24 horas, em germinador à 30ºC. De acordo com os resultados obtidos,
conclui-se que: todas as espécies apresentaram cariótipos similares, exceto M. leptophylla da
secção Peruvianae, que apresentou um par cromossômico com constrições secundárias
proximais; M. pseudoglaziovii pode está incluída nos limites taxonômicos de M. glaziovii e o
táxon endêmico do arquipélago de Fernando de Noronha foi descrito como M. glaziovii
subsp. norohense subsp. nv.; e por ultimo, considerando-se a praticidade operacional,
economicidade do processo e urgência nos resultados, recomenda-se que as sementes sejam
submetidas à condição de preparo com prensa mecânica (fissura), seguida de embebição em
água por 18 horas e coloridas à 30ºC, na concentração de 0,075% de solução de tetrazólio
durante 24 horas.
1. INTRODUÇÃO
A família Euphorbiaceae compreende cerca de 317 gêneros e 8.000 espécies,
tradicionalmente distribuídas em cinco subfamílias: Phyllanthoideae, Oldofieldioideae,
Acalyphoideae, Crotonoideae e Euphorbioideae (WEBSTERS, 1994). Destas, 70 gêneros e
aproximadamente 1.000 espécies são referidas para o Brasil (SOUZA & LORENZI, 2005),
211 delas para a região Nordeste (BARBOSA, 2006). A família tem sido mais recentemente
considerada polifilética, sendo proposto seu desmembramento em Euphorbiaceae ss,
abrangendo principalmente as espécies com um único óvulo por lóculo (WURDACK et al.,
2005), além de Phyllantaceae e outras linhagens relacionadas que compreendem as espécies
biovuladas (WURDACK et al., 2004). De acordo com Carneiro-Torres et al. (2002) as
Euphorbiaceae estão entre as famílias de maior importância econômica entre as
Angiospermas, incluindo plantas geralmente latescentes, monóicas ou dióicas, com flores
diclinas, sendo as flores pistiladas muito características pelo gineceu sincárpico, ovário
súpero e geralmente tricarpelar. Os referidos autores descrevem o fruto como capsular com
deiscência explosiva, abrindo-se em três mericarpos, sendo conhecido como cápsula tricoca.
O gênero Manihot, pertencente a família Euphorbiaceae, é constituído por plantas
perenes, desde subarbustos até pequenas árvores, com raízes geralmente tuberosas, ricas em
carboidratos. É um gênero exclusivo dos neotrópicos, com 98 espécies, 80 delas, para o
Brasil, que é considerado o principal centro de diversidade do gênero (ROGERS & APPAN,
1973; NASSAR, 1978; NASSAR 2000). É considerado como grupo numericamente estável
que apresenta número cromossômico 2n = 36, determinado inicialmente por Graner (1935)
em mandioca e confirmado por diferentes autores para as espécies de Manihot (PERAK,
1940; PERRY, 1943; ABRAHAM, 1944; CRUZ, 1968; MAGOON et al, 1969; NASSAR
1978; BAI et al., 1992; HAHN, 1992; NASSAR, 2000; CARVALHO & GUERRA, 2002;
NASSAR, 2006). A variabilidade morfológica é característica neste grupo, devido a
capacidade de suas espécies intercruzarem e produzirem híbridos férteis, o que faz tornar
difícil a identificação das espécies.
Manihot glaziovii Müll. Arg. e Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann, são
conhecidas popularmente por maniçoba, desempenham importante função no semi-árido
nordestino, por ser utilizada como pastagem nativa para manutenção dos rebanhos em
ocasião de secas prolongadas (SILVA et al., 2007). Além da utilidade desta espécie vegetal
como alimento dos rebanhos, segundo Agra et al. (2007), no Cariri paraibano, as folhas de
1
M. glaziovii são utilizadas contra reumatismos, estas são aquecidas e aplicadas diretamente
sobre a parte do corpo afetada.
A propagação da maniçoba pode ser feita por sementes e estacas, porém as sementes
apresentam severa dormência e, de acordo com Canuto et al. (1989), para superação da
dormência, as mesmas precisam ser armazenadas por um período mínimo de um ano.
Apesar da eficiência do armazenamento em superar a dormência das sementes desta espécie
vegetal, alguns fatores podem comprometer a qualidade das sementes armazenadas. Mentem
(2006) relatou que ataque fúngico durante o armazenamento é uma das principais causas de
perdas de quantidade e qualidade de sementes e grãos. O desenvolvimento de fungos de
armazenamento a exemplo dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus podem causar
rápida deterioração das sementes, pois se localizam preferencialmente no embrião. Produtos
químicos sintéticos são utilizados como método no controle de patógenos de sementes
(FESSEL et al., 2003; NASCIMENTO et al., 2006; MERTZ, et al., 2009), no entanto,
diversos organismos começaram a adquirir resistência a vários destes produtos, demandando
a utilização de quantidades cada vez maiores (SANTOS et al., 2006). Assim o uso de
extratos vegetais pode se tornar promissor a medida em que compostos secundários
presentes na estrutura química dos mesmos podem ter efeito inibitório sobre a ação de
diversos fungos.
A análise de sementes é um instrumento essencial no controle da qualidade das
sementes produzidas e/ou da avaliação da tecnologia de produção empregada (ANDRADE
et al., 1996). Marcos-Filho (2005) ressalta a importância do desenvolvimento de testes
rápidos para avaliação da viabilidade das sementes, principalmente para aquelas que
apresentam baixa capacidade de armazenamento e germinação lenta, onde o teste de
germinação apresenta grandes limitações. Uma das alternativas seria o uso do teste de
tetrazólio onde vem sendo usado principalmente devido à rapidez na estimativa da
germinação das sementes (BHERING et al., 2005).
De acordo com esse contexto, os objetivos do presente trabalho foram:
- Caracterizar citologicamente algumas espécies do gênero Manihot ocorrentes no
Nordeste Brasileiro, através da análise de número e morfologia cromossômica, estrutura dos
núcleos interfásicos, número e posição de satélites, visando avaliar a implicação desses
dados para a taxonomia do gênero;
- Discutir os limites taxonômicos entre M. glaziovii e M. pseudoglaziovii sob um
ponto de vista morfológico e biogeográfico, visando fornecer elementos para uma separação
segura entre esses dois táxons. Nesse estudo, também foi incluída a análise de materiais
2
previamente identificados como M. glaziovii, proveniente do arquipélago de Fernando de
Noronha e que constitui uma nova espécie para a ciência;
- Avaliar diferentes concentrações de extrato vegetal aquoso de melão-de-são-
caetano em sementes de M. glaziovii para o controle de fungos;
- Desenvolver um protocolo para o uso do teste de tetrazólio utilizando diferentes
concentrações, tempo de exposição e preparo das sementes, contribuindo assim para
avaliação rápida da qualidade das sementes de M. glaziovii.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 GÊNERO Manihot
2.1.1 Características Morfológicas
Da família das Euforbiaceae, as maniçobas compõem as caatingas de diferentes
altitudes. Crescem em áreas abertas e desenvolvem-se na maioria dos solos, tanto calcários e
bem drenados, como também naqueles pouco profundos e pedregosos das elevações e das
chapadas (SOARES, 1995). Segundo Andrade et al., (2004) algumas apresentam tronco
linheiro, podendo apresentar bifurcações primárias, secundárias e terciárias e segundo
Rogers & Appan (1973) variam de sub-arbusto à arbusto ou árvore.
As folhas são simples, de lâmina membranácea ou coriácea, alternas, pecioladas,
peltadas ou não, providas de estípulas, palmatipartidas, variando de 3 a 6 lóbulos, estes
podendo ser ou não sublobulados. A forma das folhas varia de lanceoladas, obovada, ovada
e até reniforme e pode ou não apresentar pandurações. O sistema radicular é bastante
desenvolvido, formado por raízes tuberosas, onde acumula suas reservas e geralmente perde
as folhas durante o verão para economizar nutrientes (SOARES & SALVIANO, 2000).
Segundo Rogers & Appan (1973) a inflorescência é do tipo racemo ou panícula,
estando às flores masculinas separadas das femininas e com perfloração quincuncial. O
cálice é membranáceo ou coreáceo, pentâmero, gamossépalo. A flor masculina é geralmente
menor que a feminina, são desprovidas de corola e o cálice formado por cinco sépalas
imbricadas e ocupa uma posição superior na inflorescência. O androceu é composto por 10
estames, formando dois conjuntos distintos: cinco externos e cinco internos. As anteras são
birrimosas e inclinadas para o eixo da flor. Ovário súpero, tricarpelar, trilocular, e
uniovulado por lóculo, com três estiletes soldados uns aos outros. O estigma é largo,
trilobado, ondulado e carnoso.
O fruto é capsular com deiscência loculicida ou septicida e explosiva, abrindo-se em
três mericarpos, sendo conhecido como cápsula tricoca (CARNEIRO-TORRES et al., 2002).
As sementes são atiradas a grandes distâncias das plantas, chegando a atingir 30 metros,
podendo se esconder na vegetação nativa, sendo a dispersão do tipo balística. De acordo
com Barroso et al. (1999) as sementes das diferentes espécies de Manihot são muito
semelhantes, a variação está no tamanho, coloração e formato, porém apresentam as mesmas
características como presença da carúncula, rafe, anti-rafe e de manchas irregulares, de
4
coloração escura brilhante com o fundo acinzentado ou ainda marron na face dorsal e ventral
da semente. A superfície da semente é glabra e de formato ovóide. É uma semente
albuminosa, de consistência firme e de coloração esbranquiçada.
2.1.2 Origem e Distribuição
São conhecidas aproximadamente 98 espécies do gênero Manihot, nativas do Novo
Mundo e encontram-se distribuídas Brasil e na América Central (NASSAR, 2002), sendo
Brasil e México considerados os dois principais centros de diversidade do gênero (ROGERS
& APPAN, 1973; NASSAR, 2000).
Acredita-se que o gênero Manihot seja originário do continente americano, por
encontrar formas nativas, distribuídas desde os Estados Unidos até a Argentina e tenham
sido levadas, algumas espécies, pelos indígenas para o Brasil e América Central (SAUER,
1994).
Segundo Nassar (2000), na região central do Brasil (sul de Goiás e oeste de Minas
Gerais) existe a maior diversidade de Manihot com cerca de 38 espécies, seguido do sudeste
do México com 17, nordeste do Brasil com 16 e o sudeste do Mato Grosso e Bolívia com 6.
A maioria das espécies ocorrem em regiões secas, embora algumas são encontradas em
florestas tropicais e tendem a ser esporádicas nas suas distribuição e nunca dominante na
vegetação (ROGERS & APPAN, 1973; NASSAR, 2002).
Para o nordeste são listadas, de acordo com Nassar (2000a), as seguintes espécies de
Manihot: M. zehntneri Ule, M. surinamensis Rogers & Appan, M. quinquefolia Pohl, M.
pseudoglaziovii Pax & Hoffmann, M. maracasenis Ule, M. quinquepartita Huber, M.
caerulescens Pohl, M. marajoara Chermont de Miranda, M. tristis Mueller, M. glaziovii
Müll. Arg., M. epruinosa Pax & Hoffmann, M. brachyandra Pax & Hoffmann, M.
dichotoma Ule, M. leptophylla Pax, M. reniformis Pohl e M. heptaphylla Ule. O referido
autor ressalta que algumas espécies tenham sido extintas, por pessoas no nordeste do Brasil,
pela presença do HCN (ácido cianídrico) e por agricultores que as utilizam para manutenção
dos rebanhos. A tabela a seguir lista as espécies de maniçoba, segundo a monografia de
Rogers & Appan (1973), reconhecidas para o nordeste semi-árido brasileiro.
5
Tabela 1. Espécies de maniçobas reconhecidas para o nordeste brasileiro.
Nome Científico Estado
Manihot caeruslescens Pohl Piauí, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Bahia
M. epruinosa Pax & Hoffmann Piauí, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Bahia
M. dichotoma Ule Bahia
M. glaziovii Müll. Arg. Ceará, Paraíba, Pernambuco e Bahia
M. jacobinensis Müll. Arg. Bahia
M. zehntneri Ule Bahia
M. maracasenis Ule Bahia
M. pseudoglaziovii Pax & Hoffmann Ceará, Rio Grande do Norte e Paraíba
M. brachyandra Pax & Hoffmann Bahia
M. catingae Ule Bahia
FONTE: Rogers & Appan, 1973.
2.1.3 Importância Econômica e Agrícola
Identificadas 98 espécies do gênero Manihot, a mandioca é a única comestível e suas
variedades são classificadas em bravas e mansas (FUKUDA, 1999). As bravas tem sabor
amargo, contem alto teor de glicosídeos cianogênicos e são consumidas após serem
processadas. Já as mansas, ou doces, não tem sabor amargo, contem baixo teor de
glicosídeos cianogênico e são consumidas com e sem processamento (VALLE et al., 2004).
As plantas do gênero Manihot apresentam grande importância no semi-árido Brasileiro, no
qual a mandioca (Manihot esculenta Crantz) e a maniçoba (Manihot glaziovii), que são
espécies selvagens estão presentes entre agricultores e criadores, nas áreas dependentes de
chuvas sendo utilizadas para fins diversos (SILVA et al., 2004).
A utilização de maniçoba e muitas outras plantas nativas como forrageira natural tem
sido tradicionalmente praticada, tanto na criação extensiva, como nas pequenas criações de
sitiantes. Esta espécie é propícia para alimentação de caprinos, bovinos e ovinos,
especialmente como feno artificial, ou no próprio campo, após a queda e secagem das
folhas, o que permite remoção do ácido cianídrico, geralmente encontrada no dobro da
concentração daquela observada em M. esculenta (BELTRÃO et al., 2006). A maniçoba
Figura 2. Variação morfológica da folha de Manihot glaziovii.
6
apresenta na planta verde em início de brotação, teor médio de HCN de 1.000 mg/kg de MS.
Portanto, se o animal consumir grande quantidade, pode sofrer intoxicação em poucos
instantes. Por outro lado, quando triturada e seca (fenada), o teor de HCN reduz para menos
de 300 mg/kg de MS, quantidade insuficiente para provocar qualquer sintoma de intoxicação
em animais, mesmo que consumida em grande quantidade e por muito tempo (CASTRO,
2007). O potencial forrageiro dessa espécie se destaca pelo elevado nível protéico
encontrado nas suas folhas, com níveis de proteína acima de 20% e digestibilidade superior
a 60% (CASTRO, 2004).
Apesar do receio no fornecimento das espécies selvagens para os animais sob o risco
de intoxicação, muitos produtores estão domestificando o uso destas plantas, utilizando
técnicas de armazenamento e aproveitamento para o suprimento no período de estiagem
(FUKUDA, 2000). A maniçoba e outras forrageiras nativas como o Pilosocereus gounelei
(xique-xique), Capparis flexuosa (feijão de boi), dentre outras, são plantas nativas
resistentes a qualquer intensidade de seca.
2.2 CITOGENÉTICA DE Manihot
A citogenética vegetal contribui de forma acentuada para o melhoramento de plantas,
tendo em vista identificar alterações cromossômicas mitóticas, analisar híbridos e seus
descendentes, realizar estudos relacionados à transferências de genes entre espécies nativas e
cultivadas, identificar alterações cromossômicas ocorrentes no cultivo in vitro, além de
análises das origens e reconstruções de poliplóides (GUERRA, 2004).
O gênero Manihot, considerado como grupo numericamente estável, apresenta
número cromossômico 2n = 36, determinado inicialmente por Graner (1935) em mandioca e
confirmado por diferentes autores para as espécies de Manihot (DOUGHTY, 1939; PERAK,
1940; PERRY, 1943; ABRAHAM, 1944; CRUZ, 1968; MAGOON et al., 1969; NASSAR
1978; BAI et al., 1992; HAHN, 1992; NASSAR, 2000a; CARVALHO & GUERRA, 2002;
NASSAR, 2006). De acordo com Perry (1943) as espécies de Manihot são consideradas auto
ou alopoliplóides apresentando número básico x = 9. Análises citológicas realizadas por
Umanah & Hartmann (1973) para o gênero Manihot, constaram a presença de dois pares de
cromossomos satelizados, a exemplo de M. esculenta, o que faz considerar este gênero como
alopoliplóide, uma vez que os diplóides, de um modo geral, apresentem um par de satélites.
7
A variabilidade genética é acentuada neste gênero em virtude de suas espécies
intercruzarem e produzirem híbridos férteis, úteis ao melhoramento genético, especialmente
para a transferência de genes desejáveis de espécies selvagens para Manihot esculenta, a
principal espécie cultivada (NASSAR & GRATAPAGLIA, 1986). Nassar (1980) relata a
freqüente hibridização entre M. reptans Pax e M. alutacea Rogers & Appan em hábitat
natural simpatrico, além de mandioca com M. glaziovii, M. pseudoglaziovii, M. aesculifolia,
M. pilosa, M. dichotoma, M.pohlii, M. neusana e M. anomala através de cruzamentos
controlados, embora com baixa freqüência. O comportamento de diversos híbridos (M.
esculenta com M. neusana, mandioca com M. pseudoglaziovii) foi estudado por Nassar
(1991), mas os resultados indicaram baixa fertilidade dos híbridos entre estas espécies e a M.
esculenta.
Em trabalhos realizados por Carvalho & Guerra (2002) com citogenética de Manihot,
a análise meiótica com Manihot sp. e M. carthaginensis observaram a presença de 18
bivalentes em metáfase I e uma separação regular dos cromossomos na náfase I e II. Para as
análises de bandeamento C e CMA/DAPI as diversas cultivares de M. esculenta, M.
dichotoma, M. caerulescens e Manihot sp.1 revelaram pequenos blocos de heterocromatina
constitutiva semelhantes.
A ocorrência da poliploidia espontânea foi constatada, nesse gênero, por Hahn et al.
(1992) e Carvalho et al. (1999) em um híbrido artificial entre M. esculenta e M. epruinosa e
M. esculenta cv. Manipeba, respectivamente. De acordo com Guerra (1988) a poliploidia é o
tipo de variação cromossômica que predomina na evolução vegetal, que segundo Mable
(2003), encontra-se presente em 95% das pteridófitas e até 80% para as angiospermas.
A variabilidade em números cromossômicos é um parâmetro cariológico muito
utilizado nas análises cromossômicas (GUERRA, 2000), em grupos citologicamente pouco
estudado. De forma geral, as caracterizações cariológicas, sejam clássicas, especializadas ou
associadas à programas de engenharia genética, por detectarem polimorfismo citogenético,
são importantes na definição de variação dentro de uma espécie, entre diferentes espécies ou
entre raças geográficas (HESLOP-HARRISON & SCHWARZACHER, 1993).
Informações sobre cromossomos são relevantes em estudos sistemáticos e
evolutivos, abrangendo, desde a simples contagem, até detalhes da citogenética molecular
que são a fronteira da pesquisa atual (FORNI-MARTINS & MARTINS, 2000).
Historicamente, quando estudos citogenéticos de espécies arbóreas são comparados aos de
espécies cultivadas e/ou nativas com valor agronômico, sua limitação é evidente,
8
restringindo-se a informações básicas sobre sua estrutura genômica e a inclusão dessas
espécies em programas de melhoramento e conservação (SCHLARBAUM, 2000).
De modo geral, os trabalhos citológicos para o gênero, são em sua maioria estudos
baseados em análises de números cromossômicos e comportamento meiótico. Porém pouco
se conhece sobre outros parâmetros citogenéticos, como padrão de bandeamento, análise
com fluorocromos, quantidade de DNA, etc. A seguir é fornecida a listagem de números
cromossômicos para o gênero Manihot (Tabela 2).
Tabela 2. Números cromossômicos referidos para o gênero Manihot.
Táxon n 2n 3n Fonte
Sect. Manihot
Manihot esculenta Crantz 36 Perry, 1943; Hahn et al.,
1992; Kavitha & Vembu,
1999; Soontornchainaksaeng
& Chaiyasut, 1999; Carvalho
& Guerra, 2002; Chen, R.-y.
et al., 2003
18 Magoon et al., 1966;
Datta, 1967; Schmer,
1968; Jos & Nair, 1979;
Hahn et al., 1992;
M. esculenta var. palakaden 36 Kavitha et al., 1998
Manihot esculenta Crantz var
"Manipeba"
54 Carvalho et al., 1999
M. utilissima Pohl 36 Graner, 1941; Graner, 1942;
Perry, 1943
Sect. Manihot
M. utilissima Pohl 36 Simmonds, 1954; Abraham et
al., 1964
M. flabellifolia Pohl 18 Moore, 74
M. dulcis Pax 36 Doughty, 1939
M. esculenta x glaziovii 18 Magoon et al., 1966
9
Táxon n 2n 3n Fonte
Sect. Parvibracteatae
M. walkarae Croiz 36 Perry, 1943
Sect. Heterophyllae
M. zehntneri Ule 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a;
Nassar, 2003
18II Nassar, 1980
M. tweedieana Muell. Arg. (=
M. grahami)
18 Bedi et al., 1981; Gill et al.,
1981
M. tweediana Muell. Arg. (=
M. grahami)
36 Perak, 1940; Nassar, 2000 a;
Nassar, 2003
M. handroana N. D. Cruz 36 Nassar, 2000 a; Nassar, 2003
M. palmata Muell. Arg (= M.
leptopoda)
36 Bowden, 1940 ; Perry, 1943;
M. jolyana N. D. Cruz 36 Nassar, 2000 a, Nassar, 2003
M. pedicellaris Muell Arg. (=
M. pilosa)
36 Nassar, 2000 a; Nassar, 2003
Sect. Anisophylla
M. anisophylla Muell. Arg 18 Di Pulvio, 1973
Sect. Carthaginenses
M. carthaginensis Muell. Arg. 36 Tjio, 1948
18 Carvalho & Guerra, 2002
M. cathartica (=M.
carthaginensis Muell. Arg.)
36 Doughty, 1939
Sect. Graciles
M. gracilis 18II Nassar 1980; Nassar 2000 a
M. gracilis Pohl 18 Nassar, 1978, Nassar, 2003
M. gracilis 36 Nassar 2000 a; Nassar, 2003
10
Táxon n 2n 3n Fonte
Sect. Sinuatae
M. anomala Pohl 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a;
Nassar, 2003
Sect. Sinuatae
M. anomala Pohl 18 II Nassar, 1980
Sect. Glaziovianae
M. glaziovii Muell. Arg 18 Datta, 1967; Nassar, 2000 a;
Carvalho & Guerra, 2002;
Nassar, 2003
M. glaziovii Muell. Arg 36 Doughty, 1939; Perry, 1943;
Krishnan et al., 1970;
Krishnappa & Reshme, 1982;
Nassar, 2000 a; Carvalho &
Guerra, 2002
M. pseudoglaziovii Pax &
Hoffman
36 Nassar, 2003
M. dichotoma Ule 18 Doughty, 1939; Perry, 1943;
Carvalho & Guerra, 2002
36 Doughty, 1939; Perry, 1943;
M. dichotoma Ule 36 Nassar, 2000 a; Carvalho &
Guerra, 2002; Nassar, 2003
M. diamantinensis Allem 36 Carvalho & Guerra, 2002
Sect. Stipulares
M. oligantha Pax 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a;
Nassar, 2003
M. oligantha Pax ssp. nesteli 18II Nassar, 1980
Sect. Stipulares
M. nana Muell. Arg. 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a;
Nassar, 2003
11
Táxon n 2n 3n Fonte
Sect. Grandibracteatae
M. tomentosa Pohl 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a
Sect. Tripartitae
M. tripartita Muell. Arg. 18 Nassar, 1978; Nassar, 2000 a
Sect. Tripartitae
M. tripartita Muell. Arg. 36 Nassar, 2000 a; Nassar, 2003
M. tripartita subsp humilis
Rogers & Appan
36 Nassar 2003
Sect. Caerulescentes
M. caerulescens Pohl 36 Carvalho & Guerra, 2002
Sect. Crotalariaeformes
M. reptans Pax in Ingler 18 Nassar, 2003
2.3 CARACTERES TAXONÔMICOS
A família Euphorbiaceae sl compreende cerca de 317 gêneros e 8.000 espécies,
tradicionalmente distribuídas em cinco subfamílias: Phyllanthoideae, Oldofieldioideae,
Acalyphoideae, Crotonoideae e Euphorbioideae (WEBSTERS, 1994). A família tem sido
mais recentemente considerada polifilética e tem sido proposto seu desmembramento em
Euphorbiaceae ss, abrangendo principalmente as espécies com um único óvulo por lóculo
(WURDACK et al., 2005), além de Phyllantaceae e outras linhagens relacionadas que
compreendem as espécies biovuladas (WURDACK et al., 2004).
Webster (1994) dividiu Euphorbiaceae em cinco subfamílias, 49 tribos e 317
gêneros. De acordo com o referido autor, são características comuns às cinco subfamílias:
lâminas foliares semelhantes (simples, inteiras ou lobadas, ou folhas compostas), presença
ou ausência de sépalas ou pétalas, frutos na maioria das vezes capsulares (raramente
indeiscentes, drupáceos, bacóides ou samaróides), sementes carunculadas ou não, estames
variando de dois a muitos, com filetes livres ou conatos. Segundo APG II (2003),
Euphorbiaceae está inserida em Malpighiales, e é subdividida somente em três subfamílias,
12
as quais possuem somente um único óvulo por lóculo, sendo elas Acalyphoideae,
Crotonoideae e Euphorbioideae. Deste modo, as duas outras subfamílias (Phyllanthoideae e
Oldfieldioideae), que apresentam dois óvulos por lóculo, foram reamostradas,
respectivamente, em Phyllanthaceae e Picrodendraceae.
O gênero Manihot, assim como Aleurites, Cnidoscolus, Croton e Jatropha
encontram-se posicionados na subfamília Crotonoideae com 65 gêneros distribuídos em 12
tribos, apresentando os seguintes caracteres: inflorescências axilares ou terminais, sépalas
sempre presentes, ovário geralmente com três lóculos, estiletes bífidos a multífidos, óvulos
anátropos e exclusivamente únicos em cada lóculo, endosperma abundante, látex não leitoso
ou ausente. Esta subfamília apresenta e se enquadram as espécies selecionadas para o
presente trabalho, inseridas na tribo Manihoteae, a qual apresenta somente dois gêneros,
Cnidoscolus e Manihot.
De acordo com Rogers & Appan (1973) o gênero Manihot apresenta 98 espécies
distribuídas em 19 secções, as quais: Manihot, Parvibracteatae, Foetidae, Heterophyllae,
Anisophyllae, Carthaginenses, Quinquelobae, Graciles, Sinuatae, Varrifolliae,
Glaziovianae, Peruvianae, Crotalariaeformes, Stipulares, Grandibracteatae,
Brivipetiolatae, Peltatae, Tripartitae, Caerulescentes.
2.4 GERMINÇÃO E DORMÊNCIA
A germinação da semente é caracterizada pela protrusão do embrião através do
tegumento, no qual se inicia com a absorção de água e termina com o alongamento do eixo
embrionário (FERREIRA & BORGHETTI, 2004). De acordo com Santos-Filha et al.
(2001), a geminação é definida como a emergência e o desenvolvimento das estruturas
essenciais do embrião, resultando na formação de uma plântula normal; é um fenômeno
biológico determinado por um conjunto de condições específicas, entre as quais o substrato.
Carvalho & Nakagawa (2000) descreveram os vários fatores que afetam a
germinação os quais se dispõem em condições internas (longevidade, viabilidade) e externas
(água, temperatura, oxigênio, luz). Segundo Popinigis (1985) fatores como a aeração,
estruturas, capacidade de retenção de umidade, grau de infestação de patógenos, entre
outros, podem variar de um substrato para outro, favorecendo ou prejudicando a geminação
das sementes.
Os agricultores do semi-árido nordestino vêm encontrando dificuldades para a
propagação sexuada da maniçoba, pois suas sementes apresentam baixa germinação
13
provocada pela dormência. De acordo com Marcos Filho (2005) a dormência é o fenômeno
pelo qual as sementes deixam de germinar, mesmo quando as condições ambientais sejam
favoráveis e podem ser classificadas em dois tipos: natural, ou primária e induzida, ou
secundária. As causas da dormência podem ser várias e provavelmente nunca acontecem
isoladamente e o tempo em que às sementes permanecem viáveis no solo depende da
intensidade da dormência, que é controlada geneticamente (SILVA et al., 2005).
Canuto et al. (1989) associaram o armazenamento aos métodos de superação de
dormência em sementes de maniçoba, onde observaram que maiores porcentagens de
germinação ocorreu a partir de 12 meses de armazenamento. De acordo com Carvalho e
Nakagawa (2000) o objetivo básico de armazenamento é manter o nível de qualidade das
sementes para aumentar a sua longevidade. Por outro lado Vieira et al. (2008) relataram que
o tempo e as condições de armazenamento influenciam a sobrevivência e a longevidade das
sementes, principalmente, por está susceptível ao ataque de microrganismos. Para as
espécies florestais, na maioria das vezes, torna-se difícil manter a viabilidade e o vigor das
sementes; por isso, fatores, como temperatura e umidade, devem ser considerados durante o
armazenamento, visando prolongar a longevidade e a sua viabilidade (OLADIRAN &
AGUNBIADE, 2000).
2.5 PATOLOGIA DE SEMENTE E EXTRATOS VEGETAIS
Os danos decorrentes da associação de patógenos com sementes não se limitam
apenas às perdas diretas de população de plantas no campo, mas abrangem também uma
série de outras implicações (MACHADO, 2000). De maneira geral, tem sido demonstrado
que patógenos quando localizados no interior da semente podem sobreviver por períodos de
tempo mais prolongados do que em outras partes da planta, onde tal fato ocorra,
provavelmente, pela existência de camadas protetoras e do acúmulo de reservas nutritivas
dos quais muitos patógenos se beneficiam (OLIVEIRA, 2007).
Na Fitopatologia, os fungos são considerados os principais agentes causais de
doenças de plantas. Nas sementes, a importância destes organismos está relacionada à
freqüência com que algumas espécies ocorrem associadas às mesmas como saprófitas ou
como patógenos (SOAVE et al., 1987). Os fungos associados às sementes podem ser
considerados saprófitas ou potencialmente patogênicos. Dentre os gêneros de fungos
saprófitas, incluem-se: Aspergillus, Cephalosporium, Epicoccum, Monilia, Mucor,
Nigrospora, Penicillium, Periconia, Rhizopus e Trichoderma. E dentre os potencialmente
14
patogênicos: Alternaria, Ascochyta, Botryodiplodia, Botrytis, Chaetomium, Cladosporium,
Colletotrichum, Curvularia, Diplodia, Dreschlera, Fusarium, Helminthosporium,
Macrophomina, Pestalotia, Phoma, Phomopsis, Rhizoctonia, Septoria e Verticillium
(LUCCA FILHO, 2003).
A transmissão de patógenos também pode ocorrer de semente para semente durante o
manejo destas entre a coleta e a semeadura. O contato entre as sementes é uma das
principais formas de disseminação de patógenos (MARCOS FILHO, 1987; OLIVEIRA,
2007). Na fase de armazenamento, os níveis de danos em sementes dependem das condições
do lote por ocasião do início do armazenamento e do controle da temperatura e umidade
durante essa fase. Se estas condições não são adequadas podem propiciar a associação de
fungos como Aspergillus sp. e Penicillium sp. que durante o armazenamento podem ser
altamente prejudiciais às sementes. Nestas circunstâncias, esses fungos podem depreciar a
qualidade das sementes na forma de: perda do poder germinativo, descoloração,
apodrecimento, aumento da taxa de ácidos graxos provocando a oxidação de óleos,
aquecimento da massa de sementes com o conseqüente aumento da taxa respiratória e com
isso uma deterioração mais rápida das sementes e produção de micotoxinas, que podem ser
letais ao homem e aos animais (MACHADO, 1988; VECHIATO et al, 2004).
A utilização de fungicidas é, em muitos casos, a única medida eficiente e
economicamente viável de garantir alta produtividade e qualidade de produção, visadas pela
agricultura moderna (KIMATI, 1995). Ao mesmo tempo, é também considerada uma
tecnologia que traz impactos negativos ao meio ambiente e à saúde pública (BETTIOL,
1997). Para reduzir os prejuízos causados pela atividade fúngica, métodos físicos, químicos
e biológicos vêm sendo empregados, visando o controle de doenças (TRIGO et al., 1998;
MACHADO, 2000; PICININI & FERNANDES, 2001; LUZ, 2003 a; COUTINHO et al.,
2007). Atualmente uma das alternativas pesquisadas envolve o uso de extratos vegetais,
buscando explorar suas propriedades fungitóxicas. A literatura tem registrado a eficiência de
extratos, obtidos de uma gama enorme de espécies botânicas, em promover a inibição do
desenvolvimento de vários fitopatógenos de natureza fúngica (KHAN & KUMAR, 1993;
VON PINHO et al., 1995; WILSON et al., 1997; CARVALHO et al., 1999; SOUZA et al.,
2002; TALAMINI & STADNIK, 2004; PEREIRA et al., 2006). Dentre os extratos mais
pesquisados encontra-se aquele obtido de alho (Allium sativum L.) (BARROS et al., 1995;
RIBEIRO & BEDENDO, 1999; CURTIS et al., 2004), hortelã (Mentha piperita) (BASTOS,
1997; CAMARGO, 2007), pimenta (Capsicum spp) (LEE et al., 2001), mamona (Ricinus
communis) (MARCANO et al. 2005; MILANESI et al., 2008) e de arruda (Ruta graveolens)
15
(BONALDO et al. 2004; PINTO et al. 1998; VALARINI et al. 1994) têm evidenciado
propriedades antifúngicas, demonstrando potencial de controle para patógenos de plantas
(BASTOS, 1997, SCHWAN-ESTRADA, 2003).
Chalfoun & Carvalho (1987), Souza et al. (2002) e Moraes (2004), que comprovaram
semelhante eficiência do extrato de alho no controle de Aspergillus spp., Fusarium spp.,
Penicillium spp. e Rhizopus sp. em sementes de milho. O uso do macerado seco de: timbó
(Ateleia glazioviana), hortelã (Mentha piperita), eucalipto (Eucalyptus citriodora) e
cinamomo (Meleia azedarach), de uma forma geral, reduziu a incidência de fungos em
sementes de espécies florestais (CAMARGO, 2007).
2.6 VIGOR
O vigor das sementes é o reflexo de um conjunto de características ou propriedades
que determinam o seu potencial fisiológico, ou seja, a capacidade de apresentar desempenho
adequado quando expostas a diferentes condições ambientais. A avaliação da qualidade
fisiológica das sementes é um fator fundamental e de grande valia para os diversos
segmentos que compõem um sistema de produção de sementes, contribuindo
significativamente para a manutenção e o aprimoramento da qualidade deste insumo básico,
com reflexos diretos na produtividade agrícola (MARCOS FILHO, 2005). Dada sua
importância, vários métodos têm sido propostos visando a avaliação do potencial fisiológico
das sementes (FERREIRA & BORGHETTI, 2004), de modo a obter estimativa segura do
desempenho dos lotes de sementes no campo e/ou no armazenamento.
McDonald Junior (1975) dividiu os testes de vigor em físicos, fisiológicos e
bioquímicos. Os físicos estariam relacionados com características de tamanho, peso e
densidade das sementes; os fisiológicos utilizam alguns parâmetros vinculados à germinação
e ao crescimento de plântulas, enquanto os bioquímicos avaliam alterações
bioquímicas/moleculares associadas ao vigor das sementes.
Para determinar a viabilidade de sementes, vários testes podem ser utilizados. No
entanto, o teste de tetrazólio, por ser rápido e barato é uma alternativa viável para fornecer
informações aos agricultores ou viveiristas, o qual vem sendo empregado rotineiramente na
avaliação rápida da viabilidade de sementes de várias espécies, principalmente daquelas que
necessitam de longos períodos para germinar, como é o caso das florestais, frutíferas e
forrageiras (MENDONÇA et al., 2001) ou que não germinam quando submetidas aos
métodos comumente usados, por se encontrarem dormentes (BRASIL, 1992). Em vista
16
dessa situação, pesquisas têm sido desenvolvidas procurando abreviar o prazo requerido para
obtenção dos resultados do teste de tetrazólio, a partir da definição de metodologia adequada
e padronizada para cada espécie (NASCIMENTO & CARVALHO, 1998).
Assim, o teste de tetrazólio poderá ser usado para determinar a viabilidade de
sementes com vantagem em relação ao teste de germinação, visto que, pode-se obter, em
laboratório, resultados rápidos e confiáveis em curto período de tempo (FRANÇA NETO,
1999; MARCOS FILHO, 2005).
2.6.1 Tetrazólio
O teste de tetrazólio fundamenta-se na alteração da coloração dos tecidos da semente em
presença de uma solução de sal de tetrazólio, o qual é reduzido pelas enzimas
desidrogenases dos tecidos vivos, resultando num composto denominado de formazam, de
coloração vermelha-carmim. O padrão de coloração dos tecidos pode ser utilizado para
identificar sementes viáveis, não viáveis e, dentro da categoria viável, classificadas como
alto e baixo vigor (VIEIRA & VON- PINHO, 1999). A coloração vermelha-brilhante ou
rosa-brilhante se desenvolve quando o hidrogênio resultante do processo de respiração das
células vivas combina-se com a solução de tetrazólio absorvida. De acordo com França Neto
(1999) a presença de tecidos não coloridos, firmes e sadios sugere maior resistência à
penetração da solução de tetrazólio do que a morte do tecido. O tecido morto geralmente é
caracterizado por cor branca ou amarelada e textura flácida (BHERING et al., 2005).
O teste de tetrazólio apresenta várias vantagens: não é afetado por diversas condições
que podem alterar os resultados do teste padrão de germinação, como a presença de fungos;
enfoca as condições físicas e fisiológicas do embrião de cada semente individualmente;
permite rápida avaliação da viabilidade; permite em algumas espécies, como soja e feijão, a
identificação de diferentes níveis de viabilidade e fornece o diagnóstico da causa da perda da
viabilidade das sementes (DELOUCHE et al., 1976; FRANÇA NETO, 1999; FERREIRA &
BORGHETTI, 2004).
Segundo Añez (2007), a concentração da solução de tetrazólio a 0,5%, em
temperatura de incubação de 30ºC e tempo de desenvolvimento de coloração de 90 minutos
é indicada como alternativa prática e econômica para a análise da viabilidade de sementes de
purga-de-lagarto (Jatropha elliptica). Zucareli et al. (2001) destacaram que, sementes de
farinha-seca (Albizia hasslerii) embebidas em água por 24 horas a 25ºC, com retirada do
tegumento, em reação com solução de tetrazólio 0,1% por cinco horas, apresentaram
coloração adequada permitindo a identificação e diferenciação de tecidos, com todas as
17
sementes coloridas de forma uniforme. Para sementes de jenipapo (Genipa americana L.), a
combinação de pré-condicionamento em água por 24 horas à temperatura de 36ºC e imersão
dos embriões por duas horas em solução de tetrazólio a 0,25% a 40ºC, mostrou-se eficiente
(NASCIMENTO & CARVALHO, 1998).
Para determinar a viabilidade de sementes de mangava-brava (Lafoensia pacari),
Mendonça et al. (2006) recomendam a imersão das sementes em água - pré-
condicionamento - por 48 horas (com agitação inicial por 60 minutos e posterior repouso por
47 horas), com retirada do tegumento e posterior embebição em solução de tetrazólio na
concentração de 0,075% e encubação em estufa a 40ºC por 60 minutos.
Esse teste pode ser usado como alternativa ao teste de germinação na avaliação da
viabilidade de sementes de castanha-do-brasil (Bertholletia excelsa) (CAMARGO et al.,
1997), nó-de-cachorro (Heteropteris aphrodisiaca) (ARRUDA, 2001), ajuí (Cordia
trichotoma) (MENDONÇA et al., 2001), guaritá-do-cerrado (Astronium graveolens),
jacarandá (Jacaranda cuspidifolia) e angico amarela (Parapiptadenia rigida) (FOGAÇA,
2003), entre outras espécies.
18
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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29
MANUSCRITO 1
Números Cromossômicos em espécies do gênero Manihot (Euphorbiaceae:
Crotonoideae) da região nordeste do Brasil
Chromosome Numbers in species of the genus Manihot (Euphorbiaceae:
Crotonoideae) from northeastern Brazil
RESUMO
Foram analisadas citogeneticamente sete espécies de Manihot através de coloração
convencional com Giemsa, pertencentes às secções Manihot, Glazioviana, Tripartita e
Peruvianae. Todas as espécies apresentaram núcleos interfásicos semi-reticulados, cariótipo
simétrico com 2n = 36 e padrão de condensação profásica do tipo proximal. O número de
satélites variou de zero em M. leptophyla a quatro satélites em M. esculenta cultivar
Pornunça, localizados quase sempre nos braços curtos, mais claramente visíveis em
cromossomos profásicos. Foram confirmadas as contagens prévias para M. glaziovii, M.
tripartita e M. esculenta e são acrescidas contagens inéditas para M. pseudoglaziovii, M.
caatingae, M. glaziovii subsp. noronhense subsp. nv. e M. leptophylla. Todas as espécies
apresentaram cariótipos similares, exceto M. leptophylla da secção Peruvianae, a única
espécie de hábito escandente, que apresentou um par cromossômico com constrições
secundárias proximais.
Palavras-chaves: Cariótipo, Citogenética, Euphorbiaceae, Maniçoba.
ABSTRACT
Seven species of Manihot belonging to the sections Manihot, Glazioviana, Tripartita
and Peruvianae were analyzed cytogenetically using conventional staining with Giemsa. All
of the species demonstrated semi-reticulated interphase nuclei, a symmetrical karyotype
with 2n = 36, and a proximal-type prophase condensation pattern. The numbers of satellites
varied from zero in M. leptophylla to four in M. esculenta cultivar Pornunça, and these were
almost always located on the short arms; but they were clearly visible in prophase
chromosomes. Earlier counts for M. glaziovii, M. tripartita, and M. esculenta were
confirmed, and new counts were made for M. pseudoglaziovii, M. caatingae, M. glaziovii
30
subsp. noronhense subsp. nv., and M. leptophylla. All of these species have similar
karyotypes, except for M. leptophylla from the section Peruvianae, which is the only species
having a climbing habit and that demonstrates a pair of chromosomes with proximal
secondary constrictions.
Key-words: Karyotype, Cytogenetics, Euphorbiaceae, Maniçoba.
INTRODUÇÃO
O gênero Manihot é constituído por plantas perenes, desde subarbustos até pequenas
árvores, com raízes geralmente tuberosas, ricas em carboidratos. É um gênero exclusivo dos
neotrópicos, com 98 espécies, 80 delas, para o Brasil, que é considerado o principal centro
de diversidade do gênero (ROGERS & APPAN, 1973; NASSAR, 1978; NASSAR 2000).
Para o Brasil, os cerrados do sul de Goiás e oeste de Minas Gerais, são considerados os
maiores centros de diversificação de gênero (NASSAR, 1978). Para o nordeste, são referidas
19 espécies (REGINA et al., 2006), principalmente do estado da Bahia (ROGERS &
APPAN, 1973)
A variabilidade genética é acentuada neste gênero em virtude de suas espécies
intercruzarem e produzirem híbridos férteis, úteis ao melhoramento genético, especialmente
para a transferência de genes desejáveis de espécies selvagens para Manihot esculenta, a
principal espécie cultivada (NASSAR & GRATAPAGLIA, 1986). O gênero é considerado
um alotetraplóide derivado do número básico x = 9 proposto para a família Euphorbiaceae
como um todo (JENNINGS, 1963; MAGOON et al., 1969; UMANAH & HARTMANN,
1973). A utilização de dados citogenéticos tem sido importante instrumento na compreensão
das relações de parentesco, dos mecanismos de evolução cariotípica (STEBBINS 1971;
GUERRA, 1990) e para o melhoramento de plantas (SUMNNER, 2003).
Em geral, o gênero Manihot é cariologicamente pouco estudado, com
aproximadamente 26 espécies analisadas, o que corresponde aproximadamente 27% da
diversidade taxonômica reconhecida para o gênero. É um grupo numericamente estável, com
2n = 36 para 27% das espécies citologicamente estudadas (BOWDEN, 1940; PERAK, 1940;
ABRAHAM, 1944; CRUZ, 1968; MAGOON et al., 1969; NASSAR, 1978; BAI et al.,
1992; CARVALHO & GUERRA, 2002). Para o Brasil são conhecidos números
cromossômicos para aproximadamente 17 espécies, com 2n = 36 na maioria delas
(NASSAR et al., 1995; NASSAR, 2000; NASSAR & COLLEVATI, 2008). Essa
32 31
estabilidade numérica interespecífica também ocorre nas espécies da região Nordeste do
Brasil. Carvalho & Guerra (2002), por exemplo, estudando a variabilidade cariotípica em
diversos acessos de Manihot esculenta e em outras espécies afins da região, observaram
além da estabilidade cromossômica numérica, uma estabilidade cariotípica estrutural em
termos de número e distribuição de bandas heterocromática, de RONs e de distribuição de
sítios de DNAr. Uma exceção a essa regra ocorreu em uma cultivar denominada "Manipepa"
proveniente da Bahia, onde foi observada a ocorrência de triploidia espontânea, com 2n =
54 em todos os indivíduos analisados desse clone (Carvalho & Guerra, 1999). Entretanto,
muitas espécies da região ainda são cariologicamente desconhecidas, não havendo estudos
comparativos entre espécies próximas do continente ou comparação destas com populações
insulares do Arquipélago de Fernando de Noronha.
O presente trabalho objetiva caracterizar citologicamente algumas espécies do gênero
Manihot ocorrentes no Nordeste brasileiro, através da análise de número e morfologia
cromossômica, estrutura dos núcleos interfásicos, número e posição de satélites, visando
avaliar a implicação desses dados para a taxonomia do gênero.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados exclusivamente materiais coletados no campo provenientes de
vários estados da região Nordeste do Brasil. Na Tabela 1 encontram-se a relação de todas as
espécies estudadas, números cromossômicos observados, posição taxonômica, contagens
prévias e locais de coletas. O material foi cultivado no jardim experimental do Laboratório
de Citogenética Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba,
utilizando-se vasos plásticos com substrato formado por areia lavada e solo agrícola na
proporção de 1:1, drenados com uma camada de brita. Foram preparadas exsicatas que se
encontram depositadas no Herbário Jayme Coelho de Morais (EAN).
Nas análises citogenéticas foram utilizadas pontas de raízes pré-tratadas com 8-
hidroxiquinoleína 0,002 M a 4ºC por 20 horas, ou colchicina a 0,1% por 18 e 24 horas. As
raízes foram então fixadas em Carnoy 3:1 (etanol absoluto/ácido acético glacial) por 3–24
horas e estocadas a -20ºC no próprio fixador até posterior análise. Para o preparo das
lâminas foi utilizada a metodologia recomendada por Guerra & Souza (2002) para a
coloração convencional. As pontas das raízes foram hidrolisadas em HCl 5N à temperatura
ambiente por 20 minutos, esmagadas em ácido acético 45%, congeladas em nitrogênio
líquido para a remoção da lamínula, secas ao ar, coradas co Giemsa a 2% e montadas com
32
Entellan. As melhores células foram fotografadas com uma câmara digital Olympus D-540
adaptada a um microscópio Olympus CX40.
Para identificação do número cromossômico, de três a cinco metáfases foram
examinadas por população, das quais as três melhores foram utilizadas para as medições
cromossômicas. Todas as medições cromossômicas foram realizadas com o auxílio do
programa Image Tool (DONALD et al., 2008).
RESULTADOS
Todas as espécies analisadas apresentaram núcleos interfásicos semi-reticulados e
cariótipo com 2n = 36 e padrão de condensação profásica do tipo proximal (Figura 1. a). Os
cariótipos foram geralmente simétricos, formados por cromossomos metacêntricos a
submetacêntricos, com tamanho cromossômico variando de 1,06 a 2,76 μm para Manihot
glaziovii subsp. noronhense subsp. nv. (Martins, em preparação). Foi observado um número
variável de satélites, desde zero em M. leptophyla até quatro satélites em M. esculenta
cultivar Pornunça, localizados quase sempre nos braços curtos, mais claramente visíveis em
pro-metáfases. As características cariótipicas das espécies analisadas são apresentadas a
seguir de acordo com suas secções.
Para a secção Manihot foram analisados dois acessos de M. esculenta: as cultivares
Pornunça e Manipeba provenientes respectivamente dos estados da Paraíba e Pernambuco.
Ambas apresentaram cariótipos similares, com 2n = 36, cromossomos pequenos,
metacêntricos a submetacêntricos, variando de 1,06 a 2,08 µm, com zero a quatro satélites
nos braços curtos de dois pares submetacêntricos (Figuras 1. a, b).
Na secção Glaziovianae, as quatro populações de M. glaziovii e as três de M.
pseudoglaziovii, apresentaram cariótipos similares, mas divergiram ligeiramente em relação
aos tamanhos cromossômicos, com 1,24 a 2,06 µm em M. glaziovii (Figura 1. c) e 1,19 a
2,16 µm em M. pseudoglaziovii (Figura 1. d), ambas com zero a um par de satélites no braço
curto de um dos pares submetacênticos. Em M. catingae, o único indivíduo analisado
apresentou cromossomos variando de 1,13 a 1,82 µm de comprimento, com até dois satélites
localizados nos braços curtos de um dos submetacêntricos (Figura 1. e). A outra espécie
desta secção, M. glaziovii subsp. noronhense subsp. nv. (Martins, em preparação), do
arquipélago de Fernando de Noronha, o único representante de uma ilha oceânica da
presente amostra, se diferenciou das demais por apresentar até quatro satélites localizados
nos braços curtos de dois pares submetacênticos (Figura 1. f).
33
Na secção Tripartitae, M. tripartita apresentou os menores cromossomos medindo
de 1,07 a 183µm, com um par de satélites nos braços curtos de dois cromossomos
metacêntricos (Figura 1. g). Todavia, na secção Peruvianae, M. leptophylla se diferenciou
das demais espécies por apresentar cromossomos maiores, medindo de 1,27 a 2,11µm e uma
constrição secundária proximal longamente distendida, localizada em par de cromossomos
metacêntricos grandes (Figura 1. h).
DISCUSSÃO
De um total de 98 espécies de Manihot, são conhecidos dados cariológicos para 26
delas, o que corresponde a aproximadamente 27% da diversidade conhecida para o gênero.
No presente trabalho são acrescidas quatro contagens inéditas para o gênero (M. catingae,
M. noronhense e M. leptophylla) e foram confirmadas todas as contagens de 2n = 36 para M.
glaziovii (DOUGHTY, 1939; DATTA, 1967; KRISHNAN ET AL., 1970; KRISHNAPPA
& RESHME, 1982; CARVALHO & GUERRA, 2002), M. pseudoglaziovii (NASSAR,
2003) e M. tripartita (NASSAR, 1978). Para M. esculenta, também foram confirmadas todas
as contagens com 2n = 36 (SCHMER, 1968; KAVITHA et al., 1998; KAVITHA &
VEMBU, 1999; CARVALHO et al., 1999; SOONTORNCHAINAKSAENG &
CHAIYASUT, 1999; CHEN et al., 2003), exceto para M. esculenta cv. Manipeba, com 2n =
54 (CARVALHO et al., 1999). Esta última, um triplóide natural do município de Sapé,
Estado da Paraíba, mantido em cultivo no banco de germoplasma da Escola de Agronomia
de Cruz das Almas, estado da Bahia.
Em nosso trabalho também foram analisados vários indivíduos de um clone
subarbóreo denominado "manipeba" cultivado como cerca viva na margem da estrada PE,
no município de Goiana, estado de Pernambuco. Estes indivíduos formaram pequenas
árvores com até 3,5m de altura, divergindo vegetativamente do material analisado por
Carvalho et al. (1999) que formava moitas de aproximadamente 1,5m de altura. Outro caso
de poliploidia espontânea foi observado em um híbrido artificial entre M. esculenta e M.
epruinosa cultivado na Nigéria (HAHN et al., 1992). Nesse caso, em uma população
cultivada no campo, um dos brotos produzidos na base de uma planta híbrida diferiu
vegetativamente dos demais brotos e apresentou 2n = 72, um autotetraplóide. Triplóides e
tetraplóides de Manihot são geralmente estéreis ou de fertilidade sexual reduzida devido
irregularidades na meiose pela formação de quadrivalentes e trivalentes na meiose I (HAHN
et al., 1992; CARVALHO et al., 1999). Entretanto, em ambos os casos, esses cariótipos são
34
mantidos através da multiplicação vegetativa por estaquia e os clones são livremente
propagados.
O gênero Manihot é notavelmente estável em termos de números cromossômicos,
padrão de condensação profásica e estrutura dos núcleos interfásicos, o que contrasta com a
destacada variabilidade morfológica de algumas espécies. Essa constância tem sido
observada em outras espécies das regiões Nordeste (PERRY, 1943; NASSAR, 1980;
CARVALHO, 1999; CARVALLHO & GUERRA, 2002) e Centro-Oeste do Brasil
(NASSAR, 1978, 1980). Alguns grupos taxonômicos como nos gêneros Spondias
(ALMEIDA et al., 2007) e Citrus (MORAES et al., 2007), com número cromossômico
igualmente estável são variáveis em termos de estrutura cromossômica revelada pela
distribuição da heterocromatina. Contudo, em Manihot, a estrutura cromossômica se
mostrou estável, com pequenas variações na distribuição da heterocromatina (CARVALHO
& GUERRA, 2002). Provavelmente, essa estabilidade cromossômica poderia estar
relacionada à compatibilidade para hibridização interespecífica, uma característica pouco
explorada no melhoramento da mandioca.
Contudo, no cruzamento de M. neusana e M. esculenta, foi observada na F1 uma
baixa fertilidade de pólen, com formação de apenas 17% de bivalentes (NASSAR, 2000).
Por outro lado, em alguns híbridos de mandioca com outras espécies a fins (M. glaziovii e
M. neusana, por exemplo), a ocorrência de apomixia parece contornar a baixa fertilidade do
pólen (NASSAR, 2000; SOUSA, 2001). Além disso, a reprodução por estaquia tem
permitido o estabelecimento de clones de interesse comercial e de híbridos interespecíficos,
como naqueles resultantes do cruzamento entre M. glaziovii e M. esculenta (NASSAR,
2000).
Em nossa amostra, as únicas diferenças cariotípicas notáveis foram observadas em
M. glaziovii subsp. noronhense e M. leptophylla. Na primeira, um táxon ainda inédito
(Martins, em preparação), provavelmente a ocorrência de quatro satélites na maioria das
metáfases e prometáfases analisadas, decorra do fato de ser uma subespécie insular, onde
essa característica pode ter sido perpetuada pela homozigose induzida através dos
cruzamentos e retro-cruzamentos entre plantas irmãs. Já M. leptophylla, a única espécie
estudada da secção Peruvianae, apresentou um par de cromossomos com uma constrição
primária proximal observada na maioria das células analisadas. Assim como as outras
espécies desta secção, M. leptophylla caracteriza-se por apresentar hábito escandente e tem
padrão amplo de distribuição, ocorrendo desde o Equador até o estado de Pernambuco
(ROGERS & APPAN, 1973). Característica cariotípica semelhante foi observada em
35
Manihot sp1. por Carvalho & Guerra (2002) para o estado do Piauí. O exame dos
“vouchers” depositados no Herbário UFP (tombo no 22487), não evidenciou qualquer
alteração morfológica que sugerisse esta espécie indeterminada com hábito escandente; ao
contrário de Manihot sp2. (tombo no 22485), de hábito escandente, porém sem constrição
secundária proximal visível.
Para o gênero Manihot são sugeridas quatro áreas biogeográficas de distribuição
(NASSAR, 2000): um centro Goiano-Mineiro, com a maioria das espécies; seguido pelos
centros Mexicano, do Nordeste do Brasil e Mato Grosso-Boliviano. Duputié et al. (2008)
com base no seqüenciamento de dois genes nucleares (G3pdh e NIA), propuseram um
arranjo filogenético com cinco clados principais semelhantes à proposta filogeográfica de
Nassar (2000). Dados cariológicos frequentemente têm confirmado propostas de filogenia e
de tratamentos taxonômicos em diversos grupos de plantas. Entretanto, em Manihot, 2n = 36
ocorre em todas as espécies do gênero e também em outros gêneros de outras tribos de
Euphorbiaceae como Dalechampia, Hevea e Pedilanthus. A constância no número e a
notável uniformidade na estrutura e na morfologia cromossômica parecem sustentar a
monofilia do gênero Manihot. Por outro lado, dificulta a utilização desses para inferir
relações taxonômicas, sendo necessária a utilização de outras abordagens para se ter uma
idéia mais precisa das relações filogenéticas no gênero.
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39
Figura 2. Metáfase mitóticas de espécies do gênero Manihot (Euphorbiaceae) do Nordeste do
Brasil, com 2n = 36 (a) Manihot esculenta cultivar Pornunça, Serraria-PB, com quatro satélites nos
braços curtos (setas); (b) M. esculenta cultivar Manipeba, Goiana-PE; (c) M. glaziovii, Areia-PB,
com um par de satélite nos braços curtos (seta); (d) M. pseudoglaziovii, Acari-RN, com um par de
satélite nos braços curtos (seta); (e) M. catingae, Canguaretama-RN, com dois satélites; (f) Manihot
glaziovii subsp. noronhense subsp. nv., Fernando de Noronha-PE, com quatro satélites localizados
nos braços curtos; (g) M. tripartita, Jacobina-BA, com um par de satélites nos braços curtos; (h) M.
leptophyla, Goianinha-RN com constrição secundária proximal longamente distendida (cabeça de
setas). Barra em h equivale a 10µm.
g
40
Tabela 2. Lista de espécies analisadas, com os respectivos locais de coletas, número cromossômico, contagens prévias e referências.
Taxon Populações analisadas Número do
coletor
Figuras
Número
cromossômico
(2n)
Contagens
Prévia Referências
n 2n 3n
Secção Manihot Rogers &
Appan
M. esculenta Crantz Cultivar
Pornunça Serraria/PB LPFelix, 11510
36
36
Carvalho & Guerra,
2002;
Hahn et al., 1992;
Perry, 1943.
Cultivar Manipeba Goiânia/PB LPFelix, 12037 36 54 Carvalho et al., 1999.
Secção Glaziovianae Pax
M. glaziovii Muell. Arg. Areia/PB LPFelix, 12763
36 36
Carvalho & Guerra,
2002;
Cubati/PB LPFelix, 12764 36 Perry, 1943.
Esperança/PB LPFelix, 12036
36 18
Nassar; 2000;
Nassar, 2003. M. pseudoglaziovii Pax & K.
Hoffmann Vertentes/PE LPFelix, 11528
36
36 Nassar, 2003.
Acari/RN LPFelix, 11937 36 Serra do Rajado/RN LPFelix, 11924 36 Gargarelhas/RN LPFelix, 12154 36 M. catingae Ule Canguaretama/RN LPFelix, 11423 36 M. glaziovii subsp.
noronhense subsp. nv. Fernando de Noronha/BA LPFelix, 11520
36
Secção Tripartitae Rogers &
Appan
M. tripartita Rogers &
Appan Jacobina/BA LPFelix, 12035
36
18
-
18
36
Nassar, 2000;
Nassar, 2003.
Nassar, 1978. Secção Peruvianae Rogers
& Appan
M. leptophylla Pax in
Engler Goianinha/RN LPFelix, 11425
36
41
Figura 2. Ilustração de alguns representantes do gênero Manihot. (a) M. esculenta
cultivar Pornunça; (b) M. glaziovii; (c) M. pseudoglaziovii; (d) M. catingae; (e)
Manihot glaziovii subsp. noronhense subsp. nv.; (f) M. tripartita; (g) M. leptophyla.
42
MANUSCRITO 2
Taxonomia de Manihot glaziovii e M. pseudoglaziovii secção
glaziovianea (Euphorbiaceae: Crotonoideae)
Taxonomy of Manihot glaziovii and M. pseudoglaziovii section
glaziovianea (Euphorbiaceae: Crotonoideae)
RESUMO
Foram discutidos os limites taxonômicos entre Manihot glaziovii e M. pseudoglaziovii
sob um ponto de vista morfológico e biogeográfico, além de uma análise de materiais
previamente identificados como M. glaziovii proveniente de Fernando de Noronha e que
constitui um novo táxon para a ciência. Manihot glaziovii e M. pseudoglaziovii ocorrem
principalmente na Caatinga dos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,
Pernambuco e Bahia. As características morfológicas utilizadas na diagnose dessas
espécies demonstraram sobreposição de caracteres, muitas vezes observados em uma
mesma população. No trabalho está sendo proposta a sinonimização de M.
pseudoglaziovii para incluí-la nos limites taxonômicos de M. glaziovii. O táxon
endêmico do Arquipélago de Fernando de Noronha está sendo descrito como M.
glaziovii subsp. norohense subsp. nv., endêmica da ilha principal daquele arquipélago.
Palavras-chave: Euphorbiaceae, Maniçoba, Nova Espécie, Taxonomia.
ABSTRACT
The taxonomic limits between Manihot glaziovii and M. pseudoglaziovii are discussed
from a morphological and biogeographical view, including analyses made of material
previously identified as M. glaziovii from the Fernando de Noronha Archipelago that
constitutes a new taxon for science. Manihot glaziovii and M. pseudoglaziovii occur
43
principally in the “Caatinga” dryland areas of the states of Piauí, Ceará, Rio Grande do
Norte, Paraíba, Pernambuco, and Bahia in northeastern Brazil. The morphological
characteristics utilized in the diagnoses of these species demonstrated overlapping
characters, many of which were observed in the same population. We proposed here the
synonymization of M. pseudoglaziovii to include it within the taxonomic limits of M.
glaziovii. The taxon endemic to the Fernando de Noronha Archipelago is described here
as M. glaziovii subsp. norohense subsp. nv., endemic to the main island of that chain.
Key-words: Euphorbiaceae, Maniçoba, New Species, Taxonomy.
INTRODUÇÃO
A família Euphorbiaceae sl compreende cerca de 317 gêneros e 8.000 espécies,
tradicionalmente distribuídas em cinco subfamílias: Phyllanthoideae, Oldofieldioideae,
Acalyphoideae, Crotonoideae e Euphorbioideae (WEBSTERS, 1994). Destas, 70
gêneros e aproximadamente 1000 espécies são referidas para o Brasil (SOUZA &
LORENZI, 2005), 211 delas para a região Nordeste (BARBOSA, 2006). A família tem
sido mais recentemente considerada polifilética e tem sido proposto seu
desmembramento em Euphorbiaceae ss, abrangendo principalmente as espécies com um
único óvulo por lóculo (WURDACK et al., 2005), além de Phyllantaceae e outras
linhagens relacionadas que compreendem as espécies biovuladas (WURDACK et al.,
2004). A família se destaca por apresentar espécies de importância no reflorestamento
de áreas degradadas (JACOBI et al., 2008), como ornamentais (BARROSO et al., 2007;
ALVES & LUCENA, 2007) e na alimentação humana e animais (CAMARA &
MADRUGA, 2001; CASTRO, 2004; SILVA et al., 2007; CASTRO, 2007). Entre as
espécies utilizadas na alimentação humana, o gênero Manihot se destaca como o grupo
mais importante na alimentação de muitas populações da América Latina e África
(ROGERS & APPAN, 1973; CASTRO, 2007). Além disso, algumas espécies estão
sendo crescentemente utilizada na alimentação de bovinos, ovinos e caprinos no semi-
árido nordestino (SOARES & SALVIANO, 2000; CASTRO, 2004; GUEDES, 2007).
O gênero compreende 98 espécies de distribuição exclusivamente neotropical,
sendo Brasil e México considerados os dois principais centros de diversidade do gênero
44
(ROGERS & APPAN, 1973; NASSAR, 2000). É formado por árvores, arbustos,
subarbustos semiherbáceos à decumbentes, plantas geralmente monóicas, com
inflorescências de flores pistiladas na base e estaminadas no ápice. A taxonomia de
algumas espécies de Manihot é especialmente confusa devido à existência de caracteres
que muitas vezes se sobrepõem entre diferentes espécies. Um exemplo desse tipo de
inconsistência taxonômica é observado entre as espécies Manihot glaziovii e M.
pseudoglaziovii, duas espécies arbóreas, freqüentes na caatinga nordestina (BELTRÃO
et al., 2006). Estas espécies são de interesse para pequenos produtores e criadores de
rebanhos, visto que seu uso sob a forma de forragem tornou-se uma alternativa em
ocasiões de secas prolongadas (CASTRO, 2007).
De acordo com Rogers & Appan (1973), M. glaziovii ocorre nos estados do
Ceará, Pernambuco, Paraíba e Bahia, apresenta folhas palmatipartidas, membranácea a
coriácea, com três a cinco lóbulos de ápice obtuso a agudo, enquanto em M.
pseudoglaziovii a lâmina foliar é coriácea, com cinco lóbulos de ápice agudo e
distribuição restrita aos estados do Ceará, Rio Grande do Norte e Paraíba. Segundo
Nassar (2000) as duas espécies possuem fracas barreiras de isolamento reprodutivo, o
que poderá levar a formação de híbridos naturais, dificultando ainda mais definir os
limites taxonômicos entre essas duas espécies.
Manihot glaziovii é ainda citada para o arquipélago de Fernando de Noronha
(RIDLEY, 1988) onde ocorre nos mais variados ambientes, como indivíduos isolados
ou formando aglomerações. Para esse arquipélago, as plantas apresentaram hábito
variando desde arbusto até árvores com cerca de 10m de altura (FREITAS, 2007). Ilhas
oceânicas são reconhecidas como importantes centros de endemismos e especiação,
onde as populações isoladas com o decorrer do tempo tendem a se diferenciar
morfologicamente dos seus ancestrais continente (BISCONTI et al., 2001; TREJO-
TORRES & ACKERMAN, 2001).
No presente trabalho são discutidos os limites taxonômicos entre Manihot
glaziovii e M. pseudoglaziovii sob um ponto de vista morfológico e biogeográfico,
visando fornecer elementos para uma separação segura entre esses dois táxons. Nesse
estudo, também foi incluída a análise de materiais previamente identificados como M.
glaziovii, proveniente do arquipélago de Fernando de Noronha e que constitui uma nova
espécie para a ciência.
45
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo taxonômico foi baseado na análise morfológica comparativas de
plantas observadas no campo e de materiais herborizados depositados nos Herbários
EAN, IPA, UFP, HST e PEUFR, além de observações de campo. Para M. glaziovii e M.
pseudoglaziovii, foram realizadas observações em populações naturais da Paraíba e do
Rio Grande do Norte, além de coletas esporádicas nos estados de Pernambuco, Bahia e
Ceará. Além disso, foram observados cultivos artificiais de M. glaziovii, M.
pseudoglaziovii e Manihot glaziovii subsp. norohense sp. nv. em campos e jardins
experimentais do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba,
Campus II, Areia, Paraíba.
RESULTADOS
1. Manihot glaziovii Müll. Arg., Fl. Bras. 11(2):446. 1874; Rogers & Appan, Fl. Neot.
13:272.1973. Figura 1, Mapa 1.
Arbusto ou arvoreta; 3-5 metros de altura; ramos lisos, verdes quando jovens,
depois branco acinzentados, glabros. Folhas simples (Figura 3. a-f), alternas; estipulas
caducas (Figura 3. h), triangulares a estreito triangulares, margem inteira a ligeiramente
serreada, (0,2) 0,3-1,0cm de comprimento, 0,1-0,3cm de largura basal; pecíolo
cilíndrico, glabro, 8-15cm de comprimento, inserido na porção inferior da lâmina, com
0-1,5cm até a margem; lâmina peltada, palmatipartida, palmatinérvea, membranácea,
abaxialmente reticulada, adaxialmente verde ou recoberta com cerosidade cinza-
esbranquiçada, margem inteira, três, mais frequentemente cinco lobadas a raro, sete
lobadas (6,0) 7,0-15,0cm de comprimento, 9,0-17,0cm de largura; lobos inteiros, raro
pandurados, agudos, apiculados; lobo mediano maior, obovado. Inflorescência em
panícula terminal ramificada, monóica, 5-15cm de comprimento, raro maiores, até 30cm
de comprimento na antese das últimas flores estaminadas; recobertas ou não com
cerosidade cinza-esbranquiçada; brácteas (Figura 3. i) e bractéolas geralmente caducas
na antese, estreito triangulares, paucidentadas, cerca de 0,1cm de comprimento; flores
pistiladas hipogínicas (Figura 6. b), no terço inferior da inflorescência, com antese ou
depois das flores estaminadas (Figura 6. a), sépalas livres, crassas, costadas,
marginadas, aproximadamente 1,0cm de comprimento e 0,5-0,6cm de largura; pedicelos
46
0,5-3,0cm de comprimento; ovário subgloboso, estilete trífido, ramificado, disco
estigmal amarelado, ligeiramente lobado; flores estaminadas nos 2/3 superiores da
inflorescência, de antese precoce, gamossépalas, sépalas crassas, costadas, marginadas,
glabras, imbricadas, 0,8-1,0cm de comprimento, 0,5cm de largura; estames, 10, cinco
externos maiores, e cinco internos menores; anteras birrimosas, introrsas; disco
estaminal, amarelado, invaginado na inserção dos filetes. Frutos globosos, tricoca, de
deiscência longitudinal, glabro, aproximadamente 3cm de comprimento e 1,5cm de
largura.
Esta espécie ocorre principalmente na Caatinga dos estados do Piauí, Ceará, Rio
Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco e Bahia. Foi descrita por Müller Argoviensis
(1874) com base em material cultivado no Rio de Janeiro, com holótipo depositado no
herbário G (ROGERS & APPAN, 1973). Pax & Hoffman (1924), com base em diversos
materiais coletados por Luetzelburg referidos para os estados da Paraíba e Rio Grande
do Norte, propuseram M. pseudoglaziovii (Figura 4) como espécie afim de M. glaziovii
(Figura 3) que foi reconhecida por Rogers & Appan (1973) em sua revisão para a Flora
Neotrópica. De acordo com estes últimos autores, M. pseudoglaziovii se diferencia por
apresentar inflorescência com menos de 10cm de comprimento, com poucas flores,
folhas cinco lobadas, lobos separados nos sinus. M. glaziovii teria inflorescências mais
longas, folhas três lobadas, lobos mais largos, sobrepostos nos sinus. Uma análise das
fichas de herbário do material coletado por Luetzelburg utilizado como sintipos na
descrição de Pax & Hoffman (1924), observou-se que aparentemente todo o material
citado para o estado Paraíba, na verdade era proveniente do Rio Grande do Norte, da
região denominada Seridó. Por exemplo: Os materiais Luetzelburg, 12430 (Brasil,
Paraíba, Currais Novos, Março de 1920) e Luetzelburg, 12429 (Brasil, Paraíba,
Galgalheira, Março de 1920), na verdade correspondem a plantas coletadas nos
municípios de Currais Novos (6º15’39”S e 36º31’04”W), no primeiro caso e Acarí
(06º26’08”S e 36º38’20”W), no segundo, ambos no estado Rio Grande Norte. Este
último, provavelmente se referindo a Serra de Gargalheira, em Acarí, local onde
também foram coletadas por Luetzelburg outras espécies de angiospermas (Luetzelburg,
1922). Nossa análise de materiais provenientes da Paraíba e do Rio Grande do Norte,
incluindo espécimes vivos provenientes da Serra de Gargalheira em Acarí no Rio
Grande do Norte, foi conclusiva de que as características utilizadas na diagnose das suas
espécies se sobrepõem. Vários espécimes de Acarí apresentam folhas com três a cinco
47
lobos separados ou não nos sinus, inflorescência de tamanho variável, com poucas a
muitas flores. Sendo assim, propomos que M. pseudoglaziovii seja incluída nos limites
taxonômicos de M. glaziovii.
Material Examinado: PARAÍBA: Remígio, LPFelix 12126, 11-III-2008;
Areia, LPFelix & MTCSMartins 12763, 12-V-2008 (EAN); Picuí, margem da estrada
via Carnaúba dos Dantas, LPFelix 12137, 11-III-2008 (EAN); Cuité, próximo à
Baraúna, LPFelix 12136, 11-III-2008 (EAN); Barra de Santa Rosa, margem da estrada
via Cuité, LPFelix 12132, 11-III-2008 (EAN); Barra de Santa Rosa, margem da estrada
via Cuité, LPFelix 12131, 11-III-2008 (EAN); Cuité, margem da estrada a 6km antes de
Barra, LPFelix 12130, 11-III-2008 (EAN); Esperança, Inselbergue, LPFelix 12036, 07-
VI-2007; Picuí, comunidade Pedreiras, LPFelix 11918, 05-VI-2007 (EAN); Algodão de
Jandaíra, margem da estrada, LPFelix 11908, 05-VI-2007 (EAN); Picuí, margem da
estrada, LPFelix 11778, 10-IV-2007 (EAN); Picuí, na margem da estrada para Barra de
Santa Rosa próximo ao Rio Jacú, LPFelix 11775, 10-IV-2007 (EAN); Esperança,
margem da estrada em frente ao Posto Almeida, LPFelix 11774, 02-IV-2007 (EAN);
São João do Cariri, Fazenda Experimental, LPFelix & JVDornelas 662, 08-V-1987
(EAN); Esperança, LPFelix 1677, 17-XII-1986 (EAN); Capoeirões, próximo a Serra de
Alagoa Grande, JCMoraes s/n, 16-VI-1953 (EAN); Solânea, JGrisi 168, 24-IV-01
(IPA); Soledade, RPereira s/n, 29-IV-1988 (IPA); São Gonçalo, TVLuetzelburg s/n, 20-
III-1936 (IPA); Monteiro, MFALucena et al. 1731, 21-IV-2007 (UFP); Boa Vista,
Lajedo dos Três Catolés, MFALucena & MAlves 1851, 21-III-2007 (UFP); Soledade,
IMMSSilva et al. 353, 22-II-2006 (HST); Patos, São Mamede, SISilva 309, 04-III-1995
(PEUFR); Santa Luzia, SISilva 307, 04-III-1994 (PEUFR); Taperoá, SISilva 305, 04-
III-1994 (PEUFR); Santa Luzia, SISilva s/n, 04-III-1994 (PEUFR); Campina Grande,
BR 230 K 173, SISilva 34, 23-I-1993 (PEUFR); CEARÁ: Ajuaba, Estação Ecológica,
JRLemos & PMatias 214, 27-IV-2004 (IPA); Guaramiranga, BPickersgill et al. 309, 09-
III-1972 (IPA); Fortaleza, BPickel 305, 09-III-1972 (IPA); Dom Quitino, BPickersgill
246, 28-II-1972 (IPA);. RIO GRANDE DO NORTE: Gargalheiras, LPFelix 12154,
11-III-2008 (EAN); Acari, margem da estrada, LPFelix 12153, 11-III-2008 (EAN);
Acari, margem da estrada para Currais Novos, LPFelix 12141, 11-III-2008 (EAN);
Carnaúba dos Dantas, LPFelix 12138, 11-III-2008 (EAN); Acari, margem da estrada
para Currais Novos, LPFelix 11936, 05-VI-2007 (EAN); Acari, Serra do Rajado,
48
LPFelix 11924, 05-VI-2007; Acari, margem da estrada para Currais Novos, LPFelix
11793, 10-IV-2007 (EAN); Acari, Lagoa Seca, LPFelix, 11786, 10-IV-2007 (EAN);
Serra do Carmo, BPickel 341, 18-III-1972 (IPA). BAHIA: Senhor do Bonfim,
Rancharia LPFelix 11580, 24-III-2007 (EAN); Jacobina, LPFelix 10847, 21-I-2006;
Ramanso, BR 235, BPickersgill et al. 105, 11-II-1972 (IPA); Senhor do Bonfim,
BPickersgill et al. 79, 05-II-1972 (IPA); Curral da Pedra, GPinto s/n, 26-X-1970 (IPA);
Escola de Agronomia Cruz das Almas, RCarvalho s/n, 14-IV-1997 (UFP); Correntina,
AMMiranda et al. 3837, 22-I-2001 (HST); Juazeiro do Norte, SISilva 76, 11-II-1993
(PEUFR); Brejo Santo, SISilva 75, 11-02-1993 (PEUFR); Sento Sê, Serra da Costela,
AMMiranda & FEsteves 46, 04-I-1990 (PEUFR). PERNAMBUCO: Estrada para Exu,
LPFelix 11755, 01-IV-2007 (EAN); Serra Talhada, LPFelix 11537, 22-III-2007 (EAN);
Vertentes, LPFelix 11528, 11-II-2007 (EAN); Lagoa do Carro, LPFelix 11479, 11-I-
2007 (EAN); Brejo do Madre de Deus, LPFelix 10945, 26-II-2006 (EAN); Nazaré da
Mata, JCMoraes s/n, 04-II-1955 (EAN); Nazaré da Mata, MBCSilva & JValdivino
2837, 15-III-2002 (IPA); Serra Talhada, MLGomes 115, 09-I-1996 (IPA); Ouricuri,
GCLima 50, 5-VI-1984 (IPA); Sertania, na BR110 BPickersgill et al. 47, 29-I-1972
(IPA); Tapera, DBPickel s/n, ?-X-1927 (IPA); Alagoinha, FPMelo et al. 139, 15-XII-
2008 (UFP); Altinho, Comunidade Carão, LGSousa 107, 16-VI-2007 (UFP);
Mirandiba, LGRSouza 51, 19-IV-2007(UFP); Gravatá, Fazenda São José, MOliveira
2681, 24-III-2007 (UFP); Pesqueira, Serra do Gavião, MOliveira 1814, 19-VI-2005
(UFP); Ouricuri, SKRocha 70, 14-VII-2003 (UFP); Floresta, Fazenda Itapemirim,
JFerraz et al. s/n, 14-V-2008 (HST); Parnamirim, AMMiranda et al. 2902, 12-XII-1997
(HST); Chã Grande, LCSantana et al. 01, 18-II-1997 (HST); Caruaru, ATFNunes 80,
18-I-2005 (PEUFR); Serra Talhada, ALaurêncio et al. 729, 05-II-1998 (PEUFR);
Aldeia, MVVOliveira et al. 11, 01-VII-1996 (PEUFR); São Caetano, SISilva &
JCMVeloso 622, 22-V-1994 (PEUFR); Betânea, Serra dos Arrombados, SISilva 516,
05-V-1994 (PEUFR); Ibimirim, SISilva 336, 22-III-1994 (PEUFR); Serra Talhada,
EFerraz 229, 25-III-1993 (PEUFR); Petrolina (CPATSA), SISilva 133, 04-III-1993
(PEUFR); Petrolina, CPATSA, SISilva 115, 03-III-1993 (PEUFR). Taquaritinga do
Norte, SISilva 41, 08-II-1993 (PEUFR); PIAUÍ: Teresina, SJunior et al 43, 24-VI-1999
(PEUFR).
49
0
2. Manihot glaziovii subsp. norohense. M.T.C.S.Martins, L.P.Felix & R. L.A.Bruno
subsp. nov. (Secção Glaziovianae). Tipo: Brasil, Paraíba: Areia, Centro de Ciências
Agrárias, Campus II (cultivada). L.P.Felix, 11520 (Holótipo: EAN; Isótipos: HST, IPA,
PEUFR, UFP, K, Y). Figura 2, Mapa 2.
Esta subespécie se distingue de M. glaziovii subsp. glaziovii por apresentar margem dos lobos foliares
repandas e estípulas com ápice ciliado.
Arbusto ou arvoreta, com 2-10m de altura, ramos glabros, verdes quando jovens,
depois branco-acinzentados. Folhas simples (Figura 5. a-f), alternas; estípulas caducas,
triangulares a estreito triangulares, margem laciniada na porção superior (Figura 5. g e
h), 1,5cm de comprimento, 0,7cm de largura; pecíolo cilíndrico, glabro, 8-10cm de
comprimento, inserido na face abaxial da lâmina, com 0-1,0cm até a margem; Lâmina
peltada, palmatipartida, palmatinérvea, membranácea, adaxialmente recoberta com
cerosidade cinza-esbranquiçada, margem inteira, frequentemente três, até cinco lobada
pecioladas, (7)9-15cm de comprimento, (8)10-13cm de largura, palmatipartidas,
membranácea a coriácea; lobos elípticos a obovados, ápice arredondado a de
mucronado-apiculado, margem ondulada, ligeiramente repanda. Inflorescência em
panícula terminal ramificada, monóica, 4-10cm de comprimento, recoberta ou não com
cerosidade cinza-esbranquiçada; brácteas (Figura 5. f) e bractéolas geralmente caducas
na antese, estreito triangulares, aproximadamente 0,2cm de comprimento; flores
pistiladas hipogínicas (Figura 6. f), no terço inferior da inflorescência, de antese
geralmente tardia em relação às estaminadas; sépalas livres, crassas, costadas,
marginadas, aproximadamente 1,3cm de comprimento e 0,5cm de largura; ovário
subgloboso, estilete trífido, ramificado, disco estigmal ligeiramente lobado; flores
estaminadas (Figura 6. e) nos 2/3 superiores da inflorescência, de antese precoce,
gramossepalas, sépalas crassas, costadas, marginadas, glabras, imbricadas, com
aproximadamente 2,0cm de comprimento e 0,8cm de largura; estames, 10, livres, cinco
externos maiores, cinco internos menores; anteras birrimosas, intorsas, disco estaminal
invaginado na inserção dos filetes. Frutos globosos, tricoca, de deiscência longitudinal,
glabros, com aproximadamente 2,3cm de comprimento e 2,5 de largura.
50
Este táxon é endêmico do arquipélago de Fernando de Noronha, onde ocorre
apenas na ilha principal. Atualmente alguns exemplares são mantidos em cultivo no
jardim experimental do laboratório de botânica do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal da Paraíba.
O nome deste novo táxon é dedicado a Ilha de Fernando de Noronha, no estado
de Pernambuco, onde o táxon é endêmico. A subespécie se distingue do autônimo, pela
sua notável uniformidade morfológica que contrasta e com a ampla variação observada
nas plantas do continente. As populações insulares caracterizam-se por apresentar lobos
das folhas onduladas, repandos e pelas estípulas ciliadas com ápice ciliado. Além disso,
o material foi estudado citologicamente e apresentou quatro satélites nos braços curtos
de dois pares cromossômicos, diferindo das plantas do continente que apresentaram no
máximo dois satélites (Martins, em preparação).
Parátipos: BRASIL, PERNAMBUCO: Fernando de Noronha, Vila do Trinta na
área urbana, AMMiranda 4449, 19-VIII-2004 (HST); Fernando de Noronha, Forte São
Pedro do Boldró, AMMiranda 4416, 17-VII-2004 (HST); Fernando de Noronha, Forte
São Pedro do Boldró, AMMiranda 4415, 17-VII-2004 (HST); Fernando de Noronha,
entre o Hotel de Transito do Governo e o Forte São Pedro do Boldró, AMMiranda 4414,
17-VII-2004 (HST); Fernando de Noronha, Morro do Quixaba, AMMiranda 3199, 8-
IV-1999 (HST); Fernando de Noronha, no Morro do Pico AMMiranda et al. 949, 03-
VI-1993 (HST); Arquipélago de Fernando de Noronha, Costões da Praia do Bode,
AMMiranda et al. 948, 03-VI-93 (PEUFR); Ilha de Fernando de Noronha, LPFelix
5680, 08-III-1993 (PEUFR); Fernando de Noronha, na margem da estrada, AMMiranda
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54
Figura 1. A-G. Manihot glaziovii Müll. Arg. A. ramo com a inflorescência; B. detalhes da
inflorescência; C e D. detalhes da folha; E. flor feminina; F. flor masculina; G. fruto. E, F
e G = Tamanho natural. Barra equivale à 2cm.
B
C D
E G H E F
A
G
A
5,8
cm
3,3
cm
6,5
cm
6,0
cm
55
A
B
C
E F
5,9
cm
A
B
C
E F
5,9
cm
Figura 2. A-F. Manihot glaziovii subsp. norohense. A. ramo com a inflorescência; B.
detalhes da inflorescência; C. flor feminina; D. detalhes da flor feminina; E. detalhe da flor
masculina; F. fruto. B, C, D, E e F = Tamanho natural. Barra equivale à 2cm.
56
Fernando de Noronha
Mapa 2. Manihot glaziovii subsp. norohense
Mapa 1. Manihot glaziovii
57
Figura 3. Morfologia vegetativa de Manihot glaziovii Müll. Arg. a – f. variação
morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h. variação morfológica da estípula; i.
botões florais e brácteas.
58
Figura 4. Morfologia vegetativa de Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffman. a – f.
variação morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h. variação morfológica da
estípula; i. botões florais e brácteas.
59
Figura 5. Morfologia vegetativa de Manihot glaziovii subsp. norohense.. a – f. variação
morfológica na folha; g. detalhe da estípula; h. variação morfológica da estípula; i.
botões florais e brácteas.
60 60
Figura 6. Flores masculinas e femininas do gênero Manihot. Manihot glaziovii (a e b);
M. pseudoglaziovii (c e d) e M. glaziovii sups. norohense (e e f).
61
MANUSCRITO 3
Atividade antifúngica de extrato de melão-de-são-caetano (Momordica charantia
L.) em sementes de Manihot glaziovii
Antifungal activity of melão-de-são-caetano extracts (Momordica charantia L.) in
Manihot glaziovii seeds
RESUMO
A utilização de extratos vegetais com propriedades antifúngicas constitui uma
alternativa viável, de custo reduzido e não ocasiona impacto ambiental como os causado
pelos agroquímicos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes concentrações
do extrato de melão-de-são-caetano em sementes armazenadas de Manihot glaziovii. O
trabalho foi realizado no laboratório de Fitopatologia no Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal da Paraíba, Campus II – Areia-PB, onde as sementes foram
inicialmente imersas no extrato aquoso de melão-de-são-caetano nas concentrações de 0
(testemunha), 10, 20, 30 e 40% sendo posteriormente distribuídas em placas de Petri
contendo os substratos papel e BDA. Foram encontrados os seguintes fungos: Rhizopus
sp., Sphaerotheca sp., Aspergillus flavus, Chaetomiun globosum, Penicillium sp. e
Aspergillus sp. As concentrações dos extratos não foram suficientes na inibição do
desenvolvimento de Sphaerotheca sp. Por outro lado em Rhizopus sp., o extrato
apresentou discreta atividade antifúngica, apresentando uma tendência na diminuição do
crescimento micelial, no substrato BDA. É necessário testar outras concentrações do
extrato de melão-de-são-caetano para melhores resultados como agente antifúngico.
Palavras-chave: Extratos Vegetais, Maniçoba, Micoflora e Qualidade Sanitária.
ABSTRACT
The plant extract use with antifungal properties constitutes a viable alternative, of low
cost and it does not cause environmental impact as the caused by Agrochemicals. The
present work aimed to evaluate different melão-de-são-caetano extract concentrations in
stored Manihot glaziovii seeds. This work was carried through in the laboratory of
62
Phytopathology, Agrarian Science Center, Universidade Federal da Paraíba, Campus II
- Areia, where the seeds had been initially immersed in melão-de-são-caetano watery
extract at levels of 0 (witness), 10, 20, 30 and 40% being later distributed in Petri dishes
contend paper and BDA substrates. The following fungus had been found: Rhizopus sp.,
Sphaerotheca sp., Aspergillus flavus, Chaetomiun globosum, Penicillium sp. and
Aspergillus sp. The extracts concentrations had not been enough in the inhibition of
Sphaerotheca sp development. On the other hand, in Rhizopus sp., the extract presented
discrete antifungal activity, exhibiting a trend in reduces the mycelial growth, on BDA
substrate. It is necessary to test other melão-de-são-caetano extract concentrations for
better results as antifungal agent.
Key words: Plant Extracts, Maniçoba, Mycoflora and Sanitary Quality.
INTRODUÇÃO
O gênero Manihot, pertencente à família Euphorbiaceae, é nativo das regiões
tropicais e subtropicais do novo mundo (ROGERS & APPAN, 1973; BAI et al., 1992).
É formado por árvores, arbustos, subarbustos semiherbáceos à decumbentes, plantas
geralmente monóicas, com inflorescências de flores pistiladas na base e estaminadas no
ápice. Desempenha importante função no semi-árido nordestino, por ser utilizada como
pastagem nativa para manutenção dos rebanhos em ocasião de secas prolongadas
(SILVA et al., 2007).
A propagação da maniçoba pode ser feita por sementes e estacas, porém as
sementes apresentam severa dormência e, de acordo com Canuto et al. (1989), para
superação da dormência, as mesmas precisam ser armazenadas por um período mínimo
de um ano. Apesar da eficiência do armazenamento em superar a dormência das
sementes desta espécie vegetal, alguns fatores podem comprometer a qualidade das
sementes armazenadas. Mentem (2006) afirma que o ataque fúngico durante o
armazenamento é uma das principais causas de perdas de quantidade e qualidade de
sementes e grãos. O desenvolvimento de fungos de armazenamento a exemplo dos
gêneros Aspergillus e Penicillium que podem causar rápida deterioração das sementes,
pois se localizam preferencialmente no embrião.
O tratamento com produtos químicos sintéticos constitui um método
comprovadamente eficiente para o controle de patógenos de sementes (USBERTI &
63
AMARAL, 1999; SIDDIQUI & ZAMAN, 2004; NASCIMENTO et al., 2006; MERTZ,
et al., 2009). No entanto, estes vêm sendo utilizados indiscriminadamente, estratégia
que está se mostrando ineficiente, uma vez que diversos organismos começaram a
adquirir resistência a vários destes produtos, demandando a utilização de quantidades
cada vez maiores (LEE et al., 2001; SANTOS et al., 2006). Assim o uso de extratos
vegetais pode se tornar promissor na medida em que compostos secundários presentes
na estrutura química dos mesmos podem ter efeito inibitório sobre a ação de diversos
fungos.
Extratos vegetais têm sido utilizados como métodos alternativos para inibir o
desenvolvimento de fungos, a exemplo de alho (Allium sativum L.) (BARROS et al.,
1995), hortelã (Mentha piperita L.) (WILSON et al., 1997), pimenta (Capsicum sp.)
(BASTOS, 1997), mamona (Ricinus communis L.) (BUENO et al.,1990). O melão-de-
são-caetano (Momordica charantia L.) foi utilizado em trabalhos realizados por Feitosa
et al. (2008) com controle de patógenos pós-colheita, apresentado resultados positivos
para Clostridium sp., embora necessitando testar outras concentrações.
Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar diferentes concentrações
de extrato vegetal aquoso de melão-de-são-caetano em sementes de Manihot glaziovii
Müll. Arg. pelos métodos PF E BDA.
MATERIAL E MÉTODOS
Localização do experimento e obtenção das sementes de Manihot glaziovii
O trabalho foi realizado nos Laboratórios de Fitopatologia e Sementes, no
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba (CCA-UFPB) em
Areia-PB, em setembro de 2008. As sementes de M. glaziovii foram provenientes de
Petrolina-PE, coletadasdas em 2008, e armazenadas por seis meses, em condições
naturais de laboratório com temperatura de 28+3ºC e fotoperíodo de 12 horas.
Obtenção do extrato de melão-de-são-caetano
As folhas de melão-de-são-caetano foram coletadas na Universidade Federal da
Paraíba, Areia-PB e conduzidas ao Laboratório de Fitopatologia para obtenção do
extrato aquoso através de maceração de 10g de massa fresca/50mL de água destilada
64
esterelizada (ADE). As concentrações utilizadas (10, 20, 30 e 40%) foram obtidas a
partir da diluição do extrato em ADE.
Teste de Sanidade: Método de Papel Filtro (Blotter Test) e BDA
Para a detecção de fungos nas sementes foram utilizados dois métodos: papel de
filtro (Blotter test) e incubação em meio batata-dextrose-ágar (BDA), utilizando-se dez
repetições de dez sementes por tratamento. As sementes foram imersas em Becker
contendo os extratos filtrados nas concentrações anteriormente citadas por 15 minutos,
sendo a testemunha embebida somente em ADE. As sementes tratadas foram
distribuídas em placas de Petri, previamente autoclavadas, contendo BDA e papel de
filtro esterelizados e umedecidos com ADE. Após oito dias em sala de incubação, com
temperatura de 28º + 2ºC e fotoperíodo de 12 horas, as sementes foram avaliadas quanto
à presença de fungos. A identificação dos fungos foi realizada sob microscópio óptico,
através das observações de estruturas morfológicas como micélio e conídios,
confrontando-as com as descrições da literatura micológica e fitopatológica
(SILVEIRA, 1981; SING et al., 1991; MENEZES & OLIVEIRA, 1993).
Delineamento Experimental
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, empregando-se
arranjo fatorial (2x5), sendo dois substratos para crescimento de fungos, papel e BDA, e
cinco concentrações de extrato vegetal (0, 10, 20, 30 e 40%) com dez repetições de dez
sementes por tratamento. As análises foram realizadas utilizando o programa Genes
(CRUZ, 2001). Os dados foram transformados em arc.sen e a comparação das
médias foi obtida por meio do teste de Tukey a 1% de significância e através de
regressão polinomial.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Conforme apresentado na Tabela1, são observadas diferenças significativas para
incidência de fungos em sementes de M. glaziovii, nas diferentes concentrações do
extrato testado, incubados em BDA e Papel de Filtro. Foi constatada uma micoflora
constituída pelos seguintes fungos: Rhizopus sp., Sphaerotheca sp., Aspergillus flavus,
65
Chaetomiun globosum, Penicillium sp. e Aspergillus sp., todos estes detectados nos
substratos/concentrações. Houve diferenças significativas de incidência, entre os
substratos, para Rhizopus sp., C. globosum e Aspergillus sp. Já nas concentrações dos
extratos, foram estatisticamente diferentes para A. flavus, C. globosum e Aspergillus sp.
(Anexo1). Esses fungos estão associados com a deterioração de sementes, no período de
armazenamento, reduzindo o poder germinativo das mesmas ou ocasionando a sua
morte (WETZEL, 1987; MACHADO, 1988). De acordo com Casaroli et al. (2006)
Rhizopus são considerados contaminantes e sua presença está relacionada à má
qualidade na semente. A ocorrência de Sphaeratheca sp. e C. globosum é inédita, em
sementes de maniçoba, bem como a utilização do extrato como agente inibidor no
crescimento de fungos. Em sementes de pau-alho (Microlobius foetidus subsp.
paraguensis) foi constatado a presença de fungo do gênero Chaetomiun (SANTOS &
FILHO, 2001) representante da Classe Pyrenomycetes (Ascomycotina), ordem
Sordariales e família Chaetomiaceae (AGGARWAL et al., 2008). Segundo os autores
esses fungos estão associados com a deterioração de sementes, em condições de
armazenamento inadequado. De acordo com Machado (1988) este gênero é considerado
comum em sementes, como saprófitas externos e a contaminação ocorre após a colheita
da semente.
As condições de armazenamento, umidade, temperatura e local, como também
as condições de temperatura e umidade durante o processo de formação e
desenvolvimento das sementes são fatores determinantes na intensidade de infestação
e/ou contaminação por microrganismos (NÓBREGA, 2004). Os fungos de
armazenamento invadem e causam danos as sementes, em geral, após serem colhidas e
armazenadas. Conforme Justice & Bass (1979), a temperatura ótima para o crescimento
da maioria dos fungos de armazenamento está entre 30 e 33ºC, a temperatura máxima
entre 50 e 55ºC e a mínima de 0 a 5ºC. No presente trabalho, as sementes de M.
glaziovii estavam armazenadas a uma temperatura de 28+2ºC, o que pode ter
contribuído para o desenvolvimento desses fungos de armazenamento.
A maior incidência de Rhizopus sp. foi nas concentrações 10, 20% do extrato e
da testemunha para as sementes cultivadas em BDA, em Aspergillus flavus à 20 e 40%
em papel e 30% em BDA. Para Aspergillus sp. nas concentrações 10 e 20% em BDA e
40% no substrato papel favoreceu o seu desenvolvimento. O crescimento de C.
globosum foi superior nas concentrações testadas, no substrato BDA e em relação a
66
Penicillium sp. apenas para a concentração 20% no substrato BDA. Por outro lado, para
Sphaerotheca sp. não houve diferença estatística entre os substratos nas concentrações
do extrato (Tabela 1). Nas concentrações testadas do extrato de melão-de-são-caetano,
para inibição do desenvolvimento de fungos nas sementes de M. glaziovii, verificou que
com C. globosum o extrato surtiu efeito, quando utilizado o substrato papel,
ocasionando uma redução significativa no desenvolvimento desse fungo (Tabela 1).
Possivelmente esse resultado associa-se ao fato que o substrato BDA, pela sua
composição, é fonte de alimentação para fungos e que é preciso testar concentrações
maiores dos extratos para verificar a eficiência na redução dos esporos. A incidência
desses fungos de armazenamento pode causar a deterioração da semente, resultando na
redução na germinação, modificação na cor e enrugamento nas sementes e produção de
toxinas (TANAKA & CORREIA, 1982; AGARWAL & SINCLAIR, 1987; MENTEN,
1995).
Os fatores mais importantes na determinação de uma infecção por fungos de
armazenamento nas sementes são: teor de umidade das sementes, umidade relativa do
ambiente, temperatura e tempo (MACHADO, 2000; BARRETO et al., 2004; REGO,
2008). Estes fatores estão inter-relacionados e devem ser considerados como de ação
complexa, no qual para que haja êxito no armazenamento é preciso conhecer cada fator
em si e em conjunto. Segundo Machado (2000) uma vez que os fungos de
armazenamento já se encontram estabelecidos num lote de sementes, seu crescimento
continuará mesmo para temperaturas e umidade inferiores às necessárias para que haja
invasão destes nas sementes sadias.
De acordo com Dhingra (1985) impurezas como resíduos de caule e folhas,
poeira, pequenos torrões de terra, presentes no lote de sementes são mais absorventes e
retentoras de umidade, fazendo com que o lote fique mais susceptível ao crescimento
fúngico. O crescimento de fungos, nessas impurezas, produz água metabólica que,
absorvida pelas sementes ao redor, faz com que seu teor de umidade aumente.
De acordo com a Figura 1, no substrato BDA, Rhizopus sp. apresentou tendência
na redução dos seus esporos com as concentrações do extrato testados. Por outro lado,
C. globosum demonstrou crescimento contínuo, e os fungos Sphaeroteca sp.,
Penicillium sp. e A. flavus revelaram elevado crescimento com as concentrações de 10 e
30%, respectivamente. Resultados semelhantes com A. flavus ocorreu em Aspergillus
sp. utilizando substrato papel. O Penicillium sp. e C. globosum apresentaram
67
desenvolvimento similares mantendo-se praticamente constate nas concentrações
utilizadas (Figura 2). O maior crescimento de Rhizopus sp., Sphaeroteca sp., A. flavus e
Aspergillus sp. foi com a concentração de 40% do extrato de melão-de-são-caetano
(Tabela 2).
Scussel (1998) relata que espécies micotoxigênicas podem ser encontradas em
todos os principais grupos de fungos, sendo que os gêneros Aspergillus, Penicillium e
Fusarium são os maiores produtores destes metabólitos. A qualidade fisiológica da
semente armazenada é muito influenciada pelo tipo de embalagem utilizada durante o
período de armazenamento, favorecendo também o desenvolvimento de
microorganismos.
A avaliação da qualidade sanitária das sementes com o emprego de extratos
vegetais têm sido analisada por diversos autores como Khan (1993), Von Pinho et al.
(1995), Carvalho et al. (1999), Souza et al. (2002), Pereira et al. (2006), onde
demonstraram que os extratos além de proporcionar redução na micoflora, promoveram
aumento do poder germinativo de sementes. No presente trabalho o extrato de melão-
de-são-caetano surtiu efeito para C. globosum, conforme mencionado, porém apresentou
variações para os demais fungos encontrados nas sementes de M. glaziovii. Com esses
resultados, sugerimos utilizações de concentrações elevadas para avaliar a utilização do
extrato de melão-de-são-caetano na redução da micoflora em M. glaziovii, visto que a
utilização de extratos proporciona equilíbrio ecológico, contrapondo aos produtos
químicos, além dos custos reduzidos aos produtores agrícolas.
CONCLUSÕES
O controle de fitopatógenos utilizando produtos naturais é possível dependendo do tipo
de produto e concentrações utilizados;
O extrato aquoso de melão-de-são-caetano apresentou efeito inibitório no
desenvolvimento de C. globosum em sementes de M. glaziovii, porém havendo
necessidade de testar outras concentrações, para melhores resultados como agente
antifúngico.
68
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72
Figura 1. Crescimento micelial em sementes de Manihot glaziovii, no substrato BDA,
tratadas com diferentes concentrações do extrato de melão-de-são-caetano.
Tabela 1. Incidência de Fungos em Sementes de Manihot glaziovii, Tratadas com
Extratos de Melão-de-São-Caetano, em Diferentes Concentrações e nos substratos BDA
e Papel de Filtro.
Concentrações Extrato de Melão de São Caetano (%)
Substrato 0 10 20 30 40
Rhizopus sp.
BDA 2,89a 2,99a 2,84a 2,64a 2,05a
PAPEL 1,45b 2,35b 2,02b 2,21a 2,52a
Sphaerotheca sp.
BDA 2,07a 2,13a 1,73a 1,99a 2,04a
PAPEL 2,02a 1,89a 2,16a 1,70a 2,35a
Aspergillus flavus
BDA 1,16a 1,01a 0,93b 1,45a 1,13b
PAPEL 0,81a 0,86a 1,20a 0,86b 1,87a
Chaetomiun globosum
BDA 1,01a 1,56a 1,57a 1,80a 2,23a
PAPEL 0,84a 0,70b 0,70b 0,70b 0,70b
Penicillium sp.
BDA 0,79a 0,86a 1,18a 0,91a 0,70a
PAPEL 0,98a 0,81a 0,81b 0,81a 0,81a
Aspergillus sp.
BDA 0,91a 1,24a 1,65a 1,75a 0,98b
PAPEL 0,86a 0,70b 0,70b 1,25a 1,65a
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem a 1% de probabilidade pelo Teste de
Tukey.
73
Figura 2. Crescimento micelial em sementes de Manihot glaziovii, no substrato papel,
tratadas com diferentes concentrações do extrato de melão-de-são-caetano.
74
MANUSCRITO 4
Protocolo para realização do teste de tetrazólio em sementes de Manihot glaziovii
Müll. Arg.
Protocol for the tetrazolium test accomplishment in Manihot glaziovii Müll. Arg.
seeds
RESUMO
A utilização do teste de tetrazólio é importante para avaliação rápida da qualidade das
sementes, indicando a viabilidade e vigor, além de possibilitar as causas da deterioração
de sementes. O objetivo deste trabalho foi propor uma metodologia adequada para a
realização do teste de tetrazólio em sementes de Manihot glaziovii. Inicialmente foram
pesquisados os seguintes métodos de pré-condicionamento à 30ºC: água quente (90ºC)
por 10, 20 e 30 minutos; imersão direta em água por 18, 24 e 48 horas, seguido de
escarificação lateral (um e dois lados) e total; escarificação lateral (um e dois lados) e
total, imersão em água (18 e 24 horas); escarificação total, abertura da semente e
imersão em água (18 e 24 horas); fissura com prensa mecânica, imersão em água (18 e
24 horas); embebição em papel toalha umedecido, (água equivalente a 2,5 vezes o peso
do papel seco), por 18 e 24 h, e escarificação total, além da testemunha que foi
diretamente imersa na solução de tetrazólio. Em todos os métodos testados as sementes
foram colocadas em solução 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio por 18 e 24 horas, em
germinador à 30ºC, nas concentrações de 0,50, 0075 e 1%. É possível e viável a
utilização do teste de tetrazólio em sementes de M. glaziovii, sendo necessário para o
obtenção da coloração ideal realizar abertura nas sementes com prensa mecânica,
embebição em água por 18 horas e imersão em solução de tetrazólio a 0,075% por 24
horas.
Palavras-chave: Análise de Sementes, Maniçoba, Pré-Condicionamento e Viabilidade
de Sementes.
75
ABSTRACT
The tetrazolium test use is important for fast seed quality evaluation, indicating the
viability and vigor, beyond making possible the seed deterioration causes. The objective
of this work was to propose an adjusted methodology for the tetrazolium test
accomplishment in Manihot glaziovii seeds. Initially the following pre-conditioning
methods at 30ºC had been searched: hot water for 10, 20 and 30 minutes; direct
immersion in water for 18, 24 and 48 hours, followed by lateral scarification (one and
two sides) and total; lateral scarification (one and two sides) and total, immersion in
water (18 and 24 hours); total scarification, seed opening and immersion in water (18
and 24 hours); fiction with mechanic press, immersion in water (18 and 24 hours);
imbibition in humidified paper towel, (water equivalent to 2,5 times the dry paper
weight), for 18 and 24 h, and total scarification, beyond the witness who was directly
immersed in tetrazolium solution. In all tested methods the seeds had been placed in
2,3,5 trifenil tetrazolium chloride solution for 18 and 24 hours, in BOD at (30ºC). It is
possible and viable the tetrazolium test use in M. glaziovii seeds, being necessary for
attainment of the ideal coloration to carry through fiction in seeds with mechanic press,
imbibition in water for 18 hours and immersion in 0.075% tetrazolium solution for 24
hours.
Key word: seed analysis, maniçoba, pre-conditioning and seed viability.
INTRODUÇÃO
As plantas da caatinga têm despertado interesse dos pesquisadores,
principalmente aquelas com potencial forrageiro, a exemplo de Manihot glaziovii
conhecida popularmente como maniçoba (SILVA et al., 2007). Esta espécie é
pertencente à família Euphorbiaceae e encontra-se bastante difundida no Nordeste
Brasileiro. Em condições naturais suas sementes apresentam porcentagem de
germinação devida impermeabilidade do tegumento, sendo fundamental a quebra da
dormência das sementes para obtenção de sucesso na propagação desta espécie
(MARTINS et al., 2007).
76
As pesquisas em tecnologia e análise de sementes possibilitam desenvolver e
aprimorar testes que avaliem a qualidade da semente, principalmente em espécies, que
requerem longo período de germinação (OLIVEIRA et al., 2005 a). Uma alternativa
promissora que vem sendo utilizada é o teste de tetrazólio, pela rapidez na determinação
da viabilidade e do vigor da semente (VIEIRA & CARVALHO, 1994). O teste se
baseia na atividade das enzimas desidrogenases, especificamente a desidrogenase do
ácido málico, responsável por reduzir o sal de tetrazólio nos tecidos vivos das sementes,
no qual íons de H+ são transferidos para o referido sal. Pela hidrogenação do 2, 3, 5
trifenil cloreto de tetrazólio é produzida nas células vivas uma substância vermelha,
estável e não difusível, o trifenil formazan, indicando atividade respiratória nas
mitocôndrias e, portanto, o tecido viável (SAWMA & MOHLER, 2002; BORZA et al.,
2007). Tecidos mortos (não viáveis) não reagem com a solução conservando a sua
coloração natural ou amarelada e textura flácida (DELOUCHE et al., 1976). Trata-se de
um teste que através da coloração obtida nas diferentes partes da semente permite
identificar, muitas vezes, as causas da perda da viabilidade e do vigor (BHERING et
al., 2005).
Para realização do teste de tetrazólio são necessários procedimentos, relativos ao
pré-condicionamento, que visam a penetração da solução nos tecidos a serem avaliados.
Para facilitar a penetração da solução de tetrazólio, em algumas espécies, são
necessários cortes, punções ou abertura da semente (BRASIL, 1992). Em sementes de
espécies florestais diversos tratamentos de pré-condicionamento vêm sendo utilizados
como corte, escarificação e embebição em água (DAVIDE et al., 1995; MALAVASI et
al., 1996; FERREIRA et al., 2001; MENDONÇA et al., 2001; OLIVEIRA, 2004).
Considerando que a maioria das espécies florestais exige longo período para germinar,
até um ano com sementes de Bertholletia excelsa (castanha-do-pará) ou seis meses com
sementes de Joahnesia princeps (boleira), o desenvolvimento de testes rápidos e
eficientes para a avaliação da viabilidade de sementes é necessário (PIÑA-
RODRIGUES & SANTOS, 1988).
Assim, a metodologia para o teste de tetrazólio vem sendo estudada para
diversas espécies florestais como jenipapo (NASCIMENTO & CARVALHO, 1998);
farinha seca (ZUCARELI et al., 2001); araucária (SOROL & PÉREZ, 2001); canafístula
(OLIVEIRA et al., 2001a); copaíba (FOGAÇA et al., 2001); guapuruvu (PAULA et al.,
2001); ipê-amarelo (OLIVEIRA et al., 2001b); louro pardo (MENDONÇA et al., 2001)
77
e pata-de-vaca (KROHN et al., 2001). Cabe ressaltar a importância desse teste para a
maniçoba, pelo fato da espécie também apresentar uma germinação lenta e desuniforme,
devido a barreira existente do tegumento, sendo, portanto, de suma importância para
identificar a viabilidade das sementes. No entanto, metodologias consolidadas e, por
conseguinte, mais eficiente para o teste de tetrazólio estão restritas a poucas espécies
como soja (Glycine max) (FRANÇA NETO et al., 1998), algodão (Gossypium
hirsutum) (VIEIRA & PINHO, 1999), amendoim (Arachis hipogeae) (BITTENCOURT
& VIEIRA et al., 1999), maracujá-doce (Passiflora alate) (MALAVASI et al., 2001;
BHERING, 2005), abóbora (Cucurbita pepo) (BARROS, 2002).
Pelo exposto este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para o
uso de tetrazólio envolvendo concentração, tempo de exposição e preparo das sementes
para aplicação do teste, contribuindo assim para avaliação correta da qualidade das
sementes de Manihot glaziovii.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Análise de sementes, da
Universidade Federal da Paraíba em Areia-PB, entre os meses de junho e outubro de
2008, utilizando-se sementes de M. glaziovii, provenientes da EMBRAPA Semi-Árido,
Petrolina-PE, safra jan/2008. As sementes adquiridas foram acondicionadas em
embalagens impermeáveis (sacos de polietileno) e armazenadas durante cinco meses
sob temperatura ambiente (28+2ºC).
Para a avaliação da viabilidade das sementes, pelo teste de tetrazólio, estudaram-
se inicialmente os seguintes métodos de pré-condicionamento à temperatura de 30ºC: T0
= semente imersa diretamente na solução de tetrazólio nas concentrações de 0,075; 0,5 e
0,1% (testemunhas); T1, T2 e T3 = água quente (95 ºC) por 10, 20 e 30 minutos,
respectivamente; T4, T5 e T6 = imersão direta em água por 18h, seguida de escarificação
lateral (um dos lados-T4); seguida de escarificação lateral (nos dois lados -T5); e seguida
de escarificação total (T6); T7,T8 e T9= imersão direta em água por 24h, seguida de
escarificação lateral (um dos lados-T7); seguida de escarificação lateral (nos dois lados -
T8) e seguida de escarificação total - T9; T10, T11 e T12 = imersão direta em água por 48h,
seguida de escarificação lateral (um dos lados-T10); seguida de escarificação lateral (nos
dois lados-T11) e seguida de escarificação total (T12); T13 e T14 = escarificação total,
78
seguida de abertura da semente e imersão em água por 18 e 24h, respectivamente; T15 e
T16= escarificação lateral seguida de imersão em água por 18 e 24h, respectivamente;
T17 e T18= escarificação total seguida de imersão em água por 18 e 24h,
respectivamente; T19 e T20= abertura total na semente, com o auxílio de uma prensa
mecânico (Anexo 1), seguida de imersão em água por 18 e 24h, respectivamente; T21 e
T22= embebição em papel toalha umedecido, (água equivalente a 2,5 vezes o peso do
papel seco), por 18 e 24 h, seguida de escarificação total, respectivamente.
Em todos os pré-condicionamentos testados as sementes foram colocadas em
solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio, para coloração, nas concentrações de
0,075; 0,5 e 0,1% durante 18 e 24h, no escuro e em BOD à 30 ºC. Após cada período, as
sementes foram lavadas em água corrente e mantidos submersos em água até o
momento da avaliação. Os embriões foram analisados individualmente, observando-se a
ocorrência de danos nas faces dos cotilédones (interna e externa) e do eixo embrionário,
verificando-se ainda a profundidade de cada dano e a sua distância em relação as áreas
vitais. A metodologia para o teste de tetrazólio nas sementes de M. glaziovii foi baseada
em Ricinus, conforme Manual de Ensayos Al Tetrazólio (MOORE, 1985), no qual é
proposto o pré-condicionamento de 18 h os seguintes tratamentos para o preparo
posterior a umidificação: cortar as sementes longitudinalmente através da cobertura
seminal (e do tecido nutritivo, caso exista) ou eliminar o extremo distal da semente
(incluindo o fragmento do tecido nutritivo). O referido autor indica de 6-24 horas para o
período de coloração, na solução de tetrazólio. Foram consideradas áreas vitais o eixo-
hipocótilo-radícula e a região de inserção entre os cotilédones e o eixo embriônico.
A diferenciação de cores dos tecidos foi observada de acordo com os critérios
estabelecidos por Moore (1985), ou seja, vermelho brilhante ou rosa brilhante (tecido
vivo e vigoroso), vermelho carmim forte (tecido em deterioração) e branco ou
amarelado (tecido morto). A interpretação foi realizada com auxílio de lupa de seis
aumentos (6x), com iluminação fluorescente. Definida a metodologia mais adequada
para o pré-condicionamento, concentração da solução e coloração das sementes, esta foi
aplicada por diversas vezes para obtenção correta das principais alterações. As classes
de viabilidade foram estabelecidas, sendo assim cada semente classificada em viável e
inviável conforme coloração dos tecidos do embrião, presença e localização dos danos.
A fim de facilitar a interpretação do teste de tetrazólio foi realizado o estudo
morfológico das sementes de M. glaziovii. A caracterização morfológica das sementes
79
maduras foi realizada conforme Damião-Filho & Môro (2001), examinando
características externas das sementes secas e as características internas que foram feitas
mediante corte longitudinal e transversal na semente, verificando-se a presença do
tecido de reserva, posição e forma do embrião, bem como a forma dos cotilédones e do
eixo hipocótilo-radícula. A documentação das estruturas foi feita mediante o auxílio de
lupa de seis aumentos (6x).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sementes de M. glaziovii (Figura 1) apresentam formato ovóide, tamanhos
variados, manchas irregulares, com coloração escura brilhante e fundo acinzentado ou
ainda marron nas faces dorsal e ventral. Na face ventral encontra-se a carúncula e a rafe
e na parte dorsal a anti-rafe, o endosperma apresenta consistência firme e coloração
esbranquiçada. O embrião é axial, reto, espatulado, esbranquiçado, localizado na porção
inferior da semente e com aproximadamente 2mm de comprimento. Os cotilédones,
também esbranquiçados, são do tipo foliáceos.
Na tabela 1 está apresentado um resumo geral das várias condições de preparo e
de coloração a que foram submetidas às sementes de Manihot glaziovii durante o
desenvolvimento do teste de tetrazólio. Os períodos (18 e 24 horas) e temperatura
11mm
ct
em
tg ar
cr
e
m
m 5,4mm
8,6mm
r
Figura 1. Morfologia da semente de Manihot glaziovii: a – Face dorsal e ventral, ar
(anti-rafe na face dorsal da semente), cr (carúncula), r (rafe na face ventral); b – corte
longitudinal, ct (cotilédone), em (eixo embrionário), tg (tegumento); c – corte
transversal, e (endosperma).
80
(30ºC) de pré-condicionamento foram constantes. Dentre os métodos de pré-
condicionamento testados, verificou-se que as sementes imersas diretamente na solução
de tetrazólio (testemunha) e as imersas em água quente por 18 e 24 horas não coloriram.
Esta ausência de coloração pode ser decorrente da presença do tegumento impermeável,
característico desta espécie, dificultando assim penetração da solução de tetrazólio.
Sementes com tegumento espesso e duro, o mesmo deve ser removido antes da
coloração, como é o caso de algumas espécies florestais (GERA et al., 1998; FOGAÇA,
2000; OLIVEIRA et al., 2005a; OLIVEIRA et al., 2005b).
Tabela1. Preparo e coloração de sementes de Manihot glaziovii submetidas a diferentes
condições, tratamentos e pré-condicionamento, na temperatura de 30ºC.
Tempo de
embebição
das
sementes
(horas)
Forma de
embebição
Tratamento na
semente
Concentração da
solução (%)
Coloração
obtida
Sem - **Testemunha 0,075; 0,50 e 0,1 NC
Sem 1 Água quente por,
10, 20 e 30 minutos
0,075; 0,50 e 0,1 NC
18, 24 e 48 1 Escarificação lateral
(um dos lados)
0,075; 0,50 e 0,1 CLE
1 Escarificação (nos
dois lados)
0,075; 0,50 e 0,1 CLE
1 Escarificação total 0,075; 0,50 e 0,1 CLE
18 e 24 1 *Escarificação
lateral (um dos
lados)
0,075; 0,50 e 0,1 CLE
1 *Escarificação
lateral (nos dois
lados)
0,075; 0,50 e 0,1 CLE
1 *Escarificação total 0,075; 0,50 e 0,1 CI
1 *Escarificação total
seguida da abertura
da semente
0,075; 0,50 e 0,1 CI
1 *Fissura total
(prensa mecânica)
0,075; 0,50 CA
1 *Fissura total
(prensa mecânica)
0,1 CIN
2 Escarificação total 0,075; 0,50 e 0,1 CLE
*O tratamento na semente foi realizado antes do período de embebição e **testemunha imersa
diretamente na solução de tetrazólio. NC= não coloriu; CLE= coloração no local da
escarificação; CI= coloração intensa; CA= coloração adequada; CIN= coloração inadequada; 1=
em água e 2= rolo de papel.
81
As sementes de Manihot, imersas diretamente em água e em rolo de papel por
18, 24 e 48 horas, seguida de escarificação lateral e total, sem abertura da semente,
apresentaram coloração apenas no local do tratamento, mesmo quando utilizado a
concentração da solução de tetrazólio a 1% por 24 horas. Por outro lado, quando
escarificadas totalmente, procedendo-se em seguida a abertura da semente, a coloração
foi inadequada (vermelho intenso). Provavelmente o contato direto da solução com a
estrutura interna da semente em função do tempo de exposição possibilitou uma
coloração vermelha intensa nas sementes, o que torna insatisfatório para a avaliação da
qualidade da semente. Procedendo-se a abertura total com a prensa mecânica, seguido
de embebição por 18 e 24 horas, nas concentrações de 0,075 e 0,50%, nos três tempos
testados, a coloração foi satisfatória em toda semente e com intensidade adequada,
permitindo análise e interpretação dos resultados.
O pré-condicionamento visa principalmente a facilitar a penetração da solução
de tetrazólio através dos tegumentos e os tratamentos realizados nas sementes para
otimizar o contato com a solução, bem como o tempo de exposição, são considerados
fatores essenciais para o sucesso do teste de tetrazólio. Zucareli et al. (2001) e Oliveira
et al. (2005 b) verificaram em sementes de Tabebuia sp. que apenas cortes ou punções
não são suficientes para a penetração da solução, necessitando de uma abertura total dos
tegumentos. Tal fato também foi observado nas sementes de maniçoba, em que a
presença dos tegumentos contribuiu para uma desuniformidade ou ausência de
coloração nas partes vitais do embrião (Figura 2. 1-3).
Zucareli et al. (2001) ainda ressaltam que danos causados no momento da
realização do pré-condicionamento devem ser atentamente observados, pois, a
dificuldade na diferenciação dos danos originais da semente e os causados pela
realização de cortes podem resultar em erros de interpretação pelo analista. O mesmo
foi constatado por Wetzel et al. (1992) em sementes de Hevea brasiliensis (seringueira),
por Oliveira et al. (2003) em Peltophorum dubium (canafístula) e ainda por Zucareli et
al. (2001) em sementes de Albizia hasslerii (farinha-seca).
O teste de tetrazólio foi padronizado para outras espécies da família
Euphorbiaceae, a exemplo de Hevea brasilienses, onde a concentração adequada foi
0,1% de solução de tetrazólio e período de coloração de 3 horas, à 40ºC (MARCOS
FILHO et al. 1987). As Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) indicam para
sementes de Euphorbia sp. a concentração de 0,5% a 0,1% de solução de tetrazólio e
82
para Ricinus sp, 1,0%; nas duas espécies o período para o desenvolvimento da coloração
é de 6 a 24 horas, em temperatura de 30ºC. Na avaliação da viabilidade das sementes de
Jatropha elliptica (jalapa), de acordo com Ãnez et al. (2007), a concentração ideal da
solução de tetrazólio é 0,5%, também à 30ºC, com tempo de coloração de 1 hora e 30
minutos. De acordo com Oliveira et al. (2006) em Ricinus communis a embebição das
sementes em água a 30 ºC por 3 horas, seguida da retirada dos tegumentos e cortes nas
laterais do embrião; e a imersão dos embriões em 0,5% da solução de tetrazólio, a 30ºC
por 6 horas são metodologias eficientes na avaliação da qualidade de sementes de
mamona.
As concentrações da solução de tetrazólio usadas neste ensaio proporcionaram
variações na coloração nos embriões de Manihot (Figura 2). As de 0,5 e 0,075%
desenvolveram coloração semelhante, onde os tecidos viáveis coloriram-se
uniformemente, estando de acordo com as observações feitas por Moore (1985).
Todavia é indicado o uso da solução a 0,075%, considerando que o sal de tetrazólio é de
alto custo e que a concentração de 0,5% requer maior quantidade deste sal.
Considerando-se a concentração de 0,075%, o tempo de pré-condicionamento de 18
horas se destacou dos demais, seguido de coloração à 24 horas. Conforme os dados
apresentados, as condições empregadas para a avaliação da eficiência do teste de
tetrazólio foram definidas levando-se em consideração, a facilidade de exposição dos
tecidos, a economicidade e a rapidez para a obtenção dos resultados.
Definida a metodologia de pré-condicionamento, concentração da solução e
coloração, foi estabelecida as classes, onde cada semente de Manihot avaliada foi
qualificada em uma das classes (Figura 3), com base nas observações de intensidade de
coloração, profundidade e localização dos danos. Cada foto representa uma semente que
foi seccionada longitudinalmente. As duas faces da semente são ilustradas, sendo que
não foi possível mostrar a superfície externa devido a mesma encontrar-se
profundamente aderida ao tegumento.
Classe 1 – Sementes viáveis: embrião com coloração rósea uniforme
apresentando tecidos com aspecto normal e firme (Figura 3. 1-3).
Classe 2 - Sementes viáveis: semelhante a anterior, só que com pequenas
manchas superficiais avermelhadas ou descoloridas nos cotilédones (Figura 3. 4-6);
Classe 3 – Sementes viáveis: com coloração branco leitoso em menos de 50%
83
dos cotilédones, identificando tecido em deterioração. Extremidade da radícula com
pequenas áreas descoloridas ou de coloração vermelho intenso (Figura 3. 7 e 8);
Classe 4 – Sementes inviáveis: ambos os cotilédones com aproximadamente 50%
branco leitoso ou com pequenas áreas vermelho intenso; extremidade da radícula
vermelho intenso ou ainda o eixo embrionário com regiões críticas descoloridas (Figura
3. 9-12).
Classe 5 – Sementes inviáveis: região vascular descolorida ou com coloração
vermelho intenso e cotilédones com mais de 50% descoloridos (Figura 3. 13-15).
Classe 6 – Sementes mortas: totalmente branca, em estágio total de deterioração
e embrião descolorido (Figura 3. 16-18).
CONCLUSÕES
O teste de tetrazólio pode ser utilizado para avaliar com rapidez a viabilidade das
sementes de Manihot glaziovii;
Considerando-se a praticidade operacional, economicidade do processo e
urgência nos resultados, recomenda-se que as sementes sejam submetidas à condição de
preparo com prensa mecânico (promovendo a abertura total), seguida de embebição em
água por 18 horas e coloridas à 30ºC, na concentração de 0,075% de solução de
tetrazólio durante 24 horas.
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89
ANEXOS
Figura 2. Testes preliminares de tetrazólio (TZ), em sementes de M. glaziovii. Escarificação total
seguido de embebição por 24h e imersão em TZ (0,075%) por 24h (1- 3); Escarificação total,
abertura da semente, seguido de embebição por 24h e imersão em TZ (0,075%) por 24h (4-9);
Escarificação total, abertura da semente, seguido de embebição por 18h e imersão em TZ (0,5%)
por 18h (10-13); Escarificação total, abertura da semente, seguido de embebição por 24h e imersão
em TZ (0,1%) por 24h (14); Escarificação total, embebição por 24h e imersão em TZ (0,5%) por
24h (15); Escarificação total, embebição por 18h e imersão em TZ (0,5%) por 24h (16); Fissura
com prensa mecânica, seguido de embebição por 18 h TZ (0,075%) por 24h (17 e 18).
90
Figura 3. Classe para a determinação da viabilidade das sementes de M. glaziovii.
91
ANEXOS
MANUSCRITO 3
Tabela 1. Resumo da análise de variância da incidência de fungos em sementes de
Manihot glaziovii.
QUADRADO MÉDIO
F.V
GL RHI.
SPHA.
FLA.
GLOB.
PEN.
ASP.
Substratos 1 8.184** 0.225ns
0.009ns
20.453** 0.057ns
1.871**
Extratos 4 0.705ns
0.333ns
1.017** 0.779** 0.154ns
1.268**
Subs x Ext. 4 2.379** 0.522ns
1.403** 1.221** 0.240** 1.888**
Resíduo 90 0.329 0.304 0,177 0.259 0.075 0.217
CV (%) 23.90 27.41 37.17 42.09 31.50 39.70
NS e ** = não significativo e significativo a 1% de probabilidade, respectivamente pelo Teste F.
RHI = Rhisopus sp; SPHA = Sphaeratheca sp.; FLA = Aspergillus flavus; GLOB = Chaetomiun
globosum; PEN = Penicillium sp.; ASP = Aspergillus sp.
Tabela 2. Quadrados médios para os dados para a regressão no substrato BDA.
FONTE DE
VARIAÇÃO
QUADRADOS MÉDIOS
¹RHI SPH FLA CHA PEN ASP
Regressão Linear 4,120** 0,04ns
0,144ns
7,182** 0,016ns
0,422**
Regressão
Quadrática
1,460** 0,292ns
0,048ns
0,000ns
0,944** 4,500**
Regressão Cúbica 0,019ns
0,062ns
0,828** 0,547** 0,036ns
0,92**
Desvio 0,041 0,565 0,554 0,086 0,317 0,041
¹RHI = Rhizopus sp.; SPH = Sphaeratheca sp.; FLA = Aspergillus flavus; CHA = Chaetomiun globosum;
PEN = Penicillium sp.; ASP = Aspergillus sp.
92
Tabela 3. Quadrados médios para os dados para a regressão no substrato Papel.
FONTE DE
VARIAÇÃO
QUADRADOS MÉDIOS
¹RHI SPH FLA CHA PEN ASP
Regressão Linear 3,920** 0,220ns
4,494** 0,078** 0,156** 4,536*
*
Regressão Quadrática 0,330ns
0,492ns
1,098ns
0,056** 0,082** 1,992*
*
Regressão Cúbica 1,795** 0,504ns
1,123ns
0,019** 0,028** 0,096ns
Desvio 0,666 1,260 1,285 0,028 0,041 0,169
¹RHI = Rhizopus sp.; SPH = Sphaeratheca sp.; FLA = Aspergillus flavus; CHA = Chaetomiun
globosum; PEN = Penicillium sp.; ASP = Aspergillus sp.
MANUSCRITO 4
Anexo1. Prensa mecânica utilizada para abertura das sementes de M.
glaziovii no teste de tetrazólio.
93
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