Susana F. Domingues

Estudo do efeito do citral na morfologia do esqueleto de peixe

zebra durante os primeiros estados de desenvolvimento

Ácido retinóico

Vitamina A(Retinol)

Citral

Introdução

Tecido conjuntivo especializado que exerce uma função estrutural

Composta por células específicas: Condroblastos e

condrócitos Produzem e

segregam uma matriz extracelular

Cartilagem

Introdução

Composto por um material extracelular calcificado Matriz óssea

Três tipos de células: Osteoblastos, osteocitos e

osteoclastos Formação do osso:

Mineralização directa da matriz, secretada pelos osteoblastos - ossificação intramembranosa

Deposição de matriz óssea substituindo a cartilagem – ossificação endocôndrica.

Osso Tecido conectivo dinâmico

e especializado

Modelo Biológico

Teleósteo tropical de água doce

Elevada taxa fecundidade Desenvolvimento rápido (3-4

meses) Desenvolvimento embrionário

externo Ovos translúcidos

Peixe zebra (Danio rerio, Hamilton, 1822)

Peixe zebra como modelo… Manipulações genéticas Embriologia Extrapolar resultados para

vertebrados superiores

Adaptado de www.biologyPager/Z/Zebrafish.html

Introdução

O citral é um óleo claro e líquido com odor a limão e sabor ligeiramente doce

Usado: Agente edulcorante em pastilhas,

rebuçados, gelados Fragrância para sopas, detergentes,

loções e perfumes

5 mg citral/kg de peso seco (Conselho da Europa, 1973)

Inibe a oxidação do retinol em ácido retinóico

Citral

Adaptado de Ress et al., 2003

Introdução

Interfere com a actividade biológica dos retinóides nos tecidos Ratos (Connor & Smit, 1987; Connor, 1988) Embriões de galinha (Nogueira et al., 1995)

Citral

Introdução

Necessário: Desenvolvimento ocular e visão nocturna Pele saudável Desenvolvimento e manutenção das células epiteliais Correcta formação do osso e dos dentes Armazenamento de lípidos Síntese de proteínas e glicogénio

Vitamina A Retinol - Álcool de cadeia longa Ácido retinóico - forma mais activa de vitamina A Adaptado de Ress et al., 2003

Regulador de expressão genética Desenvolvimento dos vertebrados Formação de estruturas e padronização dos eixos

Exemplo: Desenvolvimento das asas das galinhas, onde o ácido retinóico

induz a formação da dupla simetria dos elementos Anfíbios (Xenopus) e peixe zebra, desenvolvimento das

estruturas neural e mesodermal

Introdução

Ácido retinóico

Proteína Gla do osso (BGP)Proteína Gla da matriz (MGP)

Ácido retinóico

Vitamina A(Retinol)

Citral

Introdução

Proteína Gla do osso (BGP) e Proteína Gla da Matriz (MGP)

Proteína Função Local de síntese Referências

BGP

Regulador negativo da

formação de osso

Osso Price et al., 1976

Ducy et al., 1996

MGP

Inibição da calcificação

Regulador da maturação

de condrócitos

Cartilagem, aorta, pulmão, rim

Price et al., 1977

Luo et al., 1997

Kirfel et al., 1998

Objectivo

Determinar os efeitos do citral sobre: Formação e mineralização do esqueleto Expressão da BGP e MGP

Durante as primeiras fases do desenvolvimento larvar de peixe zebra

Efeito no desenvolvimento do organismo?

ArejadorTermóstato

Recipientes

Controle

5 g/l

g/l

g/l

Aquário com água

Procedimento experimental

Idades de início do tratamento:

2, 4 e 7 DPH

PCR em tempo real

Procedimento experimental

Recolhas

Vermelho alizarin

Azul alcian

1. Von Kossa

2. In situ

3. Hematoxilina/eosina

Observação e Medição à lupa

Histologia Coloração osso cartilagem

Extracção de ARN

PCR em Tempo Real

Acréscimo trizol ao meio de extracção Extracção do RNA dos peixes (Centrifugação) Recolha da parte sobrenadante Adição de fenol clorofórmio Verificação da pureza do RNA Introdução do RNA na máquina de PCR juntamente com os primers

adequados e nucleótidos Comparação das sequências de codões

PCR em Tempo Real

Principais vantagens: Grande Rapidez Menor possibilidade de contaminação

laboratorial Mais específico sensível e reproduzível

Aplicações: Estudo do padrão de expressão genética Sequenciação directa de produtos

amplificados Estudos diagnósticos de doenças

parasitárias, virais e bacterianas

Resultados e Discussão

Concentrações de 10M e 20M: Alterações

comportamentais durante o tratamento

Morte das larvas quando o meio é mudado

Atraso no desenvolvimento das estruturas

Tratamento com 5M de citral

10M

20M

Controlo

5M

Comprimentos

Diminuição do comprimento das larvas de 20 M

4

5

6

7

8

7 14 21Dias após tratamento

Co

mp

rim

en

to (

mm

)

Control

5uM

10uM

20uM

Controlo 5 M 5 M

Estruturas mineralizadas

Controlo: Deposição de cálcio na matriz cartilagínea extracelular

Concentração de 5 M de citral: Deposição de cálcio na periferia da cartilagem Deposição de cálcio na cavidade do pericárdio

Arcos branquiais Arcos branquiais Cavidade abdominal

Locais de expressão da MGP através de hibridação in situ

Controlo: Expressão localizada nos condrócitos maturos e hipertróficos

5 M: Expressão localizada nos condrócitos maturos Matriz extracelular de maiores dimensões

Controlo

5MControlo

Boca Cabeça e arcos branquiais Trabécula

5 M

Controlo

Histopatologia

Intestino

Controlo: Vilosidades intestinais com

enterócitos de núcleo basal (células sanguíneas junto à parede do intestino)

Citoplasma ligeiramente granular

Concentração de 5 M: Grande acumulação de pigmento

nos enterócitos na zona apical Estreitamento do epitélio intestinal

20 MControlo 5 M

Histopatologia

Controlo: Hepatócitos poligonais, com

citoplasma ligeiramente granular Concentração de 5 M:

Desorganização do parênquima hepático

Fígado

Hepatócitos com núcleos picnóticos com reduzido tamanho celular

Controlo

5 M

Histopatologia

Concentração de 5 M: Grande dilatação do lúmen Forte estreitamento das

células epiteliais

Rim

Resultados semelhantes aos obtidos por outros autores com: Insecticidas Hidrocarbonetos aromáticos

CleithrumOpérculo

Cartilagem de

Meckel

Complexo

caudal

Vertebras pré-urais

BOP (processo

basi-occipital)

Hipurais

Desenvolvimento esquelético

Deformações esqueléticas

Pré-ural Complexo

caudalHipural

5 M

Deformações esqueléticas

Encurvamento da coluna

Deformações – Concentrações 5 M e 10 M

Inibição do desenvolvimento – 20 m

Complexo caudal Inibição da calcificação

25

80 83

50

0

20

40

60

80

100

Control 5uM 10uM 20uM

% d

e de

form

açõe

s

22

50

0

20

40

60

80

100

Control 5uM 10uM 20uM

% d

e de

form

açõe

s

Considerações finais

Alterações: Desenvolvimento

Estruturas ósseas Comportamento (Movimento natatório)

Deformações (aumento): Coluna vertebral Complexo caudal

Hipurais Vertebras pré-urais

Considerações finais

Anomalias: Figado Rim Intestino

Deposição de cálcio na zona do coração

Efeito tóxico em larvas sujeitas a concentrações mais elevadas de citral – 10 M e 20 M

Futuramente…

Realização de mais amostragem utilizando concentrações menores de citral

Tratamento utilizando embriões em fases menos desenvolvidas

Agradecimentos

Professora Doutora Leonor Cancela

Paulo Gavaia Quem auxiliou

a Susana Carla Viegas no desenrolar deste Juan Bosco projecto. Sandra Marques

O nosso principal agradecimento

Susana Domingues