Taq DNA Polimerase

(recombinante)

Cat. No. 0300.0003.0100 100 unidades

Cat. No. 0300.0003.0500 500 unidades

Concentração: 5U/µL

Tampão de Reação com MgCL2

incluindo 5X GC-rich Solution (para amplificação

de regiões de DNA ricas em bases GC)

ARMAZENAR A - 20oC.

Produto estável por 10 dias a 37oC.

Transportar a temperatura ambiente.

Descrição

Taq DNA Polimerase é uma enzima termoestável isolada

da bactéria termofílica Thermus aquaticus e expressa em

bactérias Escherichia coli. Esta enzima recombinante é

constituída por uma cadeia polipeptídica com o peso

molecular de aproximadamente 94 kDa apresentando as

atividades de 5’→3’ DNA polimerase e 5´→3´ exonuclease.

Não possui atividade 3'→5' exonuclease (proofreading).

A forma recombinante da enzima Taq DNA Polimerase é

ideal para uso em reações de PCR para amplificação de

fragmentos de DNA até 5 kb.

Composição dos Tampões de Reação de PCR com MgCl2:

10X Tampão de Reação KCl 100 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25°C), 500 mM KCl, 0.8% (v/v) Nonidet P40, 15 mM MgCl2

10X Tampão de Reação (NH4)2SO4 750 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25°C), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 20 mM MgCl2

Componentes do Produto

Cat. No. 0300.0003.0100 100 unidades

AMOSTRA

500 µL 10X Tampão de

Reação KCl 15 mM de MgCl2

TAMPA VERDE

500 µL 10X Tampão de

Reação (NH4)2SO4 20 mM de MgCl2

TAMPA AZUL

500 µL 25 mM MgCl2 TAMPA

TRANSPARENTE

200 µL 5X GC-rich Solution TAMPA

AMARELA

20 µL Taq DNA

Polimerase 5U/µL TAMPA

VERMELHA

Cat. No. 0300.0003.0100 100 unidades

AMOSTRA

2 x 1,25 mL 10X Tampão de

Reação KCl 15 mM de MgCl2

TAMPA VERDE

2 x 1,25 mL 10X Tampão de

Reação (NH4)2SO4 20 mM de MgCl2

TAMPA AZUL

1500 µL 25 mM MgCl2 TAMPA

TRANSPARENTE

1000 µL 5X GC-rich Solution TAMPA

AMARELA

100 µL Taq DNA

Polimerase 5U/µL TAMPA

VERMELHA

Instruções para Uso

1. Descongelar e misturar vigorosamente os reagentes

10X Tampão de Reação contendo MgCL2 e 5X GC-rich

Solution (opcional).

2. Para realizar várias reações de PCR e minimizar a

possibilidade de erros de pipetagem, preparar uma

mistura de amplificação (Mastermix) adicionando Água

para Biologia Molecular, 10X Tampão de Reação contendo

MgCl2, dNTPs, primers e Taq DNA Polimerase.

Devido à perda de volume durante a pipetagem da

Mastermix, calcular o número de reações adicionando

uma reação extra para cada 10 reações de PCR.

Por exemplo: para 20 reações de PCR, adicionar 2 reações

extras.

Após a preparação, distribuir a Mastermix nos microtubos

individuais de PCR e a seguir, adicionar o DNA alvo ou

controle negativo.

A tabela a seguir apresenta as quantidades para uma

reação de PCR padrão de volume final de 50 µL.

As quantidades de Água para Biologia Molecular e DNA

Alvo ou controle negativo podem ser ajustadas para

completarem o volume final de 50 µL da reação de PCR:

Taq DNA Polimerase

(recombinante)

Tampão de Reação com MgCL2

Componente da Reação de PCR

Volume Concentração

Final

Água para Biologia Molecular

até 50 µL

5X GC-rich Solution (opcional)*

12 µL 1,2X

10X Tampão de Reação KCl ou (NH4)2SO4**

5 µL 1X

10 mM dNTP Mix 1 µL 0,2 mM

10 µM Primer Forward 2,5 µL 0,5 µM

10 µM Primer Reverse 2,5 µL 0,5 µM

Taq DNA Polimerase 5U/µL***

0,25 µL 1,25 U

DNA alvo ou controle negativo

variável 10 pg a 500 ng

*5X GC-rich Solution é uma solução contendo 5M de

betaine. A betaine é um dos mais efetivos aditivos para a

reação de PCR indicados para regiões de DNA ricas em

bases GC que apresentam um alto grau de estruturas

secundárias.

A betaine também aumenta a processividade da Taq DNA

Polimerase reduzindo pausas na polimerização causadas

pela presença de estruturas secundárias que podem

induzir a dissociação da polimerase do alvo de DNA.

O uso de betaine em reações de PCR pode ser facilmente

avaliado da seguinte forma:

1a Reação de PCR: adicionar 12 µL de Água

2a Reação de PCR: adicionar 12 µL de 5X GC-rich Solution

Adicionar os demais componentes da reação de PCR e

completar o volume para 50 µL.

** As concentrações finais de 1,5 mM (10X Tampão de

Reação KCl) e 2,0 mM de MgCl2 (10X Tampão de Reação

(NH4)2SO4) funcionam para a maioria dos alvos de DNA.

Porém, caso seja necessário padronizar a reação de PCR,

adicionar MgCl2 para uma concentração final de até 4 mM.

Em uma reação de PCR de volume final de 50 µL, cada 1 µL

adicional da solução 25 mM MgCl2 aumenta a

concentração de MgCl2 em 0,5 mM.

Para a amplificação de regiões de DNA ricas em bases GC,

recomendamos o uso de 1,2X GC-rich Solution e 4 mM

MgCl2.

*** Para alvos longos (fragmentos de DNA > 3 kb), utilizar

2,5 U de Taq DNA Polimerase.

3. Realizar a reação de PCR conforme as seguintes

condições de ciclagem térmica:

Temp Tempo Ciclos

Denaturação Inicial

95oC 3 minutos

Desnaturação 95oC 30 segundos

25 a 40 ciclos

Pareamento 55oC* 30 segundos

Extensão 72oC 1 min/kb

Extensão Final 72oC 10 minutos

* Depende do Tm dos primers. Geralmente, Tm - 5 oC.

4. Analisar 10 µL da reação de PCR em eletroforese em gel

de agarose.

Neste caso, utilizar a reação de PCR imediatamente em

aplicações de Biologia Molecular ou armazenar a - 20oC.

Controle de Qualidade (Certificado de Análise)

Cada lote da enzima Taq DNA Polimerase é

extensivamente purificado para garantir um grau de

pureza próximo de 100% analisado pela técnica de

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

A análise funcional da enzima é realizada em reações de

PCR (95oC por 3 minutos, 35 ciclos de 95oC por

30 segundos, 55oC por 15 segundos e 72oC por 60

segundos) para a amplificação de um fragmento de 2 kb

do gene de beta-globina humano partir de 50 ng de DNA

genômico humano utilizando os seguintes primers:

2kb_Forward (5’ TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC 3’)

2kb_ Reverse (5’ TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A 3’)

Nota: Os primers para a Reação de PCR podem ser

desenhados utilizando o software Primer-BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Taq DNA Polimerase (Tampão de Reação com MgCL2)

Rev.1

Produto para uso em pesquisas científicas

Fabricado no Brasil por:

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