Tabela NMP

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<p>ANEXO III PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM 1. TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao da formao de colnias a partir de um nmero "fixo" de clulas viveis. So utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colnias (UFC) presentes na amostra sob anlise. Os meios de cultura usados para a obteno do nmero de colnias em uma amostra podem ser de uso geral (meios com ingredientes nutritivos bsicos), enriquecidos (meios com nutrientes adicionais, como sangue, gema de ovo e soro), acrescidos ou no de sistemas inibidores e/ou indicadores. A aplicao das tcnicas de contagem tem por base o uso de diluies seriadas, obtidas a partir da homogeneizao de amostras slidas e semi-slidas ou a partir de inoculaes diretas de amostras lquidas e de suas diluies. As tcnicas bsicas de contagem em placas incluem: 1.1 Semeadura em profundidade: Distribuir as alquotas das diluies escolhidas em placas de Petri estreis. Acrescentar 12 a 15 mL do gar a 46-48C. Homogeneizar imediata e adequadamente. Deixar solidificar e incubar as placas (invertidas ou no), de acordo com as exigncias de tempo, temperatura, tenso de oxignio etc, requeridas pelo microrganismo a ser enumerado. 1.2 Semeadura em superfcie: Usar placas em que, previamente, tenha sido distribudo o meio especfico para o microrganismo a ser enumerado. Promover a secagem da superfcie deixando as placas invertidas, semi-abertas com a base apoiada na tampa, por cerca de 15 minutos em estufa a 45-50C. Inocular 0,1 mL, ou no mximo 0,5 mL, das diluies selecionadas, lembrando que 0,1 mL de uma diluio oferece resultado correspondente diluio seguinte, isto , 0,1 mL de 10-1 oferece resultado para a diluio 10-2. Observar que o inculo deve ser depositado no centro da superfcie do gar, evitando tocar a ponta da pipeta no meio, mantendo-a, entretanto, o mais prximo possvel. Espalhar o inculo, com auxlio de ala de Drigalski ou basto de vidro tipo "hockey", estreis, por toda a superfcie do gar, at absoro completa. Inverter as placas aps a absoro completa do inculo e incubar como requerido, o mais rpido possvel. 1.3 Semeadura por Sobrecamada: Proceder como para semeadura em profundidade. Aps homogeneizao do meio de cultura com o inculo e solidificao do gar, acrescentar uma nova camada de 10 a 12 mL do gar correspondente, fundido e mantido a 4648C. Deixar solidificar sem misturar e incubar conforme requerido. A tcnica por sobrecamada poder ser feita a partir de uma semeadura em superfcie, acrescentando-se uma sobrecamada de 10 a 12 mL de gar fundido aps a semeadura, distribuio e absoro total do inculo pelo gar. Deixar solidificar sem misturar e incubar o mais rpido possvel. Quando se pretende a recuperao de clulas em "stress", o tempo decorrido entre a inoculao da primeira camada e a adio da sobrecamada pode ser dilatado, deixando as placas invertidas emtemperatura ambiente, conforme indicao da metodologia especfica. 2. TCNICA DE NMERO MAIS PROVVEL A tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP) um mtodo que permite estimar a densidade de microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise. Esta tcnica no permite a contagem "fixa" de clulas viveis ou de unidades formadoras de colnias (UFC), como acontece com a tcnica de contagem em placas. A anlise por NMP recomendada quando: a) esperado, no alimento em anlise, um baixo nmero do microrganismo alvo (110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra no estava diluda (100), o resultado final a ser emitido obtido diretamente da tabela. As diferenas de resultados observadas nos diferentes exemplos de trabalho com a mesma amostra e diluies diferentes demonstram a importncia de se fazer diluies da amostra considerando o nmero estimado do microrganismo teste, pois a mesma amostra</p> <p>analisada conforme os exemplos 4 (sem suficiente diluio) e 1 (com diluies adequadas) apresentam resultados bem diferentes (&gt; 110 NMP/g ou mL e 930 NMP/g ou mL). O resultado &gt;110 NMP/g ou mL vago e pode no ser adequado para a tomada de deciso a respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando h uma tolerncia em nmeros maiores que este. Exemplo 5: Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos e que apresente os resultados abaixo: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 1 tubo positivo 10-3 0 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos Considerar o arranjo 3-1-0, j que o resultado mais prximo do real obtido quando a primeira srie considerada contm os 3 tubos positivos e a ltima srie os 3 tubos negativos. b) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas em que ocorreram tubos positivos em mais de duas diluies subseqentes escolhida. Neste caso, repassar um tubo positivo da maior diluio positiva para a imediatamente anterior, sucessivamente, at obter arranjo de tubos que se enquadre na situao anterior (casos 5 e 6 da tabela 1). Exemplo 6: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 2 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 1 tubo positivo O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-22 tubos positivos. Este arranjo obtido pela transposio do tubo positivo da diluio 10-4 para a diluio anterior. Exemplo 7: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando os seguintes resultados: 100 3 tubos positivos 10-1 2 tubos positivos 10-2 0 tubos positivos 10-3 1 tubo positivo 10-4 0 tubos positivos O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-21 de tubos positivos. Esse arranjo de tubos positivos obtido pela transposio do tubo positivo da diluio 10-3 para a diluio 10-2. c) Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos, cujos resultados indicam duas possibilidades de todos os tubos da primeira srie serem positivos e todos os da ltima srie serem negativos, considerar o maior valor de NMP apresentado pela tabela correspondente. 100 3 tubos positivos 10-1 3 tubos positivos 10-2 0 tubos positivos 10-3 0 tubos positivos</p> <p>10-4 0 tubos positivos 3-3-0 - 24 NMP/g ou mL (100, 10-1 e 10-2) 3-0-0 - 23 NMP/g ou mL (10-1, 10-2 e 10-3) O resultado final, neste caso, ser o valor NMP correspondente ao arranjo 3-3-0 (24 NMP/g ou mL). d) Inoculao de somente 3 diluies seriadas Nos casos de inoculao de somente 3 diluies seriadas, fazer a leitura diretamente na tabela (casos 1 e 4 e exemplo 4). e) Arranjos inexistentes nas tabelas Repetir a anlise sempre que os resultados dos controles aplicados no processo analtico apontarem para esta necessidade, e/ou os arranjos de tubos positivos, na srie de tubos mltiplos, revelarem comportamento incoerente como 0-1-3 ou outros arranjos inexistentes nas tabelas de NMP. f) Atendendo a legislao Utilizar a inoculao de 3 sries de 10, 5 ou 3 tubos quando a legislao estabelecer padro para NMP menor que 1,0, 2,0 ou 3,0, respectivamente. 2.3 Tabelas de NMP Tabela 1. Nmero Mais Provvel por grama ou mL, para sries de 3 tubos com inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Tubos Positivos 0,1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 0,01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 0,001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 NMP/g ou mL Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,15 0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 3,7 4,5 8,7 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 Superior 9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420</p> <p>1100</p> <p>18 37 40 90 42 90 180 420</p> <p>420 420 430 1000 1000 2000 4100 -.-</p> <p>Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001. OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na anlise. Tabela 2. Nmero Mais Provvel por 100mL, para sries de 3 tubos com inculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL, e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Tubos Positivos 10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1,0 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 0,1 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP/g ou mL Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,15 0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 3,7 4,5 8,7 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 Superior 9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1000</p> <p>1100 Manual Online, 2001.</p> <p>42 90 180 420</p> <p>1000 2000 4100 -.-</p> <p>Tabela 3. NMP por grama ou mL para sries de 10 tubos com inculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1mL e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Tubos Positivos 10 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1,0 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 0,1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 NMP/g ou mL Intervalo Confiana (95%) Inferior -.0,04 0,35 0,04 0,33 0,33 0,8 0,8 0,05 0,33 0,8 0,33 0,8 1,4 0,8 1,4 1,4 2,1 2,1 0,37 0,81 1,4 0,82 1 2,1 1,4 2,1 3 2,1 3 3 3,1 3,1 0,9 1,4 2,1 1.4 2,1 3 2,1 3 3,1 3 Superior 3,1 3,1 5,1 3,6 5,1 5,1 7,2 7,2 5,1 5,1 7,2 5,7 7,2 9 7,2 9 9 11 11 7,2 7,3 4,9 7,8 4,9 11 9,1 11 14 11 14 14 15 15 9 9,1 11 10 11 14 12 14 15 14</p> <p>2300 Analytical Manual Online, 2001.</p> <p>60 70 80 90 100 120 120 120 150 150 74 91 100 120 140 150 180 210 210 280 110 120 150 180 210 280 350 480 620 810 1300</p> <p>250 280 350 350 380 480 480 480 620 620 310 380 480 480 620 630 820 970 970 1300 480 620 820 970 1300 1500 1900 2400 3400 5300 -.-</p> <p>3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicas para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p. MATURIN,L.J.; PEELER, J.T. Aerobic Plate Count. In: Bacteriological Analytical Manual. 8 ed. Arlington, AOAC International, 1995. p. 3.01 - 3.10. SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes &amp; Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p. 53-62. FDA. Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov</p>